KR20080036648A - 이형 교차 방어를 유도하는 로타바이러스 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Gx 타입 또는 Py 타입도 아닌 로타바이러스 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 GxPy 타입의 감약된 로타바이러스 균주를 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하여 로타바이러스 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

Description

이형 교차 방어를 유도하는 로타바이러스 백신 {ROTAVIRUS VACCINE INDUCING HETEROTYPIC CROSS PROTECTION}

본 발명은 로타바이러스 백신 제형에 관한 것이다. 본 발명은 한 타입의 로타바이러스로부터의 감약된 로타바이러스 개체군의, 또 다른 타입의 로타바이러스 감염과 관련된 질병의 예방에 있어서의 용도에 관한 것이다.

급성 감염성 설사는 세계 각지의 질병 및 사망의 주요 원인이다. 개발 도상국에서 설사 질환의 영향은 매우 대단하다. 아시아, 아프리카 및 라틴 아메리카에서는 매년 30 내지 40억명의 설사 환자가 존재하고, 이중 약 500만 내지 1000만명이 사망하는 것으로 추정되고 있다 (Walsh, J.A. et al.: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)).

로타바이러스는 유아 및 연소한 아동의 중증 설사의 가장 중요한 원인중 하나로 인지되고 있다 (Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition, edited by Fields et al., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). 로타바이러스 질병으로 매년 백만명 이상이 사망하는 것으로 추정된다. 로타바이러스에 의해 유도된 질병은 6 내지 24개월의 연령의 아동에게 가장 일반적으로 영향을 미치고, 이러한 질병의 최고 이환율은 일반적으로 온대 성 기후의 서늘한 달, 및 열대 지역의 연중 동안 발생한다. 로타바이러스는 통상적으로 약 1 내지 약 3일의 잠복 기간으로 배설물-경구 경로에 의해 인간 대 인간으로 전염된다. 6개월 내지 24개월 연령 그룹에서의 감염과는 달리, 신생아는 일반적으로 징후가 없거나 단지 가벼운 질환을 지닌다. 연소한 아동에서 일반적으로 조우되는 중증 질병과는 대조적으로, 대부분의 성인은 기존의 로타바이러스 감염의 결과로 방어되어, 성인 감염은 가벼운 감염이거나 징후가 없다 (Offit, P.A. et al. Comp. Ther., 8(8):21-26, 1982).

로타바이러스는 일반적으로 구의 형태이고, 이의 명칭은 이의 독특한 외부 및 내부 또는 이중-쉘(shell) 캡시드 구조로부터 유래된 것이다. 통상적으로, 로타바이러스의 이중-쉘 캡시드 구조는 내부 단백질 쉘 또는 게놈을 함유하는 코어를 둘러싼다. 로타바이러스의 게놈은 11개 이상의 별개의 바이러스 단백질을 엔코딩하는 이중가닥 RNA의 11개 분절로 구성되어 있다. VP4 및 VP7로 명명된 상기 바이러스 단백질중 2개는 이중쉘 캡시드 구조의 외부에 배열된다. 로타바이러스의 내부 캡시드에는 VP6으로 명명된 로타바이러스 단백질인 하나의 단백질이 존재한다. 로타바이러스 감염에 따른 면역 반응의 유도에서의 상기 3개의 특정 로타바이러스 단백질의 상대적 중요성은 아직 명백하지 않다. 그럼에도 불구하고, VP6 단백질은 그룹 및 서브그룹 항원을 결정하고, VP4 및 VP7 단백질은 혈청형 (중화 검정에 의해 결정된 타입) 및 유전자형 (비-혈청학 검정에 의해 결정된 타입) 특이성의 결정인자이다. G 혈청형 및 G 유전자형에 대한 도안은 동일하다. 반대로, P 혈청형 및 유전자형으로 할당된 번호는 상이하다 (Santos N. et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56). 따라서, P 혈청형은 P와 이후에 할당된 번호로서 명명되며, P 유전자형은 P와 그 후에 할당된 괄호안의 번호로 명명된다.

오늘날 까지, 적어도 14개의 로타바이러스 G 혈청형 및 11개의 로타바이러스 P 혈청형이 확인되었다 (Santos N. et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56). 이들 중에서, 10개의 G (G1-6, G8-10 및 G12) 혈청형 및 9개의 P (P1, P2A, P3, P4, P5A, P7, P8, P11 및 P12) 혈청형이 인간 로타바이러스 중에서 확인되었다. 23개 P 유전자형은 이들중 10개가 인간 (P[3]-[6], P[8]-[11], P[14] 및 P[19])로부터 회수된 것으로 기술되어 있다.

VP7 단백질은 균주에 따라 게놈 분절 7, 8 또는 9의 번역 생성물인 38,000 MW의 당단백질 (당화되지 않은 경우, 34,000 MW)이다. 이러한 단백질은 로타바이러스 감염 후 중화 항체의 형성을 자극한다. VP4 단백질은 게놈 분절 4의 번역 생성물인 약 88,000 MW의 당화되지 않은 단백질이다. 이러한 단백질은 또한 로타바이러스 감염 후에 중화 항체를 자극한다.

VP4 및 VP7 단백질은 중화 항체에 의해 표적화되는 바이러스 단백질로, 이들은 로타바이러스 질병에 대한 방어를 제공하는 로타바이러스 백신의 개발에서 주요 후보자인 것으로 여겨진다.

초기 유년기 동안의 천연 로타바이러스 감염은 방어 면역을 유도하는 것으로 공지되어 있다.

이와 같이, 감약된 생 로타바이러스 백신이 매우 바람직하다. 적합하게는, 이는 경구용 백신이어야 하는데, 이는 바이러스 감염의 자연적 경로이기 때문이다.

로타바이러스 감염을 예방하기 위한 초기의 백신 개발은 바이러스의 발견 후 1970년대에 시작되었다. 최초로, 동물 및 인간으로부터 감약된 균주가 연구되었으며, 혼동되거나 실망스러운 결과를 나타냈다. 보다 최근의 연구는 인간-동물 재조합체에 초점을 맞추고 있으며, 이는 보다 성공적이었다.

89-12로서 공지된 로타바이러스 균주는 워드 (Ward)에 의해 기술되어 있다: US 특허 5,474,773 및 문헌 [Bernstein, D.L. et al., Vaccine, 16 (4), 381-387, 1998] 참조. 89-12 균주는 1988년 자연적 로타바이러스 병을 앓는 14개월 유아로부터 수집된 대변 표본으로부터 분리되었다. US 특허 5,474,773에 따르면, HRV 89-12 인간 로타바이러스는 문헌 [Ward in J.Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984]에 기술된 바와 같이 일차 아프리카 그린 원숭이 신장 (AGMK) 세포에서 2계대 및 MA-104 세포에서 4 계대에 의해 배양 적합화되었다. 그 후, MA-104 세포에서 3회 플라크 정제되고 (9계대까지), 이들 세포에서 추가로 2계대 후 성장시켰다. 기탁 번호 ATCC VR 2272로 ATCC에 기탁하기 위해 하나의 추가적 계대를 제조하였다 (12 계대). 기탁된 균주는 89-12C2로 알려져 있다.

번스타인 (Bernstein) 등의 백신 (Vaccine)에 기재된 1998년 논문은 논문 백신 [Vaccine (1998) paper]으로서 하기에 참조되었다. 본 논문은 경구 투여된 생 인간 로타바이러스 백신 후보의 안정성 및 면역원성을 기술하고 있다. 이러한 백신은 일차 AGMK 세포에서 플라크 정제 없이 26회 계대배양한 후, 성립된 AGMK 세포주에서 또 다시 7회 계대배양함으로써 (총 33회 계대배양) 감약된 균주 89-12로부 터 수득되었다.

이하에서 연속 26회 계대배양된 상기 물질은 P26으로서 명명되며, 연속 33회 계대배양된 상기 물질은 P33으로서 명명된다. 일반적으로, 89-12를 n회 계대배양함으로써 유래된 로타바이러스는 Pn으로서 명명될 것이다.

하기 실시예에서는, P33 물질을 베로 세포 (Vero cell)에서 추가로 5회 계대배양하였다. 이는 P38로 명명하였다.

논문 백신 (1998)에 기술된 P26 및 P33은 기탁기관에 기탁되지 않았으며, 이들의 유전적 특성을 확립하기 위해 분석되지도 않았다.

문헌에 기술된 P26이 변이체의 혼합물을 포함한다는 것이 이제 밝혀졌다. 이는 하기 기술된 바와 같은 유전적 특성 결정에 의해 확립되었다 (실시예 참조). 따라서, P26은 추가의 계대배양을 위한, 특히, 백신 로트(lot)의 생성을 위한 신뢰성있는 일관된 개체군이 아니다. 유사하게는, P33은 변이체의 혼합물을 포함하며, 백신 로트 생성을 위한 신뢰성있게 일관되지 않는다.

P26 물질은 3개 이상의 VP4 유전자 변이체의 혼합물인 것으로 밝혀졌다. P33 및 P38은 유사하게 두개 변이체의 혼합물이다. 이들 변이체는, 이들 변이체에 대한 P33으로 백신화된 유아로부터의 혈청의 중화 항체 역가를 평가하는 경우, ATCC에 기탁된 89-12C2 균주와 중화 에피토프에 있어서 항원적으로 상이한 것으로 보여진다.

게다가, P33 물질이 유아에게 투여되는 경우, 2개의 확인된 변이체가 복제되고 분비되는 것으로 밝혀졌다. 100명의 백신화된 유아중, 단지 2명만이 로타바이 러스 감염으로 인한 장염의 증후를 나타낸 반면, 플라세보 군중 20%는 감염이 되었다. 이러한 발견은 확인된 변이체가 로타바이러스 질환으로부터의 방어와 관련있음을 시사한다.

WO01/12797에는 로타바이러스 변이체를 분리하는 방법 및 클로닝된 (상동성) 인간 로타바이러스 균주로부터 유래된 개선된 감약된 생 로타바이러스 백신이 기재되어 있다. 또한, 단일 변이체 또는 실질적으로 단일 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 VP4 및 VP7로서 설계된 주요 바이러스 단백질중 하나 이상을 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 의해 규정됨을 특징으로 하는 감약된 로타바이러스 개체군 (분리물)이 기재되어 있다. G9 이종 균주에 대한 이러한 경구용의 감약된 인간 로타바이러스 백신의 방어 효과는 라틴 아메리카 유아들에서 보고되었다 (Perez et al. 42nd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC 2002) 27-30 September 2002, San Diego). WO 05/021033에는 하나의 로타바이러스 혈청형이 또 다른 혈청형으로부터 초래된 질환으로부터 방어하는데 이용될 수 있음을 기술하고 있다. 특히, WO 05/021033에는 G1 로타바이러스 개체군 [예를 들어, 유럽 콜렉션 오브 애니멀 셀 컬쳐 (European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), 백신 리서치 앤드 프로덕션 라보라토리 (Vaccine Research and Production Laboratory), 퍼블릭 헬스 라보라토리 서비스 (Public Health Laboratory Servie), 센터 퍼 아플라이드 마이크로바이올로지 앤 리써치 (Centre for Applied Micrbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Willtshire, SP4 0JG, United Kingdom)에 부다페스트 협약하에 1999년 8월 13일 기탁 번호 99081301 로 기탁됨, 또한, P43 또는 RIX4414로 불림]의 G1 및 하나 이상의 비-G1 로타바이러스 혈청형 예컨대, 비제한적으로, G2, G3, G4 및 G9 로타바이러스 혈청형 둘 모두에 의해 초래된 질환을 예방하는데 있어서의 용도가 기술되어 있다.

WO 01/12797 및 WO 05/021033의 전체 문헌은 본원에 참고문헌으로 인용되었다.

도면의 간단한 설명

도 1A (SEQ ID NO:1)는 P43의 VP4 단백질을 엔코딩하는 서열을 포함하는 P43 (RIX4414) VP4 유전자의 누클레오티드 서열이다.

도 1B (SEQ ID NO:2)는 시퀀싱 기법에 의해 유전자의 양 말단으로부터의 추가적인 누클레오티드 및 누클레오티드 치환부를 갖는다 (굵은체 - 18번 위치에서 C 대신에 G로 대체하여, TCA 대신에 TCG를 생성시켰으며, 그러나, 생성된 엔코딩된 단백질에는 영향을 끼치지 않음). 비코딩 서열은 소문자로 나타내었다. 도 1B는 P43 기탁물에 대한 정확한 서열을 나타낸다.

도 2A (SEQ ID NO:3)은 P43의 VP7 단백질을 엔코딩하는 서열을 포함하는 P43 (RIX4414) VP7 유전자의 누클레오티드 서열이다.

도 2B (SEQ ID NO:4)는 시퀀싱 기법으로 인한 유전자의 양 말단으로부터의 추가적인 누클레오티드 및 누클레오티드 치환부를 갖는다 (굵은체 - 58번 위치에서 C 대신에 A로 대체하여, 류신을 코딩하는 CTT 대신에 이소류신을 코딩하는 ATT 생성). 비코딩 서열은 소문자로 나타내었다. 도 2B는 P43 기탁물에 대한 정확한 서열을 나타낸다.

도 3 (SEQ ID NO:5)는 RIX4414 VP4의 폴리펩티드 서열이다.

도 4 (SEQ ID NO:6)은 RIX4414 VP7의 폴리펩티드 서열이다.

도 5 (SEQ ID NO:7)은 RIX4414의 NSP4의 폴리펩티드 서열이다.

도 6 (SEQ ID NO:8)은 RIX4414의 NSP4 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열이다. 비코딩 서열은 소문자로 나타내었다.

도 7 (SEQ ID NO:9)는 RIX4414의 VP6 단백질의 폴리펩티드 서열이다.

도 8 (SEQ ID NO:10)은 RIX4414의 VP6 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열이다. 비코딩 서열은 소문자로 나타내었다.

본 발명에서 본 발명자들은 감약된 로타바이러스 개체군 예를 들어, WO01/12797에서 특성결정된 바와 같은 개체군이 백신으로서 사용되어 백신에 사용된 것과 상이한 타입 (혈청형 및/또는 유전자형)의 로타바이러스 감염에 의해 초래된 질환에 대해 교차 방어를 제공할 수 있다. VP7 단백질은 G 타입 (혈청형)을 구체화하며, VP4 단백질은 균주의 P 타입 (혈청형 또는 유전자형)을 구체화한다.

특히, 본 발명은 상이한 P 타입으로부터 로타바이러스 감염과 관련된 질환의 예방에서 하나의 P 타입으로부터의 감약된 로타바이러스 개체군의 용도, 및 특히, Gx 또는 Py 타입도 아닌 로타바이러스 균주에 의해 초래된 로타바이러스 감염과 관련된 질환의 예방 및/또는 면역 반응의 유도시 GxPy 타입으로부터의 감약된 로타바이러스 개체군 또는 균주의 용도에 관한 것이다.

면역원성은 백신에 대한 항체 반응을 중화시키거나 혈청 로타바이러스 IgA 항체 반응 예컨대, 청전환인자에 의해 측정될 수 있다 (즉, 문헌 [Ward et al., 1990, J. Infect. Disease, 161, 440-445]에 기술된 바와 같이 백신접종 후 혈청 항체 IgA 수준에서 ≥3배 증가).

본 발명의 문맥상 그리고, 당해분야의 통상적인 이해와 일관되게 (Santos N. et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56), Gx는 특이적 G 타입 즉, G 유전자형 또는 G 혈청형 (두 용어는 동일함)을 나타내는 반면, Py 용어는 일반적으로 특이적 P 타입 즉, P 혈청형 (예를 들어, P8, P4) 또는 P 유전자형 (예를 들어, P[4], P[8])을 나타낸다. 특이적 P 유전자형을 나타낸는 경우, 괄호안에 할당된 번호를 갖는 P로서 나타낼 것이며; P 타입은 혈청형 또는 유전자형이다.

본 명세서에 걸쳐, 로타바이러스 질환의 예방에 있어서 백신 조성물의 제조시 본 발명에 따른 백신 조성물의 용도, 또는 상기 백신 조성물을 사용하는 것을 포함하는 치료 방법과 같은 문구는 상호교환적으로 사용될 것이다.

본 발명자들은 GxP[8] 로타바이러스 개체군 (예를 들어, ECACC, 백신 리서치 앤드 프로덕션 라보라토리, 퍼블릭 헬스 라보라토리 서비스, 센터 퍼 아플라이드 마이크로바이올로지 앤 리써치에 부다페스트 협약하에 1999년 8월 13일 기탁 번호 99081301로 기탁된 바와 같은 G1P[8])은 Gx 또는 Py 타입도 아닌 하나 이상의 로타바이러스 균주 및 GxP[8] (예를 들어, G1P[8]) 둘 모두에 의해 초래된 질환을 예방하는데 사용될 수 있음을 결정하였다. 특히, 본 발명자들은 G1P[8] 로타바이러스 개체군이 하나의 G1P[8] 및 하나 이상의 비-G1P[8] 유전자형 예컨대, G2P[4] 로타바이러스 유전자형 둘 모두에 의해 초래된 질환을 예방하는데 사용될 수 있음을 결정하였다.

따라서, 본 발명은 한 타입의 로타바이러스 타입으로부터의 감약된 로타바이러스 개체군의, 또 다른 타입의 로타바이러스 타입으로부터의 로타바이러스 감염과 관련된 질환의 예방에서 용도에 관한 것이며, 여기서, 타입은 로타바이러스 VP4 단백질 (P 타입)의 서열을 기준으로 하여 적합하게 규정된다.

본 발명은 또한, 한 로타바이러스 균주 (특이적 G 타입 및 P 타입 둘 모두에 의해 규정됨)로부터의 감약된 로타바이러스 개체군의, 또 다른 로타바이러스 균주로부터의 로타바이러스 감염과 관련된 질환 예방에서의 용도에 관한 것이며, 여기서, 균주는 로타바이러스 VP4 단백질 (P 타입) 및 VP7 단백질 (G 타입) 둘 모두의 서열을 기준으로 하여 적합하게 규정된다. 특히, 본 발명은 Gx 또는 Py 타입도 아닌 로타바이러스 균주에 의해 초래된 로타바이러스 감염에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조시 GxPy 타입으로부터의 감약된 로타바이러스 균주의 용도에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 로타바이러스 균주는 G 타입 및 P 타입 둘 모두와 상이한 제 2 로타바이러스의 감염에 의해 초래된 질병을 예방하는데 사용될 수 있다.

특히, 청구된 본 발명의 모든 양태에서, 상기 면역 반응은 방어성 면역 반응이다. 적합하게는, 로타바이러스 개체군은 교차 방어 효과를 제공하기에 적합한 ECACC 기탁번호 99081301로부터의 VP4 및/또는 VP7 바이러스 단백질을 포함한다.

문헌에 걸쳐, 교차-방어는 상이한 타입의 로타바이러스에 의해 초래된 감염에 대한 로타바이러스 타입에 의해 제공된 방어이다. 교차-방어는 상동성이거나 이종성일 수 있다. 상동성 교차-방어는 G 또는 P 타입의 균주에 대한 로타바이러스 균주에 의해 제공된 방어이며, 예컨대, G1P[8] 균주는 P[8] 타입에 의해 비-G1, P[8] 균주 (예를 들어, G2P[8])에 대한 교차-방어를 제공한다. 상동성 교차-방어의 또 다른 예는 G1 타입에 의해 G1 비-P[8] 균주 (예를 들어, G1P[4])에 대한 G1P[8] 균주에 의해 제공된다. 이종성 교차-방어는 상이한 P 및 G 타입의 로타바이러스 균주에 대하여 로타바이러스 균주에 의해 제공된 방어 예를 들어, 비 G1-비 P[8] 균주에 대하여 G1P[8] (예를 들어, G2P[4])에 의해 제공된 방어이다 (G 및 P 타입 둘 모두에 의해 제공된 이종성 방어).

적합하게는, 감약된 로타바이러스 혈청형은 G1이며, 또한, G1 및 비-G1 로타바이러스 혈청형 예컨대, G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 및 G14로 구성된 군으로부터 선택된 혈청형에 의해 초래된 질환에 대한 교차 방어를 제공할 수 있다.

특히, G1 감약된 로타바이러스 개체군 [예를 들어, CACC, 백신 리서치 앤드 프로덕션 라보라토리, 퍼블릭 헬스 라보라토리 서비스, 센터 퍼 아플라이드 마이크로바이올로지 앤 리써치에 부다페스트 협약하에 1999년 8월 13일 기탁 번호 99081301로 기탁된 바와 같음]은 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 및 G14로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 적합하게는 2개 이상, 적합하게는, 3개 이상, 적합하게는, 4개 이상 및 G1에 의해 초래된 질환의 예방에 사용될 수 있다. 따라서, G1 타입으로부터가 아닌 로타바이러스 균주에 의해 초래된 로타바이러스 감염물에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물의 제조시 G1 타입으로부터의 감약된 로타바이러스 균주의 용도가 제공된다. 특정 양태에서, 면역 반응은 1개 이상, 2개 이상의 로타바이러스 비-G1 혈청형, 전형적으로, G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 및 G14로 구성된 군으로부터 선택된 혈청형에 대해 유도된다. 전형적으로, 면역 반응은 동종성 (G1) 방어 이외에 비-G1인 타입 G2, G3, G4 및 G9중 1개 이상, 적합하게는, 2개 이상, 적합하게는, 3개 이상에 대해 유도된다. 적합하게는, 조성물은 G1 및 G2 타입에 대해 면역 반응을 유도하는데 사용되며, G1 로타바이러스 균주를 포함한다.

적합하게는, 로타바이러스 감역된 균주 타입은 P[8]이며, P[8] 로타바이러스 타입 및 비-P[8] 로타바이러스 타입 예컨대, P[1], P[2], P[3], P[4], P[5], P[6], P[7], P[8], P[9], P[10], P[11], P[12], P[14] 및 P[19]로 구성된 군으로부터 선택된 타입에 대한 교차 방어를 제공할 수 있다.

특히, P[8] 감약된 로타바이러스 개체군 [예를 들어, CACC, 백신 리서치 앤드 프로덕션 라보라토리, 퍼블릭 헬스 라보라토리 서비스, 센터 퍼 아플라이드 마이크로바이올로지 앤 리써치에 부다페스트 협약하에 1999년 8월 13일 기탁 번호 99081301로 기탁된 바와 같음]은 P[8], 및 P[1], P[2], P[3], P[4], P[5], P[6], P[7], P[8], P[9], P[10], P[11], P[12], P[14] 및 P[19]로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-P[8] 로타바이러스 타입에 의해 초래된 질환의 예방에 사용될 수 있다.

적합하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 백신 조성물은 G1P[8] 로타바이러스 균주를 포함하며, G2P[4] 로타바이러스 균주에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명은 GxPy 타입의 감약된 로타바이러스 균주를 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 로타바이러스 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이며, 상기 조성물은 Gx 또는 Py 타입도 아닌 로타바이러스 균주에 대한 면역 반응을 유도한다.

특히, 본 발명은 로타바이러스 G1 혈청형 백신을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하여 로타바이러스 및 비-G1 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 적합하게는, 비-G1 로타바이러스 혈청형은 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 및 G14로 구성된 군으로부터 선택된다. 적합하게는, 조성물은 G1 로타바이러스 균주를 포함하며, G1 및 G2 타입에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용된다.

적합하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 백신 조성물은 G1P[8] 로타바이러스 균주를 포함하며, G2P[4] 로타바이러스 균주에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.

적합하게는, 백신 조성물내의 로타바이러스 개체군은 G1P1A (즉, 최근 명명법에 따라 G1P[8]) 균주 특이성을 갖는다. 적합하게는, 면역 반응을 유도하고, 전형적으로 교차 반응 효과를 제공하기에 적합한 ECACC 기탁물 99081301로부터의 VP4 및/또는 VP7 바이러스 단백질을 포함한다. 적합하게는, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 방법 또는 용도중의 G1P[8] 로타바이러스 균주에 관한 것이다. 전형적으로, 사용된 로타바이러스 백신은 ECACC 기탁물 99081301이거나, 상기 기탁물로부터 유래된다.

특정 양태에서, 백신은 비백신화된 개체 (플라세보 군으로부터)와 비교하여 백신화된 개체에서 장염에 대한 교차 방어성 면역 반응 또는 교차 방어를 유도한다. 적합하게는, 백신은 로타바이러스 감염 징후 예컨대, 설사 또는 장염에 대한 교차 방어를 제공한다. 예를 들어, 장염은 일일내에 정상적인 대변 보다 3회 이상의 수분이 많거나 무른 대변 또는 시험한 대변 표본에서 로타바이러스의 검출과 함께 구토를 특징으로 하는 설사로서 규정될 수 있다.

당업자에 의해 이해될 바와 같이, 백신화된 개체 또는 백신화된 개체군에서 방어성 면역 반응을 유도하는 백신접종의 효능 및 질환 중증도는 여러 수단에 의해 평가될 수 있다. 방어성 면역 반응은 로타바이러스 감염과 관련된 임상 징후의 중증도를 저하시키거나, 로타바이러스 감염에 대한 민감도를 저하시키는 면역 반응을 의미한다. 비백신화되거나 백신화된 개체에서 질환 중증도는 공개된 스코어링 시스템 예컨대, 20-포인트 베시카리 스케일 (Vesikari scale) 또는 이의 약간 변형된 버젼 (Ruuska T et al. Scand. J. Infect. Dis. 1990, 22, 259-267) 또는 로타바이러스 감염의 특이적 증상을 보고하고 등급화시키는 기타 적합한 시스템 (예컨대, 문헌 [Clark HF, Borian EF, Bell LM. Protective effect of WC3 vaccine against rotavirus diarrhea in infants during a predominantly serotype 1 rotavirus season. J Infect Dis. 1988:570-86]에 보고된 방법)에 따라 등급이 매겨질 수 있다. 베시카리 방법에 따라, 중증의 RVGE는 일반적으로 ≥11 스코어로서 규정된다.

방어는 개체군 또는 군 수준에서 백신 효능 (VE)에 의해 평가될 수 있다. 백신 효능은 하기와 같은 식에 의해 계산된다:

VE (%) = 1 - RR = 1 - (ARV/ARU)

여기서, RR = 상대적 위험성 = ARV/ARU

ARU = 비백신화된 개체군에서 질환 공격율 (플라세보 군으로부터 추정됨) = 하나 이상의 RV GE 에피소드를 나타내는 피검체의 수/대조군 피검체의 총 수

ARV = 백신화된 군에서 질환 발병율 = 하나 이상의 RV GE 에피소드를 나타내는 피검체의 수/HRV 백신군의 피검체의 총 수

따라서, 본 발명의 일 양태에서, GxPy 타입의 감약된 로타바이러스 균주를 포함하는 조성물이 로타바이러스-유도된 장염 적합하게는, Gx 또는 Py 타입도 아닌 로타바이러스 균주에 의해 초래된 중증 로타바이러스-유도된 장염에 대한 교차 방어 면역 반응 및/또는 방어를 유도하는 상기 기술된 바와 같은 방법 또는 용도를 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방어성 면역 반응은 적합한 스코어링 시스템에 따라 측정된 바와 같이 로타바이러스 유도된 질환을 소멸시키거나 질환의 중증도를 저하시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 방법 또는 조성물의 용도를 제공하여, 질환 예를 들어, 장염의 중증도를 저하시키거나, 로타바이러스 초래된 질환을 제거하는 방법 또는 용도로서, 상기 질환 중증도 또는 질환은 상기 교시된 바와 같이 임의의 적합한 스코어링 시스템에 따라 기록되는 방법 또는 용도를 제공한다.

또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 조성물중에 존재하는 감약된 로타바이러스의 유형과 상이한 유형의 로타바이러스의 감여에 의해 초래된 설사에 대해 백신화된 개체의 군집에서 60% 까지의 방어율, 적합하게는, 81% 까지의 방어율을 나타낸다. 도 다른 특이적 구체예에서, 상기 조성물은 Gx 또는 Py 타입도 아닌 로타바이러스 균주에 의해 초래된 설사에 대해 백신화된 개체 군집에서 40% 이상, 적합하게는, 45% 이상의 방어율, 적합하게는, 50% 이상의 방어율, 적합하게는 60% 이상의 방어율을 나타낸다. 특이적 양태에서, 상기 조성물은 Gx 또는 Py 타입도 아닌 로타바이러스 균주에 의해 초래된 설사에 대한 40% 내지 80% 방어율, 적합하게는, 50% 내지 70% 방어율을 타나낸다. 특정 양태에서, 상기 조성물은 G2P[4] 타입의 로타바이러스 균주의 감염에 의해 초래된 장염에 대해 상기 언급된 바와 같은 방어 수준을 제공하는 G1P[8] 로타바이러스 균주를 포함한다.

적합하게는, Gx 또는 Py 타입도 아닌 로타바이러스 균주에 의해 감염된 백신화된 개체 군집에서 달성된 설사 및/또는 장염 및/또는 중증의 장염에 대한 방어율은 10 내지 90%, 적합하게는 20 내지 80%, 적합하게는 40 내지 80%, 적합하게는 45% 내지 75% 방어율을 나타낸다. 전형적으로, 장염에 대한 방어율 수준은 40% 이상, 적합하게는 50% 이상이다.

특정 양태에서, 상기 조성물은 G2P[4] 혈청형의 로타바이러스 감염에 의해 초래된, 베시카리 스코어에 따라 측정된 경우 중증의 장염에 대한 백신화된 개체 군집에서 40% 내지 80%, 적합하게는 45% 내지 75% 방어율을 나타내는 G1P[8] 로타바이러스 균주를 포함한다.

적합하게는, 백신은 2회 또는 3회 투여 요법으로 이용된다.

교차 방어를 제공하기 위해 사용된 로타바이러스 백신은 하기 적합한 특징을 갖는다.

일 양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물의 로타바이러스는 하기중 하나 이상을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 VP4 유전자를 갖는다: 개시 코돈으로부터 788번 위치에서 아데닌 염기 (A), 802번 위치에서 아데닌 염기 (A), 및 501번 위치에서 티민 염기 (T).

추가의 양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물의 로타바이러스는 하기중 하나 이상을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 VP7 유전자를 갖는다: 개시 코돈으로부터 605번 위치에서 티민 (T), 897번 위치에서 아데닌 (A), 또는 897번 위치에서 구아닌 (G). 적합하게는, 897번 위치에는 아데닌 (A)이 있다.

특이적 양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물의 로타바이러스는 VP4 유전자 서열에서 개시 코돈으로부터 788번 및 802번 위치에 아데닌 (A), 및 501번 위치에 티민 (T)을 갖는다.

또 다른 특이적 양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물의 로타바이러스는 VP7 서열에서 개시 코돈으로부터 605번 위치에서 티민 (T) 및 897번 위치에서 아데닌/구아닌 (A/G)을 갖는다. 가장 적합하게는, VP7 서열에서, 897번 위치에서 아데닌 (A)을 갖는다.

특히 적합한 양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물의 로타바이러스는 VP4 유전자 서열에서 개시 코돈으로부터 788번 및 802번 위치에서 아데닌 (A) 및 501번 위치에서 티민 (T)을 가지며, VP7 서열에서 개시 코돈으로부터 605번 위치에서 티민 (T) 및 897번 위치에서 아데닌/구아닌 (A/G)을 갖는다.

또 다른 양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물의 로타바이러스는 VP4 단백질을 엔코딩하는 도 1A (SEQ ID NO:1) 또는 도 1B (SEQ ID NO:2)에 도시된 바와 같은 누클레오티드 서열, 및/또는 VP7 단백질을 엔코딩하는 도 2A (SEQ ID NO:3) 또는 도 2B (SEQ ID NO:4)에 도시된 바와 같은 누클레오티드 서열을 포함한다. 대안적 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물의 로타바이러스는 도 3 (SEQ ID NO:5)에서와 같은 VP4 단백질 및/또는 도 4 (SEQ ID NO:6)에서와 같은 VP7 단백질을 포함한다. 대안적 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 로타바이러스 개체군은 추가적으로 도 6 (SEQ ID NO:8)에서와 같은 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩되거나 도 5 (SEQ ID NO:7)에서와 같은 NSP4 단백질, 및/또는 도 8 (SEQ ID NO:10)에서와 같은 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩되거나 도 7 (SEQ ID NO:9)에서와 같은 VP6 단백질을 포함한다.

본 발명에 사용하기에 적합한 로타바이러스 개체군은

적합한 세포 타입상에 로타바이러스 제조물을 계대배양시키고;

임의적으로, a) 한계 희석 또는 b) 개별적 플라크 분리의 단계를 이용하여 상동성 배양물을 선택하고;

VP4 및/또는 VP7 유전자 서열의 적합한 영역을 서열 결정함으로써 실질적으로 단일 변이의 존재를 체크하는 것을 포함하는 방법에 의해 달성될 수 있다.

적합하게는, 로타바이러스 개체군은 상기 기술된 바와 같이 P43 (RIX4414), P33 또는 P26 개체군으로부터 유래된다.

서열 결정은 적합하게는, 슬롯 블롯 하이브리디제이션 또는 플라크 하이브리디제인션과 같은 정량적 또는 반-정량적 하이브리디제이션에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 방법으로부터 유도된 생성된 클로닝된 바이러스 개체군은 적합한 세포주에서 추가로 계대배양함으로써 증폭될 수 있다.

상기 방법에서 로타바이러스 개체군을 계대배양하기에 적합한 세포 타입은 확립된 세포주 또는 일차 AGMK 세포일 수 있는 아프리카 그린 멍키 신장 (AGMK) 세포이다. 적합한 AGMK 세포주는 예를 들어, Vero (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) 및 CV-1 (ATCC CCL-70)을 포함한다. 또한, MA-104 (붉은털 원숭이) 및 MRC-5 (인간 - ATCC CCL-171) 세포주가 적합하다. Vero 세포는 특히, 증폭 과정에 적합하다. Vero 세포에서의 계대배양은 높은 바이러스 수율을 제공한다.

상기 방법으로부터 생성된 바이러스 개체군에서 단일 변이가 존재하는 지의 여부를 체크하고, 단일 변이의 특성을 결정하는 기법은 당해분야에 공지되어 있으며 하기에 기술된 표준 시퀀싱 또는 하이브리디제이션 공정을 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명의 방법은 적합한 로타바이러스를 사용하여 수행되며, 특히 로타바이러스는 89-12개 균주 또는 이의 계대배양된 유도체의 특징을 갖는다.

특히 적합한 단일 변이체 개체군은 P43이며, 이는 일련의 종료 희석 클로닝 단계에 이어서, 증폭을 위한 Vero 세포상에서 클로닝된 물질을 계대배양함으로써 P33 (적합한 세포 타입상의 배양물중의 분리된 33회 인간 로타바이러스 계대배양물)로부터 수득되었다.

P43 개체군은 유럽 콜렉션 오브 애니멀 셀 컬쳐 (ECACC), 백신 리서치 앤드 프로덕션 라보라토리, 퍼블릭 헬스 라보라토리 서비스, 센터 퍼 아플라이드 마이크로바이올로지 앤 리써치 (Porton Down, Salisbury, Willtshire, SP4 0JG, United Kingdom)에 부다페스트 협약하에 1999년 8월 13일 기탁 번호 99081301로 기탁되었으며, WO 01/12797에 기술되어 있다.

상기 지시된 공개물을 이용하는 것이 인간 로타바이러스 P43을 수득하는 가장 간단한 방법이지만, 유사하거나 작용상 실질적으로 동일한 로타바이러스가 본 발명의 기법에 비추어 이들 방법 또는 기타 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 작용상 실질적으로 동일한 로타바이러스는 본 발명의 인간 로타바이러스 P43과 생물학적으로 동일한 것으로 간주되며, 따라서 본 발명의 일반적 범위내에 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 P43 변이체의 특징을 갖는 로타바이러스 개체군을 포함하는 것으로 이해된다.

또한, 본 발명은 기탁된 P43 ECACC 99081301을 추가적 계대배양, 클로닝 또는 생 바이러스를 사용한 기타 공정에 의해 증식시키거나, 유전 공학 기법 또는 재조합 기법을 포함하는 임의의 방법으로 P43을 변형시키는 것과 같은 추가 공정으로 처리함으로써 기탁된 P43 ECACC 99081301으로부터 유래되는 것으로 이해될 것이다.

본 발명에 포함된 기탁된 P43으로부터 유래된 물질은 단백질 및 유전자 물질을 포함한다. 특히, 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 P43 분절을 포함하는 재조합 로타바이러스 예를 들어, 11개 게놈 분절중 하나 또는 하나의 일부가 P43의 게놈 분절 또는 일부에 의해 대체된 로타바이러스의 유독성 균주를 포함하는 재조합체가 흥미롭다. 특히, NSP4를 코딩하는 분절 또는 일부 분절이 P43 분절 또는 일부 분절인 로타바이러스 재조합체가 유용한 특성을 가질 수 있다. 재조합 로타바이러스 및 이를 제조하기 위한 기법은 널리 공지되어 있다 (Foster, R.H. and Wagstaff, A.J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDurgs, Gev, 9(2), 155-178, 1998).

특히 흥미로운 물질은 p43의 후손 및 P43의 면역학적 활성 유도체이다. 면역학적 활성 유도체는 P43 바이러스로부터 수득되거나 P43 바이러스로 수득된 물질, 특히 바이러스의 항원을 의미하며, 이는 숙주 동물로 주입될 경우 로타바이러스에 대해 반응하는 면역반응을 제거할 수 있다.

로타바이러스를 적합한 세포주 예를 들어, Vero 세포로 적응시키는데 있어서, 존재할 수 있으며 다르게는 오염을 초래하는 우발성 제제와 같은 임의의 가능한 오염물이 제거되도록 바이러스를 처리할 필요가 있을 수 있다. 에테르-민감성 우발성 바이러스의 경우, 이는 하기에 기술된 바와 같은 에테르 처리에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 또한, 감약된 생 로타바이러스 또는 이와 함께 제형화된 백신을 수득하기 위한 전체적 공정에서 임의의 단계로서 이러한 에테르 처리를 포함하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 교차 방어성 로타바이러스 균주는 다른 로타바이러스 균주와 혼합되어 로타바이러스 감염 또는 질환에 대해 추가적인 방어 또는 교차 방어를 제공할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 본원에 정의된 바와 같이 교차 방어를 제공할 수 있으며, 적합한 애쥬번트 또는 약제 담체와 혼합된 생 감약된 로타바이러스 백신을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 로타바이러스 백신은 G1P[8] 균주와 같은 단일 로타바이러스 균주를 함유하는 일가 로타바이러스 백신이다.

본 발명은 특히, 생 감약된 로타바이러스가 인간 로타바이러스며 삽입 생장을 초래하지 않는 생 로타바이러스 백신을 제공하는데 유리하다.

본 발명에 따른 감약된 로타바이러스 균주와 함께 사용하기에 적합한 약제 담체는 경구 투여 특히, 유아에 투여하기에 적합한 당해분야에 공지된 것을 포함한다. 이러한 담체는 카보히드레이트, 폴리알코올, 아미노산, 수산화알루미늄, 수산화마그네슘, 히드록시아파타이트, 활석, 산화티탄, 수산화철, 마그네슘 스테아레이트, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 젤라틴, 식물성 펩톤, 크산톤, 카라헤난, 아라비아 검, β-시클로덱스트린을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 로타바이러스 백신을 제조하는 공정 예를 들어, 적합한 안정화제의 존재하에 백신을 냉동시키거나 본 발명에 따른 바이러스를 적합한 애쥬번트 또는 약제 담체와 혼합하는 공정이 제공된다.

또한, 리피드-기재 백신 예컨대, 비로좀 또는 리포좀중에서, 수중유 에멀션중에서 또는 담체 입자와 함께 본 발명의 바이러스를 제형화시키는 것이 유리할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 경구 백신에 대해 당해분야에 공지된 것과 같은 면역자극제가 제형중에 포함될 수 있다. 이러한 면역자극제는 박테리아 독소, 특히 홀로톡신 (holotoxin; 전체 분자) 또는 B 사슬 (CTB) 형태의 콜레라 톡신 (CT) 또는 대장균의 열 불안정성 엔터톡시 (LT)을 포함한다. 천연 LT 보다 이들의 활성 형태로 덜 전환될 것 같은 변이된 LT (mLT)는 WO 96/06627, WO 93/13202 및 US 5,182,109에 기술되어 있다.

유리하게는 포함될 수 있는 추가의 면역자극제는 사포닌 유도체 예컨대, QS21 및 모노포스포릴 리피드 A, 특히, 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL)이 있다. 경구용 애쥬번트로서의 정제된 사포닌은 WO 98/56415에 기술되어 있다. 사포닌 및 모노포스포릴 리피드 A는 별도로 사용되거나 혼합되어 사용될 수 있으며 (예를 들어, WO 94/00153), 기타 제제와 함께 애쥬번트 시스템에서 제형화될 수 있다. 3D-MPL은 리비 이뮤노쳄 (Ribi Immunochem, Montana)에 의해 제조된 널리 공지된 애쥬번트이며, 이의 제조는 GB 2122204에 기술되어 있다.

경구 면역화를 위한 애쥬번트 및 비히클의 일반적 설명은 문헌 [Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995]에서 발견할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 유효량의 백신 조성물을 이를 필요로 하는 피검체에 투여함으로써 인간 피검체 특히, 유아를 백신접종하는 방법을 제공한다. 적합하게는, 감약된 생 백신이 경구 투여에 의해 투여된다.

특정 양태에서, 본 발명에 따른 감약된 로타바이러스 균주는 제산제와 제형화되어 위에서 산에 의한 백신의 불활성화를 최소화시킨다. 적합한 제산제 성분은 무기 제산제 예를 들어, 수산화알루미늄 Al(OH)₃ 및 수산화마그네슘 Mg(OH)₂를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 시중의 제산제로는 밀란타(Mylanta: 상표명)을 포함하며, 이는 수산화알루미늄 및 수산화마그네슘을 함유한다. 이는 불수용성이며, 현탁액으로 제공된다.

수산화알루미늄은 특히, 제산제 효과를 제공할 뿐만 아니라 애쥬번트 효과를 제공할 수 있기 때문에 본 발명에 따른 백신 조성물의 적합한 성분이다.

본 발명의 백신에서 제산제로서 사용하기에 적합한 것은 유기 제산제 예컨대, 유기산 카르복실레이트 염이다. 본 발명의 백신 조성물중의 적합한 제산제는 유기산 카르복실레이트 염, 특히, 시트르산의 염, 나트륨 시트레이트 또는 칼륨 시트레이트를 함유한다.

본 발명의 백신 조성물중에 사용될 수 있는 특히 적합한 제산제는 불용성 무기염, 탄산 칼슘 (CaCO₃)이다. 탄산칼슘은 로타바이러스와 결합하며, 로타바이러스 활성은 탄산 칼슘과의 결합 동안 유지된다.

충전 단계 동안 탄산칼슘의 침전을 방지하기 위해, 적합하게는 점성제가 제형중에 존재한다.

사용될 수 있는 가능한 점성제는 의가소성 부형제를 포함한다. 의가소성 용액은 진탕시에서의 점도와 비교하여 방치시 더 높은 점도를 갖는 용액으로서 정의된다. 이러한 타입의 부형제는 천연 중합체 예컨대, 아라비아 검, 아드라칸트 검, 아가-아가, 알지네이트, 펙틴 또는 반합성 중합체 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스 (틸로스 C (Tyloses C®)), 메틸셀룰로오스 (메토셀 (Methocels A®), 비스코트란 (Viscotrans MC®), 틸로스 MH® 및 MB®), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (클루셀 (Klucels®)), 및 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (메토셀 E® 및 K®, 비코트란 MPHC®)가 있다. 일반적으로, 이러한 의가소성 부형제는 요변제와 함께 사용된다. 사용될 수 있는 대안적 점성제는 낮은 유동성을 갖는 의가소성 부형제이다. 충분한 농도의 이러한 중합체는 구조적 유체 배열을 유도하여, 방치시 낮은 유동성을 갖는 고점도 용액을 유도한다. 특정 적량의 에너지가 시스템에 제공되어 유동되고 이동되어야 한다.

외부 에너지 (진탕)가 유체 용액을 수득하기 위해 구조적 유체 배열을 일시적으로 파괴하는데 요구된다. 이러한 중합체의 예로는 카르보폴 (Carbopol®) 및 크산탄 검이 있다.

요변성 부형제는 방치시에서 겔 구조가 되는 반면, 진탕시에는 유체 용액을 형성한다. 요변성 부형제의 예로는 비검 (Veegum®) (마그네슘-알루미늄 실리케이트) 및 아비셀 (Avicel®) (약 89%의 미세결정 셀룰로오스 및 11%의 카르복시메틸셀룰로오스 Na)이 있다.

본 발명의 백신 조성물은 적합하게는, 크산탄 검 또는 전분으로부터 선택된 점성제를 포함한다.

이와 같이, 본 발명의 백신 조성물은 전형적으로, 탄산칼슘과 크산탄검과 함께 제형화된다.

본 발명에 사용된 조성물의 기타 성분은 당 예를 들어, 수크로오스 및/또는 락토오스를 포함한다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 예를 들어, 향신제 (특히, 경구용 백신에 있어서) 및 정균제를 포함하는 추가적 성분을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 상이한 표상의 백신 조성물이 구상된다.

적합한 일 구체예에서, 백신은 액체 제형으로서 투여된다. 적합하게는, 액체 제형은 적어도 하기 두 성분으로부터 투여전에 재구성된다:

i) 바이러스 성분

ii) 액체 성분.

본 구체예에서, 바이러스 성분 및 액체 성분은 일반적으로 별도의 용기에 존재하며, 이들 용기는 편리하게는, 단일 용기 또는 최종 백신 조성물이 공기에 노출되지 않고 재구성되도록 연결될 수 있는 분리된 용기의 분리된 구획일 수 있다.

재구성 전에, 바이러스는 건조 형태 또는 액체 형태일 수 있다. 적합하게는, 바이러스 성분은 냉동 건조된다. 냉동 건조된 바이러스는 수용액중의 바이러스 보다 더욱 안정적이다. 냉동 건조된 바이러스는 액체 제산제 조성물을 사용하여 적합하게 재구성되어 액체 백신 제형을 생성시킬 수 있다. 대안적으로, 냉동건조된 바이러스는 물 또는 수용액과 재구성될 수 있으며, 이 경우 냉동건조된 바이러스 조성물은 적합하게는, 제산제 성분을 함유한다.

적합하게는, 백신 제형은 일 구획 또는 용기에서 탄산칼슘 및 크산탄 검과 제형화된 바이러스 성분을 포함하며, 이는 제 2 구획 또는 용기에 존재하는 물 또는 수용액으로 재구성된다.

또 다른 구체예에서, 백신 조성물은 고체 제형, 적합하게는 냉동건조된 케이크이며, 이는 입에 위치할 경우 즉시 용해되기에 적합하다. 냉동 건조된 제형은 편리하게는, 약제 블리스터 팩내에서 정제 형태로 제공될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 경구 투여용 정제를 신속하게 용해시키는 형태의 로타바이러스 백신을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 감약된 생 로타바이러스 균주 특히, 인간 로타바이러스 균주를 포함하는 조성물을 제공하며, 조성물은 입에 위치할 경우 즉시 용해될 수 있는 냉동건조된 고형물이다.

적합하게는, 본 발명에 따른 신속하게 용해되는 정제는 비용해된 정제가 삼켜지는 것을 방지하기 위해 충분히 신속하게 피검체의 입에서 용해된다. 이는 특히, 소아 로타라이브 백신에 유리하다.

적합하게는, 백신은 무기 제산제 예컨대, 탄한칼슘 및 점성제 예컨대, 크산탄 검과 제형화된 감약된 인간 생 로타바이러스이다.

본 발명의 추가의 양태는 바이러스 성분이 탄산칼슘 및 크산타검으로 제형화되는 임의의 로타바이러스 균주인 냉동 건조된 제형을 제공한다.

본 발명의 백신은 적합한 양의 생 바이러스를 사용하여 전형적인 백신 접종자에서의 심각한 부작용 없이 로타바이러스 감염에 대한 효과적인 방어를 제공하는 공지된 기법으로 제형화되고 투여될 수 있다. 적합한 양의 생 바이러스는 일반적으로, 투여량당 10⁴ 내지 10⁷ 포커스 형성 유닛 (ffu)일 것이다. 전형적 투여량의 백신은 투여량당 10⁵-10⁶ ffu를 포함하며, 일정 기간에 걸쳐 수차례 투여 예를 들어, 2달 간격으로 2회 투여량으로 제공될 수 있다. 그러나, 특히, 개발도상국에서 2회 초과의 투여, 예를 들어, 3 또는 4회 투여 요법이 이로울 수 있다. 투여 간격은 2달보다 길거나 짧을 수 있다. 단일 투여 또는 다중 투여 요법을 위한 생 바이러스의 최적량, 및 최적의 투여 시점은 항체 역가 및 피검체에서의 기타 반응을 관찰하는 것을 포함하는 기본 연구에 의해 확인될 수 있다.

본 발명의 백신은 또한, 기타 질환 예를 들어, 소아마비 바이러스에 대해 방어하기에 적합한 기타 생 바이러스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 경구 투여에 적합한 기타 생 바이러스 백신은 본 발명에 따른 로타바이러스 백신 조성물로서 동일한 때에 별도의 투여로 제공될 수 있다.

문헌 [Vaccine (1998) paper]에 기술된 바와 같이 P33 물질로 백신접종된 12명의 4개월 내지 6개월 유아로부터의 혈청을 P33, P38, P43 및 89-12C2의 중화를 위해 시험하였다.

모든 시험된 혈청의 중화 역가 범위는 P33, P38 및 P43에 있어서 유사하다. 통계학적 검정은 모든 3 바이러스에 대한 전체적인 중화 역가에서 현저한 차이를 나타내지 않는다. 이는 P33, P38 및 P43의 형태적 및 비형태적 중화 에피토프가 P33 백신접정종된 유아의 항-P33 혈청에 의해 동일하게 잘 인식된다는 것을 시사한다. 이러한 관찰은 간접적으로, 실험관내 검정에서 드러난 중화 에피토프가 P33, P38 및 P43 사이에 변화되지 않음을 시사한다.

그러나, P89-12C2의 중화 역가 범위는 P33, P38 및 P43과 현저히 상이하다. 이러한 관찰은 P33, P38 및 P43에 대한 형태적 및 비형태적 중화 에피토프가 P33 백신접종된 유아의 항-P33 형청에 의해 동일하게 잘 인식되지 않는다는 것을 시사한다. 이러한 관찰은 간접적으로, 실험관내 검정에서 드러난 중화 에피토프가 89-12 C2와 P33, P38 및 P43 사이에 변화되었음을 시사한다.

특히, 본 발명의 적합한 구체예는 하기를 포함한다.

1. 백신 조성물의 P 타입과 상이한 P 타입의 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물의 제조시 P 타입으로부터 감약된 로타바이러스 균주의 용도.

2. P[8]이 아닌 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물의 제조시 P[8] 타입으로부터 감약된 로타바이러스 균주의 용도.

3. G1P[8] 타입이 아닌 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물의 제조시 G1P[8] 타입으로부터 감약된 로타바이러스 균주의 용도.

4. 상기 제 1 내지 제 3 항목에 있어서, G1P[8] 타입에 의한 로타바이러스 감염에 대한 면역 반응이 추가적으로 유도되는 용도.

5. 상기 제 1 내지 제 4 항목에 있어서, 2개 이상의 로타바이러스 혈청형에 대한 면역 반응이 유도되며, 이러한 혈청형은 G 또는 P 타입을 기준으로 하여 규정되는 용도.

6. 상기 제 1 내지 제 5 항목에 있어서, 백신 균주의 혈청형이 G1 혈청형이며, 비-G1 혈청형은 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G10, G11, G12, G13 및 G14로 구성된 리스트로부터 선택되는 용도.

7. 상기 제 6 항목에 있어서, 면역 반응이 G1 타입 및 G2 타입 둘 모두에 대해 유도되는 용도.

8. 상기 제 1 내지 제 5 항목에 있어서, 백신 균주 타입이 P[8] 타입이며, 비-P[8] 타입이 P[1], P[2], P[3], P[4], P[5], P[6], P[7], P[9] 및 P[11] 타입으로 구성된 리스트로부터 선택되는 용도.

9. 상기 제 8 항목에 있어서, 면역 반응이 P[8] 및 P[4] 타입 둘 모두에 대해 유도되는 용도.

10. 제 1 내지 제 9 항목에 있어서, 조성물이 개시 코돈으로부터 788번 위치에서 아데닌 염기 (A), 802번 위치에서 아데닌 염기 (A) 및 501번 위치에서 티민 염기 (T)중 하나 이상을 누클레오티드 서열중에 포함하는 VP4 유전자를 갖는 로타바이러스를 포함하는 용도.

11. 제 10 항목에 있어서, VP4 유전자가 개시 코돈으로부터 788번 및 802번 위치에서 아데닌 염기 (A) 및 501번 위치에서 티민 염기 (T)를 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 용도.

12. 제 11 항목에 있어서, 조성물이 개시 코돈으로부터 605번 위치에서 티민 (T), 897번 위치에서 아데닌 (A) 및 897번 위치에서 구아닌 (G)중 하나 이상을 누클레오티드 서열중에 포함하는 VP7 유전자를 갖는 로타바이러스를 포함하는 용도.

13. 제 12 항목에 있어서, VP7 유전자가 개시 코돈으로부터 605번 위치에서 티민 (T), 및 897번 위치에서 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G)을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 용도.

14. 제 1 내지 제 13 항목에 있어서, 조성물이 누클레오티드 서열중에 개시 코돈으로부터 788번 및 802번 위치에서 아데닌 (A) 및 501번 위치에서 티민 (T)을 포함하는 VP4 유전자를 갖는 로타바이러스를 포함하며; VP7 유전자는 누클레오티드 서열중에 개시 코돈으로부터 605번 위치에 티민 (T) 및 897번 위치에 아데닌 (A)를 포함하는 용도.

15. 제 1 내지 제 14 항목에 있어서, 조성물이 조성물중에 존재하는 감약된 로타바이러스의 G 및/또는 P 타입을 기준으로 하여 규정된 상이한 타입의 로타바이러스에 의한 감염에 의해 초래된 장염 및/또는 설사를 저하시키거나 이에 대해 방어할 수 있는 용도.

16. 제 15 항목에 있어서, 조성물이 G 및/또는 P 타입을 기준으로 하여 규정된 2개 이상의 균주의 로타바이러스의 감염에 의해 초래된 중증 장염에 대해 백신접종된 개체의 군집중 40% 이상의 방어율을 갖는 용도.

17. 제 16 항목에 있어서, 중증 장염이 3개 이상, 4개 이상의 비-G1 혈청형의 로타바이러스 감염에 의해 초래되는 용도.

18. 제 17 항목에 있어서, 비-G1 혈청형이 G2, G3, G4 및 G9 혈청형인 용도.

19. 제 18 항목에 있어서, 중증의 장염이 2개 이상의 비-P[8] 타입의 로타바이러스 감염에 의해 초래된 용도.

20. 제 9 항목에 있어서, 중증의 장염이 P[4] 타입의 로타바이러스 감염에 의해 초래된 용도.

21. 제 1 내지 제 20 항목에 있어서, 로타바이러스 균주가 ECACC 기탁물 99081301이거나, ECACC 기탁물 99081301로부터 수득가능하거나 유래가능한 용도.

23. 제 1 내지 제 20 항목에 있어서, 백신이 2-투여 요법에 이용되는 용도.

또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, 로타바이러스 균주로부터의 로타바이러스 감염에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상이한 균주로부터의 감약된 로타바이러스 백신을 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 한 P 타입으로부터 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도하고/거나 한 P 타입으로부터의 로타바이러스 감염과 관련된 질환을 예방하기 위한 방법으로서, 상이한 P 타입으로부터의 감약된 로타바이러스 개체군을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태에서, P[1], P[2], P[3], P[4], P[5], P[6], P[7], P[9], P[11], P[12], P[14] 및 P[19] 타입, 적합하게는 P[4] 로타바이러스 타입으로 구성된 군으로부터 선택된 비-P[8] 타입중 하나 이상 및 P[8] 로타바이러스 타입에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 로타바이러스 P[8] 타입 백신을 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, i) 도 5에 제시된 분리된 비구조적 단백질 4 (NSP4) 단백질 서열 (SEQ ID NO:7) 또는 이의 면역원성 단편; ii) 상기 NSP4 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드 서열, 또는 이의 면역원성 단편; iii) 도 6에 제시된 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드 서열 (SEQ ID NO:8)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, i) 도 7에 제시된 분리된 로타바이러스 (VP6) 단백질 서열 (SEQ ID NO:9) 또는 이의 면역원성 단편; ii) 상기 VP6 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드 서열 또는 이의 면역원성 단편; iii) 도 8에 제시된 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드 서열 (SEQ ID NO:10)이 제공된다.

면역원성 단편은 유효량으로 투여되는 경우 (단독으로 또는 담체에 결합된 헵텐으로서), 로타바이러스 감염에 대한 방어성 면역 반응을 유도하는 단편으로서 본 발명의 문맥중에 규정될 수 있다.

하기 비제한적 예에 의해 본 발명이 설명된다.

실시예 1: 26회 계대배양시 (P26)의 균주 89-12가 변이체의 혼합물임을 입증

상이한 계대배양 롯으로부터의 VP4 및 VP7 유전자의 시퀀싱

계대배양물 P26 (일차 AGMK 세포), 계대배양물 P33 (일차 AGMK 세포주와 상방된), 계대배양물 P41 및 계대배양물 P43으로부터의 V4 및 VP7의 시퀀싱을 수행하였다. 전체 RNA 추출물은 역 전사되며, 하나의 튜브/일 단계로 PCR을 통해 증폭된다.

프라이머 Rota 5bis 및 Rota 29bis는 전체 VP4 유전자를 증폭시키며, 프라이머 Rota 1 및 Rota 2bis는 전체 VP7 유전자를 증폭시킨다. PCR 물질은 상이한 일차원을 이요아여 시퀀싱을 해야 한다 (표 1 참조).

계대배양물 P26 서열은 계대배양물 P33 서열과 VP4에서 3개 염기 (개시 코돈 으로부터 501번, 788번 및 802번 bp에서) 및 VP7에서 3개 염기 (개시 코돈으로부터 108, 605 및 897bp)가 상이하다.

VP4 및 VP7의 계대배양물 P26 서열 스캔은 변이된 위치에서 배경으로서 계대배양물 P33 서열의 존재를 나타낸다. 이와 같이, 계대배양물 P26은 2개 이상의 변이체의 혼합물일 수 있다.

계대배양물 P33 서열 스캔은 VP4에서 상동성이며, VP7에서는 이종성인 것으로 보여진다 (표 2 참조).

계대배양물 P38 (33회 계대배양으로부터 유래됨)은 Vero 세포에서 5회 계대배양되며, 계대배양물 P33으로서 동일한 세트의 VP4 및 VP7 서열을 나타낸다 (AGMK 세포주). 이와 같이, P33과 P38 사이의 개체군에는 큰 변화가 없다.

표 1: RT-PCR 및 시퀀싱에 사용되는 올리고누클레오티드

표 2: 하이브리디제이션에 사용된 올리고누클레오티드

표 2에서 굵은체로 나타낸 염기는 VP4 및 VP7에서 특이적 서열 변이 부위이다.

표 3: VP4 및 VP7 유전자의 서열 변이

표 3.1

N.B. 생성 롯 수준으로 발생한 3 클론으로부터의 이차 클론에서, VP7 897 bp 위치 누클레오티드는 P43 선택된 클론에서와 같이 A 라기 보다는 G이다. 이는 아미노산 서열에서 이소류신 대신에 메티오닌을 유도한다. VP7에서 개시 코돈으로부터 897 bp에서 G인 클론 및 선택된 P43 클론 둘 모두에 상응하는 변이체가 P33 물질로 백신화된 유아의 변에서 분비되었다.

특정 위치에서 2개의 교차적 염기가 존재하는 표 3.1에서, 2개중 첫번째는 주요 개체군에서 나타나는 염기를 대표하며, 두번째는 소수 개체군에서 나타나는 염기이다. 주요 및 소수 변이체 개체군은 시퀀싱에서 시그널의 강도에 의해 판단된다.

표 3.2

표 3.2는 변이체간의 누클레오티드 차이로부터 유도된 아미노산 변화를 나타낸다.

표 4

슬롯 블롯 하이브리디제이션

AGMK 세포상에서 계대배양 P26 내지 P33간의 개체군 변화는 슬롯 블롯 하이브리디제이션에 의해 추가로 확인되었다. RT/PCR로 생성된 VP4 및 VP7 유전자 단편은 각 변이체에 대해 특이적인 올리고누클레오티드 프로브와 하이브리디제이션되 었다 (표 3.1 및 표 3.2 참조). Rota 16, Rota 35 및 Rota 36과 하이브리디제이션되며, Rota 15와는 그렇지 못하는 P26과 반대로, 위치 788 및 802번에서 P33 물질의 VP4 PCR 단편은 단지 Rota 16과만 하이브리디제이션되고 Rota 15 또는 Rota 35 또는 Rota 36과는 하이브리디제이션되지 않는다. 이러한 결과는 P26에서 3개 이상의 변이의 존재를 확립시켜 준다 (표 4 참조).

P33 물질의 VP7 PCR 단편에 있어서, 위치 897번은 Rota 41 및 Rota 42와 하이브리디제이션된다. 이러한 결과는 P33 물질중에 2개 이상의 변이의 존재를 확립시켜 준다.

실시예 2: P43 클론의 분리 및 특성 결정

동종성 바이러스 개체군으로서 P33 성분을 분리하기 위해, Vero 세포상에서 P33/AGMK의 3개 종료점 희석을 수행하고, 생성된 바이러스를 사용하여 Vero 세포를 감염시켰다.

파지티브 웰을 두개의 기준을 이용하여 선택하였다: 통상적으로 수행된 바와 같이 플레이트상의 가장 많이 분리된 파지티브 웰 및 웰에서 검출된 포커스의 가장 큰 수에 의해 입증된 성장. 96 웰 미세적정 플레이트에서 3회 말단 희석 계대배양 후, 10개의 파지티브 웰을 연속적으로 Vero 세포상에서 증폭시키고, 이들의 수율을 평가하였다. 수율에 기초하여, 3개의 클론을 생성 롯 수준으로 계대배양하도록 발생시켰다. 폴리클로날 항체에 의한 면역인자는 3개의 클론 사이에 및 클론과 P33사이에 유사한 것으로 나타났다. 클론의 동종성은 슬롯 블롯 하이브리디제이션에 의해 평가하였다. 단일 클론의 최종 선택은 수율 및 서열에 기초하였다.

선택된 클론을 Vero 세포상에서의 연속적 계대배양에 의해 증폭하여 마스터 시드 (Master seed), 워킹 시드 (Working seed) 및 최종 생성 롯을 생성시켰다.

선택된 클론은 VP4 및 VP7 (동일성)의 시퀀싱 및 PCR 증폭 물질의 VP4 및 VP7 (상동성)의 특이적 슬롯 블롯 하이브리디제이션에 의해 상이한 계대배양 수준에서 유전적으로 특성 결정되었다. P43 물질의 VP4 및 VP7 유전자의 서열은 각각 도 1 및 2에 제공되며, P41과 동일하다.

선택된 클론의 상동성은 P26/일차 AGMK의 시퀀싱 동안 확인된 각각의 변이체에 있어서 VP4 및/또는 VP7 영역에서 누클레오티드 변화를 판별하는 올리고누클레오티드 프로브를 사용하여 선택적 하이브리디제이션에 의해 평가하였다.

VP4 단편은 Rota 16과 하이브리디제이션되나, Rota 15, Rota 35 또는 Rota 36과는 하이브리디제이션되지 않는다. VP7 단편은 Rota 41과 하이브리디제이션되나, Rota 42와는 하이브리디제이션되지 않는다.

이러한 결과는 P43이 상동성 개체군임을 확인시켜 준다.

실시예 3: 잠재적 우발성 바이러스의 제거

에테르를 P33 (AGMK 성장)에 20%의 최종 농도로 1시간 동안 첨가하였다. 그 후, 에테르를 N₂로 35분 동안 버블링시켰다. P33 시드의 역가에는 어떠한 영향도 끼치지 않았다.

실시예 4: 감약된 생 백신의 제형

상기 기술된 생성 롯을 하기 방법에 의해 유아 경구 투여용으로 제형화시켰 다.

1. 냉동 건조된 바이러스

바이러스 투여를 위해 표준 기법을 이용하였다. 냉동된 정제된 바이러스 벌크를 해동시키고, 적당한 배지 조성물, 이 경우에는, 둘베코 개질된 이글 배지 (Dulbecco's modified eagle Medium)로 목적하는 표준 바이러스 농도, 이 경우에는, 10^6.2 ffu/ml로 희석하였다. 그 후, 희석된 바이러스를 냉동건조 안정화제 (수크로오스 4%, 덱스트란 8%, 소르비톨 6%, 아미노산 4%)로 표적 바이러스 역가, 이 경우, 10^5.6 ffu/투여량으로 추가로 희석하였다. 0.5ml 분취량의 안정화된 바이러스 조성물을 무균하에 3ml 바이알에 옮겼다. 그 후, 각각의 바이알을 고무 마개로 부분적으로 밀봉하고, 샘플을 진공하에 냉동 건조시킨 후, 바이어를 완전하게 밀봉하고, 알루미늄 캡으로 바이알 둘레로 크립핑(crimping)시켜 마개를 정위에 위치시켰다.

사용을 위해서는 바이러스는 하기 제산제 재구성물중 하나를 이용하여 재구성된다.

(a) 시트레이트 재구성물

나트륨 시트레이트를 물중에 용해시키고, 여과에 의해 멸균하고, 1.5ml 투여량당 544mg Na₃시트레이트.2H₂O의 농도로 1.5ml의 양으로 재구성 용기로 옮겼다. 재구성 용기는 예를 들어, 3ml 바이알 또는 4ml 바이알 또는 2ml 주사기, 또는 경구 투여용의 연질의 플라스틱 압착가능한 캡슐일 수 있다. 멸균 조건하에 멸균 성 분을 유지시키기 위한 대안으로서, 최종 용기는 오토클레이브될 수 있다.

(b) Al(OH) ₃ 재구성물

무균의 수산화알루미늄 현탁액 (밀란타 - 상표명)을 멸균수중에서 무균하에 희석하고, 48mg의 Al(OH)₃를 각각 함유하는 2ml 양으로 재구성 용기 (예를 들어, 2ml 주사기, 또는 연질의 플라스틱 압착가능한 캡슐)로 옮겼다. 멸균 조건하에 멸균 성분을 사용하기 위한 대안은 수산화알루미늄 현탁액을 (바람직하게는, 희석 단계에서) γ 조사하는 것이다.

표준 성분은 현탁액이 고정되는 것을 방지하기 위해 포함된다. 이러한 표준 성분으로는 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스 및 실리콘 중합체를 포함한다.

정균제 예를 들어, 부틸파라벤, 프로필파라벤 또는 식품에 사용되는 기타 표준 정균제, 및 향미제가 또한 포함될 수 있다.

2. 액체 제형중 Al(OH) ₃ 를 갖는 냉동 건조된 바이러스

바이러스 투여량을 위해 표준 기법을 이용하였다. 냉동된 정제된 바이러스 벌크를 해동시키고, 적당한 배지 조성물, 이 경우에는, 둘베코 개질된 이글 배지로 목적하는 표준 바이러스 농도, 이 경우에는, 10^6.2 ffu/ml로 희석하였다. 수산화알루미늄 현탁액을 첨가하여 최종 적량이 48mg/투여량이 되게하고, 바이러스 조성물을 냉동 건조 안정화제 (수크로오스 4%, 덱스트란 8%, 소르비톨 6%, 아미노산 4%) 로 표적 바이러스 역가, 이경우에는, 10^5.6 ffu/투여량으로 희석하였다. 0.5ml 분취량의 안정화된 바이러스 조성물을 무균하에 3ml 바이알에 옮겼다. 그 후, 바이알의 냉동 건조 및 밀봉은 상기 1 파트에 기술된 바와 같이 수행하였다.

3. 블리스터 (blister) 제공을 위한 Al(OH) ₃ 를 갖는 냉동 건조된 바이러스

바이러스 투여량을 위해 표준 기법을 이용하였다. 냉동된 정제된 바이러스 벌크를 해동시키고, 적당한 배지 조성물, 이 경우에는, 둘베코 개질된 이글 배지로 목적하는 표준 바이러스 농도, 이 경우에는, 10^6.2 ffu/ml로 희석하였다. 수산화알루미늄 현탁액을 첨가하여 최종 적량이 48mg/투여량이 되게하고, 바이러스 조성물을 수크로오스, 덱스트란 또는 아미노산 4%, 또는 젤라틴, 또는 식물성 펩톤, 또는 크산탄일 수 있는 냉동 건조 안정화제로 10^5.6 ffu/투여량의 표적 바이러스 역가로 희석하였다. 무균 충전 작업을 이용하여 0.5ml, 바람직하게는 이 보다 적은 투여량을 블리스터 공동으로 옮겼다. 조성물을 냉동 건조하고, 블리스터 공동을 열 실링 (thermic sealing)에 의해 실링하였다.

선택적 표준 성분은 현탁액이 고정되는 것을 방지하기 위해 포함된다. 이러한 표준 성분으로는 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스 및 실리콘 중합체를 포함한다. 향미제가 또한 포함될 수 있다.

실시예 5: 다양한 제형을 위한 로바타이러스 바이러스 역가

5.1: 락토오스 및 수크로오스 기재 제형의 비교:

표 5

배치 n°	제형 조성	냉동 건조전의 바이러스 역가	냉동 건조 및 37℃에서 1주후의 바이러스 역가
98G06/01	락토오스: 2%; 덱스트란: 4%; 소르비톨: 3%; 아미노산: 2%	105.22	104.67
98G06/3	수크로오스: 2%; 덱스트란: 4%; 소르비톨: 3%; 아미노산: 2%	105.28	104.92

P43 로타바이러스를 상기 표에 기술된 바와 같이 수크로오스 또는 락토오스와 제형화시켰다.

냉동 건조 전의 바이러스 적정은 냉동 건조 단계 없이 완료된 제형화된 액체 (수크로오스 덱스트란 소르비톨 아미노산 함유)중의 바이러스 역가이다.

양호한 결과는 냉동 건조 단계에서 <0.5 log 감소되고, 37℃에서 1주 동안 (가속화된 안정도 시험) <0.5 log 감소가 달성되는 것이다.

정확한 바이러스 적정은 약 + 또는 - 0.2 log이다.

결과는 수크로오스가 락토오스 대신에 사용될 수 있음을 나타낸다.

5.2: 아르기닌의 효과 및 소르비톨의 말티톨로의 대체

표 6

배치 n°	제형 조성	냉동 건조 후 0시 타임에서의 바이러스 역가	냉동 건조 및 37℃에서 1주후의 바이러스 역가
98L16/01	락토오스: 2%; 덱스트란: 4%; 소르비톨: 3%; 아미노산: 2%	104.8	104.8
98L16/02	락토오스: 2%; 덱스트란: 4%; 소르비톨: 3%; 아미노산: 2%; 아르기닌: 3%	104.8	104.9
98L16/04	락토오스: 2%; 덱스트란: 4%; 말티톨: 3%; 아미노산: 2%; 아르기닌: 3%	104.7	105

결과는 아르기닌 (이는 냉동 건조 동안 바이러스의 안정도를 증가시키고, 또한 위산을 상쇄하기 위해 염기성 매질을 제공하는 것으로 공지됨)의 첨가가 바이러스 역가를 유지시킴을 입증해준다.

소르비톨은 냉동 건조된 케이크의 유리 전이 온도를 너무 많은 정도로 저하시키는 경향이 있다. 이는 상기 기술된 바와 같이 소르비톨 대신에 말티톨을 사용함으로써 극복되며, 바이러스 역가는 여전히 유지된다.

5.3: 다양한 제형 조성

본 실험은 많은 제형이 가능하다는 것을 입증해준다.

표 7

배치 n°	제형 조성	냉동 건조전의 바이러스 역가	냉동 건조 및 37℃에서 1주후의 바이러스 역가
99C11/01	수크로오스: 2%; 덱스트란: 4%; 소르비톨: 3%; 아미노산: 2%	105.24	105.07
99C11/02	수크로오스: 2%; 덱스트란: 4%; 말티톨: 3%; 아미노산: 2%	105.09	104.92
99C11/04	덱스트란: 4%; 말티톨: 3%; 아미노산: 2%	104.89	105.06

배치 n°	제형 조성	냉동 건조 후 0시 타임에서의 바이러스 역가	냉동 건조 및 37℃에서 1주후의 바이러스 역가
99C17/01	수크로오스: 2%; 덱스트란: 4%; 소르비톨: 3%; 아미노산: 2%	105.4	105.41
99C17/02	수크로오스: 2%; 덱스트란: 4%; 소르비톨: 1.5%; 아미노산: 2%	105.30	104.93
99C17/03	수크로오스: 2%; 덱스트란: 4%; 아미노산: 2%	105.31	105.24
99C17/04	수크로오스: 2%; 덱스트란: 4%; 말티톨: 3%; 아미노산: 2%	104.42	104.45
99C17/05	수크로오스: 2%; 덱스트란: 4%; 말티톨: 1.5%; 아미노산: 2%	104.39	104.40
99C17/06	수크로오스: 2%; 덱스트란: 4%; 소르비톨: 3%	105.44	104.97
99C17/07	수크로오스: 2%; 덱스트란: 4%; 소르비톨: 1.5%	105.11	104.89

5.4: 로타바이러스와 Al(OH) ₃ 제산제의 결합:

표 8

로타바이러스	Al(OH)3	H2O	실온에서의 접촉 시간	원심분리	상청액 바이러스 역가 ffu/ml	펠렛 바이러스 역가 ffu/ml
105.6 ffu/ml	0.240ml중 48mg	0.76ml	30분	8000rpm, 10분	103.66
105.6 ffu/ml	0.240ml중 48mg	0.76ml	30분	8000rpm, 10분	104.41
105.6 ffu/ml		1ml	30분	8000rpm, 10분	105.68
냉동 건조된 케이크중의 로타바이러스	0.120ml중 12mg	1.38ml	30분	8000rpm, 10분	검출 미만	104.7

Al(OH)₃는 제산제로서 사용된다. 이는 로타바이러스가 Al(OH)₃ (상청액중 바이러스 활성을 감소시킴)과 함께 원심분리되기 때문에 불용성 무기 염 (Al(OH)₃)과 결합함을 보여준다.

5.5: 바이러스 적정전의 나트륨 시트레이트에 의한 Al(OH) ₃ 제산제의 분해

표 9

바이러스 샘플	용해	조건	바이러스 역가 ffu/ml
냉동 건조 전 99B10/06 액체 제형; 105.43	1.5ml Na3시트레이트	24h 실온	105.11
99B10/06: 냉동 건조된 105.43	1.5ml Na3시트레이트	24h 실온	104.53

로타바이러스가 Al(OH)₃와 관련되는 경우, 모두를 냉동 건조시키는 것이 가능하다 (Al(OH)₃ 포함). 냉동 건조 후, 나트륨시트레이트중에 Al(OH)₃를 용해시킴으로써 로타바이러스를 회수 가능하다. 본 단계는 로타바이러스에 손상을 입히지 않으며, 용해 단계 후에도 이의 활성을 보유한다.

5.6: Al(OH) ₃ -로타바이러스 결합물의 분리 후 로타바이러스의 전염성:

바이러스 분리 (담체의 용해에 의해)의 메카니즘은 생체내에서 매우 잘 발생 할 수 있다. 실제로, pH 6 미만에서, 수산화알루미늄은 완전히 용해되며, 따라서, 로타바이러스는 위중에 유리될 것이다.

Al(OH)₃ + 3 H⁺ ----> Al⁺⁺⁺ (수용성) + 3 H₂O

위에서, Al⁺⁺⁺ 이온은 흡수되지 않는다 (J.J. Powell, R.Jugdaohsingh and R.P.H. Thompson, The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147-153). 장에서, pH의 증가로 인해, 불용성 형태의 알루미늄이 침전되며 (Al(OH)₃ 또는 AlPO₄), 자연 방식으로 제거된다. 새로이 형성된 Al(OH)₃ (또는 AIPO₄) 침전물이 유리 로타바이러스와 재결합될 것인지의 여부는 알려지지 않았다. 이는 Al(OH)₃-로타바이러스 결합 자체의 전염성에 대한 의문을 갖게 한다.

또한, 다른 메카니즘에 의해서도 Al(OH)₃-로타바이러스 결합물로부터 로타바이러스가 유리될 수 있다. 예를 들어, 리신은 Al(OH)₃상의 바이러스 흡착을 방해한다. 기타 음이온 예컨대, 보레이트, 설페이트, 탄산염 및 인산염은 수산화알루미늄에 특이적으로 흡착하는 것으로 공지되어 있으며, 따라서, 이론적으로, 이는 Al(OH)₃-로타바이러스로부터 로타바이러스를 (흡착 부위에 대한 경쟁에 의해) 대체할 수 있다.

이와 같이, 로타바이러스는 로타바이러스-Al(OH)₃ 결합물로부터 유래될 수 있으며, 유리된 로타바이러스는 활성인채 유지된다. 이러한 유리는 Al(OH)₃를 용해시키거나 (위중 HCl에 의해, 또는 실험관내 Na₃시트레이트에 의해), 염기성 아미노산 (리신)에 의해 로타바이러스를 대체시킴으로써 수행될 수 있다.

5.7: Al(OH) ₃ -로타바이러스 결합물의 전염성

단일 용량의 냉동건조된 로타바이러스를 물로 재구성시키고, 두 부분으로 나누었다. 첫번째 부분은 참조용으로서 간주하여, 추가적 용적의 물을 수용하게 하였다. 두번째 부분에는 물 0.240ml중에 현탁된 24mg Al(OH)₃를 첨가하였다 (전임상 바이러스 적정).

Al(OH)₃가 존재하는 경우, 로타바이러스는 활성적이며, 바이러스 적정 값은 참조용 샘플과 비교하여 더 높았다.

본 실험을 냉동건조된 용량을 분할하지 않고 반복하였으며, 12mg Al(OH)₃ 또는 24mg Al(OH)₃를 첨가하였다.

여기서, 참조용 샘플은 시트레이트-중탄산염 완충액으로 재구성된 것이다. 이와 같이, 바이러스 역가는 Al(OH)₃의 존재하에 더 높았다.

상기 실시예에서와 같이, 로타바이러스는 원심분리에 의해 폐기될 수 있기 때문에 로타바이러스를 Al(OH)₃ 입자와 결합시켰다. DRVC003A46은 냉동건조된 제형화된 로타바이러스이다 (수크로오스:2%; 덱스트란:4%; 소르비톨:3%; 아미노산:2%).

SDSAA = 수크로오스 2%, 덱스트란 4%, 소르비톨 3%, 아미노산 2%

상청액상에 수행된 바이러스 적정화에 따라, 로타바이러스를 흡착시키는데 요구되는 적량의 Al(OH)₃은 하기와 같다 (냉동건조된 1회 용량 5.7log로 개시하여 바이러스 적정치로 규모를 증대시킴).

표 10

Al(OH)3	흡착 시간	상청액중 역가
12mg	1시간 실온	2.7
24mg	1시간 실온	3.4
48mg	1시간 실온	3.4
72mg	1시간 실온	2.0
96mg	1시간 실온	검출 미만
12mg	밤새	2.7
24mg	밤새	검출 미만
48mg	밤새	2.5
12mg	즉시	검출 미만
24mg	즉시	2.0
48mg	즉시	검출 미만

Al(OH)₃ 상에 로타바이러스를 흡착시키는데 필요한 시간은 짧은 것으로 여겨진다:

냉동 건조된 로타바이러스 1회 용량을 24mg Al(OH)₃의 존재하에 재구성하고, 0, 15, 60분 및 24시간 후 원심분리하였다. "큐롯 (culot)"을 바이러스 적정화 전에 SDSAA중에 재현탁시켰다:

표 11

시칸	큐롯	상청액
0분	5.26	3.17
15분	5.34	<1.44
60분	5.96	<1.44
24시간	6.13	<1.44

5.8: 제산제로서 CaCO ₃ 이용

백신중의 알루미늄을 회피하기 위해, 제산제 Al(OH)₃를 또 다른 불용성 무기염 CaCO₃ (탄산칼슘)로 대체하였다.

CaCO₃로 관찰된 현상은 Al(OH)₃에 대해 기술된 것과 유사하다:

- 무기염과 로타바이러스의 결합;

- 무기염과 결합된 경우 로타바이러스의 활성 유지;

- 산에 의해 무기 염기를 용해시킴으로써 결합물로부터 로타바이러스 유리 가능;

- 제산제 및 로타바이러스의 공동-냉동건조 가능.

CaCO ₃ 및 로타바이러스 결합

1차 시도에서, 냉동 건조된 로타바이러스 (바이러스 역가 5.7)를 물중의 CaCO₃ 현탁액 (1.5ml중의 50mg)으로 재구성한 후, 원심분리하고, 상청액의 바이러스 역가를 펠렛과 비교하였다.

이는 로타바이러스중 90%를 초과하여 CaCO₃ 와 결합한다는 것을 나타낸다.

또한, 바이러스가 결합되는 경우, 적정화를 실현시키고, 원래의 바이러스 적량을 회수 가능하다.

또한, 바이러스 역가는 CaCO₃ 없이 수득된 바이러스 역가 보다 약간 더 높았다.

CaCO ₃ 및 로타바이러스 결합물의 적량

냉동 건조된 로타바이러스를 물 (1.5ml)중의 CaCO₃ 현탁액과 재구성하고:

10mg

50mg

100mg

원심분리하고, 상청액의 바이러스 역가를 큐롯과 비교하였다.

표 12

CaCO3	엑스템포 + 원심분리		1시간 + 원심분리
	큐롯	상청액	큐롯	상청액
100mg	4.57	3.01	4.79	3.09
50mg	4.17	4.15	4.22	3.86
10mg	3.17	4.77	3.87	4.87

이와 같이, 명백하게는, 더 많은 CaCO₃ 및 더 많은 바이러스가 결합하며, 상청액중에서 덜 발견되었다.

그러나, 전체 용량은 완전하게 회수되지 않았다 (더욱 초기에 수득된 것으로서 전체 5.3 이상 또는 심지어 5.8이 예상됨 - 상기 참조)

베이비 로젯-라이스 (Baby-Rossett-Rice) 제산제 적정화 동안 로타바이러스의 CaCO ₃ 방어

10회 용량의 냉동건조된 로타바이러스 (DRVC003A46) 및 50mg의 CaCO₃를 이용하여, 2가지 유형의 베이비 로젯-라이스 적정화를 수행하였다:

전형적 로젯-라이스 적정화에서, 제산제를 로타바이러스와 혼합하고, HCl을 이러한 매질에 부었다.

"역" 베이비 로젯-라이스에서, 상황을 반대로 하였다: 제산제를 HCl 풀에 부었다 (실험관내에 발생하는 바와 같이).

표 13

전형적 베이비 로젯-라이브 적정화
냉동건조된 로타바이러스 저장 온도	완충제	이론적 바이러스 역가	측정된 바이러스 역가
4℃	60mg CaCO3	5.3	4.6
-80℃	60mg CaCO3	5.3	4.6
4℃	24mg Al(OH)3	5.4	<2.9
-80℃	24mg Al(OH)3	5.4	<2.9

역 베이비 로젯-라이브 적정화
냉동건조된 로타바이러스 저장 온도	완충제	이론적 바이러스 역가	측정된 바이러스 역가
4℃	60mg CaCO3	5.3	4.6
-80℃	60mg CaCO3	5.3	4.6
4℃	24mg Al(OH)3	5.4	<2.9
-80℃	24mg Al(OH)3	5.4	<2.9

이와 같이, 실험관내 실험에서, 탄산칼슘은 HCl의 존재로부터 약 20%의 로타바이러스를 방어할 수 있는 반면, 수산화알루미늄은 그렇지 못하였다.

5.9: CaCO ₃ 제산제의 존재하에 로타바이러스 냉동건조:

표 14

배치 n°	조성물	냉동건조후 0시간에서의 바이러스 역가	냉동건조 및 1주 37℃에서 바이러스 역가
99K08/01	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2% CaCO3 : 50mg	105.28	105.10
99K08/02	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2% CaCO3 : 60mg	105.16	105.15
00C24/01	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2% CaCO3 : 60mg 크산탄 0.3%	105.07	104.69
OOC24/03	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2% CaCO3 : 60mg 크산탄 0.3%	105.07	104.85
OOE09/25	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2% CaCO3 : 60mg 크산탄 0.25%	105.03	104.91
OOE09/30	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2% CaCO3 : 60mg 크산탄 0.30%	105.01	104.87
OOF26/06	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2% CaCO3 : 60mg 전분: 0.3%	104.50	104.70

이는 "올 인 원 (all in one)"이다 - 동일한 바이알중에 로타바이러스와 제 산제 (CaCO3)가 함께 냉동 건조됨. 충전 단계 동안 CaCO₃의 침전을 방지하기 위해, 점성제가 필요하다. 이러한 점성제의 예로는 크산탄 검 및 전분을 포함한다. 로타바이러스 활성은 크산탄 검 및 전분의 존재하에서도 유지된다.

5.10 구간애에 위치하는 경우 신속하게 분해시키기 위한 냉동건조된 정제

하기 제형은 "리오크 (lyoc)" 개념을 입증한다. 즉, 마우스에서 냉동건조된 케이스의 신속한 분해.

표 15

배치 n°	조성	냉동건조후 0시간에 서의 바이러스 역가	냉동건조 및 1주 37℃에서 바이러스 역가
99B10/06	수크로오스 4% 나트륨 글루타메이트 3.7% Al(OH)3 48mg	105.11	104.53
99C11/12	말티톨 3% Al(OH)3 48mg 히드록시프로필메틸셀룰로오스:1%	104.16	103.79

배치 n°	조성	냉동건조후 0시간에 서의 바이러스 역가	냉동건조 및 1주 37℃에서 바이러스 역가
00c24/05	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2% CaCO3 : 60mg 크산탄 0.3%	105.02	104.54
00C24/06	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2% CaCO3 : 60mg 크산탄 0.3%	104.86	104.56
00F26/11	수크로오스:1% 덱스트란:2% 소르비톨:1.5% 아미노산:1% CaCO3 : 60mg 전분 2%	104.70	104.40

"리오크 개념"에서, 크산탄과 전분 모두가 사용될 수 있다 (냉동건조된 케이크의 신속한 용해 특성 유지).

실시예 6: 로타바이러스 백신 조성물을 위한 제산제로서 탄산칼슘의 사용

물중의 CaCO₃ 현탁액이 로타바이러스에 대한 제산제로서 사용되는 경우, 분말 밀도 값이 2.6에 이르고, 평균 입경이 30㎛이기 때문에, 물중에 위치할 때 탄산칼슘 입자가 급속하게 침전된다는 문제가 있다.

이러한 침전은 하기에 의해 감속화될 수 있다:

1 주위 매질의 밀도 증가

2 주위 매질의 점도 증가

3 입경 축소

4 입자들을 서로 이격시켜 유지

6.1: 주위 매질의 밀도 증가;

CaCO₃-물 현탁액 (주사기에 위치한 경우)가 냉동건조된 케이크 (수크로오스 2%; 덱스트란 4%; 소르비톨 3%; 아미노산 2% 함유)상에 위치한 경우, 주위 매질의 밀도가 증가하는 반면, CaCO₃ 침전 속도는 CaCO₃-물 현탁액과 별반 차이가 없다.

6.2 주위 매질의 점도 증가:

의가소성 부형제

의가소성 용액은 진탕하에 이의 점도와 비교하여 방치시 더 높은 점도를 갖는 용액으로서 정의내려 진다.

이러한 유형의 유용한 부형제는 다음과 같다:

예를 들어, 천연 중합체:

아라비아 검

아드라간트 검

아가-아가

알기네이트

펙틴

예를 들어, 반합성 중합체:

카르복시메틸셀룰로오스 (티로세스 C® (Tyloses C))

메틸셀룰로오스 (메토셀 A® (Methocels A), 비스콘트란스 MC® (Viscontrans MC), 티로세스 MH® 및 MB®)

히드록시프로필셀룰로오스 (클루셀스® (Klucels))

히드록시프로필메틸셀룰로오스 (메토셀 E® 및 K®, 비스콘트란스 MPHC®)

일반적으로, 이러한 의가소성 부형제는 요번제와 함께 사용된다.

낮은 유동력을 갖는 의가소성 부형제

충분한 농도에서의 이러한 중합체는 구조적 유체 배열을 발생시켜, 방치시 낮은 유동력을 갖는 고점도 용액을 유도한다. 특정 적량의 에너지가 시스템을 유동화시키고 전달하는데 제공되어야 한다. 외부 에너지 (진탕)이 유체 용액을 수득하기 위해서 구조적 유체 배열을 일시적으로 파괴하는데 요구된다.

이러한 중합체의 예는 카르보폴스® (Carbopols®) 및 크산탄 검이다.

요변성 부형제

이들 부형제를 사용하는 경우, 방치시 겔 구조가 수득된다: 진탕시에는 유체 용액이 수득된다.

요변성 부형제의 예는 다음과 같다: 비검® (Veegum®) (마그네슘-알루미늄 실리케이트) 및 아비셀 RC® (Avicel RC®) (약 89% 미세결정성 셀룰로오스 및 11% 카르복시메틸셀룰로오스 Na).

6.3. 입경 축소

CaCO₃ 입경 축소는 화합물 제산 능력의 감소를 유도한다.

6.4 입자들을 서로 이격시켜 유지

이는 응집을 방지하기 위해 CaCO₃ 사이에 CaCO₃ 입자보다 더 작은 비검® 및 아비셀®에 대해 불용성인 입자 (약 1㎛)를 위치시키는 경우이다.

실시예 7: 생성물 설계

하기 개요는 가능한 생성물 설계의 예를 설명해준다.

7.1 주사기내 CaCO ₃

냉동 건조된 바이알에 임상 배치의 로타바이러스를 미리 위치시키면서, 제산제는 주사기에 함유된 재구성 액체중에 위치시켰다

이러한 생성물 제공시, CaCO₃의 침전은 충전 단계에서 뿐만 아니라 생성물의 완전한 저장 수명 (2년 이상) 동안 조정하에 있다.

7.2 냉동건조된 바이알중의 CaCO ₃

7.3 블리스터에서의 냉동건조

이경우, 로타바이러스, CaCO₃ 및 크산탄 검을 블리스터에서 직접 함께 냉동건조하였다.

실시예 8: 상이한 균주의 로타바이러스의 냉동건조

표 16

배치 n°	로타바이러스 균주	제형 조성	냉동건조후 0시간에 서의 바이러스 역가	냉동건조 및 1주 37℃에서 바이러스 역가
00F26/01	G1 SB 정제 n°61 PRO/0232	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2%	104.6	104.7
00F26/02	G2 (DS-1)	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2%	104.4	104.4
00F26/03	G3 (P)	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2%	104.6	104.5
00F26/04	G4 (VA-70)	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2%	104.8	104.8
00F26/05	G9 (W161)	수크로오스:2% 덱스트란:4% 소르비톨:3% 아미노산:2%	104.6	104.5

균주 DS-1, P 및 VA70은 문헌 ["Fields" Raven press 1990, second edition]의 제 1361면에 각각 혈청형 G2, G3 및 G4에 대한 로타바이러스 참조 균주로서 기술되어 있다.

본 실시예에서, 상이한 로타바이러스 균주는 냉동건조되었다. 모두에 있어서, 양 바이러스 역가는 냉동 건조 동안 유지되었으며, 증가된 안정도 (37℃에서 1주)가 관찰되었다.

실시예 9: 로타바이러스의 한 경구 투여의 성인에서의 1기 (Phase I) 안정도 연구

1기 연구를 수행하여 18세 내지 45세의 건강한 성인을 대상으로 단일 경구 용량 10^6.0 ffu의 P43의 안정도 및 부반응을 평가하였다. 임상 실험은 이중맹 및 무작위 실험이었다. 이는 위약 대조 및 자가 보유 실험이다. 본 연구를 벨기에의 한 단일 센터에서 수행하였다.

9.1 개체군 연구

위약 그룹 11명 및 백신 그룹 22명의 총 33명 피검체를 등록하여 모든 연구를 완료하였다. 모든 지원자는 백신 (코카시안)이었다. 백신 접종시 이들의 평균 연령은 35.3세였으며, 18세에서 44세에 분포되어 있다. 실험은 1월에 시작하여 한달 약간 넘게 지속되었다.

9.2 재료

백신

굿 매니팩처링 프랙티스 (Good Manufacturing Practices)에 따라 P43의 임상 로트를 생성시키고, 정제하고, 제형화시키고, 냉동건조하였다. 퀄러티 컨트롤 (Quality Control) 및 퀄러티 어슈어런스 (Quality Assurance)에 의해 로트를 배포하였다. 각각의 백신 바이얼은 하기 성분을 함유하였다:

활성 성분:

P43 균주 최소 10^5.8 ffu

부형제, 안정화제:

수크로오스 9mg

덱스트란 18mg

소르비톨 13.5mg

아미노산 9mg

위약

위약 바이알을 준비하고, 배포하였다. 각각의 위약 바이알은 하기 성분을 함유하였다:

부형제, 안정화제:

수크로오스 9mg

덱스트란 18mg

소르비톨 13.5mg

아미노산 9mg

희석제

주입용 물을 희석액으로 사용하여 백신 및 위약을 재구성하였다.

9.3 투여

백신 또는 위약 투여 약 10 내지 15분 전에, 두 그룹의 피검체에 10ml의 밀란타 ®를 경구 제공하였다. 밀란타®는 등록된 제산제이다. 제산제는 위의 pH를 증가시키고, 로타바이러스가 위를 통과하는 동안 이들이 불활성화되는 것을 방지한다.

백신을 제조하기 위해, 바이알당 10^5.8 ffu를 함유하는 냉동건조된 P43의 2개 바이알을 1.5ml의 주입용 희석수로 재구성하였다. 이는 용량당 10^6.1 ffu의 계산된 바이러스 역가가 되게 한다. 재구성된 백신을 단일 경구 용량으로써 신속하게 투여하였다.

위약 제조를 위해, 2개 바이알의 냉동건조된 위약을 1.5ml의 주입용 물로 재구성하고, 단일 용량으로 경구 투여하였다.

9.4 안정성 및 부반응

하기 안정성 및 부반응 기준을 적용하였다:

원하는 일반적인 증상은 열, 설사, 구토, 메스꺼움, 복통 및 식욕 저하이다. 이들은 투여후 8일 동안 기록되었다.

원하지 않는 증상은 투여후 30일동안 기록되었다.

심각한 부작용이 전체 연구 기간 동안 기록되었다.

설사 샘플을 투여 후 8일 동안 수집하였다.

결과는 다음과 같다:

원하지 않는 증상, 원하지 않으며 심각하지 않는 부작용이 각각의 관찰 기간 동안 보고되었다.

설사는 보고되지 않았다.

9.5 결론

이중맹검 방식에서 단일 용량으로서 10^6.1 ffu의 용량을 18세 내지 44세의 건강한 성일 지원자에게 경구 투여한 경우 SB 생물학적 P43 백신은 위약과 비교하여 안정적이었다.

실시예 10 - G1 및 비-G1 (G9) 로타바이러스로 인한 장염을 예방하는데 있어서 RIX 4414를 함유하는 2회 용량의 인간 일가 로타바이러스 백신의 효능

10.1 방법

무작위식, 이중맹검 및 위약 대조 II기 (phase II) 실험을 라틴 아메리카에서 수행하여 유아 면역화를 위해 G1P[8] 인간 균주 89-12로부터 유래된 백신 (RIX4414 인간 로타바이러스 균주)의 방어성 효율을 평가하였다. RIX4414 백신은 ECACC 기탁물 99081301 (WO01/12797)로서 기탁된 감약된 G1P[8] 인간 균주를 로타바이러스 성분으로 포함한다.

백신 조성물 (표 17)

HRV 백신 또는 위약을 냉동건조된 생성물 바이알 (바이알 또는 위약)에 탄산칼슘 완충제를 함유하는 하나의 사전 충전된 주사기 전체 용량을 주입함으로써 준비하였다. 바이알을 쉐이킹하여 백신/위약을 재현탁시켰다. 전체 용적의 재현탁된 생성물을 동일한 주사기로 회수하고, 주사 바늘을 폐기하고, 재현탁된 생성물을 단일 경구 용량 (약 1.0ml)으로 신속하에 투여하였다.

표 17 - RIX4414 로타바이러스 백신 조성물

성분	적량 (공칭 용량: 1ml 당)
활성 성분 RIX4414	105.8 ffu/용량
부형제 유리 바이알중의 냉동건조된 백신 수크로오스 덱스트란 소르비톨 아미노산 둘베코의 개질된 이글 배지 (DMEM) 사전 충전된 주사기중의 희석액 (CaCO3-기재) 탄산칼슘 크산탄 주입용 수	9mg 18mg 13.5mg 9mg 2.25mg 60mg 2.5mg 1ml가 되게하는 양

백신 투여

2개월 내지 4개월의 건강한 유아 (493)에게 1회 용량당 10^5.8 ffu의 바이러스 농도로 RIX4414-로타바이러스 백신 2회 용량을 투여하고, 동시에 DTPw-HBV 및 Hiv 백신을 투여하였다. 3회 투여의 OPV (경구용 폴리오 바이러스 백신)을 연구용 백신과 2주 간격을 두게 하였다. 즉, 연구용 백신의 각각의 투여 전 2주 전부터 시작하여 투여 후 2주 후까지는 투여하지 않았다. 2개의 다른 그룹에는 상이한 바이러스 농도 10^4.7 ffu 및 10^5.2 ffu의 RIX4414-로타바이러스 백신을 2회 투여하였다. 설사 샘플을 로타바이러스의 존재를 확인하기 위해 시험하고 (ELISA), 양성 샘플에서 혈청형을 결정하였다 (RT-PCR). 2차 투여 후 2주로부터 보고된 설사 현상물은 분석에 유효한 것으로 간주되었다. 중증도는 20-포인트 등급을 이용하여 결정하였다 (Ruuska and Vesikari, 1990). 본 연구에서 각각의 설사 현상의 중증도를 평가하기 위해 사용된 20-포인트 스코어 시스템은 하기 표 18에 도시되어 있다. 11 이상의 스코어가 중증 질환인 것으로 규정된다.

표 18

부작용	포인트
정상 변보다 더 무른 변이 나타난 기간 (일) 1-4 5 ≥6	1 2 3
정상 변보다 더 무른 변의 최대 배변 횟수/24시간 1-3 4-5 ≥6	1 2 3
구토 기간 (일) 1 2 ≥3	1 2 3
최대 구토 횟수/24시간 1 2-4 ≥5	1 2 3
열 (직장/겨드랑이에서 측정)* 37.1-38.4℃/36.6-37.9℃ 38.5-38.9℃/38.0-38.4℃ ≥39℃/≥38.5℃	1 2 3
처리 수분 공급 입원	1 2
탈수 1-5% ≥6%	2 3

* 징후 기간 중 기록된 가장 높은 온도

10.2 결과

효능의 중간 분석을 상기 언급된 그룹에서 수행하였으며, 분리된 혈청형은 주로 G1 및 G9이며, 대부분 균일하게 분포되어 있다. 위약 그룹에서 전체적인 공격율은 6개월의 관찰 기간 동안 G1에 있어서는 4.8% 내지 G9에 있어서는 3.6%로 다양하였다. 10^5.8 ffu RIX4414의 2회 용량은 G1에 의해 초래된 모든 유형의 설사에 대해 83% 효능 [95% CI: 50.4-95.7] 및 중증 장염에 대해서는 92.1% 효능 [95% CI: 47.6-99.8]을 나타내었다. 설사가 G9에 의해 초래되는 경우, 모든 유형의 설사에 대한 방어율은 60.2% [95% CI: 0.2-86.0]이며, 중증 장염에 대해서는 80.8% [95% CI: 33.0-96.4]이었다. 이러한 효능의 종말점 (G1 및 G9에 있어서 임의의 정도 및 중증 정도) 각각에 있어서, 위약 그룹과 비교하여 HRV 그룹에서 설사 현상이 통계학적으로 현저하게 감소하였다 (p < 0.05, 투 사이디드(two-sided Fisher)의 정밀 시험)

다른 2 백신 그룹 (상이한 로타바이러스 농도)에서 수득된 결과는 실시예에 방어된 것과 일관되며, 최종 분석에 나타내었다 (실시예 11). G2, G3 및 G4에 대한 효능 데이타를 또한 분석하였다. 본 연구에서는 매우 적은 경우만 보고되었기 때문에 G2, G3 및 G4 교차 방어에 대한 결론을 이끌어내지 못하였다. 그러나, G2, G3 및 G4에 대한 효능 데이타는 더욱 중요한 샘플 크기에 대한 최종 분석에 제공하였다 (실시예 11).

10.3 결론

이러한 결과는 어린 유아에서 G1 균주에 대한 방어 및 G9 균주에 대한 교차 방어에서 2회 용량의 일가 HRV 백신 즉, RIX4414 로타바이러스 백신의 효능을 매우 지지해준다.

실시예 11 - G1 및 비-G1 (G2, G3, G4, G9) 로타바이러스로 인한 장염 예방에서 3개의 상이한 바이러스 농도로 투여되는 경우, RIX4414 균주를 함유하는 2회 용량의 인간 일가 로타바이러스 백신의 효능

11.1 방법

무작위식, 이중맹검 및 위약 대조 II기 실험을 라틴 아메리카에서 수행하여 유아 면역화를 위한 G1P[8] 인간 균주 89-12로부터 유래된 백신의 방어 효능 및 입원에 대한 효능을 평가하였다. 특히, 사용된 백신은 RIX4414 로타바이러스 백신이며, 로타바이러스 성분으로서 ECACC 기탁물 99081301로서 기탁된 감약된 G1 인간 균주를 포함한다.

건강한 유아에게 3개의 상이한 바이러스 농도로 RIX4414 로타바이러스 백신을 2회 투여하였다. 효능 분석을 위한 군집은 2개월 내지 4개월 연령의 1846명의 피검체 (468명 피검체는 10^4.7 ffu HRV 백신 그룹, 460명은 10^5.2 ffu HRV 백신 그룹, 464명은 10^5.8 ffu HRV 백신 그룹, 및 454명은 위약 그룹)로 이루어지며, DTPw-HBV 및 Hiv 백신을 동시에 투여하였다. 3회 투여의 OPV는 연구용 백신과 2주 간격을 두게 하였다. 즉, 연구용 백신의 각각의 투여 전 2주 전부터 시작하여 투여 후 2주 후까지는 투여하지 않았다. 설사 샘플을 로타바이러스의 존재를 확인하기 위해 시험하고 (ELISA), 양성 샘플에서 혈청형을 결정하였다 (RT-PCR). 피검체의 연령이 1세가 될 때까지는 2차 투여 후 2주로부터 보고된 설사 현상물은 분석에 유효한 것으로 간주되었다. 중증도는 20-포인트 등급을 이용하여 결정하였다 (Ruuska and Vesikari, 1990). 11 이상의 스코어가 중증 질환인 것으로 규정된다 (20-포인트 스코어링 시스템에 대한 기술에 있어서는 실시예 10 참조).

11.2 결론

실시예 10에 언급된 데이타의 최종 분석에 대한 결과는 하기 표에서 설명하겠다. 백신 그룹의 유아는 위약 그룹의 아이들 보다 현저하게 적은 로타바이러스 장염 현상을 가졌다 (p <0.001, 투 사이디드 정밀 시험) (표 19). 투여량에 따라, 중증 장염에 대한 방어율은 85.6% (95% CI: 63.0%-95.6%)에 이르며, 임의의 로타바이러스 장염에 대해서는 70% (95% CI, 45.7%-84.4%)에 이른다 (표 20). 이들 효능 종말점 각각에 있어서, 위약 그룹과 비교하여 HRV 그룹에서 설사 현상이 통계학적으로 현저하게 감소하였다 (p <0.001, 투 사이디드 정밀 시험). 다중 로타바이러스 혈청형 (G1, G2, G3, G4 및 G9)를 장염 대변으로부터 확인하였으며 (ELISA 및 RT-PCR), 이는 비-G1 혈청형에 대한 백신 효능을 계산가능하게 한다. 특히, 표 21로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 비-G1 혈청형 (G2, G3, G4 및 G9)에 있어서, 투여량에 따라, 중증 로타바이러스 장염에 대한 효능은 82.7% (95% CI: 40.3%-96.8%)에 이르며, 이는 일가의 G1-기재 G1P1A[8] 인간 로타바이러스 백신이 혈청형 (즉, 비-G1 및 비-P[8]) 계통에 대해 교차 방어를 유도해낸다는 것을 입증한다.

표 19: 연구 동안 보고된 로타바이러스 장염

표 20: 로타바이러스 장염에 대한 RIX4414 인간 로타바이러스 백신의 2회 투여량의 방어 효능

*투 사이디드 정밀 시험에 의한 백신 그룹과 위약 그룹간의 각각의 비교 p <0.001 (유의적 수준 α=0.05)

†투 사이디드 정밀 시험에 의한 백신 그룹과 위약 그룹간의 각각의 비교 p =0.037 (유의적 수준 α=0.05)

‡투 사이디드 정밀 시험에 의한 백신 그룹과 위약 그룹간의 각각의 비교 p =0.007 (유의적 수준 α=0.05)

N = 피검체의 수

n/% = 적어도 하나의 특이적 로타바이러스 장염 현상을 보고하는 피검체의 수/백분율

정확히 95%의 신뢰 구간이 나타남.

표 21: 혈청형 특이적 중증 로타바이러스 장염에 대한 RIX4414 인간 로타바이러스 백신의 2회 용량의 방어 효능

* 백신 그룹과 위약 그룹간의 각각의 비교를 위한 투 사이디드 정밀 시험이 사용됨 (유의적 수준 α=0.05)

N = 피검체의 수

n/% = 적어도 하나의 특이적 로타바이러스 장염 현상을 보고하는 피검체의 수/백분율

정확히 95%의 신뢰 구간이 나타남

11.3 결론

이러한 결과는 G1 균주에 의해 초래된 임의의 및 중증 로타바이러스 장염에 대해 어린 유아를 방어하는데 있어서 그리고, 기타 RV G 유형 즉, G2, G3, G4 및 G9에 대한 넓은 교차 방어에 대한 RIX4414를 함유하는 일가 HRV 백신의 2회 용량의 효능을 매우 지지한다.

실시예 12 - 인간 감약된 로타바이러스 백신 RIX4414 백신의 2회 용량은 라틴 아메리카 및 유럽에서 이형적 방어를 나타낸다.

RIX4414 균주를 함유하는 생 감약된 G1P[8] 인간 로타바이러스 (RV) 백신의 2회 경구 용량의 효능을 핀란드 및 라틴 아메리카 유아에서 II/III기 임상 시험으로 분석하였다. RIX 4414 로타바이러스 백신은 ECACC 기탁물 99081301로서 기탁된 감약된 G1 인간 균주를 로타바이러스 성분으로서 포함한다.

12.1. 방법

실시예 12의 결과의 일부는 이미 실시예 10 및 11에 제시되어 있다. 데이타는 핀란드에서 하나 및 라틴 아메리카 (브라질, 멕시코 및 베네수엘라)에서 하나 II기 연구 (실시예 10 및 11)로부터 그리고, 동일한 방법론 및 효능 기준을 이용하여 11개 라틴 아메리카 국가에서 하나의 III기 연구 (실시예 13)으로부터 공동으로 제공된 것이다. 총, 2개월 내지 4개월 연령의 2회 용량의 RIX 4414 백신 또는 위약으로 백신접종한 20081명의 건강한 유아 (효능 군집)를 1세가 될 때 까지 베시카리 (Ruuska T et al. Scand.J.Infect. Dis. 1990, 22, 259-267)에 대한 스코어로 중증 장염 (GE)에 대해 지켜보았다 (중증도 스케일 ≥12). GE 샘플을 로타바이러스에 대해 시험하고 (ELISA), RT-PCR로 유형화시켰다.

메타 분석을 3개의 언급된 연구에 대해 수행하였다. 중증 RV GE에 대한 통합된 효능 (베시카리에 따라 증중 스코어는 11 이상인 것으로 규정됨)을 2회 투여 후 2주로부터 1세때까지 계산하였다 (만텔-핸스젤 어림값 (Mantel-Haenszel approximation)을 이용하여 연구 효과 조절).

12.2. 결과

효능 군집에서, 11 이상의 베시카리 스코어를 갖는 G2P[4] 타입의 5개 중증 로타바이러스 GE 현상이 백신 그룹에서 검출되었으며, 위약 그룹에서는 13개 현상이 검출되었다. G2P[4] 유형에 대한 백신 효능은 62.7% (95% CI: 14.8; 87.1)이며, 이는 동형 균주 (G1P[8], G3P[8] 및 G4P[8])에 대한 방어 이외에, RIX4414 백신은 이종형 비-P[8] 비-G1 G2P[4] 균주에 의해 초래된 중증의 로타바이러스 GE에 대해 방어한다.

상이한 연구에 걸친 타입 특이적 효능은 하기에 제공되었다 (표 22)

표 22

균주	중중 RV 경우의 수		% 백신 효능* (VE) (95% CI)
	N 백신 수용자 (N=10646)	N 위약 (N=9435)
G1	17	52	83.7 (70.0; 91.2)
G2P[4]	5	13	67.2 (14.8; 87.1)
G3	2	8	82.7 (5.9; 96.8)
G9	15	34	79.5 (59.2; 89.7)

* 만텔-핸스젤 어림값을 이용하여 연구 효과에 대해 조절된 VE

모든 3 실험 하나의 백신 및 2개의 위약 수용체에서 단지 3개의 G4 경우가 발생하였다.

12.3 결론

이러한 분석은 상동성 G1 로타바이러스 균주 (백신과 항원적으로 유사한 2개의 외부 캡시드 단백질 (VP4 및 VP7) 및 하나의 내부 캡시드 단백질 (VP6)를 가짐)에 대해 높은 수준의 방어를 제공하는 것 이외에, RIX4414 백신이 또한, 상이한 G 타입 (예를 들어, G3, G9), 상이한 P 타입 (예를 들어, P[4]), 또는 G2P[4]에 대한 효능에 설명된 바와 같이 둘 모두 상이한 G 타입 및 P 타입을 갖는 다른 균주에 대해 매우 높은 방어성을 갖는다.

실시예 13 - 인간 감약된 로타바이러스 백신 RIX4414의 2회 용량이 이형적 방어를 나타냄을 보여주는 메타 분석

더욱 많은 데이타가 싱가폴 및 유럽 연구로부터 이용가능하기 때문에 (실시예 15), 실시예 12에 언급된 연구 이외에 이들 연구를 포함하여 추가적인 메타 분석을 수행하였다.

13.1 방법

3개의 II기 (핀란드, 라틴 아메리카 및 싱가폴) 및 2개의 III기 연구 (라틴 아메리카 및 유럽)가 메타-분석에 포함되었다. 2회 경구 용량을 0, 1 내지 2개월 스케줄에 따라 투여시 6주 내지 14주된 건강한 유아에게 1회 투여하였다. 모든 연구에서, 중증 RVGE는 20-포인트 베시카리 스케일에서 11 이상인 것으로 규정된다. 설사 샘플로 RV 존재에 대해 ELISA에 의해 분석하고, RT-PCR 기초 방법에 의해 유형화시켰다. 임의의 RV GE에 대한 효능을 III기 라틴 아메리카 연구에서와 같이 3개의 II기 연구 및 III기 유럽 연구에서 평가하였으며, 단지 중증의 RV GE를 기록하였다.

VE 및 이의 95% CI이 연구에 의해 분류된 정밀 포이슨 비율 (Poisson rate ratio)을 이용하여 위약군에 비해 1-비율의 RVGE로서 산정되었다 (Proc StatXact4 for SAS Users, 1999, cytel software corporation, exact Confidence Interval for common relative risk, p298).

13.2 결과

2회 용량의 RIX4414 또는 위약으로 백신접종된 총 8221명 유아에서, 임의의 G2P[4] RVGE의 4개 현상이 RIX4414 (N = 5783)에서 검출되었으며 위약 그룹 (N = 2438)중 9개 현상이 검출되었으며, 이는 G2P[4] 균주로 인해 임의의 중증도의 RVGE에 대한 81.0% (95% CI: 31.6; 95.8)의 VE를 시사한다.

2회 용량의 RIX4414 또는 위약으로 백신접종된 26088명의 건강한 유아에서, G2P[4] 타입으로 인한 중증 RVGE의 6개 현상이 RIX4414 (N=14792)에서 검출되었고, 위약 (N = 11296)에서는 15개 현상이 검출되었으며, 이는 G2P[4]로 인한 중증 RVGE에 대한 71.4% (95% CI: 20.1; 91.1)의 VE를 시사한다.

표 23 - G2P[4] RV 타입에 의해 초래된 임의의 또는 중증 RV GE 현상을 보고하는 피검체의 수 및 제 1 효능 기간 동안의 백신 효능 - (메타 분석), 효능 군집

표 23

N = 각 그룹에 포함된 피검체이 수;

n/% = 각 그룹에서 하나 이상의 특정화된 RV G2P[4] GE를 보고하는 피검체의 수/백분율;

% VE = 관찰된 백신 효능,

95% CI = 95% 신뢰 구간

* 13개 G2중 2개는 P 타입이 아니었다.

13.3 결론:

G2P[4] RV 타입에 대한 백신 효능의 이러한 메타 분석은 G2P[4] 타입으로 인한 임의의 RV GE에 대해서는 81.0% (95% CI: 31.6%; 95.8%) 및 G2P[4] 타입으로 인한 중증 RV GE에 대해서는 71.4% (95% CI: 20.1%; 91.1%)의 효능을 보고하였다.

실시예 14 - 다수 나라 III기 시험에서 인간 감약된 로타바이러스 백신 로타릭스 (Rotarix ^TM )의 효능

14.1 방법

11개의 라틴 아메리카 국가의 2개월 내지 4개월 연령의 20169명의 건강한 유아에 2회 경구 용량의 HRV 백신 (10159) 또는 위약 (10010)을 투여하였다. 로타바이러스 (RV)에 대해 대변 샘플을 ELISA에 의해 시험하고, 적합한 프라이머 및 타입 특이적 프로브를 사용하여 RT-PCR에 의해 유형화시켰다. 중증 장염 현상에 해당하는 임상 케이스 규정은 의료 기관 예컨대, 병원, 클리닉 또는 관리감독 지방 건강방어 센터에서 WHO 플랜 B (경구 수분공급 치료법) 또는 WHO 플랜 C (정맥내 수분공급 치료법)에 해당하는 수분공급 치료법 및/또는 밤새 입원이 요망되는 구토를 동반하거나 동반하지 않는 설사 현상이다 (http://www.who.int/child-adolescent-health/New Publication/CHILDHEALTH/textrev4.htm). 질환 중증도를 20-포인트 베시카리 스케일을 이용하여 등급화시키고; 중증 RVGE는 스코어가 11 이상인 것으로 규정하였다. 베시카리 스코어를 변형시켰다: 탈수가 eCRF에 기록되지 않기 때문에, 하기 룰을 적용하였다: 피검제가 경구 수분 공급을 받는 경우, 중증 GE 현상을 갖는 피검체를 1 내지 5% 탈수된 것으로 간주하였다. 피검체가 입원하고/거나 정맥내 (IV) 수분 공급을 받는 경우, 피검체를 6% 이상 탈수된 것으로 간주하였다.

14.2. 백신 효능

중증 로타바이러스 장염에 대한 백신 효능 (표 24)

위약 투여된 8858명 피검체 및 HRV 백신으로 백신접종된 9009 피검체로 이루어진 효능 군집. 임상 정의에 따라 중증 로타바이러스 장염을 갖는 아이가 백신 처리된 아이중에서는 12명이고 위약 그룹에서는 77명이었으며 (각각 1,000 아동기 (child-years) 당 1개 이상의 현상을 갖는 아동 2.0 대 13.3; p<0.001, 투 사이디드 정밀 시험), 이는 1세가 될 때까지 2회 투여 후 15일로부터 84.7%의 중증 로타바이러스 장염에 대한 백신 효능을 시사한다 (표 24에 도시됨). 유사한 결과가 1세가 될 때 까지 1회 투여로부터 총 백신접종된 군집에서 수득되었다 (81.1%의 백신 효능; 95% C.I. 68.5-89.3; p<0.001, 투 사이디드 정밀 시험). 백신접종 그룹에서는 9명의 아이가 하룻밤 이상의 입원이 요구되었고, 위약 그룹에서는 59명이 요구되었으며 (각각 1,000 아동기 당 1.5 대 10.2 입원), 이중 중증 로타바이러스 장염에 있어서 입원에 대한 85%의 백신 효능을 나타낸다 (p <0.001, 투 사이디드 정밀 시험) (표 24).

표 24 - 1세가 될 때 까지 2회 투여 2주 이후로부터의 기간 동안 로타바이러스 중증 장염, 특이적 로타바이러스 G 타입 중증 장염 및 모든 원인의 중증 장염에 대한 백신 효능

표 24에 대한 설명:

하나 초과의 단리된 G 타입으로 인한 현상을 갖는 참가자를 각각의 검출된 로타바이러스 타입 카테고리에서 계수하였다.

n = 하나 이상의 특이적 현상을 보고하는 유아의 수

RR = 상대적 리스크 = 위약 그룹에서 하나 이상의 현상을 보고하는 피검체의 발생률에 대한 백신 그룹에서 하나 이상의 현상을 보고하는 피검체의 발생율의 비

CI = 신뢰 구간

1000명의 유아기 (infant-year) 비는 유아기당 하나 초과의 특이적 현상을 나타내는 유아의 수이다.

^* 연구 프로토콜에 따른 케이스 규정: 의료 기관 예컨대, 병원, 클리닉 또는 관리감독 지방 건강방어 센터에서 WHO 플랜 B (경구 수분공급 치료법) 또는 WHO 플랜 C (정맥내 수분공급 치료법)에 해당하는 수분공급 치료 및/또는 밤새 입원이 요 망되는 구토를 동반하거나 동반하지 않는 설사 현상 (1일내에 정상적인 또는 수분기의 대변 보다 3회 이상의 더 무른 변).

^# 분리된 모든 G1 타입은 야생형 로타바이러스이다; G1P[8] 및 G9P[8]은 한 유아로부터 분리되었다.

^a G1P[8] 타입 단독은 2명의 유아로부터 분리되었다: G1P[8] 및 G9P[8]은 한 유아로부터 분리되었다.

^b; G1P[8] 타입 단독은 34명의 유아로부터 분리되었다: G1P[8] 및 G9P[8]은 한 유아로부터 분리되었다; G1, G2, G9 타입은 한 유아로부터 분리되었다.

^c G3P[8] 타입 단독은 한 유아로부터 분리되었으며, G4P[8] 타입 단독은 2명의 유아로부터 분리되었고, G9P[8] 타입은 19명의 유아로부터 분리되었다; G1P[8] 및 G9P[8]은 1명의 유아로부터 분리되었다.

^d G3P[8] 타입 단독은 8명의 유아로부터 분리되었으며, G4P[8] 타입 단독은 2명의 유아로부터 분리되었고, G9P[8] 타입은 19명의 유아로부터 분리되었다; G1P[8] 및 G9P[8]은 1명의 유아로부터 분리되었다; G1P[8] 및 G2P[4] 및 G9P[8]은 1명의 유아로부터 분리되었다.

^e G2P[4] 단독은 9명의 유아로부터 분리되며, G1P[8], G2P[4] 및 G9P[8]은 1명의 유아로부터 분리되었다.

p_값 = 투 사이디드 정밀 시험 (유의적 수준의 α = 5)

베시카리 스코어에 따른 백신 효능

백신 그룹중 중증 로타바이러스 현상을 갖는 12명의 아이들 중 11명 및 위약 그룹에서 77명중 71명의 베시카리 스코어는 11 이상이었으며, 이는 84.7%t의 백신 효능을 유도한다 (P<0.001, 투 사이디드 정밀 시험). 11 내지 20 스코어의 질환 중증도 증가에 있어서, 백신 효능은 더욱 증가하였으며, 더욱 중증의 로타바이러스 장염에 대해서는 100% 효능을 보였다. 베시카리 스코어가 11 이상인 전체 16명의 중증 로타바이러스 장염 현상이 1회 투여부터 2회 투여때까지 보고되었으며, 백신 그룹에서는 6명 위약 그룹에서는 10명이었다.

로타바이러스 타입 당 베시카리 스코어에 따른 백신 효능

야생형 균주에 대한 타입 특이적 백신 효능은 표 24에 도시되어 있다. 백신 균주에 상동성인 G1P[8] 타입 균주에 의해 초래되는 11 이상의 베시카리 스코어를 갖는 중증 로타바이러스 현상에 대한 백신 효능은 91.8%였다 (P <0.001, 투 사이디드 정밀 시험). P[8] 항원 (G3P[8], G4P[8] 및 G9P[8])을 공유하는 균주에 대한 백신 효능은 86.9%였다 (P <0.001, 투 사이디드 정밀 시험). 백신 균주와 G 또는 P 항원도 공유하지 않은 G2P[4] 로타바이러스 타입이 백신 그룹중 5개 현상 및 위약 그룹중 9개 현상에서 검출되었으며, 이는 45% 효능을 나타낸다 (P = 0.298, 투-사이디드 피셔 정밀 시험). 본 연구에서 관찰된 소수의 G2 현상으로 인해, 5개 연구의 메타 분석 (실시예 13)을 수행하였으며, 5개 연구 결과를 통합할 경우, 본 연구에서 관찰된 성향은 유의적 가치를 띠었다.

설사 질환에 대한 백신 효능

WHO 플랜 B/C에 따라 입원 및/또는 수분 공급이 요망되는 원인의 장염에 걸린 아이들의 발생 비율은 위약 그룹에서는 51.7과 비교하여 백신 그룹에서 30.9/1,000 아동기 (child-year)이며, 이는 백신 수용자중에서 모든 원인의 중증 설사 현상에서 전체 40% 감소 (P<0.001, 투-사이디드 피셔 정밀 시험)를 나타낸다. 마찬가지로, 임의의 현상의 설사로 인한 입원이 42%로 현저하게 감소되었다 (P<0.001, 투-사이디드 피셔 정밀 시험) (표 24, 모두 GE 유발).

14.3 결과 요약

중증 로타바이러스 위장염 (RV GE) 및 로타바이러스 관련-입원에 대한 백신 효능은 85% (P<0.001, 투-사이디드 피셔 정밀 시험)이며, 베시카리 스코어가 19 이상인 RV GE를 갖는 군집에서는 100%에 이른다. G1P[8] 및 HRV를 갖는 단지 P[8] 에피토프만을 공유하는 균주에 대한 효능은 각각 92% (95% C.I. 74,98) 및 87% (95% C.I. 64,97) (P<0.001, 투-사이디드 피셔 정밀 시험)에 이른다. 모든 원인으로 인한 설사에 대한 입원은 42% 감소하였다 (95% C.I. 29,53; P < 0.001, 투-사이디드 피셔 정밀 시험)에 이른다.

실시예 15 - 유럽 6개국 인간 감약된 로타바이러스 백신 로타릭스의 효능

15.1. 방법

유럽 6개국의 3,994명의 아동에게 일정한 아동 백신과 공동 투여하면서 무작위로 10^6.5 CCID₅₀ HRV (인간 로타바이러스) 백신 로타릭스^TM (조성 참조) 또는 위약 을 투여하였다. 후속 기간 제 1 효능은 2회 투여 후 2주로부터 시작되어 2005년 6월 - 7월에 끝났다. 전체 3874명의 피검체가 첫번째 1년 효능 군집에 속하였다.

백신 조성: (표 25)

백신	제형
GSK 바이오로지칼스 HRV 백신	89-12 HRV 백신 균주로부터 유래된 RIX4414 HRV 균주 106.5 중간 세포 배양물 감염성 투여량 (CCID50) 둘베코 개질된 이글 배지 (DMEM) 3.7mg 수크로오스 9mg 덱스트란 18mg 소르비톨 13.5mg 아미노산 9mg
GSK 바이오로지칼스 희석제	탄산칼슘 80mg 크산탄 3.25mg 1.3ml가 되게하는 주입용 물

15.2 백신 효능

HRV 백신은 제 1 효능 기간 동안 RV GE에 대한 방어에 매우 효과적이었다. RV GE의 임의의 현상에 대한 백신 효능은 87.1% (95% CI: 79.6%, 92.1%)이며, 중증 RV GE 현상에 대해서는 95.8% (95% CI: 89.6%; 98.7%)이었다. 질환 중증도가 증가하는데 있어서 (11 내지 20의 베시카리 스코어), 백신 효능은 더 높게 증가하였으며, 17점 이상의 베시카리 스코어를 갖는 RV GE 군집에서는 100%에 이르렀다. RV GE로 인한 입원에 대한 백신 효능은 100% (95% CI: 81.8%; 100%)이었으며, 의학적 주의가 요망되는 RV GE 현상에 대해서는 91.8% (95% CI: 84.0%; 96.3%) (표 26 및 27)이었다.

표 26 - 임의의 및 중증 RV GE를 보고하는 피검체의 백분율, RV GE 현상으로 인해 입원한 피검체의 백분율, 및 제 1 효능 기간 동안의 백신 효능 - 효능 군집

N = 각 그룹에 포함된 피검체의 수

N% = 각 그룹에서 하나 이상의 특이적 RV GE를 보고하는 피검체의 수/백분율

P-값 = 투-사이디드 피셔 정밀 시험 (유의적 값 α = 0.05)

% VE = 관찰된 백신 효능

95% CI = 95% 신뢰 구간

20 포인트 베시카리 스케일에서 11 이상의 스코어는 중증으로서 규정된다.

표 27 - 의학적 주의가 요망되는 RV GE 현상을 보고하는 피검체의 백분율 및 제 1 효능 기간 동안의 백신 효능 - 효능 군집

N = 각 그룹에 포함된 피검체의 수

N% = 각 그룹에서 하나 이상의 특이적 RV GE를 보고하는 피검체의 수/백분율

P-값 = 투-사이디드 피셔 정밀 시험 (유의적 값 α = 0.05)

% VE = 관찰된 백신 효능, 95% CI = 95% 신뢰 구간

HRV 백신은 G1P[8], G3P[8], G4P[8] 및 G9P[8] 균주에 의해 초래되는 임의의 및 중증 RV GE에 대해 매우 방어성을 띤다.

HRV 백신의 외부 캡시드 항원을 공유하지 않는 G2P[4]에 대한 방어성은 본 연구에서는 낮았으나, II기 및 III기 효능 연구를 조합한 메타 분석 결과는 G2P[4]로 인한 임의의 및 중증 GE에 대해 현저한 방어 효능을 나타내었다.

표 28 - 임의의 또는 중증 RV GE 현상을 보고하는 피검체의 백분율 및 제 1 효능 기간 동안 혈청형에 의한 백신 효능 - 효능 군집

N = 각 그룹에 포함된 피검체의 수

N% = 각 그룹에서 하나 이상의 특이적 RV GE를 보고하는 피검체의 수/백분율

P-값 = 투-사이디드 피셔 정밀 시험 (유의적 값 α = 0.05)

% VE = 관찰된 백신 효능

95% CI = 95% 신뢰 구간

20 포인트 베시카리 스케일에서 11 이상의 스코어는 중증으로서 규정된다.

† G1 및 G4 혈청형 모두가 분리되기 때문에 G1 및 G4 카테고리에 포함된 위약군으로부터의 한 피검체

15.3 결과 요약

아동 백신과 공동 투여된 2회 경구 투여량의 HRV 로타릭스^TM 백신은 G1P[8] 야생형 RV 및 비-G1P[8] RV 타입에 의해 초래되는 임의의 RV GE에 대한 유아 방어에 있어서 위약 그룹과 비교하여 제 1 효능 기간 동안 매우 효과적이었으며; 백신 효능은 각각 95.6% (95% CI: 87.9%; 98.8%) 및 79.3% (95% CI: 64.6%; 88.4%)이었다. G1P[8] 야생형 RV 및 비-G1P[8] RV 유형에 의해 초래된 중증 RV GE에 대한 효능은 각각 96.4% (95% CI: 85.7%; 99.6%) 및 95.4% (95% CI: 85.3%; 99.1%)이었다.

이러한 결과는 HRV 백신이 순환하는 RV 균주에 대해 넓은 적용 범위를 제공한다는 개념을 뒷받침해준다 (표 28 참조: G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8]). 특히, G2P[4]에 대한 백신 효능의 메타 분석을 수행하였으며, 실시예 13을 참조하길 바란다.

전체적 결론

RIX4414 로타바이러스 백신은 설사, 구토, 열, 탈수 및 입원과 관련하여 적량가능한 환자수 결과를 포함하는 정당한 베시카리 스케일 및 입원 및 수분공급에 촛점을 맞춘 케이스의 임상적 규정의해 측정된 로타바이러스 장염 현상에 대해 매우 방어성을 띠는 것으로 입증되었다. 2회 경구 투여량의 HRV 백신은 다중 순환 로타바이러스 균주로 인한 입원 및 임의의 및 중증 RVGE에 대해 유아 방어에 있어서 매유 효과적이었다.

높은 수준의 방어성이 상동성 G1P[8] 로타바이러스에 대해서도 입증되었으 며, 상기 로타바이러스는 HRV 백신과 항원적으로 유사한 두개의 외부 캡시드 단백질 (VP4 및 VP7) 및 하나의 내부 캡시드 단백질 (VP6)을 갖는다. 또한, 단지 유전자형 P[8] (VP4 항원) 및 VP6 항원을 공유하는 균주에 대해서는 잘 방어된다. HRV 백신의 외부 캡시드 하원의 일부를 공유하지 않는 로타바이러스 균주에 대한 방어성 또한, 핀란드, 싱가폴 및 라틴 아메티라로부터의 3가지의 II기 연구 및 라티아메리타 및 유럽으로부터의 2가지의 III기 연구 결과를 포함한 메타 분석으로 입증되었으며, 이는 실시예 13에 보고되어 잇으며, 중증의 G2P[4] 타입에 대한 백신 요율은 81% (95% C.I. 31.6-95.8)이었으며, G2P[4] 타입으로 인한 GE에 대한 백신 효능은 71.4% (95% C.I. 20.1-91.1)이며, 이는 백신이 또한 백신 균주와 동일한 G 또는 P 단백질을 공유하지 않은 균주에 대해서도 방어할 수 있음을 시사한다.

SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Biologicals s.a. <120> Vaccine <130> VB61582 <160> 42 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2350 <212> DNA <213> Rotavirus <400> 1 atggcttcac tcatttatag acaacttctc actaattcat attcagtaga tttacatgat 60 gaaatagagc aaattggatc agaaaaaact cagaatgtaa ctataaatcc gggtccattt 120 gcacagacta gatatgctcc agtcaattgg gatcatggag agataaatga ttcgactaca 180 gtagaaccaa ttttagatgg tccttatcag ccaactacat ttactccacc taatgattat 240 tggatactta ttaattcaaa tacaaatgga gtagtatatg aaagtacaaa taatagtgac 300 ttttggactg cagtcgttgc tattgaaccg cacgtcaacc cagtagatag acaatatatg 360 atatttggtg aaagcaagca atttaatgtg agtaacgatt caaataaatg gaagttttta 420 gaaatgttta gaagcagtag tcaaaatgaa ttttataata gacgtacatt aacttctgat 480 accagacttg taggaatatt taaatatggt ggaagagtat ggacatttca tggtgaaaca 540 ccgagagcta ctactgacag ttcaagtact gcaaatttaa ataatatatc aattacaatt 600 cattcagaat tttacattat tccaaggtcc caggaatcta aatgtaatga atatattaat 660 aatggtctgc caccaattca aaatactaga aatgtagttc cattgccatt atcatctaga 720 tcgatacagt ataagagagc acaagttaat gaagacatta tagtttcaaa aacttcatta 780 tggaaagaaa tgcagtataa tagggatatt ataattagat ttaaatttgg taatagtatt 840 gtaaagatgg gaggactagg ttataaatgg tctgaaatat catataaggc agcaaattat 900 caatataatt acttacgtga cggtgaacaa gtaaccgcac acaccacttg ttcagtaaat 960 ggagtgaaca attttagcta taatggaggg tttctaccca ctgattttgg tatttcaagg 1020 tatgaagtta ttaaagagaa ttcttatgta tatgtagact attgggatga ttcaaaagca 1080 tttagaaata tggtatatgt tagatcatta gcagctaatt taaattcagt gaaatgtaca 1140 ggtggaagtt attatttcag tataccagta ggtgcatggc cagtaatgaa tggtggcgct 1200 gtttcgttgc attttgccgg agttacatta tccacgcaat ttactgattt tgtatcatta 1260 aattcactac gatttagatt tagtttgaca gttgatgaac cacctttctc aatactgaga 1320 acacgtacag tgaatttgta tggattacca gccgctaatc caaataatgg aaatgaatac 1380 tacgaaatat caggaaggtt ttcactcatt tctttagttc caactaatga tgattatcag 1440 actccaatta tgaattcagt gacggtaaga caagatttag agcgccaact tactgattta 1500 cgagaagaat ttaactcatt gtcacaagaa atagctatgg cacaattgat 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<400> 2 ggctataaaa tggcttcgct catttataga caacttctca ctaattcata ttcagtagat 60 ttacatgatg aaatagagca aattggatca gaaaaaactc agaatgtaac tataaatccg 120 ggtccatttg cacagactag atatgctcca gtcaattggg atcatggaga gataaatgat 180 tcgactacag tagaaccaat tttagatggt ccttatcagc caactacatt tactccacct 240 aatgattatt ggatacttat taattcaaat acaaatggag tagtatatga aagtacaaat 300 aatagtgact tttggactgc agtcgttgct attgaaccgc acgtcaaccc agtagataga 360 caatatatga tatttggtga aagcaagcaa tttaatgtga gtaacgattc aaataaatgg 420 aagtttttag aaatgtttag aagcagtagt caaaatgaat tttataatag acgtacatta 480 acttctgata ccagacttgt aggaatattt aaatatggtg gaagagtatg gacatttcat 540 ggtgaaacac cgagagctac tactgacagt tcaagtactg caaatttaaa taatatatca 600 attacaattc attcagaatt ttacattatt ccaaggtccc aggaatctaa atgtaatgaa 660 tatattaata atggtctgcc accaattcaa aatactagaa atgtagttcc attgccatta 720 tcatctagat cgatacagta taagagagca caagttaatg aagacattat agtttcaaaa 780 acttcattat ggaaagaaat gcagtataat agggatatta taattagatt taaatttggt 840 aatagtattg 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cagaaatgac taattcattg tcagatgctg cttcatcagc atcaagaaac 1740 gtttctatta gatcgaattt atctgcgatt tcaaattgga ctaatgtttc aaatgatgtg 1800 tcaaacgtaa ctaattcatt gaacgatatt tcaacacaaa catctacaat tagtaagaaa 1860 cttagattaa aagaaatgat tactcaaact gaaggaatga gctttgacga catttcagca 1920 gctgtactaa aaacaaaaat agatatgtct actcaaattg gaaaaaatac tttacctgat 1980 atagttacag aagcatctga gaaatttatt ccaaaacgat catatcgaat attaaaggat 2040 gatgaagtaa tggaaattaa tactgaagga aaattctttg catacaaaat taatacattt 2100 gatgaagtgc cattcgatgt aaataaattc gctgaactag taacagattc tccagttata 2160 tcagcgataa tcgattttaa gacattgaaa aatttaaatg ataattatgg aatcactcgt 2220 acagaagcgt taaatttaat taaatcgaat ccaaatatgt tacgtaattt cattaatcaa 2280 aataatccaa ttataaggaa tagaattgaa cagttaatac tacaatgtaa attgtgagaa 2340 cgctattgag gatgtgacc 2359 <210> 3 <211> 1009 <212> DNA <213> Rotavirus <400> 3 atgtatggtc ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaattat tctactcaac 60 tatatattaa aatcagtaac tcgaataatg gactacatta tatatagatc tttgttgatt 120 tatgtagcat 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Phe Leu Glu Met Phe Arg 130 135 140 Ser Ser Ser Gln Asn Glu Phe Tyr Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Asp 145 150 155 160 Thr Arg Leu Val Gly Ile Phe Lys Tyr Gly Gly Arg Val Trp Thr Phe 165 170 175 His Gly Glu Thr Pro Arg Ala Thr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Ala Asn 180 185 190 Leu Asn Asn Ile Ser Ile Thr Ile His Ser Glu Phe Tyr Ile Ile Pro 195 200 205 Arg Ser Gln Glu Ser Lys Cys Asn Glu Tyr Ile Asn Asn Gly Leu Pro 210 215 220 Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Leu Pro Leu Ser Ser Arg 225 230 235 240 Ser Ile Gln Tyr Lys Arg Ala Gln Val Asn Glu Asp Ile Ile Val Ser 245 250 255 Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Tyr Asn Arg Asp Ile Ile Ile 260 265 270 Arg Phe Lys Phe Gly Asn Ser Ile Val Lys Met Gly Gly Leu Gly Tyr 275 280 285 Lys Trp Ser Glu Ile Ser Tyr Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr 290 295 300 Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val Asn 305 310 315 320 Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn Gly Gly Phe Leu Pro Thr Asp Phe 325 330 335 Gly Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Val 340 345 350 Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Lys Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg 355 360 365 Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Ser Val Lys Cys Thr Gly Gly Ser Tyr 370 375 380 Tyr Phe Ser Ile Pro Val Gly Ala Trp Pro Val Met Asn Gly Gly Ala 385 390 395 400 Val Ser Leu His Phe Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp 405 410 415 Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Asp 420 425 430 Glu Pro Pro Phe Ser Ile Leu Arg Thr Arg Thr Val Asn Leu Tyr Gly 435 440 445 Leu Pro Ala Ala Asn Pro Asn Asn Gly Asn Glu Tyr Tyr Glu Ile Ser 450 455 460 Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Thr Asn Asp Asp Tyr Gln 465 470 475 480 Thr Pro Ile Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gln 485 490 495 Leu Thr Asp Leu Arg Glu Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gln Glu Ile Ala 500 505 510 Met Ala Gln Leu Ile Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe Ser 515 520 525 Met Phe Ser Gly Ile Lys Ser Thr Ile Asp Leu Thr Lys Ser Met Ala 530 535 540 Thr Ser Val Met Lys Lys Phe Arg Lys Ser Lys Leu Ala Thr Ser Ile 545 550 555 560 Ser Glu Met Thr Asn Ser Leu Ser Asp Ala Ala Ser Ser Ala Ser Arg 565 570 575 Asn Val Ser Ile Arg Ser Asn Leu Ser Ala Ile Ser Asn Trp Thr Asn 580 585 590 Val Ser Asn Asp Val Ser Asn Val Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ile Ser 595 600 605 Thr Gln Thr Ser Thr Ile Ser Lys Lys Leu Arg Leu Lys Glu Met Ile 610 615 620 Thr Gln Thr Glu Gly Met Ser Phe Asp Asp Ile Ser Ala Ala Val Leu 625 630 635 640 Lys Thr Lys Ile Asp Met Ser Thr Gln Ile Gly Lys Asn Thr Leu Pro 645 650 655 Asp Ile Val Thr Glu Ala Ser Glu Lys Phe Ile Pro Lys Arg Ser Tyr 660 665 670 Arg Ile Leu Lys Asp Asp Glu Val Met Glu Ile Asn Thr Glu Gly Lys 675 680 685 Phe Phe Ala Tyr Lys Ile Asn Thr Phe Asp Glu Val Pro Phe Asp Val 690 695 700 Asn Lys Phe Ala Glu Leu Val Thr Asp Ser Pro Val Ile Ser Ala Ile 705 710 715 720 Ile Asp Phe Lys Thr Leu Lys Asn Leu Asn Asp Asn Tyr Gly Ile Thr 725 730 735 Arg Thr Glu Ala Leu Asn Leu Ile Lys Ser Asn Pro Asn Met Leu Arg 740 745 750 Asn Phe Ile Asn Gln Asn Asn Pro Ile Ile Arg Asn Arg Ile Glu Gln 755 760 765 Leu Ile Leu Gln Cys Lys Leu 770 775 <210> 6 <211> 326 <212> PRT <213> Rotavirus <400> 6 Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Ile Leu Ile Phe Leu Ile Ser Ile 1 5 10 15 Ile Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Val Thr Arg Ile Met Asp Tyr 20 25 30 Ile Ile Tyr Arg Ser Leu Leu Ile Tyr Val Ala Leu Phe Ala Leu Thr 35 40 45 Arg Ala Gln Asn Tyr Gly Leu Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp 50 55 60 Thr Val Tyr Ala Asn Ser Thr Gln Glu Gly Ile Phe Leu Thr Ser Thr 65 70 75 80 Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile Asn Asp Gly 85 90 95 Glu Trp Lys Asp Ser Leu Ser Gln Met Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro 100 105 110 Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Ser Ser Ile Val Asp Phe Ser 115 120 125 Val Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Leu Val Leu Met Lys Tyr 130 135 140 Asp Gln Asn Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu 145 150 155 160 Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Thr Leu Tyr Tyr Tyr Gln 165 170 175 Gln Ser Gly Glu Ser Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Ser Ser Cys Thr 180 185 190 Val Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Met Leu Gly Ile Gly Cys Gln 195 200 205 Thr Thr Asn Val Asp Ser Phe Glu Met Val Ala Glu Asn Glu Lys Leu 210 215 220 Ala Ile Val Asp Val Val Asp Gly Ile Asn His Lys Ile Asn Leu Thr 225 230 235 240 Thr Thr Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu 245 250 255 Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Ser Asn Val Leu Asp Ile Thr 260 265 270 Ala Asp Pro Thr Thr Asn Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Val Asn 275 280 285 Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp Tyr Ile Asn 290 295 300 Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asn Ser Ala 305 310 315 320 Ala Phe Tyr Tyr Arg Val 325 <210> 7 <211> 175 <212> PRT <213> Rotavirus <400> 7 Met Asp Lys Leu Ala Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Ser Val Ile Thr Leu 1 5 10 15 Met Asn Asp Thr Leu His Ser Ile Ile Gln Asp Pro Gly Met Ala Tyr 20 25 30 Phe Ser Tyr Ile Ala Ser Val Leu Thr Val Leu Phe Ile Leu His Lys 35 40 45 Ala Ser Ile Pro Thr Met Lys Ile Ala Leu Lys Thr Ser Lys Cys Ser 50 55 60 Tyr Lys Val Ile Lys Tyr Cys Ile Val Thr Ile Ile Asn Thr Leu Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Glu Gln Val Thr Thr Lys Asp Glu Ile Glu 85 90 95 Gln Gln Met Asp Arg Ile Val Lys Glu Met Arg Arg Gln Leu Asp Met 100 105 110 Ile Asp Lys Leu Thr Thr Arg Glu Ile Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys 115 120 125 Arg Ile His Asp Asn Leu Ile Thr Arg Pro Val Asp Val Ile Asp Met 130 135 140 Ser Lys Glu Phe Asn Gln Lys Asn Ile Lys Thr Leu Asp Glu Trp Glu 145 150 155 160 Ser Gly Lys Asn Pro Tyr Glu Pro Ser Glu Val Thr Ala Ser Met 165 170 175 <210> 8 <211> 750 <212> DNA <213> Rotavirus <400> 8 ggcttttaaa agttctgttc cgagagagcg cgtgcggaaa gatggataag cttgccgacc 60 tcaactacac attgagtgta atcactttaa tgaatgacac attgcattct ataattcaag 120 atcctggaat ggcgtatttt tcatatattg catctgttct aacagtttta ttcatattac 180 ataaagcttc aattccaacc atgaaaatag cattgaaaac atcaaaatgt tcatataaag 240 tgattaaata ttgtatagtc acgatcatta atactctttt aaaattggct ggatataaag 300 agcaggttac tacaaaagac gaaattgagc aacagatgga cagaattgtt aaagagatga 360 gacgtcagct ggatatgatt gataaattaa ctactcgtga aattgaacag gttgaattgc 420 ttaaacgtat acatgacaac ctgataacta gaccagttga cgtcatagat atgtcgaagg 480 aattcaatca gaaaaacatc aaaacgctag atgaatggga gagtggaaaa aatccatatg 540 aaccgtcaga agtgactgca tccatgtgag aggttgagtt accgtcgtct gtcttcggaa 600 gcggcggaac tcttcaccgc aagccccatt agacctgatg attgactgag aagccacagt 660 caatcatatc gcgtgtggct cagccttaat cccgtttaac caatccagcg agtgttggac 720 gttaatggaa ggaatggtct tagtgtgacc 750 <210> 9 <211> 397 <212> PRT <213> Rotavirus <400> 9 Met Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp 1 5 10 15 Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln 20 25 30 Gln Phe Asn Gln Met Ile Val Thr Met Asn Gly Asn Asp Phe Gln Thr 35 40 45 Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Val Arg Asn Trp Thr Phe Asp Phe Gly 50 55 60 Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Asn 65 70 75 80 Ala Arg Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Ile Asp Asn Val Cys 85 90 95 Met Asp Glu Met Ala Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Val Ser Pro Gln 100 105 110 Ser Glu Ala Leu Arg Lys Leu Ala Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn 115 120 125 Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg 130 135 140 Arg Gln Arg Thr Gly Phe Val Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr 145 150 155 160 Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Met His Asp Asn Leu 165 170 175 Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly 180 185 190 Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe 195 200 205 Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Ala Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr 210 215 220 Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser 225 230 235 240 Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Phe Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro 245 250 255 Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr 260 265 270 Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile 275 280 285 Arg Leu Leu Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val 290 295 300 Asn Ala Leu Phe Pro Gln Ala Gln Pro Phe Gln His His Ala Thr Val 305 310 315 320 Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala 325 330 335 Asp Ala Asn Glu Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ala Val Arg Gln Glu 340 345 350 Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr 355 360 365 Glu Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg 370 375 380 Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys 385 390 395 <210> 10 <211> 1356 <212> DNA <213> Rotavirus <400> 10 ggctttaaaa cgaagtcttc gacatggagg ttctgtactc actgtcaaaa actcttaaag 60 atgctaggga caaaattgtt gaaggtacat tatattctaa cgttagcgat cttattcagc 120 aattcaatca aatgatagta actatgaatg gaaatgactt tcagactgga ggaattggta 180 atttacctgt tagaaattgg actttcgatt ttggtctatt aggtacaaca cttttgaact 240 tggatgctaa ttatgttgag aatgcaagaa ctacaattga atattttatt gactttattg 300 ataatgtatg tatggatgaa atggcaagag aatctcaaag aaatggagta tcgccacaat 360 ctgaagcgtt aagaaagcta gcgggaatta aatttaagag aataaatttc gataattcat 420 cagaatacat agaaaattgg aacttacaaa atagaagaca gcgcaccgga tttgtttttc 480 ataaacctaa catttttcca tactcagctt catttactct aaatagatct caaccaatgc 540 atgataattt aatgggaacc atgtggctta atgctggatc agaaattcaa gtggctggat 600 ttgattactc atgcgccata aatgcaccag cgaacataca gcaatttgag catatcgttc 660 agcttaggcg cgcactgact acagctacta taactttatt acctgatgca gagagattta 720 gttttccaag agtaattaat tcagctgatg gcgcgactac atggttcttt aatccagtta 780 ttctaagacc aaacaatgta gaggtagaat ttttattgaa tggacaaatt attaatacat 840 atcaggctag atttggtact atcatcgcaa gaaattttga tacaattcgt ttattatttc 900 agttgatgcg tccacctaat atgacaccag ctgttaatgc actatttcca caagcacaac 960 cttttcagca ccatgcaaca gttggactta cattacgtat tgaatctgcg gtttgtgaat 1020 cagtgcttgc ggacgcgaat gaaactctgt tagcaaatgt gaccgcggtg cgtcaagaat 1080 atgccatacc agttggaccg gtatttccac caggcatgaa ttggactgaa ttgattacta 1140 actattcgcc atctagagaa gataacttgc aacgcgtttt cacggtagct tccattagaa 1200 gcatgttgat taagtgagga ccagactaaa catctggtat ccaatcttag ttagcatgta 1260 gctacatcaa gtcattcaga ctcttcaagt aaggacatga tttcatgttc gctacgtaga 1320 gtaactgtct gaatgatgta gtgagaggat gtgacc 1356 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 11 ggctttaaaa gagagaattt ccgtctgg 28 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 12 ggttagctcc ttttaatgta tggta 25 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 13 ggtcacatcg aacaattcta atctaag 27 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 14 caagtactca aatcaatgat gg 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 15 tgttgatttt tctgtcgatc cac 23 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 16 ggttgctgag aatgagaaat tagctatagt gg 32 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 17 ccactatagc taatttctca ttctcagcaa cc 32 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 18 tggcttcgcc attttataga ca 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 19 atttcggacc atttataacc 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 20 tggcttcact catttataga ca 22 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 21 atttcagacc atttataacc tag 23 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 22 ggagtagtat atgaaagtac aaataatag 29 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 23 ctattatttg tactttcata tactactcc 29 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 24 tcgatacagt ataagagagc acaag 25 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 25 ttcattaact tgtgctctct tatactg 27 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 26 gtatatgtag actattggga tg 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 27 catcccaata gtctacatat ac 22 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 28 tgtaactccg gcaaaatgca acg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 29 cgttgcattt tgccggagtt aca 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 30 gtaagacaag atttagagcg cca 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 31 tggcgctcta aatcttgtct tac 23 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 32 cttgatgctg atgaagcagc atctg 25 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 33 cagatgctgc ttcatcagca tcaag 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 34 cgatcatatc gaatattaaa ggatg 25 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 35 catcctttaa tattcgatat gatcg 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 36 agcgttcaca caatttacat tgtag 25 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 37 agtattttat actatagtag attatattaa tc 32 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 38 agtattttat actatggtag attatattaa tc 32 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 39 atccccatta tactgcattc ctttc 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 40 atccctatta tactgcattt ctttc 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 41 atccccatta tactgcattt ctttc 25 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sharing homoly with rotavirus nucleotide sequences <400> 42 atccctatta tactgcattc ctttc 25

Claims (23)

1. Gx 타입 또는 Py 타입도 아닌 로타바리어스 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 GxPy 타입의 감약된 로타바이러스 균주를 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 로타바이러스 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
2. Gx 타입 또는 Py 타입도 아닌 로타바리어스 균주에 의해 초래된 로타바이러스 감염에 대한 면역 반응을 유도하는 약제 제조시 GxPy 타입으로부터의 감약된 로타바이러스 균주의 용도.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 조성물이 누클레오티드 서열에 하기중 하나 이상을 포함하는 VP4 유전자를 갖는 로타바이러스를 포함하는 방법 또는 용도:

   개시 코돈으로부터 788번 위치에 아데닌 염기 (A), 802번 위치에 아데닌 염기 (A) 및 501번 위치에 티민 염기 (T)
4. 제 3항에 있어서, VP4 유전자가 개시 코돈으로부터 788번 및 802번 위치에 아데닌 염기 (A) 및 501번 위치에 티민 염기 (T)를 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 방법 또는 용도.
5. 제 1항 내지 제 4항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 누클레오티드 서열 에 하기중 하나 이상을 포함하는 VP7 유전자를 갖는 로타바이러스를 포함하는 방법 또는 용도:

   개시 코돈으로부터 605번 위치에 티민 (T), 897번 위치에 아데닌 (A) 및 897번 위치에 구아닌 (G)
6. 제 5항에 있어서, VP7 유전자가 개시 코돈으로부터 605번 위치에 티민 (T) 및 897번 위치에 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G)을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 방법 또는 용도.
7. 제 1항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 누클레오티드 서열에 개시 코돈으로부터 788번 및 802번 위치에 아데닌 (A) 및 501번 위치에 티민 (T)를 포함하는 VP4 유전자를 갖는 로타바이러스를 포함하며, VP7 유전자는 누클레오티드 서열에 개시 코돈으로부터 605번 위치에 티민 (T) 및 897번 위치에 아데닌 (A)를 포함하는 방법 또는 용도.
8. 제 1항 내지 제 7항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 G1 로타바이러스 균주를 포함하며, G1 혈청형, 및 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 및 G14 혈청형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-G1 혈청형에 대한 면역반응을 유도하는데 사용되는 방법 또는 용도.
9. 제 8항에 있어서, 조성물이 G1 로타바이러스 균주를 포함하며, G1 및 G2 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용되는 방법 또는 용도.
10. 제 9항에 있어서, 조성물이 G3, G4 및 G9로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-G1 혈청형에 대한 면역 반응을 추가로 유도가능한 방법 또는 용도.
11. 제 1항 내지 제 10항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 P[8] 로타바이러스 균주를 포함하며, P[8] 타입, 및 P[1], P[2], P[3], P[4], P[5], P[6], P[7], P[9], P[11], P[12], P[14] 및 P[19] 타입으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-P[8] 타입에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용되는 방법 또는 용도.
12. 제 11항에 있어서, 조성물이 P[4] 타입에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용되는 방법 또는 용도.
13. 제 1항 내지 제 12항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 G1P[8] 로타바이러스 균주를 포함하며, G2P[4] 로타바이러스 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 방법 또는 용도.
14. 제 1항 내지 제 13항중의 어느 한 항에 있어서, GxPy 타입의 감약된 로타바이러스 균주를 포함하는 조성물이 Gx 타입 또는 Py 타입도 아닌 로타바리어스 균주 에 의해 초래된 중증 로타바이러스-유도된 장염에 대한 방어성을 제공하는 방법 또는 용도.
15. 제 1항 내지 제 14항중의 어느 한 항에 있어서, GxPy 타입의 감약된 로타바이러스 균주를 포함하는 조성물이 로타바이러스 균주의 Gx 타입 또는 Py 타입도 아닌 로타바이러스 균주에 의해 초래된 설사에 대해 백신접종된 개체 군집에서 40% 이상의 방어율을 나타내는 방법 또는 용도.
16. 제 15항에 있어서, 조성물이 50% 이상의 방어율을 나타내는 방법 또는 용도.
17. 제 1항 내지 제 16항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 60% 이상의 방어율을 나타내는 방법 또는 용도.
18. 제 14항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 40% 내지 80% 방어율을 나타내는 방법 또는 용도.
19. 제 18항에 있어서, 조성물이 50% 내지 70% 방어율을 나타내는 방법 또는 용도.
20. 제 1항 내지 제 19항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 G1P[8] 로타바이러 스 균주를 포함하며, G2P4 혈청형을 갖는 로타바이러스 감염에 의해 초래된 중증 장염에 대해 백신접종된 개체군집에서 40% 내지 70% 방어율을 나타내는 방법 또는 용도.
21. 제 1항 내지 제 20항중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물중의 로타바이러스 균주가 ECACC 기탁물 99081301이거나 ECACC 기탁물 99081301로부터 획득가능하거나 유도가능한 방법 또는 용도.
22. 제 1항 내지 제 21항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 2회 투여 요법으로 투여되는 방법 또는 용도.
23. 제 1항 내지 제 21항중의 어느 한 항에 있어서, 감약된 로타바이러스 균주가 적합한 약제학적 담체, 제산성 희석제 또는 이 둘 모두로 제형화되는 방법 또는 용도.

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