CN115991785A - 一种双特异性抗体、制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本申请的实施例公开了一种双特异性抗体、制备方法和用途。所述双特异性抗体包括：特异性结合干细胞表面抗原的第一蛋白功能区，所述第一蛋白功能区为抗干细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段；和特异性结合软骨细胞表面抗原的第二蛋白功能区，所述第二蛋白功能区为抗软骨细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段。本申请的实施例所揭示的双功能抗体实现了干细胞在关节软骨受损部位的靶向定植，与干细胞发挥协同作用提高关节炎治疗效果。

Description

一种双特异性抗体、制备方法和用途

技术领域

本申请一般涉及医药技术领域，具体涉及一种双特异性抗体、制备方法和用途，更具体的，本申请涉及一种双特异性抗体，一种核酸，一种表达载体，一种宿主细胞，一种制备双特异性抗体的方法，一种药物组合物，以及双特异性抗体、核酸、表达载体、宿主细胞或药物组合物在制备用于治疗或者预防关节炎的药物中的用途。

背景技术

关节炎是当今世界严重危害人类健康的疾病之一，目前临床上采用的常规疗法如物理治疗、药物治疗、免疫治疗或手术治疗虽一定程度上缓解了病情，但这些方法仍然存在很大的局限性。

Matrilin-3(MATN3)是一种非胶原细胞外基质蛋白，主要由成软骨细胞分泌，特异性分布在软骨上，是现今发现的Matrilin家族中唯一一个基因突变致软骨疾病发生的成员。研究表明骨关节炎中MATN3表达增加，且与关节损伤严重程度呈正相关，是研究关节炎的有利靶点。然而，现有技术中缺乏针对MATN3靶点的药物。

发明内容

本申请是基于发明人的下列发现而完成的：

干细胞具有促进关节软骨修复再生的作用，将其作用于关节软骨损伤部位时能够快速、有效地修复损伤，由此可用于制备用于治疗或者预防关节炎的药物。

其中，干细胞发挥作用的前提是能够定植在组织损伤部位，然而干细胞移植面临归巢、定植效率低的难题，发明人发现，通过设计靶向干细胞表面抗原和靶向软骨细胞表面抗原的双特异性抗体能够实现将干细胞特异性定植到软骨损伤部位，显著提高干细胞对软骨损伤的修复效果。

在本申请的一个方面，本申请的实施例提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括特异性结合干细胞表面抗原的第一蛋白功能区和特异性结合软骨细胞表面抗原的第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区为抗干细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段，所述第二蛋白功能区为抗软骨细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段。该双特异性抗体能够引导干细胞靶向定植到软骨损伤部位，从而与干细胞发挥协同修复软骨作用。

根据本申请的实施例，所述干细胞为造血干细胞。

根据本申请的实施例，所述干细胞表面抗原为CD34。

根据本申请的实施例，所述软骨细胞表面抗原为MATN3。

根据本申请的实施例，所述第一蛋白功能区的轻链可变区包含如SEQ ID No.1-3所示的CDR，重链可变区包含如SEQ ID No.4-6所示的CDR；所述第二蛋白功能区的轻链可变区包含如SEQ ID No.7-9所示的CDR，重链可变区包含如SEQ ID No.10-12所示的CDR。

根据本申请的实施例，所述第一蛋白功能区选自全长免疫球蛋白、Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv、scFv或VHH；和/或，

所述第二蛋白功能区选自全长免疫球蛋白、Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv、scFv或VHH。

根据本申请的实施例，所述第一蛋白功能区为全长IgG1免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为scFv。

根据本申请的实施例，所述scFv为轻链可变区-第一连接子-重链可变区，所述scFv的轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过第二连接子相应地连接在所述全长IgG1免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；或，

所述scFv为重链可变区-第一连接子-轻链可变区，所述scFv的重链可变区N末端或轻链可变区C末端通过第二连接子相应地连接在所述全长IgG1免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端。

根据本申请的实施例，所述scFv的数量为两个，分别对称地连接在所述全长IgG1免疫球蛋白轻链的C末端。

根据本申请的实施例，所述第一连接子和所述第二连接子各自独立地包含选自GS、GGSG、GGGS和GGGGS序列的重复。

根据本申请的实施例，所述全长免疫球蛋白的恒定区来源于IgG或IgG突变体。

根据本申请的实施例，所述恒定区与野生型IgG1恒定区相比,包含L234A，L235A和P329G的氨基酸替换。

在本申请的另一些方面，本申请的实施例提供了编码本申请双特异性抗体的核酸、用于制备本申请双特异性抗体的表达载体、宿主细胞、制备方法，一种药物组合物，以及本申请双特异性抗体在治疗或者预防关节炎方面的应用。

本申请的实施例所揭示的双功能抗体实现了干细胞在关节软骨受损部位的靶向定植，增强了干细胞的靶向定植能力，使更多干细胞在损伤部位实现长期存活，提高了关节炎治疗效果。

附图说明

通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是本申请不同实施方式的双特异性抗体的结构示意图；

图2是本申请一种实施方式的呈IgG-scFv形式的双特异性抗体的结构示意图；

图3是扩增片段的PCR鉴定结果，其中A为PCR鉴定Anti-CD34-V_L片段、C_L片段；B为PCR鉴定Anti-CD34-L与Anti-MATN3-scFv片段；

图4是PCR鉴定pIL-15载体酶切；

图5是通过PCR进行C_H区域的氨基酸突变；

图6是PCR鉴定Anti-CD34-V_H、C_H片段；

图7是扩增片段的PCR鉴定结果，其中，A为Overlap PCR所得的Anti-CD34-V_H-C_H’片段，B为通过引物延伸所得的Anti-CD34-V_H-C_H片段；

图8是WB检测Anti-CD34×MATN3-H与Anti-CD34×MATN3-L质量比以确定最佳共转染比例，A为非还原样品，B为还原样品；

图9是CD34×MATN3的HiTrap MabSelect SuRe亲和纯化色谱图；

图10是CD34×MATN3双特异性抗体纯化后SDS-PAGE鉴定，A为非还原样品，B为还原样品；

图11是Biacore检测抗体与CD34-Fc抗原亲和力结果，其中，A为Anti-CD34-scFv与CD34-Fc抗原的相互作用，B为CD34×MATN3与CD34-Fc抗原的相互作用；

图12是Biacore检测抗体与MATN3-Fc抗原亲和力结果，A为Anti-MATN3-scFv与MATN3-Fc抗原的相互作用，B为CD34×MATN3与MATN3-Fc抗原的相互作用；

图13是流式检测抗体与软骨细胞的亲和，A为阴性对照，B为Anti-MATN3-scFv与软骨细胞的亲和，C为CD34×MATN3与软骨细胞的亲和，D为单抗、CD34×MATN3与软骨细胞的亲和对比；

图14是流式检测抗体与HSCs的亲和，A为阴性对照-PE，B为阴性对照-APC，C为阳性对照，D为不同量的CD34×MATN3与HSCs的结合情况；

图15是293T-GFP与293T-Anti-MATN3-scFv-GFP稳定细胞池的构建，A为293T-GFP白光，B为293T-GFP荧光，C为293T-Anti-MATN3-scFv-GFP白光，D为293T-Anti-MATN3-scFv-GFP荧光；

图16是流式检测293T-Anti-MATN3-scFv-GFP稳定细胞池GFP基因与Anti-MATN3-scFv基因表达，A为GFP基因表达情况，B为Anti-MATN3-scFv基因表达情况；

图17是软骨片MATN3抗原的表达，A&D为空白对照组的两张软骨片，B&E为293T-GFP组的两张软骨片，C&F为293T-Anti-MATN3-scFv-GFP组的两张软骨片；

图18是CD34×MATN3介导HSCs靶向软骨片，A&B为空白对照组软骨片放大40倍与100倍；C&D为CFSE处理过的HSCs对照组软骨片放大40倍与100倍，E&F为修饰了CD34×MATN3的实验组软骨片放大40倍与100倍；

图19是给药治疗后大鼠膝关节磨损情况；

图20是给药治疗后大鼠膝关节番红-固绿染色结果；

图21是给药治疗后大鼠膝关节甲苯胺蓝染色结果；

图22是给药治疗后COL2表达情况；

图23是给药治疗后COL10表达情况；

图24是给药治疗后MMP-13表达情况；

图25是给药治疗后MATN3表达情况；

图26是大鼠膝关节滑车沟打孔后HSCs-CD34xMATN3、HSCs和PBS的修复结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本申请提供一种双特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区为抗干细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段，能够特异性结合干细胞表面抗原，所述第二蛋白功能区为抗软骨细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段，能够特异性结合软骨细胞表面抗原。因此，本申请的双特异性抗体可以识别并结合至干细胞和软骨细胞两者，从而引导干细胞靶向定植到软骨损伤部位。

在本申请的一些实施例中，所述干细胞为间充质干细胞或造血干细胞，所述造血干细胞表面抗原选自CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD106，所述造血干细胞表面抗原为CD34或Try-1抗原。在本申请的一些实施例中，优选所述干细胞为造血干细胞，所述干细胞表面抗原为CD34。

根据本申请的实施例，所述第一蛋白功能区和所述第二蛋白功能区均包括轻链可变区和重链可变区，所述第一蛋白功能区的轻链可变区包含如SEQ ID No.1-3所示的CDR(依次为CDR₁、CDR₂和CDR₃)，重链可变区包含如SEQ ID No.4-6所示的CDR(依次为CDR₁、CDR₂和CDR₃)；所述第二蛋白功能区的轻链可变区包含如SEQ ID No.7-9所示的CDR(依次为CDR₁、CDR₂和CDR₃)，重链可变区包含如SEQ ID No.10-12所示的CDR(依次为CDR₁、CDR₂和CDR₃)。

进一步地，所述第一蛋白功能区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，所述第二蛋白功能区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。

根据本申请的实施例，所述第一蛋白功能区和所述第二蛋白功能区各自独立地选自全长免疫球蛋白、Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv、scFv或VHH，即所述抗CD34的抗体或其抗原结合片段以及所述抗MATN3的抗体或其抗原结合片段各自独立地选自全长免疫球蛋白、Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv、scFv或VHH，本申请双特异性抗体可能的结构如图1所示(引用自doi:10.1016/j.molimm.2015.01.003.)。

为了设计工艺简单且保留有效活性的双特异性抗体，在一些实施例中，本申请的双特异性抗体的形式为类似正常IgG的结构，具体地，分别设计单独的轻链和重链，在轻链和/或重链N端设计能够靶向两个靶点的轻链和/或重链可变区，且共享相同的重链Fc区域。在另一些实施例中，将一个靶点的抗体分子以scFv的形式连到另一靶点完整抗体的轻链或重链的一端，例如第一蛋白功能区为完整抗体，第二蛋白功能区为scFv，或者第一蛋白功能区为scFv，第二蛋白功能区为完整抗体，这样既能够避免表达不同重链Fc带来表达产物的不均一，比如Knob形式的Fc和Hole形式的Fc共表达会有不均一的Fc-Fc配对，影响表达量且造成纯化困难；也能够避免轻、重链部分区域交换设计可能对结构活性的影响。

根据本申请的实施例，所述第一蛋白功能区为全长IgG1免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为scFv，即所述双特异性抗体呈IgG1-scFv结构(图2)。

示例性地，所述scFv可以为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，可以是scFv的轻链可变区的N末端连接至全长IgG1免疫球蛋白轻链或重链的C末端，或scFv的重链可变区的C末端连接至全长IgG1免疫球蛋白重链或轻链的N末端；或，所述scFv可以为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，可以是scFv的重链可变区的N末端连接至全长IgG1免疫球蛋白轻链或重链的C末端，或scFv的轻链可变区的C末端连接至全长IgG1免疫球蛋白重链或轻链的N末端。

根据本申请的一些实施例，所述scFv为轻链可变区-第一连接子-重链可变区，所述scFv的轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过第二连接子相应地连接在所述全长IgG1免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；或，

所述scFv为重链可变区-第一连接子-轻链可变区，所述scFv的重链可变区N末端或轻链可变区C末端通过第二连接子相应地连接在所述全长IgG1免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端。

示例性地，所述scFv为重链可变区-第一连接子-轻链可变区，所述scFv的重链可变区N末端通过第二连接子连接在所述全长IgG1免疫球蛋白轻链C末端。由此，所述双特异性抗体至少包括第一蛋白链和第二蛋白链，所述第一蛋白链从N末端至C末端具有下式：

轻链可变区-轻链恒定区-第二连接子-重链可变区-第一连接子-轻链可变区；

所述第二蛋白链从N末端至C末端具有下式：

重链可变区-重链恒定区(C_H-1)-铰链区-Fc区(C_H-2+C_H-3)；

根据本申请的实施例，所述scFv的数量为两个，分别对称地连接在所述全长IgG1免疫球蛋白轻链的C末端。

示例性地，所述双特异性抗体包括两条相同的如上所述的第一蛋白链和两条相同的如上所述的第二蛋白链，第一蛋白链的轻链可变区-轻链恒定区与第二蛋白链的重链可变区-重链恒定区通过二硫键结合形成蛋白链组。

本领域技术人员应当理解的是，连接于免疫球蛋白的scFv的数量还可以是四个、六个或八个。

示例性地，当所述scFv的数量为四个时：(1)四个scFv均为轻链可变区-第一连接子-重链可变区结构，其中两个scFv的重链可变区的C末端分别对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链可变区的N末端、另两个scFv的重链可变区的C末端分别对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链可变区的N末端；(2)四个scFv均为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，其中两个scFv的重链可变区的N末端分别对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链的C末端、另两个scFv的重链可变区的N末端分别对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端；(3)其中两个scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，其重链可变区的C末端分别对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链可变区或轻链可变区的N末端；另两个scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，其重链可变区的N末端分别对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链或重链的C末端。

上述的与轻链或重链的C末端连接，均指的是与轻链恒定区或重链恒定区的C末端连接。

根据本申请的实施例，所述第一连接子和第二连接子各自独立地包含选自GS、GGSG、GGGS和GGGGS序列的重复。

根据本申请的实施例，所述全长免疫球蛋白的恒定区来源于IgG或IgG突变体，优选来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，更优选来源于IgG1。

根据本申请的实施例，所述恒定区与野生型IgG1恒定区相比，包含L234A，L235A和P329G的氨基酸替换，使得所述双特异性抗体减弱甚至消除ADCC或CDC功能，延长半衰期以长时间保持疗效。

在本实施例中，具体是Fc区的C_H-2区域的氨基酸发生突变，相当于是Fc区包含L14A、L15A和P109G的氨基酸替换，其中，野生型IgG1 Fc区的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，氨基酸突变的IgG1Fc区的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。

本申请还提供编码双特异性抗体的核酸、相应的表达载体和宿主细胞。

本申请的核酸可以是DNA分子或RNA分子，也可以是核酸类似物。在本申请中的核酸分子可以包含天然存在的核酸残基或人工生成的核酸残基。本申请的核酸分子可以是单链或双链的、线性或环状的、天然的或合成的，并且若没有另外指出，则没有任何大小限制。核酸分子还可以包含启动子，启动子可以是同源或异源的。

优选地，在一些实施例中，编码所述第一蛋白功能区轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，编码所述第一蛋白功能区重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，编码所述第二蛋白功能区轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，编码所述第二蛋白功能区重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示。

本申请的核酸分子可以克隆到载体中。本申请的“载体”包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其它在遗传工程中通常使用的载体。在一些实施方案中，这些载体适用于转化细胞、真核生物细胞如真菌细胞、微生物的细胞诸如酵母或原核细胞。在一个优选的实施方案中，这些载体适用于细菌细胞的稳定转化，例如以转录本申请的核酸分子。

本申请的载体可以是表达载体。已经在文献中广泛描述的合适的表达载体都可用于本申请。在一个实施方案中，表达载体可以含有标志基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点，以及启动子和转录终止信号。在启动子和终止信号之间，优选地，有至少一个能够***期望表达的核酸序列/分子的限制性位点。优选的，本申请的表达载体选自pET系列表达载体、pGEX系列表达载体、pcDNA系列表达载体，更优选本申请的表达载体是pIL-15表达载体。

在一个实施方案中，在宿主细胞中表达双特异性抗体，随后分离抗体，并通常纯化到药学可接受的纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码其蛋白质的核酸***表达载体中。在合适的稳定宿主细胞中实施表达，并且从所述细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收蛋白质。

在另一个实施方案中，可以将本申请的核酸分子和/或其中含有本发明核酸分子的载体转导、转化或转染、或者以其它方式导入宿主细胞中。例如，宿主细胞是真核或原核细胞，优选是真核细胞。作为一个非限制性例子，宿主细胞是哺乳动物细胞。本申请的宿主细胞可以是人、酵母或真菌细胞，例如中国仓鼠的卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠的肾脏细胞(BHK,ATCC CCL 10)、幼鼠的塞尔托利细胞(Sertoli cells)、猴的肾脏细胞(COS细胞)、通过SV40(COS-7,ATCC CRL1651)转化的猴的肾脏CVI细胞、人的胚肾细胞(HEK-293)、猴肾脏细胞(CVI，ATCC CCL-70)、非洲绿猴的肾脏细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人的子***细胞(HELA,ATCC CCL-2)等。优选的，本申请的宿主细胞是人HEK293细胞。

本申请还提供制备如上所述的双特异性抗体的方法，包括如下步骤：在适合表达双特异性抗体的条件下培养本申请的宿主细胞，并从细胞或细胞培养物上清液回收双特异性抗体。在一个实施方案中，制备本申请双特异性抗体的方法包括以下步骤：构建包含双特异性抗体编码基因的表达载体，通过瞬时转染宿主细胞的方法构建包含表达载体的宿主细胞，培养宿主细胞并收集细胞上清，纯化双特异性抗体。

合适的表达所述抗体的条件对于本领域技术人员来说应该是已知的，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。

分离和纯化双特异性抗体的方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本申请还提供包含本申请双特异性抗体、核酸、表达载体和/或宿主细胞的药物组合物。

在本申请的一些实施方案中，所述药物组合物还包括干细胞。示例性地，将本申请的双特异性抗体与干细胞共同孵育，在干细胞表面修饰双特异性抗体，双特异性抗体通过介导干细胞靶向定植到软骨细胞而与干细胞发挥协同修复作用。在本申请的一些实施方案中，优选所述干细胞为造血干细胞。

在本申请的一些实施方案中，本申请的药物组合物可以进一步包含药学可接受载体。药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

合适的药用载体的例子是本领域中公知的。可以通过公知的常规方法配制包含这类载体的药物组合物。在一些实施方案中，本申请的药物组合物中还可以含有其他用于治疗的活性成分。

本申请还提供本申请所述的双特异性抗体、核酸、表达载体、宿主细胞和药物组合物在制备用于治疗或者预防关节炎的药物中的用途。

关节炎选自包括骨性、类风湿性、强直性、反应性、痛风性、风湿性、化脓性关节炎。关节包括但不限于为手、手腕、脚趾、颈部、背部、膝盖和臀部等部位的关节。

本申请的药物组合物或药物可被制成悬液或凝胶液或呈液态的组织工程材料，在使用时，将本申请的药物组合物或药物注射在待修复的关节腔，或包埋在合适的组织工程用生物材料中制成硬组织工程材料，通过手术的方式植入在待修复的关节腔。

在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本申请，下面提供相关术语的定义和解释。

如本申请中所使用的，术语“CD34蛋白”是唾液白蛋白细胞表面跨膜蛋白，是造血干细胞的特异性标志物，当提及CD34蛋白的氨基酸序列时，其包括CD34蛋白的全长，还包括CD34的胞外片段。本领域技术人员应当理解，在CD34蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本申请中，术语“CD34蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。

如本申请中所使用的，术语“MATN3蛋白”是人母系蛋白3，是MATN3基因编码的寡聚胞外蛋白，当提及MATN3蛋白的氨基酸序列时，其包括MATN3蛋白的全长。本领域技术人员应当理解，在MATN3蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本申请中，术语“MATN3蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。

如本申请中所使用的，“蛋白功能区”是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。

如本申请中所使用的，术语“特异性结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。

如本申请中所使用的，术语“抗体”是指通常由两对多肽链，每对具有一条轻链(L链)和一条重链(H链)组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。各重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)组成。重链恒定区由3个结构域(C_H-1、C_H-2和C_H-3)组成，各轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成，轻链恒定区由一个结构域C_L组成，V_H和V_L区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，各重链/轻链对的可变区(V_H和V_L)分别形成抗体结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG或其突变体，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本申请中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。

如本申请中所使用的，术语“恒定区”包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下一种：C_H-1结构域，铰链(例如，上部铰链区、中间铰链区，和/或下部铰链区)结构域，C_H-2结构域，C_H-3结构域，或其变体或片段。例如，本申请中使用的抗原结合片段可包含具有C_H-1结构域的多肽链；具有C_H-1结构域、至少一部分的铰链结构域和C_H-2结构域的多肽；具有C_H-1结构域和C_H-3结构域的多肽链；具有C_H-1结构域、至少一部分铰链结构域和C_H-3结构域的多肽链，或者具有C_H-1结构域，至少一部分铰链结构，C_H-2结构域，和C_H-3结构域的多肽链。“C_H片段”包括C_H-1结构域，铰链结构域，C_H-2结构域和C_H-3结构域。

轻链恒定区包括来自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包括恒定kappa结构域和恒定lambda结构域中的至少一个。

如本申请中所使用的，术语“铰链区”包括重链分子的将C_H-1结构域连接至C_H-2结构域的那一部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，从而使两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可分为三个不同的结构域：上部、中部、和下部铰链结构域。

如本申请中所使用的，术语“Fab”是通过用木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理抗体分子所获得的片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。

如本申请中所使用的，术语“F(ab')₂”是通过用胃蛋白酶消化抗体分子铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量约为100,000Da并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。

如本申请中所使用的，术语“Fab'”是通过切割上述F(ab')₂的铰链区的二硫键而获得的抗体片段。Fab'可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理特异性识别并结合抗原的F(ab')₂来生产。

如本申请中所使用的，术语“Fv”是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段，由轻链可变区和重链可变区组成，二者通过非共价键结合在一起。

如本申请中所使用的，术语“scFv”是指包含抗体的V_H和V_L结构域的抗体片段，是通过连接子(linker)连接的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)的重组蛋白，连接子使得这两个结构域相交联以形成抗原结合位点，scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6，优选是由一个核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。

如本申请中所使用的，术语“VHH”是重链抗体的单独的可变区，具有抗原结合能力。

如本申请中所使用的，术语“连接子”是指连接两个多肽的肽，通常具有一定的柔性，其的使用不会使多肽原有结构和功能丧失。连接子是本领域技术人员已知的。连接子的制备可以采用本领域任何方法，例如，可以是合成的。

如本申请中所使用的，术语“IgG”是免疫球蛋白G的缩写，根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

如本申请中所使用的，术语“Fc区”是指可结晶段，相当于抗体分子的C_H-2和C_H-3结构域。

如本申请中所使用的，术语“治疗”指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述药物给予有需要的个体。

如本申请中所使用的，术语“预防”是指在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防关节炎)或延迟或阻止病症发生。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

实施例1 CD34×MATN3双特异性抗体分子的表达载体的构建

1、含Anti-CD34-V_L和Anti-MATN3 scFv片段的第一质粒的构建

根据目的基因序列及酶切位点设计引物，并使用聚合酶链式反应(PCR)分别扩增Anti-CD34-V_L序列、C_Lκ序列(图3A)和Anti-MATN3scFv序列(图3B)，扩增结束后将Anti-CD34-V_L序列和C_Lκ序列Overlap连接；其中，C_Lκ的氨基酸序列如SEQ ID No.23所示。

PCR反应根据PrimerStar Max酶说明书配制PCR扩增体系，PCR反应条件如下：95℃预变性10秒，然后进行35个循环的95℃变性10秒，55℃退火5秒和72℃延伸10秒，循环结束后72℃终延伸5分钟。扩增结束后通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离得到目标条带，随后将清晰的目标条带用AXYGEN凝胶回收试剂盒进行胶回收。

根据HindⅢ、BamHⅠ限制性内切酶说明书所述条件配制酶切体系，并根据所述酶切条件将真核载体pIL-15进行酶切，通过凝胶电泳、胶回收获得酶切产物即线性化载体(图4)，利用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit将Anti-CD34-V_L和C_Lκ的融合片段以及Anti-MATN3scFv片段同源重组到pIL-15载体上，随后经转化、抗性筛选、挑取克隆、抽提质粒，测序，得到构建成功的第一质粒。质粒经测序正确后可经转化、摇菌扩增后加入终浓度为20％的无菌甘油，放入-80℃冰箱保藏菌株。

2、含Anti-CD34-VH和含L234A，L235A和P329G突变的Fc区的第二质粒的构建。

通过PCR扩增得到三段氨基酸突变过的C_H片段，分别为C_H-1/2/3(图5)，通过Overlap PCR将C_H-1/2/3连接成为突变成功的C_H片段；PCR扩增得到Anti-CD34-V_H片段(图6)；其中，C_H-1的氨基酸序列如SEQ ID No.24所示，C_H-2的氨基酸序列如SEQ ID No.25所示，C_H-3的氨基酸序列如SEQ ID No.26所示。

将CH片段与Anti-CD34-V_H片段通过Overlap PCR连接，得到Anti-CD34-VH-C_H’片段(图7A)，并通过引物延伸信号肽得到Anti-CD34-VH-C_H片段(图7B)；

经HindⅢ、BamHⅠ限制性内切酶双酶切pIL-15得到线性化载体，将上述融合片段与pIL-15载体同源重组，经转化、AMP筛选、单克隆挑选、抽质粒、测序，得到构建成功的第二质粒。质粒经测序正确后可经转化、摇菌扩增后加入终浓度为20％的无菌甘油，放入-80℃冰箱保藏菌株。

实施例2 CD34×MATN3双特异性抗体的表达

1、准备细胞：取处于对数生长期的HEK293E细胞悬液计数，取所需细胞，于室温下1000rpm离心3min，弃上清，用适量Freestyle293培养基重悬细胞沉淀后，再次离心(此步骤目的为了洗去血清)；用Freestyle293培养基重悬至细胞密度为6×10⁶个/mL，置于培养箱中备用。

2、准备质粒：将第一质粒和第二质粒用Freestyle293培养基稀释至40ng/μL；按照每10⁶个细胞对应0.5μg质粒来量取质粒。

3、质粒与PEI混合：按质粒与PEI质量比例为1:5进行混合，混合均匀后室温静置15min。

4、转染：将质粒与PEI混合物加入准备好的细胞中，混合均匀后放入5％CO₂、125rpm、37℃的摇床培养箱培养；

其中，将第一质粒与第二质粒分别按质量比为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3的比例共转染细胞。

5、补液：4h后加入与Freestyle 293培养液等体积的SFM4HEK293培养基，终浓度为100μg/mL的G418和3.75mM的VPA溶液；24h后于培养液中补充TN1至终浓度为0.5％，加入1000×的Anti-clamping agent。

6、收样：测定细胞活率降至约50％时，4000rpm离心10min去除细胞沉淀，然后7000rpm离心20min分别收集表达上清，以上离心需在4℃条件下进行，最后经0.45μm微孔滤膜过滤后备用。

收集的样品经SDS-PAGE电泳后，以HRP-Goat-Anti-Human-IgG(H+L)抗体进行WB检测，根据目的蛋白条带确定最佳共转染比例。从图8可以看出，在第一质粒(L)与第二质粒(H)的质量比为1:1时，目的蛋白表达量较高，经非还原处理的样品分子量约为250kDa，经还原处理的样品分子量在50kDa与70kDa之间，条带单一。目的蛋白理论分子量约为210kDa，实际分子量偏大可能是由于抗体形成了多聚体、抗体发生糖基化或者电泳条件所影响，具体原因有待更进一步的研究。

实施例3 CD34×MATN3双特异性抗体的纯化

Protein A能特异性与IgG抗体的Fc区域亲和，MabSelect SuRe是一种Protein A亲和介质，在此使用HiTrap MabSelect SuRe预装柱纯化双特异性抗体

1、样品及溶液前处理：将获得的表达上清置于冰上待用；本实验所用溶液均采用0.22μm微孔滤膜过滤。

2、以1mL/min的流速使用浓度为20％的乙醇冲洗管路中可能存在的气泡及杂质，将体积为1mL的HiTrap MabSelect SuRe纯化柱连接至

蛋白纯化仪；

3、以1mL/min的流速使用10个柱体积的ddH₂O冲洗***及纯化柱，确保将乙醇冲洗干净；

4、以1mL/min的流速使用pH 7.2，20mM PB，150mM NaCl的平衡缓冲液平衡整个层析***至UV280基线及电导值平稳；

5、将表达上清以1mL/min的流速上样到纯化柱中，保证管路无气泡；

6、以1mL/min的流速使用平衡缓冲液冲洗至UV280基线及电导值平稳；

7、以1mL/min的流速使用约10倍柱体积的pH 5.0，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠除杂缓冲液除去杂蛋白；

8、以1mL/min的流速使用pH 3.0，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠洗脱双特异性抗体，并立即使用pH 9.0，1M Tris-HCl缓冲液将所收集蛋白的pH调至中性；

9、以1mL/min的流速使用约10个柱体积的50mM NaOH将纯化柱上的残余蛋白冲洗干净；

10、以1mL/min的流速使用10个柱体积的ddH₂O冲洗***及纯化柱；

11、以1mL/min的流速使用20％乙醇冲洗***及纯化柱，使***处于无菌环境中，且使用20％乙醇保存纯化柱；

12、蛋白样品超滤浓缩置换到PBS缓冲液中，测定浓度后，用无菌滤膜过滤，将蛋白分装置于-80℃冰箱保存。

纯化图谱见图9，纯化后所收集蛋白进行SDS-PAGE鉴定(图10)，可见纯化所得目的蛋白纯度约为70％，能满足亲和及体内实验需求。经非还原处理的样品分子量约为250kDa，经还原处理的样品分子量在50kDa与70kDa之间，WB检测情况一致。纯化得到目的蛋白后，将缓冲液置换为PBS，测定蛋白浓度并经过无菌过滤后，将蛋白分装于-80℃保存，本申请的制备方法CD34×MATN3双特异性抗体的产量约为22mg/L。

实施例4 CD34×MATN3双特异性抗体抗原亲和力检测

本实施例中，将抗原/抗体固定在CM5芯片上，检测抗原抗体亲和力，过程如下：

1、从PBS里将CM5芯片取出，使用ddH₂O洗涤后，用液氮将芯片吹干，将芯片放进芯片壳中，执行change chip指令，按照指示方向放入芯片；

2、将缓冲液入口管用无尘纸擦干后放入新鲜配制的PBS中，执行change buffer指令；

3、获取合适的配体固定浓度及pH值：用pH＝4.5、5.0、5.5的Acetate将配体稀释成不同浓度，设置pH Scouting程序：结合180s，流速10μL/min，然后用50mM NaOH再生30s，流速30μL/min，(RL为目标RL的0.5倍到2倍的富集条件较为合适)；

4、使用步骤3获取的合适pH值及浓度的配体进行固定：固定buffer为PBS，设置配体固定程序：使用EDC+NHS 1:1混合物利用10μL/min的流速，活化420s，固定时间根据步骤3来设定，乙醇胺封闭420s；(RL的70％-80％为目标RL的0.5-2倍时条件较为合适)

5、进行Binding test，获取合适的解离时间及再生条件：设置Binding test的程序：使用10μL/min流速结合120s，解离120s，使用pH＝2.5(需要根据不同的实验来确定再生Glycine的pH值)的Glycine利用30μL/min流速，再生30s；

6、动力学常数测定实验：设置浓度梯度组及相应的重复组，且在开头和结尾各设置两个空白组，以观察基线是否稳定；将缓冲液入口管用无尘纸擦干后放入新鲜配制的HBS-EP中，执行change buffer指令；使用HBS-EP倍比稀释分析物，设置动力学常数测定程序：结合120s，解离120s，流速30μL/min，start up 5个循环；再生试剂为Gly2.5；再生时间30s；流速30μL/min；

7、实验结束后，执行change chip指令，将芯片换成维护芯片，使用过的芯片需要记录已使用通道，将其泡在PBS溶液中；将Buffer换成超纯水；

8、使用1:1结合模型对数据进行分析。

检测CD34-Fc抗原与Anti-CD34-scFv和CD34×MATN3的结合与解离情况，见图11，所测得的亲和力参数表2所示；检测MATN3-Fc抗原与Anti-CD34-scFv和CD34×MATN3的结合与解离情况，见图12，所测得的亲和力参数表2所示。

可见所得到CD34×MATN3与CD34-Fc、MATN3-Fc两抗原对应的亲和力分别为KD＝8.53nM、KD＝8.95pM，具有较高的亲和力，能满足后续实验要求。

表1 Anti-CD34-scFv和CD34×MATN3与CD34-Fc抗原的亲和力参数

表2 Anti-CD34-scFv和CD34×MATN3与MATN3-Fc抗原的亲和力参数

实施例5 CD34×MATN3的靶向能力检测

1、软骨细胞提取及培养。

大鼠处死后于70％乙醇中浸泡5分钟；

将大鼠平铺在超净台中，剪开腿部皮肤及肌肉，切开髌骨韧带与髌骨，暴露关节腔；用无菌手术刀切下软骨，并将软骨切碎；将软骨加入无菌PBS润洗两遍，洗去血水；向软骨中加入1mL胰酶，于37℃摇床上消化半小时；吸去胰酶，加入1mL浓度为2mg/mL的Ⅱ型胶原酶，于37℃水浴4小时；加入完全培养基(含10％FBS与1％PS的DMEM培养基)1mL吹吸，将液体吸出，过200目细胞滤网；1000rpm离心3min，弃上清，沉淀用1mL培养基重悬，随后加入含4mL培养基的T25培养瓶中。

48小时后，去除未贴壁的细胞，以后每三天更换一次培养基，待细胞贴壁达80％左右，吸去原有培养基，加入无菌PBS轻轻冲洗，加入胰酶，放入培养箱中消化约3-5min，显微镜观察部分细胞呈流沙状时，加入完全培养基终止消化，1000rpm离心3min后，将细胞以2×10⁵个/mL的密度接种于培养皿中培养。

2、CD34×MATN3双特异性抗体与软骨细胞的亲和力检测

取生长良好的第三代软骨细胞，用胰酶消化，共三组，每组取5×10⁵个细胞，1000rpm离心3min，弃上清，用FACS(含2％FBS的PBS，需提前于4℃预冷)将细胞重悬至100μL；实验组加入10μg的CD34×MATN3，阳性对照组加入10μg的Anti-MATN3-scFv，阴性对照组加入10μg的PBS，于4℃孵育1小时；1000rpm离心3min，弃上清，加入500μL FACS重悬，重复清洗两次后，将细胞重悬至100μL；每组加入1μL FITC-Anti-human IgG(H+L)，于4℃避光孵育30min；

重复上述清洗步骤；将细胞用200μL FACS重悬，使用流式细胞仪FITC通道进行检测。具体检测结果见图13，与阴性对照相比，Anti-MATN3-scFv和CD34×MATN3与软骨细胞均有较好的亲和力，且CD34×MATN3与软骨细胞亲和优于对照Anti-MATN3-scFv，与SPR亲和力检测数据一致。

3、CD34×MATN3双特异性抗体与造血干细胞的亲和力检测

造血干细胞(HSCs)细胞复苏后，分为共8组，每组取5×104个细胞，按照软骨细胞的步骤处理后，第1实验组加入0.5μg的CD34×MATN3，第2实验组加入0.1μg，第3实验组加入0.05μg，第4实验组加入0.02μg，第5实验组加入0.01μg，第6实验组加入0.002μg，阳性对照组加入10μg的PE-anti-CD34，阴性对照组加入10μg的PBS，于4℃孵育1小时；随后按上述步骤清洗并重悬；每组加入1μLAPC-Anti-human IgG(H+L)，阳性对照组加入1μL PE-anti-CD34，于4℃避光孵育30min；重复上述清洗步骤；将细胞用200μL FACS重悬，使用流式细胞仪PE通道检测HSCs细胞的阳性率，使用APC通道检测不同浓度双特异性抗体与HSCs细胞的亲和，见图14，由图可知CD34×MATN3与HSCs细胞的亲和较好，且二者的亲和与CD34×MATN3加入量相关。加入0.1μg双特异性抗体时，已能结合超过95％的HSCs细胞。

4、CD34×MATN3体外靶向能力检测

由于在HSCs修饰CD34×MATN3后，期望其靶向软骨部位进行修复，故通过慢病毒感染技术构建了293T-Anti-MATN3-scFv-GFP与293T-GFP细胞株，以293T-GFP细胞株作为对照(第1实验组)，观察293T-Anti-MATN3-scFv-GFP细胞(第2实验组)是否能够靶向软骨细胞，确定软骨部位MATN3抗原的表达；进而观察软骨片是否能吸附修饰了CD34×MATN3的HSCs细胞，即在体外证明其靶向能力，实验过程如下。

1)293T-Anti-MATN3-scFv-GFP细胞池构建

慢病毒感染前一天将293T细胞以1×10⁵个细胞/mL的密度将细胞均匀铺在6孔板中，于恒温静置培养箱中培养。待细胞汇合度约为50％时可进行感染，感染前将病毒、Polybrene于冰上慢慢融化，计算所需病毒：所需病毒(μL)＝细胞数*MOI/滴度(6孔板长满约2E6个细胞，293T细胞MOI值为1-3)，所用Polybrene浓度为1μg/mL。将DMEM、慢病毒及Polybrene混合均匀，将原有培养基弃掉后，加入三者混合物500μL，于恒温培养箱中静置培养；感染4小时后，每孔补入完全培养基500μL。感染后24小时，为减少对细胞的伤害，将含病毒的培养基换为新鲜的完全培养基。感染后48小时，需要将在培养基中加入2μg/mL的Puromycin以筛选稳定细胞株，之后约每2-3天更换培养基，至未感染目的基因的Blank组细胞被杀光，将稳定细胞池继续加压扩大培养，使用含10％DMSO的培养基冻存于液氮罐中。在细胞池培养过程中使用流式细胞仪检测Anti-MATN3-scFv基因的表达情况，由于此基因能表达抗体，故在此可直接加入APC-Anti-human IgG(H+L)二抗进行检测，并使用FITC通道及APC通道分别检测GFP与Anti-MATN3-scFv基因的表达情况。由图15可知，两个稳定细胞池的荧光效率均达到90％以上，满足后续实验要求。与空白293T相比，稳定细胞池几乎100％的细胞能表达GFP(第1实验组和第2实验组)；由图16可知，稳定细胞池几乎100％的细胞能表达Anti-MATN3-scFv(第2实验组)，故此细胞池构建成功，几乎100％的细胞成功整合外源基因。

2)293T-Anti-MATN3-scFv-GFP细胞对软骨片的亲和检测

大鼠处死后，于70％乙醇中浸泡5分钟；将大鼠平铺在超净台中，剪开腿部皮肤及肌肉，切开髌骨韧带与髌骨，暴露关节腔；切下几片软骨，PBS冲洗两次，放入平皿中备用。

复苏293T-GFP与293T-Anti-MATN3-scFv稳定细胞池，两个EP管中分别加入1×10⁶个细胞，另设置一组不加入细胞仅加入培养基作为空白对照；每管分别加入几片软骨片，于37℃孵育30min，将软骨片夹出来，在PBS中洗两次，使用荧光倒置显微镜记录实验结果。由图17可知，软骨片本身带一点绿色荧光，但其本身的荧光与细胞所带荧光较好区分，图为利用293T-Anti-MATN3-scFv-GFP细胞检测软骨片的MATN3表达情况，放大倍数为40倍，图17A&D为不加入细胞，即空白对照组的两张软骨片，图17B&E为加入293T-GFP细胞的软骨片，可见有部分细胞滞留在软骨片上，图17C&F为加入293T-Anti-MATN3-scFv-GFP细胞的软骨片，与前两组相比，软骨片明显能吸附更多的293T-Anti-MATN3-scFv-GFP细胞，印证了软骨片的确含较为丰富的MATN3抗原。

3)双特异性抗体介导HSCs靶向软骨片检测。

使用终浓度为0.5μM的CFSE染料对HSCs细胞进行标记后，将细胞用1mL培养基重悬，分成2份，冰上备用；其中0.5mL细胞加入2μg CD34×MATN3，另外0.5mL细胞加入1μLPBS，37℃孵育30min；1000rpm离心3min，弃上清，沉淀各用0.5mL PBS重悬，两管中分别加入几片软骨片，并设置无细胞仅加入软骨片的空白对照组，37℃孵育30min，将软骨片夹出后在PBS中清洗，使用荧光倒置显微镜记录实验结果。图18A&B分别是未加入细胞组，即空白对照组软骨片放大40倍与100倍的情况，可见软骨片自发绿色荧光，但与细胞所发荧光有所不同；图18C&D为加入CFSE处理过的HSCs对照组，可见细胞有非常少量的滞留；图18E&F为修饰了CD34×MATN3的HSCs实验组，与前两组相比，可见软骨片明显吸附更多的细胞，由此证明CD34×MATN3能介导HSCs细胞靶向软骨片。

实施例6 CD34×MATN3介导干细胞靶向修复软骨损伤

1、软骨损伤模型构建

实验材料为重量250-300g的SD雄性大鼠。将大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，置于恒温加热垫上，使其保持体温。使用剃毛器剔除膝关节附近的毛发，使用手术刀沿膝关节内侧打开皮肤，沿髌骨韧带切开肌肉组织；先将大鼠腿伸直，然后将髌骨移到膝关节外侧，暴露关节腔；用1mm球形钻头将大鼠股骨滑槽两侧突起处软骨磨去；随后用生理盐水冲洗，碘伏擦洗，将大鼠腿伸直，并将髌骨复位；使用19mm圆针可吸收缝合线将伤口缝合；于大鼠腿部肌肉注射硫酸庆大霉素，并将其置于加热垫复温苏醒。手术后的三天，连续肌肉注射硫酸庆大霉素。造模时间为一个月。

2、给药处理

使用关节腔注射50μL细胞进行治疗，给药剂量为每个实验对象给药5×10⁵个细胞。本研究共设置PBS、MSCs、MSCs+HSCs、MSCs+HSCs-CD34×MATN3四组，每只大鼠左右膝关节腔均给药。基于先前流式细胞术实验，已确定当HSCs数量为5×10⁴时，加入0.1μgCD34×MATN3便可达到90％以上的结合率；在此研究中将按照此比例加入CD34×MATN3双特异性抗体。

将MSCs与HSCs于37℃水浴中复苏，复苏后均用PBS重悬，对于MSCs+HSCs实验组直接将两者1:1混匀即可，对于MSCs+HSCs-CD34×MATN3组，先往HSCs中加入一定量的CD34×MATN3，于37℃孵育30分钟，后使用PBS洗去未结合的CD34×MATN3，再将HSCs-CD34×MATN3与MSCs 1:1混匀即可。

将大鼠使用***吸入麻醉后，使用剃毛器将膝关节附近毛发除去，使用1mL注射器针头将大鼠关节腔按压出一道印子，随后使用胰岛素注射器腔内注射细胞，关节腔刺入应无阻力感，给药后应缓慢抽出针头，以免细胞外漏。

3、治疗效果检测

移植治疗后一个月，收获组织进行病理染色及免疫组化实验，观察HSCs的修复效果及CD34×MATN3引导HSCs靶向定植修复受损软骨的能力。由图19可见，空白组(软骨未损伤)股骨表面亮白有光泽，弹性较好，未见裂隙；PBS组股骨磨损较为严重，股骨表面未见白色光滑软骨，粗糙不平，可见明显裂隙；MSCs治疗组较PBS组有一定的修复效果，但表面仍然较为暗淡、粗糙；MSCs+HSCs治疗组股骨表面亮白，仅右侧有一小处暗区，整体修复效果尚可；与前面的治疗组相比，MSCs+HSCs-CD34×MATN3组软骨层明显较厚，有较好的弹性，色泽明亮，修复效果较好。

进一步使用番红-固绿(图20)、甲苯胺蓝(图21)病理染色观察组织切片发现，MSCs+HSCs-CD34×MATN3组软骨层更厚，软骨细胞排列更为整齐，修复效果最好。

进一步使用免疫组化分析了关节炎中常见病理标志物的表达情况，由图22、23、24、25可知，在使用干细胞进行软骨修复治疗后，COL2表达明显上调、COL10、MMP-13、MATN3表达明显下调。

由此可见，HSCs对于损伤的软骨有较好的修复能力，且加入CD34×MATN3能引导其靶向软骨损伤部位，提升修复效果。

实施例7 CD34×MATN3介导造血干细胞靶向修复软骨损伤

1、软骨损伤模型构建

实验材料为重量250-300g的SD雄性大鼠。将大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，置于恒温加热垫上，使其保持体温。使用剃毛器剔除膝关节附近的毛发，使用手术刀沿膝关节内侧打开皮肤，沿髌骨韧带切开肌肉组织；先将大鼠腿伸直，然后将髌骨移到膝关节外侧，暴露关节腔；用1mm球形钻头在大鼠股骨滑车沟打孔，直径2mm左右，磨掉软骨层；随后用生理盐水冲洗，碘伏擦洗，将大鼠腿伸直，并将髌骨复位；使用19mm圆针可吸收缝合线将伤口缝合；于大鼠腿部肌肉注射硫酸庆大霉素，并将其置于加热垫复温苏醒。手术后的三天，连续肌肉注射硫酸庆大霉素。造模时间为一个月。

2、给药处理

使用关节腔注射50μL细胞进行治疗，给药剂量为每个实验对象给药5×10⁵个细胞。共设置PBS、HSCs、HSCs-CD34×MATN3三组，每只大鼠左右膝关节腔均给药。将HSCs于37℃水浴中复苏，用PBS重悬并加入一定量的CD34×MATN3对HSCs进行修饰，于37℃孵育30分钟后使用PBS洗去未结合的CD34×MATN3。

将大鼠使用***吸入麻醉后，使用剃毛器将膝关节附近毛发除去，使用1mL注射器针头将大鼠关节腔按压出一道印子，随后使用胰岛素注射器腔内注射细胞，关节腔刺入应无阻力感，给药后应缓慢抽出针头，以免细胞外漏。

3、治疗效果检测

治疗后一个月，收获组织进行病理染色及免疫组化实验，观察HSCs的修复效果及CD34×MATN3引导HSCs靶向定植修复受损软骨的能力。由图26可见，PBS组的磨损未得到有效修复，仍然可见损伤圆孔；HSCs治疗组较PBS组有明显修复效果，但修复区域表面仍然较为暗淡、粗糙；与前面的治疗组相比，HSCs-CD34×MATN3组软骨层明显较厚，有较好的弹性，色泽明亮，修复效果较好。根据此结果，CD34×MATN3双特异性抗体有效介导了HSCs在软骨损伤部位的靶向定植，从而促进了软骨组织的再生修复。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 一种双特异性抗体、制备方法和用途

<130> 0000

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn

1               5                   10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser

1               5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr Thr

1               5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His

1               5                   10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Phe Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Cys Tyr Tyr Asn Tyr Asp Asp Glu Gly Arg Ala Met Asp Tyr

1               5                   10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1               5                   10

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr

1               5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr

1               5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1               5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala

1               5

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Ala Arg Gly Gln Gly Tyr Trp Phe Asp Pro

1               5                   10

<210> 13

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Leu Gln Gln Gly Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Ser Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210> 14

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Gln Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Phe Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met His Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Cys Tyr Tyr Asn Tyr Asp Asp Glu Gly Arg Ala Met Asp Tyr

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210> 15

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210> 16

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Gln Gly Tyr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210> 17

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1               5                   10                  15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

            20                  25                  30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

        35                  40                  45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

    50                  55                  60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65                  70                  75                  80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                85                  90                  95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

            100                 105                 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

        115                 120                 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

    130                 135                 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145                 150                 155                 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

                165                 170                 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

            180                 185                 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

        195                 200                 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

    210                 215                 220

Pro Gly Lys

225

<210> 18

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1               5                   10                  15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

            20                  25                  30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

        35                  40                  45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

    50                  55                  60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65                  70                  75                  80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                85                  90                  95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

            100                 105                 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

        115                 120                 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

    130                 135                 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145                 150                 155                 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

                165                 170                 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

            180                 185                 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

        195                 200                 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

    210                 215                 220

Pro Gly Lys

225

<210> 19

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60

ctcacttgtc gggcaagtca ggacattggt agtagcttaa actggcttca gcaggggcca 120

gatggaactt ttaaacgcct gatctacgcc acatccagtt tagattctag tgtccccaag 180

aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240

gaagattttg tagactatta ctgtctacaa tatgctagtt ctccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaatcaa acga 324

<210> 20

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctgatgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact agctactaca tgcactgggt gaagcagagc 120

caaggaaaga gccttgagtg gattggattt attgatcctt tcaatggtgg tattacatac 180

aaccagaaat tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca gatcttccag cacagcctac 240

atgcatctca gaagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatgctac 300

tataattacg acgacgaggg gagggctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360

gtctcatca 369

<210> 21

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gacgtccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tcccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagc tggagatcaa acgt 324

<210> 22

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggccaa 300

gggtattggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

<210> 23

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1               5                   10                  15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

            20                  25                  30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

        35                  40                  45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

    50                  55                  60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65                  70                  75                  80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

                85                  90                  95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

            100                 105

<210> 24

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 24

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1               5                   10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

            20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

        35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

    50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                85                  90                  95

Lys Val

<210> 25

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1               5                   10                  15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

            20                  25                  30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

        35                  40                  45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

    50                  55                  60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65                  70                  75                  80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

                85                  90                  95

Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

            100                 105                 110

<210> 26

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1               5                   10                  15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

            20                  25                  30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

        35                  40                  45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

    50                  55                  60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65                  70                  75                  80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

                85                  90                  95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

            100                 105

Claims (19)

1.一种双特异性抗体，其特征在于，包括：

特异性结合干细胞表面抗原的第一蛋白功能区，所述第一蛋白功能区为抗干细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段；

特异性结合软骨细胞表面抗原的第二蛋白功能区，所述第二蛋白功能区为抗软骨细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述干细胞为造血干细胞。

3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述干细胞表面抗原为CD34。

4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述软骨细胞表面抗原为MATN3。

5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，

所述第一蛋白功能区的轻链可变区包含如SEQ ID No.1-3所示的CDR，重链可变区包含如SEQ ID No.4-6所示的CDR；

所述第二蛋白功能区的轻链可变区包含如SEQ ID No.7-9所示的CDR，重链可变区包含如SEQ ID No.10-12所示的CDR。

6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，

所述第一蛋白功能区选自全长免疫球蛋白、Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv、scFv或VHH；和/或，

所述第二蛋白功能区选自全长免疫球蛋白、Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv、scFv或VHH。

7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白功能区为全长IgG1免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为scFv。

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其特征在于，所述scFv为轻链可变区-第一连接子-重链可变区，所述scFv的轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过第二连接子相应地连接在所述全长IgG1免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；或，

所述scFv为重链可变区-第一连接子-轻链可变区，所述scFv的重链可变区N末端或轻链可变区C末端通过第二连接子相应地连接在所述全长IgG1免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端。

9.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述scFv的数量为两个，分别对称地连接在所述全长IgG1免疫球蛋白轻链的C末端。

10.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一连接子和所述第二连接子各自独立地包含选自GS、GGSG、GGGS和GGGGS序列的重复。

11.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述全长免疫球蛋白的恒定区来源于IgG或IgG突变体。

12.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其特征在于，所述恒定区与野生型IgG1恒定区相比，包含L234A，L235A和P329G的氨基酸替换。

13.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-12任一项所述的双特异性抗体。

14.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求13所述核酸。

15.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求13所述的核酸或权利要求14所述的表达载体。

16.一种制备权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

在适合表达所述双特异性抗体的条件下培养权利要求15所述的宿主细胞；

收集并纯化所述双特异性抗体。

17.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1-12任一项所述的双特异性抗体、如权利要求13所述的核酸、如权利要求14所述的表达载体、或如权利要求15所述的宿主细胞。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，还包含干细胞；优选地，所述干细胞为造血干细胞。

19.如权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗体、如权利要求13所述的核酸、如权利要求14所述的表达载体、如权利要求15所述的宿主细胞在制备用于治疗或者预防关节炎的药物中的用途。

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