KR20080003321A

KR20080003321A - 생물학적 샘플을 분류하는 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20080003321A
Application number: KR1020077021910A
Authority: KR
Inventors: 토마스 노이만; 메히스 폴드
Original assignee: 세미네스 인코퍼레이티드
Priority date: 2005-02-24
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2008-01-07
Also published as: EP1859266A4; JP2008532014A; CA2598889A1; RU2007135030A; EP1859266A2; WO2006091734A9; AU2006216683A1; WO2006091734A2; CN101160524A; IL185458A0; WO2006091734A3; MX2007010349A; US20090075832A1

Abstract

본 발명은 자가항체 및 펩티드 에피토프의 그 검출에 관한 것이다. 본 발명은 또한 자가항체 패턴 및 생물학적 클래스 구별과의 그 상관관계에 관한 것이다.

Description

생물학적 샘플을 분류하는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR CLASSIFYING BIOLOGICAL SAMPLES}

암은 미국에서 두 번째로 많은 사망 원인이다. 통상의 진단법 및 치료법에 대한 집중된 연구에도 불구하고 5년 생존율은 지난 25 년간 최소한도로 개선되었다. 매우 요구되고있고, 효과적인 진단 및 치료제의 개발 및 상품화를 위해서 종양발생의 복잡성을 더 잘 이해하는 것이 필요하다.

인간 종양에 대한 면역 반응을 관찰한 것을 기초로 혈청 자가항체 ("aAB") 가 암 진단에서 사용될 수 있음이 제안되었다 (Fernandez-Madrid 등, Clin Cancer Res. 5:1393-400 (1999)). 예를 들어, 보고에 의하면 특정 혈청 aAB 의 존재를 통해, 위험에 노출된 환자 중에서 폐암의 발현 (Lubin 등, Nat Med. 1995; 1:701-2) 뿐만 아니라 비소세포 폐암 (NSCLC) 환자의 예후도 예측할 수 있다 (Blaes 등, Ann Thorac Surg. 2000; 69:254-8). 그러나 이러한 암 연구는 오직 암의 존재 또는 부재를 확정지을 수 없는 소수의 마커에 대해서만 보고되어 있고, 항상 암 환자의 암-관련 혈청 aAB 및 그 종양-관련 항원의 출현에만 집중하여 왔다 (Vernino 등, Clin. Cancer Res. 10:7270-5(2004); Metcalfe 등, Breast Cancer Res. 2:438-43 (2000); Tan, J. Clin. Invest. 108:1411-5 (2001); Lubin 등, Nat Med. 1:701-2 (1995); Torchilin 등, Trends Immunol. 22:424-7 (2001); Koziol 등, Clin. Cancer Res. 9:5120-5126, (2003); Zhang 등, Clin. Exp. Immunol. 125:3-9, (2001)). 또한 종양-관련 항원이 검출된 임의의 개체에 대해 특이적인 자가항체의 빈도가 낮은 것이, 유용한 진단 마커로서 자가항체가 사용되는 것을 방해하여 왔다.

질병 상태에서 aAB 의 다양한 분석에 대한 몇몇 연구가 보고되어 왔다. 이러한 특수한 분야에서 Robinson 등의 선구자적인 연구가 2002 년도에 출판되었고, 다수의 aAB 가 여러 생체분자를 인식하고, 8가지 특유의 인간 자가면역 질병 (전신홍반루푸스 및 류마티스성 관절염 포함) 에서 존재함을 기재하고 있다 (Robinson 등, Nat Med. 8:295-301 (2002)). 암에 대한 유사한 연구가 아직은 보고되지 않았다.

현재 사용되는 모든 aAB 검출 전략은 그 고유의 강점 및 약점을 가진다. 예를 들어 개별 aAB 의 ELISA 를 통한 검출은 단순함을 제공한다. 그러나 이러한 접근법의 주요 약점은 기타 잠재적으로 정보적인 aAB 을 검출하지 못하므로 그 예측적인 가치가 제한된다는 것이다. SEREX 분석 (발현 cDNA 라이브러리의 혈청 분석) 을 통하여, 알려진 특이성을 가지는 상이한 aAB 의 동시적인 식별이 가능하다 (Gure 등, Cancer Res. 58:1034-41 (1998)). 그러나 이 기술은 시간과 노동력이 많이 들어서 임상 용도로 부적합하다. 환자 혈청으로 웨스턴 블로팅을 하면 단백질 샘플 중 잠재적 자가항원의 크기를 빨리 식별할 수 있지만 사용되는 단백질 샘플에 정보적인 능력이 제한되고, 자가항체:항원 복합체의 분해능이 제한적이고, 자가항원의 식별과 관련된 추가적인 정보를 제공하지 못한다 (Fernandez- Madrid 등, Clin Cancer Res. 5:1393-400 (1999)).

결과적으로, 암, 암 하부유형을 결정하는 자가항체 패턴 및 질병의 기타 측면이 설명될 수 없다. 또한 암의 진단 및 특징화와 관련된 생물학적 샘플 중 자가항체 및 자가항체 패턴을 검출하기 위한 고속 분석 도구가 매우 유익할 것이다.

본 발명의 개요

본 발명은 생물학적 샘플 중에서 자가항체 (aAB) 를 검출하는 것에 관한 것이고, 자가항체 프로파일로 결정되는 면역 상태의 차이를 이용하여, 생리적인 상태 또는 표현형 (본원에서 클래스(class) 으로 지칭됨) 을 구별하고, 진단 및 예후 정보를 수득한다. 본 발명은 생물학적 샘플에서 항원-항체 결합을 모방하며, 면역 상태의 반(半)수량화 수단으로서 자가항체 결합 활성 (자가항체 프로파일링) 을 측정하는데 펩티드 에피토프를 사용한다. 진단 및 예후 결정을 포함하는 자가항체 프로파일링 및 클래스 예측에 유용한 정보적인(informative) 에피토프의 집합 (set) 뿐 아니라 특정 질병 클래스 구별에 유용한 에피토프의 집합을 선택하는 방법이 제공된다. 본 원에 기재되는 한 예로, 상이한 종양 상태의 환자는 그 혈청 aAB 프로파일에 차이가 있어서, 진단과 관련성이 있다. 합성 펩티드의 집합은 암 및 비(非)암에서 자가항체 결합 활성을 측정하는데 사용되고, 정보적인 에피토프의 부분집합이 식별되고, 암과 관련된 면역 상태를 특징화하고, 매우 정확한 암 진단을 제공한다. 본원에 기재되는 또 다른 예로서, 폐암 하부클래스를 구별하는데 유용한 정보적인 에피토프의 집합이 제공된다. 유리하게, 본 발명은 자가항체 결합 활성 패턴 인지 및 정보적인 에피토프의 집합을 사용하는데, 이는 복합물로서의 다중 자가항체 결합 활성의 조합이, 단일 aAB 를 포함하여 통상적인 단일-주체 생물마커와 비교하였을 때 암을 정확하게 특징화 할 수 있는 더 큰 잠재력을 지니기 때문이다.

다양한 암을 진단할 수 있는 자가항체 결합 활성 패턴을 검출하는데 사용될 수 있는 정보적인 에피토프의 집합 이외에, 본 발명은 그로써 검출되는 자가항체 결합 활성 패턴을 바탕으로 종양의 조직병리학적 표현형 또는 특이적 질병 단계를 결정하는데 사용할 수 있는 정보적인 에피토프의 집합을 제공한다. 또한 그로써 검출되는 자가항체 결합 활성 패턴을 바탕으로, 질병 발현 위험에 노출된 개체로부터의 샘플을 분류하는데 사용될 수 있는 정보적인 에피토프의 집합이 제공된다. 특히 유전자-어레이와는 달리 본원에 기재되는 aAB-검정에 사용되는 생물학적 샘플에는 생검 또는 시간이 걸리는 샘플 정제가 요구되지 않는다.

중요하게, 본 발명은 단백질 전체 또는 그 단편 대신에 에피토프를 사용하여 자가항체의 샘플을 탐지한다. 본원에서 확인되듯이, 단일 단백질의 상이한 조각에 해당하는 에피토프는 상이한 클래스의 샘플들 사이에서 그 결합 활성이 불일치할 수 있다. 그 결과 전체 단백질 또는 그 단편 (즉, 다중 에피토프의 복합물) 으로 자가항체 검출하는 것은 클래스 구별에 유익하지 않은 반면, 단일 단백질 중의 개별 에피토프를 사용하는 것은 매우 유익할 수 있다. 예를 들어 첫 번째 에피토프는 비암 (non-cancer) 샘플에서 특정 빈도수로 에피토프 결합 활성을 보일 수 있고, 소세포 폐암 환자의 샘플에서는 검출되는 에피토프 결합 활성이 없을 수 있다. 동일한 단백질에 해당하지만 첫 번째 에피토프와 겹치지 않는 두 번째 에피토프는 정상 샘플 및 암 샘플 모두에서 동일한 빈도수로 풍부한 에피토프 결합 활성이 나타날 수 있다. 이 경우 상기한 바와 같이 첫 번째 에피토프는 유익할 수 있는 반면, 이러한 결과를 바탕으로 두 번째 에피토프 및 전체 단백질은 클래스 구별에 정보적이지 않을 수 있다.

본원에 기재되는 진단 및 예후예상 방법의 또 다른 중요한 양태는, 특히 정상 샘플에서 존재하고, 질병 샘플에서는 감소되는 에피토프의 결합 활성을 포함하는 다양한 분포의 자가 항체를 고려한다는 것이다. 즉, 본 방법은 질병-연합 자가항원의 출현에 대한 반응으로서 질병 상태에서 나타나는 자가 항체에만 집중하지는 않는다. 오히려 본 발명은 다양한 에피토프, 정상 샘플에서 에피토프 결합 활성이 특정 빈도수의 높은 수준으로 검출되고, 질병 상태에 해당하는 샘풀에서는 에피토프 결합 활성이 검출되지 않을 만큼 낮은 수준으로 나타나는 다수의 에피토프를 사용한다. 질병 샘플에서 이러한 에피토프에 결합할 수 있는 자가 항체가 자주 검출되지 않지만, 그럼에도 불구하고 이러한 에피토프는 클래스 구별에 정보적이고, 본 원에 기재되는 진단 및 예후예상 방법에 유용하다.

따라서 한 양태에서, 본 발명은 자가항체 결합 활성이 샘플 간의 클래스 구별과 상관관계가 있는, 정보적인 에피토프의 집합을 식별하는 방법을 제공한다. 본 방법은 클래스 구별과 상관관계가 있는 샘플 중 그 자가항체 결합 활성 수준으로 에피토프를 구분하는 것을 포함하고, 상관관계가 우연히 기대되는 (expected by chance) 것보다 더 강한지의 여부를 결정한다. 우연히 기대되는 것보다 더 강 하게 클래스 구별과 상관관계가 있는 자가항체 결합 활성을 가지는 에피토프가 정보적인 에피토프이다. 정보적인 에피토프의 집합이 식별된다. 한 구현예에서, 알려진 클래스 사이에서 클래스 구별이 결정된다. 바람직하게 클래스 구별은 질병 클래스 및 비(非)질병 클래스 사이에, 더 바람직하게 암 클래스 및 정상 클래스 사이에 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 클래스 구별은 위험이 높은 클래스과 비질병 클래스 사이에, 더 바람직하게 위험이 높은 암 클래스과 비암 클래스 사이에 이루어진다. 알려진 클래스는 또한 화학요법에 잘 반응하는 개체의 클래스 또는 화학요법에 잘 반응하지 않는 개체의 클래스일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 알려진 클래스 구별은 질병 클래스 구별, 바람직하게 암 클래스 구별, 더욱 바람직하게 폐암 클래스 구별, 유방암 클래스 구별, 위장 암 클래스 구별, 또는 전립선암 클래스 구별이다. 한 구현예에서, 알려진 클래스 구별은 SCLC 클래스 및 NSCLC 클래스 사이의 폐암 클래스 구별이다.

샘플 중 클래스 구별과 상관관계가 있는 자가항체 결합 활성의 정도로 에피토프를 분류하는 것과 상관관계의 유의성을 측정하는 것은 근접(neighborhood) 분석 (예, 신호 대 잡음 루틴 이용, 피어슨 상관관계 루틴, 또는 유클리드 거리 루틴) 을 통해 수행될 수 있으며, 이는 이상적인 자가항체 결합 활성 패턴 (여기서 이상적인 패턴은 자가항체 결합 활성이 제 1 클래스에서 균일하게 높고, 제 2 클래스에서 균일하게 낮은 것임) 을 정의하는 것; 및 자가항체 결합 활성이, 동등한 무작위 패턴과 비교하여 이상적인 패턴과 유사한 높은 밀도의 에피토프가 있는지 여부를 측정하는 것을 포함한다. 신호 대 잡음의 루틴은 다음과 같다:

P(g,c) = (μ₁(g) - μ₂(g)) / (σ₁(g) + σ₂(g))

[식 중, g 는 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성 수치이고; c 는 클래스 구별이고, μ₁(g) 은 제 1 클래스에 대한 자가항체 결합 활성 수치의 평균이고; μ₂(g) 는 제 2 클래스에 대한 자가항체 결합 활성 수치의 평균이고; σ₁(g) 는 제 1 클래스의 표준 편차이고; σ₂(g) 는 제 2 클래스의 표준 편차임].

한 구현예에서 근접 분석을 하지 않고 암의 분류에 정보적인 에피토프의 가중표 (weighted vote) 를 결정하는데 신호 대 잡음 루틴이 사용된다.

본 발명의 또 다른 양태는, 알려진 또는 추정 클래스에 샘플을 배정하는 방법이며, 이는 가중표 도식을 가지고 만든 모델에 따라 클래스 중 하나에 대해 정보적인 하나 이상의 에피토프의 가중표 (예, 20 초과, 50, 100, 150) 를 결정하는 것 (여기서 각 표의 규모는, 주어진 에피토프에 대한 샘플의 자가항체 결합 활성, 및 주어진 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성과 클래스 구별의 상관관계 정도에 의존함); 및 이기는 클래스를 결정하기 위해 표의 합계를 내는 것을 포함한다. 가중표 도식은 다음과 같다:

V_g = a_g (x_g - b_g)

[식 중, V_g 은 에피토프 g 의 가중표이고; a_g 는 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성과 클래스 구별 사이의 상관관계이고, P(g,c) 는 상기 정의와 같고; b_g = (μ₁(g) + μ₂(g)) / 2 이고, 이는 제 1 클래스 및 제 2 클래스에서의 에피토프에 대한 평균 log₁₀ 자가항체 결합 활성 수치의 평균치이고; x_g 는 검정될 샘플에서 에피토프에 대한 log₁₀ 자가항체 결합 활성이며; 여기서 양수 V 는 제 1 클래스에 대한 표를 나타내고, 음수 V 는 제 1 클래스의 반대표임 (제 2 클래스의 표)].

예측검정력 또한 측정될 수 있는데, 여기서 예측검정력이 일정 역치, 예로써 0.3 초과일 때 샘플이 이기는 클래스로 할당된다. 예측검정력은 다음과 같이 측정된다:

(V_win - V_lose) / (V_win + V_lose)

[식 중, V_win 및 V_lose 은 각각 이기는 클래스 및 지는 클래스에 대한 총 득표수 임].

본 발명은 또한 샘플을 분류하는데 사용되는 정보적인 에피토프에 대한 가중표를 결정하는 방법을 포함하는데, 여기서 각 표의 규모는 에피토프에 대한 샘플의 자가항체 결합 활성 및 클래스 구별과 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성의 상관관계 정도에 의존하는, 하나 이상의 정보적인 에피토프에 대한 하나 이상의 클래스에 대한 가중표를 결정하는 것을 포함한다. 표는 이기는 클래스를 결정하기 위해 합계 내어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현에는 2 개 이상의 샘플에서부터 다수의 분류를 확인하는 방법으로서, 이는 추정 클래스를 만들기 위해 자가항체 결합 활성으로 샘플을 군집화하는 것; 및 추정 클래스를 기초로 클래스 예측을 수행하고, 클래스 예측이 높은 예측검정력을 가지는지의 여부를 평가하여 추정 클래스가 유효한지 결정하는 것을 포함한다. 샘플의 군집화는 예를 들어, 자기조직화 지도에 따라 수행될 수 있다. 자기조직화 지도는 여러 노드 N 으로 형성되고, 지도는 경쟁적인 학습 루틴에 따른 벡터를 군집화시킨다. 경쟁적인 학습 루틴은 다음과 같다:

f_i ₊₁(N) = f_i(N) + τ(d(N,N_p),i) (P-f_i(N))

[식 중, i 는 반복 회수이고, N 은 자기조직화 지도의 노드이고, τ 는 학습 속도이고, P 는 대상 작업 벡터이고, d 는 거리이고, N_p 은 P 의 가장 인접하게 매핑된 노드이고, f_i(N) 은 i 일 때 N 의 위치임].

추정 클래스가 유효한지 여부를 결정하기 위해 본원에 기재된 가중표 도식을 만드는 단계를 수행할 수 있고, 클래스 예측을 샘플에 수행할 수 있다.

또한 본 발명은 개체에게서 수득한 샘플을 클래스로 분류하는 방법으로서, 하나 이상의 에피토프에 대한 자가항체 결합 항체의 샘플을 평가하고, 가중표 도식으로 만들어진 모델을 사용하고, 모델과 비교해 자가항체 결합 활성의 함수로서 샘플을 분류하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 개체에게서 수득한 샘플 분류용, 예를 들어 컴퓨터 시스템에서 사용하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 가중표 도식을 이용하여 만든 모델을 제공하고, 하나 이상의 에피토프에 대한 샘플의 자가항체 결합 활성을 평가하여 각 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성을 수득하고; 가중표 도식을 이용하여 만든 모델을 사용하고, 샘플의 자가항체 결합 활성을 모델에 비교하여 샘플을 분류하여, 분류를 수득하고; 분류의 결과 표시를 제공하는 것을 포함한다. 가 중표 도식 및 근접 분석을 위한 루틴은 본원에 기재된다. 본 방법은 샘플의 일련의 자가항체 결합 활성 수치를 나타내는 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 벡터를 컴퓨터 시스템에서 수령한 후 상기 단계를 거친다. 본 방법은 모델의 교차-타당성입증 (cross-validation) 수행을 추가로 포함한다. 모델의 교차-타당성입증은, 모델의 만드는데 사용한 샘플을 제거 또는 보류하고; 가중표 루틴을 사용하여, 제거되는 샘플을 제외하고 분류를 위한 교차-타당성입증 모델을 만들고; 교차-타당성입증 모델을 사용하여, 제거되는 샘플의 자가항체 결합 활성 수치와 교차-타당성입증 모델의 자가항체 결합 활성 수치와 비교하여, 제거되는 샘플을 이기는 클래스로 분류하고; 제거되는 샘플의 교차-타당성입증 모델 분류를 기초로 하여, 제거되는 샘플에 대한 이기는 클래스의 예측검정력을 측정하는 것을 수반한다. 본 방법은 추가로 유의적이지 않은 변화를 지니는 샘플에서 자가항체 결합 활성 수치를 필터링하여 제거하고, 벡터의 자가항체 결합 활성 수치를 정규화, 및/또는 재스케일링하는 것을 포함한다. 본 방법은 군집 (예, 형성된 작업 군집) 을 표시하는 결과를 제공하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한, 이전에 알려지지 않은 하나 이상의 클래스를 검정할 하나 이상의 샘플로 분류하여 확인하는 방법을 포함하는데, 여기서 샘플은 개체에게서 수득된다. 본 방법은 2 개 이상의 샘플에서 다수의 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성 수치를 수득하는 것; 각 벡터가 해당 샘플에서의 자가항체 결합 활성을 표시하는 일련의 자가항체 결합 활성 수치인 해당 벡터를 형성하는 것; 군집화 루틴을 사용하여 유사한 자가항체 결합 활성을 표시하는 벡터가 함께 군집화되도록 샘플의 벡터를 그룹화하여 (예, 자기조직화 지도를 사용) 작업 군집을 형성하고, 이 작업 군집이 하나 이상의 이전에 알려지지 않은 클래스를 정의하는 것을 포함한다. 이전에 알려지지 않은 클래스는 본원에 기재한 가중표 도식 방법을 사용하여 타당성입증 된다. 자기조직화 지도는 다수의 노드 N 으로 형성되고, 경쟁적 학습 루틴에 따라 벡터가 군집화된다. 경쟁적 학습 루틴은 다음과 같다:

f_i ₊₁(N) = f_i(N) + τ(d(N,N_p),i) (P-f =_i(N))

본 발명은 또한 특정 클래스 예측에 유용한 정보적인 에피토프의 수를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 클래스 구별과 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성의 상관관계를 측정하는 것, 및 에피토프가 정보적인 에피토프인지 결정하는 것을 수반한다. 한 구현예에서, 본 방법은 신호 대 잡음 루틴 사용을 수반한다. 에피토프가 정보적인 것으로 측정되면, 즉 유의적인 예측 수치를 가지면, 이는 정보적인 기타 에피토프와 조합될 수 있고, 클래스 예측에 대해 기재된 가중표 도식 모델에 따라 사용된다.

한 구현예에서, 제 1 클래스의 샘플에 걸친 2 개 이상의 에피토프의 평균 평균치 항체 결합 활성 (±SEM) 을 제 2 클래스의 샘플에 걸친 2 개 이상의 에피토프의 평균 평균치 항체 결합 활성 (±SEM) 과 비교하고, 양측 스튜던트 t-검정을 사 용한 근접 분석을 수행하여 정보적인 에피토프를 식별한다.

한 구현예에서, 본 발명은 샘플 간 클래스 구별과 상관관계가 있는 자가항체 결합 활성을 가지는 정보적인 에피토프의 집합을 식별하는 방법을 제공하는데, 이는 다음의 단계를 포함한다:

(a) 각 2 개 이상의 클래스에 대한 다수의 샘플에서 다수의 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성을 측정하는 단계;

(b) 다수의 샘플로부터의 동일한 샘플 클래스의 샘플 중에서 자가항체 결합 활성을 가지는 다수의 에피토프로부터 에피토프 군집을 식별하는 단계로서, 여기서 에피토프 군집은 다수의 샘플로부터의 상이한 클래스의 샘플 간의 클래스 구별과 상관관계가 있는 자가항체 결합 활성을 가짐; 및

(c) 상관관계가 우연히 기대되는 것보다 강한지를 측정하는 단계로서, 여기서 우연히 기대되는 것보다 강하게 클래스 구별과 상관관계가 있는 자가항체 결합 활성을 가지는 에피토프의 군집이 정보적인 에피토프의 집합임.

바람직한 구현예에서, 2 개 이상의 클래스 각각에 대한 다수의 샘플 중 다수의 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성을 사용하여 정보적인 에피토프의 집합을 식별하는데 패턴 인지 알고리즘을 사용한다. 패턴 인지 알고리즘은 샘플 중에서 클래스를 차별화하는데 사용될 수 있는 자가항체 결합 활성의 군집을 인지한다. 바람직한 구현예에서, 생성된 패턴의 타당성입증에 패턴 인지 알고리즘이 사용된다. 바람직한 구현예에서, 신경 회로망 패턴 인지 알고리즘이 사용된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 서포트 벡터 머신 알고리즘이 패턴 인지에 사용된 다. 소수의 샘플이 사용될 때, 서포트 벡터 머신 알고리즘이 바람직하게 사용된다. 구별해야할 임의의 클래스로부터의 샘플, 예로써 암 샘플 또는 대조군 샘플을 사용하여 훈련을 해볼 수 있다.

본 발명은 또한 샘플을 클래스로 분류하는 컴퓨터 장치에 관한 것으로, 여기서 샘플은 개체에게서 수득되고, 장치는 다음을 포함한다: 샘플의 자가항체 결합 활성 수치의 원천; 원천으로부터 자가항체 결합 활성 수치를 수취하기 위해 커플링 된 디지털 프로세서로 처리되는 프로세서 루틴, 샘플의 자가항체 결합 활성 수치에 가중표 도식을 이용하여 만든 모델 또는 패턴인지 알고리즘 및 훈련 샘플에 비교하여 분류를 결정하는 프로세서 루틴; 및 샘플의 분류의 표시를 제공하기 위해 디지털 프로세서에 커플링 된 결과 어셈블리. 모델은 본원에 기재된 가중표 도식을 이용하여 만들어지거나, 또는 패턴 인지 알고리즘 및 훈련 샘플을 사용하여 만들어진다. 결과 어셈블리는 분류의 디스플레이를 포함한다.

또 다른 구현예는 검정할 하나 이상의 샘플을 분류하기 위한 모델을 구축하는 컴퓨터 장치이고, 여기서 상기 장치는 2 개 이상의 클래스에 속하는 2 개 이상의 샘플로부터의 자가항체 결합 활성 수치에 대한 벡터의 원천을 포함하고, 벡터는 샘플의 일련의 자가항체 결합 활성 수치이고; 프로세서 루틴은 원천으로부터 자가항체 결합 활성 수치를 수취하기 위해 커플링 된 디지털 프로세서로 처리되고, 프로세서 루틴은 자가항체 결합 활성 수치를 기초로 샘플 분류와 관련이 있는 에피토프를 결정하고, 가중표 도식을 사용하여 관련된 에피토프의 일부로 모델을 구축한다. 장치는 유의적이지 않은 변화를 지니는 샘플에서 모든 자가항체 결합 활성 수치를 걸러내는, 원천과 프로세서 루틴 사이에 커플링 된 필터; 또는 자가항체 결합 활성 수치를 정규화하는, 필터에 커플링 된 정규화기를 추가로 포함할 수 있다. 결과 어셈블리는 그래프로 표현될 수 있다.

본 발명은 또한 검정할 하나 이상의 샘플 분류용 모델을 구축하기 위한 컴퓨터 장치를 포함하고, 여기서 모델은 패턴 인지 알고리즘 및 훈련 샘플을 사용하여 확립되는 자가항체 결합 활성 패턴을 기초로 한다.

본 발명에는 또한 샘플을 클래스로 분류하기 위한 기계로 읽을 수 있는 컴퓨터 어셈블리를 수반하며, 여기서 샘플을 개체로부터 수득되며, 컴퓨터 어셈블리는 샘플의 자가항체 결합 활성 수치의 원천을 포함하고; 프로세서 루틴은 원천으로부터 자가항체 결합 활성 수치를 수취하기 위해 커플링 된 디지털 프로세서로 처리되고, 프로세서 루틴은 가중표 도식으로 만들어진 모델과 샘플의 자가항체 결합 활성 수치를 비교하여 샘플의 분류를 결정하고; 집합은 샘플의 분류의 표시를 제공하기 위해 디지털 프로세서에 커플링 된다. 본 발명은 또한 검정할 하나 이상의 샘플 분류용 모델을 구축하기 위한 기계로 읽을 수 있는 컴퓨터 어셈블리를 포함하고, 여기서 컴퓨터 어셈블리는 2 개 이상의 클래스에 속하는 2 개 이상의 샘플로부터의 자가항체 결합 활성 수치에 대한 벡터의 원천을 포함하고, 벡터는 샘플에 대한 일련의 자가항체 결합 활성 수치이고; 프로세서 루틴은 원천으로부터 자가항체 결합 활성 수치를 수취하기 위해 커플링 된 디지털 프로세서로 처리되고, 프로세서 루틴은 샘플을 분류하기 위한 결정적인 관련된 에피토프를 결정하고, 가중표 도식을 사용하여 관련된 에피토프의 일부로 모델을 구축한다.

본 발명은 또한 디지털 프로세서로 처리되는 프로세서 루틴을 포함하는, 샘플을 클래스로 분류하기 위한 기계로 읽을 수 있는 컴퓨터 어셈블리를 포함하며, 여기서 프로세서 루틴은 패턴 인지 알고리즘 및 훈련 샘플을 사용하여 확립되는 자가항체 결합 활성 패턴을 기초로하는 모델에 샘플의 자가항체 결합 활성을 비교하여 샘플의 분류를 결정한다.

한 구현예에서, 본 발명은 질병을 지니는 개체를 위한 치료 계획을 결정하는 방법을 포함하고, 이는 다음을 포함한다: 개체에게서 샘플을 수득; 하나 이상의 에피토프에 대한 샘플의 자가항체 결합 활성 평가; 가중표 도식으로 만들어진 컴퓨터 모델을 사용하여, 모델의 자가항체 결합 활성에 대한 샘플의 자가항체 결합 활성의 함수로서, 샘플을 질병 클래스로 분류; 및 질병 클래스를 사용하여 치료 계획을 결정. 또 다른 적용은 샘플을 수득한 개체의 진단 또는 진단을 돕는 방법이고, 이는 다음을 포함한다: 하나 이상의 에피토프에 대한 샘플의 자가항체 결합 활성 평가; 및 가중표 도식으로 만들어진 컴퓨터 모델의 자가항체 결합 활성과 비교하여 샘플의 자가항체 결합 활성을 평가하는 것을 포함하여 샘플을 질병의 클래스로 분류; 및 개체의 진단 또는 진단을 돕는 것. 본 발명은 질병 클래스를 치료하도록 디자인된 약물의 효능을 측정하는 방법을 포함하는데, 여기서 개체에게 약물을 투여하고, 이 방법은 다음을 포함한다: 약물을 투여한 개체에게서 샘플을 수득; 하나 이상의 에피토프에 대한 샘플의 자가항체 결합 활성 평가; 및 가중표 도식으로 만들어진 모델을 사용하여, 모델의 자가항체 결합 활성과 비교한 샘플의 자가항체 결합 활성을 평가하는 것을 포함하여 샘플을 클래스로 분류. 또 다른 적용은 개체가 표현형 클래스에 속하는지 여부를 결정하는 방법으로서, 이는 다음을 포함한다: 개체에게서 샘플을 수득; 하나 이상의 에피토프에 대한 샘플의 자가항체 결합 활성 평가; 및 가중표 도식으로 만들어진 모델을 사용하여, 모델의 자가항체 결합 활성과 비교한 샘플의 자가항체 결합 활성을 평가하는 것을 포함하여 샘플을 클래스로 분류.

또 다른 구현예에서, 치료 계획의 결정 방법은 패턴 인지 알고리즘 및 훈련 샘플을 사용하여 확립되는 자가항체 결합 활성 패턴을 기초로하는 컴퓨터 모델을 사용하여 환자 샘플의 2 개 이상의 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성을 평가하는 것을 포함한다.

한 양태에서, 본 발명은 유방암 진단에 정보적인 에피토프의 집합을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 유방암 진단에 정보적인 에피토프의 집합을 제공하는데, 이는 도 2 에 기재되어 있는 것을 포함하는 군에서 선택되는 1 ~ 27, 더 바람직하게 2 ~ 27, 더 바람직하게 5 ~ 27, 더 바람직하게 10 ~ 27, 더 바람직하게 15 ~ 27, 더 바람직하게 20 ~ 27, 더 바람직하게 25 ~ 27 개의 정보적인 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 2 에 기재되어 있는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 2 에 기재되어 있는 것으로 본질적으로 이루어진다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 정보적인 에피토프의 집합을 제공하는데, 여기서 에피토프는 폐암, 특히 NSCLC 의 진단에 정보적이며, 도 2 에 기재되어 있는 것을 포함하는 군에서 선택되는 1 ~ 51, 더 바람직하게 2 ~ 51, 더 바람 직하게 5 ~ 51, 더 바람직하게 10 ~ 51, 더 바람직하게 15 ~ 51, 더 바람직하게 20 ~ 51, 더 바람직하게 25 ~ 51, 더 바람직하게 30 ~ 51, 더 바람직하게 35 ~ 51, 더 바람직하게 40 ~ 51, 더 바람직하게 45 ~ 51 개의 정보적인 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 2 에 기재되어 있는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 2 에 기재되어 있는 것으로 본질적으로 이루어진다.

한 양태에서, 본 발명은 NSCLC 및 SCLC 를 구별하는데 정보적인 에피토프의 집합을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 NSCLC 및 SCLC 를 구별하는데 정보적인 에피토프의 집합을 제공하는데, 이는 도 3 에 기재되어 있는 것을 포함하는 군에서 선택되는 1 ~ 28, 더 바람직하게 2 ~ 28, 더 바람직하게 5 ~ 28, 더 바람직하게 10 ~ 28, 더 바람직하게 15 ~ 28, 더 바람직하게 20 ~ 28, 더 바람직하게 25 ~ 28 개의 정보적인 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 3 에 기재되어 있는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 3 에 기재되어 있는 것으로 본질적으로 이루어진다.

한 양태에서, 본 발명은 NSCLC 및 SCLC 를 구별하는데 정보적인 에피토프의 집합을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 NSCLC 및 SCLC 를 구별하는데 정보적인 에피토프의 집합을 제공하는데, 이는 표 2 에 기재되어 있는 것으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ~ 51, 더 바람직하게 2 ~ 51, 더 바람직하게 5 ~ 51, 더 바람직하게 10 ~ 51, 더 바람직하게 15 ~ 51, 더 바람직하게 20 ~ 51, 더 바람직하게 25 ~ 51, 더 바람직하게 30 ~ 51, 더 바람직하게 35 ~ 51, 더 바람직하게 40 ~ 51, 더 바람직하게 45 ~ 51 개의 정보적인 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 표 2 에 기재되어 있는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 2 에 기재되어 있는 것으로 본질적으로 이루어진다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 폐암, 특히 NSCLC 의 진단에 정보적인 에피토프를 제공하며, 이는 표 11 에 기재되어 있는 것으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ~ 25, 더 바람직하게 2 ~ 25, 더 바람직하게 5 ~ 25, 더 바람직하게 10 ~ 25, 더 바람직하게 15 ~ 25, 더 바람직하게 20 ~ 25 개의 정보적인 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 11 에 기재되어 있는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 표 11 에 기재되어 있는 것으로 본질적으로 이루어진다.

한 양태에서, 본 발명은 특정 클래스 구별을 위한 정보적인 에피토프의 집합을 식별하는에 유용한 펩티드의 집합을 제공한다. 한 구현예에서, 펩티드의 집합은 표 1 에 기재된 펩티드의 군에서 선택되는 1 ~ 1448, 더 바람직하게 2 ~ 1448, 더 바람직하게 5 ~ 1448, 더 바람직하게 10 ~ 1448, 더 바람직하게 25 ~ 1448, 더 바람직하게 50 ~ 1448, 더 바람직하게 100 ~ 1448, 더 바람직하게 250 ~ 1448, 더 바람직하게 500 ~ 1448, 더 바람직하게 750 ~ 1448, 더 바람직하게 1000 ~ 1448, 더 바람직하게 1250 ~ 1448 개의 펩티드, 및/또는 표 10 에 기재된 펩티드의 군에서 선택되는 1 ~ 31, 더 바람직하게 2 ~ 31, 더 바람직하게 5 ~ 31, 더 바람직하게 10 ~ 31, 더 바람직하게 15 ~ 31, 더 바람직하게 20 ~ 31, 더 바람직하게 25 ~ 31 개의 펩티드, 및/또는 표 9 에 기재된 펩티드의 군에서 선택되는 1 ~ 83, 더 바람직하게 2 ~ 83, 더 바람직하게 5 ~ 83, 더 바람직하게 10 ~ 83, 더 바람직하게 15 ~ 83, 더 바람직하게 20 ~ 83, 더 바람직하게 25 ~ 83, 더 바람직하게 50 ~ 83, 더 바람직하게 75 ~ 83 개의 펩티드, 및/또는 표 8 에 기재된 펩티드의 군에서 선택되는 1 ~ 42, 더 바람직하게 2 ~ 42, 더 바람직하게 5 ~ 42, 더 바람직하게 10 ~ 42, 더 바람직하게 15 ~ 42, 더 바람직하게 20 ~ 42, 더 바람직하게 25 ~ 42, 더 바람직하게 30 ~ 42, 더 바람직하게 35 ~ 42 개의 펩티드, 및/또는 표 7 에 기재된 펩티드의 군에서 선택되는 1 ~ 52, 더 바람직하게 2 ~ 52, 더 바람직하게 5 ~ 52, 더 바람직하게 10 ~ 52, 더 바람직하게 15 ~ 52, 더 바람직하게 20 ~ 52, 더 바람직하게 25 ~ 52, 더 바람직하게 30 ~ 52, 더 바람직하게 35 ~ 52, 더 바람직하게 40 ~ 52, 더 바람직하게 45 ~ 52 개의 펩티드를 포함한다.

한 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에 대한 다수의 클래스를 구별하기 위한 에피토프 마이크로어레이를 제공하는데, 여기서 마이크로어레이는 다수의 펩티드를 포함하고, 각 펩티드는 다수의 특정 클래스에서 선택되는 특정 클래스의 샘플 특징에 해당하는 에피토프 결합 활성을 독립적으로 가지며, 모두 합쳤을 때 다수의 펩티드는 다수의 특정 클래스의 모든 샘플 종합 특징에 해당하는 에피토프 결합 활성을 가지고, 여기서 각 펩티드의 자가항체 결합 활성은 다수의 특정 클래스 중 어느 하나의 샘플 특징에서, 다수의 특정 클래스 중 다른 하나의 샘플 특징에서보다 독립적으로 높다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 생물학적 샘플을 제 1 클래스 및 제 2 클래스로 구별하기 위한 에피토프 마이크로어레이를 제공한다. 에피토프 마이크로어레이는 다수의 펩티드를 포함하고, 각 펩티드는 제 1 클래스의 샘플 특징 또는 제 2 클래스의 샘플 특징에 해당하는 에피토프 결합 활성을 독립적으로 가지며, 모두 합쳤을 때, 다수의 펩티드는 제 1 클래스 및 제 2 클래스의 샘플 종합 특징에 해당하는 에피토프 결합 활성을 가지고, 여기서 제 1 클래스 또는 제 2 클래스의 샘플 특징에서의 각 펩티드의 자가항체 결합 활성이 기타 클래스의 샘플 특징에서보다 독립적으로 높다.

바람직한 변별적인 클래스는 비질병 클래스 및 질병 클래스, 더 바람직하게 비암 클래스 및 암 클래스를 포함하고, 암 클래스는 바람직하게 폐암, 유방암, 위장 암 또는 전립선암이다. 기타 바람직한 변별적인 클래스는 위험이 높은 클래스 및 비질병 클래스, 바람직하게 위험이 높은 암 클래스 및 비암 클래스이다. 기타 바람직한 변별적인 클래스는 변별적인 암 클래스, 예컨대 변별적인 폐암 클래스, 예컨대 NSCLC 및 SCLC 이다. 기타 바람직한 변별적인 암 클래스는 전이성 암 및 비전이성 암 클래스이다.

바람직한 구현예에서, 에피토프 마이크로어레이의 2 개 이상의 펩티드는 단일 단백질의 변별적인 영역, 바람직하게 단백질의 비(非) 중복 영역에 해당한다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 폐암, 특히 NSCLC 의 진단에 유용한 에피토프 마이크로어레이를 제공하는데, 여기서 어레이는 표 11 에 기재되어 있는 것으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ~ 25, 더 바람직하게 2 ~ 25, 더 바람직 하게 5 ~ 25, 더 바람직하게 10 ~ 25, 더 바람직하게 15 ~ 25, 더 바람직하게 20 ~ 25 개의 정보적인 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 표 11 에 기재되어 있는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 표 11 에 기재되어 있는 것으로 본질적으로 이루어진다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 폐암, 특히 NSCLC 의 진단에 유용한 에피토프 마이크로어레이를 제공하는데, 여기서 어레이는 표 2 에 기재되어 있는 것으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ~ 51, 더 바람직하게 2 ~ 51, 더 바람직하게 5 ~ 51, 더 바람직하게 10 ~ 51, 더 바람직하게 15 ~ 51, 더 바람직하게 20 ~ 51, 더 바람직하게 25 ~ 51, 더 바람직하게 30 ~ 51, 더 바람직하게 35 ~ 51, 더 바람직하게 40 ~ 51, 더 바람직하게 45 ~ 51 개의 정보적인 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 표 2 에 기재되어 있는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 2 에 기재되어 있는 것으로 본질적으로 이루어진다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 유방암의 진단에 유용한 에피토프 마이크로어레이를 제공하는데, 여기서 어레이는 도 2 에 기재된 것으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ~ 27, 더 바람직하게 2 ~ 27, 더 바람직하게 5 ~ 27, 더 바람직하게 10 ~ 27, 더 바람직하게 15 ~ 27, 더 바람직하게 20 ~ 27, 더 바람직하게 25 ~ 27 개의 정보적인 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 2 에 기재된 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에 서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 2 에 기재된 것으로 본질적으로 이루어진다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 NSCLC 및 SCLC 를 구별하는데 유용한 에피토프 마이크로어레이를 제공하는데, 여기서 어레이는 표 2 에 기재된 것으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ~ 51, 더 바람직하게 2 ~ 51, 더 바람직하게 5 ~ 51, 더 바람직하게 10 ~ 51, 더 바람직하게 15 ~ 51, 더 바람직하게 20 ~ 51, 더 바람직하게 25 ~ 51, 더 바람직하게 30 ~ 51, 더 바람직하게 35 ~ 51, 더 바람직하게 40 ~ 51, 더 바람직하게 45 ~ 51 개의 정보적인 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 표 2 에 기재되어 있는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 2 에 기재되어 있는 것으로 본질적으로 이루어진다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 NSCLC 및 SCLC 를 구별하는데 유용한 에피토프 마이크로어레이를 제공하고, 여기서 어레이는 도 3 에 기재되어 있는 것으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ~ 28, 더 바람직하게 2 ~ 28, 더 바람직하게 5 ~ 28, 더 바람직하게 10 ~ 28, 더 바람직하게 15 ~ 28, 더 바람직하게 20 ~ 28, 더 바람직하게 25 ~ 28 개의 정보적인 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 3 에 기재되어 있는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 정보적인 에피토프의 집합은 도 3 에 기재되어 있는 것으로 본질적으로 이루어진다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 특정 클래스 구별을 위한 정보적인 에피토프를 식별하는데 유용한 에피토프 마이크로어레이를 제공한다. 에피토프 마이 크로어레이는 표 1 에 기재되어 있는 펩티드의 군에서 선택되는 1 ~ 1448, 더 바람직하게 2 ~ 1448, 더 바람직하게 5 ~ 1448, 더 바람직하게 10 ~ 1448, 더 바람직하게 25 ~ 1448, 더 바람직하게 50 ~ 1448, 더 바람직하게 100 ~ 1448, 더 바람직하게 250 ~ 1448, 더 바람직하게 500 ~ 1448, 더 바람직하게 750 ~ 1448, 더 바람직하게 1000 ~ 1448, 더 바람직하게 1250 ~ 1448 개의 펩티드, 및/또는 표 10 에 기재되어 있는 펩티드의 군에서 선택되는 1 ~ 31, 더 바람직하게 2 ~ 31, 더 바람직하게 5 ~ 31, 더 바람직하게 10 ~ 31, 더 바람직하게 15 ~ 31, 더 바람직하게 20 ~ 31, 더 바람직하게 25 ~ 31 개의 펩티드, 및/또는 표 9 에 기재되어 있는 펩티드의 군에서 선택되는 1 ~ 83, 더 바람직하게 2 ~ 83, 더 바람직하게 5 ~ 83, 더 바람직하게 10 ~ 83, 더 바람직하게 15 ~ 83, 더 바람직하게 20 ~ 83, 더 바람직하게 25 ~ 83, 더 바람직하게 50 ~ 83, 더 바람직하게 75 ~ 83 개의 펩티드, 및/또는 표 8 에 기재되어 있는 펩티드의 군에서 선택되는 1 ~ 42, 더 바람직하게 2 ~ 42, 더 바람직하게 5 ~ 42, 더 바람직하게 10 ~ 42, 더 바람직하게 15 ~ 42, 더 바람직하게 20 ~ 42, 더 바람직하게 25 ~ 42, 더 바람직하게 30 ~ 42, 더 바람직하게 35 ~ 42 개의 펩티드, 및/또는 표 7 에 기재되어 있는 펩티드의 군에서 선택되는 1 ~ 52, 더 바람직하게 2 ~ 52, 더 바람직하게 5 ~ 52, 더 바람직하게 10 ~ 52, 더 바람직하게 15 ~ 52, 더 바람직하게 20 ~ 52, 더 바람직하게 25 ~ 52, 더 바람직하게 30 ~ 52, 더 바람직하게 35 ~ 52, 더 바람직하게 40 ~ 52, 더 바람직하게 45 ~ 52 개의 펩티드를 포함한다.

한 구현예에서, 본 발명은 2 개 이상의 클래스를 구별하는데 유용한, 따라서 샘플의 분류를 예측하는데 유용한 에피토프 마이크로어레이를 제공하고, 이는 본원에 기재되는 방법을 사용하여 선택되는 클래스 구별을 위한 정보적인 에피토프의 집합을 포함한다.

도면의 간단한 설명

도 1. 에피토프 마이크로어레이 디자인. 두 개의 어레이를 동일한 혈청에 하이브리다이즈 시켰고, 펩티드-aAb 복합체를 (A) 알칼리성 인산효소 또는 (B) Cy3 에 컨쥬게이션시킨 2차 항-인간 Ig 컨쥬게이트로 검출하였다. 이러한 독립적인 두 가지 검출 방법을 사용하여 유사한 신호 패턴이 수득되었다. 따라서 에피토프 마이크로어레이는 상이한 검출 방법과 호환가능하다. (C) 데이터 정규화를 위해 IgG 를 연속 희석시켰다. PC - 포지티브 대조군; NC - 네가티브 대조군.

도 2. 유방암 정보적인 에피토프의 샘플 집합. 동일한 분산을 가정하여 양측 t-검정을 사용하고, I/D 신호 이분법을 기초로 2 개의 군으로 분류하여 유방암에 대한 정보적인 에피토프의 집합을 결정하였다. 실시예 부분에서 기재한 바와 같이 EB 및 EC 를 측정하였다.

도 3. 폐암 정보적인 에피토프의 샘플 집합. 스튜던트 t-검정을 사용한 후, I/D 신호 이분법을 기초로 2 개의 군으로 분류하여 폐암 정보적인 에피토프의 집합을 결정하였다. 실시예 부분에서 기재한 바와 같이 EN 및 ES 를 측정하였다.

도 4. 암 생존 데이터에 대해 이미 출판된 것 (Marcus 등, J Natl Cancer Inst. 92:1308-16 (2000) 참고) 과 비교한 본원 결과의 군집화.

도 5. 에피토프 평가 및 신호 분석. 각 환자 및 대조군 개체의 신호 강도를 5 의 단계로 표현한다. 짝 지은 에피토프 신호 비교를 각 개별 에피토프에 대해 수행한다. 오직 유의적으로 상이한 신호를 생성하는 (p ≤ 0.05) 에피토프 만이 2 개의 군을 차별화하는 마커 집합을 구성하는데 사용된다. 본 도에서 모든 에피토프는 유방암에 대해 정보적인 것으로 고려하는데, 이는 모두가 비암 대조군에 비해 유방암에서 유의적으로 상이한 신호를 생성하기 때문이다.

"자가항체 결합 활성" 및 "자가항체 결합 활성 수치" 는 주어진 샘플에서 주어진 에피토프와 자가항체 사이의 결합 상호작용의 측정치를 지칭하고, 이는 샘플중 에피토프-결합 자가항체의 양을 반영하는 반(半)정량화 측정치이다. 본원에서 사용되었듯이, "샘플의", "샘플 중", "샘플에서의", "샘플에 대한" 자가항체 결합 활성은 주어진 샘플에서 자가 항체 및 주어진 에피토프 사이의 결합 상호작용 측정치를 지칭한다.

본원에서 사용되는 "에피토프 결합 활성" 은 샘플 중 에피토프-결합 자가항체를 지칭한다. 특정 에피토프에 대한 "해당 에피토프 결합 활성" 은 특정 에피토프에 특이적으로 결합하는 자가항체이다.

"자가항체" ("aAB") 는 이를 생성하는 동일한 체(body) 의 성분과 특이적으로 결합한다. 개조된 혈청 자가항체 조성물은 유방암 (Metcalfe 등, Breast Cancer Res. 2:438-43 (2000)) 및 폐암 (Lubin 등, Nat Med. 1:701-2 (1995); Blaes 등, Ann Thorac Surg. 69:254-8 (2000); Gure 등, Cancer Res. 58:1034-41 (1998)) 을 포함하는 다수의 상이한 암, 및 전신홍반루푸스, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 피부병/다발근육염, 제 1 형 당뇨병, 신생물곁신경성 증후군, 염증성창자병 및 갑상선 내분비병증(chwarz, Autoimmunity and Autoimmune Disease, In: Fundamental Immunology, 3rd ed. (Ed. Paul WE) pp. 1033-99 Raven Press, New York, 1993 참고) 를 포함하는 기타 질병에서 확인되었다.

본원에 기재된 방법은 일반적으로 2 가지 분야와 관련이 있다: 클래스 예측 및 클래스 발견. 클래스 예측은 특정 샘플을 현재 상태, 소인 또는 미래 결과를 반영할 수 있는 정의된 클래스로 배정하는 것을 지칭한다. 클래스 발견은 이미 인지되지 않은 생물학적 클래스 하나 이상을 정의하는 것을 지칭한다.

한 양태에서, 본 발명은 샘플의 분류를 예측 또는 결정하는 것과 관련이 있고, 이는 샘플 중에서 클래스 구별과 상관관계가 있는 자가항체 결합 활성을 지니는 정보적인 에피토프의 집합을 식별하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 클래스 구별과 상관관계가 있는 모든 샘플에 걸쳐서 자가항체 결합의 정도로 에피토프를 분류한 후, 우연히 기대되는 것보다 상관관계가 강한지 (즉, 통계적 유의성) 결정하는 방법을 포함한다. 만약 자가항체 결합 활성과 클래스 구별 사이의 상관관계가 통계적으로 유의적이라면, 에피토프는 "정보적인" 또는 "관련된" 에피토프로 고려된다.

유전자 발현 프로파일을 기초로 한 관련된 분류 방법이 이미 기재되어 있다. 본원에 전체가 참고문헌으로 명백히 도입된 "Golub 등, U.S. Patent No. 6,647,341" 를 참고한다. 본 분류 도식 및 방법이 유전자 발현의 측정을 포함하지 않는다는 점에서 본 발명은 Golub 등에 기재된 것과는 현저하게 다르다. 반면 본 방법은 생물학적 샘플에서 자가항체가 펩티드 에피토프에 결합하는 것을 기초로 면역 상태를 측정하는 것을 포함한다. 본 발명은, 적절하게 정보적인 에피토프의 집합이 주어졌을 때, 샘플의 자가항체 결합 활성으로 증명되는 면역 상태가 생물학적 클래스 구별의 측면에서 매우 정보적임을 발견하는 것에서 유래된다.

일단 정보적인 에피토프의 집합이 확인되면, 각 정보적인 에피토프에 의해 제공되는 정보에 주어지는 가중치가 결정된다. 각 표(vote)는 새로운 샘플의 자가항체 결합 활성의 수준이, 특정 클래스로부터의 훈련 샘플의 자가항체 결합 활성의 통상적인 수준과 얼마나 유사한지를 측정한 것이다. 자가항체 결합 활성이 더 강하게 클래스 구별과 상관관계를 가지면, 에피토프에 의해 제공되는 정보에 주어지는 가중이 커진다. 다시 말하면, 만약 특정 에피토프에 대한 자가항체 결합이 클래스 구별과 강한 상관관계가 있으면, 샘플이 속하는 클래스를 결정하는데 에피토프는 큰 가중치를 지닐 것이다. 반대로, 만약 특정 에피토프에 대한 자가항체 결합이 클래스 구별과 약한 상관관계가 있으면, 샘플이 속하는 클래스를 결정하는데 작은 가중치를 지닐 것이다. 정보적인 에피토프의 집합로부터의 사용되는 각 정보적인 에피토프에는 가중치가 배정된다. 정보적인 에피토프의 완전 집합이 사용될 필요는 없고; 총 정보적인 에피토프의 요구되는 부분집합이 사용될 수 있다. 이 방법을 사용하면, 가중표 도식이 결정될 수 있고, 정보적인 에피토프의 집합으로 클래스 구별을 위한 예측변수 또는 모델을 창안해낼 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는, 정보적인 에피토프에 대한 샘플의 자가항체 결합 활성을 평가하여, 생물학적 샘플을 공지된 클래스 또는 추정 클래스 (즉, 클래스 예측) 에 배정하는 것을 포함한다. 각 정보적인 에피토프에 있어서, 하나 이상의 기타 클래스의 표는 샘플의 자가항체 결합 활성을 기초로 결정된다. 각 표는 상기한 가중표 도식에 따라 가중치가 주어지고, 가중표의 합계를 내어서 샘플에 대한 이기는 클래스를 결정한다. 이기는 클래스는 가장 많은 표를 얻은 클래스로 정의된다. 임의로, 이기는 클래스에 대한 예측검정력 (PS) 또한 결정할 수 있다. 예측검정력은 이기는 클래스의 승리의 마진이고, 이는 0 내지 1 범위이다. 한 구현예에서, PS 가 특정 역치 (예, 0.3) 을 초과할 때만 이기는 클래스에 샘플이 배정될 수 있고; 다른 경우 평가가 불확실한 것으로 고려된다.

다른 구현예에서, 패턴 인지 알고리즘은 특정 클래스의 훈련 샘플 특징과 함께 사용된다. 사용되는 샘플의 특정 클래스는 서로 구별되어야 할 것 중 하나 일 수 있다. 예를 들어 암 클래스의 샘플 특징, 또는 비암 클래스의 샘플 특징은 패턴 인지 알고리즘과 함께 사용되어 암과 비암 샘플을 구별하는데 유용한 모델을 만들 수 있다.

한 구현예에서, 서포트 벡터 머신 알고리즘이 사용된다. 또 다른 구현예에서, 신경 회로망 알고리즘이 사용된다. 바람직하게, 만약 소수의 훈련 샘플이 사용되면 서포트 벡터 머신 알고리즘이 사용된다.

본 발명의 다른 구현예는 자가항체 결합 활성을 기초로 샘플을 군집화시킴으로써 샘플로부터 2 개 이상의 클래스를 발견 또는 확인하여 추정 클래스를 수득 (즉, 클래스 발견) 하는 방법과 관련이 있다. 추정 클래스는 상기한 바와 같이 클래스 예측 단계를 수행하여 확인된다. 바람직한 구현예에서, 방법 중 하나 이상의 단계는 적합한 프로세싱 수단, 예를 들어 컴퓨터를 사용하여 수행된다.

한 구현예에서, 본 발명의 방법은 특이적 질병 클래스 또는 특이적 질병 클래스 내 하부클래스로 샘플을 분류하는데 사용된다. 본 발명은, 비제한 적으로 암, 자가면역 질병, 전염성 질병, 신경변성 질병 등을 포함하는 사실상 모든 질병, 상태 또는 증후군의 샘플을 분류하는데 유용하다. 즉, 본 발명은 샘플이 특이적 질병 범주 (예, 비암의 반대, 폐암 발현 위험율이 높은 것의 반대로서, 존재하는 폐암) 및/또는 특이적 질병 내의 클래스 (예, 비소세포 폐암 ("NSCLC") 클래스의 반대인 소세포 폐암 ("SCLC") 클래스) 에 속하는지 (분류되는지) 를 결정하는데 사용될 수 있다.

본원에 사용되는 "클래스" 및 "하부클래스" 라는 용어는 하나 이상의 특징을 공유하는 군을 의미한다. 예를 들어 질병 클래스는 넓은범위 (예, 증식성 장애), 중간범위 (예, 암) 또는 좁은 범위 (예, 폐암) 일 수 있다. "하부클래스" 라는 용어는 클래스를 추가로 정의 또는 차별화하는 것이다. 예를 들어 폐암의 클래스에서, NSCLC 및 SCLC 는 하부클래스의 예인 반면; NSCLC 및 SCLC 는 또한 그 자체로 클래스로 고려될 수 있다. 이러한 용어들은 군 멤버의 수에 특정 제한을 부여하고자 하는 것이 아니다. 오히려, 이는 생물학적으로 구별되는, 군의 상이한 집합 또는 부분집합을 조직화하는 것을 돕기 위한 것이다.

본 발명은 또한 거의 모든 범주 또는 반응을 통해 샘플 간의 클래스 또는 하부클래스를 식별하는데 사용될 수 있고, 그러한 범주 또는 반응을 통해 주어진 샘플을 분류하는데 사용될 수 있다. 한 구현예에서 클래스 또는 하부클래스는 이미 알려져 있다. 예를 들어 본 발명은, 바이러스성 (예, HIV, 인간 유두종 바이러스, 수막염) 또는 세균성 (예, 클라미디아, 포도구균, 연쇄구균) 감염에 취약한 개체 대 이러한 감염에 덜 취약한 개체로부터의 샘플을, 자가항체 결합 활성을 기초로하여 분류하는데 사용될 수 있다. 본 발명은, 비제한적으로 암, 비만, 당뇨, 고혈압, 화학요법에 대한 반응 등을 포함하는 모든 표현형 또는 생리적인 특성을 기초로 샘플을 분류하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 이미 공지되지 않은 생물학적 클래스를 식별하는데 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 클래스 예측은 연구되는 질병 유형 또는 클래스를 가지는 것으로 알려진 개체로부터의 샘플과 이러한 질병을 가지지 않는 또는 질병의 상이한 유형 또는 클래스를 가지는 개체로부터의 샘플을 사용하여 수행된다. 이는 표현형의 전체 범위에 걸쳐 자가항체 결합 활성 패턴을 평가할 수 있는 능력을 제공한다. 분류 모델은 이러한 샘플의 자가항체 결합 활성을 이용하여 상기 방법에 따라 만들어진다.

한 구현예에서, 샘플 중 자가항체 결합 활성이 예측되는 클래스 구별과 상관관계를 가지는, 정보적인 또는 관련된 에피토프의 집합을 식별함으로써 이러한 모델이 만들어진다. 예를 들어, 에피토프는 그 자가항체 결합 활성과 클래스 구별의 상관관계 정도에 따라 분류되고, 이 데이터를 평가하여 관찰된 상관관계가 우연히 기대되는 것 (예, 통계적 유의성) 보다 강한지 여부를 결정한다. 만약 특정 에피토프에 대한 상관관계가 통계적으로 유의적이라면, 에피토프는 정보적인 에피토프로 고려된다. 만약 상관관계가 통계적으로 유의적이지 않다면 에피토프는 정보적인 에피토프로 고려되지 않는다.

자가항체 결합 활성과 클래스 구별 사이의 상관관계 정도는 여러 방법을 통해 평가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 각 에피토프는 다음과 같은 자가항체 결합 활성 벡터로 표시된다:

v(g) = (a₁, a₂, . . . , a_n)

[식 중, a_i은 샘플의 초기 집합 (S) 중 i 번째 샘플의 에피토프 g 의 자가항체 결합 활성을 나타냄].

클래스 구별은 다음과 같은 이상화된 자가항체 결합 활성 패턴으로 표시된다:

c = (c₁, c₂, . . . , c_n)

[식 중, c_i 는 i 번째 샘플이 클래스 1 또는 클래스 2 에 속하는지에 따라 +1 또는 0 임].

에피토프와 클래스 구별 사이의 상관관계는 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 적절한 방법은 예를 들어 피어슨 상관계수 r(g,c) 또는 정규화 벡터 사이의 유클리드 거리 d(g*,c*) (식 중, 벡터 g* 및 c* 은 평균치 0 또는 표준 편차 1 을 가지도록 정규화된 것임) 를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 에피토프를 예측변수로서 사용할 경우, 상관관계는 "신호 대 잡음" 비율을 강조하는 상관관계의 측정치를 사용하여 평가한다. 본 구현예에서 (μ₁(g), σ₁(g)) 및 ((μ₂(g), σ₂(g)) 는 각각 클래스 1 및 클래스 2 중 샘플에 대한 에피토프 g 의 자가항체 결합 수치의 log₁₀ 의 평균치 및 표준 편차를 나타낸다.

P(g,c) = (μ₁(g) - μ₂(g)) / (σ₁(g) + σ₂(g)) 는 클래스 내 표준 편차에 대한 클래스 간의 차이를 반영한다. ｜P(g,c)｜의 수치가 크면 자가항체 결합 활성과 클래스 구별 사이의 상관관계가 강하다는 것을 지시하는 반면, ｜P(g,c)｜의 수치가 작으면 자가항체 결합 활성과 클래스 구별 사이의 상관관계가 약하다는 것을 지시한다. P(g,c) 의 부호가 양수 또는 음수인 것은 클래스 1 또는 클래스 2 중의 자가항체 결합 활성이 더 큰 것에 각각 해당한다. 표준 피어슨 상관계수와는 달리 P(g,c) 는 범위 [-1,+1] 에 제한되지 않음을 주의해야 한다. 만약 N₁(c,r) 이 P(g,c) ≥ r 인 유전자의 집합을 나타내고, N₂(c,r) 이 P(g,c) ≤r 인 에피토프를 나타낸다면, N₁(c,r) 인 에피토프의 집합을 나타낸다면, N₁(c,r) 및 N₂(c,r) 은 클래스 1 및 클래스 2 주위의 반지름 r 의 근접이다. 근접에서 에피토프의 수가 특히 많으면 다수의 에피토프가 클래스 벡터와 밀접한 상관관계를 가짐을 지시한다.

관찰된 상관관계가 우연히 기대되는 것보다 강한지 여부의 평가는 가장 바람직하게 "근접 분석" 을 사용하여 수행된다. 이 방법에서 한 클래스에서 균일하게 높고, 기타 클래스에서는 균일하게 낮은 자가항체 결합 활성에 해당하는 이상화된 패턴이 정의되고, 동등한 랜덤 패턴보다 이상화된 패턴에 "가까운" 또는 "근접한", 즉 더 유사한 자가항체 결합 활성이 특히 높은지를 검정한다. 가까운 자가항체 결합 활성의 밀도가 기대보다 통계적으로 유의하게 높은 지의 결정은 차이의 통계적 유의성을 결정하는 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 한 방법은, c 의 좌표 순열에서 수득한 랜덤 클래스 구별에 해당하는 이상화된 패턴 주변의 유사한 근접에서 자가항체 결합 활성의 수와 근접 (가까운) 자가항체 결합 활성의 수를 비교하는 순열 검정이다.

평가한 샘플은 에피토프-결합 자가항체를 함유할 수 있는 임의의 샘플일 수 있다. 바람직한 샘플은 개체로부터의 혈청 샘플이다. 또한 바람직한 것은 활액 및 뇌척수액의 샘플이다. 본원에 기재된 방법을 사용하여, 다수의 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성을 동시적으로 측정할 수 있다. 여러 자가항체 결합 활성의 평가 (자가항체 프로파일) 는 샘플의 더 정확한 평가를 제공할 수 있는데, 이는 샘플 분류를 도울 수 있는 자가항체 결합 활성이 더 많기 때문이다.

자가항체 결합 활성은 예를 들어 샘플과 적합한 에피토프 마이크로어레이를 접촉시키고, 샘플 중 자가항체와 마이크로어레이 상의 에피토프의 결합 정도를 측정하여 수득된다. 샘플의 자가항체 결합 활성이 수득되면 이를 모델에 대해 비교 또는 평가한 후, 샘플을 분류한다. 샘플의 평가는, 연구되는 특정 클래스에 샘플이 배정될 수 있는 지의 여부를 결정한다.

측정 또는 평가된 자가항체 결합 활성은 자가항체 결합 활성 수준을 측정할 수 있는 장치로부터 수득되는 수치이다. 자가항체 결합 활성 수치는 본원에 기재된 바와 같이 주어진 에피토프에 대해 검출된 자가항체 결합의 양을 지칭한다. 수치는 장치로부터 나온 미가공 수치, 또는 임의적으로 재스케일링(rescaling), 필터링한 및/또는 정규화한 수치이다. 이러한 데이터는 예를 들어 형광측정법-기초 또는 비색측정법 자가항체 검출 기술을 사용한 에피토프 마이크로어레이 플랫폼으로부터 수득된다.

데이터는 임의적으로 하기의 조합을 사용하여 제조될 수 있다: 데이터 재스케일링, 데이터 필터링 및 데이터 정규화. 실험 또는 조건에서의 변수가 되도록 자가항체 결합 활성 수치를 재스케일링 할 수 있고, 또는 전체 어레이 강도에서 작은 차이를 조정하도록 재스케일링 할 수 있다. 이러한 변수는 연구자가 선택하는 실험 디자인에 의존한다. 데이터의 생성은 종종 자가항체 결합 활성 수치를 군집화 하기 전에 수치를 필터링 및/또는 정규화하는 것을 포함한다.

자가항체 결합 활성 수치의 필터링은, 샘플에 걸쳐 자가항체 결합 활성 수치의 변화가 없거나 또는 유의적이지 않은 변화를 지니는 모든 벡터를 제거하는 것을 포함한다. 일단 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성이 필터되면, 남는 에피토프/자가항체 결합 활성의 부분집합은 "작업 벡터" 로 지칭된다.

본 발명은 또한 자가항체 결합 활성 수준을 정규화하는 것을 포함한다. 자가항체 결합 활성 수준의 정규화가 항상 필요한 것은 아니고, 자가항체 결합 활성과 클래스 구별 사이의 상관관계를 측정하는데 사용되는 유형 또는 알고리즘에 따른다. 자가항체 결합 활성의 절대 수준보다는 특정 클래스에 대한 상관관계 자가항체 결합 활성의 정도가 더 중요하다. 정규화는 하기 수식에 따라 수행된다:

NV = (ABV - AABV) / SDV

[식 중, NV 는 정규화 수치, ABV 는 샘플에 걸친 자가항체 결합 활성 수치, AABV 는 샘플에 걸친 평균치 자가항체 결합 활성 수치, 및 SDV 는 자가항체 결합 활성 수치의 표준 편차임].

일단 자가항체 결합 활성 수치가 준비되면, 데이터는 분류되거나, 또는 분류를 위한 모델을 만드는데 사용된다. 분류와 관련이 있는 에피토프가 첫 번째로 결정된다. "관련된 에피토프" 라는 용어는 자가항체 결합 활성이 클래스 구별과 상관관계가 있는 에피토프를 지칭한다. 분류와 관련이 있는 에피토프는 또한 본원에서 "정보적인 에피토프" 로 지칭된다. 자가항체 결합 활성과 클래스 구별 사이의 상관관계는 예로써 근접 분석과 같은 다양한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 근접 분석은 순열 검정을 수행하고, 랜덤 클래스 구별의 근접과 비교하여 클래스 구별의 근접에서 유전자의 수의 확률을 결정하는 것을 포함한다. 근접의 크기 또는 반지름은 거리척도를 사용하여 측정된다. 예를 들어 근접 분석에 피어슨 상관계수, 유클리드 거리 계수 또는 신호 대 잡음 계수를 이용할 수 있다. 관련된 에피토프된 에피토프는 예를 들어, 한 클래스에서 균일하게 높고, 기타 클래스(들) 에서는 균일하게 낮은 자가항체 결합 활성에 해당하는 이상화된 자가항체 결합 활성 패턴을 정의하는 근접 분석을 사용하여 측정된다. 하나의 클래스와 기타 클래스에서의 자가항체 결합 활성의 수준을 비교할 때 자가항체 결합 활성의 불일치가 존재한다. 이러한 에피토프는 자가항체 결합 활성을 기초로 샘플을 평가 및 분류하는데 양호한 지표가 된다. 한 구현예에서, 근접 분석은 하기 신호 대 잡음 루틴을 이용한다:

P(g,c) = (μ₁(g) - μ₂(g)) / (σ₁(g) + σ₂(g))

[식 중, g 는 주어진 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성 수치이고; c 는 클래스 구별이고, μ₁(g) 은 제 1 클래스에 대한 g 의 자가항체 결합 활성의 평균치이고; μ₂(g) 는 제 2 클래스에 대한 g 의 자가항체 결합 활성의 평균치이고; σ₁(g) 는 제 1 클래스에 대한 g 의 표준 편차이고; σ₂(g) 는 제 2 클래스에 대한 g 의 표준 편차임]. 본 발명은 샘플을 하나 또는 두 개의 클래스로 분류하는 것, 또는 다중 (다수의) 클래스로 분류하는 것을 포함한다.

특히 관련된 에피토프는 샘플 분류에 가장 적합한 것이다. 관련된 에피토프의 결정 단계는 또한 클래스의 발현과 잠재적으로 관련된 면역성 단백질 (예, 발병기전과 관련된 단백질) 을 식별하는데 사용될 수 있는 항체를 분리하는 수단을 제공한다. 결과적으로 본 발명의 방법은 또한 자가항체와 결합하는 에피토프와 특이적으로 결합하는 면역성 단백질을 기초로 약물 목표(들)을 결정하는 것에 대한 것이고, 연구되는 클래스 (예, 질병), 및 상기 방법으로 결정된 약물 자체도 포함된다.

에피토프 분류의 다음 단계는 검정할 샘플을 분류하는데 사용될 수 있는 모델 또는 예측변수를 만들거나 또는 구축하는 것을 포함한다. 분류가 이미 확인된 샘플을 사용하여 모델을 만들고, 이는 본원에서 "초기 데이터집합" 이라고 지칭한다. 일단 모델이 만들어지면, 이후 검정할 샘플을 모델과 비교하여 평가한다 (예, 모델의 자가항체 결합 활성과 비교한 상대적인 샘플의 자가항체 결합 활성의 함수로를 이용하여 분류함).

상기한 바와 같이 결정된 관련된 에피토프의 일부를 선택하여 모델을 만들 수 있다. 모든 에피토프가 사용될 필요는 없다. 모델을 만드는데 사용되는 관련된 에피토프의 수는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 클래스 구별과 자가항체 결합 활성의 상관관계가 높은 1000 개의 에피토프 중 25, 50, 75 또는 100 초과의 이러한 에피토프가 모델을 만드는데 사용될 수 있다.

모델 또는 예측변수는 "가중표 도식" 또는 "가중표 루틴" 을 사용하여 만들어진다. 가중표 도식은 이러한 정보적인 에피토프가 하나 이상의 클래스에 가중표를 내도록 한다. 표의 규모는 자가항체 결합 활성 수준, 및 클래스 구별과 자가항체 결합 활성의 상관관계의 정도 모두에 의존한다. 하나의 클래스와 다음 클래스 사이의 자가항체 결합 활성 불일치 또는 차이가 크면, 에피토프가 내는 표가 더 클 것이다. 더 큰 차이가 있는 에피토프가 클래스 구별을 위한 더 나은 지표이고, 따라서 더 큰 표를 낸다.

상기 모델은 하기 가중표 루틴에 따라 만들어진다:

V _g = a_g (x_g - b_g)

[식 중, V_g 는 에피토프 g 에 대한 가중표이고, a_g 는 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성 수치와 클래스 구별 사이의 상관관계이고, P(g,c) 는 상기 정의와 같이 제 1 클래스 및 제 2 클래스 중 평균 log₁₀ 자가항체 결합 활성 수치의 평균치인 b_g = (μ₁(g) + μ₂(g)) / 2 이고; x_g 은 검정할 샘플 중 log₁₀ 자가항체 결합 활성 수치임]. 양수 가중표는 제 1 클래스 중 새로운 샘플의 멤버십이고, 음수 가중표는 제 2 클래스 중 새로운 샘플의 멤버십이다. 제 1 클래스에 대한 총 표 V₁ 는 정보적인 에피토프에 대한 양수 표의 절대 수치를 합하여 수득되는 반면, 제 2 클래스에 대한 총 표 V₂ 는 정보적인 에피토프에 대한 음수 표의 절대 수치를 합하여 수득된다.

예측검정력을 측정하여, 검정할 샘플의 모델을 분류하는 신뢰도를 결정할 수 있다. 예측검정력은 샘플 분류의 신뢰도를 나타내고, 샘플을 분류할 수 없음을 평가한다. 샘플을 검정하였지만 특정 클래스에 속하지 않는 경우도 있을 수 있다. 이는 역치를 이용하여 이루어지고, 여기서 정해진 역치 미만의 점수를 가지는 샘플은 분류될 수 없는 샘플이다 (예, "노 콜(no call)"). 예를 들어 만약 샘플이 2 개의 폐암 클래스 중 하나에 속하는 샘플인지를 결정하기 위해 모델이 만들어졌으나, 샘플은 폐암이 없는 개체에게서 취해졌다면 샘플은 "노 콜" 일 것이고, 분류될 수 없을 것이다. 예측검정력 역치는, 비제한적으로 "노 콜" 에 대비한 거짓 양수 분류의 수치를 포함하는 공지된 인자를 기초로 당업자가 결정할 수 있다.

일단 모델이 만들어지면, 모델의 타당성을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 검정할 수 있다. 모델의 타당성을 검정하는 한 방법은 데이터집합의 교차-타당성입증을 통한 것이다. 교차-타당성입증을 수행하기 위해서 샘플 중 하나를 제거하고 상기한 바와 같이 모델을 만들고 (제거된 샘플 없이), "교차-타당성입증 모델" 을 형성한다. 이후 제거된 샘플을 상기한 바와 같이 모델에 의해서 분류한다. 이 방법은 초기 데이터 집합의 모든 샘플에 대해 수행되고, 오류율이 측정된다. 이후 모델의 정확성을 평가한다. 이 모델은 공지된 클래스에 대해서 또는 클래스 발견을 통해 이미 확인된 또는 확립된 클래스에 대해서, 검정할 샘플을 높은 정확도로 분류해야한다. 모델 타당성입증의 또 다른 방법은 모델을 독립적인 데이터집합을 응용하는 것이다. 미래에 공지될 또는 개발될 기타 표준 생물학적 또는 의학적 연구 기술을 사용하여 클래스 발견 또는 클래스 예측을 타당성입증할 수 있다.

본 발명은 또한 특정 클래스 예측에 유용한 정보적인 에피토프의 수를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성과 클래스 구별의 상관관계를 결정하고, 에피토프가 정보적인 에피토프인지 결정하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 본 방법은 신호 대 잡음 루틴의 용도를 포함한다. 만약 에피토프가 정보적인 것으로 결정되면, 즉, 유의적인 예측 수치를 가지면, 이는 기타 정보적인 에피토프와 조합되어 클래스 예측에 대해 상기한 가중표 도식 모델에 따라 사용된다.

본 발명은 또한 특정 생물학적 클래스 구별에 있어서 에피토프가 정보적인지의 여부를 결정하는데 대안적인 수단을 제공한다. 예를 들어 한 구현예에서, 제 1 클래스의 샘플에 걸친 2 개 이상의 에피토프에 대한 평균 평균치 항체 결합 활성 (±SEM) 은 제 2 클래스의 샘플에 걸친 2 개 이상의 에피토프에 대한 평균 평균치 항체 결합 활성 (±SEM) 와 비교되고, 양측 스튜던트 t-검정을 실시하여 정보적인 에피토프를 식별한다.

본 발명의 한 양태는 또한 이전에 공지되지 않은 클래스를 확인 또는 발견하는 것 또는 미리 가정한 클래스의 타당성입증을 포함한다. 이 방법은 본원에서 "클래스 발견" 으로 지칭된다. 본 발명의 이 구현예는 클래스 또는 미리 알려지지 않은 클래스들을 결정하고, 클래스 결정의 타당성입증 (예, 클래스 결정이 정확한지 확인하는 것) 을 포함한다.

미리 알려지지 않은 또는 인지되지 않은 클래스를 확인하기 위해서, 또는 다른 발견을 기초로 제안된 클래스의 타당성입증을 위해서, 자가항체 결합 활성을 기초로 샘플은 그룹화 또는 군집화 된다. 샘플의 자가항체 결합 활성 패턴 (즉, aAB 프로파일) 및 유사한 자가항체 결합 활성 패턴을 가지는 샘플이 함께 그룹화 또는 군집화 된다. 샘플의 그룹 또는 군집이 클래스를 식별한다. 이러한 군집화 방법론은, 그 자가항체 결합 활성 패턴을 기초로 클래스가 상이한 임의의 클래스를 식별하는데 적용될 수 있다.

이미 알려지지 않은 클래스의 결정은 군집화 루틴을 사용하는 본 방법을 통해 수행된다. 본 발명은 미리 알려지지 않은 클래스를 확인하기 위해 여러 군집화 루틴, 예컨대 베이스(Bayesian) 군집화, k-평균 군집화, 계층적 군집화 및 자기조직화 지도 (SOM) 군집화를 사용할 수 있다.

일단 자가항체 결합 활성 수치가 생성되면, 데이터를 군집화 또는 그룹화한다. 본 발명의 한 양태는 클래스를 확인하기 위해 자가항체 결합 활성 패턴에 대해 SOM 군집화, 경쟁적 학습 루틴을 이용한다. SOM 은 "관련된" 군집 또는 클래스를 정의하는 근접 노드와 함께 데이터에 구조를 부여한다.

SOM 은 먼저 "노드" 의 기하체계를 선택하여 구축된다. 바람직하게 2 차원 그리드 (예, 3x2 그리드) 가 사용되나, 기타 기하체계도 사용될 수 있다. 노드들은 초기에 랜덤하게 이후 상호작용하면서 조절되도록 k-차원 공간에 매핑된다. 각 반복은 벡터를 무작위로 선택하고, 노드들을 벡터 방향으로 이동시키는 것을 포함한다. 최근접 노드들이 가장 많이 움직이는 반면, 기타 노드들은 초기 기하체계에서 최근접 노드로부터의 거리에 따라 더 적은 양으로 움직인다. 이러한 방식으로 초기 기하체계에서 근접점은 k-차원 공간에서 가까운 점에 매핑되는 경향이 있다. 본 과정은 수차례 반복되면서 계속된다 (예, 20,000 ~ 50,000 회).

SOM 에서 노드의 수는 데이터에 따라 가변적이다. 예를 들어 사용자는 더 많은 군집을 수득하기 위해 노드의 수를 증가시킬 수 있다. 적당한 수의 군집은 샘플의 더 양호하고 더 변별적인 특정 군집화를 가능하게 한다. 그리드 크기는 노드의 수에 대응된다. 예를 들어 3x2 그리드는 6 개의 노드를 포함하고, 4x5 그리드는 20 개의 노드를 포함한다. SOM 알고리즘이 자가항체 결합 활성 데이터를 기초로 적용되므로, 수회 반복되면서 노드들이 샘플 군집을 향해 이동한다. 노드의 수는 군집의 수와 직접 연관된다. 따라서 노드의 수를 증가시키면 군집의 수가 증가된다. 노드의 수가 너무 적으면 변별적이지 않은 패턴이 생성된다. 부가적인 군집은 변별적이고 조밀한 자가항체 결합 활성 군집을 야기한다. 이 점을 초과하는 더 많은 군집의 첨가는 근본적으로 새로운 패턴을 야기하지 않는다. 예를 들어 3x2 그리드 또는 4x5 그리드 및/또는 6x7 그리드를 선택할 수 있고, 결과를 연구하여 가장 적합한 그리드 크기를 결정한다.

자가항체 결합 활성 벡터에 따라 샘플을 군집화시킬 수 있는 다양한 SOM 알고리즘이 존재한다. 본 발명은 임의의 SOM 루틴 (예, 자가항체 결합 활성 패턴을 군집시키는 경쟁적 학습 루틴), 바람직하게 하기 SOM 루틴을 사용한다:

f_i ₊₁(N) = f_i(N) + τ(d(N,N_p), i) (P-f_i(N))

[식 중, i 는 반복 횟수이고, N 은 자기조직화 지도의 노드이고, τ 는 학습율이고, P 는 대상 작업 벡터이고, d 는 거리이고, N_p 는 P 의 가장 인접하게 매핑된 노드이고, f_i(N) 는 i 에서 N 의 위치임].

군집화 루틴을 사용하여 일단 샘플이 클래스로 그룹화되면, 추정 클래스는 타당성입증 된다. 샘플의 분류 단계 (예, 클래스 예측) 는 클래스를 검증하는데 사용될 수 있다. 상기한 바와 같은 가중표 도식을 기초한 모델은 클래스 발견이 수행되는 동일한 샘플로 부터의 자가항체 결합 활성 데이터를 사용하여 만들어진다. 이러한 모델은, 클래스가 적당하게 결정 또는 확인되었을 때, (예, 교차-타당성이브ㅈㅇ 및 독립적인 샘플 분류를 통해) 잘 수행할 것이다. 만약 새로 발견된 클래스가 적당하게 결정되지 않으면, 모델은 (예, 다수의 클래스에 의해 예측되는 것보다 불량하게) 잘 수행하지 않을 것이다. 선택된 클래스 발견 방법에 의해 발견된 모든 클래스의 짝은 비교될 수 있다. 각 짝 C₁, C₂, S 는 C₁ 또는 C₂ 과 함께 샘플의 집합이다. 클래스 멤버십 (C₁ 또는 C₂) 은 S 에서 각 샘플에 대해서 상기한 교차-타당성입증 방법을 통해 예측된다. 평균 PS (｜S｜ 예측 초과) 는 주어진 데이터에서 얼마나 클래스 구별이 예측 가능한지의 척도이다. 낮은 평균 PS 수치 (예, 0.3 근처) 는 허위 클래스 구별 또는 진짜 구별을 지지하기에는 데이터의 양이 불충분함을 나타낸다. 높은 평균 PS 수치 (예, 0.8) 는 강하고, 예측가능한 클래스 구별을 나타낸다.

상기 클래스 발견 기술은 암과 같은 임의의 장애의 기본적인 하부유형을 식별하는데 사용될 수 있다. 클래스 발견 방법은 또한 암의 변별적인 유형을 초월하는 기본적인 면역 기작을 조사하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상이한 암 (예, 유방 종양 및 전립성 종양) 을 단일 데이터집합으로 조합할 수 있고, 에피토프 결합 활성을 기초로 샘플을 군집화시킬 수 있다. 게다가 바람직한 구현예에서, 본원에 기재되는 클래스 예측변수는 본원에 기재한 적합한 에피토프 마이크로어레이와 함께 임상 집합에 적응시킬 수 있다.

샘플의 분류는 의료 제공자에게, 다중 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성의 분석 또는 평가를 기초로 샘플이 속하는 분류의 정보를 제공한다. 본 방법은, 전통적인 검정에서 하나 또는 두 개의 마커를 분석하는 것에 반해, 다중 자가항체 결합 활성 또는 마커를 분석하기 때문에 전통적인 검정보다 더 정확한 평가를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 정보는 단독으로 또는 기타 시험 결과와 결합되어 의료 제공자가 개체를 진단하는 것을 돕는다.

또한 본 발명은 치료 계획을 결정하는 방법을 제공한다. 일단 의료 제공자가 샘플, 따라서 개체가 질병 클래스에 속하는지 안다면, 의료 제공자는 개체에ㄱ게 적절한 치료 계획은 결정해 줄 수 있다.

상이한 질병 클래스에는 종종 상이한 치료가 요구된다. 적절하게 진단 및 이해된 개체의 질병의 클래스는 더 양호하고 더 성공적인 치료 및 예후를 가능하게 한다.

본 발명의 기타 적용은 특정 약물 또는 식이요법으로 성공적인 치료를 할 수 있는 개체의 클래스 확인 또는 분류를 포함한다. 약물의 효능을 결정하는데 관심이 있는 사람은 본 발명의 방법을 이용할 수 있다. 약물의 연구 또는 치료의 검정이 진행되는 동안, 질병을 지니는 개체는 또한 약물 또는 치료에 반응할 수도 있고, 반응하지 않을 수 있다. 검정할 약물을 투여하였고, 치료에 대한 반응을 예정한 개체에게서 샘플을 수득하였다. 상기한 가중표 도식을 사용하여 관련된 에피토프의 일부로 모델을 만들 수 있다. 검정할 샘플을 이후 모델과 비교하여 평가하고, 치료가 성공적일지 성공적이지 않을지를 기초로 분류할 수 있다. 약물을 검정하는 회사는 약물이 가장 유용할 수 있는 개체의 클래스에 대한 더 정확한 정보를 제공할 수 있다. 이 정보는 또한 의료 제공자가 개체에게 최상인 치료 계획을 결정하는데 도움을 준다.

본 발명의 또 다른 적용은 개체에게서 특정 질병 또는 상태가 발현될 가능성을 결정하기 위해 개체로부터의 샘플을 분류하는 것이다. 예를 들어 심장 질병 또는 고혈압이 나타나기 쉬운 개체는 이러한 질병으로 고생할 가능성이 적은 사람과는 상이한 자가항체 결합 활성 프로파일을 가질 수 있다. 상기 방법을 사용한 모델은 심장 질병 또는 고혈압을 가지는 개체로부터 만들어지고, 가중표 도식을 사용하지 않는 모델을 만들 수 있다. 일단 모델이 만들어지면, 개체로부터의 샘플을 모델과 비교하여 검정 또는 평가하여 샘플이 어느 클래스가 속하는지 결정할 수 있다. 질병을 지니는 개체의 클래스에 속하는 개체는 예방 수단 (예, 운동, 아스피린 등) 을 취할 수 있다. 심장 질병 및 고혈압이 분류될 수 있는 질병의 예이지만, 본 발명은 암의 소인을 포함한 거의 모든 질병에 대한 샘플을 분류하는데 사용될 수 있다.

질병에 대한 소인을 식별 및 예측하기 위한 바람직한 구현예는, 특정 질병 상태를 가지지는 않지만 위험이 높은 개체로부터의 샘플로 상기한 방법을 사용하여 가중표 도식 모델을 만드는 것을 포함한다. 이러한 개체의 예는 폐암을 지니지 않은 장기간 높은 빈도의 흡연자일 수 있고, 또는 가족성 질병의 발생을 예측할 수 있는 계통의 가족원이지만 질병을 지니지 않은 사람일 수 있다. 일단 모델이 만들어지면, 개체로부터의 샘플을 모델과 비교해 검정 및 평가하여, 샘플이 속하는 클래스를 결정한다. 질병 소인을 가지는 개체의 클래스에 속하는 개체는 예방 수단 (예, 운동, 아스피린, 금연 등) 을 취할 수 있다.

더 일반적으로 클래스 예측변수는 다양한 세팅에서 유용할 수 있다. 첫 번째로, 알려진 병리 범주에 대해, 종양의 세포 기원, 단계 또는 등급을 반영하는 클래스 예측변수를 구축할 수 있다. 이러한 예측변수는 진단 확인을 제공하거나, 이례적인 경우를 명확히 할 수 있다. 두 번째로, 클래스 예측 기술은 미래 임상 결과, 예컨대 약물 반응 또는 생존률과 연관되는 구별에 적용될 수 있다.

에피토프 마이크로어레이

한 양태에서, 본 발명은 어레이에 부착된 자가항체-결합 펩티드 (에피토프) 의 위치가 표시되는 어레이인 에피토프 마이크로어레이를 제공한다. 어레이는 2 내지 수천개의 에피토프, 더 바람직하게 10 ~ 1,500, 더 바람직하게 20 ~ 1,000, 더 바람직하게 50 ~ 500 개의 에피토프를 포함한다. 사용되는 에피토프는 바람직하게 약 3 ~ 약 20, 더 바람직하게 약 15 개 길이의 아미노산이고, 다른 길이의 에피토프도 사용될 수 있다. 결합 제제, 바람직하게 샘플에 존재하는 자가항체에 특이적으로 결합하는 2차 항체를 사용하여 어레이의 에피토프에 특이적으로 결합하는 자가항체의 존재를 검출한다. 검출 제제는 에피토프 어레이와 항온배양하기 전에 바람직하게 검출가능한 표지 (예, ³²P, 비색 지표 또는 형광 표지) 로 표지한다.

자가항체 검출 및 에피토프 마이크로어레이에 사용되는 에피토프의 선택은 요구되는 클래스 구별에 따른다. 대안적으로 랜덤 펩티드의 집합이 사용될 수 있고, 집합내의 정보적인 에피토프가 상기한 방법으로 식별될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 진단에 유용한 에피토프 마이크로어레이를 제공하고, 이러한 마이크로어레이에 존재하는 펩티드는 하기 도식을 기초로 디자인된 집합에서 선택된다. 배아 조직에서 발현되는 단백질에 해당하는 집합의 에피토프 첫 번째 군, 및 이상 발현이 있는 성인의 조직은 체액성 면역을 유발시킬 수 있다. 이는 배아 발생에서 활성이고, 종양 세포에 발현되면서 면역 반응을 유도하는 전사 인자 (TF) 를 포함한다. 예를 들어 SOX-패밀리 전사 인자의 멤버에 대한 aAb 를 소세포 폐암 (SCLC) 환자의 혈청에서 식별되었다 (Gure 등, 상기한 바와 동일). 발생되는 신경계에서 정상적으로 발현되는 SOX-패밀리 TF 의 멤버는 보통 발생되는 신경계에서 발현되고, 및 그 발현은 정상 폐 상피에서는 나타나는 것이 기록되지 않다 (Gure 등, 상기한 바와 동일). 또한 배아 신경계에서 역할을 하는 기본 헬릭스-루프-헬릭스 (bHLH) 패밀리 TF 의 멤버의 발현은 NSCLC 및 SCLC 에 나타난다고 기록되어 있다 (Chen 등, Proc Natl Acad Sci USA. (1997) 94:5355-60).

부가적으로, 암 진단 에피토프 마이크로어레이에는, 바람직하게 이미 발행된 B-세포 에피토프, 및 클래스 Ⅱ 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 의 다양한 아이소형에 결합되는 것으로 예측되는 에피토프가 도입된다. 공개적으로 입수가능한 MHC Ⅱ 결합 알고리즘, 예컨대 ProPred 및 RankPept 가 사용될 수 있다. 에피토프 디자인에 있어서, 암과 연관이 있는 자가항체를 가지는 단백질에 특별한 관심을 보이고 있다. 이는 p53 및 다양한 SOX, FOX, IMP, ELAV/HU 및 기타 패밀리의 멤버를 포함한다 (Tan, J Clin Invest. (2001) 108:1411-5). 또한 바람직하게 암 진단 마이크로어레이에 포함되는 것은, T-면역과 B-면역 사이에 중복되는, T-세포 반응을 유도하는 것으로 알려진 에피토프를 포함한다 (Scanlan 등, Cancer Immun. (2001) 1:4; Chen 등, Proc Natl Acad Sci USA. (1998) 95:6919-23). 공지된 T-세포 에피토프의 우수한 모음은 Cancer Immunity 데이터베이스에 존재한다. 따라서 매우 바람직한 암 진단 에피토프 마이크로어레이는 이미 확인된 면역성 서열과 상기한 배아 인자 에피토프 디자인을 조합한 것이다. 펩티드는 합성되어, 공지된 방법을 통해 마이크로어레이에 프린트될 수 있다. 예를 들어 상기한 Robinson 등의 문헌을 참고한다.

유방암의 진단을 위해 바람직한 정보적인 에피토프는 도 2 에 기재된 것을 포함한다.

NSCLC 과 SCLC 를 구별하는 바람직한 정보적인 에피토프는 도 3, 7 및 13 에 기재된 것을 포함한다.

NSCLC 의 진단을 위해 바람직한 정보적인 에피토프는 도 7 및 13 에 기재된 것을 포함한다.

클래스 구별 예측용으로서 정보적인 에피토프를 선택하기 위해 바람직한 에피토프는 도 6, 7, 9, 10, 11, 12 및 13 에 기재된 것을 포함한다.

한 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플의 다수의 클래스를 구별하기 위한 에피토프 마이크로어레이를 제공하고, 여기서 마이크로어레이는 다수의 펩티드를 포함하며, 각 펩티드는 다수의 특정 클래스로부터 선택되는 특정 클래스의 샘플 특징에 해당하는 에피토프 결합 활성을 독립적으로 가지고, 이를 종합하면 다수의 펩티드는 다수의 샘플의 종합적인 특징에 해당하는 에피토프 결합 활성을 가지며, 여기서 각 펩티드의 자가항체 결합 활성은 독립적으로 다수의 특정 클래스 중 하나의 샘플 특징에서, 다수의 특정 클래스 중 기타 샘플의 특징에서 더 높다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 생물학적 샘플에 있어서 제 1 클래스 및 제 2 클래스를 구별하기 위한 에피토프 마이크로어레이를 제공한다. 에피토프 마이크로어레이는 다수의 펩티드를 포함하고, 각 펩티드는 제 1 클래스의 샘플 특징 또는 제 2 클래스의 샘플 특징에 해당하는 에피토프 결합 활성을 독립적으로 가지며, 이를 종합하면 다수의 펩티드는 제 1 클래스 및 제 2 클래스의 종합적인 특징 샘플 중에서 에피토프 결합 활성에 해당하는 에피토프를 가지며, 여기서 각 펩티드의 자가항체 결합 활성은 제 1 클래스 또는 제 2 클래스의 샘플 특징에서, 기타 클래스의 샘플 특징 중 그 자가항체 결합 활성보다 독립적으로 높다.

한 구현예에서, 본 발명은 다수의 펩티드를 포함하는 에피토프 마이크로어레이를 제공하고, 각 펩티드는 첫 번째 샘플 또는 두 번째 샘플에 해당하는 에피토프 결합 활성을 가지며, 여기서 각 펩티드의 자가항체 결합 활성은 두 번째 샘플과 비교하여 첫 번째 샘플에서 더 높거나 낮고, 여기서 첫 번째 샘플 및 두 번째 샘플이 변별적인 클래스에 해당한다.

바람직한 구현예에서, 에피토프 마이크로어레이의 상의 적어도 첫 번째 펩티드는, 제 2 클래스에 해당하는 두 번째 샘플에서의 자가항체 결합 활성과 비교하여 제 1 클래스에 해당하는 첫 번째 샘플에서의 자가항체 결합 활성이 더 높고, 에피토프 마이크로어레이의 적어도 두 번째 펩티드는 제 1 클래스에 해당하는 첫 번째 샘플에서의 자가항체 결합 활성과 비교하여 제 2 클래스에 해당하는 두 번째 샘플에서의 자가항체 결합 활성이 더 높다.

각 펩티드는 클래스 구별과 상관관계가 있는 자가항체 결합 활성을 나타내는 에피토프 마이크로어레이에 포함되지만, 임의의 특정 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성이 검출되는 빈도수는 낮을 수 있고, 특정 클래스의 샘플 특징 중 특정 에피토프-결합 자가항체를 검출할 가능성은 낮을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 에피토프는 상기한 바와 같이 조합으로 사용될 때 진단에 유용하다.

바람직한 변별적인 클래스는 비질병 클래스 및 질병 클래스, 더 바람직하게 비암 클래스 및 암 클래스를 포함하고, 암 클래스는 바람직하게 폐암, 유방암, 위장 암, 또는 전립선암이다. 기타 바람직한 변별적인 클래스는 위험이 높은 클래스 및 비질병 클래스, 바람직하게 위험이 높은 암 클래스 및 비암 클래스이다. 기타 바람직한 변별적인 클래스는 변별적인 암 클래스, 예컨대 변별적인 폐암 클래스, 예컨대 NSCLC 및 SCLC 이다. 기타 바람직한 변별적인 클래스는 전이성 암 및 비전이성 암 클래스이다.

바람직한 구현예에서, 에피토프 마이크로어레이의 2 개 이상의 펩티드는 단일 단백질의 변별적인 영역, 바람직하게 단일 단백질의 중복되지 않는 영역에 해당한다.

상기한 바와 같이, 단일 단백질의 상이한 단편에 해당하는 에피토프는 한 샘플과 상이한 클래스로부터의 샘플들 사이의 그 결합 활성에서 차이를 지닐 수 있다. 이론에 종속되지 않으면서, 동일한 단백질에 해당하는 에피토프들의 자가항체 결합 활성 차이는 부분적으로, 클래스 구별에 기여하는 단백질 변형 및 그에 따른 에피토프 변형에 의한 것일 수 있다. 배아 전사 인자를 인코딩하는 mRNA 를 포함하는 다수의 mRNA 의 스플라이스 변형체가 다양한 암에서 식별되었다는 것이 이를 뒷받침한다.

한 구현예에서, 어레이의 하나 이상의 펩티드는, 제 2 클래스에는 부재하거나 또는 주류가 아니며, 제 1 클래스의 특정 유전자의 전사물에 있어서는, 존재 또는 주된, 대안적으로 스플라이싱된 mRNA 의 단백질 생성물과 특이적으로 결합하는 항체에 대응한다.

본원의 에피토프 마이크로어레이의 적어도 첫 번째 펩티드는, 제 2 클래스에 해당하는 두 번째 샘플의 자가항체 결합 활성과 비교하여 제 1 클래스에 해당하는 첫 번째 샘플에서 자가항체 결합 활성이 더 높고, 에피토프 마이크로어레이의 적어도 두 번째 펩티드는, 제 1 클래스에 해당하는 첫 번째 샘플의 자가항체 결합 활성과 비교하여 제 2 클래스에 해당하는 두 번째 샘플에서 자가항체 결합 활성이 더 높다. 따라서 두 개의 변별적인 클래스 사이에서, 각 클래스에서 더 높은 자가항체 결합 활성을 가지는 것이 본 발명의 바람직한 마이크로어레이로 검출된다. 암 진단에 있어서, 바람직한 암 진단 마이크로어레이는 암 샘플에서보다 비암 샘플에서 더 높은 자가항체 결합 활성을 검출할 수 있는 에피토프를 포함하고, 또한 비암 샘플 보다 암 샘플에서 더 높은 자가항체 결합 활성을 검출할 수 있는 에피토프를 포함하는데, 후자 에피토프는 암 환자에서 종양-관련 항원의 출현에 잠재적으로 기여한다.

일단 어레이-결합 에피토프에 자가항체가 결합, 및 고정된 자가항체에 검출제제가 결합하면, 결합의 패턴을 검출하는 스캐너에 어레이를 넣는다. 어레이에 결합된 검출제제의 표지된 기에서 나오는 빛으로 자가항체 결합 데이터를 수집할 수 있다. 어레이 상의 각 에피토프의 위치를 알고 있기 때문에 특정 자가항체 결합 활성이 측정된다. 스캐너로 검출된 빛의 양은 본 발명이 적용 및 이용하는 미가공 데이터가 된다. 에피토프 어레이는 미가공 자가항체 결합 활성 데이터를 수득하는 하나의 예에 지나지 않는다. 자가항체 결합 활성을 측정하는 기타 방법은 당업계에 공지되어 있고, (예, ELISA, 파지 디스플레이 등) 또는 미래에 개발될 방법도 본 발명에 사용될 수 있다.

펩티드 에피토프 및 마이크로어레이 제조

본원에서 사용되는 펩티드는 개질된 펩티드, 예컨대 포스포펩티드를 포함한다. 펩티드는 당업계에서 인정되는 여러 원천 중 임의의 것에서 유도될 수 있다. 예를 들어, 랜덤 펩티드는 당업계에 공지된 발현 시스템을 통해 생성될 수 있다. 펩티드는 광범위한 단백질 단편들로부터 생성될 수 있다. 바람직하게 펩티드는 당업계에 공지된 방법에 따라 합성된다. 예를 들어, "Methods in Enzymology, Volume 289: Solid-Phase Peptide Synthesis, J. Abelson 등, Academic Press, 1st edition, November 15, 1997, ISBN 0121821900" 를 참고한다. 바람직한 구현예에서, Perkin-Elmer Applied Biosystems 433A 펩티드 합성기를 사용하여 펩티드를 합성하고, 이는 개질된 펩티드의 합성을 가능하게 한다.

에피토프 마이크로어레이는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어 "Protein Microarray Technology, D. Kambhampati (ed.), John Wiley & Sons, March 5, 2004, ISBN 3527305971", "Protein Microarray, M. Schena, Jones & Bartlett Publishers, July, 2004, ISBN 0763731277" 및 "Protein Arrays: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), E. Fung, Humana Press, April 1, 2004, ISBN 158829255X" 를 참고한다. 바람직한 구현예에서, Perkin Elmer 사제 Piezorray Non-contact Spotting System 을 사용설명서에 따라 사용할 수 있다.

샘플 원천 및 조작

샘플은 자가항체를 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 바람직한 샘플은 혈액, 혈장, 뇌척수액 및 활액을 포함한다.

혈액은 정맥천자를 통해 각 개체에게서 수집할 수 있다. 혈액 혈청 또는 혈장을 준비하는데 0.1 ~ 0.5 ml 이 사용될 수 있다. 채혈 직후 혈청을 준비할 수 있다. 튜브를 실온에서 4 시간 동안 정치시킨 후, 170 x g 에서 5 분 동안 원심분리하여 혈청을 제거할 수 있다. 혈청을 분취한 후, - 20 ℃ 에 저장할 수 있다. 혈액 샘플에 EDTA (최종 농도 5 mM) 를 첨가하여 혈장을 준비할 수 있다. 혈액 샘플을 170 x g 에서 5 분 동안 원심 분리한 후, 상등액을 제거해내어 - 20 ℃ 에 저장할 수 있다.

[표 1] 정보적인 에피토프

1,448 개의 에피토프가 기재되고, 해당 단백질 명칭, Genbank 등록 번호 및 펩티드 사이트가 기재되어 있다. 이러한 에피토프를 자가항체 프로파일의 초기 집합으로 사용할 수 있다. 이 중, 1,253 개가 폐암 샘플에서 자가항체 결합 활성을 측정하기 위한 초기 집합으로서 사용되었다.

[표 2]

표 1 의 1,448 개의 펩티드 에피토프의 집합 중에서, NSCLC, SCLC 및 대조군을 구별하는데 정보적인 것으로 결정된 51 개의 펩티드 에피토프가 기재되어 있다. 실시예 참고.

표 3 내지 6 에는 표 2 의 51 개의 에피토프를 NSCLC, SCLC 및 대조군 샘플에 사용한 자가항체 프로파일 결과가 기재되어 있다. 실시예 참고.

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6]

[표 7]

자가항체 프로파일링에 사용될 수 있는, 분화 항원에 해당하는 부가적인 에피토프를 기재한다.

[표 8]

자가항체 프로파일링에 사용될 수 있는, 종양에서 과발현된 항원에 해당하는 부가적인 에피토프를 기재한다.

[표 9]

자가항체 프로파일링에 사용될 수 있는, 다양한 종양 유형에서 발현된 항원에 해당하는 부가적인 에피토프를 기재한다.

[표 10]

자가항체 프로파일링에 사용될 수 있는, 돌연변이를 통해 생성되는 종양 항원에 해당하는 부가적인 에피토프를 기재한다.

[표 11]

표 1 의 1,448 개의 펩티드 에피토프 중에서 25 개의 바람직한 폐암 결정적 에피토프를 기재한다.

[표 12]

표 11 의 25 개의 에피토프를 NSCLC 대조군 샘플에 사용하여 자가항체 프로파일링한 결과를 기재한다. 실시예 참고.

유방암 및 폐암에 대해 파일럿 연구를 수행하였다. 본 유방암 연구에서, 16 명의 유방암 환자 및 성별을 매치시킨 비암 대조군 16 명의 개체에서 혈청 aAB 구성을 측정하였다. 폐암 연구를 NSCLC 및 SCLC 혈청의 비교 연구로서 수행하였는데, 이는 이러한 2 가지 지배적인 폐암 유형 사이의 차이를 검출하기 위함이다. 이러한 2 가지 파일럿 연구는 에피토프의 동일한 집합에 대해 동시적으로 수행하였다. 이러한 집합은 135 개의 상이한 단백질을 나타내는 428 개의 상이한 에피토프를 포함한다. 정보적인 에피토프를 증가/감소된 (I/D) 신호 이분법을 기초로 2 개의 군으로 분류하였다. 간단하게, 근접 분석을 이용하여 유방암에 대해서 암 대 비암 비교를 실시하고, 폐암에 대해서 NSCLC 대 SCLC 비교를 수행하였다. 대규모 유전자-발현 연구 (Golub 등, Science (1999) 286:531-7) 에서 채택된 이러한 방법은 정보적인 펩티드 에피토프를 식별한다. 정보적인 에피토프는 하나의 군의 환자 혈청을 기타 환자군의 혈청과 비교하였을 때, 유의적으로 상이한 신호를 발생시키는 에피토프이다.

유방암 : 정보적인 에피토프

유방암 파일럿 연구를 통해 증가/감소된 (I/D) 이분법을 보이는 27 개의 정보적인 에피토프의 집합을 생성하였다 (도 2). 흥미롭게, 비암 대조군과 비교하여 유방암에서 증가된 신호를 생성하는 에피토프의 부분집합보다 감소된 신호를 생성하는 에피토프의 부분집합이 컸다. 정보적인 에피토프의 두 가지 부분집합에 있어서, EB 대 EC 비교를 통해 크게 유의적인 p-수치가 측정되었다 (도 2).

정보적인 유방암 에피토프에 대한 I/D-이분법이 유의적으로 불균일하다. 분류되지 않은 정보적인 에피토프에 대해 측정한 결과 EB 는 EC 보다 유의적으로 작았다 (각각 22±0.8 대 30±1.3; p = 0.00000183). 따라서 정보적인 유방암 에피토프로 확인되었듯이, 혈청 aAB 으로 인비트로 면역 반응을 생성하는 펩티드 에피토프의 능력은 비암 대조군과 비교하여 유방암에서 더 작다 (도 2). 이 결과는 유방암 혈청이 대조군 혈청보다 낮은 역가의 aAB 또는 낮은 친화성 aAB 를 포함함을 지시하는 것으로 해석된다. 사실, 유방암에서 "인비트로 면역 반응" 의 "사라짐" 은 약해지는 B-세포 면역을 나타내는 것으로 가정한다. 그럼에도 불구하고, 항-종양 체액성 면역 반응이 유방암에서 나타난다고 판단하는데, 이는 유방암 혈청 중에서 유의적으로 증가된 인비트로 면역 반응을 생성하는 정보적인 에피토프의 하위집합을 검출하였기 때문이다 (도 2).

폐암 : NSCLC 대 SCLC : 정보적인 에피토프

폐암 파일럿 연구를 통해 NSCLC 및 SCLC 를 구별하는 혈청 aAB 특징을 가지는 28 개의 정보적인 에피토프를 생성하였다. 정보적인 유방암 에피토프와 유사하게, 정보적인 폐암 에피토프도 유의적으로 불균일한 I/D-이분법을 지녔다 (도 3). 특이적으로, ES 는 EN 보다 유의적으로 작았다 (28.4±1.0 대 32.5±0.9; p = 0.006). 본 유방암 연구 및 암 생존률에 대해 발행된 데이터를 고려하면, 하기 가정을 할 수 있다: 유방암 및 SCLC 에서 감소된 정보적인 에피토프 강도 [E] 평균치는, 다른 참고 군과 비교하였을 때 유방암 및 SCLC 환자에서 약화된 면역 상태를 지시한다. 이러한 약화된 면역 상태는 각각 비암 대조군 및 NSCLC 환자와 비교하였을 때, 유방암 및 SCLC 에서의 불량한 생존률을 설명한다. Mayo Lung Project 에서 증명되었듯이, NSCLC 와 비교한 SCLC 에서의 생존률 중간값은 더 짧고, 5 년 생존률은 더 낮다 (Marcus 등, J Natl Cancer Inst. (2000) 92:1308-16). 또한 상기 가정의 관점에서, 비암 개체는 일반적으로 암 환자보다 더 양호한 기대 수명을 가지기 때문에, EB 및 EC 와 비교한 ES 및 EN 사이에 나타나는 차이가 작은 것이 타당하다.

에피토프 마이크로어레이는 정보적인 암 에피토프 중 더 상위인 것을 밝혀냄

(i) 중복되는 정보적인 에피토프

상기 두 파일럿 연구를 통해 중복되는 것을 밝혀내었다 (도 4). 유방암 및 폐암 모두에 정보적인 3 개의 에피토프를 검출하였다 (도 4). 흥미롭게, 중복되는 에피토프 3 개 모두는 암 생존률에 대한 발행된 지식과 관련하여 동일한 I/D-이분법을 지닌다. 특이적으로, ZFP-200 는 각각 비암 대조군 및 NSCLC 과 비교하여 유방암 및 SCLC 모두에서 증가된 신호를 생성하고; MAGE4a/14 및 SOX2/5 는 비암 대조군 및 NSCLC 과 비교하여 유방암 및 SCLC 에서 감소된 신호를 생성했다.

(ii) 중복되는 정보적인 단백질

또한 중복되지는 않지만 동일한 단백질을 표현하는 정보적인 에피토프를 검출하였다 (도 4). 4 개의 단백질 MAGE4a, NY-ESO, SOX-1 및 SOX-2 로 부터의 중복되지 않는 에피토프는 유방암 및 폐암 모두에 대해 정보적인 신호를 생성하였다. 발행된 암 생존률 데이터 (Marcus 등, J Natl Cancer Inst. (2000) 92:1308-16) 와 관련하여 이러한 4 개의 단백질 모두의 I/D-이분법은 생존률이 더 낮은 군에서 모두 감소된 감소된 인비트로 면역 반응성을 보였다. 따라서, 정보적인 에피토프 및 단백질 모두의 군집화는 암 유형과 관련이 있는 aAB 를 밝혀내고, 잠재적으로 공통적인 병원 기작을 밝혀내는 것이 에피토프 마이크로어레이를 사용함으로써 가능함을 보인다.

에피토프 타당성입증

본원의 암 에피토프 마이크로어레이를 사용하여, (1) 배아 조직에서 발현된 전사 인자 (Gure 등 상기한 바와 동일; Chen 등, (1997) 상기한 바와 동일), (2) 암에서 B-세포 반응을 일으키는 것으로 알려진 단백질 (Tan, 상기한 바와 동일, Lubin, 상기한 바와 동일), 및 (3) 종양 특이적 세포용해성 T-세포를 활성화시키는 것을 알려진 배아/고환/종양에서 특이적인 단백질 (Van Der Bruggen 등, Immunol Rev. (2002) 188:51-64; Boon 등, Annu Rev Immunol. (1994) 12:337-65) 에 집중하였다. 본 파일럿 연구가 지시하듯이, 이러한 접근은 유방암 및 폐암 모두에 대해서 정보적인 에피토프에 SOX-패밀리 (배아 특이적 전사 인자) 의 멤버, p53, IMP 및 HuD-패밀리 (암에서 B-세포 반응의 유도자로 알려짐) 의 멤버 및 종양/고환/암 단백질, 예컨대 MAGE 및 NY-ESO 패밀리의 멤버가 포함된다는 것을 발견하는 성과를 내었다 (도 2 ~ 4).

에피토프 신호 분석

정보적인 에피토프를 결정하기 위해 근접 분석 (Golub 등, 상기한 바와 동일) 을 사용하였다. 데이터 분석에 신호 빈도수 및 강도를 포함하였다. 하나의 군에서의 특이적 에피토프 당 신호 강도의 평균 평균치±SEM 은 에피토프 신 호로 지칭된다. 에피토프를 평가하기 위해서, 에피토프 신호에 대해 동일한 분산을 가정한 양측 스튜던트 t-검정을 수행하였다 (도 5). 양측 비교에서 유의적으로 상이한 에피토프 신호를 생성하는 모든 에피토프를 정보적인 에피토프로 고려하였다. 도 5 에서의 예는 에피토프의 평가를 나타낸다. 에피토프 신호 이외에, 하기 끝점을 계산하고, 데이터 분석을 평가하였다:

ΣP - 개체 검정 대상 당 모든 정보적인 에피토프에 대한 복합 신호 강도;

E - 환자 군 당 평균치 정보적인 에피토프 강도;

E = [ΣP1 +...+ ΣPn / N] ± SEM

[식 중, N 은 군 중 환자의 수를 나타냄] (도 5).

이러한 파라미터는 분류되지 않은 데이터 및 분류된 데이터 모두에 대해서 계산된다.

신호 검출 및 수량화

알칼리성 인산효소 ("AP")-기재 비색측정법 및 Cy3-기재 형광측정법에 대한 예비 비교 실험은 배경에 대한 신호의 비율이 AP 대신 Cy3 가 사용될 때 그 크기가 10 배 정도 더 큰 것을 나타낸다 (데이터 나타내지 않음). 이 결과는 형광-기재 표지가 전통적인 색 생성 표지보다 더 동적인 신호 범위를 생성한다는 것을 지시하는 이전 연구와 일치한다 (Boon 등, 상기한 바와 동일).

존재하는 비색측정법-기재 데이터는 99 % 경우 중 최대 범위 3 을 가진다. 비색 데이터를 기초로 한 에피토프 중요성의 과소 평가 및 과대 평가를 감소시키기 위해 근접 분석을 사용하여 Cy3-형광-기재 실험을 수행하였다. 다소 상이한 정보적인 에피토프 집합이 발생될 수 있다. 민감도가 높기 때문에, 어세이당 적은 양의 혈청이 요구되는 것이 형광측정법-기재 시각화 플랫폼의 매우 관련 높은 혜택으로 예상되며, 이 혜택은 마이크로어레이 상의 에피토프의 밀도가 증가하면서 그 중요성이 증가할 것이다.

데이터 정규화

도 1 에 도시되어 있듯이, 인간 IgG 의 연속 희석을 기초로한 내부 대조군을 사용하여 신호 수량화 및 정규화가 개선된다. 이 내부 대조군은 단일-농도 기초 신호 수량화와 비교하여, 모든 각각의 개별 펩티드: aAB 상호작용의 더 정확한 정규화를 가능하게 한다. 결과로서, 개별 펩티드 에피토프/aAB-결합 활성이 인간 IgG 의 x-양의 면역반응성에 동등량으로 표현될 수 있다. 이러한 특이적 정규화 특성을 도입하면 상이한 실험과 검정 사이트로부터의 데이터 호환성을 개선시킬 것이다.

데이터 분석

t-검정에서 가장 큰 분산을 생성하는 에피토프를 순서대로 분류하여 가장 편차가 큰 에피토프의 수치를 결정한다. 예비 데이터에 의해 지시되듯이, 모든 개별 펩티드/자가항체 결합 반응의 1 % 는 매우 강한 신호를 생성하는데, 일부 경우 이는 양성 대조군을 초과하기도 한다 (데이터 표시하지 않음). 드물지만 매우 강한 이러한 신호는 특정 에피토프가 특이적인 고-친화성 항종양 혈청 aAB 를 검출하는 경우를 나타낼 수 있다. Cy3-기재 형광측정법 검출은 타당성입증 되는데, 이는 에피토프 마이크로어레이에 있어서 더 넓은 동적인 범위를 생성하기 때 문이다. Cy3 를 사용함으로써 고-역가 및 고-친화성 항-종양 혈청 aAB 를 식별하는 에피토프가 밝혀진다. 비색측정법 및 형광측정법으로 생성된 데이터는 모두 분석되고, 교차-타당성입증된다. 교차-타당성입증은 p-수치 및 분산-기재 분석 모두를 포함한다.

개별 aAB 및 aAB 패턴의 검정력

사용되는 시스템은 (1) 모든 각각의 정보적인 에피토프의 개별적 진단 검정력을 측정하고, 및 (2) 정보적인 에피토프 다양한 조합 (aAB 패턴) 의 진단 검정력을 타당성 입증한다. (1) 은 상기한 Golub 등에 의해 기재된 "가중표" 의 원리를 이용하여 수행될 수 있는 반면, (2) 는 다양한 패턴 인지 알고리즘을 사용하여 수행된 후, 생성된 패턴을 개별적으로 타당성입증하여 수행될 수 있다. 간단하게, 개별적인 에피토프의 진단 검정력을 설명하기 위해 "가중표" 의 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 유형의 시스템에서, 특정 종양을 예측하기 위한 정보적인 에피토프의 수용력은 (1) 정보적인 에피토프의 군의 진단 검정력을 변화시키는 능력, 및 (2) 눈가림 연구에서 종양 클래스를 예측할 수 있는 능력에 의존한다. 상세하게, 에피토프의 군의 진단 검정력을 변형시킬 수 있는 개별 에피토프의 수용력이 클수록, 에피토프가 특정 종양을 예측할 가능성이 크다. 개별 예측 검정력이 가장 큰 에피토프가 눈가림 연구에서 가장 중요한 마커일 것이다. 암의 유전적 복잡성이 매우 크고, 면역 반응 및 항원 제시 (presentation) 의 다양성 때문에 다양한 aAB 패턴의 진단 효용이 개별 에피토프의 진단 효용을 능가한다.

동일한 항원에 해당하는 상이한 에피토프는 상이한 진단 가치를 지님

항원인 단백질은, 모두 동일하게 면역성이지 않고, 항원 제시 및 종양 세포로 동일하게 제시되지 않는 다수의 에피토프를 지니고 있다.

예를 들어 22 개의 KIA0373 에피토프 중에서 오직 2 개 (KIAA0373-1107-RKFAVIRHQQSLLYK 및 KIAA0373-1193-MKKILAENSRKITVL) 만이 NSCLC 에 대해서 변함없는 자가항체 결합 활성 및 진단 수치를 나타낸다. 개별 에피토프 사이의 진단 수치에서 유사한 구별이 NISCH, SDCCAG3, ZNF292, RBPSUH 및 기타 여러 단백질에서 관찰되었다.

결론적으로, 본 분석을 통해, 동일한 단백질 항원으로부터의 상이한 에피토프가상이한, 심지어 반대의 진단 수치를 가질 수 있음을 확인하였다. 예를 들어 에피토프 SOX3/7 (펩티드 - PAMYSLLETELKNPV) 를 인지하는 항체가 존재하고, NSCLC 의 특징이며, 에피토프 SOX3/14 (펩티드 - DEAKRLRAVHMKEYP) 는 SCLC 의 특징이다.

폐암 환자의 대규모 자가항체 프로파일링: 자가항체 패턴의 진단 가치

본 연구는 3 군의 환자에게 수행된다:

1. 과도한 흡연의 이력이 있는 건강한 환자 (32 명)

2. 비소세포 폐암 환자 (36 명)

3. 소세포 폐암 환자 (26 명)

표 1 에 기재되어 있는 1,448 개의 펩티드 에피토프 중 1,253 개를 이용한 펩티드 에피토프 어레이를 사용하여 모든 연구 대상으로부터의 혈액 혈청을 분석하였다.

어레이 이미지를 Array-Pro Analyzer (Media Cybernetics) 를 사용하여 분석하였고, 이미지 데이터를 GeneMaths XT (Applied Maths) 로 분석하여 암환자에서 특징적이고, 진단 도구로 사용될 수 있는 자가항체 결합 활성의 패턴을 수득하였다 (표 3 ~ 6).

신경 회로망 및 서포트 벡터 머신 소프트웨어를 사용한 분석으로 자가항체의 별개의 군이 각 환자의 범주에 존재함을 확인하였다. 이러한 연구 대상의 특이적 집합에서 비소세포 암 환자를 83 ~ 85 % 특이성을 가지는 환자들로 그룹화 할 수 있는 반면, 대조군 환자가 이 군에 속할 수 있는 가능성은 5 % 미만이다 (표 3 ~ 6).

폐암 환자의 자가항체 프로파일링: 폐암 결정적 펩티드

가장 정보적인 에피토프 25 개 (표 11) 를 포함하는 펩티드 어레이를 상기 샘플과 함께 사용하였다. 이 어레이는 표 1 에 기재되어 있는 1,448 개의 펩티드 에피토프 중에서 1,253 개를 사용한 대규모 스크리닝에서 비소세포 폐암 (NSCLC) 및 대조군 샘플을 가장 잘 식별해내는 펩티드를 포함한다. 폐암 진단 에피토프의 고 정확성 집합으로 사용될 수 있는 '폐암 결정적 펩티드' 로 이를 지칭한다. 패턴 인지 알고리즘으로서 서포트 벡터 머신을 사용하였다. 첫 번째로 분류를 구성하기 위해 NSCLC 샘플 모두를 사용하였고, 이후 이러한 분류를 NSCLC 및 대조군 샘플에 적용하였다. NSCLC 샘플의 NSCLC 분류에 대한 평균치 유사성은 ~ 95 % 으로 밝혀졌고, 대조군 샘플의 유사성은 12.5 % 로 밝혀졌다 (표 12).

자가-항체의 검출: 커버슬립 상에 니트로셀룰로오스 패드를 사용한 펩티드 마이크로어레이 프로토콜

마이크로어레이 슬라이드는 예를 들어 Schleicher & Schuell 사에서 시판된다. 프로토콜은 하기와 같다:

1. Superblock, TBS 기재 (pH 7.4), (Pierce Cat# 37535), 0.05% Tween 20 을 사용하여 1 시간 동안 실온에서 블로킹함. 웰 당 100 ~ 150 ㎕ 의 블로킹 용액을 사용함 (16 패드 슬라이드).

2. TBS, pH 7.4 및 0.05 % Tween 20 으로 실온에서 각각 2 분 동안 세척함. 각각 150 ㎕ 으로 세척함.

3. 1:10 으로 희석된 Superblock 및 0.05 % Tween 20 을 함유하는 TBS, pH 7.4 으로 혈청을 1:15 로 희석시킴.

4. 희석 혈청 150 ㎕ 와 함께 어레이를 밤새 4 ℃ 에서 항온배양 시킴 (최소 16 시간).

5. 0.05 % Tween 20 을 함유하는 TBS, pH 7.4 를 사용하여 실온에서 매회 5 분 동안 5 회 세척함. 각각 150 ㎕ 으로 세척함.

6. 1:10 으로 희석된 Superblock 및 0.05 % Tween 20 을 함유하는 TBS, pH 7.4 으로, 1:3000 희석시킨 2차 항체 (알칼리성 인산효소 컨쥬게이트 항-인간 IgA, IgM, IgG; ChemiconAP120A, lot 23091469) 를 1 시간 동안 실온에서 항온배양시킴. 부피는 150 ㎕ 임.

7. 0.05 % Tween 20 을 함유하는 TBS, pH 7.4 를 사용하여 실온에서 매회 5 분 동안 5 회 세척함. 각각 150 ㎕ 으로 세척함.

8. 알칼리성 인산효소 기질 (Pierce 1-단계 NBT/BCIP, 생성물 # 34042) 을 사용하여 자가항체 결합을 시각화함. 반응 생성물이 보이기까지 15 ~ 30 분이 걸릴 것이다. 과하게 항온배양하지 않음. 오랜 항온배양은 높은 배경을 야기할 것임.

9. 물로 헹구어 반응을 멈춤.

10. 슬라이드를 건조시키고 분석을 실시함.

Perkin Elmer Piezzo Arrayer 을 사용한 펩티드 프린팅 프로토콜

제제:

PBS 완충액 중 0.1% Tween

HPLC 등급 물

50 mM NaOH

Repel-Silane ES

HPLC 메탄올

방법:

모든 실행 전 하기를 수행한다:

1) Prime Utility 를 사용하여 팁을 준비함;

2) 앞선 NaOH 세정 유틸리티를 사용하여 50 mM NaOH 로 팁을 세정함;

3) Prime Utility 을 사용하여 팁을 준비함;

4) Silanate Utility 을 사용하여 팁을 실란화시키고, 처음 4 개의 웰을 100% HPLC 등급 메탄올로 채움; NaOH 세정에 의해서 단백질 침전이 일어나면 안됨; 마지막 4 개의 웰은 Repel-Silane ES 용액을 포함함;

5) Prime Utility 을 사용하여 팁을 준비함;

6) Tuning Utility 를 사용하여 팁을 조정함;

7) 표준 세척을 실시함.

프로토콜 세팅:

1) 세척 세팅 탭은 하기와 같이 세팅되어야 함: 시린지 세척 부피는 400 ㎕, 페리펌프 시간은 10 초이고, 초음파 분해를 "YES" 로 세팅함;

2) 프로토콜 설치에는 세정 용액이 포함되어야 하며, 이 용액은 PBS 중 1% Tween 이어야 하며; 접촉 시간은 35 초, 플러쉬 부피는 400 ㎕, 흡입 부피는 15 ㎕이어야 함;

3) 어레이는 55 개의 샘플을 2 부씩 프린트하거나 또는 16 Pad Fast Slide 상에 110 개의 점을 프린트해야함;

4) 오류가 났을 경우, 무시하기 이전에 한번 재시도 해야 함.

프린팅:

1) 대조군과 함께 펩티드 샘플 (H₂O 중 2 mg/ml) 은 96 웰 플레이트에 도달하고, 원래 홀더 중에 정확하게 위치되기만 하면됨;

2) 프린팅한 후, 모든 슬라이드는 정확하게 표지되어야 함.

다음 프린팅을 위해 상기 세정을 반복한다.

모든 참고 문헌 및 특허는 본원에 그 전체가 명확히 참고문헌으로 도입되어 있다.

Claims

다음의 단계를 포함하는, 샘플 간 클래스 구별과 상관관계가 있는 자가항체 결합 활성을 가지는 정보적인 에피토프의 집합 (set) 을 식별하는 방법:

a) 각 2 개 이상의 클래스에 대한 다수의 샘플에서 다수의 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성을 측정하는 단계;

b) 상기 다수의 샘플 중 자가항체 결합 활성과 클래스 구별의 상관관계 정도에 따라 상기 에피토프를 구분하는 단계; 및

c) 상기 상관관계가 우연히 기대되는 것보다 강한지를 측정하는 단계;

여기서 자가항체 결합 활성과 클래스 구별 사이의 상관관계가 우연히 기대되는 것보다 강한 에피토프가 정보적인 에피토프이며, 따라서 정보적인 에피토프의 집합을 식별함.
다음의 단계를 포함하는, 샘플 간 클래스 구별과 상관관계가 있는 자가항체 결합 활성을 가지는 정보적인 에피토프의 집합을 식별하는 방법:

a) 각 2 개 이상의 클래스에 대한 다수의 샘플에서 다수의 에피토프에 대한 자가항체 결합 활성을 측정하는 단계;

b) 상기 다수의 샘플로부터의 동일한 샘플 클래스의 샘플 중에서 자가항체 결합 활성을 가지는 상기 다수의 에피토프로부터 에피토프 군집을 식별하는 단계로서, 여기서 상기 에피토프 군집은 다수의 샘플로부터의 상이한 클래스의 샘플 간의 클래스 구별과 상관관계가 있는 자가항체 결합 활성을 가짐; 및

c) 상관관계가 우연히 기대되는 것보다 강한지를 측정하는 단계;

여기서 자가항체 결합 활성과 클래스 구별 사이의 상관관계가 우연히 기대되는 것보다 강한 자가항체 결합 활성을 가지는 에피토프 군집이 정보적인 에피토프의 집합임.
다수의 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플에 대한 다수의 클래스를 구별할 수 있는 에피토프 마이크로어레이로서, 각각의 상기 펩티드는 다수의 특정 클래스로부터 선택되는 특정 클래스의 샘플 특징에 해당하는 에피토프 결합 활성을 독립적으로 가지고, 이를 종합하면 상기 다수의 펩티드는 상기 다수의 특정 클래스 모두의 종합 특징을 가지는 다수의 샘플에 해당하는 에피토프 결합 활성을 가지며, 상기 펩티드 각각의 자가항체 결합 활성은 상기 다수의 특정 클래스 중 어느 하나의 샘플 특징에서, 상기 다수의 특정 클래스의 다른 하나의 샘플 특징에서보다 독립적으로 높은 에피토프 마이크로어레이.