KR20080016789A

KR20080016789A - 혈액 림프구에서 자궁내막증을 진단할 수 있는 분자마커의동정

Info

Publication number: KR20080016789A
Application number: KR1020077021464A
Authority: KR
Inventors: 이드할리즈 플로레스; 스피로 무세스; 이스터 로젠블럼
Original assignee: 더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 써비시즈; 폰스 스쿨 오브 메디슨
Priority date: 2005-02-18
Filing date: 2005-12-09
Publication date: 2008-02-22
Also published as: JP2008537474A; NO20074762L; BRPI0520012A2; CA2596932A1; US20090208939A1; CN101124340A; EP1848818A1; ZA200707752B; IL184920A0; MX2007009562A; AU2005327929A1; WO2006091254A1

Abstract

본 발명은, 환자의 말초혈액 백혈구 또는 말초혈액시료에서 말초혈액 백혈구의 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준 또는 그의 단백질 또는 펩티드의 수준을 결정하여, 1차 측정값을 제공하는 단계; 대조군 또는 표준시료에서 상기 백혈구의 상기 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준 또는 그의 단백질 또는 펩티드의 수준을 결정하여, 2차 측정값을 제공하는 단계; 및, 상기 1차 측정값과 2차 측정값 사이에 차이가 있는지의 여부를 비교하는 단계를 포함하는, 여성 환자에게서 자궁내막증(endometriosis)의 소인(predisposition)을 동정 또는 예측하는 방법을 포함한다.

자궁내막증(endometriosis), 이상발현되는 유전자

Description

혈액 림프구에서 자궁내막증을 진단할 수 있는 분자마커의 동정{Identification of Molecular Diagnostic Markers for Endometriosis in Blood Lymphocytes}

관련 출원

본 출원은 본 출원에 전문이 참고문헌으로 포함된 2005년 2월 18일자 미합중국 가출원 제 60/654,331호를 우선권으로 주장하는 출원이다.

기술분야

자궁내막증(endometriosis)의 비침습성(non-invasive) 진단을 위한 DNA 마이크로어레이 동정 유전자 표적을 이용한 자궁내막증 환자의 말초 혈액 백혈구(peripheral blood leukocyte)의 유전자 발현양상의 분석

자궁내막증은 가임여성의 10% 정도에서 발견될 정도로 상당히 흔한 부인과 질 환이다(참조: Mahmood, T.A. and Templeton, A. 1991 Hum Reprod 6:544-549). 자궁내막증의 원인은 아직 알려지지 않았고, 어떻게 질병이 발병, 진행되어 골반 외까지 전이되는지, 즉 질병의 메카니즘 또한 명확히 밝혀지지 않은 상태이다(참조: Witz, C.A., et al. 2003 Hum Fertil 6:34-40). 자궁내막증의 진단은 일반적으로 복강경검사법(laparoscopy)으로 골반의 육안검사에 의해 수행된다(참조: Attaran, M. et al. 2002 Clev Clin J Med 69:547-653). 이러한 진단은 외과의사의 전문성에 전적으로 의존하기 때문에, 근본적으로 부정확하다. 또한, 복강경검사의 침습성과 관련된 이완상태는 치료에 대한 재발과 반응을 탐지하는 것을 어렵게 한다. 비(非)외과적인 자궁내막증 진단기법의 개발, 질병의 예후와 치료 상황을 모니터링하기 위한 비침습성 도구의 개발이 시급함에도 불구하고, 여전히 혈액에 있는 표지를 동정하여 질병을 판단할 수 있도록 하는 기법은 존재하지 않았다(참조: Falcone, T. and Mascha, E. 2003 Fertil Steril 80:886-888). 게다가, 자궁내막증과 동시에 다른 만성질환, 심각한 통증, 불임, 정신적 질환을 겪는 여성들의 경우, 선택할 수 있는 치료법이 거의 없어 질병의 근본적 치료가 불가능하게 된다. 자궁내막증에 특유한 테스트 기법을 통해 자궁내막증을 일으킬 가능성이 있는 후보 유전자를 찾아내는 것은 고무적인 일로 증명되었다. 따라서, 본 발명자들은 자궁내막증의 바이오마커 동정을 촉진하기 위해, DNA 마이크로어레이 기술을 이용하려고 한다.

암, 당뇨, 심장혈관성 질환과 같은 복잡한 유전적 질병에 관여하는 유전자의 발현양상을 확인하기 위한, DNA 마이크로어레이의 사용이 증가되는 추세에 있다(참 조: Hughes, T.R. and Shoemaker, D.D. 2001 Curr Opin Chem Biol 5:21-25). 이 강력한 기술은 유전자 발현에 있어 질병에 따른 특유 패턴을 보여주고, 이로써 후보 유전자의 동정을 앞당기고 있다(참조: Albertson, D.G. and Pinkel, D. 2003 Hum Mol Genet 12:R145-52). 현재까지 DNA 마이크로어레이 기법을 자궁내막증 관련 유전자를 탐지하기 위해 적용한 예는 다섯 건에 불과하다. 위 다섯 건의 연구는 모두 복강경 검사를 통해 얻어진 자궁내막증 조직의 유전자 발현 프로필을 정상적인 자궁내막 유전자와 비교한 것으로서, 질병의 다른 측면들에 초점을 맞춘 것이다(즉, 불임, 깊은 자궁내막증, 난소의 자궁내막증). 이스터(Eyster) 등에 의한 연구에 따르면, 자궁내막증의 경우 정상 내막과 비교할 때, 분석된 4,133개 유전자 중 8개가 과발현된 것으로 알려졌다(참조: Eyster, K.M. et al. 2002 Fertil Steril 77:38-42). 과발현된 유전자에는 세포골격 요소(vimentin, β-actin, α-2-actin), 하우스키핑 유전자(40S 리보솜 단백질 S23), 또는 면역 관련 유전자(Igγ L사슬, Ig 배선(germline) H 사슬, 보체, MHC class Ι)가 있었다. 위 논문의 저자들은, 비메틴(vimentin))과 같은 세포골격 단백질의 발현수준의 증가는 자궁내막증성 세포가 침입할 수 있는 가능성을 의미하며, 자궁내막 조직에 면역세포가 침투함으로써 면역글로불린항체 유전자가 과발현되는 것이라고 설명하였다. 아리모토(Arimoto) 등도 역시 난소 자궁내막증의 유전자 발현 프로필을 확인하기 위해 DNA 마이크로어레이 기법을 사용하였다(참조: Arimoto, T. et al. 2003 Int J Oncol 22:551-560). 자궁내막의 낭종에서 발현이 증가된 것으로 나타난 유전자들 가운데는 HLA 항원, 보체 인자, 리보솜 단백질, 전환 성장인자 B1(transforming growth factor BI, TGFBΙ)이 있었다. 발현이 억제되는 유전자들 중에는 TP53, 성장억제 단백질, DNA 손상유도 단백질(GADD34, GADD45A, GADD45B), p53 유도 단백질(PIG11), 난관의 당단백질(OVGP1)이 있었다. 르보빅(Lebovic) 등은 자궁내막증 환자의 IL-1β에 의해 유도된 597개 유전자의 발현수준을 정상 자궁내막 생검(biopsy)과 비교하였다(참조: Lebovic, D.I. et al. 2002 Fertil Steril 78:849-854). 그들은 세포주기 조절 유전자인 Tob-1이 자궁 외 기질세포에 있는 IL-1β에 의해 발현이 억제된다는 것을 관찰하고, 이 유전자의 억제는 자궁내막증성 세포의 성장을 촉진시킬 수 있다는 이론을 제안하였다. 카오(Kao) 등은 자궁내막증과 연관된 불임을 분자생물학적 관점에서 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이 기법을 사용하였다(참조: Kao, L.C. et al. 2003 Endocrinology 144:2870-2881). 정상 자궁내막에서는 발현이 증가되나, 자궁내막증의 경우 발현이 감소되는 것으로 밝혀진 유전자들에는, IL-15(NK 세포의 증식과 기능에 대한 강력한 프로모터), C4BP(LRP5와의 상호작용에 의해 Wint 신호전달을 방해할 가능성이 있다), 글리코델린(glycodelin, 프로게스테론에 의해 조절되고 수정에 관여하는 것으로 알려졌다)가 있다. 마지막으로, 최근 중증 자궁내막증의 경우 혈소판 유도 성장 인자 수용체 알파(PDGFRA), 단백질 키나제 C 베타 1(PKCβ1), 야누스 키나제 1(JAK1)의 발현이 증가된다는 사실이 알려졌고, 이는 자궁내막증의 병태생리에 RAS/RAF IMAPK 경로가 수반된다 점에 대한 증거로 제시될 수 있다(참조: Matsuzaki, S. et al. 2004 Mol Hum Reprod 10:719-728).

본 발명의 목적은 자궁내막증 환자와 정상인 사이의 혈액 림프구 유전자 발 현양상의 차이점을 확인하는 것이다. 혈액 조직이 자궁내막증에 있어 일차적인 표적이 아니더라도, 이 병은 염증유발 성분과 관련이 있어서 말초혈액 림프구에서 탐지되고, 심지어 그곳에서 진단도 가능할 수 있다는 증거가 있다(참조: Bedaiwy, M.A. et al. 2002 Hum Reprod 17:426-431 ). 비록, 혈액 림프구가 이 병의 경로와 직접적인 관련이 없을지라도, 이들 세포의 유전자 발현양상은 질병의 상태를 진단할 수 있는 지표로서 기능한다는 것이 밝혀져 있다(참조: Tang, Y. et al. 2001 Ann Neurol 50:699-707). 본 발명자들은, 이러한 점들을 바탕으로 말초혈액 림프구에서 다르게 발현되는 유전자를 탐지하는 것은 병인(病因, disease pathogenesis)의 이해, 특히 질병의 진단을 위한 질병 특이적이며 비침습성인 분자수준의 검사를 설계하는 것에 유용하게 사용될 것이라는 가설을 세웠다. 본 발명자들은 혈액시료를 사용하여 자궁내막증을 진단하기 위해서, 그 기초가 될 표적 유전자의 동정을 보고한다.

발명의 요약

본 발명은 (a) 환자의 말초혈액 백혈구 또는 말초혈액시료에서 말초혈액 백혈구의 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 1차 측정값을 제공하는 단계; (b) 대조군 또는 표준시료에서 상기 백혈구의 상기 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 2차 측정값을 제공하는 단계; 및, (c) 상기 1차 측정값과 2차 측정값 사이에 차이가 있는지의 여부를 비교하는 단계를 포함하는, 여성 환자에게서 자궁내막증(endometriosis)의 소인(predisposition)을 동정 또는 예측하는 방법을 포함한다.

본 발명은 LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 및 PDGF로 구성된 그룹의 한 유전자의 유전자 발현수준을 결정하는 방법을 포함한다.

본 발명은 비교한 단백질 또는 펩티드의 수준이 LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 및 PDGF로 구성된 그룹의 한가지에 대해 증가 또는 감소하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 (a) 치료하기 이전에, 상기 환자의 말초혈액 백혈구 또는 말초혈액시료에서 말초혈액 백혈구의 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 1차 측정값을 제공하는 단계; (b) 치료후에, 상기 백혈구의 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 2차 측정값을 제공하는 단계; 및, (c) 치료하기 이전 및 치료후에, 상기 환자의 유전자 발현수준의 차이를 비교하는 단계를 포함하는, 치료의 전후에 자궁내막증을 갖는것으로 동정된 환자를 모니터링하는 방법을 포함하다.

아울러, 본 발명은 (a) 생체외 조건(ex vivo)에서 적어도 하나의 이상발현되는 유전자를 발현시키는 것이 가능한 세포에 후보 약물을 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포에서 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 1차 측정값을 제공하는 단계; (c) 후보 약물이 존재하지 않는 세포에서 적어도 하나의 이상발현되는 동일한 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 2차 측정값을 제공하는 단계; 및, (d) 상기 유전자 발현수준의 차이는 자궁내막증의 치료에 사용될 가능성이 있는 약물임을 의미하도록, 상기 1차 측정값과 2차 측정값을 비교하는 단계를 포함하는, 자궁내막증의 치료에 유용한 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 포함한다.

본 발명은 적어도 하나의 이상발현되는 유전자 또는 유전자 발현물의 유전자 발현, 합성 또는 활성화 수준의 감소 또는 증진을 유도할 수 있는 약물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 자궁내막증을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.

본 발명은 적어도 하나의 이상발현되는 유전자 또는 유전자 발현물의 유전자 발현, 합성 또는 활성화 수준의 감소 또는 증진을 유도할 수 있는 약물의 유효량을 포함하는 자궁내막증의 치료 또는 예방용 의약의 제조방법을 포함한다.

본 발명은 (a) 환자의 말초혈액 백혈구 또는 말초혈액시료에서 말초혈액 백혈구의 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 1차 측정값을 제공하는 단계; (b) 대조군 또는 표준시료에서 상기 백혈구의 상기 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 2차 측정값을 제공하는 단계; 및, (c) 상기 1차 측정값과 2차 측정값 사이에 차이가 있는지의 여부를 비교하는 단계를 수행하기 위한 수단을 포함하는 여성 환자에게서 자궁내막증 소인의 동정 또는 예측용 키트를 포함한다.

도 1 유전자 선택 프로그램(arrayanalysis.nih.gov, 실시예 1 참조)에 근거 한 9개의 가장 차별화된 유전자의 발현을 나타낸다.

각 열은 유전자를 각 행은 시료를 나타낸다. 각 유전자에서 빨간색(진한 회색)은 평균과 비교할 때 높은 수준의 발현수준을, 녹색(옅은 회색)은 평균과 비교하여 낮은 수준의 발현수준을 나타낸다. 아래 표시된 눈금은 평균으로 부터의 표준편차값을 나타낸다. (이탤릭체의 클론 ID는 IMAGE 클론이 아니다. UniGene/Gene 기호는 UniGene build #173에 근거하였다.)

도 2는 자궁내막증 환자 대 정상 대조군에서의 상대적 유전자 발현을 나타낸다.

y축은 하우스키핑 유전자 GAPDH의 발현을 정규화(normalization)시킨 후에 9개의 가장 차별화된 유전자의 평균적인 상대 발현정도(2^-△△ ^Ct)를 보여준다. P 값은 양측 t-테스트(two-tailed unpaired t-test)에 의해 계산되었다. ^**p<0.001, ^*p<0.01

도 3은 자궁내막증 환자 대 정상 대조군에서의 유전자의 mRNA의 발현(Set 1)을 나타낸다.

도 4는 자궁내막증 환자 대 정상 대조군에서의 유전자의 mRNA의 발현(Set 2)을 나타낸다.

도 5는 자궁내막증 환자 대 정상 대조군에서의 상대적인 유전자 발현(Set 2)을 나타낸다.

도 6은 Set 1에 대한 Set 2의 상대적 발현 비교를 나타낸다.

도 7은 상대적 발현(All)을 나타낸다.

본 발명의 목적은 DNA 마이크로어레이 기법을 이용하여 말초 혈액 림프구에서의 자궁내막증 탐지를 위한 분자 바이오마커(biomarker)를 동정하는 것이다. 멀티센터 학술조사 프로그램의 일부로서 케이스 컨트롤(case-control) 연구가 이루어졌다. 산부인과 전문의에 의해 수술 중 자궁내막증으로 판명된 폐경기 이전의 여자들과 자궁내막증이 없는 여자들이 조사되었다. 마이크로어레이 분석은 6명의 자궁내막증 환자들과 5명의 대조군을 포함하였다. 15명의 자궁내막증 환자와 15명의 대조군이 실시간 RT-PCR로 분석되었다. 자궁내막증 환자들과 대조군에서의 혈액 림프구에서의 mRNA의 발현수준을 기준이 되는 전체 RNA의 수준과 비교하였다. 유전자 발현 데이타는 RT-PCR 분석에 의해 명확해졌다. 자궁내막증 환자의 시료에서 이상발현(differentially expressed)된 유전자를 유전자 선택 프로그램(gene selection program)으로 동정하였다. 유전자 발현 데이타를 확인하기 위하여, RT-PCR에 의해 9개의 가장 차별화되는 유전자들이 분석되었다. 동정된 9개의 유전자 중 2개는, Genbank Accession Number AY692262의 핵산과 아미노산 서열을 가지는 인터루킨 2 수용체 감마(심각한 결합성 면역결핍증)(IL2RG)와 Genbank Accession Number BC015090의 핵산과 아미노산 서열을 가지는 라이실 옥시다제-양 1(Lysyl oxidase-like 1, LOXL1)으로, 상당수준 이상발현되었다. 이것은 자궁내막증 환자의 말초 혈액 림프구에서 이상발현되는 유전자의 첫번째 보고로서, 이 질병의 발병원인과 관련된 중요한 단서를 제공할지도 모른다. 더욱이, 이들은 자궁내막증을 위한 비침습성 진단용 분석을 위한 표적으로 여겨지고, 널리 확인되고 있다.

다르게 정의하지 않는다면, 본 명세서에서 사용된 기술적, 학술용어들은 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 인식되는 것과 동일한 의미를 가진다. 예를 들면, Singleton P and Sainsbury D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J. Wiley & Sons, Chichester, New York, 2001; and The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag(1991)을 보라.

본 명세서의 문맥상 "이상발현(differential expression)"은 전사된 발현 물질과 유전자 발현물질(즉, 단백질 또는 펩티드, mRNA, cRNA)을 의미하는 것으로, 대조군과 비교해 볼 때 자궁내막증 환자군의 말초 혈액의 백혈구에서 차별되는 양으로 발현된다(즉, 음성진단 또는 탐지불능한 자궁내막증을 가진 사람, 정상 또는 건강한 개체).

"전사체(transcript)"는 주형(template)으로서 다른 핵산 가닥을 이용하여 합성되는 하나의 핵산 가닥을 의미한다.

본 명세서에서 "단백질 또는 폴리펩티드 또는 펩티드(protein or polypeptide or peptide)"라 함은 면역학적으로 탐지되는 절편을 포함한다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면, 세포로부터 유리된 단백질이 이러한 절편으로 분해되거나 절단될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 어떤 단백질 또는 폴리펩티드는 불완전한 형태로 합성되고, 단백질 분해과정에 의해 결과적으로 활성화될 수도 있다. 특정 단백질의 절편이 단백질 자체 대신(surrogate) 탐지될 수도 있다.

단백질은 분비되거나 분비되지 않을 수 있으며, 분비되지 않는 단백질은 세포내부 또는 세포벽에 존재할 것이다.

본 명세서에서 사용된 "시료(sample)"이라는 용어는, 확인, 진단, 예측 또는 탐지의 목적으로 환자로 부터 수득된 시료를 의미한다. 본 발명의 일 측면에 따르면, 시료는 자궁내막증의 진행상태의 결과 또는 치료요법의 효과를 판단하기 위한 목적으로 얻어진다. 바람직한 테스트 시료는 혈액, 혈청, 혈장을 포함한다. 더욱이, 당업자라면 몇몇 테스트 시료들이 전혈액을 혈청이나 혈장성분으로 분리하는 등의 분획 또는 정제과정을 통해서 훨씬 신속하게 분석된다는 인식할 수 있을 것이다,

본 명세서에 사용된 "혈액(blood)"라는 용어는, 분획을 하지 않은 전혈액, 말초혈액의 백혈구, 말초혈액의 단핵세포(PBMCs) 또는 혈액의 소분획 부분을 의미한다.

"말초혈액(peripheral blood)"이라는 용어는 순환계내의 혈액을 의미한다.

"유전자 발현수준(level of gene expression)" 또는 "펩티드수준(peptide level)"에서의 편차는 상대적 편차이다. 예를 들어, 대조군 또는 참조기준군(reference standard)과 비교하여, 자궁내막증 환자에서 추출한 시료의 유전자 발현수준의 차이가 그것이다. 자궁내막증 위험이 있는 환자에서의 유전자 발현 수준과 자궁내막증을 앓지 않는 정상개체(즉, "정상 대조군(normal)" 또는 "대조군(control)")과의 유전자 발현수준을 비교할 수 있다. 선택적으로, 자궁내막증을 앓지 않는 정상 개체군에서의 평균수준과 같은 상태의 "기준군(normal standard)(즉, 자궁내막증의 부재)"과의 비교도 가능하다. 본 발명에 의하면, 자궁내막증 환자의 유전자 발현수준과 자궁내막증 동정 또는 소인(predisposition) 사이의 비교가 가능하다.

테스트 시료에서의 유전자 발현수준이나 단백질/펩티드의 수준은 절대값(즉, ㎍/ml) 또는 상대값(즉, 신호의 상대적 강도)일 수 있다.

만약 유전자 발현량이나 단백질/펩티드 수준이 통계학적으로 다른 시료의 유전자 발현량이나 단백질/펩티드 수치와 현저하게 다르다면, 두 시료 사이에 차이가 있는 것이다. 예를 들어, 유전자 발현량이나 단백질/펩티드 수준이 다른 시료와 비교하여, 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400%, 600%, 800%, 1000% 정도 크다면, 유전자 발현과 단백질/펩티드 수준의 차이가 있는 것이다.

자궁내막증에 걸리기 쉬운 성질을 확인하고 예측하는 것이 진단기술로서 고려될 수 있다. 진단방법은 민감도와 특이성에 따라 다르다. 당업자는 예를 들어 하나 그 이상의 진단지표에 근거하여 진단한다. 본 발명에서는 이상발현 유전자의 발현수준과 폴리펩티드 수준이 이에 해당한다. 이상발현 유전자 또는 폴리펩티드가 있는가, 없는가, 또는 그 양이 자궁내막증의 판단지표가 된다.

질환의 진전과 치료를 모니터링하는데 사용되는 유전자 발현과 폴리펩티드 양의 일시적 변화의 판단뿐만 아니라, 하나 또는 그 이상의 유전자 발현과 폴리펩티드 수준의 다중적 판단(multiple determination)이 가능하다. 예를 들면, 처음시점에 유전자 발현/폴리펩티드 양을 판단하고, 두번째 시점에 다시 판단한다. 처음과 두번째 시점에서의 수준변화로 자궁내막증을 진단할 수 있다. 마찬가지로, 수치상의 감소가 자궁내막증의 특별한 치료법에 대한 반응을 나타내는 지표가 될 수 있다. 더욱이, 수치의 변화가 자궁내막증의 악화와 향후의 악영향과 관련이 있을 수 있다.

구체적으로, 적어도 1개이상의 유전자의 발현수준과 폴리펩티드 수준이 결정된다. 또한, LOXL1, IL2RG, LRP5, MBP, TNF, MAN2A2, P4HA1, PDGFD의 유전자 발현수준과 폴리펩티드 수치가 결정된다. 또한, LOXL1(Genbank Number BC015090), IL2RG(Genbank Number AY692262), LRP5(Genbank Number AF064548), MBP(Genbank Number L18866), TNF(Genbank Number BC028148), MAN2A2(Genbank Number NM_006122), P4HA1(Genbank Number AK222960), PDGFD(Genbank Number AF336376)의 복합체의 유전자 발현수준이 결정된다.

당업계의 숙련된 자라면, 같은 유전자를 여러 시간에 비교측정하거나, 하나의 유전자를 한 시점에 측정하고 다른 유전자를 다른 시점에 측정하여 비교하는 것이 진단정보와 병의 진척도를 제공할 수 있다는 것을 인식할 것이다.

본 발명에서는 하나 그 이상의 유전자의 발현에 관해 다른 시점에서 측정하여 비교하였다.

본 명세서에서 사용된 "자궁내막증 존재 가능성(probability of the presence of endomertriosis)"이라는 용어는 숙련된 자가 환자의 상태를 예측할 수 있는 것을 의미한다. 그것은 100%의 정확성으로 자궁내막증을 예측할 수 있는 능력을 의미하는 것은 아니다. 대신, 자궁내막증이 있거나 발전될 수 있는 가능성의 증가를 의미한다는 것을 숙련된 자는 이해할 것이다. 예를 들면, 자궁내막증이 없는 대조군과 비교하여 볼 때, IL2RG의 유전자 발현수준과 폴리펩티드 수치가 높거나 LOXL1의 유전자 발현수준과 폴리펩티드 수치가 낮으면, 환자에서 자궁내막증이 더 쉽게 발생한다. 본 명세서에서 약 50%, 60%, 75%, 90%, 95%의 확률로 자궁내막증의 존재가능성이 있다고 표현하고 있는데, 이때 "약(about)"은 1%를 나타낸다.

숙련된 자라면 특정 유전자가 자궁내막증에 잘 걸리게 하는 것과 연관이 있다는 것이 통계학적인 분석이라는 것을 인식할 것이다. 더욱이, 기준수치에서의 유전자 발현과 펩티드 수치의 변화가 환자예측과 상호관련이 있을 수 있으며, 유전자 발현에서의 변화정도가 악영향과 관련이 있을 수 있다. 둘 또는 그 이상의 군(群)을 비교하여 통계학적 의의 내지 p 값을 결정한다. 결정된 p 값은 0.1, 0.05, 0.025, 0.2, 0.1, 0.005, 0.001과 0.0001이다.

한편, 본 발명은 자궁내막증을 확인하는 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 유전자 발현과 폴리펩티드 수치를 측정하는 장치와 시약 그리고 분석을 행하고 결과를 예측하는 지침서로 구성되어 있다. 이러한 키트들은 한번 이상의 실험을 행할 수 있도록 충분한 시약을 포함하고 있다.

본 발명에서 분석의 "민감도(sensitivity)"라 함은 양성반응(진짜 양성, true positive)을 나타내는 자궁내막증 환자의 백분율이다. 분석에 의해 탐지되지 않는 질병을 가진 환자는 "가짜 음성(false negative)"이다. 질병이 없고 분석에서도 음성으로 나온 환자는 "진짜 음성(true negative)이라 불린다. 진단분석의 "특이도(specificity)"는 1 빼기 가짜 음성의 비율을 의미하고, "가짜 음성비율(false positive rate)"은 양성반응이 나왔으나 질병이 없는 비율을 의미한다. 한편, 특정한 진단방법이 정확한 진단을 제공하지 못한다 할지라도, 그 방법이 진단에 도움을 주는 양성 반응을 보여준다면 그것으로 충분하다.

유전자 발현의 측정

숙련된 당업자에게 유전자 발현의 측정과 분석, 폴리펩티드의 측정을 위한 수많은 방법과 장치들이 잘 알려져 있다. "유전자 발현(gene expression)"이라 함은 mRNA, cDNA, 폴리펩티드 펩티드, 단백질 등에 제한되지 않은 특정 유전자의 존재 또는 그 양을 의미한다. 본 발명에서는 LOXL1, IL2RG, LRP5, MBP, TNF, MAN2A2, P4HA1, PDGF의 유전자 발현과 폴리펩티드의 수치가 결정된다.

본 발명의 일 실시태양에 따르면, 유전자 발현은 RNA 수준을 측정함으로써 결정된다. 유전자 발현은 PCR에 근거한 분석을 이용하여 탐지된다. 예를 들면, RT-PCR이 RNA의 발현을 탐지하는데 사용된다. RT-PCR에서 역전사효소를 이용하여 RNA는 cDNA로 전환되며, 이 cDNA는 PCR반응을 위한 주형으로 사용된다. PCR 산물은 전기영동 및 DNA-특이적 염색이나 표지된 프로브에 혼성화하여 탐지될 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 경쟁적 주형(competitive template)의 표준화 혼합물과의 정량적 RT-PCR이 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 유전자 발현은 혼성화 측정법(hybridization assay)을 이용하여 탐지될 수 있다. 혼성화 측정법에서 바이오마커의 유무는 핵산이 자기와 상응하는 핵산분자와 결합하는 능력에 근거하여 결정된다. 여러 가지 혼성화 측정법이 이용가능하다. 본 발명의 몇몇 실시태양에 따르면, 관심있는 서열에 프로브가 혼성화되는 것은, 예를 들면, 노던(Northern) 또는 서던(Southern) 분석과 같이 프로브를 가시화함으로써 탐지된다. 이 분석으로 DNA(서던)와 RNA(노던)가 분리되고, DNA 또는 RNA는 드물게 지놈에서, 그리고 분석되는 마커에 가깝지 않도록 일련의 제한효소에 의하여 절단된다. DNA나 RNA는, 예를 들면 아가로스 겔(agrose gel) 등으로 분리되어 막으로 옮겨진다. 표지된 프로브 또는 프로브는, 예를 들면, 방사성 핵산 등을 혼입시킴으로써 약하게 혹은 중간, 강한 상태로 막과 접촉하게 된다. 결합되지 않은 프로브는 제거되고 표지된 프로브를 가시화함으로써 결합 여부를 확인할 수 있다. 본 발명에서는 유전자 발현은 LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1, PDGF로 확인되었다.

핵산배열

핵산배열(nucleic acid array)은, 혈액내에 존재하는 핵산 전사체들을 포함하는, 핵산 전사체들로 부터 생성되는 핵산서열, 혹은 그에 상보적인 핵산서열, 또는 그의 일부서열의 조합을 포함한다. 본 발명에 따르면, 마이크로어레이는 바람직하게는 10, 100, 500, 1000, 5000, 10,000과 15,000 핵산의 사이에서, 보다 바람직하게는 최소 5000개의 핵산을 포함한다. 핵산은 본 명세서에 개시된 공지되거나 혹은 새로운 핵산 염기서열, 또는 이들의 조합이다. 본 발명에 따르면, 마이크로어레이는 병을 갖고 있는 환자와 비교하여, 건강한 환자에서부터 얻은 혈액시료에 존재하는 전사 RNA 발현의 차별적인 수준의 분석에 사용되었다.

마이크로어레이는 개체에게서 발현되는 전사체를 포함하는 배열을 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에 의하면, 마이크로어레이는 인간에게서 발현되는 전사체를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 의하면, 본 발명의 마이크로어레이는 cDNA 기반 배열이거나 올리고뉴클레오티드 기반 배열이다.

정량적 실시간 RT - PCR

본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 하나 이상의 전사체의 수준은, 중합효소연쇄반응(PCR)과 조합한 정량적 역전사법(RT)을 이용한 QRT-PCR법을 포함하는 정량적 방법으로 혈액으로부터 수득한 RNA를 가지고 결정할 수 있다.

혈액에서 수득한 전체 RNA 또는 mRNA는 주형이나 특정 프라이머로서 역전사를 개시하는데 사용된다. 프라이머는 상업적으로 입수가능한 소프트웨어(Primer Designer 1.0, Scientific Software 등)를 이용하여 설계할 수 있다. 이어, 역전사 산물은 PCR의 주형으로서 사용될 수 있다.

PCR은 부분 핵산 염기서열을 DNA 중합효소를 이용하여 특정 염기서열을 DNA 복제를 통해 신속하게 증폭하는데 사용한다. PCR은 증폭할 핵산과 두 개의 단일가닥 올리고뉴클레오티드 프라이머, DNA 중합효소, 디옥시뉴클레오시드 삼인산염, 완충용액과 염이 필요하다.

PCR법은 물리스(Mullis)와 팔코나(Faloona)의 논문(참조: Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155:335)에 잘 기술되어 있다.

PCR은 DNA나 cDNA를 주형으로 하여 실행하며, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 적어도 25 pmol은 되어야 한다. 통상적인 반응 혼합물은 DNA 10ng, 올리고뉴클레오티드 프라이머 25pmol, 10X PCR 완충용액(Perkin Elmer, Foster City, CA) 2.5㎕, 1.25μM dNTP 0.4㎕, Taq DNA 중합효소(Perkin Elmer, Foster City, CA) 0.15㎕(또는 2.5 units) 그리고 증류수를 포함하여 총 25㎕가 되도록 한다. 미네랄 오일은 선택적으로 첨가하고, PCR은 프로그램 가능한 열 순환기를 사용하여 수행한다.

PCR 순환의 각 단계의 길이와 온도 및 단계의 횟수는 필요에 따라 조절하였다. 어닐링(annealing) 온도와 시간은 프라이머가 주형에 결합하는 능력과, 내성으로 인해 결합되지 않을 정도를 둘 다 고려하였다. 프라이머가 결합되는 상태의 엄격성(stringency)을 최적화하는 능력은 당업계에서 일반적으로 숙련된 자에게 잘 알려져 있다. 30～72℃ 사이에서 결합 온도(annealing temperature)를 사용한다. 92～99℃ 4분에서 주형 분자의 최초 변성이 일어나며, 다음에 변성(94～99℃ 15초～1분) 20～40회 반복, 어닐링(1～2분. 온도는 상술한 바와 같다) 그리고 연장(72℃ 1분) 반응을 일으킨다. 일반적으로, 마지막 연장단계는 72℃에서 4분간 수행하며, 4℃에서 명확하지 않은 다음의 단계(0～24시간)를 거쳤다.

근본적으로, 정량적 QRT-PCR은 혈액에서 하나 이상의 RNA 전사체 수준의 정량적 측정이 가능하도록, 역전사나 PCR의 두 단계, 또는 PCR과 조합한 역전사법을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 기술중 하나를, Taqman^®(Perkin Elmer, Foster City, CA)과 같은 적절한 키트로 전사 특이적 안티센스 프로브를 가지고 실행하였다. 이 프로브는 PCR 산물(예를 들면, 유전자로 부터 유리된 핵산절편)에 특이적이며, 올리고뉴클레오티드의 5‘ 말단에 결합된 소광제(quencher)와 형광 리포터 프로브를 가지고 제조되었다. 서로 다른 형광 마커가 서로 다른 리포터에 결합되면, 한번의 반응에서 두 개의 산물의 측정할 수 있다. Taq DNA 중합효소가 활성화되면, 5‘ 에서 3’의 엑소뉴클레아제 활성의 효능에 의해 주형에 결합한 프로브의 형광 리포터가 절단된다. 소광제가 없으면 리포터는 형광을 낸다. 리포터에서의 색변화는 각 특이 산물의 양에 비례하고, 이는 형광계를 이용하여 측정하였다. 그러므로, 각 색깔의 양을 측정하여, PCR 산물은 정량하였다. PCR 반응은 각각의 많은 시료를 동시에 처리하고 측정할 수 있는 96 웰(well) 플레이트에서 수행하였다. Taqman 시스템은 젤 전기영동과, 표준곡선을 그릴 때 정량이 필요하지 않은 추가적인 장점이 있다.

전기영동하지 않고 정량적으로 PCR 산물을 탐지하는 두 번째 기술은 상업적으로 입수가능한 TectTM SYBR^®Green PCR(Qiagen, Valencia California)과 같은 개재염료(intercalation dye)를 사이에 끼워 넣어 사용하는 것이다. RT-PCR은 PCR 단계 동안 PCR 산물에 포함시킬 형광 표지와 PCR 산물의 양에 비례하여 형광을 생성하는 SYBR^® green을 사용하여 수행하였다.

Taqman^®과 QuantiTectTM SYBR^® 시스템 모두 RNA 역전사에 사용할 수 있다.

추가적으로, 하나 이상의 전사 수준을 정량적으로 측정하는 다른 시스템은 형광 분자와 소광제 분자를 가지는 프로브를 사용하는 Molecular Beacons를 포함하여 알려져 있는데, 상기 프로브는 헤어핀 구조일때 형광물질이 소광되고, 혼성화되면 형광이 증가하여 하나 또는 그 이상의 RNA 전사체의 정량적 측정을 하게 되는 헤어핀 구조를 형성할 능력이 있다.

전기영동없이 정량적으로 PCR 산물을 확인하는 몇몇 다른 기술이 또한 본 발명에 이용될 수 있다(참조: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y.,(1990)의 PCR 프로토콜의 예).

단백질 발현의 측정

본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 유전자 발현은 폴리펩티드 유전자의 발현 생산물을 측정함으로써 측정된다. 본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 유전자 발현은 하나 혹은 그 이상의 LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1, PDGF 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 양을 확인함으로써 측정된다. 본 발명은 유전자 발현을 발견하거나 측정하는 방법에 의해 제한되지 않는다.

LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1, PDGF 유전자에 의해 암호화되는 단백질 혹은 폴리펩티드 혹은 펩티드 발현 생산물은 적절한 방법으로 검출할 수 있다. 더불어, 시료 중의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은, 면역측정기구나 방법이 종종 사용된다. 이러한 기구나 방법은 다양한 샌드위치, 경쟁적, 비경쟁적 분석에서 표지된 분자를 이용하여 관심있는 분석물(analyte)의 양이나 존재와 관계되는 신호를 발생시킨다. 추가적으로, 바이오센서와 광학적 면역분석법과 같은 방법과 기구는 표지된 분자없이도 분석물의 존재여부와 양을 결정하는데 사용될 수 있다.

단백질, 폴리펩티드, 펩티드의 존재여부와 양은 일반적으로 특이 항체를 이용하여 특이결합을 측정함으로써 결정한다. 예를 들어, 효소결합 면역측정(ELISA), 방사능 면역측정법(RIAs), 길항적 결합방법 등과 같은 적절한 면역측정법을 이용할 수 있다. 단백질 또는 폴리펩티드와 항체의 특이적 면역결합은 직접 또는 간접적으로 탐지할 수 있다. 직접 표지는 항체에 결합하는 형광성이나 발광성 태그, 금속, 염료, 방사성 핵종(radionuclide) 등을 포함한다. 간접 표지는 알칼리 인산가수분해효소, 호스래디쉬 퍼옥시다제 등과 같은, 당업계에 널리 알려진 다양한 효소가 포함된다.

또한, 단백질 혹은 폴리펩티드에 특이적인 고정화 항체의 이용이 본 발명에서 고려되었다. 항체는 자성 또는 크로마토그래피 메트릭스 입자, 분석 플레이트의 표면(마이크로타이터 웰 같은), 고체 기질의 절편(플라스틱, 나일론, 종이 같은) 등과 같은 다양한 고상 지지체에 고정화될 수 있다. 분석 스트립은 고상 지지체 상에 어레이 형태로 항체 또는 다수의 항체를 코팅하여 제조할 수 있다. 이 스트립은 테스트 시료에 살짝 담근 다음, 재빨리 세척하여 발색점(colored spot)과 같은 측정신호를 생성하는 검출 단계로 넘어갈 수 있다.

본 발명에서의 유전자 및/또는 폴리펩티드의 다수의 분석은 한가지의 테스트 시료를 가지고 개별적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 게다가, 당업자라면 같은 개체로부터 다수의 시료(예를 들면, 연속적인 시점)를 테스트한 값을 알 수 있을 것이다. 이러한 일련의 시료의 테스트는 시간의 경과에 따른 유전자 발현 및/또는 폴리펩티드 수준의 변화를 확인할 수 있게 한다. 유전자 발현수준의 증가나 감소는 유전자 발현수준의 및/또는 폴리펩티드 수준의 불변과 더불어, 이에 제한되는 것은 아니나, 결과의 발단으로 부터의 대략적인 시간, 구제할 수 있는(salvegable) 시료의 존재 및 양, 약물치료의 적정성, 증상의 해결에 의해 지적되는 여러가지 치료법의 효율성, 여러가지 타입의 자궁내막증의 분화, 결과의 심각성 확인, 질환의 심각성의 동정, 미래의 위험성을 포함한 환자의 결과확인을 포함하는 질환의 상태에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다.

상술한 유전자를 포함하는 패널은 자궁내막증의 진단이나 예후와 관련된 적절한 정보를 제공하도록 구성할 수 있을 것이다. 이러한 패널은 LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1, PDGF의 염기서열을 사용하여 보다 낫게 구성될 수 있다. 단일 유전자 또는 유전자들만의 더 커다란 패널을 포함하는 유전자 서브셋(subset)의 분석 또는 단일 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 서브셋의 분석의 조합은 민감도(sensitivity) 또는 특이도(specificity)를 최적화하기 위하여 당업계의 숙련된 자들에 의해 수행될 수 있다.

유전자 발현 및/또는 폴리펩티드 수준의 측정은 다양한 물리적 실험을 통해 수행할 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 사용이나 자동화는 많은 수의 실험시료의 처리를 용이하게 할 수 있을 것이다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, cDNA, mRNA, cRNA, 폴리펩티드 및 그들의 절편들과 같은 유전자 산물에 서열이 대응하는 프로브가 알려진 위치에 특이적으로 혼성화하거나 결합하는 어레이가 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 어레이는 각 위치가 LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1, PDGF 유전자에 의해 암호화되는 산물이 부착하는 개별적인 결합부위를 나타내는 메트릭스(matrix)이다. 본 발명의 다른 측면에 의하면, “결합부위(binding site)"(이하에서는, ”부위(site)" 라고도 함)는 특정의 같은 종류의 cDNA가 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산이나 핵산 유사체로서, 결합부위의 핵산이나 핵산 유사체의 예로는 합성 올리고머, 전체 cDNA, 전체 cDNA보다 작은 핵산, 유전자 절편 같은 핵산 또는 결합부위의 유사체를 들 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 유전자 발현이나 폴리펩티드 수준을 분석하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 적어도 한 개의 시료의 분석을 위한 장치나 시약 및 사용설명서를 포함한다. 선택적으로, 키트는 자궁내막증의 진단이나 예후에서 유전자 발현 및/또는 폴리펩티드의 양에 변화를 주는 최소한 한개 이상의 수단을 포함할 수 있다. 대조군과 비교표준을 가지고 환자의 유전자 발현양상을 비교하면, 환자가 자궁내막증을 가졌는지의 여부를 가릴 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시태양에 따르면, 키트는 LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1, PDGF 중 적어도 한 개의 특정 항체를 포함한다. 키트는 올리고뉴클레오티드 프로브나 프라이머와 같은 핵산의 검출에 특이적인 시약을 포함한다. 또한, 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 키트는 분석을 수행하고 결과를 분석할 수 있는 모든 대조군과 사용설명서를 포함하고, 탐지를 행하는데 필수적인 성분도 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 키트는 실험실적 조건의 진단 분석 및/또는 제약 또는 식품의 표시를 위해 미국 식품의약국(FDA)이나 외국의 유사기관에서 요구하는 바대로 사용설명서를 포함하는 지시서를 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 자궁내막증의 치료에서 사용되는 약물의 검색방법을 제공된다. 특히, IL2RG의 합성이나 활성, 유전자 발현수준의 감소를 유도하는 약물 및/또는 LOXL1의 합성이나 활성, 유전자 발현수준의 증가를 유도하는 시약이 고려된다.

예를 들어, 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 우선 실험 화합물로 자궁내막증으로 알려진 실험 환자를 처리하고, 자궁내막증에 대하여 발현에 변화를 주는 유전자 또는 서열의 발현수준 및/또는 폴리펩티드의 수준측정을 위하여 환자의 대표적 시료를 분석할 수 있다. 그 후, 시료의 분석결과를 실험 화합물이 주어지지 않은 자궁내막증 대조군 환자의 시료와의 비교를 통하여 유전자 발현에 변화를 줄 수 있는 실험 화합물을 동정한다.

본 발명의 다른 실시태양에 따르면, LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1, PDGF의 염기서열에서 치료를 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, IL2RG의 발현을 감소시키고, LOXL1의 수준의 증가를 유도하는 것이다.

상술한 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 방법은 잘 알려진 기술 중 하나일 것이다. 발현을 보충하는 예로는 유전자를 추가적으로 환자에 공급하는 것을 들 수 있다. 발현을 감소시키는 한 예로는 RNA 안티센스 기술 또는 의약적 억제를 들 수 있다.

DNA 마이크로어레이 기법을 이용한 혈액 림프구에서의 자궁내막증 분자마커의 동정

마이크로어레이 데이타 분석

데이타는 실시예 1에 기술된 방법으로 분석하였다. 과다발현으로 여겨지는 배수차(fold difference)는 DNA 마이크로어레이 데이타 분석에서 일반적으로 사용하는 ≥2로 정하였다. 본 발명자들은 환자와 일반인의 말초 혈액 림프구 총 RNA를 사용하여, 전체 15,097개의 cDNA 클론(14,185개의 알려진 유전자와 912개의 발현된 STSs(sequence tag sites)를 분석하였다. 각 유전자의 두 그룹을 나누는 특이한 능력을 T-통계로 평가하였다(표 1의 가중치). 대부분의 특이한 유전자는 상향조절 및 하향조절을 포함하여 모두 개시되어 있다. 본 발명자들은 추가적 분석을 위하여, 대조군과 비교하여 환자에게 추가 발현된 이러한 유전자로부터 4보다 더 큰 가중치(weight)를 가지며, 평균비 차이(mean ratio difference)가 2.0보다 큰, 9개의 유전자를 선택하였다(참조: 도 1). 이들은 신호인식 입자 수용체 B-서브유닛(siganl recognition particle receptor, B subunit, SRPRB); 프로콜라겐-프롤린(procollagen-proline), 2-옥소글루타레이트-4-디옥시게나제(프롤린 4-히드록실라제)알파 폴리펩티드 1(2-oxoglutarate-4-dioxygenase(proline 4-hydroxylase) alpha polypeptide 1(P4HA1); 라이실 옥시다제-양 1(lysyl oxidase-like 1, LOXL1); 인터루킨 2 수용체, gamma(강하게 결합된 면역결핍증)(IL2RG); 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 5(LRP5); 미엘린 기초 단백질(MBP); 종양 괴사인자(TNF superfamily, member 2; TNF); 만노시다제, 알파, 클래스 2A, 멤버 2(mannosidase, alpha, class 2A, member 2(MAN2A2); 및, 혈소판 유래 성장 인자 D/ DNA-손상 유도 단백질 1(PDGFD)이다(참조: 표 1). 총 9개의 유전자의 발현은 일반인에 비해 환자의 말초혈액림프구에서 2-배 이상 증가하였다.

표 1: 자궁내막증 환자와 정상 대조군의 유전자의 마이크로어레이 및 상대적 RT-PCR 분석

	마이크로어레이		RT-PCR
유전자	발현배수(fold- expression)	가중치 마이크로어레이 분석^a	발현배수(fold- expression)^b	P RT-PCR
SRPRB	3.59	5.812	1.02	0.2369
P4HA1	3.74	5.114	0.77	0.0594
LOXL1	3.96	4.970	0.06	0.0002
IL2RG	2.32	4.849	6.49	0.0037
LRP5	2.92	4.733	3.80	0.1274
MBP	3.03	4.460	3.62	0.6503
TNF	2.79	4.417	3.44	0.2973
MAN2A2	2.41	4.374	12.93	0.2998
PDGFD	2.56	4.316	1.96	0.6708

^a결과는 다섯 일반인에 비교하여 여섯 환자들을 보여준다. ^b결과는 열다섯 일반인에 비교하여 열다섯 환자들을 보여준다. 차별적인 가중치(weight) 값은 실시예 1에서와 같이 결정하였다. 실시간 RT-PCR을 위한 p-값은 양측 t-테스트(two-tailed unpaired t test)를 통해 결정하였다. 유의값은 0.05로 하였다.

실시간 RT - PCR 에 의한 마이크로어레이 데이타 분석

가장 차이가 뚜렷한 9개의 유전자를 상대적 실시간(real-time) RT-PCR을 이용하여, 추가적인 환자군(N=15)과 대조군(N=15)의 혈액 림프구에서 다시 평가하고, 그 결과를 표 1에 요약하였다. 확인된 9개 중 2개의 유전자는 실시간 RT-PCR에 의해 이상발현하는 것으로 증명되었다: 정상 대조군과 비교한 환자군에서, IL2RG는 상향조절(6.49배; p=0.0037)되었고, LOXLI는 하향조절(0.06배; p=0.0002)되었다. LRP5, MBP, TNF, MAN2A2, PDGFD은 RT-PCR에 나타난 것처럼 두배 이상 상향조절되었지만, 환자군과 대조군의 유전자 발현정도 차이에서는 통계적인 의미를 보이지 않았다.

토 의

지난 몇 년간 바이오마커의 발굴을 위해 매진하는 연구들이 급속도로 증가되었다(참조: Colburn, W.A. 2003 J. Clin . Pharmacol 43:329-341; Frank, R. and Hargreaves, R. 2003 Nat Rev Drug Discov 2:566-580). Biomakers Definitions Working Group에 따르면, 바이오마커(biomarker)란 “치료적 개입에 대한 정상적인 생물학적 변화, 병원체의 진행, 약물학적 반응들의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가되어지는 특성(a characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological process, pathogenic processes, or phramacologic responses to a therapeutic intervention)”이다(참조: Biomakers Definitions Working Group 2001 Clin Pharmacol Ther 69:89-95). 그러나, 가능한 진단 바이오마커들의 개수는 의약개발을 위해 고려된 잠재적인 표적들보다 훨씬 적다(참조: Levenson, V.V. 2004 Pharmacogenomics 5:459-461). 유전자 발현의 폭넓은 분석은 새로운 진단 혹은 예측을 위한 바이오마커의 발굴을 가속화시킬 것이며, 다양한 집단에서의 입증이 필요할 것이다.

따라서, 본 발명자들은 가장 접근이 용이한 조직인 말초혈액 림프구에서의 유전자 발현양상 특징이 자궁내막증을 위한 진단, 예후 바이오마커로서 사용가능한 유전자의 동정을 촉진시킬 것이라는 전제와 함께 연구를 시작하였다. 혈액 림프구의 전사양상에 대한 마이크로어레이 분석이 자궁내막 이식, 자궁내막증, 복강내 흡인액(peritoneal fluid) 연구와는 다르게, 이 질병을 위한 비침습성 마커를 찾는다는 목적과 더 부합한다는 가설을 세웠다. 이 가설은 자궁내막증을 가지고 있는 여성, 그렇지 않은 여성의 혈청과 복강내 흡인액에서 다양한 염증성 분자/성장조절 인자들의 수준이 상당이 다르게 나타난 최근의 연구를 기초로 하였다(참조: Bedaiwy, M.A. et al. 2002 Hum Reprod 17:426-431; Navarro, J. 2003 Obstet Gynecol Clin North Am 30:181-192; Iwabe, T. et al. 2002 Gynecol Obstet Invest 53 Suppl 1:19-25). 또한, 자궁내막증 환자군과 대조군 사이에 유전적 차이에 대한 자료는 충분하며, 이러한 차이들은 혈액 림프구에서도 증명이 가능하다(참조: Talyor, R.N. et al. 2002 Fertil Steril 78:694-698; Nakago, S. et al. 2001 Mol Hum Reprod 7:1079-1083). 결론적으로, 면역체계는 자궁내막증에서 중요한 역할을 하므로, 전신적 면역반응의 분석은 국부(즉, 복막강(peritoneal cavity))부위를 반영할 것이라는 설이 폭넓게 받아드려졌다(참조: Gagne, D. et al. 2003 Fertil Steril 80:43-53; Gagne, D. et al. 2003 Fertil Steril 80:876-885).

지금까지 자궁내막증을 위한 소수 잠재적인 마커-주로 사이토카인, 성장 조절인자, 유착분자(adhesion molecule) 및 호르몬들이 혈액 림프구나 혈청에서 발견되어 왔다. 베대위(Bedaiwy) 등은 혈청 IL-6와 복강내 흡인액 TNF-a가 높은 수준의 민감도, 특이도와 함께 자궁내막증 환자군과 아닌 집단에서 차이가 나타날 수 있음을 보여줬다(참조: Bedaiwy, M.A. et al. 2002 Hum Reprod 17:426-431; Bedaiwy, M.A. and Falcone, T. 2004 Clin Chim Acta 340:41-56). 그러나, 복강내 흡인액 TNF-a의 측정은 여전히 전이과정을 필요로 하기에, 자궁내막증을 위한 간단한 실험의 기반으로서 채택할 수가 없었다. 바리어(Barrier)와 샤페-팀즈(Sharpe-Timms)는 진전된 단계의 자궁내막증 여성환자들이 높은 혈청수준의 VCAM-1과 낮은 혈청수준의 ICAM-1을 갖는다고 보고하였다(참조: Barrier, B.F. and Sharpe-Timms, K.L. 2002 J Soc Gynecol Investing 9:98-101). 그들은 비정상적인 수준의 수용성 유착분자들이 자궁내막증의 발병에 대하여 설명할 뿐 아니라, 그 질병을 겨냥한 생화학적인 마커로서 사용 가능하다는 결론을 내렸다. 피죠(Pizzo) 등은 혈청 TNF-B 수준은 질병심화에 따라 증가되지만, 질병심화에 따라 감소되는 TNF-a, IL-8, MCP-1은 자궁내막증 환자들에게서 높은 혈청수준을 갖는다고 하였다(참조: Pizzo, A. et al. 2002 Gynecol Obstet Invest 54:82-87). 게다가, 이 관찰이 다른 연구에서 반복되지는 않았지만, 혈관내피 성장인자(VEGF) 또한 대조군에 비교하여 환자군에서 유의적으로 증가하였다(참조: Matalliotakis, I.M. et al. 2004 Int Immunopharmacol 4:159-160; Gagne, D. et al 2003 Hum Reprod 18:1674-1680). 수용성 종양괴사인자 수용체와 ICAM-1은 월경주기에 따라 특정 단계의 환자들에서만 유의적으로 증가하였지만, 자궁내막증 환자의 혈청에서 유의적으로 증가하는 다른 단백질들은 황체형성 호르몬(LH), Fas 리간드, 수용성 종양괴사인자 수용체, ICAM-1이다(참조: Illera, J.C. et al. 2001 Reproduction 121:761-769; Garcia-Velasco, J.A. et al. 2002 Fertil Steril 78:855-859; Koga, K. et al. 2000 Mol Hum Reprod 6:929-933; Steff, A.M. et al. 2004 Hum Reprod 19:172-178). 종합하면, 상술한 연구들은 전 질병단계의 환자들의 진단에 유용하며, 발현량이 진단시 환자의 월경주기 단계에 따라 의존하지 않는 자궁내막증의 비침습성 마커를 동정하는데는 도움이 되지 않았다.

지금까지, 오직 5개의 보고서만이 유전자 발현으로부터 자궁내막증 특이적인 양상을 증명하기 위해 DNA 마이크로어레이 기법을 사용하였다(참조: Hughes, T.R. and Shoemaker, D.D. 2001 Curr Opin Chem Biol 5:21-25; Albertson, D.G. and Pinkel, D. 2003 Hum Mol Genet 12:R145-52; Eyster, K.M. et al. 2002 Fertil Steril 77:38-42; Arimoto, T. et al. 2003 Int J Oncol 22:551-560; Lebovic, D.I. et al. 2002 Fertil Steril 78:849-854; Kao, L.C. et al. 2003 Endocrinology 144:2870-2881; Matsuzaki, S. et al. 2004 Mol Hum Reprod 10:719-728; Giudice, L.C. et al. 2002 Ann NY Acad Sci 955:252-264; Discussion 293-295, 396-406). 그러나, 이들 연구 중 어느 것도 이 쇠약해지는 질병을 위한 혈청 혹은 혈액을 기초로 한 진단 수단이 없음을 명확하게 언급하지 않았다. 그리하여, 자궁내막증의 병리 생리학을 포함하는 분자수준의 절차 분석을 충분히 도울만한 중요한 정보가 수집되었음에도 불구하고, 이러한 연구들은 혈액이나 혈청 실험으로서 진단과 치료 감독을 용이하게 할 수 있는 공통의 특이한 마커를 찾아내지 못하였다. 게다가, 이러한 연구들은 사실상 특이한 유전자 발현양상에 따라 정의될 수 있는 여러 종류의 아류형(불임, 자궁내막증, 난소 자궁내막증)들을 관찰해 왔기 때문에, 보고된 자료는 상이하며 광범위하게 적용될 수 없다.

혈액내 자궁내막증을 위한 분자 바이오마커의 동정을 위해서, 여섯명의 환자군과 5명의 정상 대조군으로부터 추출한 혈액 림프구에서 유전자(~15,000 gene/ESTs) 발현을 비교하였다. 상향, 하향조절되는 유전자들이 목록에 올랐고, 두 개의 그룹으로 나누기 위해 각각의 유전자의 특징들은 실시예 1에 나타낸 것과 같이 t-통계치에 의해 평가되었다. 과발현되는 유전자들 중에서 4배 이상 농도차가 있고 집단에 따라 평균적으로 2배 이상 차이가 있는 9개의 유전자를 좀 더 분석하였다. 이들은 다음의 그룹으로 분류되었다: (ⅰ) 면역반응과 관련된 단백질: 자궁내막증 환자의 복강내 흡인액에서 증가된 수준을 나타내기 전에 나타나는 감염전 사이토카인인 종양 괴사인자(참조: Eisermann, J. et al. 1988 Fertil Steril 50:573-579)와 기능적인 IL-2, IL-4, IL-7 수용체(참조: Nakajima, H. et al. 1997 Exp Med 185:189-195)의 중요한 구성요소로서 일반적으로는 감마 사슬이라고도 알려진 IL-2 R γ 사슬; (ⅱ) 아교질 대사에 관련된 효소: 프로릴-4 수산화효소(P4HA1)는 아교질에서 4-하이드록시프롤린을 형성하도록 촉매하며(참조: Annunen, P. et al. 1997 J Biol Chem 272:17342-17348), 라이실 옥시다제 유사 1(LOXL1)은 세포 외 기질에서 불용성 아교질의 형성을 조정한다(참조: Molnar, J. et al. 2003 Biochim Biophys Acta 1647:220-224); (ⅲ) 세포증식/ 종양형성 촉진과 관련된 유전자: α-만노시다제(mannosidase)(MAN2A2), N-연관 글리칸을 지니며 발현정도가 실험실 조건의 악성반응과 연관되어진 글리코실 가수분해효소(참조: Misago, M. et al. 1995 Proc Natl Acad Sci USA 92:11766-11770; Yue, W. et al. 2004 Int J Cancer 108:189-195); 암유전자 Wnt의 공동 수용체로서의 역할을 하며, 세포증식과 유방암 세포의 침습성을 실제적으로 조절하는 것으로 보이는 저밀도 지단백질 수용체 5(LRP5)(참조: Li, Y. et al. 1998 Invasion Metastasis 18:240-251); 세포사멸과 악성세포에서 과조절되는 신호인지 미립분자 B 서브유닛(signal recognition particle B subunit, SRPRB)(참조: Yan, W. et al. 2003 World J Gastroenterol 9:1719-1724); 혈소판 유래 성장조절 인자 D/ DNA 손상 유도 단백질 1(PDGFD)는 중간엽 기원의 세포에서 미토겐 효과에 의해 특징이 나타났다(참조: Hamada, T. et al. 2000 FEBS Lett 475:97-102); 및 (ⅳ) 중추신경계와 조혈세포에서 발현되고 그것의 발현은 종양 괴사인자에 의해 증가되는 것으로 보여지는, 미엘린 수초의 주요 단백질인 미엘린 기본 단백질(myelin basic protein, MBP)(참조: Marty, M.C. et al. 2002 Proc Natl Acad Sci USA 99:8856-8861; Huang, C.J. et al. 2002 Int J Dev Neurosci 20:289-296). 환자군과 정상 대조군으로부터의 추가적인 시료들은 실시간 RT-PCR을 이용하여 분석되었으며, IL2RG와 LOXL1의 상대적인 mRNA 발현 차이가 유의적으로 나타났다.

IL-2RG 또는 일반적인 감마 사슬은 알려진 모든 T세포 성장조절 인자 수용체(예를 들면, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21)의 일부이다(참조: Habib, T. et al. 2003 J Allergy Clin Immunol 112:1033-1045). 이 수용체 사슬은 Th1 면역반응의 전개를 조정하는 신호의 발생과 밀접하게 관련된다. 자궁내막증 환자들이 활성화된 면역세포들과 IL-2와 IL-4를 포함한 수용성 사이토카인의 증가된 수치를 보인다는 것은 잘 알려져 있다(참조: Iwabe, T. et al. 2002 Gynecol Obstet Invest 53 Suppl 1:19-25; Szyllo, K. et al. 2003 Mediators Inflamm 12:131-138; Wu, M. Y. and Ho, H.N. 2003 Am J Reprod Immunol 49:285-296). 게다가, 자궁내막증 Ⅱ에서 Ⅳ단계의 개코원숭이는 말초혈액의 세포에서 IL-2R의 단계가 증가하는 것을 보여준다(참조: D'Hooge, T.M. et al. 1996 Human Reprod 11:1736-1740). 이 유전자의 발현은 자궁내막증 환자에게서 증가되는 것으로 보인다. 한편, LOXL1은 그 역할은 뚜렷이 밝혀지지는 않았지만, 종양억제 유전자로 관련되어져 왔다(참조: Contente, S. et al. 1990 Science 249:796-798; Hamalainen, E.R. et al. 1995 J Biol Chem 270:21590-21593). LOXL1은 TNF-beta 신호 변환과정에 관여하고, 머리와 목 편평 상피세포와 전립선 암에서 하향조절되는 것으로 보여진다(참조: Dairkee, S.H. et al. 2004 BMC Genomics 5:47; Rost, T. et al. 2003 Anticancer Res 23:1565-1573; Ren, C. et al. 1998 Cancer Res 58:1285-1290) 비록 LOXL1에 대한 실시간 RT-PCR과 마이크로어레이 자료의 불일치를 설명할 수는 없지만, 추정되는 발암억제 유전자가 RT-PCR을 이용한 모든 자궁내막증 환자 연구에서 극적으로 조절 억제된다는 사실은 호기심을 돋우며 앞으로 연구할 만한 가치가 있다. 마이크로어레이와 실시간 PCR 결과간의 조절과 발현정도의 불일치는 이미 보고되었다(참조: Orr, W.E. et al. 2003 Mol Vis 9:482-496; Jenson, S.D. et al 2003 Mol Pathol 56:307-312; Ginestier, C. et al. 2002 Am J Pahol 161:1223-1233; Mutch, D.M. et al. Nov 2001 Genome Biol 2:PREPRINT0009(전자출판); Goodsaid, F.M. et al. 2004 Environ Health Persoect 112:456-460). RT-PCR이 유전자 발현정도를 정의하는데 있어 가장 표준적인 것으로 고려되고, LOXL1이 RT-PCR 분석에 의해 모든 환자군에서 극적으로 감소되는 것으로 보아, 후자의 결과들은 환자들에게 나타날 영향을 개선할 수 있을 것이다.

환자군과 정상 대조군 사이에서 상대적인 mRNA의 발현 차이들이 통계학적인 의미에 도달하지 않았음에도 불구하고, 추가적인 시료들의 RT-PCR 분석으로 LRP5, MBP, TNF, MAN2A2, PDGFD를 위한 마이크로어레이 데이타를 증명할 수 있었다. 이것은 아마 개체적인 차이점이거나 적은 양의 시료분석이 원인일 것이다. MAN2A2의 발현이 정상 대조군보다 환자군에서 12.93배 높게 나왔음에도 불구하고, 큰 표준 오차는 이 차이점이 통계적인 의미에 부합하지 않다는 사실을 설명해 줄 것이다. 특별히, 종양괴사인자는 자궁내막증의 병리 생리학적인 측면에서 깊게 관련되어 있다. 그 발현은 월경주기에 따라 다양하게 나타나며(참조: Hunt, J.S. et al. 1997 J Reprod Immunol 35:87-99), 높은 수준은 이 특별한 유전자의 중요성 결핍을 설명할 수 있는, 약한 질병과 심한 질병의 환자군에서 확인되어졌다(참조: Pizzo, A. et al. 2002 Gynecol Obstet Invest 54:82-87). 또한, DNA 마이크로어레이 분석을 통해 보여진 것처럼, PDGFD의 발현이 환자군 시료에서 상향조절된다는 것이 최근의 연구에 의해 드러났다. 이러한 관찰들은 마쯔자키(Matsuzaki) 등에 의해 보고된 자료와 함께, 이 질병에서 혈소판 유래 성장 조절인자계의 중요성을 뒷받침한다: 본 발명자들은 PDGF 리간드가 자궁내막증 환자의 혈액 림프구에서 상향조절됨을 증명하였으나, 그들은 심각한 자궁내막증 장애에서 PDGF 수용체의 발현증가를 보고하였다. PDGFD는 세포증식과 형질전환을 자극하고, 혈관신생에 관여한다고 알려져 왔다(참조: Ustach, C.V. et al. 2004 Cancer Res 64:1722-1729; Li, H. et al. 2003 Oncogene 22:1501-1510); 따라서, PDGF계의 활성화는 이소부위(ectopic site)에서 자궁내막세포의 성장을 자극시킬 것이라는 추측을 하게 한다.

본 발명자들은 자궁내막증 환자의 말초 혈액 림프구에서 특이하게 발현하는 유전자에 대한 최초로 보고한다. 이는 이 질병의 발병학적인 측면에서 중요한 단서를 제공할 것이다. 발명자들의 분석은 유전자들의 동정에 주력하였다. 유전자들의 분리와 함께, 질병, 구조적 변경, 발현양상들은 질병마커로서의 사용을 좀 더 명확히 하기 위해 앞으로 연구가 진행될 것이라 기대된다. 구체적으로, 유전자 결합에 따른 유전자 발현정도의 분석이 자궁내막증의 극소 침습성 인지방법에 대한 민감성과 특이성을 증가시킬 것이라 제안한다. 또한, 마이크로어레이 분석과 RT-PCR에 의해 더 많은 집단에서 시행된 검증 연구들은 후보 유전자들의 혈청 단백질 수준의 측정과 자궁내막증 시료에 대한 고밀도 조직 마이크로어레이 분석에 의해 보완될 것으로 기대된다.

본 연구에서 분석된 환자군은 여러 단계의 질병심화(심함; 중간; 약함; 미소) 또는 증상(불임 대비 월경불순 대비 양쪽 모두)에 따라 다양한 임상적인 부류로 나뉠 수 있다; 이 분석은 상이한 유전적 분류를 반영할 것이다. 월경주기 단계, 동반 감염, 약물복용과 같은 림프구 유전자 발현양상에 영향을 미칠 인자를 고려하는 것 또한 중요할 것이다(참조: Willis, C. et al. 2003 Hum Reprod 18:1173-1178; Dosiou, C. et al. 2004 J Clin Endocrinol Metab 89:2501-2504). 각 부류의 적은 환자 수 때문에 이러한 분류에 따라 변화를 비교하는 것은 불가능할 것이다. 현 정보를 토대로, 자궁내막증 환자군과 정상 대조군을 비교하는 발현분석은 연구된 모든 환자 부류에서 공통적인 유전자 발현에서의 차이를 알아보는 것만이 가능할 것이다. 이러한 점에 본 연구의 가치를 둔다- IL-2RG와 LOXLI에 대한 유전자 발현의 차이는 질병 아류형, 약물 복용 또는 환자의 월경주기 단계에 관계없이 의미를 갖는다. 우리 실험실에서 진행이 기대되는 연구들은 관심 유전자의 발현양상을 밝히기 위해 유전자 발현정도의 차이가 월경주기 단계에 따라 다양한지, 이러한 다양성이 임상적인 예 또는 질병 특성과 관련될 수 있는지(예를 들면, 심한 질병 대비 약한 질병; 월경불순 대비 불임)에 관해 상세히 계획되었다.

요약하면, 본 연구는 자궁내막증의 새로운 표적 유전자의 위치를 규명하였고, 이는 비침습적, 특이적 진단법의 개발은 물론, 상기 만성적 질환의 새로운 치료법으로의 토대가 될 것으로 기대된다.

실시예 1

연구모집단

환자(환자와 대조군)들은 푸에르토 리코의 산부인과 의사들로부터 직접 소개받은 사람들이 모집되었다. 본 연구의 환자 모집단은 수술 중 산부인과 의사로부터 자궁내막증으로 진단받은 조기 폐경기의 여성들로 구성되었으며, 환자들의 병의 단계는 다음과 같았다: 심함(severe, 11), 중간(moderate, 6), 약함(mild, 3), 미소(minimal, 1). 마이크로어레이를 위한 환자시료(N=6, 나이 범위 32-39세, 평균 나이= 35.5세)와 실시간 RT-PCR 평가실험을 위한 환자시료(N=15, 나이 범위 26-39세, 평균 나이= 31.2세)는 발명자들의 핵산은행(nucleic acid bank)에서 임의로 선택하였다. 21명 중 13명(62%)은 어떠한 약물치료제도 취하지 않은 상태에서 시료를 수득하였다. 약물치료제를 취한 개체는 생식세포 자극 호르몬 작용제(GnRH agonist, 6), 경구 피임약(oral contraceptive, 1), 다노크린(danocrine, 1)으로 취하게 하였다. 대조군(마이크로어레이를 위하여는 N=4; 실시간 RT-PCR을 위하여는 N=15)은 부인과학의 조건(예, 자궁 섬유종, DUB, 멸균)과 관련이 없는 복강경 검사 또는 개복술을 경험했던 여성들이고, 수술로 확인된 자궁내막증을 갖고 있지 않았다. 남성 지원자로부터 얻어진 시료는 마이크로어레이 실험의 대조군으로 포 함되었다. 대조군 시료는 완벽히 익명이며, 따라서 인구통계학의 정보와 연결되지 않는다. 환자와 대조군의 시료는 마이크로어레이와 실시간 RT-PCR 실험에 사용되었고, 중복되지는 않았다. 실험에 앞서 본 연구방법은 폰스(Ponce) 의과대학과 NHGRI-NIH 두 곳의 IRB 위원회로부터 평가되고 인증받았다. 실험에 앞서 모든 참가자는 동의서를 읽고 서명하였다.

혈액시료

동의서를 받은 후, 혈액시료는 연구 간호사로부터 표준 무균절차로 정맥 천자(venipuncture)에 의해 수집되었다. 일단, 실험실에서 Histopaque(Sigma, St. Louis, MO)로 전혈액을 40분 동안 2000rpm으로 원심분리하여 먼저 림프구를 분리하였다. 제조사(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 부터 제공받은 용법에 의거하여, 전체 RNA를 Trizol LS를 사용하여 림프구에서 분리하였다. cDNA 마이크로어레이에 의한 발현분석: 본 발명자들은 유전자 선택과정을 사용하여 감염된 여성의 6개의 혈액시료와 5개의 대조군을 분석하였다(하기 참조). 그 분석법은 이전에 기술된 문헌(참조: DeRisi, J. et al. 1996 Nat Genet 14:457-460; Shalon, D. et al. 1996 Genome Res 6:639-645; Mousses, S. et al. Gene expression analysis by cDNA microarrays in Functional Genomics)으로서 유리막에 준비되어 표지된 15,097 cDNA클론이 사용되었다. 이 클론들 중 912개 클론은 서열 태그(tag)들이 발현되었고, 남은 14,185클론은 알려진 유전자였다. 혼성화와 혼성화 후 세척은 상기 문헌에 기술된 대로 수행하였다(참조: Mousses, S. et al. Gene expression analysis by cDNA microarrays cDNA in Functional Genomics, F.J. Liversey and S.P. Hunt(Eds.),2000, Oxford University Press, Oxford, pp.113-137; Monni, O. et al. 2001 Proc Natl Acad Sci USA 98:5711-5716; Pollack, J.R. et al. 2002 Proc Natl Acad Sci USA 99:12963-12968). 간단히, 피실험자의 혈액 림프구의 전체 RNA의 약 15~20mg과 표준 참조(Universal Human Reference RNA, Stratagene, LaJolla, CA)의 같은 양이 SuperScript 역전사 효소(Invitrogen, Carlsbad, CA)와 Cy3-dUTP,Cy5-dUTP(Amersham Pharmacia, Pisactaway, NJ) 중 하나가 각각 사용되어 역전사로 표지되었다. 표지된 탐침은 알칼리성 가수분해로 Microcon 30(Milipore, Billerica, CA)을 사용하여 정제되고, 농축되었다. 혼성화는 65℃의 습기찬 밀폐된 공간의 수용액에서 밤새(16-24시간) 행하여졌다.

cDNA 마이크로어레이 자료의 통계적 분석

두 집단(자궁내막증이 있고, 없는) 사이의 현저한 이상발현과 관련한 유전자를 증명하기 위해서, 유전자 선택프로그램(arrayanalysis.nih.gov) 은 이전에 기술된 것(참조: Bittner, M. et al.2000 Nature 406:536-540; Hedenfalk, I et al. 2001 N Engl J Med 344:539-548)과 같이 사용되었다. 우선, 유전자 발현 데이타를 측정 품질 평가(measurement quality assessment)로 걸르고, 차별되는 가중치 값으로 t-통계값이 계산되었다. 의미없는 생물학적 정보와 잉여값들은 제거한 후, 가 장 차별되는 유전자(즉, 이 유전자들은 4.0보다 더 큰 가중치를 갖고, 집단-별로 2.0이상의 평균배수 변화(두 집단간의 평균비율 차이))들을 목록으로 만들었다. 유전자 발현비율은 우선 로그 변형한 후, 그것들의 모든 실험 하에서의 평균발현정도의 표준편차(σ)에 따라 과발현은 빨간색(어두운 회색)과 저발현은 녹색(옅은 녹색)으로 표시하였다(참조: 도 1).

실시간 RT - PCR 에 의한 유전자 발현 데이타 확인

DNA 마이크로어레이에 의한 유전자 발현 데이타를 확인하기 위해서, 추가 환자(N=15)와 여성 대조군(N=15)의 말초 혈액 림프구의 전체 RNA를 사용하여 상대적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다. 모든 실험은 3배수로 행하였다. 간단히, 전체 RNA는 Trizol LS 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 말초 혈액 림프구에서 분리하였다. 오염된 DNA를 제거하기 위해서, 시료는 DNA 분해효소 I(DNA-free, Ambion, Austin, TX)로 처리하였다. 역전사는 제조사의 프로토콜에 따라 iScript cDNA 합성 키트(Bio-rad, Hercules, CA)를 사용하여, PTC-200 열순환기(MJ Research, Waltham, MA)에서 수행하였다. cDNA 합성 후, 중합효소연쇄반응을 특이적 올리고-프라이머 쌍을 가지고 iQ SYBR Green Super Mix 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜(Bio-rad, Hercules, CA)에 따라 행하였다. 중합효소연쇄반응 증폭방법은 다음과 같았다: 94℃, 4분 후, 변성을 위해 94℃/30초, 유전자-특이적 연결을 위해 유전자-특이 어닐링 온도/30초, 연장을 위해 72℃/40초의 과정을 50회 반복하 였다. 각각 실행한 후, 융해곡선(melting curve)이 프라이머의 특이성을 증명하기 위해서 만들어졌다. 중합효소연쇄반응 증폭의 실시간 분석은 iCycler iQ Optical System software, 3.0a 판(Bio-rad, Hercules, CA)을 사용하여 수행하였다. 특이적 올리고-프라이머 쌍은 공공 데이타베이스로 부터 입수하여, 뉴저지(New Jersey) 의과대학의 분자자원시설(Molecular Resource Facility)에서 합성하였다. 상대적 발현정도는 하우스 키핑 유전자 GAPDH 에 대한 정규화 후 각 시료에 대하여 계산하였다(참조: Livak, K.J. 2001 Methods 25:402-408). 통계분석은 환자와 대조군의 상대적인 mRNA 발현정도를 비교하기 위해, 양측 t-테스트(unpaired two-tailed t-test)을 사용하여 수행하였다(GraphPad InStat 3). 통계적 유의성은 p 값<0.05 에 으로 정의되었다..

실시예 2

추가적인 14명 환자로부터의 데이타를 분석하였다. 이 표지들 각각의 변화를 더 잘 표현하기 위하여 본래 데이타(세트 1)의 산점도(scatter plot)들을 포함시켰다(도 3). 산점도들은 지금까지 검정된 모든 환자에서 알려진 LOXL1의 낮은 발현정도를 보여준다.

또한, 본래의 결과를 확증하는 14명 환자들의 또 다른 집단(세트 2)의 추가적인 데이타를 포함시켰다. 하단의 수치는 두 번째 세트 환자의 결과 요약을 보여준다. 도 4는 세트 2의 각 유전자의 변화를 나타내는 산점도이다. 도 5는 환자 세트 1(상단)과 세트 2(하단)의 평균배수 발현을 보여주는 반면, 도 6은 두 집단의 결과 비교를 보여준다. 도 7은 지금까지 검정된 39명 환자로 부터의 데이타 곡선이다.

***

본 발명은 기술의 명료성과 이해의 목적으로 다소 자세하게 기술되었지만, 이 분야의 숙련된 자들이라면 본 발명의 실 범주에 벗어나지 않고 형식이나 세부적인 사항에 있어서 다양한 변형이 가능하다는 것을 이해하게 될 것이다. 상술한 모든 그림, 표, 부록 뿐만 아니라, 특허, 출원, 공개문헌들은 본 명세서에 참고문헌으로 삽입되었다.

Claims

하기의 각 단계를 포함하는, 여성 환자에게서 자궁내막증(endometriosis)의 소인(predisposition)을 동정 또는 예측하는 방법:

(a) 환자의 말초혈액 백혈구 또는 말초혈액시료에서 말초혈액 백혈구의 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 1차 측정값을 제공하는 단계;

(b) 대조군 또는 표준시료에서 상기 백혈구의 상기 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 2차 측정값을 제공하는 단계; 및,

(c) 상기 1차 측정값과 2차 측정값 사이에 차이가 있는지의 여부를 비교하는 단계.
제 1항에 있어서,

상기 대조군 또는 표준시료는 자궁내막증이 발병되지 않은 환자 또는 환자의 그룹으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는

방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 1차 측정값이 2차 측정값보다 큰 것은 자궁내막증의 발병 또는 발병예측(prediction)을 의미하는 것을 특징으로 하는

방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 1차 측정값이 2차 측정값보다 작은 것은 자궁내막증의 발병 또는 발병예측을 의미하는 것을 특징으로 하는

방법.
제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서,

자궁내막증의 발병의 예측은 약 50%의 확률을 갖는 것을 특징으로 하는

방법.
제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서,

상기 1차 측정값은 2차 측정값보다 약 20% 크거나 또는 작은 것을 특징으로 하는

방법.
제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,

유전자 발현수준을 결정하는 것은 상기 유전자의 전사된 폴리뉴클레오티드의 유전자 발현을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는

방법.
제 7항에 있어서,

상기 전사된 폴리뉴클레오티드는 mRNA 또는 cDNA인 것을 특징으로 하는

방법.
제 7항 또는 제 8항에 있어서,

상기 발현수준은 마이크로어레이 분석(마이크로어레이 analysis), 노던블럿 분석(노던 blot analysis), 역전사 PCR(reverse transcription PCR) 또는 RT- PCR에 의하여 검출되는 것을 특징으로 하는

방법.
제 1항 내지 제 9항의 어느 한 항에 있어서,

LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 및 PDGF로 구성된 그룹의 한 유전자의 유전자 발현수준을 결정하는 것을 특징으로 하는

방법.
하기의 각 단계를 포함하는, 여성 환자에게서 자궁내막증의 소인을 동정 또는 예측하는 방법:

(a) 환자의 말초혈액 백혈구 또는 말초혈액시료에서 말초혈액 백혈구의 적어도 하나의 이상발현되는 단백질 또는 펩티드의 수준을 결정하여, 1차 측정값을 제공하는 단계;

(b) 대조군 또는 표준시료에서 상기 백혈구의 상기 적어도 하나의 이상발현되는 단백질 또는 펩티드의 수준을 결정하여, 2차 측정값을 제공하는 단계; 및,

(c) 상기 1차 측정값과 2차 측정값 사이에 차이가 있는지의 여부를 비교하는 단계.
제 11항에 있어서,

상기 1차 측정값이 2차 측정값보다 큰 것은 자궁내막증의 발병 또는 발병예측을 의미하는 것을 특징으로 하는

방법.
제 11항에 있어서,

상기 1차 측정값이 2차 측정값보다 적은 것은 자궁내막증의 발병 또는 발병예측을 의미하는 것을 특징으로 하는

방법.
제 1항에 있어서,

유전자 발현수준을 결정하는 것은 발현산물인 단백질을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는

방법.
제 11항에 있어서,

단백질 또는 펩티드의 양은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는

방법.
하기의 각 단계를 포함하는, 치료의 전후에 자궁내막증을 갖는것으로 동정된 환자를 모니터링하는 방법:

(a) 치료하기 이전에, 상기 환자의 말초혈액 백혈구 또는 말초혈액시료에서 말초혈액 백혈구의 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 1차 측정값을 제공하는 단계;

(b) 치료후에, 상기 백혈구의 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 2차 측정값을 제공하는 단계; 및,

(c) 치료하기 이전 및 치료후에, 상기 환자의 유전자 발현수준의 차이를 비교하는 단계.
하기의 각 단계를 포함하는, 자궁내막증의 치료에 유용한 후보 약물을 스크리닝하는 방법:

(a) 생체외 조건(ex vivo)에서 적어도 하나의 이상발현되는 유전자를 발현시키는 것이 가능한 세포에 후보 약물을 접촉시키는 단계;

(b) 상기 세포에서 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 1차 측정값을 제공하는 단계;

(c) 후보 약물이 존재하지 않는 세포에서 적어도 하나의 이상발현되는 동일한 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 2차 측정값을 제공하는 단계; 및,

(d) 상기 유전자 발현수준의 차이는 자궁내막증의 치료에 사용될 가능성이 있는 약물임을 의미하도록, 상기 1차 측정값과 2차 측정값을 비교하는 단계.
적어도 하나의 이상발현되는 유전자 또는 유전자 발현물의 유전자 발현, 합성 또는 활성화 수준의 감소 또는 증진을 유도할 수 있는 약물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 자궁내막증을 치료 또는 예방하는 방법.
적어도 하나의 이상발현되는 유전자 또는 유전자 발현물의 유전자 발현, 합성 또는 활성화 수준의 감소 또는 증진을 유도할 수 있는 약물의 유효량을 포함하는 자궁내막증의 치료 또는 예방용 의약의 제조방법.
하기의 각 단계를 수행하기 위한 수단을 포함하는 여성 환자에게서 자궁내막증 소인의 동정 또는 예측용 키트:

(a) 환자의 말초혈액 백혈구 또는 말초혈액시료에서 말초혈액 백혈구의 적어도 하나의 이상발현되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 1차 측정값을 제공하는 단계;

(b) 대조군 또는 표준시료에서 상기 백혈구의 상기 적어도 하나의 이상발현 되는 유전자의 유전자 발현수준을 결정하여, 2차 측정값을 제공하는 단계; 및,

(c) 상기 1차 측정값과 2차 측정값 사이에 차이가 있는지의 여부를 비교하는 단계.