KR100481796B1 - 섬유아세포의 αｖβ5 인테그린과 특이적으로 결합하는βｉｇ-ｈ3 단백질 유래 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 섬유아세포에 특이적으로 결합하며, 세포의 부착, 확산 및 탈착을 매개하는 βig-h3 단백질 유래 펩타이드 및 그의 유도체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기능적 세포 수용체로서 αvβ5 인테그린과 결합하여 이들 세포의 부착 활성을 매개하며 세포 부착 및 탈착 활성을 위한 보존된 아미노산으로서 티로신 및 히스티딘을 포함하는 펩타이드 및 그의 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체는 βig-h3를 포함하는 다양한 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein)에 의해 매개되는 세포 부착 활성 연구에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 창상치유, 조직재생, 신생혈관 억제 및 암전이 억제 등에 매우 유용한 세포 부착, 확산 및 탈착을 촉진하는 펩타이드의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

섬유아세포의 αｖβ5 인테그린과 특이적으로 결합하는 βｉｇ-ｈ3 단백질 유래 펩타이드 {Peptide originated from βig-h3 protein binding specifically to the αvβ5 integrin of fibroblast cells}

본 발명은 섬유아세포에 특이적으로 결합하며, 세포의 부착, 확산 및 탈착을 매개하는 βｉｇ-ｈ3 단백질 유래 펩타이드 및 그의 유도체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기능적 세포 수용체로서 αvβ5 인테그린과 결합하여 세포의 부착 활성을 매개하며 세포 부착 및 탈착 활성을 위한 보존된 아미노산으로 티로신 및 히스티딘을 포함하는 펩타이드 및 그의 유도체에 관한 것이다.

βig-h3은 인간의 흑색소 세포종 세포(human melanoma cells), 포유동물의 상피세포(mammary ephithelial cells), 피부각질세포(keratinocytes) 및 허파 섬유아 세포(lung fibroblasts)등을 포함하는 여러 종류의 세포에서 TGF-β에 의해 유도되는 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein)이다. βig-h3은 TGF-β를 처리한 인간의 허파 선암 세포(lung adenocarcinoma cells) A549로부터 제조된 cDNA 라이브러리의 스크리닝(differential screening)에 의하여 최초로 분리되었다. βig-h3은 683개의 아미노산으로 구성되며, 카르복실 말단에는 여러 가지 인테그린에 대한 리간드 인식부위로 작용하는 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열이 존재하고 아미노 말단에는 분비서열이 존재하는 단백질을 코딩한다.

βig-h3 mRNA와 단백질은 여러 세포계에서 TGF-β에 의해 조절되어 그 발현량이 증가하고 TGF-β에 의하여 세포증식이 조절되는 여러 세포계에서 βig-h3 유전자가 유도되기 때문에 βig-h3이 TGF-β의 신호 중 일부를 매개하는데 관여할 것으로 생각된다. 이와는 반대로, 희귀한 골질환인 국한성 유선상과골증(melorheostosis)에 걸린 피부손상 부위로부터 배양된 섬유아세포, 일부 종양세포계 및 덱싸메타손(dexamethasone)으로 처리된 골수 간 세포(stem cells)에서는 βig-h3 발현이 감소되는 것이 보고되었다. 이처럼 βig-h3은 다양한 조직에서 세포외 기질 단백질 및 세포들 사이의 상호작용과 형태 형성에서 중요한 인자로 작용하는 것으로 보인다. 또한, βig-h3는 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)로서 세포 부착(attachment)과 탈착(detachment)을 매개하는 것으로 알려져 있다. 정제된 βig-h3 단백질은 피부 섬유아세포의 부착과 확산을 촉진시키는 한편, 무혈청배지에서 A549, HeLa 및 WI-38 세포의 부착을 저해하였다. 특히, βig-h3은 종양세포의 성장, 콜로니 형성 및 출현을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 실예로 차이니즈 햄스터의 난소 세포(Chinase hamster ovary cells)에 βig-h3 발현벡터를 전이(transfection)시킨 누드 마우스에서 상기 세포들의 종양형성능이 현저하게 감소함이 보고되었다. 또한, 빠르고 효과적인 상처 치유를 위하여 유효한 양의 βig-h3을 상처와 접촉시킴으로써 세포, 특히 섬유아세포가 상처부위에 퍼지고 점착하는 것을 촉진시킬 수 있는 방법이 개발되었다. 따라서, βig-h3은 여러 세포에서 TGF-β에 의해 고도로 유도되는 세포 부착 분자로서 세포 성장(cell growth), 세포 분화(cell differentiation), 창상 치유(wound healing), 형태 형성(morphogenesis) 및 세포 부착(cell adhesion)에 있어 매우 중요한 역할을 담당한다(Skonier J., Benenett K., Rothwell V., Kosowski S., Plowman G., Wallace P., Edelhoff S., Disteche C., Neubauer M., Marquardt H., Rodgers J., 및 Purchio A.F., DNA Cell Biol., 1994, 13, 571-584; Dieudonne S.C., Kerr K.M., Xu T., Sommer B., DeRubeis A.R., Kuznetsov S.A., Kim I.-S., Robey P.G., 및 Young M.F., J. Cell. Biochem., 1999, 76, 231-243; Kim J.-E., Kim E.-H., Han E.-H., Park R.-W., Park I.-H., Jun S.-H., Kim J.-C., Young M.F., 및 Kim I.-S., J. Cell. Biochem., 2000, 77, 169-178; Rawe I.M., Zhan Q., Burrows R., Bennett K., 및 Cintron C., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1997, 38, 893-900; LeBaron R.G., Bezverkov K.I., Zimber M.P., Pavele R., Skonier J., 및 Purchio A.F., J. Invest. Dermatol., 1995, 104, 844-849; Ohno S., Noshiro M., Makihira S., Kawamoto T., Shen M., Yan W., Kawashim-Ohya Y., Fujimoto K., Tanne K., 및 Kato Y., Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1451, 196-205; Kim J.-E., Kim S.-J., Lee B.-H., Park R.-W., Kim K.-S., 및 Kim I.-S., J. Biol. Chem., 2000, 275, 30907-30915).

βig-h3은 RGD 모티프와 함께 상동성을 지닌 4개의 내부 반복 도메인(internal repeated domain)을 포함하는데, 이들은 포유류, 곤충, 섬게, 식물, 효모 및 세균을 포함하는 여러 종의 분비 단백질 또는 막 단백질에서 매우 보존적인 서열로서 발견된다. 상기 보존적 서열을 포함하는 단백질들에는 페리오스틴(periostin), 파스시클린 Ⅰ(fasciclin Ⅰ), 섬게 HLC-2(sea urchin HLC-2), 알갈-CAM(algal-CAM) 및 마이코박테리움 MPB70(mycobacterium MPB70) 등이 포함된다. 이러한 단백질들에서 보존적으로 발견되는 상동성 도메인(이하 "파스-1( fas-1)"이라 약칭함)은 110 내지 140개의 아미노산으로 구성되며 약 10개의 아미노산으로 구성된 매우 보존적인 두 개의 가지(H1 및 H2)를 포함하고 있다. 상기 단백질들 중 βig-h3, 페리오스틴 및 파스시클린 Ⅰ은 4개의 파스-1 도메인을 가지며, HLC-2는 2개, MPB70은 오직 한 개의 파스-1 도메인을 가지고 있다. 상기 단백질들의 생물학적 기능이 정확하게 밝혀진 것은 아니지만, 이들 중 몇몇이 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)로서 작용함이 보고되었다. 예를 들면, βig-h3, 페리오스틴 및 파스시클린 Ⅰ은 각각 섬유아세포, 골아세포 및 신경세포의 부착을 매개하는 것으로 보고되었으며, 알갈-CAM은 조류 볼복스(Vovolx)의 자층(embryos)에 존재하는 세포 부착 분자임이 밝혀졌다.

이와 같이 세포 부착 분자로서 βig-h3의 세포 부착 활성은 인간의 피부 섬유아세포(dermal fibroblasts)에서 최초로 보고된 후 연골아세포(chondrocytes), 복막 섬유아세포(peritoneal fibroblasts) 및 인간의 MRC5 섬유아세포 등에서도 보고되었다. 이러한 βig-h3의 세포 부착 활성은 초기에는 βig-h3의 C-말단에 존재하는 RGD 모티프에 의해 매개되는 것으로 여겨졌으나, RGD 모티프가 연골아세포의 분산을 촉진하는데 필요하지 않으며, 카르복실-말단 프로쎄싱(carbocyl-terminus processing)에 의해 RGD 모티프가 결실된 성숙한 형태의 βig-h3이 세포 부착을 억제할 수 있음이 보고되면서, RGD 모티프가 βig-h3의 세포 부착 활성을 매개하는데 필수불가결한 요소가 아님이 확인되었다. 또한, 최근의 연구 결과에서 βig-h3은 인테그린 α1β1을 통해 섬유아세포의 분산을 증가시키는 반면, βig-h3의 RGD 모티프는 βig-h3-매개성 세포 분산에 요구되지 않으며 βig-h3 내 보존적 H1 및 H2 펩타이드 역시 βig-h3-매개성 세포 부착에 효과적이지 않음이 보고되었다. 이러한 결과는 βig-h3의 세포 부착 활성을 위한 필수적인 아미노산이 H1 및 H2 지역이 아닌 다른 곳에 존재함을 의미하며, βig-h3의 반복 파스-1 도메인 뿐만 아니라 다른 단백질들의 파스-1 도메인들과의 상동성을 비교한 컴퓨터 분석 결과 역시 H1 및 H2 이외에도 여러 개의 매우 보존적인 아미노산이 존재하여 이들이 세포 부착 활성에 관여할 수 있음을 제시하였다.

한편, βig-h3는 세포외 매트릭스 단백질로서 섬유아세포(fibroblast)를 포함하는 몇몇 종류의 세포들에서 TGF-β에 의해서 발현이 유도된다. βig-h3 유전자는 Skonier 등에 의하여 TGF-β로 처리한 인간 폐 선암종 세포주인 A549 세포주를 이용하여 제조한 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 최초로 동정되었다(Skonier J., Neubauer M., Madisen L., Bennett K., Plowman G.D., 및 Purchio A.F., DNA Cell Biol., 1992, 11, 511-522). βig-h3 단백질은 초파리의 파시클린(fasciclin)-I에 존재하는 유사한 모티프(motif)와 동질성을 가지는 파스(fas)-1 도메인이라고 불리는 네 개의 동질적(homologous) 내부 반복 도메인을 포함하는 683개의 아미노산으로 구성된다. 파스-1 도메인은 포유동물, 곤충, 성게, 식물, 효모 및 세균을 포함하는 몇몇 종들의 어떤 분비단백질 및 막 단백질에서 발견되며, 매우 보존적인 서열을 가진다(Kawamoto T., Noshiro M., Shen M., Nakamasu K., Hashimoto K., Kawashima-Ohya Y., Gotoh O., 및 Kato Y., Biochim. Biophys, Acta, 1998, 288-292). βig-h3의 돌연변이는 인간 상 염색체의 5q31과 연관된 우성 각막 기능장애(corneal dystrophy)와 관련이 있음이 보고되었다(Munier FL, Korvatska E, Djemai S, LePaslier D, Zografos L, Pescia G, Schorderet DF. Nat Genet. 1997, 15, 247-252). βig-h3 단백질은 섬유성 구조(fibrillar structure)를 가지며 피브로넥틴(fibronectin) 및 콜라겐(collagen)과 같은 몇몇 종류의 세포외 매트릭스 단백질(extracellualr matrix protein)과 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Kim J.-E., Park R.-W., Choi J.-Y., Bae Y.-C., Kim K.-S., Joo C.-K., 및 Kim I.-S., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2002, 43, 656-661). 아울러, βig-h3는 세포의 성장, 분화, 상처의 치료 및 세포의 부착에 관여한다는 보고도 있다(Skonier J., Benenett K., Rothwell V., Kosowski S., Plowman G., Wallace P., Edelhoff S., Disteche C., Neubauer M., Marquardt H., Rodgers J., 및 Purchio A.F., DNA Cell Biol., 1994, 13, 571-584; Dieudonne S.C., Kerr K.M., Xu T., Sommer B., DeRubeis A.R., Kuznetsov S.A., Kim I.-S., Robey P.G., 및 Young M.F., J. Cell. Biochem., 1999, 76, 231-243; Kim J.-E., Kim E.-H., Han E.-H., Park R.-W., Park I.-H., Jun S.-H., Kim J.-C., Young M.F., 및 Kim I.-S., J. Cell. Biochem., 2000, 77, 169-178; Rawe I.M., Zhan Q., Burrows R., Bennett K., 및 Cintron C., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1997, 38, 893-900; LeBaron R.G., Bezverkov K.I., Zimber M.P., Pavele R., Skonier J., 및 Purchio A.F., J. Invest. Dermatol., 1995, 104, 844-849; Ohno S., Noshiro M., Makihira S., Kawamoto T., Shen M., Yan W., Kawashim-Ohya Y., Fujimoto K., Tanne K., 및 Kato Y., Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1451, 196-205). βig-h3는 각막 상피 세포, 연골세포 및 섬유아세포와 같은 많은 다양한 유형의 세포들의 부착을 매개하는 것으로 알려져 있다(LeBaron R.G., Bezverkov K.I., Zimber M.P., Pavele R., Skonier J., 및 Purchio A.F., J. Invest. Dermatol., 1995, 104, 844-849; Ohno S., Noshiro M., Makihira S., Kawamoto T., Shen M., Yan W., Kawashim-Ohya Y., Fujimoto K., Tanne K., 및 Kato Y., Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1451, 196-205; Kim J.-E., Kim S.-J., Lee B.-H., Park R.-W., Kim K.-S., 및 Kim I.-S., J. Biol. Chem., 2000, 275, 30907-30915). 본 발명자들은 βig-h3가 α3β1 인테그린(integrin)을 통하여 각막 상피 세포의 부착을 매개한다는 것을 확인하였으며, βig-h3의 두 번째 및 네 번째 파스-1 도메인에 존재하는 α3β1 인테그린과 상호작용하는 두 개의 모티프를 동정하였음을 보고한 바 있다(Kim J.-E., Kim S.-J., Lee B.-H., Park R.-W., Kim K.-S., 및 Kim I.-S., J. Biol. Chem., 2000, 275, 30907-30915). 그러나, 흥미롭게도 본 발명자들은 α3β1 인테그린과 상호작용하는 상기 두 개의 모티프가 섬유아세포의 부착을 매개할 수 없다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 βig-h3의 모든 네 개의 파스-1 도메인이 섬유아세포의 부착을 매개할 수 있는 반면에 단지 2번째 및 네 번째 파스-1 도메인만이 각막 상피세포의 부착을 매개할 수 있음을 발견하였다. 상기 결과는 βig-h3가 종래에 알려진 α3β1 인테그린과 상호작용하는 모티프와 구별되는 세포의 부착을 매개하는 또 다른 모티프를 가지고 있음을 제시한다.

이에, 본 발명자들은 보존된 아미노산으로서 티로신 및 히스티딘을 포함하는 βig-h3 단백질 유래의 신규한 모티프가 αvβ5 인테그린과 상호작용함으로써 섬유아세포의 부착을 매개하고, 상기 모티프가 다양한 종(species)의 다양한 단백질에 존재하는 많은 파스-1 도메인에서 매우 보존되어 있음을 확인하였으며, 또한 βig-h3가 다른 종류의 인테그린과 상호작용하는 다중 세포 부착 모티프를 통하여 다양한 유형의 세포의 기능을 매개하며, 파스-1 도메인을 가지고 있는 많은 단백질들이 다양한 조건하에서 인테그린을 통하여 세포의 기능을 조절할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 섬유아세포 αvβ5 integrin과 특이적으로 결합하며, 세포의 부착, 확산 및 탈착을 매개하는 βｉｇ-ｈ3 단백질 유래 펩타이드 및 그의 유도체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 섬유아세포에 특이적으로 부착하며, αvβ5 인테그린을 통하여 세포 부착 활성을 매개하고 세포 부착 및 탈착 활성에 관여하는 보존된 아미노산으로서 티로신 및 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 창상치유, 조직재생 또는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 섬유아세포에 특이적으로 부착하며, αvβ5 인테그린을 통하여 세포 부착 활성을 매개하고 세포 부착 및 탈착 활성에 관여하는 보존된 아미노산으로서 티로신 및 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 βig-h3 단백질의 제 4 파스-1 도메인으로부터 분리하였으며, 세포의 부착에 관여하는 보존된 아미노산 서열로서 티로신 및 히스티딘 잔기를 포함하고 10개 이상의 아미노산의 잔기를 가지는 펩타이드이다. 본 발명의 펩타이드에 있어서, 티로신 및 히스티딘 잔기는 모두 존재하는 것이 가장 바람직하나 이중에서 하나의 아미노산 잔기가 티로신 및 히스티딘 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 펩타이드도 여전히 세포 부착 활성을 가지므로 이들도 역시 본 발명에 포함된다. 또한, 18개 이상의 아미노산 서열을 가지는 것이 더욱 바람직하다. 특히, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 10 내지 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드를 포함하는 것이 바람직하며, 이 중에서 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 펩타이드는 αvβ5 인테그린을 통하여 세포 부착 및 탈착 활성을 매개한다.

본 발명자들은 서열번호 1로 기재되는 βig-h3 단백질의 1번째 및 3번째 도메인이 아니라 2번째 및 4번째 파스-1 도메인에 존재하는 두 개의 모티프가 각막 상피 세포의 부착을 매개한다는 사실을 보고한 바 있다(Kim J.-E., Kim S.-J., Lee B.-H., Park R.-W., Kim K.-S., 및 Kim I.-S., J. Biol. Chem., 2000, 275, 30907-30915). 그러나, 본 발명자들은 상기 모티프가 단지 상피 세포의 부착만을 매개할 수 있으며, 섬유아세포, 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cell) 및 조골세포(osteoblast)를 포함하는 간엽세포(mesenchymal cell)의 부착은 매개할 수 없음을 발견하였다. 이러한 예비 실험으로부터, 본 발명자들은 섬유아세포의 부착을 매개할 수 있는 βig-h3에 존재하는 다른 모티프를 발견하고자 하였다. 본 발명자들은 본 발명에서 αvβ5 인테그린과 상호작용하는 신규한 모티프를 동정하였으며, 상기 모티프를 통하여 βig-h3가 섬유아세포의 부착을 매개한다는 것을 확인하였다.

각막 상피 세포와는 달리, MRC-5 섬유아세포는 βig-h3의 각각의 파스-1 도메인에 부착하며, 이러한 부착은 α3β1 인테그린과 상호작용하는 펩타이드인 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 NKDIL 및 EPDIM 펩타이드에 의하여 방해받지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 MRC-5 세포는 α3β1 인테그린과는 구별되는 또 다른 인테그린을 통하여 βig-h3에 부착하는 것으로 판단하였다.

MRC-5 세포의 부착을 매개하는 인테그린 타입을 동정하기 위하여, 본 발명자들은 인테그린의 기능을 블록하는 몇몇 항체들을 이용하여 실험을 실시하였다. 그 결과, 본 발명자들은 αvβ5 인테그린의 기능을 억제하는 항체만이 βig-h3 단백질 및 각각의 도메인에 대한 MRC-5 세포의 부착을 억제할 수 있음을 확인하였으며(도 1b 및 도 1c 참조), 또한 MRC-5 세포가 αvβ5 인테그린을 세포 표면에 발현한다는 것을 확인하였다(도 1d 참조). Ohno 등은 βig-h3가 α1β1 인테그린을 통하여 MRC-5 섬유아세포의 부착을 매개한다는 사실을 보고한 바 있다(Ohno S., Noshiro M., Makihira S., Kawamoto T., Shen M., Yan W., Kawashim-Ohya Y., Fujimoto K., Tanne K., 및 Kato Y., Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1451, 196-205). 상기 보고와는 반대로 본 발명자들은 α1β1 인테그린의 기능을 블록하는 항체는 βig-h3에 대한 MRC-5 세포의 부착을 의미있는 정도로 억제하지 못한다는 것을 확인하였다. 따라서, MRC-5 세포가 α1β1 인테그린을 발현할지라도 그것은 βig-h3에 의해 매개되는 βig-h3에 대한 MRC-5 세포의 부착에 관여하지 않을 수도 있다.

흥미롭게도, MRC-5 세포와 각막상피세포인 HCE 세포가 α3β1 인테그린 및 αvβ5 인테그린을 모두 발현함에도 불구하고(Kim J.-E., Kim S.-J., Lee B.-H., Park R.-W., Kim K.-S., 및 Kim I.-S., J. Biol. Chem., 2000, 275, 30907-30915), 각각의 세포주는 βig-h3에 부착하기 위하여 단지 한가지 타입의 인테그린만을 사용한다. 그 이유는 각 세포주에 존재하는 각각의 인테그린의 활성 상태에 기인하는 것으로 보인다. 동일한 분자와 상호작용하기 위하여 다른 종류의 세포주들이 어떻게 서로 다른 종류의 인테그린을 사용하는가에 대한 연구는 흥미로울 것이다. 다양한 세포내 인자들이 신호를 보내며, 이러한 신호에 의하여 세포는 ECM 리간드에 대한 인테그린의 친화성(affinity)과 결합성(avidity)을 조정하게 된다. 예를 들면, R-라스(Ras) 및 H-라스 단백질은 다양한 인테그린의 세포외 기질단백질에 대한 친화성을 변화시킴으로써 세포의 부착을 조절할 수 있는 것으로 알려져 있다(Zhang Z., Vuori K., Wang H., Reed J.C., 및 Ruoslahti E., Cell, 1996, 85, 61-69; Hughes P.E., Renshaw M.W., Pfaff M., Forsyth J., Keivens V.M., Schwartz M.A., 및 Ginsberg M.H., Cell, 1997, 88, 521-530). 인테그린의 세포질 도메인에 인산화가 일어나면 인테그린의 구조가 변화되어서 리간드에 대한 친화성이 변하게 된다(Datta A., Huber F., 및 Boettiger D., J. Biol. Chem., 2002, 277, 3943-3949). MRC-5 세포가 βig-h3와 상호작용하기 위하여 α3β1 인테그린 보다는 αvβ5 인테그린을 선택하는 메카니즘을 밝히기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.

파스-1 도메인에 의해 매개되는 모든 MRC-5 세포의 부착이 αvβ5 인테그린에 특이적인 항체에 의해서 블록된다는 사실은 각각의 도메인이 αvβ5 인테그린과 상호작용하는 모티프를 가지고 있다는 것을 제시한다(도 1a 참조). 비록 H1 및 H2 도메인이 각각의 파스-1 도메인에서 매우 보존되어 있지만, 본 발명자들은 상기 두 개의 도메인이 βig-h3의 세포 부착 활성에 관여하고 있지 않다는 것을 확인하였다(도 2a 참조). 모든 네 개의 파스-1 도메인이 동일한 인테그린 타입을 통해서 세포의 부착을 매개하였으므로, 본 발명자들은 보존된 모티프(conserved motif)가 각각의 도메인에 존재할 것이라고 추측하였다. 실제로, βig-h3의 네 개의 파스-1 도메인 및 파스-1 도메인을 포함하는 다른 단백질들의 서열을 분석한 결과, 본 발명자들은 티로신, 히스티딘 및 많은 루신 잔기들이 매우 보존되어 있다는 것을 발견하였다(도 2b 참조). 본 발명자들은 결실 및 치환 돌연변이 연구 결과, 상기 아미노산 잔기들을 포함하는 모티프는 αvβ5 인테그린과의 상호작용을 통하여 βig-h3의 세포 부착 활성에 필수적임을 확인하였다(도 2c 참조). 티로신 및 히스티딘의 단일(single) 점 돌연변이는 세포 부착 활성에 의미있는 정도로 영향을 미치지 않았으며, 아울러 다중(multiple) 아미노산의 치환 돌연변이도 세포 부착 활성을 완전히 없앨 수는 없었기 때문에, 본 발명자들은 α3β1 인테그린과 상호작용하는 모티프인 βig-h3의 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 NKDIL 및 EPDIM 펩타이드와는 달리 상기 새로운 모티프의 세포 부착 활성은 몇몇 아미노산 잔기에 의존하지는 않음을 확인하였다. 모든 보존된 아미노산을 광범위하게 돌연변이시킨 경우에만 βig-h3의 세포 부착 활성을 거의 완전히 없앨 수 있었다. 이러한 사실은 합성 펩타이드를 사용한 연구에서 6개의 아미노산 또는 10개의 아미노산으로 구성되는 펩타이드는 세포 부착을 방해할 수 없었던 반면에 18개의 아미노산으로 구성되는 펩타이드는 세포 부착을 방해할 수 있었던 것에 의해서 뒷받침된다(도 3a 내지 도 3c 참조). 상기 결과로부터, 세포 부착 활성에 요구되는 상기 모티프의 구조(conformation)는 몇몇 아미노산보다는 많은 아미노산들에 의존적임을 알 수 있다.

인간의 경우, 네가지 단백질이 파스-1 도메인을 포함하고 있다고 알려져 있다. βig-h3 및 페리오스틴(periostin)은 네 개의 파스-1 도메인을 가지는 분비(secretory) 단백질인 반면에, 스타빌린(stabilin)-1 및 스타빌린-2는 일곱 개의 파스-1 도메인을 가지는 막(membrane) 단백질이다. 이들의 생물학적인 기능을 완전하게 이해하고 있는 것은 아니지만, 상기 단백질들의 모든 파스-1 도메인은 인테그린과 상호작용 할 수 있는 YH 모티프를 가지고 있다고 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 상기 모든 단백질들이 세포-기질 상호작용 및 세포-세포 상호작용을 조절하는 기능을 할 수 있다고 제시한다. 인테그린과 상호작용하는 것으로 알려진 어떤 단백질들도 하나의 인테그린 타입과 상호작용하는 다중 반복 모티프를 가지고 있지 않기 때문에, 상기 네가지 인간 단백질들은 단일한 분자 내에 다중 반복적인 인테그린과 상호작용하는 모티프를 가지고 있다는 점에서 독특하다(unique). 이러한 구별되는 특성의 생물학적인 의미를 연구하는 것은 흥미로운 일이다.

결론적으로, 본 발명자들은 βig-h3의 각각의 파스-1 반복 도메인에 존재하는 αvβ5 인테그린과 상호작용하는 신규한 세포 부착 모티프를 동정하였으며, 상기 모티프는 다중 루신/이소루신 잔기들이 인접해 있는 티로신 및 히스티딘 아미노산 잔기들로 구성되어 있다. 상기 모티프가 다른 단백질들의 대부분의 파스-1 도메인에서도 잘 보존되어 있다는 사실로부터, 파스-1 도메인을 포함하는 단백질들은 인테그린을 통하여 세포의 기능을 조절할 수 있음을 추측할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 창상치유, 조직재생 또는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드 및 그의 유도체는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드 및 그의 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 펩타이드의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르빅산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분활 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> βig-h3의 각 도메인에 대한 세포의 부착 및 세포의 부착에 관여하는 수용체의 동정

<1-1> 세포의 배양

인간 폐 섬유아세포주인 MRC-5 세포(한국세포주은행)는 10% FBS (Fetal Bovine Serum)를 포함하는 RPMI 1640 배지(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)에서 37℃, 5% CO₂ 상태에서 배양하였다.

<1-2> 세포 부착 분석

세포 부착 분석은 이전 기술에 따라 수행하였다(Kim I.-S., Sinha S., deCrombrugghe B., 및 Maity S.N., Mol. Cell. Biol., 1996, 16, 4003-4013). 구체적으로, 바닥이 평평한 96웰 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 플레이트(Costar, Corning Inc., NY)에 상기에서 제조한 재조합 βig-h3 단백질 또는 다른 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질을 첨가한 후 4℃에서 밤새 배양하여 코팅하였고, 그 후 2% BSA를 포함하는 PBS 용액으로 실온에서 1시간동안 블록시켰다. 3×10⁵ 세포/㎖의 농도로 배양 배지에서 MRC-5 세포를 부유시킨 후, 0.1 ㎖의 세포 부유물을 코팅된 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 30분간 배양시킨 후 부착되지 않은 세포들을 PBS로 한차례 세척하여 제거하였다. 부착된 세포는 3.75 mM p-니트로페닐-N-아세틸 β-D-글리코사미나이드(glycosaminide) 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함하는 pH 5.0의 50 mM 구연산(citrate) 버퍼를 첨가하여 37℃에서 1시간동안 배양하였다. N-acetyl-β-D-glucosaminidase 효소의 활성은 5 mM EDTA를 포함하는 pH 10.4의 50 mM의 글리신(glycine) 버퍼를 첨가함으로써 블록시켰으며, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(Bio-Rad model 550 microplate reader). 이때, 세포가 많이 붙어있을수록, 즉 세포의 수가 많을수록 효소의 활성도가 높게 측정된다.

그 결과, MRC-5 섬유아세포는 βig-h3의 네 개의 파스-1 도메인에 각각 동일하게 부착한다는 것을 확인하였다(도 1a 참조). 상기 결과는 MRC-5 세포의 부착에 필요한 모티프를 βig-h3에 존재하는 각각의 파스-1 도메인이 가지고 있으며, 상기 모티프는 이전에 본 발명자들이 βig-h3의 2번째 및 4번째 파스-1 도메인에서 동정한 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 NKDIL 및 EPDIM 아미노산 서열과는 다른 서열임을 의미한다. 실제로, 본 발명자들은 첫 번째 파스-1 도메인의 서열번호 4로 기재되는 KADHH 서열, 두 번째 파스-1 도메인의 NKDIL 서열 및 4번째 파스-1 도메인의 EPDIM 서열이 MRC-5 세포가 βig-h3-WT 단백질 및 각각의 파스-1 도메인 단백질에 부착하는 것을 억제할 수 없음을 확인하였다(도 1a).

<1-3> 세포의 부착에 관여하는 수용체의 동정

다음으로, 본 발명자들은 βig-h3 단백질에 결합하는 MRC-5 섬유아세포의 수용체를 동정하기 위하여, 인테그린 서브유닛의 기능을 블록하는 단일클론 항체가 βig-h3-WT 단백질 또는 각각의 파스-1 도메인 단백질이 코팅된 표면에 대한 MRC-5 세포의 부착에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 βig-h3와 결합하는 수용체를 동정하기 위하여, 0.1 ㎖의 배양 용액에서 3×10⁵ 세포/㎖ 농도의 MRC-5 세포와 함께 다양한 종류의 인테그린(Chemicon, International Inc. Temecula, CA)에 대한 단일클론 항체를 37℃에서 30분간 각각 전배양시켰다. 전배양된 세포를 재조합 βig-h3 단백질로 미리 코팅된 플레이트로 전달시킨 후 37℃에서 30분간 추가로 배양하였다. 부착된 세포는 실시예 <1-2>에 기술한 바와 같이 정량하였다. 인테그린 서브유닛(subunit)에 대한 기능을 블록하는(function-blocking) 단일클론 항체를 하기에 나타내었다; α1(FB12), α2(P1E6), α3(P1B5), α4(P1H4), α5(P1D6), α6(G₀H₃), αv(P3G8), β1(6S6), β2(P4H9), αvβ3(LM609), αvβ5(P1F6).

그 결과, 야생형 βig-h3 단백질 또는 네 번째 파스-1 도메인이 코팅된 표면에 대한 MRC-5 세포의 부착은 αvβ5 서브유닛에 대한 항체에 의해서 특이적으로 억제되었으나 다른 인테그린 서브유닛에 대한 항체에 의해서는 억제되지 않았다(도 1b). 또한, 각각의 파스-1 도메인에 대한 MRC-5 세포의 부착도 αvβ5 인테그린에 대한 항체에 의해서 억제되었다(도 1c). 상기 결과로부터, βig-h3의 각각의 파스-1 도메인에 αvβ5 인테그린과 상호작용하는 모티프가 존재함을 확인하였다.

<1-4> 유세포 분석(flow cytometric analysis, FACS)

MRC-5 세포가 세포 표면에 αvβ5 인테그린을 발현한다는 것을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 다양한 인테그린에 대한 단일클론 항체를 사용하여 FACS 분석을 추가로 실시하였다. 구체적으로, 플레이트에 완전히 자란(confluent) 세포에 0.25% 트립신-0.05% EDTA를 처리하여 플레이트로부터 세포를 떼어내었다. 세포를 PBS로 두차례 세척한 후 PBS에 재부유시켰으며, 적당한(appropriate) 항체로 4℃에서 1시간동안 배양하였다. 인테그린에 대한 항체인 α1(Fβ12), α3(ASC-1), α4(P1H4), 5β1(HA5), α6(CLB701), αv(P3G8), αvβ3(LM609), αvβ5(P1F6) 및 β1(12G10)은 케미콘사(Chemicon)로부터 구입하였다. 10 ㎍/㎖의 FITC(Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)와 결합된 이차(secondary) 염소-항마우스 IgG 항체로 4℃에서 1시간동안 세포를 배양시킨 후 유세포 분석을 실시하였다(FACSCalibur system, Becton Dickinson, San Jose, CA).

그 결과, αvβ5 인테그린을 포함하는 몇몇 인테그린이 MRC-5 세포의 표면에서 검출되었으나 αvβ3 인테그린은 검출되지 않음을 확인하였다(도 1d).

<실시예 2> 세포의 부착을 매개하는 모티프의 동정

<2-1> 결실 재조합 단백질의 제조

αvβ5 인테그린과 상호작용하는 모티프를 동정하기 위하여, 본 발명자들은 네 번째 파스-1 도메인에 대한 다양한 N-말단 및 C-말단 결실 재조합 단백질을 제조하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 네 번째 파스-1 도메인의 재조합 단백질인 ΔH1, ΔH2, ΔH2(6), ΔH1H2 및 ΔH1H2(6)를 제조하였다(도 2a 참조). 상기에서, ΔH1 및 ΔH2는 각각 매우 보존적인 서열인 H1 및 H2가 결실된 재조합 단백질을 나타내며, Δ(6)는 α3β1 인테그린과 상호작용하는 모티프인 서열번호 3으로 기재되는 EPDIM 서열을 포함하는 C-말단 절편이 결실된 것을 나타낸다. 상기 재조합 단백질을 제조하기 위하여, 먼저 βig-h3의 네 번째 도메인인 서열번호 5로 기재되는 498-637 아미노산을 코딩하는 βigh3 D-Ⅳ cDNA를 사용하여 결실 돌연변이 구조체를 클로닝하였다(Kim J.-E., Kim S.-J., Lee B.-H., Park R.-W., Kim K.-S., 및 Kim I.-S., J. Biol. Chem., 2000, 275, 30907-30915). 각각 서열번호 6 내지 서열번호 10으로 기재되는 548-637, 498-620, 498-614, 548-620 및 548-614 아미노산을 코딩하는 βig-h3 cDNA의 각 절편들은 βigh3 D-Ⅳ cDNA를 주형으로 PCR을 실시하여 제조하였으며, pET-29b(+) 벡터(Novagen; Madison, WI)의 EcoRV/XhoI 부위에 클로닝한 후 각각 ΔH1, ΔH2, ΔH2(6), ΔH1H2 및 ΔH1H2(6)라 명명하였다. βigh3 D-Ⅳ의 티로신 또는 히스티딘 아미노산의 치환 돌연변이체는 이전에 기술된 방법에 따라 두 단계의 PCR에 의하여 제조하였다(Kim I.-S., Sinha S., deCrombrugghe B., 및 Maity S.N., Mol. Cell. Biol., 1996, 16, 4003-4013). 돌연변이는 DNA 시퀀싱(sequence)에 의하여 확인하였다. 재조합 βig-h3 단백질은 이전에 기술된 방법에 따라 발현한 후 정제하였다(Kim J.-E., Kim E.-H., Han E.-H., Park R.-W., Park I.-H., Jun S.-H., Kim J.-C., Young M.F., 및 Kim I.-S., J. Cell. Biochem., 2000, 77, 169-178).

다음으로 본 발명자들은 각각의 상기 돌연변이 단백질의 세포 부착 활성을 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과, 가장 작은 크기의 돌연변이 단백질인 ΔH1H2(6)도 MRC-5 세포의 부착을 매개하는데 있어서 여전히 활성적임을 확인하였다(도 2a). 상기 결과로부터, 세포 부착에 관여하는 모티프는 아미노산 548-614의 절편에 존재한다는 것을 확인하였다.

상기 절편에 존재하는 세포 부착 모티프를 추가로 동정하기 위하여, 본 발명자들은 Prodom 2001.2 프로그램을 이용하여 각각의 βig-h3 도메인 사이에서뿐만 아니라 다른 단백질의 파스-1 도메인 사이에서도 동질성(homology)이 존재하는 부위에 대한 컴퓨터 검색을 실시하였다. 흥미롭게도, βig-h3의 네 개의 파스-1 도메인을 포함하는 많은 파스-1 도메인들의 경우, 본 발명자들은 티로신과 히스티딘의 두 개의 아미노산 잔기들이 각각의 도메인의 중심에 매우 보존되어 있음을 발견하였다(도 2b). 따라서, 본 발명자들은 티로신과 히스티딘을 포함하는 서열이 MRC-5 세포의 부착에 필수적으로 요구되는지 여부를 조사하기 위하여, 각각 아미노산 569-632 및 575-632 절편을 코딩하는 두 개의 결실 단백질인 βigh3 D-Ⅳ-569 및 βigh3 D-Ⅳ-575를 상기와 동일한 방법으로 추가로 제조하였다(Kim I.-S., Sinha S., deCrombrugghe B., 및 Maity S.N., Mol. Cell. Biol., 1996, 16, 4003-4013). 티로신 및 히스티딘이 각각 βig-h3의 네 번째 파스-1 도메인의 아미노산 571 및 572에 위치하고 있기 때문에, βigh3 D-Ⅳ-575는 티로신 및 히스티딘 잔기들이 결실되어 있으며, βigh3 D-Ⅳ-569는 티로신 571 이전에 단지 두 개의 아미노산만이 더 존재한다.

그 결과, 두 가지 돌연변이 단백질의 세포 부착 활성은 의미있는 정도로 감소되었다(도 2c). D-Ⅳ-575의 세포 부착 활성은 βigh3 D-Ⅳ-569의 경우보다 더 많이 감소하였다. 상기 결과는 티로신 및 히스티딘 주위의 서열들이 βig-h3의 세포 부착 활성에 있어서 매우 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

상기의 결과를 추가로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 571 티로신 및 572 히스티딘 또는 양쪽 모두가 알라닌으로 치환된 치환 돌연변이 단백질을 제조하였다(도 2c). 구체적으로, 이전에 기술된 방법에 따라 두 단계의 PCR에 의하여 치환 돌연변이 단백질을 제조하였다(Kim I.-S., Sinha S., deCrombrugghe B., 및 Maity S.N., Mol. Cell. Biol., 1996, 16, 4003-4013).

그 결과, 예상과는 달리 Y571A(βigh3 D-Ⅳ-AH) 및 H572A(βigh3 D-Ⅳ-YA) 단일 점 돌연변이(single point mutation) 단백질은 세포 부착 활성에 의미있는 정도로 영향을 미치지는 않았다. 이중(double) 점 돌연변이인 Y571A/H572A(βigh3 D-Ⅳ-AA)는 세포 부착 활성을 의미있는 정도로 억제하였으나 세포 부착 활성 자체가 완전히 없어지지는 않았다. 상기 결과로부터, 571 티로신 및 572 히스티딘 뿐만 아니라 인접한 아미노산들도 βig-h3에 대한 MRC-5 세포의 부착을 매개하는데 필요하다는 것을 확인하였다.

<2-2> 합성 펩타이드의 제조

본 발명자들은 티로신 및 히스티딘 잔기들이 MRC-5 세포의 부착에 필수적으로 요구되는지 여부를 확인하기 위하여, 합성 펩타이드를 사용하여 세포가 기질에 부착하는 것을 억제하는 능력을 측정하였다. 합성 펩타이드는 각각 서열번호 11 내지 서열번호 13으로 기재되는 596-574(YH6), 567-576(YH10) 및 563-580(YH18) 아미노산 서열을 가지는 세 가지 종류의 펩타이드를 사용하였으며, 애니진사(AnyGen Co. Ltd., Kwangju, Korea)로부터 구입하였다. 세포 부착 분석은 이전 기술에 따라 수행하였다(Kim J.-E., Kim S.-J., Lee B.-H., Park R.-W., Kim K.-S., 및 Kim I.-S., J. Biol. Chem., 2000, 275, 30907-30915).

그 결과, 본 발명자들은 YH6 펩타이드 및 YH10 펩타이드는 βig-h3에 대한 MRC-5 세포의 부착을 방해할 수 없음을 확인하였다. 반면에, YH18 펩타이드는 βig-h3에 대한 MRC-5 세포의 부착을 거의 완전히 억제하였다. YH18과 동일하지만 569-574 아미노산 서열이 뒤섞인 서열번호 17로 기재되는 YH18-con을 대조군으로 사용한 결과, 상기 대조군 펩타이드는 βig-h3에 대한 MRC-5 세포의 부착에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 3a). 본 발명자들은 각각의 파스-1 도메인이 세포 기질로 사용된 경우에도 유사한 결과를 얻었으며(도 3b), YH18 펩타이드에 의한 세포 부착의 억제는 농도-의존적임을 확인하였다(도 3c).

<2-3> 대응하는 파스-1 도메인 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ의 서열로부터 유래된 합성 펩타이드의 제조

본 발명자들은 βig-h3의 다른 파스-1 도메인의 보존된 아미노산 서열이 βig-h3에 대한 MRC-5 세포의 부착을 억제하는데 효과적인지 여부를 확인하기 위하여, 대응하는 파스-1 도메인 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ의 서열로부터 유래된 서열번호 14 내지 서열번호 16으로 기재되는 세 가지 합성 펩타이드를 사용하여 추가로 실험을 실시하였다. 구체적으로, 상기의 방법과 동일하게 300 μM의 각 펩타이드의 세포부착 억제 효과를 실험하였다.

그 결과, 도메인 Ⅳ의 YH18 펩타이드에 대응하는 도메인 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 유래의 각각의 펩타이드는 βig-h3에 대한 MRC-5 세포의 부착을 방해한다는 것을 확인하였다(도 3d). 상기 결과를 종합하여 볼 때, 티로신 및 히스티딘을 포함하는 보존된 아미노산들이 MRC-5 세포의 부착에 필수적으로 요구되며, 또한 티로신 및 히스티딘 뿐만 아니라 인접하는 아미노산들도 βig-h3 매개성 세포의 부착에 요구된다는 것을 확인하였다.

<2-4> 보존된 아미노산 잔기의 돌연변이가 세포의 부착에 미치는 영향 측정

도 4a에서 볼 수 있는 바와 같이 루신 및 이소루신이 다른 단백질의 파스-1 도메인 사이에서 매우 보존적이기 때문에, 본 발명자들은 티로신 및 히스티딘에 인접한 루신 및 이소루신 잔기가 세포의 부착에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 구체적으로, 티로신, 히스티딘, 루신 및 이소루신 잔기에 치환 돌연변이를 도입하였다(도 4b 참조). 구체적으로, 이전에 기술된 방법에 따라 두 단계의 PCR에 의하여 치환 돌연변이를 제조하였다(Kim I.-S., Sinha S., deCrombrugghe B., 및 Maity S.N., Mol. Cell. Biol., 1996, 16, 4003-4013).

그 결과, D-Ⅳ-L, D-Ⅳ-R, D-Ⅳ-LAA, D-Ⅳ-AAR 및 D-Ⅳ-LYHR은 낮은 세포 부착 활성을 나타내었지만 어느 정도는 여전히 세포 부착 활성을 유지하였다(도 4b). 반면에, 보존된 모든 아미노산이 치환된 D-Ⅳ-LAAR 돌연변이의 경우에는 MRC-5 세포에 대한 세포 부착 활성을 거의 완전히 잃어버렸다. 상기 결과로부터, αvβ5 인테그린을 통한 MRC-5 세포의 부착을 매개하기 위하여 βig-h3 단백질에 요구되는 구조를 형성하기 위하여 다중(multiple) 아미노산 서열의 펩타이드가 요구됨을 확인하였다.

<실시예 3> βig-h3에 대한 기능적 수용체의 동정

βig-h3가 αvβ5 인테그린을 통하여 세포 부착을 매개한다는 것을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 인간 β5 인테그린을 발현하고 안정적으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주인 HEK 293 세포(β5/293)를 사용하여 추가로 실험을 실시하였다. 대조군으로는 pcDNA3로 형질전환된 HEK 293 세포(pc/293, 미국 산디에고의 번햄연구소(Burnham Institutue)의 Jeffrey Smith 박사에게서 제공받음)를 사용하였다. 안정적으로(stable) 형질전환된 HEK 293 세포주는 10% FBS와 항생제를 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 배양하였다. HEK 293 세포는 내생적으로(endogenously)는 β5 인테그린을 발현하지 않는 반면, α1β1, α3β1, α5β1, α6β1 및 αvβ1을 포함하는 다중 β1 인테그린을 발현한다(Bossy B. 및 Reichardt LF., Biochemistry, 1990, 29, 10191-10198). 먼저, 본 발명자들은 상기 실시예 <1-4>와 동일한 방법으로 FACS 분석을 통하여 β5/293 세포가 αvβ5 인테그린을 발현한다는 것을 확인하였다.

그 결과, β5/293 세포는 βigh3-WT 또는 비트로넥틴(vitronectin)으로 코팅된 표면에 강하게 부착한 반면, 대조군(empty) 벡터로 안정하게 형질전환된 pc/293 세포의 경우에는 코팅된 표면에 부착하지 않았다(도 5a). βig-h3에 대한 β5/293 세포의 부착은 αvβ5 인테그린에 대한 항체(도 5b) 및 YH18 펩타이드(도 5c)에 의해 특이적으로 억제되었다. 상기 결과로부터, 본 발명자들은 βig-h3가 αvβ5 인테그린과의 상호작용을 통하여 세포 부착을 매개한다는 것을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 βig-h3 단백질 유래 펩타이드 및 그의 유도체는 βig-h3를 포함하는 다양한 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein)에 의해 매개되는 세포 부착 활성 연구에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 창상치유, 조직재생 및 암전이 억제 등에 매우 유용한 세포 부착, 확산 및 탈착을 촉진하는 펩타이드의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 합성 펩타이드에 의하여 MRC-5 세포의 부착이 억제되는 것을 보여주는 그래프이고,

도 1b는 βig-h3에 대한 MRC-5 세포 표면 수용체를 동정한 결과를 보여주는 그래프이고,

α1 ; FB12, α2 ; P1E6, α3 ; P1B5, α4 ; P1H4,

α5 ; P1D6, α6 ; G₀H₃, αv ; P3G8, β1 ; 6S6,

β2 ; P4H9, αvβ3 ; LM609, αvβ5 ; P1F6

도 1c는 각각의 파스-1 도메인에 MRC-5 세포가 부착하는 것에 대하여 인테그린 αvβ5의 기능을 블록하는 항체가 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,

도 1d는 MRC-5 세포의 표면에 발현되는 인테그린의 종류를 보여주는 유세포분석 결과이고,

도 2a는 βig-h3의 다섯 가지의 H1 또는 H2 결실 재조합 단백질에 대한 개략도 및 이들이 MRC-5 세포의 부착에 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,

도 2b는 다양한 단백질 유래의 파스-1 도메인 사이에서 보존된 티로신 및 히스티딘 잔기를 포함하는 서열을 비교한 것이고,

도 2c는 βig-h3의 티로신-히스티딘 치환 재조합 단백질에 대한 개략도 및 이들이 MRC-5 세포의 부착에 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,

도 3a는 βig-h3의 네 번째 파스-1 도메인에 존재하는 네 가지 합성 펩타이드가 세포의 부착에 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,

도 3b는 합성 펩타이드인 YH18에 의하여 βig-h3의 각각의 도메인에 MRC-5 세포가 부착하는 것을 방해하는 정도를 보여주는 그래프이고,

도 3c는 합성 펩타이드의 농도에 따라 βig-h3 D-Ⅳ로 코팅된 표면에 MRC-5 세포가 부착하는 것을 방해하는 정도를 보여주는 그래프이고,

도 3d는 파스-1 도메인 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 유래의 합성 펩타이드에 의한 MRC-5 세포의 부착 억제 정도를 보여주는 그래프이고,

도 4a는 다양한 단백질 유래의 파스-1 도메인에 존재하는 티로신 및 히스티딘에 인접하는 보존된 루신/이소루신 잔기를 포함하는 서열을 비교한 것이고,

도 4b는 티로신 및 히스티딘 뿐만 아니라 루신/이소루신 잔기의 치환 돌연변이가 세포의 부착 활성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,

도 5a는 β5 인테그린으로 안정적으로 형질전환된 HEK 293 세포가 βig-h3 또는 비트로넥틴(VN)으로 코팅된 플레이트에 부착하는 정도를 보여주는 그래프이고,

β5/293 ; β5 인테그린으로 형질전환된 HEK 293 세포,

pc/293 : 대조군 벡터로 형질전환된 HEK 293 세포

도 5b는 β5/293 세포가 βigh3-WT 단백질에 부착하는데 인테그린의 기능을 억제하는 항체가 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,

도 5c는 합성 YH18 펩타이드가 βigh3-WT 단백질에 대한 β5/293 세포의 결합에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

<110> KOREA(KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY) <120> Peptide originated from βig-h3 protein binding specifically to the αvβ5 integrin of fibroblast cells <130> 2p-06-62B <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Lys Asp Ile Leu 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Pro Asp Ile Met 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Ala Asp His His 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Lys Tyr His Ile Gly 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu 1 5 10 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu 1 5 10 15 Val Ser <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val Gly Arg Arg Val 1 5 10 15 Leu Thr <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Ala Leu Arg Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met 1 5 10 15 Cys Ala <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Leu Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr 1 5 10 15 Leu Gly <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> control peptide having scrambled sequence at the 7-12 amino acids in the peptide of the SEQ. ID. No. 13 <400> 17 Lys Glu Leu Ala Asn Ile His Gly Ile Lys Leu Tyr Asp Glu Ile Leu 1 5 10 15 Val Ser

Claims (9)

1. 서열번호 13 내지 서열번호 16으로 구성된 군으로부터 선택되고, αvβ5 인테그린을 발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, βig-h3 단백질 유래 펩타이드.
2. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드의 보존적 아미노산서열은 티로신 및 히스티딘 잔기인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
3. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 βig-h3 단백질의 파스-1 도메인으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
4. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 13으로 기재되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
5. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 잔기는 10개 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
6. 제 5항에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 잔기는 18개 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
7. 제 1항에 있어서, 상기 αvβ5 인테그린을 발현하는 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
8. 제 1항의 펩타이드에 있어서, 티로신 및 히스티딘 잔기 중 어느 하나의 아미노산 잔기가 티로신 및 히스티딘 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
9. 제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 창상치유, 조직재생 또는 암전이 억제용 약학적 조성물.