KR20080002213A - 암세포의 성장 및 전이 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드또는 그의 융합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 막횡단 단백질의 일종인 CD99에서 유래한 암세포의 성장 및 전이 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 포함하는 암세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질은 혈관신생을 억제하고, 암세포의 결합조직에서의 이동과 혈관외 유출을 억제함으로써, 암세포의 성장 및 전이를 억제할 수 있다.
암 성장, 암 전이, 암세포이동, 혈관신생
Description
도 1은 서열번호 2 내지 9의 폴리펩타이드의 구조를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 폴리펩타이드가 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC; Human Umbilical Vein Endothelial Cell)의 파이브로넥틴(fibronectin)에 대한 유착에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 폴리펩타이드가 bFGF에 의하여 유도된 혈관신생에 미치는 영향을 도립현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 4는 대조군과 본 발명의 폴리펩타이드를 투여한 군에서의 흑색종의 성장 정도(A) 및 혈관신생 정도(B)를 나타낸다.
도 5는 대조군과 본 발명의 폴리펩타이드를 투여한 군에서의 흑색종의 부피를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 인간 유방암 세포주 MCF-7 및/또는 인간 제대 정맥 내피 세포에 본 발명의 폴리펩타이드를 처리하였을 때, 혈관 외로 유출된 인간 유방암 세포의 갯수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때, 파이브로넥틴을 침윤한 인간 유방암 세포의 갯수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 혈관밖으로 유출하여 폐와 간으로 전이한 흑색종 세포가 형성한 소절(A) 및 그 소절의 숫자를 비교한 결과(B)를 나타낸다.
본 발명은 막횡단 단백질의 일종인 CD99에서 유래한 암세포의 성장 및 전이 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 포함하는 암세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
발암원(carcinogen)에 의해 변화된 암세포는 정상세포보다 빠르게 증식을 하며 종양(tumors) 덩어리를 형성하고, 주변의 조직에 침투하며 정상적인 신체 기능을 저해한다. 암세포는 혈관신생을 유도함으로써, 영양분과 산소를 공급받을 뿐 아니라, 혈관신생에 의해 암세포가 전이되게 된다. 암세포는 특정부위에서 무한 성장을 할 뿐만 아니라, 기존의 성장부위를 이탈하여 새로운 부위로 이동하여 성장을 하는데 이러한 과정을 전이(metastasis)라고 한다. 전이과정은 암세포가 이동성이 높은 중간엽성 세포로 변화하여 기존 조직에서 이탈하는 단계, 주위 결합조직과 모 세혈관을 침윤하고 이동하는 단계, 혈관 내에서 이동한 후 혈관 밖으로 유출하는 단계, 결합조직 내에서의 이동 및 새로운 부위에서의 성장단계 등으로 구분할 수 있다.
종양세포의 전이과정에서 세포유착분자의 세포표면 발현과 활성화 조절은 매우 중요한 역할을 한다 (Zetter, B. R. (1993). Adhesion molecules in tumor metastasis. Semin Cancer Biol. 4: 219). 종양세포의 전이 과정은 세포유착물질의 세포면 발현 형태나 활성도의 조절을 통하여 이루어지며, 전이현상의 온전한 이해를 위해서는 세포 유착 분자들뿐만 아니라 이들의 발현과 기능을 조절하는 물질에 대한 이해가 필수적이다. (Bailly, M., Yan, L., Whitesides, G. M., Condeelis, J. S., and Segall, J. E. (1998). regulation of Protusion Shape and Adhesion to the sustratum during chemoacic esponses of mammalian carcinoma cells. Exp Cell Res. 241: 285; Frisch, S. M., Vuori, K., Ruoslahti, E., and Chan-Hui., P. (1996). Control of adhesion-dependent cell survival by focal adhesion kinase. J Cell Biol 134: 793; 및 Hannigan, G. E., Leung-Hagesteijn, C. , Fitz-Gibbon, L., Coppolino, M. G., Radeva, G., Filmus, J., Bell, J. C., and Dedhar, S. (1996). Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new β1-integrin-linked protein kinase. Nature 379: 91).
본 발명자들은 막횡단 단백질의 일종인 CD99(MIC2) 분자가 LFA-1의 세포표면 발현을 조절하여 세포간의 유착을 조절하는 물질임을 보고한 바 있다(Hahn, J. H., Kim, M. K., Choi, E. Y., Kim, S. H., Sohn, H. W., Ham, D. I., Chung, D. H., Kim, T. J., Lee, W. J., Park, C. K., Ree, H. J., and Park, S. H. (1997). CD99 (MIC2) regulates the LFA-1/ICAM-1-mediated adhesion of lymphocytes, and its gene encodes both positive and negative regulators of cellular adhesion. J. Immunol. 159: 2250). CD99 는 당질화된 세포 밖 부위, 세포막 횡단부위와 짧은 세포 내 부위로 구성된 제1형 막횡단 단백질이다(Banting, G. S., Pym, B., Darling, S. M., and Goodfellow P. N. (1989). The MIC2 gene product: epitope mapping and structural prediction analysis define an integral membrane protein. Mol. Immunol. 26: 181). 현재까지 CD99 분자의 기능에 대한 연구가 많이 수행되지는 않았으나, CD99 분자를 항 CD99 단일클론항체로 결합시키면 이중양성 가슴샘세포 (double-positive thymocytes) 뿐만 아니라 여러 림프계 세포주(lymphoid cell line)들 사이의 동종세포간 유착이 관찰되므로, CD99의 기능은 세포유착과 관련된 것으로 추정되어 왔다(Bernard, A., Aubrit, F., Raynal, B., Pham, D., and Boumsell, L. (1988). A T cell surface molecule different from CD2 is involved in spontaneous rosette formation with erythrocytes. J Immunol 140: 1802; 및 Bernard, G., Zoccola, D., Deckert, M., Breittmayer, J., Aussel, C., and Bernard. A.(1995). The E2 molecules (CD99) specifically triggers homotypic aggregation of CD4+ CD8+ thymocytes. J. Immunol. 154: 26).
최근 본 발명자들은 CD99 분자가 활성화되면 β1 인테그린(β1 integrin)의 기능을 변화시켜, 암세포가 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)에 부착하는 것을 억제함으로써, 암전이 과정에 관여할 수 있음을 개시한 바 있다(Suh JS., 2001. Control of invasiveness of human breast carcinoma cell line MCF-7 by CD99 molecule. Kangwon National University).
본 발명자들은 CD99 분자를 활성화시킴으로써 암 성장 및/또는 암 전이를 억제할 수 있는 리간드를 개발하고자 다양한 연구를 시도한 결과, CD99로부터 유래된 특정 서열을 갖는 폴리펩타이드가 CD99를 효과적으로 활성화시킴으로써, 암세포의 성장 및/또는 전이를 억제할 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 CD99 로부터 유래된 폴리펩타이드로서, 암세포의 성장 또는 전이 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 4 내지 130개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로서, 암세포의 성장 또는 전이 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역과의 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물이 제공된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CD99 분자를 활성화시킬 수 있는 리간드에 대하여 다양한 검색을 실시하였다. CD99 자체가 막횡단 단백질의 일종인 CD99 분자에 리간드로 작용할 수 있다는 점에 착안하여, CD99 분자로부터 다양한 길이의 리간드를 제조하여 검색을 실시하였다. 놀랍게도, CD99 로부터 유래된 특정 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 혈관 내피 세포나 암세포의 표면에 높은 친화성으로 결합하여 이들의 이동을 억제하는 것을 발견하였다. 또한, 얻어진 폴리 펩타이드를 흑색종이 유도된 마우스의 환부에 주입한 경우, 대조군에 비해 암의 성장율 및 전이율이 유의성 있게 감소하였으므로, 상기 폴리펩타이드는 암세포의 성장 또는 전이 억제 활성을 갖는다.
본 발명은 서열번호 1의 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 4 내지 130개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로서, 암세포의 성장 또는 전이 억제활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 4 및 6 내지 9의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역과의 융합 단백질을 포함한다. 상기 폴리히스티딘(poly-His) 영역은 표지 펩타이드 중 하나로서, 히스티딘 결합 수지와 결합하여 본 발명의 폴리펩타이드를 분리 및 정제하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 폴리히스티딘(poly-His) 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 CD99를 코딩하는 공지의 핵산 서열로부터 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11 내지 13 및 15 내지 18의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 상기 벡터의 클로닝 벡터로 사용가능한 벡터로는 공지된 다양한 벡터를 사용할 수 있으며, 예를 들면, pPICZα A, B, C (Invitrogen사, 미국) 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 클로닝 벡터는 폴리히스티딘(poly-His) 영역을 코딩하는 DNA가 삽입되어 있는 벡터, 예를 들면 pET28a(+) 벡터(Novagene사, 미국)를 바람직하게 사용할 있다. 상기 벡터는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 적절한 제한효소로 절단한 클로닝 벡터에 통상의 방법으로 삽입시켜 제조할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 벡터는 유전자 치료의 목적으로 유전자 치료용 조성물에 직접 함유되거나, 형질전환체 제조를 위해 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 포함한다. 상기 숙주세포로는 상기한 폴리펩타이드가 효과적으로 발현될 수 있다면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 에스케리치아 속(Escherichia genus) 균주(예를 들어, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)), 피키아 속(Pichia genus) 균주(예를 들어, X-33 Pichia; Invitrogen사, 미국) 등을 바람직한 숙주 세포로 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함 할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 암세포의 성장 및 전이를 효과적으로 억제함으로써, 유방암, 위암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암을 비롯한 다양한 고형암 또는 골수성 백혈병 등의 암환자에게 투여될 수 있으며, 그 투여용량은 통상 각 환자의 연령, 체중 및 환자의 증상에 따라 일반적으로 변화시킬 수 있는 용량, 예를 들어 1일 약 0.01 내지 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
폴리펩타이드의
합성
서열번호 2 내지 6의 폴리펩타이드를 각각 코딩하는 서열번호 11 내지 15의 cDNA 단편을 인간의 면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 cDNA가 이미 삽입되어 있는 pET28a(+) 벡터에 삽입하여, 5종류의 pET28a-hCD99-Fc 벡터를 제조하였다. 즉, PCR을 통해 서열번호 11 내지 15의 cDNA 단편을 얻은 뒤 말단부위를 EcoRI으로 절단한 후, 결합효소를 이용하여 cDNA 단편들을 동일한 제한효소로 절단된 pET28a(+) 벡터에 결합함으로써 5종류의 pET28a-hCD99-Fc 벡터를 제조하였다.
얻어진 발현 벡터를 BL21(DE3) 세포에 형질전환시켜 얻은 콜로니를 LB배지에서 약 4 내지 6시간 배양한 후, 흡광도(A600)가 0.4-0.6이 되었을 때 7～9 시간 동 안 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG) (1.4 mM)를 첨가하여 발현을 유도하였다. 세포를 원심분리를 통하여 침전시킨 후, 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척한 후 다시 침전시켜 배지에 있는 불순물을 제거하였다. SDS-PAGE 겔을 통해서 발현이 유도되었는지 여부를 확인하였다.
발현된 단백질의 분리를 위해 8M 우레아 완충액 (8M urea, 0.01M Tris-Cl , 0.1M NaH2PO4)을 사용했으며, 분리 단계에 따라 pH 농도를 8.0 , 6.3 , 4.5 등으로 제조하여 사용하였다. 단백질분해효소 억제제들 (1mM PMSF, 10 ㎍/㎖ leupeptin, 1 ㎍/㎖, pepstatin, 1 ㎍/㎖ aprotinin)이 첨가된 pH 8.0 완충액으로 세포를 용해한 후에 4℃, 13000 rpm의 조건에서 20분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액을 히스티딘 결합 수지(His binding resin)인 Ni-NTA His Bind Resin(Novagen사, 미국)과 1 ㎖ 에펜도르프 튜브 상에서 혼합한 후에 4℃에서 16 시간 동안 반응시켜, 발현된 단백질의 히스티딘과 수지의 결합을 유도하였다. 얻어진 반응 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 버리고, pH 6.3 완충액으로 세척하였다. PBS로 투석한 후, 정량하여 냉장 보관하였다.
서열번호 7 내지 9의 펩타이드는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)을 이용하여 FMOC solid-phase method로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 analytical RP 컬럼 (Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.
상기와 같이 제조된 서열번호 2 내지 9의 폴리펩타이드의 구조는 도 1과 같다.
실시예
2.
폴리펩타이드를
포함하는 조성물의 제조
서열번호 2 내지 6의 폴리펩타이드를 PBS에 용해시켜, 부피 100 ㎕ 중 3 ㎍ 의 농도가 되도록 제조하였다. 또한, 서열번호 7 내지 9의 펩타이드를 디메틸술폭시드 (Dimethylsulfoxide; DMSO)에 3 ㎎/㎖ 농도로 용해시켜, 부피 100 ㎕에 20 ㎍ 또는 100 ㎍의 농도가 되도록 생리식염수를 첨가하였다. 얻어진 단백질 용액을 하기 시험예에서 사용하였다.
시험예
1. 인간 제대 정맥 내피 세포와
세포외기질
간의 유착 억제 시험
서열번호 2 내지 9의 펩타이드가 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC; Human Umbilical Vein Endothelial Cell)의 파이브로넥틴(fibronectin)에 대한 유착에 미치는 영향을 측정하였다.
세포외 기질 성분의 하나인 파이브로넥틴을 96 웰(well) 세포배양판에 도말하여 자외선하에서 건조하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포를 웰당 5 x 104이 되도록 준비한 다음, 실시예 2에서 제조한 단백질 용액을 각 웰에 분주하고 1시간 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)를 이용하여 세포외 기질에 유착되어있는 세포를 걷어낸 다음 트리판-블루(Trypan-blue)용액으로 염색하 고, 혈구계산기(hemacytometer)를 사용하여 유착한 세포수를 측정하였다. 그 결과는 도 2a 및 2b와 같다.
도 2a 및 2b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 처리한 경우, 파이브로넥틴에 유착한 내피 세포의 갯수가 대조군에 비해서 약 10 ～ 40% 정도 감소된다. 그러나, 서열번호 1의 94번 내지 97 번째 아미노산을 포함하지 아니한 서열번호 5의 폴리펩타이드의 경우는 대조군과 유사한 유착도를 나타내었다. 따라서, 서열번호 1의 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 혈관신생을 억제할 수 있을 것으로 기대된다.
시험예
2. 시험관 내(
in
vitro
) 혈관신생
억제능
시험
혈관의 바닥막 성분과 혈관내피 세포의 상호작용은 신생혈관의 형성과 유지에 중요한 요소이므로, 본 발명의 폴리펩타이드가 혈관신생에 미치는 영향을 평가하였다.
인간 제대 정맥 내피 세포를 8 x 104 cells/well의 밀도로 매트리젤(Matrigel)이 도포된 24 웰 세포배양판에 접종한 후, 실시예 2에서 제조한 단백질 용액(서열번호 2의 폴리펩타이드 포함)(3 ㎍/㎖), 이차 항체(Goat anti-mouse IgG; Dinona사, 한국), 또는 이들의 혼합물을 각각 가하고, 20% 소태아혈청(fetal bovine serum), 페니실린 (100 units/㎖), 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖), bFGF (3 ng/㎖), 헤파린 (5 units/㎖) 이 포함된 Media 199 배양액을 사용하여 5% CO2 분압, 37 ℃로 유지되는 CO2 배양기(incubator)로 24시간 동안 배양한 다음, 도립현미 경(inverted microscope)으로 x50 배율로 확대하여 신생혈관 형성 여부를 관찰하였다. 그 결과는 도 3과 같다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 함유한 단백질 용액으로 인간 제대 정맥 내피 세포를 처리한 경우, 혈관신생이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있다.
시험예
3. 생체 내(
In
vivo
) 종양성장 및 혈관신생
억제능
시험
10마리의 5 주령 수컷 누드마우스(nude mouse)의 등 부위 피하지방층에 1 마리당 1.5 x 105의 생쥐흑색종 세포주인 B16-F10-Luc-G5(mouse melanoma cell line, Xenogen사, 미국)를 주입하였다. 48시간 후, 실험군과 대조군으로 5 마리씩 구분하고 각 그룹의 쥐 한 마리당, 100 ㎍의 서열번호 7의 폴리펩타이드를 48시간을 주기로 복강에 주입하였다. 종양세포를 주입한 후 12일째부터 종양의 부피를 측정하였다. 상기 부피 측정은 종양의 가로, 세로, 높이의 수치를 잰 다음, (가로 x 세로)2 x 높이 x 0.5 의 식으로 계산된 값을 부피로 하였다.
종양세포를 주입한 후 14일째 종양 조직을 적출하고, 종양조직을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 이용하여 고정한 뒤, 수세과정을 거친 후 파라핀 블록을 제작한 다음, 5 ㎛의 표준 정면 절편을 만들고 헤마톡실린&에오신(hematoxylin & eosin) 염색을 수행하였다. 헤마톡실린과 에오신 염색의 결과를 일반현미경으로 x40 배율로 확대하여 혈관신생 정도를 비교하였다.
도 4는 대조군과 본 발명의 폴리펩타이드를 투여한 군에서의 흑색종의 성장 정도(A) 및 혈관신생 정도(B)를 나타낸다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 투여할 경우, 흑색종의 성장 및 혈관신생이 대조군에 비해서 현저히 억제된다.
도 5는 대조군과 본 발명의 폴리펩타이드를 투여한 군에서의 흑색종의 부피를 측정한 결과를 나타낸다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 투여할 경우, 흑색종의 부피가 처리 후 12일 후에 대조군에 비해 약 6 분의 1 수준으로 감소된다.
시험예
4. 암세포의 시험관 내(
in
vitro
)
혈관외
유출
억제능
시험
세공의 지름이 8 ㎛인 트랜스웰에 침윤 유도 배지(생쥐 섬유모세포인 NIH/3T3를 0.005% 비타민C와 0.1% 소혈청알부민이 첨가된 DMEM 무혈청배지에서 16시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액)를 가한 후, 이를 4군으로 나누었다. 첫 번째 군은 EEFD로 구성된 대조군 펩타이드 10 ㎍을 처리하고(대조군), 두 번째 군은 인간 유방암 세포주인 MCF-7 (human breast cancer cell) 5 X 105 cells 및 서열번호 9의 펩타이드 10 ㎍을 처리하고, 세 번째 군은 인간 제대 정맥 내피 세포 6 X 104 cells 및 서열번호 9의 펩타이드 10 ㎍을 처리하고, 네 번째 군은 MCF-7 5 X 105 cells, 인간 제대 정맥 내피 세포 6 X 104 cells 및 서열번호 9의 펩타이드 10 ㎍을 처리하였다. 각 웰을 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 배양한 후, 0.1% BSA를 가하고 6시간 이후에, 침윤 유도 배지가 담겨 있는 트랜스웰의 하단으로 빠 져나온 세포의 수를 측정하였다.
도 6은 상기와 같이 인간 유방암 세포주 MCF-7 및/또는 인간 제대 정맥 내피 세포에 본 발명의 폴리펩타이드를 처리하였을 때, 혈관 외로 유출된 인간 유방암 세포의 갯수를 측정한 결과를 나타낸다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 처리한 경우, 인간 유방암 세포의 혈관외 유출이 약 60% 수준으로 억제된다. 혈관 내로 침윤한 암세포가 혈관을 따라 이동하다가 장기로 전이되기 위해서는 혈관 밖으로 유출되는 과정이 수반됨을 감안할 때, 본 발명의 폴리펩타이드는 효과적인 암세포 전이 억제 활성을 가질 것으로 기대된다.
시험예
5. 암세포의 침윤
억제능
시험
인테그린(integrin)의 리간드인 파이브로넥틴(fibronectin)을 트랜스웰에 미리 도말한 후, 5 x 105개의 인간 유방암 세포주 MCF-7을 트랜스웰의 상단부에 넣고 배양하였다. 24시간 경과 후, 세포가 80% 이상 자라면 서열번호 7의 펩타이드를 10 ㎍, 50 ㎍, 및 100 ㎍의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 1 시간 동안 배양하였다. 0.1% BSA를 가하고, 트랜스웰 하단부에는 침윤유도배지(NIH 3T3 세포를 0.005% 비타민 C, 1% BSA, DMEM 혈청제거 배양액에서 24시간 동안 배양하여 얻은 배양상층액)를 넣어준 후 24시간 주기로 트랜스웰의 하단부에 떨어진 세포 수를 3회에 걸쳐 측정하였다. 각각의 시험은 3회씩 수행하여 그 결과를 통계처리 하였다.
도 7은 상기와 같이 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때, 파이브로넥틴을 침윤한 인간 유방암 세포의 갯수를 측정한 결과를 나타낸다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 처리한 경우 EEFDDAEEFDD의 펩타이드를 처리한 대조군에 비해서 인간 유방암 세포의 세포외 물질을 침윤하는 정도가 약 50% 수준으로 억제된다. 혈관 밖으로 빠져나온 암세포는 바닥막이나 주위 결합조직을 침윤하는 과정을 거쳐 새로운 부위로 전이하는 것을 감안할 때, 본 발명의 폴리펩타이드는 효과적인 암세포 전이 억제 활성을 가진다.
시험예
6. 암세포의
생체내
혈관외유출
억제 시험
5주령의 누드 마우스에 1.5 x 105 개의 B16-F10-Luc-G5(mouse melanoma cell line, Xenogen사, 미국)를 꼬리 정맥에 주사하였다. 누드 마우스는 대조군과 시험군으로 나눈 후(n=10), 대조군에는 EEFDDAEEFDD의 펩타이드(대조군 펩타이드)를, 시험군에는 서열번호 7의 펩타이드를 100 ㎍의 농도로 PBS에 혼합하여 주사하였다. 이틀 주기로 각 그룹의 복강내에 대조군 펩타이드와 서열번호 7의 펩타이드를 주사하고 15일 후에 누드마우스를 해부하여 폐와 간을 적출한 후 전이된 암세포 소절의 수를 측정하였다.
도 8은 상기와 같이 처리하였을 때 혈관밖으로 유출하여 폐와 간으로 전이한 흑색종 소절(A) 및 전이한 흑색종 소절의 숫자를 비교한 결과(B)를 나타낸다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 투여한 경우, 흑색종 세포의 전이도가 대조군에 비해서 약 40% 수준으로 감소된다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질은 혈관신생을 억제하고, 암 세포의 결합조직에서의 이동과 혈관외 유출을 억제함으로써, 암세포의 성장 및 전이를 억제할 수 있다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation
<120> Polypeptides or fusion proteins thereof having an inhibitory
activity against growth and metastasis of cancer cells
<130> PN0061
<160> 18
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 185
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Phe Gly Leu Leu Gly
1 5 10 15
Val Leu Val Ala Ala Pro Asp Gly Gly Phe Asp Leu Ser Asp Ala Leu
20 25 30
Pro Asp Asn Glu Asn Lys Lys Pro Thr Ala Ile Pro Lys Lys Pro Ser
35 40 45
Ala Gly Asp Asp Phe Asp Leu Gly Asp Ala Val Val Asp Gly Glu Asn
50 55 60
Asp Asp Pro Arg Pro Pro Asn Pro Pro Lys Pro Met Pro Asn Pro Asn
65 70 75 80
Pro Asn His Pro Ser Ser Ser Gly Ser Phe Ser Asp Ala Asp Leu Ala
85 90 95
Asp Gly Val Ser Gly Gly Glu Gly Lys Gly Gly Ser Asp Gly Gly Gly
100 105 110
Ser His Arg Lys Glu Gly Glu Glu Ala Asp Ala Pro Gly Val Ile Pro
115 120 125
Gly Ile Val Gly Ala Val Val Val Ala Val Ala Gly Ala Ile Ser Ser
130 135 140
Phe Ile Ala Tyr Gln Lys Lys Lys Leu Cys Phe Lys Glu Asn Ala Glu
145 150 155 160
Gln Gly Glu Val Asp Met Glu Ser His Arg Asn Ala Asn Ala Glu Pro
165 170 175
Ala Val Gln Arg Thr Leu Leu Glu Lys
180 185
<210> 2
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide fragment
<400> 2
Pro Asp Gly Gly Phe Asp Leu Ser Asp Ala Leu Pro Asp Asn Glu Asn
1 5 10 15
Lys Lys Pro Thr Ala Ile Pro Lys Lys Pro Ser Ala Gly Asp Asp Phe
20 25 30
Asp Leu Gly Asp Ala Val Val Asp Gly Glu Asn Asp Asp Pro Arg Pro
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Ser Ser Gly Ser Phe Ser Asp Ala Asp Leu Ala Asp Gly Val Ser Gly
65 70 75 80
Gly Glu Gly Lys Gly Gly Ser Asp Gly Gly Gly Ser His Arg Lys Glu
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Val Val Val Ala Val Ala Gly Ala Ile Ser Ser Phe Ile Ala
115 120 125
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1 5 10 15
Asn Pro Asn Pro Asn His Pro Ser Ser Ser Gly Ser Phe Ser Asp Ala
20 25 30
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65 70 75 80
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85
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<211> 59
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide fragment
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Lys Gly Gly Ser Asp Gly Gly Gly Ser His Arg Lys Glu Gly Glu Glu
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35 40 45
Ala Val Ala Gly Ala Ile Ser Ser Phe Ile Ala
50 55
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<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide fragment
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Gly Ser Asp Gly Gly Gly Ser His Arg Lys Glu Gly Glu Glu Ala Asp
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<400> 6
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35
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<223> peptide fragment
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide fragment
<400> 9
Asp Leu Ala Asp
1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> poly-His fragment
<400> 10
His His His His His His
1 5
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide fragment
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ccggatggtg gtttcgattt atccgatgcc cttcctgaca atgaaaacaa gaaacccact 60
gcaatcccca agaaacccag tgctggggat gactttgact taggagatgc tgttgttgat 120
ggagaaaatg acgacccacg accaccgaac ccacccaaac cgatgccaaa tccaaacccc 180
aaccacccta gttcctccgg tagcttttca gatgctgacc ttgcggatgg cgtttcaggt 240
ggagaaggaa aaggaggcag tgatggtgga ggcagccaca ggaaagaagg ggaagaggcc 300
gacgccccag gcgtgatccc cgggattgtg ggggctgtcg tggtcgccgt ggctggagcc 360
atctctagct tcattgct 378
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<220>
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aaccacccta gttcctccgg tagcttttca gatgctgacc ttgcggatgg cgtttcaggt 120
ggagaaggaa aaggaggcag tgatggtgga ggcagccaca ggaaagaagg ggaagaggcc 180
gacgccccag gcgtgatccc cgggattgtg ggggctgtcg tggtcgccgt ggctggagcc 240
atctctagct tcattgct 258
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<212> DNA
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<220>
<223> nucleotide fragment
<400> 13
agcttttcag atgctgacct tgcggatggc gtttcaggtg gagaaggaaa aggaggcagt 60
gatggtggag gcagccacag gaaagaaggg gaagaggccg acgccccagg cgtgatcccc 120
gggattgtgg gggctgtcgt ggtcgccgtg gctggagcca tctctagctt cattgct 177
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<212> DNA
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<220>
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gct 123
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<212> DNA
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tcagatgctg accttgcgga t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide fragment
<400> 18
gaccttgcgg at 12
Claims (12)
- 서열번호 1의 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 4 내지 130개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로서, 암세포의 성장 또는 전이 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 2 내지 4 및 6 내지 9의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역과의 융합 단백질.
- 제3항에 있어서, 상기 폴리히스티딘 영역이 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제5항에 있어서, 서열번호 11 내지 13 및 15 내지 18의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 벡터가 폴리히스티딘(poly-His) 영역을 코딩하는 cDNA가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제7항의 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체.
- 제9항에 있어서, 상기 숙주세포가 에스케리치아 속(Escherichia genus) 균주 또는 피키아 속(Pichia genus) 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
- 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물.
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