EA014328B1 - Ротавирусная вакцина, индуцирующая гетеротипический перекрестный иммунитет - Google Patents

Abstract

Согласно изобретению предложен способ индукции иммунного ответа против штамма ротавируса, включающий введение субъекту композиции, содержащей ослабленный штамм ротавируса типа GxPy, причем указанная композиция вызывает иммунный ответ против штамма ротавируса, который не представляет собой ни тип Gx, ни тип Ру.

Description

Данное изобретение относится к препаратам ротавирусной вакцины. Изобретение относится к применению ослабленной популяции ротавируса одного типа в предупреждении заболевания, связанного с инфекцией ротавируса другого типа.

Предшествующий уровень техники

Острая инфекционная диарея является основной причиной заболеваний и смерти во многих районах мира. В развивающихся странах влияние диареи поразительно. По оценкам в Азии, Африки и Латинской Америке наблюдают 3-4 биллиона случаев диареи каждый год, и из этих случаев около 5-10 миллионов приводят к смерти (ХУаНг 1.А. е! а1.: Ν.Εη§1. 1. Меб., 301:967-974 (1979)).

Ротавирусы известны как одна из наиболее важных причин тяжелой диареи у младенцев и маленьких детей (Ейек, М.К. Во!ау1ги8е8 апб Тйеп Верйеабоп ίη Р1е1б§ У1го1о§у, третье издание, под редакцией Р1е1б§ е! а1., Вауеп РиЬНкРега, РЫ1абе1рЫа, 1996). Установлено, что ротавирусные заболевания лежат в основе более одного миллиона смертей ежегодно. Болезни, вызванные ротавирусами, наиболее часто поражают детей в возрасте между 6 и 24 месяцами, и максимальное распространение заболевания обычно наблюдается во время более холодных месяцев в зоне умеренного климата и круглый год в тропических областях. Ротавирусы обычно передаются от человека к человеку фекально-оральным способом с инкубационным периодом примерно от 1 до 3 дней. В отличие от инфекции в возрастной группе от 6 месяцев до 24 месяцев, инфекция у новорожденных обычно протекает бессимптомно или заболевание имеет легкую степень тяжести. В отличие от тяжелого заболевания, обычно встречающегося у маленьких детей, большинство взрослых имеют иммунитет в результате предыдущей ротавирусной инфекции, вследствие чего большинство инфекций у взрослых имеют легкую степень тяжести или протекают бессимптомно (ОВД, Р.А. е! а1. Сотр. Тйег., 8(8):2126, 1982).

Ротавирусы обычно имеют сферическую форму, и их название является производным от их уникальной внешней и внутренней или двухслойной структуры капсида. Обычно двухслойная структура капсида ротавируса окружает внутреннюю белковую оболочку или ядро, которое содержит геном. Геном ротавируса составлен из 11 сегментов двуцепочечной РНК, которая кодирует по меньшей мере 11 различных вирусных белков. Два из этих белков, обозначаемые УР4 и УР7, расположены на наружной стороне двухслойной капсидной структуры. Внутренний капсид ротавируса представлен одним белком, который является ротавирусным белком, обозначаемым УР6. Относительная значимость этих трех конкретных ротавирусных белков в индукции иммунного ответа, который вызывает ротавирусная инфекция, пока неясна. Тем не менее, белок УР6 определяет групповой и подгрупповой антиген, а белки УР4 и УР7 являются определителями серотипической (типы, определяемые посредством реакции нейтрализации) и генотипической (типы, определяемые не с помощью серологического анализа) специфичности. Обозначение для 6 серотипов и С генотипов идентично. В отличие от этого, номера, присвоенные Р серотипам и генотипам, отличаются (8ап!о§ Ν. Е! НокЫпо Υ., 2005, Веу1е\\ъ ίη Меб1са1 Упо1о§у, 15, 29-56). Поэтому Р серотип обозначают как Р, за которым следует присвоенный номер, а Р генотип обозначают как Р, за которым следует присвоенный номер в скобках.

На сегодняшний день идентифицировано по меньшей мере 14 С серотипов ротавируса и 14 Р серотипов ротавируса (8ап!о§ Ν. Е! НокЫпо Υ., 2005, Веу1е\\ъ ίη Меб1са1 Упо1оду, 15, 29-56). Среди них 10 6 серотипов (61-6, 68-10 и 612) и 9 Р серотипов (Р1, Р2А, Р3, Р4, Р5А, Р7, Р8, Р11 и Р12) были идентифицированы среди ротавирусов человека. Было описано двадцать три Р генотипа, десять из которых выделены из человека (Р[3]-[6], Р[8]-[11], Р[14] и Р[19]).

Белок УР7 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 38000 (в негликозилированном состоянии 34000), который является продуктом трансляции сегмента генома 7, 8 или 9 в зависимости от штамма. Данный белок стимулирует образование нейтрализующих антител после ротавирусной инфекции. Белок УР4 представляет собой негликозилированный белок с молекулярной массой около 88000, который является продуктом трансляции сегмента генома 4. Данный белок также стимулирует нейтрализующие антитела после ротавирусной инфекции.

Поскольку белки УР4 и УР7 являются вирусными белками, против которых направлены нейтрализующие антитела, полагают, что они являются главными кандидатами для развития ротавирусных вакцин, обеспечивающих иммунитет против ротавирусных заболеваний.

Известно, что естественная ротавирусная инфекция в раннем детстве вызывает защитный иммунитет. Таким образом, крайне предпочтительной является живая ослабленная ротавирусная вакцина. Удобно, если это будет пероральная вакцина, так как это естественный путь инфицирования вирусом.

Ранняя разработка вакцины для предупреждения ротавирусных инфекций началась в 1970-е после открытия вируса. Вначале изучали ослабленные штаммы из животных и человека и получали противоречивые или неутешительные результаты. Более недавние попытки были сосредоточены на реассортантных штаммах вирусов человека и животных, которые были более успешны.

Ротавирусный штамм, известный как 89-12, был описан \Уагб. см. патент США № 5474773, и

- 1 014328

ВепгЛеш. Э.Ь. е! а1., Уассше, 16 (4), 381-387, 1998. Штамм 89-12 был выделен из образца кала, полученного от 14-месячного ребенка с естественным ротавирусным заболеванием в 1988. Согласно патенту США № 5474773 ротавирус человека НКУ 89-12 был затем адаптирован к выращиванию в культуре с помощью 2 пассажей в первичных клетках почки африканской зеленой мартышки (АСМК, ЛГпсап Сгееп Мопкеу Ктбпеу) и 4 пассажей в клетках МА-104, как описано \Уагб в 1. С1ш. МюгоЫоЦ 19, 748-753, 1984. Затем его очищали выделением из бляшек 3 раза в клетках МА-104 (до 9 пассажа) и выращивали после 2 дополнительных пассажей в данных клетках. Был проведен один дополнительный пассаж (пассаж 12) для помещения в американскую коллекцию типовых культур (АТСС, Лшепсап Туре СиЙиге СоПесИоп) под инвентарным номером АТСС УК 2272. Помещенный в коллекцию штамм также известен как 89-12С2.

На статью Вегпйеш е! а1. в Уассше в 1988 году ниже ссылаются как на статью в Уассше (1998). Статья описывает безопасность и иммуногенность кандидата на живую человеческую ротавирусную вакцину, вводимого перорально. Данная вакцина была получена из штамма 89-12, атеннуированного посредством пересева без очищения выделением из бляшек 26 раз в первичных клетках АСМК и затем еще 7 раз в постоянной клеточной линии АСМК (всего 33 пассажа).

В дальнейшем на вышеуказанный материал, который прошел 26 последовательных пассажей, будут ссылаться как на Р26, а на материал, который прошел 33 последовательных пассажа, будут ссылаться как на Р33. В целом, на ротавирус, полученный посредством пересева штамма 89-12 п раз будут ссылаться как на Рп.

В приведенных ниже примерах для материала Р33 были проведены 5 дополнительных пассажа в клетках Уего. На этот материал ссылаются как на Р38.

Выделенные культуры Р26 и Р33, описанные в статье в Уассше (1998), не были депонированы в коллекции культур, также они не были проанализированы для установления их генетической характеристики.

Было обнаружено, что популяция Р26, описанная в литературе, содержит смесь вариантов. Это было установлено посредством генетической характеристики, как описано ниже (смотри примеры). Таким образом, Р26 не является надежной единообразной популяцией для дальнейших пассажей, в частности для продуцирования серий вакцины. Аналогично Р33 содержит смесь вариантов и не является надежно единообразной популяцией для продуцирования серий вакцины.

Было обнаружено, что материал Р26 является смесью по меньшей мере трех генных вариантов УР4. Аналогично Р33 и Р38 являются смесью двух вариантов. При оценке титров нейтрализующих антител в сыворотке, полученной от детей, вакцинированных Р33 по сравнению с другими вариантами, оказалось, что эти варианты отличаются в антигеном отношении, в том, что касается нейтрализующих эпитопов, от штамма 89-12С2, хранящегося в АТСС.

Кроме того, было обнаружено, что при введении материала Р33 детям, реплицируются и выделяются два идентифицированных варианта. Из 100 вакцинированных детей только у 2 были признаки гастроэнтерита вследствие ротавирусной инфекции, в то время 20% плацебо группы были инфицированы.

Эти данные предполагают, что идентифицированные варианты связаны с иммунитетом против ротавирусного заболевания.

XVО 01/12797 раскрывает способ разделения вариантов ротавируса и улучшенную живую ослабленную вакцину, полученную от клонированного (гомогенного) штамма ротавируса человека. Также раскрыта ослабленная ротавирусная популяция (культура), характеризуемая тем, что она содержит единственный вариант или преимущественно единственный вариант, который определяется нуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере один из основных вирусных белков, обозначаемых как УР4 и УР7. Были получены сообщения о защитной эффективности такой пероральной ослабленной человеческой ротавирусной вакцины по отношению к гетерологичному штамму С9 у детей в Латинской Америке (Регех е! а1. 42-я межотраслевая конференция по противомикробным агентам и химиотерапии (1СААС 2002) 27-30 сентября 2002, Сан-Диего). νθ 05/021033 раскрывает тот факт, что один серотип ротавируса может быть использован для защиты от заболевания, вызванного другим серотипом. В частности, νθ 05/021033 раскрывает применение популяции ротавируса С1 [например, такой как помещенная в Европейскую коллекцию животных клеточных культур (ЕСАСС, Еигореап Со11есПоп оГ Ашша1 Се11 СиЙигек) Лабораторией по исследованию и продуцированию вакцин, Лабораторная служба здравоохранения, Центр прикладной микробиологии и исследований, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир, 8РС4 01С, Великобритания, 13 августа 1999 года под инвентарным номером 99081301, в соответствии с условиями Будапештского договора, также называемой Р43 или ΚΙΧ4414] для предупреждения заболевания, вызванного как серотипом С1, так и по меньшей мере одним из серотипов ротавируса, не являющимся С1, такими как серотипами ротавируса С2, С3, С4 и С9, но не ограничиваясь ими.

Полное содержание νθ 01/12797 и νθ 05/021033 включено ниже посредством ссылки.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1А (8 ЕС ΙΌ N0:1) представлена нуклеотидная последовательность гена УР4 Р43

- 2 014328 (ШХ4414), включающая последовательность, кодирующую белок ΥΡ4 Р43.

Фиг. 1В (5>Е0 ΙΌ N0:2) имеет дополнительные нуклеотиды на обоих концах гена и нуклеотидную замену (выделено жирным - 6 вместо С в позиции 18, что приводит к ТСС вместо ТСА, не оказывая однако влияния на получаемый кодируемый белок) вследствие техники секвенирования. Малым регистром выделена некодирующая последовательность. Фиг. 1В показывает правильную последовательность для штамма из коллекции Р43.

На фиг. 2А (5>Е0 ΙΌ N0:3) представлена нуклеотидная последовательность гена УР7 Р43 (ШХ4414), включающая последовательность, кодирующую белок УР7 Р43.

Фиг. 2В (5>Е0 ΙΌ N0:4) имеет дополнительные нуклеотиды на обоих концах гена и нуклеотидную замену (выделено жирным - А вместо С в позиции 58, что приводит к АТТ, кодирующему лейцин, вместо СТТ, кодирующему изолейцин) вследствие техники секвенирования. Малым регистром выделена некодирующая последовательность. Фиг. 2В показывает правильную последовательность для штамма из коллекции Р43.

На фиг. 3 (5>Е0 ΙΌ N0:5) представлена полипептидная последовательность УР4 ΡΙΧ4414.

На фиг. 4 (5>Е0 ΙΌ N0:6) представлена полипептидная последовательность УР7 ΡΙΧ4414.

На фиг. 5 (5>Е0 ΙΌ N0:7) показана полипептидная последовательность белка ЖР4 ΡΙΧ4414.

На фиг. 6 (5>Е0 ΙΌ N0:8) показана нуклеотидная последовательность, кодирующая белок Х8Р4 ШХ4414. Некодирующая последовательность выделена малым регистром.

На фиг. 7 (5>Е0 ΙΌ N0:9) показана полипептидная последовательность белка УР6 ΡΙΧ4414.

На фиг. 8 (5>Е0 ΙΌ N0:10) показана нуклеотидная последовательность, кодирующая белок УР6 ШХ4414. Некодирующая последовательность выделена малым регистром.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении авторы изобретения определили, что ослабленная ротавирусная популяция, например, одна из охарактеризованных в \Х0 01/12797, может быть использована в качестве вакцины для обеспечения перекрестного иммунитета против заболеваний, вызванных ротавирусной инфекцией типа (серотипа и/или генотипа), отличного от того, который использовался в вакцине. Белок УР7 определяет С тип (серотип), а белок УР4 определяет Р тип штамма (серотип или генотип).

В частности настоящее изобретение относится к применению ослабленной ротавирусной популяции одного Р типа в предупреждении заболевания, связанного с ротавирусной инфекцией другого Р типа, и особенно к применению ослабленной ротавирусной популяции или штамма СхРу типа в индукции иммунного ответа и/или предупреждении заболевания, связанного с ротавирусной инфекцией, вызванной штаммом ротавируса, который не относится ни к Сх, ни к Ру типу.

Иммунитет может быть измерен по образованию нейтрализирующих антител на вакцину или по образованию антител ΙβΑ на ротавирус в сыворотке, например по фактору серологической конверсии (т.е. увеличение уровня антител ΙβΑ в сыворотке после вакцинации > чем в 3 раза, как описано \Хагб е! а1., 1990, 1. Шее!. Ощеаке, 161, 440-445).

В контексте данного изобретения, а также в соответствии с общепринятым пониманием в области (8ап!ок N. Е! НокЫпо Υ., 2005, Ве\зе\\ъ ίη шебюа1 У1го1о§у, 15, 29-56), 6х относится к определенному С типу, т.е. генотипу С или серотипу С (обе терминологии идентичны), в то время как терминология Ру обычно относится к определенному Р типу, либо серотипу Р (например Р8, Р4) либо генотипу Р (например Р[4], Р[8]). При ссылке на определенный генотип Р используется обозначение Р, за которым следует присвоенный номер в скобках; в другом случае тип Р означает либо серотип, либо генотип.

На протяжении данной спецификации такие формулировки, как применение вакцинной композиции согласно изобретению в изготовлении вакцинной композиции для предупреждения ротавирусных заболеваний или как способы терапии, включающие применение указанной вакцинной композиции, будут взаимозаменяемы.

Авторы изобретения определили, что ротавирусная популяция СхР[8] [например С1Р[8], депонированная в Европейской коллекции животных клеточных культур (ЕСАСС), Лаборатория по исследованию и продуцированию вакцин, Лабораторная служба здравоохранения, Центр прикладной микробиологии и исследований, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир, 8Р4 01С, Великобритания, 13 августа 1999 года под депозитарным номером 99081301, в соответствии с условиями Будапештского договора] может быть использована для предупреждения заболевания, вызванного как штаммом СхР[8] (например С1Р[8]), так и по меньшей мере одним ротавирусным штаммом, не относящимся ни к Сх, ни к Ру типу. В частности, авторы изобретения определили, что ротавирусная популяция С1Р[8] может быть использована для предупреждения заболевания, вызванного как одним С1Р[8], так и по меньшей мере одним Не-С1Р[8] генотипом, таким как генотип ротавируса С2Р[4].

Соответственно настоящее изобретение относится к применению ослабленной ротавирусной популяции одного типа ротавируса в предупреждении заболевания, связанного с ротавирусной инфекцией другого типа ротавируса, где тип надлежащим образом определяют посредством ссылки на последовательность белка ротавируса УР4 (Р тип).

- 3 014328

Изобретение также относится к применению ослабленной ротавирусной популяции одного штамма ротавируса (определяемого специфическим С и Р типом) в предупреждении заболевания, связанного с ротавирусной инфекцией другого штамма ротавируса, где штамм надлежащим образом определяют посредством ссылки на последовательность обоих белков ротавируса УР4 (Р тип) и УР7 (С тип). Более конкретно, изобретение относится к применению ослабленного ротавирусного штамма типа СхРу в изготовлении лекарственного средства для индукции иммунного ответа против ротавирусной инфекции, вызванной ротавирусным штаммом, не относящимся ни к Сх, ни к Ру типу. Другими словами, ротавирусный штамм по изобретению может быть использован в предупреждении заболевания, вызванного заражением другим ротавирусом, который отличается и по С, и по Р типу.

В частности, во всех аспектах заявленного изобретения указанный иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ. Применимо, если ротавирусная популяция содержит вирусные белки УР4 и/или УР7 из популяции 99081301, хранящейся в ЕСАСС, пригодной для обеспечения перекрестного иммунного эффекта.

На всем протяжении данного документа на перекрестный иммунитет будут ссылаться, как на иммунитет, обеспеченный одним типом ротавируса, против инфекции, вызванной другим типом ротавируса. Перекрестный иммунитет может быть гомотипическим или гетеротипическим. Гомотипический перекрестный иммунитет представляет собой иммунитет, обеспеченный штаммом ротавируса, против штамма либо С, либо Р типа, такой как, например, в случае штамма С1Р[8], обеспечивающего перекрестный иммунитет против не-С1, Р[8] штамма (например, С2Р[8]) через тип Р[8]. Другим примером гомотипического перекрестного иммунитет является тот, который обеспечен штаммом С1Р[8] против штамма С1 не-Р[8] (например, С1Р[4]) через тип С1. Гетеротипический перекрестный иммунитет представляет собой иммунитет, обеспеченный ротавирусным штаммом, против ротавирусного штамма других Р и С типов, такой как, например, иммунитет, обеспеченный С1Р[8], против штамма не-С1 не-Р[8] (например, С2Р[4]) (гетеротипический иммунитет, обеспеченный через С и Р типы).

Применимо, если серотип ослабленного ротавируса является С1 серотипом и способен обеспечить перекрестный иммунитет против заболевания, вызванного серотипами ротавируса С1 и не-С1, такими как серотипами, выбранными из группы, состоящей из С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8, С9, С10, С11, С12, С13 и С14.

В частности применение ослабленной ротавирусной популяции С1 [например, как депонированная в Европейской коллекции животных клеточных культур (ЕСАСС), Лаборатория по исследованию и продуцированию вакцин, Лабораторная служба здравоохранения, Центр прикладной микробиологии и исследований, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир, 8Р4 01С, Великобритания, 13 августа 1999 года под депозитарным номером 99081301, в соответствии с условиями Будапештского договора] может быть использовано для предупреждения заболевания, вызванного серотипом С1 и по меньшей мере одним, применимо по меньшей мере двумя, применимо по меньшей мере тремя, применимо по меньшей мере четырьмя не-С1 серотипами ротавируса, выбранными из группы, состоящей из. С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8, С9, С10, С11, С12, С13 и С14. Соответственно предлагается применение ослабленного ротавирусного штамма С1 типа в изготовлении вакцинной композиции для индукции иммунного ответа против ротавирусной инфекции, вызванной штаммом ротавируса, не относящимся к С1 типу. В конкретном аспекте иммунный ответ индуцируют против по меньшей мере одного, по меньшей мере двух или более не-С1 серотипов ротавируса, обычно против любого серотипа, выбранного из группы, состоящей из С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8, С9, С10, С11, С12, С13 и С14. Обычно иммунный ответ индуцируют против по меньшей мере одного, применимо по меньшей мере двух, применимо по меньшей мере трех из следующих не-С1 типов: С2, С3, С4 и С9, в дополнение к гомотипическому (С1) иммунитету. Применимо, если композиция содержит штамм ротавируса С1 и применяется для индукции иммунного ответа против типов С1 и С2.

Применимо, если ослабленный ротавирусный штамм имеет тип Р[8] и способен обеспечить перекрестный иммунитет против заболевания, вызванного типами ротавируса Р[8] и не-Р[8], такими как типами, выбранными из группы, состоящей из Р[1], Р[2], Р[3], Р[4], Р[5], Р[6], Р[7], Р[9], Р[10], Р[11], Р[12], Р[14] и Р[19].

В частности, применение ослабленной ротавирусной популяции Р[8] [например, как депонированная в Европейской коллекции животных клеточных культур (ЕСАСС), Лаборатория по исследованию и продуцированию вакцин, Лабораторная служба здравоохранения, Центр прикладной микробиологии и исследований, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир, 8РС4 01С, Великобритания, 13 августа 1999 года под депозитарным номером 99081301, в соответствии с условиями Будапештского договора] может быть использовано для предупреждения заболевания, вызванного типом Р[8] и по меньшей мере одним из не-Р[8] типов ротавируса, выбранных из группы, состоящей из Р[1], Р[2], Р[3], Р[4], Р[5], Р[6], Р[7], Р[9], Р[10], Р[11], Р[12], Р[14] и Р[19]. В частности, применимо, если иммунный ответ индуцируют против, по меньшей мере, Р[4] типа в дополнение к типу ротавируса Р[8].

- 4 014328

Соответственно, вакцинная композиция для применения согласно изобретению содержит штамм ротавируса С1Р[8] и способна вызывать иммунный ответ против штамма ротавируса С2Р[4].

В определенном аспекте изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против штамма ротавируса, который включает введение субъекту композиции, содержащей ослабленный ротавирусный штамм типа СхРу, где указанная композиция вызывает иммунный ответ против штамма ротавируса, не относящегося ни к Сх, ни к Ру типу.

В частности, изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против ротавируса серотипа С1 и не-С1, который включает введение субъекту композиции, содержащей ротавирусную вакцину серотипа С1. Применимо, если серотипы не-С1 выбирают из группы, состоящей из С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8, С9, С10. С11, С12, С13 и С14. Применимо, если композиция содержит штамм ротавируса С1 и применяется для индукции иммунного ответа против типов С1 и С2.

Применимо, если вакцинная композиция для применения согласно изобретению содержит штамм ротавируса С1Р[8] и способна вызывать иммунный ответ против штамма ротавируса С2Р[4].

Применимо, если ротавирусная популяция в вакцинной композиции относится конкретно к штамму С1Р1А (т.е. С1Р[8] согласно современной номенклатуре). Применимо, если ротавирусная популяция содержит вирусные белки УР4 и/или УР7 из популяции 99081301, хранящейся в ЕСАСС, пригодной для индукции иммунного ответа и обычно для обеспечения перекрестного защитного эффекта. Применимо, если изобретение относится к штаммам ротавируса С1Р[8] в методах или применениях, описанных выше. Обычно используемая ротавирусная вакцина относится к популяции 99081301, хранящейся в ЕСАСС, или является производной из данной популяции.

В определенном аспекте изобретения вакцина индуцирует перекрестный защитный иммунный ответ или перекрестный иммунитет против гастроэнтерита у вакцинированного лица по сравнению с невакцинированным (из плацебо группы). Применимо, если вакцина обеспечивает перекрестный иммунитет против таких симптомов ротавирусной инфекции, как диарея или гастроэнтерит. Например, гастроэнтерит можно определить как диарею, характеризуемую водянистым или более жидким стулом, чем обычно, три или более раза в сутки или интенсивной рвотой наряду с определением ротавируса в исследованном образце кала.

Как будет понятно специалистам в области, интенсивность заболевания и эффективность вакцинации в индукции защитного иммунного ответа у вакцинированного лица или у вакцинированного населения могут быть оценены несколькими способами. Под защитным иммунным ответом понимают иммунный ответ, который ведет к снижению выраженности клинических симптомов, связанных с ротавирусной инфекцией, или который ведет к снижению восприимчивости к ротавирусной инфекции. Интенсивность заболевания у лица, не прошедшего или прошедшего вакцинацию, может быть оценена в соответствии с опубликованными оценочными системами, такими как 20балльная шкала Везикари или слегка измененная версия указанного способа (Кишка Т. с1 а1. 8сапб. 1. 1пГсс1. И18. 1990, 22, 259-267) или в соответствии с любой другой подходящей системой, описывающей и оценивающей специфичные симптомы ротавирусной инфекции (такой как методология, описанная у С1агк Н.Е., Вопап Е.Е., Вс11 Ь.М. РгоЮсНгс сГГсс! оГ иС3 уасстс адашк! гоЕпзгш Фаггйса ίη 1иГаи18 бигшд а ргсботшапйу ксго1урс 1 ΐΌΐηνίπικ ксакоп. 1. 1пГсс1 Ищ. 1988:570-86). В соответствии с методом Везикари, тяжелый ротавирусный гастроэнтерит (КУСЕ, го1ау1ги8 дакйосШсгШк) обычно определяют баллом >11.

Эффективность защиты можно оценить на уровне населения или группы по эффективности вакцины (УЕ). Эффективность вакцины рассчитывают по следующей формуле:

УЕ (%) = 1 - КК = 1 - (АКУ/АКИ), где КК = относительный риск = АКУ/АКИ;

АКИ = уровень приступов заболевания среди населения, не прошедшего вакцинацию (оценивается по плацебо группе) = число пациентов, сообщающих по меньшей мере об одном эпизоде КУСЕ/общее число пациентов в контрольной группе;

АКУ = уровень приступов заболевания в группе, прошедшей вакцинацию = число пациентов, сообщающих по меньшей мере об одном эпизоде КУСЕ/общее число пациентов в группе вакцины НКУ (ротавирус человека, йцтап ΐΌΐηνίπικ).

Соответственно в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ или применение, как описано выше, где композиция, содержащая ослабленный ротавирусный штамм типа СхРу, индуцирует перекрестный защитный иммунный ответ и/или иммунитет против гастроэнтерита, вызванного ротавирусом, применимо против тяжелого гастроэнтерита, вызванного ротавирусом, вызванного заражением штаммом ротавируса, не относящимся ни к Сх, ни к Ру типу. В определенном воплощении указанный защитный иммунный ответ способен снизить интенсивность заболевания или устранить заболевание, вызванное ротавирусом, по оценке в соответствии с любой подходящей оценочно системой.

В еще одном воплощении предложен способ или применение композиции согласно изобретению для снижения интенсивности заболевания, например, гастроэнтерита, или для устранения заболевания, вызванного ротавирусом, где указанную интенсивность заболевания или заболевание опи

- 5 014328 сывают в соответствии с любой подходящей оценочной системой, как указано выше.

В определенном воплощении указанная композиция является до 60% защитной, применимо до 81% защитной в популяции лиц, прошедших вакцинацию, по отношению к диарее, вызванной заражением ротавирусом другого типа, чем ослабленный ротавирус, присутствующий в композиции. В другом определенном воплощении указанная композиция является по меньшей мере на 40% защитной, применимо по меньшей мере на 45% защитной, применимо по меньшей мере на 50% защитной, применимо по меньшей мере на 60% защитной в популяции лиц, прошедших вакцинацию, по отношению к диарее, вызванной штаммом ротавируса, не относящимся ни к Сх, ни к Ру типу. В определенном аспекте указанная композиция является от 40 до 80% защитной, применимо от 50 до 70% защитной по отношению к диарее, вызванной штаммом ротавируса, не относящимся ни к Сх, ни к Ру типу. В определенном аспекте указанная композиция содержит штамм ротавируса С1Р[8], который обеспечивает уровень защиты, как описано выше, по отношению к гастроэнтериту, вызванному заражением штаммом ротавируса типа С2Р[4].

Применимо, если уровень защиты по отношению к диарее и/или гастроэнтериту и/или тяжелому гастроэнтериту, достигаемый в популяции лиц, прошедших вакцинацию, зараженных ротавирусным штаммом, не относящимся ни к Сх, ни к Ру типу, составляет от 10 до 90%, применимо от 20 до 80%, применимо от 40 до 80%, применимо от 45 до 75%. Обычно уровень защиты по отношению к гастроэнтериту составляет по меньшей мере 40%, применимо по меньшей мере 50%.

В определенном аспекте указанная композиция содержит штамм ротавируса С1Р[8], который является защитным в степени от 40 до 80%, применимо от 45 до 75% в популяции лиц, прошедших вакцинацию, по отношению к тяжелому гастроэнтериту по оценке в соответствии со шкалой Везикари, вызванному заражением ротавирусом серотипа С2Р[4].

Применимо, если используется режим применения вакцины в 2 дозы или 3 дозы.

Ротавирусная вакцина, используемая для обеспечения перекрестного иммунитета, имеет следующие применимые характеристики.

В одном аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению имеет ген УР4, содержащий нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере одно из следующего: основание аденин (А) в позиции 788, основание аденин (А) в позиции 802 и основание тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона.

В еще одном аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению имеет ген УР7, содержащий нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере одно из следующего: тимин (Т) в позиции 605, аденин (А) в позиции 897, гуанин (С) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона. Применимо, если в позиции 897 находится аденин (А).

В определенном аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению имеет аденин (А) в позициях 788 и 802 и тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона, в последовательности гена УР4.

В другом определенном аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению имеет тимин (Т) в позиции 605 и аденин/гуанин (А/С) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона, в последовательности УР7. Наиболее применимо, если в последовательности УР7 в позиции 897 находится аденин (А).

В особенно применимом аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению имеет аденин (А) в позициях 788 и 802 и тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона, в последовательности гена УР4 и тимин (Т) в позиции 605 и аденин/гуанин (А/С) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона, в последовательности УР7. Применимо, если в последовательности УР7 в позиции 897 находится аденин (А).

В другом аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок УР4, где нуклеотидная последовательность является такой, как изображена в фиг. 1А (8ЕО ΙΌ N0:1) или фиг. 1В (8ЕО ΙΌ N0:2), и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок УР7, где нуклеотидная последовательность является такой, как изображена в фиг. 2А (8ЕО ΙΌ N0:3) или фиг. 2В (8ЕО ΙΌ N0:4). В альтернативном воплощении ротавирус из композиции для применения согласно изобретению содержит белок УР4, такой как изображено в фиг. 3 (8ЕО ΙΌ N0:5), и/или белок УР7, такой как изображено в фиг. 4 (8Е0 ΙΌ N0:6). В другом воплощении указанная ротавирусная популяция для применения согласно изобретению дополнительно содержит белок №Р4, такой как изображено в фиг. 5 (8Е0 ΙΌ N0:7) или кодируемый нуклеотидной последовательностью, такой как изображено в фиг. 6 (8Е0 ΙΌ N0:8), и/или белок УР6, такой как изображено в фиг. 7 (8Е0 ΙΌ N0:9) или кодируемый нуклеотидной последовательностью, такой как изображено в фиг. 8 (8Е0 ΙΌ N0:10).

Применимые ротавирусные популяции для применения в настоящем изобретении могут быть получены посредством способа, включающего:

перепрививание препарата ротавируса в пригодном типе клеток;

возможно, выбор гомогенной культуры, используя стадии либо:

а) предельного разбавления, либо

- 6 014328

б) выделения индивидуальной бляшки; и проверка на присутствие преимущественно единственного варианта посредством выполнения определения последовательности соответствующей области последовательности гена УР4 и/или УР7.

Применимо, если ротавирусная популяция является производной из штаммов Р43 (ΒΙΧ4414), Р33 или Р26, как описано выше.

Определение последовательности может быть подходящим образом выполнено с помощью количественной или полуколичественной методики гибридизации, такой как блот-гибридизация или гибридизация бляшек.

Полученная клонированная вирусная популяция, полученная методом согласно изобретению, может быть амплифицирована посредством дальнейшего перепрививания в подходящей клеточной линии.

Подходящие типы клеток для перепрививания ротавирусной популяции в вышеописанном методе включают клетки АОМК (почки африканской зеленой мартышки), которые могут представлять собой постоянные клеточные линии или первичные клетки АОМК. Подходящие клеточные линии АОМК включают, например, Уего (АТСС ССЬ-81), ПВ8-РКЬЬ-2 (АТСС СЬ-160), В8С-1 (ЕСАСС 85011422) и СУ-1 (АТСС ССЬ-70). Также применимыми являются клеточные линии МА-104 (макак-резус) и МРС-5 (человека - АТСС ССЬ-171). Клетки Уего особенно подходят для целей амплификации. Перепрививание в клетках Уего дает высокий выход вируса.

Методики для проверки того, присутствует ли в вирусной популяции, полученной методом по изобретению, единственный вариант, и для определения природы этого единственного варианта включают стандартные процедуры секвенирования или гибридизации, известные специалистам, и описаны ниже.

В определенном аспекте метод по изобретению осуществляют, используя соответствующий ротавирус, особенно ротавирус, имеющий характеристики штамма 89-12, или перевиваемое производное из этого штамма.

Особенно применимой популяцией с единственным вариантом является Р43, которая получена из Р33 (выделенный ротавирус человека, прошедший 33 пассажа в культуре подходящих типов клеток) с помощью серий конечных разведений в качестве шагов клонирования, за чем следовало перепрививание клонированного материала в клетках Уего для амплификации.

Популяция Р43 была депонирована в Европейской коллекции животных клеточных культур (ЕСАСС), Лаборатория по исследованию и продуцированию вакцин, Лабораторная служба здравоохранения, Центр прикладной микробиологии и исследований, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир, 8РО4 01О, Великобритания, 13 августа 1999 года под депозитарным номером 99081301, в соответствии с условиями Будапештского договора, и раскрыта в \УО 01/12797.

Несмотря на то, что указанный общий доступ представляет собой наиболее простой способ получения ротавируса человека Р43, похожие и практически идентичные в функциональном плане ротавирусы могут быть получены с помощью других способов, лежащих в области рассмотрения данного изобретения. Такие практически идентичные в функциональном отношении ротавирусы считаются биологически эквивалентными ротавирусу человека Р43 по данному изобретению и, следовательно, относятся к общему объему настоящего изобретения. Поэтому следует понимать, что изобретение охватывает популяции ротавируса, имеющие характеристики варианта Р43, как описано здесь.

Также следует понимать, что изобретение охватывает материалы, полученные на основе размещенного в ЕСАСС Р43 под номером 99081301 посредством дальнейшей обработки, такой как размножение путем дальнейшего перепрививания, клонирования или других процедур, используя живой вирус, или путем модификации Р43 любым способом, включая методики генной инженерии или реассортантные методики. Такие действия и методики общеизвестны в области.

Материалы, полученные на основе хранящегося в коллекции Р43, охватываемые изобретением, включают белковый и генетический материал. Особенный интерес представляют реассортантные ротавирусы, которые содержат по меньшей мере один антиген или по меньшей мере один сегмент Р43, например, реассортанты, которые содержат вирулентный штамм ротавируса, в котором один из или часть одного из 11 сегментов генома была заменена на сегмент генома или его часть из Р43. Более конкретно, реассортант ротавируса, в котором сегмент или часть сегмента, кодирующего Ν8Ρ4, является сегментом или частью сегмента Р43, может иметь полезные характеристики. Реассортантные ротавирусы и методики их получения общеизвестны (Ройег, Р.Н. апб ХУад^аГГ, АЛ. Те1гауа1еШ Ко1ауни8 Уассте, а ге\ае\\·. ΛΩΙ8 бгцд еуа1иа1юп, ВюПгцдк, Оеу, 9(2), 155-178, 1998).

Материалами, представляющими особенный интерес, являются продукты Р43 или иммунологически активные производные Р43. Под иммунологически активными производными понимают материалы, полученные из или на основе вируса Р43, особенно антигены вируса, которые при инъекции животному-хозяину способны вызывать иммунный ответ, направленный против ротавирсуа.

При проведении адаптации ротавируса к соответствующей клеточной линии, например к клет

- 7 014328 кам Уего, может быть необходимо проведение обработки вируса с целью избавления от возможных загрязнителей, таких как адвентициальные агенты, которые могут присутствовать и которые в противном случае могли бы вызвать контаминацию. В случае адвентициальных вирусов, чувствительных к эфиру, это можно осуществить с помощью обработки эфиром, как описано ниже. Настоящее изобретение также относится к включению такой обработки эфиром в качестве дополнительной стадии в общей процедуре получения ослабленного живого ротавируса или препарата вакцины на его основе.

Ротавирусный штамм по настоящему изобретению, обеспечивающий перекрестный иммунитет, может быть комбинирован с другими ротавирусными штаммами для обеспечения дополнительного иммунитета или перекрестного иммунитета против ротавирусной инфекции или заболевания.

Настоящее изобретение также предлагает живую ослабленную вакцину, способную обеспечить перекрестный иммунитет, как определено выше, смешанную с подходящим адъювантом или фармацевтическим носителем.

В одном воплощении ротавирусная вакцина для применения согласно изобретению представляет собой моновалентную вакцину, содержащую единственный ротавирусный штамм, такой как штамм С1Р[8].

Настоящее изобретение является особенно эффективным, если предложена живая ротавирусная вакцина, в которой живой ослабленный ротавирус является ротавирусом человека и не вызывает интуссусцепции.

Подходящие фармацевтические носители для применения с ослабленным ротавирусным штаммом согласно изобретению включают общеизвестные в области, пригодные для перорального введения, особенно для введения детям. Такие носители включают углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты, гидроксид алюминия, гидроксид магния, гидроксиапатит, тальк, оксид титана, гидроксид железа, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, желатин, растительный пептон, ксантан, каррагенан, аравийскую камедь, β-циклодекстрин, но не ограничиваются ими.

Согласно изобретению также предложен способ получения ротавирусной вакцины, например, путем лиофилизации вируса в присутствии подходящих стабилизаторов или путем смешивания вируса согласно изобретению с подходящим адъювантом или фармацевтическим носителем.

Также может быть полезно получение препарата вируса по изобретению в носителе на основе жиров, таком как виросомы или липосомы, в масляной или водной эмульсии или с частицами носителя. В качестве альтернативы или дополнительно в препарат могут быть включены иммуностимуляторы, известные в области для пероральных вакцин. Такие иммуностимуляторы включают бактериальные токсины, особенно токсин холеры (СТ, ейо1ега ΐοχίη) в форме голотоксина (целая молекула) или только В цепи (СТВ, ейо1ега ΐοχίη В сйаш) и термолабильный энтеротоксин Е.сой (ЬТ). Мутированные ЬТк (тЬТк), для которых менее вероятно превращение в активную форму, чем для нативных ЬТ, описаны в АО 96/06627, АО 93/13202 и И8 5182109.

Другими иммуностимуляторами, которые могут быть эффективно включены, являются производные сапонина, такие как 0821 и монофосфорил-липид А, особенно 3-де-О-ацилированный монофосфорил-липид А (3Б-МРЕ). Очищенные сапонины в качестве пероральных адъювантов, как описано в АО 98/56415. Сапонины и монофосфорил-липид А могут применяться по отдельности или в комбинации (например, АО 94/00153) и могут составлять препараты адъювантных систем вместе с другими агентами. 3Ό-ΜΡΕ представляет собой общеизвестный адъювант производства Е1Ь1 1ттипос11ет. Монтана, и его изготовление описано в СВ 2122204.

Общее обсуждение носителей и адъювантов для пероральной иммунизации можно найти в Уассше Беадп, Тйе 8иЬиш1 апб АбщсаШ Арргоасй, под редакцией Ро\\сН апб Ые^тап, Р1епит Рге§8, Ыете Уогк, 1995.

Согласно изобретению также предложен способ вакцинирования субъектов-людей, особенно детей, с помощью введения нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества вакцинной композиции согласно изобретению. Применимо, если живую ослабленную вакцину вводят пероральным путем.

В определенном аспекте ослабленный ротавирусный штамм согласно изобретению входит в состав препарата вместе с нейтрализующим кислоту средством для минимизации инактивации вакцины желудочной кислотой. Применимые компоненты, нейтрализующие кислоту, включают неорганические антациды, например, гидроксид алюминия А1(ОН)₃ и гидроксид магния МС(ОН)₂. Коммерчески доступные антациды, пригодные для применения в изобретении, включают Му1аШа (товарный знак), которая содержит гидроксид алюминия и гидроксид магния. Они нерастворимы в воде и представлены в виде суспензии.

Гидроксид алюминия представляет собой особенно применимый компонент вакцинной композиции согласно изобретению, так как он может обеспечить не только эффект нейтрализации кислоты, но также эффект адъювантности.

Также пригодными веществами для применения в качестве антацидов в вакцине по изобрете

- 8 014328 нию являются органические антациды, такие как соли карбоновых кислот. Подходящий антацид в вакцинной композиции по изобретению содержит соль карбоновой кислоты, более конкретно соль лимонной кислоты, такую как цитрат натрия или цитрат калия.

Особенно пригодным антацидом, который может применяться в вакцинной композиции по настоящему изобретению, является нерастворимая неорганическая соль, карбонат кальция (СаСО₃). Карбонат кальция может взаимодействовать с ротавирусом, и во время взаимодействия с карбонатом кальция сохраняется ротавирусная активность.

Для предупреждения осаждения карбоната кальция во время стадии наполнения, применимо, если в препарате присутствуют вязкие агенты.

Возможные вязкие агенты, которые могут использоваться, включают псевдопластические эксципиенты. Псевдопластический раствор определяют, как раствор, имеющий более высокую вязкость в неподвижном положении по сравнению с его вязкостью при перемешивании. Эксципиентами этого типа являются природные полимеры, такие как аравийская камедь, трагантовая камедь, агар-агар, альгинаты, пектины, или полусинтетические полимеры, например карбоксиметилцеллюлоза (Ту1о5С С®), метилцеллюлоза (МеФосек А®, Уксоп1гап8 МС®, Ту1о5С МН® и МВ®), гидроксипропилцеллюлоза (К1исек®) и гидроксипропилметилцеллюлоза (МеФосек Е® и К®, У15соп1гап5 МРНС®). Обычно данные псевдопластические эксципиенты используются вместе с тиксотропными агентами. Альтернативными вязкими агентами, которые могут применяться, являются псевдопластические эксципиенты с низкой текучей способностью. Эти полимеры при достаточной концентрации способствуют появлению структурной организации жидкости, результатом чего является раствор с высокой вязкостью, имеющий низкую текучую способность при неподвижном положении. Для того чтобы раствор мог течь и перемещаться, системе необходимо сообщить определенное количество энергии. Для временного разрушения структурной организации жидкости с целью получения жидкого раствора, необходима внешняя энергия (перемешивание). Примерами таких полимеров являются СагЬорок® и ксантановая камедь.

Тиксотропные эксципиенты формируют гелевую структуру при неподвижном положении, в то время как при перемешивании они образуют жидкий раствор. Примерами тиксотропных эксципиентов являются: Уеедит® (магний-алюминий силикат) и Ау1се1 ВС® (около 89% микрокристаллической целлюлозы и 11% натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы).

Применимо, если вакцинная композиция по настоящему изобретению содержит вязкий агент, выбранный из ксантановой камеди или крахмала.

Таким образом, обычно вакцинная композиция по настоящему изобретению входит в состав препарата с комбинацией карбоната кальция и ксантановой камеди.

Другие подходящие компоненты композиции для применения в изобретении включают сахара, например сахарозу и/или лактозу.

Вакцинная композиция согласно изобретению может содержать дополнительные компоненты, включая, например, корригенты (особенно для пероральной вакцины) и бактериостатические агенты.

Предусмотрены различные представления вакцинной композиции согласно изобретению.

В одном применимом воплощении вакцину вводят в виде жидкого препарата. Применимо, если жидкий препарат восстанавливают перед введением из по меньшей мере двух следующих компонентов:

1) вирусный компонент;

2) жидкий компонент.

В данном воплощении вирусный компонент и жидкий компонент обычно находятся в отдельных контейнерах, которые могут для удобства представлять собой раздельные отделения одного сосуда или отдельные сосуды, которые могут быть соединены таким образом, чтобы восстановление конечной вакцинной композиции происходило без воздействия воздуха.

Перед восстановлением вирус может находиться в сухой форме или в жидкой форме. Применимо, если вирусный компонент лиофилизован. Лиофилизованный вирус более стабилен, чем вирус в водном растворе. Лиофилизованный вирус может быть надлежащим образом восстановлен с помощью жидкой композиции антацидов для получения жидкого препарата вакцины. В качестве альтернативы лиофилизованный вирус может быть восстановлен с помощью воды или водного раствора, в таком случае применимо, если композиция лиофилизованного вируса содержит компонент, нейтрализующий кислоту.

Применимо, если вакцинный препарат содержит вирусный компонент с карбонатом кальция и ксантановой камедью в одном отделении или сосуде, и его восстанавливают водой или водным раствором, находящимся во втором отделении или сосуде.

В другом воплощении вакцинная композиция представляет собой твердый препарат, применимо, лиофилизованную лепешку, которая пригодна для непосредственного растворения при попадании в рот. Лиофилизованные препараты для удобства могут быть предложены в форме таблеток в

- 9 014328 фармацевтической блистерной упаковке.

В другом аспекте согласно изобретению предложена ротавирусная вакцина в форме быстрорастворимых таблеток для перорального введения.

В другом аспекте изобретение предлагает композицию, содержащую живой ослабленный ротавирусный штамм, более конкретно ротавирусный штамм человека, где композиция представляет собой лиофилизованную твердую фазу, способную к непосредственному растворению при попадании в рот.

Применимо, если быстрорастворимая таблетка согласно изобретению растворяется во рту пациента достаточно быстро для предупреждения глотания нерастворенной таблетки. Данный подход особенно эффективен для педиатрических ротавирусных вакцин.

Применимо, если вирус представляет собой живой ослабленный ротавирус человека, который входит в состав препарата с неорганическим антацидом, таким как карбонат кальция, и вязким агентом, таким как ксантановая камедь.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен лиофилизованный препарат, где вирусный компонент представляет собой любой ротавирусный штамм, который входит в состав препарата с карбонатом кальция и ксантановой камедью.

Вакцины по изобретению могут быть получены в виде препаратов и введены посредством известных методик, используя подходящее количество живого вируса для обеспечения эффективного иммунитета против ротавирусной инфекции без значительных нежелательных побочных эффектов у типичных вакцинируемых. Подходящее количество живого вируса обычно будет находиться в диапазоне от 10⁴ до 10⁷ бляшко-образующих единиц (БОЕ; ГГи, Госщ Гогтшд цш1) на дозу. Типичная доза вакцины может содержать 10⁵-10⁶ БОЕ на дозу и может быть введена несколькими дозами в течение периода времени, например двумя дозами, введенными с двухмесячным интервалом. Однако можно получить преимущество, если использовать более чем 2 дозы, например режим в 3 или 4 дозы, особенно в развивающихся странах. Интервал между дозами может быть больше или меньше, чем два месяца. Оптимальное количество живого вируса для одной дозы или для режима с многократными дозами и оптимальное расписание доз может быть уточнено с помощью стандартных исследований, включающих наблюдение титров антител и других реакций у пациентов.

Вакцина по изобретению может также содержать другие пригодные живые вирусы для защиты от других заболеваний, например, вирус полиомиелита. В качестве альтернативы другие пригодные живые вирусные вакцины для перорального введения могут быть введены отдельной дозой, но в то же время, что и ротавирусная вакцинная композиция согласно изобретению.

Сыворотки от двенадцати детей в возрасте от 4 до 6 месяцев, вакцинированных материалом Р33, были проанализированы на нейтрализацию Р33, Р38, Р43 и 89-12С2, как описано в статье в Уассте (1998).

Диапазон титров нейтрализующих антител всех проанализированных сывороток аналогичен для Р33, Р38 и Р43. Статистический анализ не показывает значительной разницы в общих титрах нейтрализующих антител по отношению ко всем трем вирусам. Это предполагает, что конформационные и неконформационные нейтрализующие эпитопы Р33, Р38 и Р43 одинаково хорошо распознаются анти-Р33 сывороткой, полученной от детей, вакцинированных Р33. Данное наблюдение непрямым образом предполагает, что нейтрализующие эпитопы, обнаруженные в этом анализе ίη νίΐτο, не различаются у Р33, Р38 и Р43.

Однако диапазон титров нейтрализующих антител для Р89-12С2 значительно отличается от Р33, Р38 и Р43. Данное наблюдение предполагает, что конформационные и неконформационные нейтрализующие эпитопы Р33, Р38 и Р43 неодинаково хорошо распознаются анти-Р33 сывороткой, полученной от детей, вакцинированных Р33. Данное наблюдение непрямым образом предполагает, что нейтрализующие эпитопы, обнаруженные в этом анализе ίη νίΐτο, различаются у 89-12 С2 и у Р33, Р38 и Р43.

Особенно применимые воплощения настоящего изобретения включают:

1. Применение ослабленного ротавирусного штамма Р типа в изготовлении вакцинной композиции для индукции иммунного ответа против ротавируса Р типа, отличного от того, который использовался в указанной вакцинной композиции.

2. Применение ослабленного ротавирусного штамма Р[8] типа в изготовлении вакцинной композиции для индукции иммунного ответа против ротавируса, не относящегося к Р[8].

3. Применение ослабленного ротавирусного штамма С1Р[8] типа в изготовлении вакцинной композиции для индукции иммунного ответа против ротавируса, не относящегося к С1Р[8].

4. Применение по пп.1-3, где иммунный ответ дополнительно индуцируют против инфекции, вызванной ротавирусом С1Р[8] типа.

5. Применение по пп.1-4, где иммунный ответ индуцируют против двух или более серотипов ротавируса, данные серотипы определяют ссылкой на С или Р типы.

6. Применение по пп.1-5, где серотип вакцинного штамма является С1 серотипом, а не-С1 серотип выбирают из списка, состоящего из С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8, С10, С11, С12, С13 и С14.

- 10 014328

7. Применение по п.6, где иммунный ответ индуцируют как против С1 типа, так и против С2 типа.

8. Применение по любому из пп.1-5, где тип вакцинного штамма является типом Р[8], а не-Р[8] тип выбирают из списка, состоящего из Р[1], Р[2], Р[3], Р[4], Р[5], Р[6], Р[7], Р[9] и Р[11] типов.

9. Применение по п.8, где иммунный ответ индуцируют как против Р[8], так и против Р[4] типов.

10. Применение по любому из пп.1-9, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген УР4, содержащий в нуклеотидной последовательности по меньшей мере одно из следующего: основание аденин (А) в позиции 788, основание аденин (А) в позиции 802 и основание тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона.

11. Применение по п.10, где ген УР4 содержит нуклеотидную последовательность, содержащую основание аденин (А) в позициях 788 и 802 и основание тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона.

12. Применение по п.11, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген УР7, содержащий в нуклеотидной последовательности по меньшей мере одно из следующего: тимин (Т) в позиции 605, аденин (А) в позиции 897 и гуанин (С) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона.

13. Применение по п.12, где ген УР7 содержит нуклеотидную последовательность, содержащую тимин (Т) в позиции 605, аденин (А) или гуанин (С) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона.

14. Применение по любому из пп.1-13, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген УР4, содержащий в нуклеотидной последовательности аденин (А) в позициях 788 и 802 и тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона; и где ген УР7 содержит в нуклеотидной последовательности тимин (Т) в позиции 605 и аденин (А) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона.

15. Применение по любому из пп.1-14, где композиция способна ослаблять или защищать от гастроэнтерита и/или диареи, вызванных заражением ротавирусом типа, определяемого посредством ссылки на С и/или на Р тип и отличного от типа ослабленного ротавируса, присутствующего в композиции.

16. Применение по п.15, где композиция является по меньшей мере на 40% защитной в популяции лиц, прошедших вакцинацию, по отношению к тяжелому гастроэнтериту, вызванному заражением ротавирусами по меньшей мере двух штаммов, определенных посредством ссылки на С и/или Р тип, данные типы отличаются от С1Р[8] типа ослабленного ротавируса, присутствующего в композиции.

17. Применение по п.16, где тяжелый гастроэнтерит вызван заражением ротавирусом по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех не-С1 серотипов.

18. Применение по п.17, где не-С1 серотипы являются серотипами С2, С3, С4 и С9.

19. Применение по п.18, где тяжелый гастроэнтерит вызван заражением ротавирусом по меньшей мере двух не-Р[8] типов.

20. Применение по п.9, где тяжелый гастроэнтерит вызван заражением ротавирусом Р[4] типа.

21. Применение по любому из пп.1-20, где штамм ротавируса представляет собой штамм, депонированный в ЕСАСС под номером 99081301, или получен из этого штамма, или является производным от штамма, депонированного в ЕСАСС под номером 99081301.

23. Применение по любому из пп.1-20, где вакцину применяют в 2-дозовом режиме.

В другом аспекте изобретение также относится к способу индукции иммунного ответа против ротавирусной инфекции, вызванной штаммом ротавируса, который включает введение пациенту композиции, содержащей ослабленную ротавирусную вакцину, полученную из другого штамма. Более конкретно, изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против ротавируса одного Р типа и/или для предупреждения заболевания, связанного с инфекцией, вызванной ротавирусом одного Р типа, указанный способ включает введение нуждающемуся в этом пациенту ослабленной ротавирусной популяции другого Р типа.

В определенном аспекте изобретения предложен способ индукции иммунного ответа против ротавируса Р[8] типа и по меньшей мере одного из не-Р[8] типов, выбранных из группы, состоящей из Р[1], Р[2], Р[3], Р[4], Р[5], Р[6], Р[7], Р[9], Р[11], Р[12], Р[14] и Р[19], применимо против ротавируса типа Р[4], причем способ включает введение пациенту композиции, содержащей вакцину ротавируса типа Р[8].

В другом аспекте изобретения предложена 1) изолированная последовательность неструктурного белка 4 ((Ы8Р4, поп-8!гис!ига1 рго1с!п 4), как изображена в фиг. 5 8ЕО Ш N0:7), или ее иммуногенный фрагмент; 2) изолированная полинуклеотидная последовательность, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный полипептид Ν&Γ4, или ее иммуногенный фрагмент; 3) изолированная полинуклеотидная последовательность, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как изображено в фиг. 6 (8ЕО Ш N0:8).

В еще одном аспекте изобретения предложена 1) изолированная последовательность ротави

- 11 014328 русного белка 6 (УР6), как изображена в фиг. 7 (8ЕЦ ΙΌ N0:9), или ее иммуногенный фрагмент; 2) изолированная полинуклеотидная последовательность, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный полипептид УР6, или ее иммуногенный фрагмент; 3) изолированная полинуклеотидная последовательность, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как изображено в фиг. 8 (ЪЕЦ ΙΌ N0:10).

Иммуногенные фрагменты можно определить в контексте данного изобретения, как фрагменты, которые при введении в эффективной дозе (либо по отдельности, либо в виде гаптена, связанного с носителем) вызывают защитный иммунный ответ против ротавирусной инфекции.

Следующие не ограничивающие примеры иллюстрируют изобретение.

Примеры

Пример 1. Демонстрация того, что штамм 89-12 на пассаже 26 (Р26) представляет собой смесь вариантов.

Секвенирование генов УР4 и УР7 из партий, прошедших различное число пассажей.

Было выполнено секвенирование генов УР4 и УР7 из пассажа Р26 (первичные клетки АСМК), пассажа Р33 (постоянная (в отличие от первичной) клеточная линия АСМК), пассажа Р41 и пассажа Р43. Для всего экстракта РНК была проведена обратная транскрипция и амплификация посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) в одной пробирке/одной стадии.

Для амплификации целого гена УР4 использовали праймеры Ко1а 5Ы§ и Ко1а 29Ы§, и для амплификации целого гена УР7 использовали праймеры Ко!а 1 и Ко!а 2Ы§. Материал ПЦР был секвенирован с использованием различных праймеров (см. табл. 1).

Последовательность пассажа Р26 отличалась от последовательности пассажа Р33 на 3 основания (в позициях 501, 788 и 802 пар оснований от инициирующего кодона) в УР4 и на три основания в УР7 (108, 605 и 897 пара оснований от инициирующего кодона).

Сканограммы последовательности пассажа Р26 для УР4 и УР7 демонстрируют наличие последовательности пассажа Р33 в качестве фона в позициях с мутациями. Таким образом, можно увидеть, что пассаж Р26 представляет собой смесь по меньшей мере 2 вариантов.

Сканограммы последовательности пассажа Р33 представляются гомогенными для УР4 и гетерогенными для УР7 (см. табл. 2).

Пассаж Р38 (полученный от пассажа 33) прошел 5 перепрививаний в клетках Уего и демонстрировал тот же набор последовательностей УР4 и УР7, что и пассаж Р33 (клеточная линия АСМК). Следовательно, не было больших изменений в популяциях между Р33 и Р38.

Таблица 1. Олигонуклеотиды, используемые для ПЦР с обратной транскрипцией (КТ-РСК) и секвенирования

	название	последовательность	ПОЗИЦИЯ
νΡ7	Кой 1	ССС ТТТ ААА АСА ОАО ААТ ТТС ССТ СТС С (ЗЕО Ю N0:11)	-49 (о -22
	Кой 1Ь(3	ССТ ТАС СТС СТТ ТТА АТС ТАТ ССТ А (ЗЕО Ι0 N0:12)	-16Й10
	Кой 2Ь13	СОТ САС АТС САА САА ТТС ТАА ТСТ ААС (ЗЕО Ю N0:13)	1014-988
	Рой 7	САА СТА СТС ААА ТСА АТС АТС С (ЗЕО Ю N0:14)	266-287
	Кой 12	ТСТ ТСА ТТТ ТТС ТСТ ССА ТСС АС (ЗЕО Ю N0:15)	372-394
	Кой 46	ССТ ТСС ТСА САА ТСА САА АТТ АСС ТАТ АСТ СС (5Е0 Ю N0:16)	651-682
	КОЙ 18	ССА СТА ТАС СТА АТТ ТСТ САТ ТСТ САС САА СС (ЗЕО Ю N0:17)	682-651
Х/Р4	Кой 5	ТСС СТТ ССС САТ ТТТ АТА САС А (ЗЕО Ю N0:18)	2-23
	Кой 6	АТТ ТСС САС САТ ТТА ТАА СС (ЗЕО Ю ΝΟ: 19)	878-859
	Кой 5Ь1з	ТСС СТТ САС ТСА ТТТ АТА САС А (ЗЕО Ю N0:20)	2-23
	Кой 6Ыз	АТТ ТСА САС САТ ТТА ТАА ССТ АС (ЗЕО Ю N0:21)	878-856
	Кой 25	СОА СТА СТА ТАТ САА АСТ АСА ААТ ААТ АС (ЗЕО Ю N0:22)	268-296
	Кой 26	СТА ТТА ТТТ СТА СТТ ТСА ТАТ АСТ АСТ СС (ЗЕО Ю N0:23)	296-268
	Кой 27Ыз	ТСС АТА САС ТАТ ААС АСА ССА САА С (ЗЕО Ю N0:24)	721-745
	Кой 28	ТТС АТТ ААС ТТС ТСС ТСТ СТТ АТА СТС (ЗЕО Ю N0:25)
	Рой 31	СТА ТАТ СТА САС ТАТ ТСС САТ С (ЗЕО Ю N0:26)	753-727
	Кой 32	САТ ССС ААТ АСТ СТА САТ АТА С (ЗЕО Ю N0:27)	1048-1070
	Кой 45	ТСТ ААС ТСС ССС ААА АТС САА СО (ЗЕО Ю N0:28)	1070-1048
	Рой 53	ССТ ТСС АТТ ТТС ССС САС ТТА СА (ЗЕО Ю N0:29)	1205-1227
	КОЙ 54	СТА АСА САА САТ ТТА САС ССС СА (ЗЕО Ю N0:30)	1227-1205
	Рой 55	ТСС ССС ТСТ ААА ТСТ ТСТ СТТ АС (ЗЕО Ю N0:31)	1465-1487
	Рой 40	СТТ САТ ССТ САТ САА ССА ССА ТСТ С (ЗЕО Ι0 N0:32)	1487-1465
	Кой 39	САС АТС СТС СТТ САТ САС САТ САА С (ЗЕО Ю N0:33)	1703-1727
	Рой 33	ССА ТСА ТАТ ССА АТА ТТА ААС САТ С (ЗЕО Ю N0:34)	1727-1703
	Кой 34	САТ ССТ ТТА АТА ТТС САТ АТС АТС С (ЗЕО Ю N0:35)	2008-2032
	КОЙ 29015	АСС СТТ САС АСА АТТ ТАС АТТ СТА С (ЗЕО Ю N0:36)	2032-2008 2335-2311

- 12 014328

Таблица 2. Олигонуклеотиды, используемые для гибридизации

	название	последовательность	позиция
Х/Р7	Рой 41 Ро1а 42	АСТ АТТ ТТА ТАС ТАТ АСТ АСА ТТА ТАТ ТАА ТС (ЗЕО Ю N0:37) ЛОТ АТТ ТТА ТАС ТАТ СОТ АСА ТТА ТАТ ТАА ТС (ЗЕО Ι0 N0:38)	882-913 882-913
7Р4	Ко(а 15 Ко1а 16 Ко(а 35 Во(а 35	АТС ССС АТТ АТА СТО САТ ТСС ТТТ С (ЗЕО ΙΟ N0:39) АТС ССТ АТТ АТА СТО САТ ТТС ТТТ С (ЗЕО Ю N0:40) АТС ССС АТТ АТА СТО САТ ТТС ТТТ С (ЗЕО Ю N0:41) АТС ССТ АТТ АТА СТО САТ ТСС ТТТ С (ЗЕО !□ N0:42)	807-783 807-783 807-783 807-783

Основания, выделенные жирным в табл. 2, являются сайтами специфической вариации последовательности в УР4 и УР7.

Таблица 3. Вариация последовательности генов УР4 и УР7

Таблица 3.1

Х/Р4	УР7
	501 п.о. 167 а. к.	788 п.о. 263 а к	802 п.о. 268 а к	108 п.о. 36 а.к	605 п.о. 202 а. к	897 п ° 299 а.к.
Р26 (АОМК)	А	0/А	0/А	А	С/Т	А
Р'Ч'З (АОМК)	Т	А	А	6 /А	Т/С	А/6
Р38 (УЕЕЮ)	Т	А	А	А/<3	т	6/А
Р43 (Х/ЕРО)	т	А	А	А	т	А

Примечание: Во втором клоне из 3 клонов, которые были развиты до уровня производственной партии, нуклеотидом в позиции 897 п.о. УР7 является О, в отличие от А в выбранном клоне Р43. Это приводит к появлению метионина вместо изолейцина в аминокислотной последовательности. Варианты, соответствующие как выбранному Р43 клону, так и клону, в котором в позиции 897 п.о. от инициирующего кодона в УР7 находится О, выделялись в кале детей, которые были вакцинированы материалом Р33.

В табл. 3.1, в местах, где имеются два альтернативных основания в определенной позиции, первое из двух представляет собой основание, которое имеется у большей популяции, а второе представляет собой основание, которое имеется у меньшей популяции. О популяциях с основным и минорным вариантом судят по силе сигнала при секвенировании.

Таблица 3.2 демонстрирует аминокислотные замены в результате разницы в нуклеотидах меж ду вариантами.

Таблица 3.2

Х/Р4	УР7
	501 п.о. 167 а к	788 п.о. 263 а к	802 π·°· 268 а. к.	108 п о. 36 а· к-	605 п.о. 202 а к	897 п.о. 299 а к.
Р26 (АОМК)	1_еи	С1у/6!и	(э1у/Агд	Агд	Тйг/Ме»	Не
(АОМК)	Рбе	61и	Агд	Агд/Агд	Μθί/Тйг	ΙΙθ/ΜθΙ
Ρ3Θ (ΫΕΚΟ)	Рйе		Агд	Агд/Агд	Ме1	МеРПе
Р43 (Х/ЕРО)	Рйе	СЮ	Агд	Агд	Ме(	Не

Таблица 4

	Х/Р4 (позиции 788-802)	Х/Р7 (позиция 897)
	С-6	А-А	А-6	6-А	А	6
Зонды	Ро1а 15	Но1а 16	Ро1а 35	Ро1а 36	Ро(а 41	Во(а 42
Пассажи
Р26		+	+		Н6 сделано	не сделано
РЗЗ		+	-	-		+
Р38	-	+	-	-	+	++
Р43	-	+	-	-	+	-

- 13 014328

Слот-блот гибридизация

Изменение в популяциях между пассажами Р26 и Р33 в клетках АСМК было затем подтверждено посредством слот-блот гибридизации. Проводили гибридизацию фрагментов генов УР4 и УР7, полученных с помощью ПЦР с обратной транскрипцией, с олигонуклеотидными зондами, специфичными для каждого варианта (см. табл. 3.1 и 3.1). В отличие от Р26, для которого гибридизацию проводили с Ко1а 16, Ео1а 35 и Ео1а 36 и не с Во1а 15, для ПЦР фрагмента УР4 материала Р33 в позициях 788 и 802 гибридизация была возможна только с Ро1а 16 и ни с Ро1а 15, ни с Ро1а 35, ни с Во1а 36. Эти результаты установили присутствие по меньшей мере 3 вариантов в Р26 (см. табл. 4).

Для ПЦР фрагмента УР7 материала Р33 проводили гибридизацию позиции 897 с Ео1а 41 и Ео1а 42. Эти результаты установили присутствие по меньшей мере двух вариантов в материале Р33.

Пример 2. Выделение и характеристика клона Р43.

Для выделения компонентов Р33 в виде гомогенной вирусной популяции было выполнено три конечных разведения Р33/АСМК в клетках Уего, и полученный вирус был использован для инфицирования клеток Уего.

Положительные лунки отбирали, используя два критерия: рост, демонстрируемый наибольшим количеством фокусов, определяемых в лунках, и большинством выделенных положительных лунок на планшетах, как это выполняют классически. После трех пассажей с конечным разведением в 96-луночных планшетах 10 положительных лунок успешно амплифицировали в клетках Уего и оценили их на выход продукта. На основании выхода продукта три клона были доведены с помощью перепрививаний до уровня производственной партии. Было показано, что иммунологическое распознавание поликлональными антителами одинаково для всех трех клонов и для Р33. Гомогенность клонов оценивали с помощью слот-блот гибридизации. Окончательный выбор единственного клона основывался на выходе продукта и на последовательности.

Выбранный клон амплифицировали посредством успешных перепрививаний в клетках Уего для получения исходного посевного материала, рабочего посевного материала и, наконец, производственных партий.

Для выбранного клона была проведена генетическая характеристика на разных стадиях перепрививания путем секвенирования УР4 и УР7 (идентичность) и путем специфичной слот-блот гибридизации УР4 и УР7 (гомогенность) из материалов после ПЦР амплификации. Последовательности генов УР4 и УР7 из материала Р43 представлены в фиг. 1 и 2 соответственно и идентичны Р41.

Гомогенность выбранного клона оценивали посредством селективной гибридизации с использованием олигонуклеотидных зондов, распознавая нуклеотидные замены в областях УР4 и/или УР7 для каждого варианта, идентифицированные во время секвенирования Р26/первичных клеток АСМК (см. табл. 4).

Гибридизация фрагмента УР4 была возможна с Ео1а 16 и не с Ео1а 15, Ео1а 35 или Ео1а 36. Гибридизация фрагмента УР7 была возможна с Ео1а 41 и не с Ео1а 42.

Данные результаты подтверждают, что Р43 представляет собой гомогенную популяцию.

Пример 3. Удаление возможного адвентициального вируса.

К Р33 (выращенным АСМК) добавляли эфир в конечной концентрации 20% на 1 ч. Затем эфир насыщали N в течение 35 мин. Не наблюдалось никакого эффекта на титр посевного материала Р33.

Пример 4. Приготовление препарата живой ослабленной вакцины.

На основе производственных партий, описанных выше, получали препарат для перорального введения детям с помощью следующего метода.

1. Лиофилизированный вирус.

Для получения доз вируса используют стандартные методики. Массу замороженного очищенного вируса оттаивают и разводят с помощью композиции соответствующей среды, в данном случае модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, до желательной стандартной концентрации вируса, в данном случае до 10⁶'² БОЕ/мл. Разведенный вирус затем разводят далее стабилизатором для лиофилизации (сахароза 4%, декстран 8%, сорбит 6%, аминокислота 4%) до целевого титра вируса, в данном случае до 10⁵'⁶ БОЕ/дозу. 0,5 аликвот композиции стабилизированного вируса асептически переносят в 3 мл пробирки. Каждую пробирку затем частично закрывают резиновой крышкой, пробу сушат при низкой температуре в вакууме, затем пробирку полностью закрывают и запечатывают алюминиевой крышкой вокруг пробирки для фиксации резиновой крышки.

Для применения вирус восстанавливают с помощью одного из следующих антацидов.

(а) Цитратный восстановитель.

Цитрат натрия растворяют в воде, стерилизуют путем фильтрации и асептически переносят в контейнеры для восстановителя в 1,5 мл объемах при концентрации 544 мг №₃ Цитрат-2Н₂О на 1,5 мл дозу. Контейнеры для восстановителя могут представлять собой, например, 3 мл пробирки, или 4 мл пробирки, или 2 мл шприцы, или мягкие пластиковые выдавливаемые капсулы для перорального введения. В качестве альтернативы для поддержания стерильных компонентов в стерильных условиях конечный контейнер может быть автоклавирован.

- 14 014328 (б) А1(0Н)₃ восстановитель.

Асептическую суспензию гидроксида алюминия (Му1ап!а - торговая марка) асептически разводят в стерильной воде, асептически переносят в контейнеры для восстановителя (например, 2 мл шприцы или мягкие пластиковые выдавливаемые капсулы) в 2 мл объемах, каждый содержит 48 мг А1(0Н)₃. Альтернативой использования стерильных компонентов в стерильных условиях является γоблучение суспензии гидроксида алюминия (предпочтительно на стадии после разведения).

Для предупреждения осаждения суспензии включают стандартные ингредиенты. Такие стандартные ингредиенты включают, например, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу и силиконовые полимеры.

Также могут быть включены бактериостатические агенты, например, бутилпарабен, пропилпарабен или другие стандартные бактериостатические агенты, используемые в пище, и корригенты.

2. Лиофилизированный вирус с А1(0Н)3 в жидком препарате.

Для получения доз вируса используют стандартные методики. Массу замороженного очищенного вируса оттаивают и разводят с помощью композиции соответствующей среды, в данном случае модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, до желательной стандартной концентрации вируса, в данном случае до 10⁶'² БОЕ/мл. Добавляют суспензию гидроксида алюминия до достижения конечной концентрации 48 мг/дозу и композицию вируса разводят стабилизатором для лиофилизации (сахароза 4%, декстран 8%, сорбит 6%, аминокислота 4%) до целевого титра вируса, в данном случае до 10⁵'⁶ БОЕ/дозу. 0,5 аликвот композиции стабилизированного вируса асептически переносят в 3 мл пробирки. Лиофилизацию и закупорку пробирок производят так, как описано в части 1.

3. Лиофилизированный вирус с А1(0Н)3 для блистерного представления.

Для получения доз вируса используют стандартные методики. Массу замороженного очищенного вируса оттаивают и разводят с помощью композиции соответствующей среды, в данном случае модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, до желательной стандартной концентрации вируса, в данном случае до 10^6.2 БОЕ/мл. Добавляют суспензию гидроксида алюминия до достижения конечной концентрации 48 мг/дозу и композицию вируса разводят стабилизатором для лиофилизации, который может представлять собой сахарозу, декстран или 4% аминокислоту, или желатин, или растительный пептон, или ксантан до целевого титра вируса 10^5.6 БОЕ/дозу. Для переноса доз в 0,5 мл или предпочтительно меньше в углубления блистера применяют асептическую операцию наполнения.

Производят лиофилизацию композиции, и углубления блистера запечатывают с помощью термического запечатывания.

Возможно включение стандартных ингредиентов для предупреждения осаждения суспензии гидроксида алюминия. Такие стандартные ингредиенты включают, например, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу и силиконовые полимеры. Также могут быть включены корригенты.

Пример 5. Вирусная титрация ротавируса для различных препаратов.

5.1. Сравнение препаратов на основе лактозы и сахарозы.

Таблица 5

Номер серии	Состав препарата	Титр вируса до лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и 1 недели при 37°С
98006/01	Лактоза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	П2	То^
98606/03	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	ιο8,ΖΒ

Препарат ротавируса Р43 получали либо с сахарозой, либо с лактозой, как показано в таблице выше.

Титрация вируса до лиофилизации представляет собой титр вируса в законченном жидком препарате (содержащем сахарозу, декстран, сорбит, аминокислоты) без стадии лиофилизации.

Хорошими результатами являются такие, где достигается <0,5 1од снижение на стадии лиофилизации и <0,5 1од снижение в течение 1 недели при 37°С (тест на стабильность в форсированных условиях). Точность титрации вируса составляет около + или - 0,2 1од.

- 15 014328

Результаты показывают, что сахароза может применяться вместо лактозы.

5.2. Эффект аргинина и замены сорбита на мальтит.

Таблица 6

Номер серии	Композиция препарата	Титр вируса в момент времени = ноль после лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и 1 недели при 37°С
98Ы6/01	Лактоза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	ю4·8	104'8
981.16/02	Лактоза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% Аргинин: 3%	10«.»	ю4·9
981.16/04	Лактоза: 2% Декстран: 4% Мальтит: 3% Аминокислоты: 2% Аргинин: 3%	ю47	То5

Результаты демонстрируют, что добавление аргинина (который известен тем, что улучшает стабильность вируса при лиофилизации и также обеспечивает основную среду с целью компенсации кислотности желудка) поддерживает титр вируса.

Сорбит имеет тенденцию в значительной степени снижать температуру стеклования лиофилизованной лепешки. Это можно преодолеть посредством использования мальтита вместо сорбита, как показано выше, при чем также поддерживается титр вируса.

5.3. Композиции различных препаратов.

Данные эксперименты демонстрируют тот факт, что возможен целый ряд препаратов.

- 16 014328

Таблица 7

Номер серии	Композиция препарата	Титр вируса до лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и 1 недели при 37С
99С11/01	Сахароза; 2% Декстран: 4% Сорбит; 3% Аминокислоты: 2%	“Ϊ0534	То5707
99С11/02	Сахароза: 2% Декстран: 4% Мальтит: 3% Аминокислоты: 2%	То™	10*’“
99С11/04	Декстран: 4% Мальтит: 3% Аминокислоты: 2%	104,аэ	10ь.щ

Номер серии	Композиция препарата	Титр вируса в момент времени = ноль после лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и 1 недели при 37°С
99С17/01	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	10® 40	То™
99С17/02	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 1,5% Аминокислоты: 2%	То5·30	То™
99С17/ОЗ	Сахароза: 2% Декстран: 4% Аминокислоты: 2%	По5731	То™
99С17/04	Сахароза: 2% Декстран: 4%	То™	ю44®

	Мальтит: 3% Аминокислоты: 2%
99 С17/05	Сахароза: 2% Декстран: 4% Мальтит: 1,5% Аминокислоты: 2%	Ю4 39	То™
99С17/06	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3%	То™	То™
99С17/07	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 1,5%	ю®11	10* 09

5.4. Взаимодействие ротавируса и антацида А1(ОН)₃.

- 17 014328

Таблица 8

Ротавирус	А1(ОН)3	Н2О	Время контакта при комнатной температуре	Центрифугирование	Титр вируса в надосадочной жидкости в БОЕ/мл	Титр вируса в осадке в БОЕ/мл
10ае БОЕ/мл	48 мг в 0,240 мл	0,76 мл	30 мин	8000 об/мин, 10 мин	10з.ы,
БОЕ/мл	0,48 мг В 0,240 мл	0,76 мл	30 мин	8000 об/мин, 10 мин	ίο^
ΐϊΡ3 БОЕ/мл		1 мл	30 мин	8000 об/мин, 10 мин	105·6®
Ротавирус в лиофилизованной	12 мг в 0,120 мл	1,38 мл	30 мин	8000 об/мин, 10 мин	Ниже определяемого уровня	ю4-7
лепешке

А1(ОН)₃ использовали в качестве антацида. Данные показывают, что ротавирус взаимодействует с нерастворимой неорганической солью (А1(ОН)₃), поскольку он осаждался вместе с А1(ОН)₃ (снижение активности вируса в надосадочной жидкости).

5.5. Растворение антацида А1(ОН)₃ в цитрате натрия перед титрованием вируса.

Таблица 9

Вирусные образцы	Растворение	Условия	Титры вируса БОЕ/мл
99В10/06 жидкий препарат перед лиофилизацией; 105.43	1,5 мл ИазЦитрат	24ч при комнатной температуре	Ίο371
99В10/06: лиофилизованный ю543	1,5 мл №3Цитрат	24ч при комнатной температуре	То4^

При взаимодействии ротавируса с А1(ОН)3 возможна полная лиофилизация (включая А1(ОН)3). После лиофилизации можно восстановить ротавирус посредством растворения А1(ОН)3 в цитрате натрия. Данная стадия не повреждает ротавирус и сохраняет его активность после стадии растворения.

5.6. Инфекционность ротавируса после высвобождения из связи А1(ОН)₃-ротавирус.

Механизм высвобождения вируса (посредством растворения носителя) может успешно происходить ίη у1уо. Действительно, гидроксид алюминия становится полностью растворимым при рН ниже 6, и, таким образом, ротавирус может высвобождаться в желудке.

А1(ОН)₃ + 3Н⁺ А1⁺⁺⁺ (растворимый в воде) + 3Н₂О

В желудке ионы А1⁺⁺⁺ не абсорбируются (1.1. Ро\уе1к К. 1идйаой8тдй апб К.Р.Н. Тйотркоп, ТНе гедиШюп оГ ттега1 абюгрйоп т (Не да81гот1е8Йпа1 1гаск, Ргосеебтдк оГ (Не МИпНоп 8ос1е1у (1999), 58, 147-153).

В кишечнике вследствие повышения уровня рН нерастворимые формы алюминия выпадают в осадок (А1(ОН)3 или А1РО4) и удаляются естественным способом.

Неизвестно, будет ли способен вновь образованный осадок А1(ОН)3 (или А1РО4) на повторное взаимодействие со свободным ротавирусом. Это рождает вопрос об инфекционности самого комплекса А1(ОН)3-ротавирус.

Высвобождение ротавируса из комплекса А1(ОН)₃-ротавирус с помощью других механизмов

- 18 014328 также возможно. Лизин, например, препятствует адсорбции вируса на А1(ОН)₃. Известно, что другие анионы, такие как борат, сульфат, карбонат и фосфат, специфично адсорбируются на гидроксиде алюминия, таким образом, теоретически должна иметься возможность заместить (посредством конкуренции за сайты адсорбции) ротавирус в комплексе А1(ОН)₃-ротавирус.

БЕУСООЗАДб +

мгА1(ОН)₃ в 0,120 мл +

мг Лизина

1,380 мл Η₂Ο +

мин при комнатной температуре +

Центрифугирование

8000 об/мин 10 мин

осадок надосадочная жидкость +

растворение в цитрате ниже определяемого уровня 3,8

Таким образом, ротавирус может высвобождаться из комплекса А1(ОН)3-ротавирус, и высвобожденный ротавирус сохраняет активность.

Данное высвобождение может осуществляться либо посредством растворения А1(ОН)3 с помощью НС1 в желудке или с помощью Ыа₃ Цитрата ίη уйго, либо посредством замещения ротавируса основной аминокислотой (лизином).

5.7. Инфекционность комплекса А1(ОН)₃-ротавирус.

Одну дозу лиофилизованного ротавируса восстанавливали водой и разделяли на две части. В первую часть, считаемую контрольной, добавляли дополнительный объем воды. Во вторую часть добавляли 24 мг А1(ОН)₃, взвешенного в 0,240 мл воды (Доклинические титрования вируса).

В присутствии А1(ОН)₃ ротавирус активен, и титр вируса выше по сравнению с контрольным образцом.

Этот эксперимент был повторен без разделения лиофилизованной дозы с добавлением 12 мг А1(ОН)3 или 24 мг А1(ОН)3.

Здесь контрольным образцом являлся образец, восстановленный с помощью цитратнобикарбонатного буфера. Таким образом, титр вируса снова был выше в присутствии А1(ОН)3.

- 19 014328

Как в примере выше, ротавирус взаимодействует с частицами А1(0Н)₃, так как вирус удаляется при центрифугировании. 0ЕУС003А46 представляет собой лиофилизованный препарат ротавируса (сахароза 2%, декстран 4%, сорбит 3%, аминокислоты 2%).

□КУСООЗАДб □НХ/СООЗА46 мг А1(ОН)₃ в 0,120 мл +

мгА!(ОН)з е 0,240 мл +

1,260 мл Н₂О +

Центрифугирование

8000 об/мин 10 мин

Центрифугирование

8000 об/мин 10 мин

осадок +

1,5 мл 8ϋδΑΑ

5,78

5,96 надосадочная жидкость <1,44 <1,44 осадок +

1,5 мл 3ϋ3ΑΑ

5,92

6,11 надосадочная жидкость <1,44 <1,44

8Ό8ΑΑ = сахароза 2%, декстран 4%, сорбит 3%, аминокислоты 2%.

В соответствии с титрованием вируса, проведенным для надосадочной жидкости, оказывается, что необходимо малое количество А1(0Н)₃ для адсорбции ротавируса (начиная с одной лиофилизованной дозы 5,7 1од, постепенно повышая титр вируса):

Таблица 10

А1(ОН)3	Время адсорбции	Титр в надосадочной жидкости
12 мг	1 час при комнатной температуре	2,7
24 мг	1 час при комнатной температуре	3,4
48 мг	1 час при комнатной температуре	3,4
72 мг	1 час при комнатной температуре	2,0
96 мг	1 час при комнатной	ниже определяемого уровня

	температуре
12 мг	в течение ночи	2,7
24 мг	в течение ночи	ниже определяемого уровня
48 мг	в течение ночи	2,5
12 мг	немедленно	ниже определяемого уровня
24 мг	немедленно	2,0
48 мг	немедленно	ниже определяемого уровня

Представляется, что для адсорбции ротавируса на А1(0Н)₃ необходим небольшой период вре

- 20 014328 мени.

Одну дозу лиофилизованного ротавируса восстанавливали в присутствии 24 мг А1(ОН)₃ и центрифугировали через 0, 15, 60 мин и 24 ч. Осадок повторно суспендировали в 8Э8АА перед титрованием вируса.

Таблица11

С целью избежать присутствия алюминия в вакцине антацид А1(ОН)₃ заменили другой нерастворимой неорганической солью: СаСО₃ (карбонат кальция).

Явления, наблюдаемые с СаСО₃, соответствуют явлениям, описанным для А1(ОН)₃: взаимодействие ротавируса с неорганической солью;

сохранение активности ротавируса при взаимодействии с неорганической солью;

возможность высвобождения ротавируса из комплекса путем растворения неорганического основания кислотой;

возможность совместной лиофилизации антацида и ротавируса.

Взаимодействие СаСО₃ и ротавируса

В первом исследовании лиофилизованный ротавирус (титр вируса 5,7) восстанавливали с помощью суспензии СаСО3 в воде (50 мг в 1,5 мл); затем центрифугировали и сравнивали титры вируса в надосадочной жидкости и осадке.

ОКУСООЗА4б

ОКУСООЗА46 мг СаСОЗ в 1,5 мл Н₂О

Центрифугирование

8000 об/мин 10 мин

Центрифугирование

8000 об/мин 10 мин осадок

надосадочная осадок надосадочная жидкость жидкость

1,5 мл цитрат №

5,88 4,33

Это свидетельствует о том, что более 90% ротавируса связывается с СаСО3.

Также после взаимодействия с вирусом было возможно выполнить титрование и восстановить изначальное количество вируса.

Также титры вирусы немного выше, чем получаемые без СаСО₃.

1,5 мл 8ϋ8ΑΑ

5,83

4,46

Лиофилизованный ротавирус восстанавливали с помощью суспензии СаСО₃ в воде (1,5 мл): 10 мг;

мг;

- 21 014328

100 мг и затем центрифугировали и сравнивали титры вируса в надосадочной жидкости и осадке. Таблица 12

СаСОз	ех1етро 4- центрифугирование	1 час + центрифугирование
	Осадок	Надосадочная жидкость	Осадок	Надосадочная жидкость
100 мг	4,57	3,01	4,79	3,09
50 мг	4,17	4,15	4,22	3,86
10 мг	3,17	4.77	3,87	4,87

Таким образом, очевидно, что чем больше СаСО₃, тем больше вируса взаимодействует и тем меньше вируса обнаруживается в надосадочной жидкости.

Однако полная доза не восстанавливается полностью (ожидалось по меньшей мере всего 5,3 или даже 5,8, как получали ранее - см. выше).

Защита ротавируса СаСО₃ во время титрования антацида, по методу КоззеНе-Кюе, имитирующему детский желудок

Было выполнено два типа титрования по методу Коккейе-К1се, имитирующему детский желудок, с использованием 10 доз лиофилизованного ротавируса (0КУС003Л46) и 50 мг СаСО₃.

В классическом титровании по методу Коккейе-К1се, антацид смешивают с ротавирусом и наливают в данную смесь НС1.

В обратном титровании по методу Коккейе-К1се, имитирующему детский желудок, ситуация обратная: антацид по капле добавляют в объем НС1 (как это происходит ίη νίνο).

Таблица 13

Классическое титрование по методу Ко8зеКе-К|се, имитирующему детский желудок
Лиофилизованный ротавирус хранили при:	Буфер	Теоретический титр вируса	Измеренный титр вируса
4°С	60 мг СаСОз	5,3	4,6
-80°С	60 мг СаСОз	5,3	4,6
4°С	24 мгА1(ОН)з	5,4	<2,9
-80°С	24 мгА1(ОН)з	5,4	<2,9

Обратное титрование по методу Козеейе-Яюе, имитирующему детский желудок
Лиофилизованный ротавирус хранили при:	Буфер	Теоретический титр вируса	Измеренный титр вируса
4°С	60 мг СаСОз	5,3	4,6
-80° С	60 мг СаСОз	5,3	4,6
4°С	24 мг А1(ОН)3	5,4	<2,9
-80°С	24 мгА1(ОН)з	5,4	<2,9

Таким образом, в данном эксперименте ίη νίίτο, карбонат кальция способен защищать около 20% ротавируса от присутствия НС1, в то время как гидроксид алюминия неспособен на это.

5.9. Лиофилизация ротавируса в присутствии антацида СаСО₃.

Таблица 14

Номер серии	Композиция	Титр вируса в момент времени = ноль после лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и 1 недели при 37°С
99К08/01	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	10Ь2а	То57™

- 22 014328

	СаСО3: 50 мг
99К08/02	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСО3: 60 мг	106·’6	10Ь'15
О0С24/01	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСОз: 60 мг Ксантан: 0,3%	10ь,и/	10^
00С24/03	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСОз: 60 мг Ксантан: 0,3%	Ιο3*7	До*35 .....
ООЕ09/25	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСОз: 60 мг Ксантан: 0,25%	ю5·03 ’	То*31
00Е09/30	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСОз: 60 мг Ксантан: 0,30%	То5751	То*®7
00Е26/06	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3%	Ϊ0450-	То*™

Аминокислоты: 2%

СаСО₃: 60 мг

Крахмал: 2%

Аминокислоты: 2% СаСО3: 60 мг Крахмал: 2%

Это представляет собой все в одном - лиофилизацию ротавируса и антацида (СаСО₃) вместе в одной пробирке. Для предупреждения осаждения СаСО₃ во время стадии наполнения необходимы вязкие агенты. Примеры таких вязких агентов включают ксантановую камедь и крахмал. Активность ротавируса сохраняется даже в присутствии ксантановой камеди и крахмала.

5.10. Лиофилизированные таблетки для быстрой дезинтеграции при попадании в рот.

Следующие препараты демонстрируют концепцию 1уос (препараты, не требующие воды для растворения). Это означает быстрое растворение лиофилизованной лепешки во рту.

- 23 014328

Таблица 15

Номер серии	Композиция препарата	Титр вируса	Титр вируса после
		перед	лиофилизации и 1
		лиофилизацией	недели при 37°С
99В10/06	Сахароза 4 Глутамат натрия 3,7% А!(ОН)з 48 мг	То570
99С11/12	Мальтит 3% ΑΙ(ΟΗ) 48 мг Г идроксипропилметилцеллюлоза: 1%	ю41И	ηθ375

Номер серии	Композиция	Титр вируса в момент времени = ноль после лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и 1 недели при 37°С
0ОС24/05	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	1О5·02	То373
	СаСОз: 60 мг Ксантан: 0,3%
00С24/06	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСОз: 60 мг Ксантан: 0,3%	ю4Ве	1 о4'ьь
ООР26/11	Сахароза: 1% Декстран: 2% Сорбит: 1,5% Аминокислоты: 1% СаСОз: 60 мг Крахмал: 2%		Тотэд

В концепции 1уос могут применяться и ксантан, и крахмал (сохраняя свойства быстрого растворения лиофилизованной лепешки).

Пример 6. Применение карбоната кальция в качестве антацида для ротавирусной вакцинной композиции.

При применении суспензии СаСО3 в воде в качестве антацида для ротавируса возникает проблема, состоящая в том, что частицы карбоната кальция быстро осаждаются при попадании в воду, поскольку величина плотности порошка приближается к 2,6, а средний размер частиц составляет 30 мкм. Это осаждение может быть замедлено с помощью:

1) увеличения плотности окружающей среды;

2) увеличения вязкости окружающей среды;

3) снижения размеров частиц;

4) удержания частиц на расстоянии друг от друга.

6.1. Увеличение плотности окружающей среды.

При попадании суспензии СаСО₃-вода (при нахождении в шприце) на лиофилизованную лепешку (содержащую сахарозу 2%, декстран 4%, сорбит 3%, аминокислоты 2%) плотность окружающей среды увеличивается, но скорость осаждения СаСО3 незначительно отличается по сравне

- 24 014328 нию с суспензией СаС0₃-вода.

6.2. Увеличение вязкости окружающей среды.

Псевдопластические эксципиенты

Псевдопластический раствор определяют, как раствор, имеющий более высокую вязкость в неподвижном положении по сравнению с его вязкостью при перемешивании.

Обычными эксципиентами этого типа являются природные полимеры, например аравийская камедь, трагантовая камедь, агар-агар, альгинаты, пектины; полусинтетические полимеры, например карбоксиметилцеллюлоза (Ту1о§е С®), метилцеллюлоза (МеОюсек А®, Уксопйапк МС®, Ту1о5С МН® и МВ®), гидроксипропилцеллюлоза (К1исек®), гидроксипропилметилцеллюлоза (Ме11юсек Е® и К®, УксоШгащ МРНС®).

Обычно данные псевдопластические эксципиенты используются вместе с тиксотропными агентами.

Псевдопластические эксципиенты с низкой текучей способностью

Эти полимеры при достаточной концентрации способствуют появлению структурной организации жидкости, результатом чего является раствор с высокой вязкостью, имеющий низкую текучую способность при неподвижном положении. Для того чтобы раствор мог течь и перемещаться, системе необходимо сообщить определенное количество энергии. Для временного разрушения структурной организации жидкости с целью получения жидкого раствора необходима внешняя энергия (перемешивание).

Примерами таких полимеров являются СатЬорок® и ксантановая камедь.

Тиксотропные эксципиенты

С помощью этих эксципиентов формируется гелевая структура при неподвижном положении, в то время как при перемешивании образуется жидкий раствор.

Примерами тиксотропных эксципиентов являются: Уеедиш® (магний-алюминий силикат) и Ауюе1 КС® (около 89% микрокристаллической целлюлозы и 11% натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы).

6.3. Снижение размеров частиц.

Снижение размеров частиц СаС03 приводило к снижению способности соединения к нейтрализации кислоты.

6.4. Удержание частиц на расстоянии друг от друга.

Это имеет место для Уеедиш® и Ауюе1®, где нерастворимые частицы меньше (около 1 мкм), чем частицы СаС03, помещают между частицами СаС03 с целью предупреждения агрегации.

Пример 7. Дизайн продукта.

Следующие схемы демонстрируют примеры возможных дизайнов продукта.

7.1. СаС0₃ в шприце.

Имея клинические партии лиофилизованного ротавируса в пробирках, можно поместить анта цид в жидкость для восстановления, содержащуюся в шприце.

шприц с 1,3 мл СаСОз (60 мг/мл) игла лиофилизированный ротавирус

В данном представлении продукта осаждение СаС03 должно находиться под контролем не только во время стадий наполнения, но также в течение всего срока хранения продукта (по меньшей мере 2 года).

7.2. СаС0₃ в лиофилизованной пробирке.

шприц с 1,3 мл воды

- 25 014328 лиофилизированный ротавирус +

СаСОз (60 мг)

Ксантан

7.3. Лиофилизация в блистере.

В данном случае проводят совместную лиофилизацию ротавируса, СаС03 и ксантановой камеди непосредственно в блистере.

Пример 8. Лиофилизация различных штаммов ротавируса.

Таблица 16

Номер серии	Штамм ротавируса	Композиция препарата	Титр вируса в момент времени = ноль после лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и 1 недели при 37°С
00Е26/01	01 ЗВ ригИ п°61 РКО/0232	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	Тоте	Ίο477
00Р26/02	С2 (ФЗ-1)	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	Ίο”	До”
00Р26/03	СЗ(Р)	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	До*®	ю4·5
00Е26/04	О40/А-70)	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	ю4“	104а
00Р26/05	С9(\Л/161)	Сахароза: 2%	То*8	Τθο
		Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%

Штаммы Ό8-1, Р и УА70 описаны, как эталонные штаммы ротавируса человека для серотипов 62, 63 и 04 соответственно на странице 1361 НеИк Вауеп рге§8 1990, второе издание.

В данном эксперименте различные штаммы ротавируса были лиофилизованы.

Для всех штаммов было показано сохранение титра вируса во время лиофилизации и в тесте на стабильность при форсированных условиях (одна неделя при 37°С).

Пример 9. Исследование безопасности I фазы одного перорального введения ротавирусной вакцины у взрослых.

Было выполнено исследование I фазы для оценки безопасности и реактогенности единичной пероральной дозы в 10^6.0 БОЕ вакцины Р43 у взрослых здоровых людей в возрасте от 18 до 45 лет.

Клиническое исследование было двойным слепым и рандомизированным. Оно было плацебоконтролируемым и независимым. Исследование проводили в одном центре в Бельгии.

9.1. Исследуемая популяция.

Всего в исследование было включено 33 пациента, 11 в группу плацебо и 22 в группу вакцины, и все пациенты завершили исследование. Все добровольцы были белой расы. Их средний возраст в момент вакцинации составлял 35,3 года, в диапазоне от 18 до 44 лет. Исследование началось в январе и продолжалось только в течение одного месяца.

9.2. Материал.

Вакцина.

Были произведены, очищены, сформированы в препараты и лиофилизованы клинические партии вакцины Р43 в соответствии с надлежащей производственной практикой. Партии прошли контроль качества и получили гарантию качества. Каждый флакон вакцины содержал следующие ком

- 26 014328 поненты:

Активный ингредиент:

Штамм Р43 минимум Ю^5,8БОЕ

Эксципиенты, стабилизаторы:

Сахароза 9 мг

Декстран 18 мг

Сорбит 13,5 мг

Аминокислоты 9 мг

Плацебо.

Флаконы плацебо были подготовлены и выпущены. Каждый флакон плацебо содержал следующие компоненты.

Эксципиенты, стабилизаторы:

Сахароза 9 мг

Декстран 18 мг

Сорбит 13,5 мг

Аминокислоты 9 мг

Разбавитель.

В качестве разбавителя для восстановления вакцины и плацебо использовали воду для инъекций.

9.3. Введение.

Примерно за 10-15 мин до введения вакцины или плацебо пациентам обоих групп давали 10 мл Му1ап1а® перорально. Му1ап1а® представляет собой зарегистрированный антацид. Антацид повышает уровень рН желудка и предупреждает инактивацию ротавируса во время его прохождения через желудок.

Для получения вакцины 2 флакона лиофилизованного Р43, содержащих 10⁵'⁸ БОЕ на флакон были восстановлены с помощью 1,5 мл воды для инъекций в качестве разбавителя. Таким образом достигался вычисленный титр вируса 10^6.1 БОЕ на дозу. Восстановленную вакцину немедленно вводили в виде единичной пероральной дозы.

Для получения плацебо два флакона лиофилизованного плацебо восстанавливали с помощью

1,5 мл воды для инъекций и вводили перорально в качестве единичной дозы.

9.4. Безопасность и реактогенность.

Применяли следующие критерии безопасности и реактогенности.

Ожидаемыми общими симптомами были лихорадка, диарея, рвота, тошнота, боль в области живота и потеря аппетита. Их регистрировали в течение восьми дней после введения.

Неожидаемые симптомы регистрировали в течение 30 дней после введения.

Серьезные нежелательные явления регистрировали в течение всего периода исследования.

Забор образцов диареи должен был осуществляться в течение восьми дней после введения. Результаты.

Во время соответствующих периодов наблюдения не было получено сообщений об ожидаемых симптомах, о неожидаемых симптомах и о серьезных нежелательных явлениях.

Не было получено сообщений о случаях диареи.

9.5. Заключения.

Р43 вакцина 8В Вю1ощса1к была безопасной по сравнению с плацебо при пероральном введении двойным слепым образом в виде единичной дозы в дозе 10^6.1 БОЕ здоровым взрослым добровольцам в возрасте от 18 до 44 лет.

Пример 10. Эффективность двух доз моновалентной вакцины ротавируса человека, содержащей К1Х4414, в предупреждении гастроэнтерита, вызванного ротавирусом С1 и не-С1 (С9).

10.1. Методы.

Было проведено рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование II фазы в Латинской Америке для оценки защитной эффективности вакцины (штамм ротавируса человека К1Х4414), полученной на основе штамма человека С1Р[8] 89-12, для иммунизации детей. Вакцина К1Х4414 содержит в качестве ротавирусного компонента ослабленный штамм человека С1Р[8], хранящийся в ЕСАСС под номером 99081301 (\УО 01/12797).

Вакцинная композиция (табл. 17)

Вакцину НКУ или плацебо подготавливали для введения путем инъекции всего содержимого одного предварительно заполненного шприца, содержащего буфер карбоната кальция, во флакон с лиофилизованным продуктом (вакциной или плацебо). Флакон встряхивали для повторного суспендирования вакцины/плацебо. Весь объем повторно суспендированного продукта извлекали в этот же шприц, удаляли иглу и повторно суспендированный продукт немедленно вводили в виде единичной

- 27 014328 пероральной дозы (примерно 1,0 мл).

Таблица 17. Вакцинная композиция ротавируса К1Х4414

Ингредиенты	Количество (на номинальную дозу: 1 мл)
Активный ингредиент К1Х4414	106·8 БОЕ/дозу

Эксципиенты
Лиофилизованная вакцина	Сахароза	9 мг
в стеклянном флаконе
	Декстран	18 мг
	Сорбит	13,5 мг
	Аминокислоты	9 мг
	Модифицированная по	2,25 мг

способу Дульбекко среда Игла (ϋΜΕΜ)

Жидкий разбавитель (на основе СаСО₃) в предварительно заполненном шприце

Карбонат кальция

Ксантан

Вода для инъекций мг

2,5 мг достаточное количество до 1 мл

Введение вакцины

Здоровые дети в возрасте от 2 до 4 месяцев получали две дозы вакцины ШХ4414-ротавируса при концентрации вируса 10⁵'⁸ БОЕ на дозу (493) или плацебо (504) совместно с вакцинами ЭТР-\\НВУ (дифтерия-столбняк-коклюш, гепатит В) и Н1Ь (НаеторЫ1ик тПиепхае тип Ь). Три дозы 0РУ (пероральная вакцина против вируса полиомиелита) давали с промежутком в 2 недели от введения исследуемой вакцины, т. е. их введение не должно было происходить во время периода, начинающегося с 2 недель до введения каждой дозы исследуемой вакцины и заканчивающегося через 2 недели после введения. Две другие группы получали 2 дозы вакцины РIX4414-ротавируса при различных концентрациях вируса: 10^4.7 БОЕ и 10^5.2 БОЕ. Образцы диареи тестировали на присутствие ротавируса (иммуноферментным анализом, ЕЫ8А, еп/уте-йпкей 1ттцпокогЬеп1 аккау) и серотипы, определяемые в положительных образцах (ПЦР с обратной транскрипцией). Сообщения об эпизодах диареи, начиная с двух недель после второй дозы, учитывали в анализе эффективности. Интенсивность определяли, используя 20-балльную шкалу (Киикка апй Уек1кап, 1990). 20-балльную оценочную систему использовали для оценки интенсивности каждого эпизода диареи в данном исследовании, как показано ниже в табл. 18. Тяжелое заболевание определяли баллом >11.

Таблица 18

Нежелательное явление	Баллы
Продолжительность более жидкого стула, чем обычно (дни)
1-4	1
5	2
>6	3
Максимальное число случаев более жидкого стула, чем
обычно / 24 часа
1-3	1
4-5	2
>6	3
Продолжительность рвоты (дни)
1	1
2	2
г 3	3

- 28 014328

Максимальное число эпизодов рвоты / 24 часа
1	1
2-4	2
3:5	3
Лихорадка (измерено ректально/подмышечно)*
37,1-38,4°С/36,6-37,9°С	1
38,5-38,9°С/38,0-38,4°С	2
> 39’С/а 38,5°С	3
Лечение
Восстановление водного баланса	1
Госпитализация	2
Обезвоживание
1-5%	2
й 6%	3

* Оценивали самую высокую зарегистрированную температуру.

10.2. Результаты.

Промежуточный анализ эффективности выполняли для вышеупомянутой группы, и выделенными серотипами в основном были 01 и 09, распределенные почти равномерно. Общий уровень приступов в группе плацебо варьировал от 4,8% для 01 до 3,6% для 09 в течение 6-месячного периода наблюдения. Две дозы ротавирусной вакцины К1Х4414 по 10⁵'⁸ БОЕ защищали от всех типов диареи, вызванной 01 с эффективностью 83% [95% С!: 50,4-95,7] и от всех тяжелых гастроэнтеритов с эффективностью 92,1% [95% С!: 47,6-99,9]. Если диарея была вызвана 09, эффективность защиты от всех типов диареи составляла 60,2% [95% С!: 0,2-86,0] и 80,8% [95% С!: 33,0-96,4] от тяжелых гастроэнтеритов. Для каждого из этих критериев эффективности (любые и тяжелые случаи для 01 и 09) наблюдалось статистически значимое уменьшение количества эпизодов диареи в группе НКУ по сравнению с группой плацебо (р<0,05, двусторонний точный критерий Фишера).

Результаты, полученные в двух других группах вакцины (с другими концентрациями ротавируса), соответствуют приведенным в примере и представлены в окончательном анализе (пример 11). Также были проанализированы данные по эффективности для 02, 03 и 04. Из данного исследования не было сделано выводов о перекрестном иммунитете 02, 03 и 04, так как были получены сообщения о слишком малом числе случаев. Однако данные по эффективности по отношению к 02, 03 и 04 представлены в окончательном анализе для более важного размера выборки (пример 11).

10.3. Заключение.

Данные результаты в высокой степени подтверждают эффективность 2 доз моновалентной НКУ вакцины, ротавирусной вакцины К!Х4414, в создании иммунитета у маленьких детей против штамма 01 и перекрестного иммунитета против штамма 09.

Пример 11. Эффективность двух доз моновалентной вакцины ротавируса человека, содержащей штамм К1Х4414, при введении с тремя различными концентрациями вируса в предупреждении гастроэнтерита, вызванного ротавирусом 01 и не-01 (02, 03, 04, 09).

11.1 Методы.

Было проведено рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование !! фазы в Латинской Америке для оценки защитной эффективности и эффективности по отношению к госпитализации вакцины, полученной на основе штамма человека 01Р[8] 89-12, для иммунизации детей. Более конкретно используемая вакцина называется ротавирусная вакцина К1Х4414 и содержит в качестве ротавирусного компонента ослабленный штамм человека 01, хранящийся в ЕСАСС под номером 99081301.

Здоровые дети получали две дозы ротавирусной вакцины К!Х4414 с использованием трех различных концентраций вируса. Когорта для анализа эффективности состояла из 1846 субъектов (468 субъектов в группе НКУ вакцины с концентрацией 10⁴'⁷ БОЕ, 460 субъектов в группе НКУ вакцины с концентрацией 10⁵'² БОЕ, 464 субъекта в группе НКУ вакцины с концентрацией 10⁵'⁸ БОЕ и 454 субъекта в группе плацебо) в возрасте от 2 до 4 месяцев, вакцину применяли совместно с вакцинами ЭТР\\-НВУ и Н1Ь. Три дозы ОРУ давали с промежутком в 2 недели от введения исследуемой вакцины, т.е. их введение не должно было происходить во время периода, начинающегося с 2 недель до введения каждой дозы исследуемой вакцины и заканчивающегося через 2 недели после введения. Образцы диареи тестировали на присутствие ротавируса (иммуноферментным анализом) и серотипы, определяемые в положительных образцах (ПЦР с обратной транскрипцией). Сообщения об эпизодах диареи, начиная с двух недель после второй дозы и до достижения пациентами одного года,

- 29 014328 учитывали в анализе эффективности Интенсивность определяли, используя 20-балльную шкалу (Киикка апб Усекал. 1990). Тяжелое заболевание определяли баллом >11 (см. пример 10 для описания 20-балльной оценочной системы).

11.2. Результаты.

Результаты. представляющие собой окончательный анализ данных. упоминаемый в примере 10. продемонстрированы в таблицах ниже. Дети в группах вакцины имели значительно меньшее число эпизодов ротавирусного гастроэнтерита. чем дети в группе плацебо (р<0.001. двусторонний точный критерий Фишера) (табл. 19). В зависимости от дозировки защитная эффективность по отношению к тяжелому ротавирусному гастроэнтериту достигала 85.6% (95% С1: 63.0-95.6%) и 70% (95% С1: 45.7-84.4%) по отношению к любому ротавирусному гастроэнтериту (табл. 20). Для каждого из этих критериев эффективности наблюдалось статистически значимое уменьшение количества эпизодов диареи в группе НКУ по сравнению с группой плацебо (р<0.001. двусторонний точный критерий Фишера). В образцах кала от детей с гастроэнтеритом были идентифицированы (иммуноферментным анализом и ПЦР с обратной транскрипцией) многочисленные серотипы ротавируса (01. 02. 03. 04 и 09). что позволило также вычислить эффективность вакцины по отношению к неС1серотипам. Как можно увидеть из табл. 21 более конкретно. для не-01 серотипов (02. 03. 04 и 09) в зависимости от дозировки эффективность по отношению к тяжелому ротавирусному гастроэнтериту достигала 82.7% (95% С1: 40.3-96.8%). обеспечивая доказательство правильности концепции. что моновалентная вакцина ротавируса человека 01Р1А Р[8] на основе 01 вызывает перекрестный иммунитет против гетеротипических штаммов (т.е. не-01 и не-Р[8]).

Таблица 19. Характеристики эпизодов ротавирусного гастроэнтерита. зарегистрированных в течение исследования

41X4414 41X4414 41X4414 Плацебо

Ю⁴⁷БОЕ 10⁵²БОЕ 10®⁸ БОЕ

Любой ротавирусный 21 22 15 51 гастроэнтерит

Число эпизодов (процент) с определенной характеристикой среди всех зарегистрированных эпизодов ротавирусного гастроэнтерита

Баллы интенсивности <7	4 (19,0)	8 (36,4)	2(13,3)	5 (9,8)
7-10	5 (23,8)	4(18,2)	8(53,3)	12 (23,5)
>11	12(57,1)	10 (45,5)	5 (33,3)	34 (66,7)
Идентифицированные серотипы ротавируса
Дикий 61	12 (57,1)	6 (27,3)	7 (46,7)	30 (58,8)
62	0	0	1 (6,7)	3 (5,9)
63	1 (4,8)	0	0	2 (3,9)
64	0	0	1 (6.7)	0
69	8(38,1)	14 (63,6)	7 (46,7)	15 (29,4)
Собачий	0	0	0	1 (2,0)
Неизвестно	0	2 (9.1)	0	0

Таблица 20. Защитная эффективность двух доз вакцины ротавируса человека К1Х4414 по отношению к ротавирусному гастроэнтериту

Любой	Тяжелый	Г оспитализация
ротавирусный	ротавирусный	по поводу
гастроэнтерит	гастроэнтерит	ротавирусного
		гастроэнтерита

	N	η (%)	Эффективность (95% С1)	η (%)	Эффективность (95% С1)	η (%)	Эффективность (95% С1)
Объединенные	1392	58	61,4	27	74,1	9	79,0
группы			(4,2)*	(42,3; 4,1)	(1,9)*	(55,8;	(0,6)*	(48,0;
вакцины						85,0)		92,0)
41X4414	106в	464	15	70,0	5	85,6	3	79,0
БОЕ			(3,2)*	(45,7;	(1.1)*	(63,0;	(0,6»	(24,9;
				84,4)		95,6)		96,1)
41X4414	10®2	460	22	55,7	10	71,0	1	93,0
БОЕ			(4,8)*	(25,3;	(2,2)*	(39,9;	(0,2)*	(53,7;

- 30 014328

		74,5)		87,2)		99,8)
ΚΪΧ4414 1(?7 468“	21	58,4	12	65,8	5	65,4 (-
БОЕ	(4.5)*	(29,4;	(2,6)*	(32,2;	(1.1)1	1,8; 90,2)
		76,3)		83,9)
Плацебо 454	49	-	34	-	14	-
	(10,8)		(7,5)		(3,1)

*р<0,001 для каждого сравнения между группами вакцины и плацебо по двустороннему точному критерию Фишера (значимый уровень α=0,05);

Тр=0,037 для сравнения между группами вакцины и плацебо по двустороннему точному критерию Фишера (значимый уровень α=0,05);

фр=0,007 для сравнения между группами вакцины и плацебо по двустороннему точному критерию Фишера (значимый уровень α=0,05)

N = число субъектов;

п/% = число/процент субъектов, для которых был зарегистрирован по меньшей мере один специфический эпизод ротавирусного гастроэнтерита.

Показаны точные 95% доверительные интервалы.

Таблица 21. Защитная эффективность двух доз вакцины ротавируса человека ΚΙΧ4414 по отношению к тяжелому ротавирусному гастроэнтериту со специфическим серотипом

Тяжелый ротавирусный гастроэнтерит

N п (%) Эффективность р-величина* (95% С1)

Ротавирус дикого типа 61

Объединенные группы	1392	13 (0,9)	73,5 (41,2; 88,3)	<0,001
вакцины
ΠΙΧ4414 105 8 БОЕ	464	2 (0,4)	87,8 (48,0; 98,6)	<0,001
ΚΙΧ4414 Ю52БОЕ	460	4 (0,9)	75,3 (23,5; 94,0)	0,006
ГС1Х4414 1 04 7 БОЕ	468	7(1,5)	57,6 (-9,0; 85,2)	0,057
Плацебо	454	16 (3,5)	-	-

Не-61 ротавирус (в основном 69 с типами 62, 63 и 64)

Объединенные группы	1392	14(1,0)	73,1 (42,1; 87,7)	<0,001
вакцины
Я1Х4414 105 8 БОЕ	464	3 (0,6)	82,7 (40,3; 96,8)	0,001
ΚΙΧ4414 105 2 БОЕ	460	6(1,3)	65,2 (7,4; 88,8)	0,020
ΚΙΧ4414 104 7 БОЕ	468	5(1,1)	71,5 (19,4; 91,8)	0,009
Плацебо	454	17 (3,7)	-	-

* Двусторонний точный критерий Фишера (значимый уровень α=0,05) использовался для каждого сравнения между группами вакцины и плацебо;

N = число субъектов;

п/% = число/процент субъектов, для которых был зарегистрирован по меньшей мере один специфический эпизод тяжелого ротавирусного гастроэнтерита.

Показаны точные 95% доверительные интервалы.

11.3. Заключение.

Данные результаты в высокой степени подтверждают эффективность 2 доз моновалентной НКУ вакцины, содержащей ΚΙΧ4414, в создании иммунитета у маленьких детей против любого и тяжелого ротавирусного гастроэнтерита, вызванного штаммом С1, и широкого перекрестного иммунитета против других С типов ротавируса, а именно С2, С3, С4 и С9.

Пример 12. Две дозы вакцины ослабленного ротавируса человека ШХ4414 вакцины демонстрируют гетеротипическую защиту в Латинской Америке и Европе.

Эффективность двух доз пероральной, живой ослабленной вакцины ротавируса (КУ) человека С1Р[8], содержащей штамм ΡΙΧ4414. была проанализирована в клинических исследованиях ΙΙ/ΙΙΙ фазы среди детей Финляндии и Латинской Америки. Ротавирусная вакцина К1Х4414 содержит в качестве ротавирусного компонента ослабленный штамм человека С1, хранящийся в ЕСАСС под номером 99081301.

- 31 014328

12.1. Методы.

Часть результатов примера 12 уже представлена в примерах 10 и 11. Данные были объединены по двум исследованиям ΙΙ фазы, одно в Финляндии, одно в Латинской Америке (Бразилия, Мексика и Венесуэла) (примеры 10 и 11), и по одному исследованию ΙΙΙ фазы в 11 странах Латинской Америки (пример 13) с использованием одинаковой методологии и критериев эффективности. Всего 20081 здоровых детей в возрасте от 2 до 4 месяцев (когорта для анализа эффективности), вакцинированных 2 дозами вакцины КТХ4414 или плацебо, наблюдали до возраста одного года на предмет тяжелого гастроэнтерита (ГЭ) с баллом > 11 по шкале интенсивности Везикари (Киикка Т. е! а1. 8сапб. 1. ΙηίοοΙ. Όίκ. 1990, 22, 259-267). Образцы ГЭ тестировали на ротавирус (посредством ИФА), и определяли тип ротавируса с помощью ПЦР с обратной транскрипцией.

Мета-анализ выполняли на основании трех упомянутых исследований. Объединенную эффективность по отношению к тяжелому КУСЕ (определяемому баллом по шкале интенсивности Везикари >11) вычисляли, начиная с 2 недель после дозы до возраста 1 года (корректировка для эффективности исследования по критерию Мантеля-Хэнзеля).

12.2. Результаты.

В когорте для анализа эффективности было выявлено 5 эпизодов тяжелого ГЭ, вызванного ротавирусом типа С2Р[4], с баллом по шкале Везикари >11 в группе вакцины и 13 эпизодов в группе плацебо. Эффективность вакцины по отношению к типу С2Р[4] составила 67,2% (95% СТ: 14,8; 87,1), что демонстрирует тот факт, что в дополнение к обеспечению иммунитета против гомотипических штаммов (С1Р[8], С3Р[8] и С4Р[8]), вакцина ШХ4414 защищает от тяжелого ротавирусного ГЭ, вызванного гетеротипическим не-Р[8] не-С1 штаммом.

Типоспецифическая эффективность по различным исследованиям приведена ниже (табл. 22).

Таблица 22

Штамм	Число случаев тяжелого КУ6Е	Эффективность вакцины* % (УЕ) (95% С1)
	N вакцинированных (N= 10646)	N плацебо (Ν = 9435)
61	17	52	83,7 (70,0,91,2)
62Р[4]	5	13	67,2(14,8; 87,1)
63	2	8	82,7 (5,9; 96,8)
69	15	34	79,5 (59,2; 89,7)

* УЕ корректирована для эффективности исследования по критерию Мантеля-Хэнзеля.

В 3 исследованиях произошло только 3 случая С4, 1 среди получивших вакцину, 2 среди получивших плацебо.

12.3. Заключение.

Данный анализ показывает, что в дополнение к обеспечению защиты высокого уровня по отношению к гомологичным штаммам ротавируса С1 (которые имеют два внешних белка капсида (УР4 и УР7) и один внутренний белок капсида (УР6), схожие в антигенном отношении с белками вакцины) вакцина К1Х4414 также является в высокой степени защитной по отношению к другим штаммам, которые имеют либо другой С тип (например, С3, С9), либо другой Р тип (например, Р[4]), либо другие С тип и Р тип, как демонстрирует эффективность по отношению к С2Р[4].

Пример 13. Мета-анализ, демонстрирующий, что две дозы вакцины ослабленного ротавируса человека КТХ4414 обеспечивают гетеротипический иммунитет.

Когда стали доступными дополнительные данные из Сингапура и из Европейского исследования (пример 15), был выполнен дополнительный мета-анализ для включения этих исследований в дополнение к исследованиям, упомянутым в примере 12.

13.1. Методы.

В мета-анализ были включены данные трех исследований ΙΙ фазы (Финляндия, Латинская Америка и Сингапур) и двух исследований ΙΙΙ фазы (Латинская Америка и Европа). Здоровым детям в возрасте 6-14 недель на момент дозы 1 вводили две пероральные дозы в соответствии с 0-, 1- и 2месячным расписанием. Во всех исследованиях тяжелый КУСЕ определяли по баллу >11 по 20балльной шкале Везикари. Образцы диареи анализировали на присутствие ротавируса посредством ИФА и определяли тип ротавируса посредством метода, основанного на ПЦР с обратной транскрипцией. Эффективность по отношению к КУСЕ любой интенсивности оценивали только в трех исследованиях ΙΙ фазы и исследовании ΙΙΙ фазы в Европе, так как в исследовании ΙΙΙ фазы в Латинской Америке регистрировали только тяжелый КУСЕ.

УЕ и 95% О оценивали как 1-степень КУСЕ по отношению к плацебо, используя точный ко- 32 014328 эффициент Пуассона, стратифицированный по исследованию (Ргос 8!а!Хас!4 Вог 8А8 икегк, 1999, су!е1 коП\уаге согрогабоп, ехас! Сопббепсе ш!етуа1 Вог соттоп те1абуе пкк, стр. 298).

13.2. Результаты.

Среди 8221 детей, вакцинированных двумя дозами В1Х4414 или плацебо, было выявлено 4 эпизода 62Р[4] ВУ6Е любой интенсивности в группе К1Х4414 (N=5783) и 9 эпизодов в группе плацебо (N=2438), что означает УЕ 81,0% (95% С1: 31,6; 95,8) по отношению к ВУ6Е любой интенсивности, вызванному штаммом 62Р[4].

Среди 26088 здоровых детей, вакцинированных двумя дозами В1Х4414 или плацебо, было выявлено 6 эпизодов тяжелого ВУ6Е, вызванного типом 62Р[4], в группе В1Х4414 (N=14792) и 15 эпизодов в группе плацебо (N=11296), что означает УЕ 71,4% (95% С1: 20,1; 91,1) по отношению к тяжелому ВУ6Е, вызванному штаммом 62Р[4]. Результаты отображены в табл. 23.

Таблица 23. Число субъектов, сообщивших об эпизоде любого или тяжелого ВУ6Е, вызванного РУ типа 62Р[4], и эффективность вакцины в процентах во время первого периода эффективности (мета-анализ), когорта для оценки эффективности

Таблица 23

Группы		Любой НУСЕ* (исключая Латинскую Америку)	Тяжелый НУСЕ (балл >11 по шкале Везикари) (5 исследований)
N	п	%	Эффективность вакцины	N	η	%	Эффективность вакцины
Штамм κν				%УЕ					% УЕ	95% С!
62Р[4]
ΗΗν вакцина	5783	4	0,07	81,0	31,6- 95,8	14792	6	0, 04	71,4	20,1- 91,1
Плацебо	2438	9	0,37			11296	15	0, 13

N = число субъектов, включенных в каждую группу;

п/% = число/процент субъектов, сообщивших по меньшей мере об одном специфическом эпизоде ВУ6Е, вызванного 62Р[4], в каждой группе;

% УЕ = наблюдаемая эффективность вакцины;

95% С1 = 95% доверительные интервалы;

* для двух из 13 62 Р тип был не определен.

13.3. Заключение.

Данный мета-анализ эффективности вакцины по отношению к ротавирусу типа 62Р[4] демонстрирует эффективность вакцины 81,0% (95% С1: 31,6%; 95,8%) по отношению к ВУ6Е любой интенсивности, вызванному типом 62Р[4], и эффективность 71,4% (95% С1: 20,1%; 91,1%) по отношению к тяжелому ВУ6Е, вызванному типом 62Р[4].

Пример 14. Эффективность вакцины ослабленного ротавируса человека Во!апх™ в международном исследовании III фазы.

14.1. Методы.

20169 здоровых детей в возрасте приблизительно от 2 до 4 месяцев из 11 стран латинской Америки получали 2 пероральные дозы НВУ вакцины (10159) или плацебо (10010). Образцы кала тестировали на ротавирус (ВУ) посредством ИФА и определяли тип ротавируса посредством ПЦР с обратной транскрипцией, используя подходящие праймеры и типоспецифические зонды. Определением клинического случая для регистрации эпизода тяжелого гастроэнтерита был эпизод диареи (водянистый или более жидкий стул, чем обычно, три или более раз в течение 24 ч) с рвотой или без, который требовал госпитализации на ночь и/или терапии для восстановления водного баланса, эквивалентной плану В ВОЗ (пероральная терапия для восстановления водного баланса) или плану С ВОЗ (внутривенная терапия для восстановления водного баланса) в таком медицинском учреждении, как больница, клиника или контролируемый сельский центр здравоохранения (1Шр://\у\у\у.\у1ю.т1/с1и1б-або1е8сеп1-11еа1111/№\у РиЬ11са!1оп8/СН1ЬПНЕАЬТН/!ех1геу4.Ыт).

Интенсивность заболевания оценивали, используя 20-балльную шкалу Везикари; тяжелый ВУ6Е определяли баллом >11. Шкала Везикари была модифицирована: поскольку обезвоживание не регистрировали в электронных ИРК (индивидуальные регистрационные карты), применяли следующее правило: пациента, у которого был эпизод тяжелого ГЭ, расценивали, как обезвоженного в степени от 1 до 5%, если этот пациент получал пероральную терапию для восстановления водного баланса. Пациента расценивали как обезвоженного в степени >6%, если пациент был госпитализирован и/или получал внутривенную (в/в) терапию для восстановления водного баланса.

- 33 014328

14.2. Эффективность вакцины.

Эффективность вакцины по отношению к тяжелому ротавирусному гастроэнтериту (табл. 24).

Когорта для анализа эффективности состояла из 9009 субъектов, вакцинированных НКУ вакциной, и 8858 субъектов, получавших плацебо. В группе вакцины было 12 детей с тяжелым ротавирусным гастроэнтеритом в соответствии с клиническим определением, и в группе плацебо - 77 детей (2,0 ν8. 13,3 детей с >1 эпизодом на 1000 детей в год, соответственно; р<0,001, двусторонний точный критерий Фишера), что свидетельствует об эффективности вакцины 84,7% по отношению к тяжелому ротавирусному гастроэнтериту, начиная с 15 дней после дозы до возраста одного года (показано в табл. 24). Похожие результаты были получены для общей когорты вакцинированных (эффективность вакцины 81,1%; 95% С1 68,5-89,3; р<0,001, двусторонний точный критерий Фишера) от дозы 1 до возраста одного года. Госпитализация по меньшей мере на одну ночь была необходима для 9 детей в группе вакцины и для 59 в группе плацебо (1,5 ν8. 10,2 госпитализаций на 1000 человек в год, соответственно), что свидетельствует об эффективности вакцины по отношению к госпитализации по поводу тяжелого ротавирусного гастроэнтерита 85% (р<0,001, двусторонний точный критерий Фишера) (табл. 24).

Таблица 24. Эффективность вакцины по отношению к тяжелому ротавирусному гастроэнтериту, тяжелому гастроэнтериту, вызванному ротавирусами специфических С типов, и тяжелым гастроэнтеритам, вызванным любой причиной, во время периода, начиная с 2 недель после дозы до возраста одного года

Группа вакцины	Группа плацебо РР	Эффектна-
(Ν =9009)	(Ν = 8858)	ность
η коэффици-	η коэффици-	вакцины
ент на 1000	ент на 1000	(95%С1) и р-
детей в год	детей в год	величины

Тяжелый ротавирусный гастроэнтерит в соответствии с определением клинического случая *

Ротавирусный гастроэнтерит

Тяжелый	13,3	0,153	84,7(71,7; 92,4) <0,001
12	2,0	77
Госпитализация					85,0 (69,6;
9	1,5	59	10,2	0,150	93,5)

<0,001

Гастроэнтерит, вызванный любой причиной

Тяжелый	183	30,9	300	51,7	0,600	40,0 (27,7; 50,4) <0,001
Госпитализация						42,0 (28,6;
	145	24,5	246	42,4	0,580	53,1)
						<0,001
Типоспецифический гастроэнтерит
Θ1 Р[8)*						91,8(74,1;
	За	0,5	36°	6,2	0,082	98,4)
						<0,001
ОЗР[8], С4Р[8],						87,3(64,1;
С9Р[8]	4°	0,66	зГ	5,3	0,126	96,7)
						<0,001
С2Р[4]						41,0(-79,2;
	6	1,0	10е	1,7	0,590	82,4)

0,328

Тяжелый ротавирусный гастроэнтерит с баллом > 11 по шкале Везикари

Группа вакцины (Ν = 9009) η коэффициент на 1000

Группа плацебо (Ν = 8858) коэффициент на 1000 детей в год

Типоспецифический гастроэнтерит

О1Р[8]^# 3 0,5 32 детей в год

5,5

0,092

Эффективность вакцины (95%С|) и рвеличины

90,8 (70,5;

- 34 014328

98,2) <0,001

Θ3Ρ[8], С4Р[8],	86,9 (62,8;
С9Р[8] 4	0,66	30	5,2	0,130	96,6)
					<0,001
С2Р[4]					45,4 (-81,5;
5	0,8	9	1,5	0,546	85,6)

0,298

Условные обозначения для табл. 24.

В каждой выявленной категории типа ротавируса считали участников с эпизодами, вызванными более чем одним выделенным С типом η = число детей, для которых был зарегистрирован по меньшей мере один специфический эпизод;

КК = относительный риск (гс1а11ус пкк) = соотношение уровня встречаемости субъектов, для которых был зарегистрирован по меньшей мере один эпизод, в группе вакцины и уровня встречаемости субъектов, для которых был зарегистрирован по меньшей мере один эпизод, в группе плацебо.

С1 = доверительный интервал.

Коэффициент на 1000 детей в год представляет собой число детей, у которых наблюдается >= 1 специфический эпизод, на число детей в год.

* Определение случая в соответствии с протоколом исследования: эпизод диареи (водянистый или более жидкий стул, чем обычно, три или более раз в сутки) с рвотой или без, который требовал госпитализации на ночь и/или терапии для восстановления водного баланса, эквивалентной плану В ВОЗ (пероральная терапия для восстановления водного баланса) или плану С ВОЗ (внутривенная терапия для восстановления водного баланса) в таком медицинском учреждении, как больница, клиника или контролируемый сельский центр здравоохранения.

# Все выделенные С1 типы были ротавирусами дикого типа; С1Р[8] и С9Р[8] были выделены из одного ребенка;

а - только С1Р[8] тип был выделен из двух детей; С1Р[8] и С9Р[8] были выделены из одного ребенка;

Ь - только С1Р[8] тип был выделен из 34 детей; С1Р[8] и С9Р[8] были выделены из одного ребенка; типы С1, С2, С9 были выделены из одного ребенка;

с - только С3Р[8] тип был выделен из одного ребенка; только С4Р[8] тип был выделен из 1 ребенка и только С9Р[8] тип был выделен из одного ребенка; С1Р[8] и С9Р[8] были выделены из одного ребенка;

ά - только С3Р[8] тип был выделен из 8 детей; только С4Р[8] тип был выделен из 2 детей и только С9Р[8] тип был выделен из 19 детей; С1Р[8] и С9Р[8] были выделены из 1 ребенка, и С1Р[8], С2Р[4] и С9Р[8] из 1 ребенка;

е - только С2Р[4] тип был выделен из 9 детей; и С1Р[8], С2Р[4] и С9Р[8] - из 1 ребенка; р-величины = по двустороннему точному критерию Фишера (значимый уровень α=0,05).

Эффективность вакцины в соответствии со шкалой Везикари

Одиннадцать из 12 детей с эпизодами тяжелого ротавирусного гастроэнтерита в группе вакцины и 71 из 77 детей в группе плацебо имели балл по шкале Везикари >11, что свидетельствует об эффективности вакцины 84,7% (р<0,001, двусторонний точный критерий Фишера). Для более высокой интенсивности заболевания с баллами от 11 до 20 эффективность вакцины была значительно выше, достигая 100% по отношению к наиболее тяжелому ротавирусному гастроэнтериту. Всего были получены сообщения о 16 эпизодах тяжелого ротавирусного гастроэнтерита с баллом >11 по шкале Везикари, начиная с дозы 1 до дозы 2, шесть из них в группе вакцины и 10 в группе плацебо.

Эффективность вакцины в соответствии со шкалой Везикари по типу ротавируса

Типоспецифическая эффективность вакцины по отношению к штаммам дикого типа отражена в табл. 24. Эффективность вакцины по отношению к эпизодам тяжелого ротавирусного гастроэнтерита с баллом >11 по шкале Везикари, вызванного штаммами типа С1Р[8], гомологичными штамму вакцины, составила 91,8% (Р<0,001, двусторонний точный критерий Фишера). Эффективность вакцины по отношению штаммам, имеющим общий Р[8] антиген (С3Р[8], С4Р[8] и С9Р[8]) составила 86,9% (Р<0,001, двусторонний точный критерий Фишера). Ротавирус типа С2Р[4], который не имеет ни общего С, ни общего Р антигена со штаммом вакцины, был обнаружен в пяти эпизодах в группе вакцины и в девяти в группе плацебо, что свидетельствует об эффективности 45 процентов (Р=0,298, двусторонний точный критерий Фишера). По причине малого числа эпизодов С2, наблюдаемых в данном исследовании, был выполнен мета-анализ 5 исследований (пример 13), и тенденция, наблюдаемая для данного исследования, приобрела большое значение при объединении дан- 35 014328 ных 5 исследований (пример 13).

Эффективность вакцины на основании диареи

У детей с гастроэнтеритом, вызванным любой причиной, которым была необходима госпитализация и/или восстановление водного баланса в соответствии с планами В/С ВОЗ, наблюдали уровень встречаемости 30,9/1000 детей в год в группе вакцины по сравнению с 51,7 в группе плацебо, что говорит об общем уменьшении эпизодов тяжелой диареи, вызванной любой причиной, на 40% (Р<0,001, двусторонний точный критерий Фишера) у получавших вакцину. Аналогично частота госпитализации по поводу диареи любой этиологии была значимо снижена на 42% (Р<0,001, двусторонний точный критерий Фишера) (табл. 24, все случаи ГЭ).

14.3. Обобщение результатов.

Эффективность вакцины по отношению к тяжелому ротавирусному гастроэнтериту (КУСЕ) и по отношению к госпитализации, связанной с ротавирусной инфекцией, составила 85% (Р<0,001, двусторонний точный критерий Фишера), достигая 100% в популяции пациентов, имевших КУСЕ с баллом по шкале Везикари >=19. Эффективность по отношению к С1Р[8] и штаммам, имеющим только общий Р[8] эпитоп с НКУ, составила 92% (95% С.1. 74,98) и 87% (95% С.1. 64,97) соответственно (Р<0,001, двусторонний точный критерий Фишера).

Частота госпитализации по поводу диареи, вызванной любой причиной, была снижена на 42% (95% С.1. 29,53; Р<0,001; двусторонний точный критерий Фишера) (табл. 24, все случаи ГЭ).

Пример 15. Эффективность вакцины ослабленного ротавируса человека Ко!апх™ в шести странах Европы.

15.1. Методы.

3994 детей в шести странах Европы было распределено случайным образом для получения

10^6,5 ССШ₅₀ НКУ (ротавирус человека) вакцины Ко!апх™ (см. композицию) или плацебо с совместным введением обычных детских вакцин. Первый период наблюдения эффективности начался через две недели после дозы 2 и закончился в июне-июле 2005г. В состав когорты для анализа эффективности за 1^ыи год вошло всего 3874 субъекта.

Композиция вакцины: (табл. 25)

Вакцина	Препарат
<38К Вю1од|'са18’ НРХ/ вакцина	НК\/ штамм ΚΙΧ4414, полученный из НРХ/ вакцинного штамма 89-12 106,5 средняя инфекционная доза для клеточной культуры (ССЮ50) Модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (ОМЕМ) 3,7 мг Сахароза 9 мг Декстран 18 мг Сорбит 13,5 мг Аминокислоты 9 мг
С5К Вго1одюа18’ Разбавитель	Карбонат кальция 80 мг Ксантан 3,25 мг Вода для инъекций, достаточное количество до 1,3 мл

15.2. Эффективность вакцины.

НКУ вакцина высока эффективна в обеспечение иммунитета против КУСЕ в течение первого периода наблюдения. Эффективность вакцины составила 87,1% (95% С1: 79,6%; 92,1%) по отношению к эпизодам КУСЕ любой интенсивности и 95,8% (95% С1: 89,6%; 98,7%) по отношению к эпизодам тяжелого КУСЕ. При увеличении интенсивности заболевания (баллы по шкале Везикари между 11 и 20) эффективность вакцины повышалась, достигая 100% в популяции пациентов, имевших КУСЕ с баллом по шкале Везикари >=17. Эффективность вакцины по отношению к госпитализации по поводу КУСЕ составила 100% (95% С1: 81,8%; 100%), а по отношению к эпизодам КУСЕ, требующим медицинского внимания, эффективность вакцины составила 91,8% (95% С1: 84,0%; 96,3%) (табл. 26 и 27).

- 36 014328

Таблица 26. Процент субъектов, сообщивших о любом или о тяжелом КУСЕ, процент субъектов, госпитализированных по поводу эпизодов КУСЕ, и эффективность вакцины в течение первого периода эффективности - когорта для анализа эффективности

N = число субъектов в каждой группе;

Ν% = число/процент субъектов, сообщивших по меньшей мере об одном специфическом эпизоде КУСЕ, в каждой группе;

Р-величина = двусторонний точный критерий Фишера (значимый уровень α=0,05);

% УЕ = наблюдаемая эффективность вакцины;

95% С1 = 95% доверительные интервалы;

балл >11 по 20-балльной шкале Везикари определяли как тяжелый.

Таблица 27. Процент субъектов, сообщивших об эпизодах КУСЕ, требовавших медицинского внимания, и эффективность вакцины в течение первого периода эффективности - когорта для анализа эффективности

Группы	N	КУСЕ, требующий медицинского внимания
η	%	Эффективность вакцины	Р-величина
%УЕ	95% С1
106 5 ССЮбо	2572	10	0,4	91,8	84,0-96,3	<0,001
Плацебо	1302	62	4,8	-	-	-

N = число субъектов, включенных в каждую группу;

Ν% = число/процент субъектов, сообщивших по меньшей мере об одном эпизоде КУСЕ, требовавшем медицинского внимания, в каждой группе;

Р-величина = двусторонний точный критерий Фишера (значимый уровень α=0,05);

% УЕ = наблюдаемая эффективность вакцины, 95% С1 = 95% доверительные интервалы.

НКУ вакцина была эффективна в высокой степени по отношению к КУСЕ любой интенсивности и к тяжелому КУСЕ, вызванному штаммами С1Р[8], С3Р[8], С4Р[8] и С9Р[8] (табл. 28).

Степень защиты по отношению к типу ротавируса С2Р[4], который не имеет ни одного общего антигена капсида с вакциной НКУ, была ниже в данном исследовании, однако результаты метаанализа, учитывающего исследования эффективности II и III фазы, показали значительную защитную эффективность по отношению к любому и к тяжелому СЕ, вызванному С2Р[4] (см. пример 13).

- 37 014328

Таблица 28. Процент субъектов, сообщивших об эпизодах любого или тяжелого КУСЕ, и эффективность вакцины в зависимости от серотипа в течение первого периода эффективности - когорта для анализа эффективности

Г руплы У|га1 Сопс Штамм κν	N	Любой КУСЕ	Тяжелый КУСЕ (балл £11 по шкале Везикари)
п	%	Эффективность вакцины	рвеличина	п	%	Эффектность вакцины	Рвеличина
% УЕ	95% С1	% УЕ	95% С1
С1Р[8] Дикий тип
10е5	2572	4	0,2	95,6	87,9-	<0,001	2	0,1	96,4	85,7-	<0,001
ССЮво					98,8					99,6
Плацебо	1302	461	3,5				28|	2,2
О2Р[4]
108 8	2572	3	0,1	62,0	-124,4	0,234	1	0,0	74,7	-386,2	0,263
ссю50					-94,4					-99,6
Плацебо	1302	4	0,3				2	0,2
ОЗР[8]
1088	2572	1	0,0	89,9	9,5-	0,018	0	0,0	100	44,8-	0,004
ссю60					99,8					100
Плацебо	1302	5	0,4				5	0,4
О4Р[8]
1085	2572	3	0,1	88,3	57,5-	<0,001	0	0,0	100	64,9-	<0,001
ССЮ50					97,9					100
Плацебо	1302	13Т	1,0				7|	0,5
С9Р[8]
1088	2572	13	0,5	75,6	51,1-	<0,001	2	0,1	94,7	77,9-	<0,001
ССЮ5а					88,5					99,4
Плацебо	1302	27	2,1				19	1,5
Объединенные не-О1Р[8_	(02, ОЗ, 04, 09)
1085	2572	20	0,8	79,3	64,6-	<0,001	3	0,1	95,4	85,3-	<0,001
ССЮ50					88,4					99,1
Плацебо	1302	49	3,8				33	2,5

N = число субъектов, включенных в каждую группу;

Ν% = число/процент субъектов, сообщивших по меньшей мере об одном эпизоде КУСЕ в каждой группе;

Р-величина = двусторонний точный критерий Фишера (значимый уровень ос=0,05);

% УЕ = наблюдаемая эффективность вакцины;

95% С1 = 95% доверительные интервалы;

балл >11 по 20-балльной шкале Везикари определяли как тяжелый;

”1” Один субъект из группы плацебо учтен и в С1, и в С4 категории, так как были выделены оба серотипа.

15.3. Обобщение результатов.

Две пероральные дозы НКУ вакцины Ко1апх™, вводимой совместно с детскими вакцинами, были высоко эффективны по сравнению с плацебо по отношению к защите детей от КУСЕ любой интенсивности, вызванного диким типом КУ С1Р[8] и Не-С1Р[8] типами КУ, в течение первого периода наблюдения, эффективность вакцины составила 95,6% (95% С1: 87,9%; 98,8%) и 79,3% (95% С1: 64,6%; 88,4%) соответственно. Эффективность по отношению к тяжелому КУСЕ, вызванному дикими типом КУ С1Р[8] и Не-С1Р[8] типами КУ, составила 96,4% (95% С1: 85,7%; 99,6%) и 95,4% (95% С1: 85,3%; 99,1%) соответственно.

Данные результаты в высокой степени подтверждают вывод о том, что НКУ вакцина обеспечивает иммунитет широкого спектра по отношению к распространенным штаммам КУ (см. табл. 28: С1Р[8], С2Р[4], СЗР[8], С4Р[8], С9Р[8]). Был выполнен специфический мета-анализ эффективности

-38014328 вакцины по отношению к О2Р[4], пожалуйста, обратитесь к примеру 13.

Общие заключения

Было подтверждено, что ротавирусная вакцина ΚΙΧ4414 является в высокой степени защитной по отношению к эпизодам ротавирусного гастроэнтерита, оцененным с помощью клинического определения регистрации случая, обращая особое внимание на госпитализацию и восстановление водного баланса, а также с помощью утвержденной шкалы Везикари, которая включает количественно определяемые параметры осложнений, связанных с диареей, рвотой, лихорадкой, обезвоживанием и госпитализацией. Две пероральные дозы НКУ вакцины были высоко эффективны в защите детей от КУОЕ любой интенсивности или тяжелого КУОЕ и от госпитализации, вызванными множественными распространенными штаммами ротавируса.

Высокий уровень защиты был продемонстрирован по отношению к гомологичным О1Р[8] ротавирусам, у которых два внешних белка капсида (УР4 и УР7) и один внутренний белок капсида (УР6) схожи в антигенном отношении с вакциной НКУ. Вакцина также обеспечивала хорошую защиту по отношению к штаммам, имеющим только общий генотип Р[8] (УР4 антиген) и антиген УР6. Также в мета-анализе, включавшем результаты трех исследований II фазы из Финляндии, Сингапура и Латинской Америки (во всех исследованиях использовали идентичную методологию и критерии эффективности) и 2 исследований III фазы из Латинской Америки и Европы, которые представлены в примере 13, была продемонстрирована защита по отношению к штаммам ротавируса, не имеющим ни одного общего антигена внешней оболочки капсида с НКУ вакциной, эффективность вакцины по отношению к заболеванию любой интенсивности, вызванному О2Р[4] типом, составила 81% (95% СТ. 31,6-95,8), а эффективность вакцины по отношению к тяжелому ГЭ, вызванному типом О2Р[4], составила 71,4% (95 процентов СТ. 20,1-91,1), что свидетельствует о том, что вакцина также обеспечивает иммунитет против штамма, который не имеет идентичного О или Р белка со штаммом вакцины.

Claims (20)

1. Способ индукции иммунного ответа против штамма ротавируса типа О2Р[4], включающий введение субъекту композиции, содержащей ослабленный штамм ротавируса типа О1Р[8].

2. Применение ослабленного штамма ротавируса типа О1Р[8] в изготовлении лекарственного средства для индукции иммунного ответа против ротавирусной инфекции, вызванной штаммом ротавируса типа О2Р[4].

3. Способ по п.1, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген УР4, содержащий в нуклеотидной последовательности по меньшей мере одно из следующего: основание аденин (А) в позиции 788, основание аденин (А) в позиции 802 и основание тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона.

4. Способ по п.3, где ген УР4 содержит нуклеотидную последовательность, содержащую основание аденин (А) в позициях 788 и 802 и основание тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона.

5. Способ по любому из пп.1, 3 или 4, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген УР7, содержащий в нуклеотидной последовательности по меньшей мере одно из следующего: тимин (Т) в позиции 605, аденин (А) в позиции 897 и гуанин (О) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона.

6. Способ по п.5, где ген УР7 содержит нуклеотидную последовательность, содержащую тимин (Т) в позиции 605 и аденин (А) или гуанин (О) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона.

7. Способ по любому из пп.1 или 3-6, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген УР4, содержащий в нуклеотидной последовательности аденин (А) в позициях 788 и 802 и тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона; и где ген УР7 содержит в нуклеотидной последовательности тимин (Т) в позиции 605 и аденин (А) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона.

8. Способ по любому из пп.1 или 3-7, где композиция дополнительно индуцирует иммунный ответ против О1 и против по меньшей мере одного из серотипов, не являющихся О1, выбранных из группы, состоящей из серотипов О3, О4, О5, О6, О7, О8, О9, О10, О11, О12, О13 и О14.

9. Способ по п.8, где по меньшей мере один из серотипов, не являющихся О1, выбран из группы, состоящей из О3, О4 и О9.

10. Способ по любому из пп.1 или 3-9, где композицию используют для того, чтобы дополнительно индуцировать иммунный ответ против Р[8] и против по меньшей мере одного из типов, не являющихся Р[8], выбранных из группы, состоящей из типов Р[1], Р[2], Р[3], Р[5], Р[6], Р[7], Р[9], Р[11], Р[12], Р[14] и Р[19].

11. Способ по любому из пп.1 или 3-10, где композиция, содержащая ослабленный штамм ротавируса типа О1Р[8], обеспечивает иммунитет против тяжелого вызванного ротавирусом гастроэнтерита, вызванного инфекцией штаммом ротавируса типа О2Р[4].

- 39 014328

12. Способ по любому из пп.1 или 3-11, где композиция, содержащая ослабленный штамм ротавируса типа О1Р[8], является по меньшей мере на 40% защитной в популяции индивидуумов, прошедших вакцинацию, против диареи, вызванной штаммом ротавируса, относящимся к типу О2Р[4].

13. Способ по п.12, где композиция является по меньшей мере на 50% защитной.

14. Способ по любому из пп.1 или 3-13, где композиция является по меньшей мере на 60% защитной.

15. Способ по любому из пп.11-14, где композиция является защитной в степени от 40 до 80%.

16. Способ по п.15, где композиция является защитной в степени от 50 до 70%.

17. Способ по любому из пп.1 или 3-16, где композиция содержит штамм ротавируса О1Р[8] и является защитной в степени от 40 до 75% в популяции индивидуумов, прошедших вакцинацию, против тяжелого гастроэнтерита, вызванного инфекцией ротавирусом с серотипом О2Р4.

18. Способ по любому из пп.1 или 3-17, где штамм ротавируса в указанной композиции представляет собой штамм, депонированный в ЕСАСС под номером 99081301, либо получен из штамма, депонированного в ЕСАСС под номером 99081301, или происходит от него.

19. Способ по любому из пп.1 или 3-18, где композицию вводят в 2-дозовом режиме.

20. Способ по любому из пп.1 или 3-18, где ослабленный штамм ротавируса приготавливают в виде препарата с подходящим фармацевтическим носителем, или с буфером, нейтрализующим ки слоту, или и с тем, и с другим.

Последовательность УР4 Р43