KR20070116653A - 핵산 분자와 콜라겐의 복합체 미세 입자 제제 - Google Patents

핵산 분자와 콜라겐의 복합체 미세 입자 제제 Download PDF

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미호 마에다
요시코 기시모토
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다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤
가부시키가이샤 고켄
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Abstract

본 발명은, 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 히스티딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 숙신산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 및 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 첨가제에 관한 것으로서, 그 첨가제는, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 미세 입자가 응집되는 것을 방지하여, 사이즈가 제어되어 있고 핵산의 운반에 적합한 복합체 입자 함유 제제의 제조에 유용하다.

Description

핵산 분자와 콜라겐의 복합체 미세 입자 제제{PREPARATION COMPRISING MICROPARTICLES OF COMPLEX COMPOSED OF NUCLEIC ACID MOLECULE AND COLLAGEN}
본 발명은 제어된 사이즈를 갖는 핵산 분자와 콜라겐의 복합체 미세 입자를 함유하는 제제에 관한 것으로, 상세하게는 특정 종류의 첨가제를 함유시킴으로써 형성되는 핵산 분자와 콜라겐의 미세 복합체 입자, 그 미세 복합체 입자를 함유하는 것을 특징으로 하는, 세포에 핵산 분자를 도입하기 위한 제제, 및 이들의 제조 방법을 제공한다.
콜라겐은 우수한 생체 적합성을 나타내어, 종래부터 의료용구로서 생체 내 매립에 사용되고 있는데, 재생 의료나 바이오 관계의 시약, 키트류에 대한 응용 등 폭넓은 가능성을 갖는다. 또한, 콜라겐은 핵산 분자와 정전적으로 상호 작용하여 복합체를 형성함으로써 핵산 분자를 안정화시키고, 조직에 대한 핵산 분자의 도입을 촉진하는 효과가 인정되고 있어, 핵산 분자의 DDS 로서의 응용이 기대된다 (특허 문헌 1, 2, 3). 특히, 아테로콜라겐은 항원성이 배제되고, 가용성이기 때문에, 의약으로서의 응용 가치가 높다.
한편, 정상인 유전자를 세포에 보충하거나, 유전자의 결함을 수복, 수정함으로써 병을 치료하는 유전자 치료에서는, 목적으로 하는 효소, 사이토카인 등을 코 드하는 핵산 분자를 환자의 세포 내에 도입하고, 그 핵산 분자로부터 체내에 목적으로 하는 물질을 생성시켜, 질환을 치료한다. 그러나, 유전자 단독으로는 표적 세포에 대한 도입 효율이 낮기 때문에, 그 도입 효율을 높여 치료의 유효성을 높이기 위해, 아데노바이러스 등의 바이러스를 벡터에 사용하는 방법 (비특허 문헌 1 ∼ 6 및 이들의 인용 문헌) 이나 리포솜 제제를 사용하는 방법 (비특허 문헌 7 ∼ 9) 등이 사용되어 왔다. 또한, 염기성 지질 (비특허 문헌 10 이래, 여러 가지 지질이 많이 개발되어 왔다) 이나 염기성 폴리머를 베이스로 한 화합물 (대표예로는 폴리에틸렌이민 (비특허 문헌 11)) 등의 유전자 캐리어도 개발되어 왔다. 이들 벡터 등은 유전자 치료에 사용되는 유전자뿐만 아니라, 세포 내의 유전자의 발현을 조절하는 안티센스 DNA 나, siRNA 등의 핵산 제제에 대한 응용을 할 수 있다.
또한, 유전자의 도입 효율을 높여 치료의 유효성을 높이기 위해, 생체 고분자인 콜라겐을 사용하여, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를 이용하는 방법이 제안되어 있다 (특허 문헌 3). 콜라겐은 생체 적합성이 우수하기 때문에 의약에 대한 응용이 기대된다.
그러나, 핵산 분자의 안정성이나 의약품으로서의 응용을 아울러 생각하면, 그러한 복합체의 제조나 보존시에, 용액의 pH 는 중성일 것이 요구되는 한편, 콜라겐은 중성 pH 영역의 수용액 중에서는 회합되기 쉽다는 성질을 갖고, 응집물이 침전물로서 발생한다는 문제가 있다. 특히, 콜라겐이 생리적 조건하에서 규칙적으로 회합되어 섬유를 형성하는 것, 및 핵산 분자와 복합체를 형성함으로써 응집이 촉진된다는 것은 가공성이나 균일한 품질의 의약을 얻는 데에 있어서 장해가 된다. 또한, 콜라겐과 핵산 분자의 복합체가 불용성의 거대한 응집물을 형성하는 것은, 국소 체류성의 데포(depot)형 서방 제제로서 장시간의 서방화에는 유리한 경우도 있을 수 있지만, 넓게 생체 내에 분포시키고자 하는 경우나 세포에 효율적으로 도입하고자 하는 경우에는 바람직하지 않다. 후자의 목적에는, 수 ㎛ 이하의 사이즈인 것이 바람직하고, 거대 응집 형성은 바람직하지 않다. 특히 모세혈관의 직경은 5 ∼ 10㎛ 이기 때문에, 혈류를 통하여 넓게 생체 내에 분포시키고자 하는 경우, 복합체 입자의 사이즈는 5㎛ 이하인 것이 바람직하다고 여겨지고 있다. 따라서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체에서 콜라겐은 단분자 또는 분자가 수 개 ∼ 수십 개 모인 정도의 미세 섬유상의 콜라겐인 것이 바람직하다.
섬유상 콜라겐은 pH 중성에서는 0.9M ∼ 1.0M NaCl 존재하에서 가용화되는 경향이 있어, pH 중성 (염 첨가) 에서 콜라겐 섬유 형성 억제 작용을 갖는 글루코오스 또는 자당 (0.25 ∼ 0.5M) 을 첨가하면 보다 효과적이라는 것이 「콜라겐 실험법」(코단사, p3) 에 기재되어 있다. 또한, 섬유상 콜라겐을 비섬유상 콜라겐으로 분해하는 섬유 분해제로서, 생체 적합성 알코올, 아미노산 등이 특허 문헌 4 에 기재되어 있다. 그러나, 특허 문헌 4 에 기재된 조성물에는 핵산 분자는 함유되어 있지 않으며, 콜라겐과 핵산 분자의 복합체에 관한 것은 아니다.
콜라겐 단독에서는 균일하고 투명한 용해 상태에 있지만, 핵산 분자를 첨가함으로써, 바로 수 ㎛ 이상의 복합체를 발생시키고, 또한 실온 정도의 가온에 의해 응집이 현저히 촉진되기 쉬운 경향이 있다. 그 결과, 10㎛ 이상의 복합체 응집 물이 되고, 백탁되어 침전이 발생하기 쉬운 경향이 있다. 또한 보존이나 동결 융해에 의해서도 응집이 촉진되기 쉽다.
본 발명자들은, 콜라겐의 회합을 방지하기 위해 사용되고 있는 상기의 방법 (가용화 또는 섬유 분해제) 은, 콜라겐 단독인 경우에 유효해도, 핵산 분자를 통한 복합체의 응집 방지, 거대 입자의 형성 방지에는 유효하지 않다는 것을 새롭게 알아냈다. 따라서, 기본적으로 핵산 분자와 콜라겐으로 이루어지는 복합체를 함유하는, 균일한 분산성을 안정적으로 유지할 수 있는, 바꾸어 말하면, 균일하고 분산성이 우수한 실용적인 미세 입자 제제의 개발이 강하게 요구되고 있다.
특허 문헌 1 : 일본 공개특허공보 평9-71542호
특허 문헌 2 : WO2001/97857호 팜플렛
특허 문헌 3 : WO2003/297호 팜플렛
특허 문헌 4 : 일본 공개특허공보 평9-99052호
비특허 문헌 1 : Cardiovascular Research, 28, 445 (1994)
비특허 문헌 2 : Science, 256, 808 (1992)
비특허 문헌 3 : Gastroenterology, 106, 1076 (1994)
비특허 문헌 4 : TIBTECH, 11, 182 (1993)
비특허 문헌 5 : J.Biol.Chem, 266, 3361 (1991)
비특허 문헌 6 : Nature Medicine, 1, 583 (1995)
비특허 문헌 7 : Biochem Biophys Acta, 1097, 1 (1991)
비특허 문헌 8 : Human Gene Therapy, 3, 399 (1992)
비특허 문헌 9 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11277 (1992)
비특허 문헌 10 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)
비특허 문헌 11 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7297 (1995)
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 균일한 분산성을 안정적으로 유지할 수 있는, 바꾸어 말하면, 균일하고 분산성이 우수한 실용적인 핵산 분자 함유 미세 입자 제제를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 핵산 분자／콜라겐／첨가제의 3 자를 필수 성분으로 한 제어된 사이즈를 갖는 복합체 제제에 관한 것으로, 단순히 콜라겐의 회합 방지제를 핵산 분자와 콜라겐의 복합체에 적용한 것만으로는 해결할 수 없는 기술적 과제를 해결하는 것이다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명은 핵산 분자와 콜라겐의 제어된 사이즈를 갖는 복합체 미세 입자를 기본으로 한다. 즉, 핵산 분자와 콜라겐에 특정 종류의 첨가제를 함유시킴으로써 형성되는 복합체의 미세 입자 및 그 복합체 미세 입자를 함유하는 것을 특징으로 하는 세포에 핵산 분자를 운반하기 위한 제제를 제공한다. 본 발명은 그러한 복합체 미세 입자나 제제의 제조 방법도 제공한다. 복합체의 입자 사이즈는 체내 동태나 효과에 영향을 줄 가능성뿐만 아니라, 입자 사이즈를 제어하는 것은 특히 의약품에 대한 응용에 있어서 품질 관리면에서 불가결하다.
본 발명자들은 상기 과제를 감안하여 예의 연구를 실시한 결과, 첨가제로서 특정 종류의 유기 염기 또는 산을 공존시킴으로써, 콜라겐과 핵산 분자의 복합체 형성에 있어서도 양자의 결합성을 유지한 채, 10㎛ 이상의 큰 사이즈의 복합체의 형성을 억제하는 효과가 있다는 것을 알아냈다. 이와 같이, 콜라겐이 핵산과 복합체를 형성하는 경우에도 응집을 억제할 수 있다는 것은 완전히 예상 외의 사실이다.
즉, 본 발명의 요지는,
1. 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 히스티딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 숙신산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 및 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 첨가제로서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 첨가제,
2. 상기 1 에 기재된 첨가제 및 콜라겐을 함유하는, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 수용액, 또는, 상기 1 에 기재된 첨가제 및 콜라겐을 함유하는 수용액으로서, 그 수용액에 핵산을 첨가함으로써, 제어된 사이즈를 갖는 핵산 분자와 콜라겐의 미세 입자의 복합체를 조제하기 위한 수용액,
3. 상기 2 에 기재된 수용액으로서,
(1) 첨가제의 총 농도가 1 ∼ 20％ 이고,
(2) 콜라겐의 농도가 0.01％ ∼ 2％ 이며,
(3) 첨가제가 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 모노에탄올아민, 트리에탄올아민, 시트르산, 타르타르산 및 이들의 염 중에서 선택되는 수용액,
4. 첨가제가 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는 상기 2 에 기재된 수용액,
4-1. 첨가제가 아르기닌, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는 상기 2 에 기재된 수용액,
4-2. 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 건조 제제를 용액 제제로 재구성하기 위한, 상기 1 에 기재된 첨가제를 함유하는 수용액으로서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 수용액,
5. 상기 4 에 기재된 수용액으로서,
(1) 첨가제의 총 농도가 1 ∼10％, 및/또는
(2) 수용액의 pH 가 5 ∼ 9 인 수용액이고,
(3) 첨가제가 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 모노에탄올아민, 트리에탄올아민, 시트르산, 타르타르산 및 이들의 염 중에서 선택되는 수용액으로서, 더욱 바람직하게는, 첨가제가 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는 수용액이고, 보다 더 바람직하게는, 첨가제가 아르기닌, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는 수용액,
6. 상기 1 에 기재된 첨가제, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 제제로서, 핵산 분자와 콜라겐이, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체를 형성하고 있는 제제,
7. 상기 6 에 기재된 제제로서,
(1) 핵산 분자의 농도가 0.001 ∼ 100㎎/㎖, 바람직하게는 0.001 ∼ 50㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.001 ∼ 10㎎/㎖,
(2) 콜라겐의 농도가 0.01％ ∼ 2％,
(3) 첨가제의 총 농도가 1 ∼ 10％, 및/또는
(4) 수용액의 pH 가 6 ∼ 8 인 제제,
8. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자가 빠르게 침강되지 않고 분산 상태를 유지할 수 있는 사이즈의 복합체로서, 투여시에 통상의 주사 바늘의 통과가 방해받지 않는 복합체인 상기 6 에 기재된 제제,
9. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자가, 정맥·동맥 내, 근육 내 투여에 사용되는 23 내지 21 게이지 (내경 약 0.4 내지 0.6㎜), 더욱 바람직하게는 피내·피하 투여용으로 사용되는 27 내지 24 게이지 (내경 약 0.2 내지 0.4 ㎜) 의 주사 바늘을 통과하는 사이즈의 복합체인 상기 8 에 기재된 제제,
10. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자가 100㎛ 이하, 바람직하게는 10㎛ 이하의 입자인 상기 6 에 기재된 제제,
11. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자가, 그 70％ 이상이 10㎛ 이하의 입자인 상기 6 에 기재된 제제,
12. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자가, 그 80％ 이상이 10㎛ 이하의 사이즈인 상기 6 에 기재된 제제,
13. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자가, 그 70％ 이상이 5㎛ 이하의 사이즈인 상기 6 에 기재된 제제,
14. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자가, 그 80％ 이상이 5㎛ 이하의 사이즈인 상기 6 에 기재된 제제,
15. 상기 7 에 기재된 용액 제제를 동결 건조시켜 얻어지는 동결 건조 제제,
16. 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 히스티딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 및 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는, 핵산 분자와 콜라겐으로 이루어지는 복합체 미세 입자의 응집 방지제,
17. 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 트리에탄올아민 및 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 첨가제로서,
(1) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키고,
(2) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자를 함유하는 용액 제제에 있어서, 그 미세 입자의 응집을 방지하고, 또한 양호하게 분산시키며, 및/또는
(3) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자를 함유하는 건조 제제로 재구성한 용액 제제에 있어서, 그 미세 입자의 응집 방지 및 양호한 분산성을 유지시키기 위한 첨가제,
18. 상기 17 에 기재된 첨가제 및 콜라겐을 함유하는, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 수용액,
19. 상기 18 에 기재된 수용액으로서,
(1) 첨가제의 총 농도가 1 ∼ 20％,
(2) 콜라겐의 농도가 0.01％ ∼ 2％ 인 수용액,
20. 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 건조 제제를 용액 제제로 재구성하기 위한, 상기 17 에 기재된 첨가제를 함유하는 수용액으로서,
(1) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키고, 및/또는
(2) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자를 함유하는, 재구성된 용액 제제에 있어서, 그 미세 입자의 응집을 방지하고, 양호하게 분산시키기 위한 수용액,
21. 상기 20 에 기재된 수용액으로서,
(1) 첨가제의 총 농도가 1 ∼ 10％, 및/또는
(2) 수용액의 pH 가 5 ∼ 9 인 수용액,
22. 상기 17 에 기재된 첨가제, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 제제로서, 핵산 분자와 콜라겐이, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체를 형성하고 있는 제제,
23. 하기 (1) 내지 (4) 인 상기 18 에 기재된 용액 제제 :
(1) 핵산 분자의 농도가 0.001 ∼ 100㎎/㎖, 바람직하게는 0.001 ∼ 50㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.001 ∼ 10㎎/㎖,
(2) 콜라겐의 농도가 0.001％ ∼ 10％, 보다 바람직하게는 0.01％ ∼ 2％, 더욱 바람직하게는 0.01％ ∼ 0.5％,
(3) 첨가제의 총 농도가 1 ∼ 10％, 및/또는
(4) 수용액의 pH 가 5 ∼ 9, 보다 바람직하게는 pH 가 6 ∼ 8 이다,
24. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자가 빠르게 침강되지 않고 분산 상태를 유지할 수 있는 사이즈의 복합체로서, 투여시에 통상의 주사 바늘의 통과가 방해받지 않는 복합체인 상기 6 에 기재된 제제,
25. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자가, 정맥·동맥 내, 근육 내 투여에 사용되는 23 내지 21 게이지 (내경 약 0.4 내지 0.6㎜), 더욱 바람직하게는 피내·피하 투여용으로 사용되는 27 내지 24 게이지 (내경 약 0.2 내지 0.4㎜) 의 주사 바늘을 통과하는 사이즈의 복합체인 상기 8 에 기재된 제제,
26. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자가 100㎛ 이하, 바람직하게는 10㎛ 이하의 입자인 상기 8 에 기재된 제제,
27. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체가, 그 70％ 이상이 10㎛ 이하의 사이즈인 상기 8 에 기재된 제제,
28. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체가, 그 80％ 이상이 10㎛ 이하의 사이즈인 상기 8 에 기재된 제제,
29. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체가, 그 제제 중의 콜라겐과 핵산 분자의 복합체의 70％ 이상이 5㎛ 이하의 사이즈인 상기 8 에 기재된 제제,
30. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체가, 그 제제 중의 콜라겐과 핵산 분자의 복합체의 80％ 이상이 5㎛ 이하의 사이즈인 상기 8 에 기재된 제제,
31. 실온에서부터 체온 부근의 비냉장 상태에 있어서, 12 시간 이상 응집되지 않고, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 응집이 방지되어, 양호하게 분산되어 있는 상기 7 에 기재된 제제,
32. 상기 31 에 기재된 제제를 유효 성분으로 하는, 원하는 세포에 대한 핵산 분자의 도입제,
33. 콜라겐이 아테로콜라겐인 상기 4 에 기재된 수용액,
34. 콜라겐이 아테로콜라겐인 상기 7 에 기재된 제제,
35. 핵산 분자가 하기 (1) 내지 (6) 인 상기 7 에 기재된 제제 :
(1) DNA 올리고뉴클레오티드
(2) 플라스미드 DNA
(3) RNA 올리고뉴클레오티드
(4) RNA/DNA 키메라올리고뉴클레오티드
(5) 안티센스 DNA, 또는
(6) siRNA,
36. 핵산 분자가 안티센스 DNA 인 상기 35 에 기재된 제제,
37. 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 히스티딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 숙신산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 유효 성분으로 하는, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체인 소프트 코팅제,
38. 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는, 적어도 하나를 유효 성분으로 하는, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체인 소프트 코팅제,
39. 상기 37, 38 의 소프트 코팅제를 유효 성분으로 하는, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체인 응집 억제제,
40. 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를 상기 1 에 기재된 첨가제의 존재하, pH 5 ∼ 9 에서 형성시키는 것을 특징으로 하는, 평균 입자 사이즈가 100㎛ 이하인, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체 미세 입자 제제의 제조법에 관한 것이다.
도 1 은 복합체 미세 입자 응집에 대한 각종 첨가제의 방지 효과를 나타내는 현미경에 의한, 도면을 대신하는 사진이다. 비교예 3-5 의 글리세린 (글리세롤) 은 특허 문헌 4 의 콜라겐 섬유 분해제인데, 콜라겐과 DNA 혼합 후에 응집 (＞ 10㎛) 이 관찰되었고, 실온 보존 후에는 더욱 응집이 커져, 콜라겐과 DNA 복합체에 대한 응집 방지 효과는 인정되지 않았다.
도 2 는 복합체 미세화 및 온도와 동결 융해 처리에 의한 응집에 대한 아르기닌의 방지 효과를 나타내는 현미경에 의한, 도면을 대신하는 사진이다.
도 3 은 복합체 미세화에 대한 각종 첨가제의 효과를 나타내는 현미경에 의한, 도면을 대신하는 사진이다. 비교예 7-5 의 프로필렌글리콜은 특허 문헌 4 의 대표적인 콜라겐 섬유 분해제인데, 콜라겐과 DNA 혼합 후에 큰 응집 (＞ 100㎛) 이 다수 관찰되어, 콜라겐과 DNA 복합체에 대한 미세화 효과는 인정되지 않았다.
도 4 는 핵산 분자를 고농도 (40㎎/㎖) 함유하는 제제의 복합체 응집 방지에 대한 본 발명 제제의 효과를 나타내는 현미경 이미지에 의한, 도면을 대신하는 사 진이다 (스케일은 100㎛).
도 5 는 마우스 피부염 모델에 있어서의 감작 및 제제 투여 24 시간 후의 귓바퀴 종창도를 나타내는 막대 그래프이다. 안티센스 ICAM-1 을 함유하는 본 발명 제제는 미세 복합체 제제로서, 안티센스 ICAM-1 의 단독 투여보다 우수한 항염증 효과 (귓바퀴 종창 억제 효과) 를 나타냈다.
도 6 은 마우스 피부염 모델에 있어서의 감작 및 제제 투여 24 시간 후의 귓바퀴 종창도를 나타내는 막대 그래프이다. 안티센스 ICAM-1 을 함유하는 본 발명의 동결 건조 제제는 유의한 항염증 효과 (귓바퀴 종창 억제 효과) 를 나타냈다. 이로부터, 본 발명의 미세 복합체는 동결 건조 제제로서도 유효하다는 것이 나타났다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
(1) 첨가제
본 발명의 제제는 특정 첨가제, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 제제로서, 핵산 분자와 콜라겐이, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체를 형성하고 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 예의 연구를 실시한 결과, 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 히스티딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 숙신산, 시트르산, 타르타르산, 락트산 또는 이들의 염이, 콜라겐과 핵산 분자의 복합체 형성을 저해하지 않고, 콜라겐 또는 복합체의 회합에 의한 응집을 방지할 뿐만 아니라, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시킬 수 있다 는 것을 알아냈다.
이 점으로부터, 본 발명은 제 1 양태로서, 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 히스티딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 숙신산, 시트르산, 타르타르산, 락트산 및 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 첨가제로서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명자들은, 유기 염기인 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 히스티딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 및 이들의 염이, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시킬 뿐만 아니라, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자를 함유하는 용액 제제에 있어서, 그 미세 입자의 응집을 방지하고, 양호하게 분산시키며, 및/또는 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자를 함유하는 건조 제제로 재구성한 용액 제제에 있어서, 그 미세 입자의 응집 방지 및 양호한 분산성을 유지시킨다는 것을 알아냈다.
이 점으로부터, 본 발명은, 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 트리에탄올아민 및 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 첨가제로서,
(1) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키고,
(2) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자를 함유하는 용액 제제에 있어서, 그 미세 입자의 응집을 방지하고, 양호하게 분산시키며, 및/또는
(3) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자를 함유하는 건조 제제로 재구성한 용액 제제에 있어서, 그 미세 입자의 응집 방지 및 양호한 분산성을 유지시키기 위한 첨가제를 제공한다.
본 발명에 있어서, 「염」이란, 상기 유기 염기가 염산 또는 인산, 시트르산, 타르타르산, 숙신산, 락트산, 아세트산에서 선택되는 유기산과의 염이 포함되고, 및 상기 산이 수산화나트륨, 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 히스티딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민에서 선택되는 염기와의 염이 포함된다.
특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 발명의 첨가제는 콜라겐 또는 복합체 둘레를 이온적으로, 말하자면 소프트 코팅함으로써, 콜라겐과 핵산 분자의 결합성을 유지한 상태에서, 응집물의 생성을 효과적으로 방지하는 것이라고 사료된다. 이러한 이온에 의한 소프트 코팅적인 효과는, 일반적으로 콜라겐의 회합 방지제로서 사용되는 NaCl 이나 인산 Na 등의 염이나 글루코오스에는 인정되지 않는다.
본 발명의 첨가제는 안정화, pH 조절, 등장화 등을 목적으로 한 다른 첨가 물질을 함유할 수 있다. 본 발명의 첨가제 중 유기 염기 첨가제는, pH 조정제로서 염산 외에, 인산, 시트르산, 타르타르산, 숙신산, 락트산, 아세트산 등의 유기산과 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 효과는, 제제를 동결 보존하는 것이나 동결 건조 제제화를 가능하게 하는 것이다. 핵산 분자와 콜라겐의 복합체 용액을 장기간 안정적으로 보존 하려면 동결 보존이 필요해진다. 본 발명을 사용하지 않는 경우에는, 종종 동결 보존품의 융해 후에 응집되어 입자의 거대화가 일어난다. 또한, 다른 장기 보존법으로서 동결 건조 제제화를 들 수 있다. 동결 건조 제제의 조제에는 동결 공정에 이어서 건조 공정이 있으며, 사용시에는 용해액을 첨가하여 사용시 용해를 실시하는 것이 일반적인데, 일련의 과정에서는 응집이 발생하기 쉬워 용해성이 불량해지는 경우가 많다. 본 발명에서는 응집이 방지되어, 동결 건조 전과 변함없는 미세 입자의 양호한 분산을 얻을 수 있다. 또한 동결 건조 제제에는, 그 밖의 첨가 물질로서, 안정화제, pH 조절제, 등장화제 외에, 부형제나 용해 촉진제를 첨가할 수 있으며, 예를 들어, 당류 등을 사용할 수 있다.
(2) 첨가제 및 콜라겐을 함유하는 수용액
특정 첨가제, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 제제로서 핵산 분자와 콜라겐이, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체를 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 본 발명의 제제는, 본 발명의 첨가제 및 콜라겐을 함유하는 수용액을 사용함으로써 조제할 수 있다.
이 양태로서, 본 발명은, 본 발명의 첨가제 및 콜라겐을 함유하는, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 수용액을 제공한다.
이 수용액은 핵산 동결 건조품의 용해나 핵산 수용액의 희석에 사용할 수 있고, 그러한 핵산 분자에 대하여 적용함으로써, 핵산 분자와 이 수용액 중의 콜라겐이 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체로 형성된다. 즉, 본 발명의 첨가 제 및 콜라겐을 함유하는 수용액을 사용함으로써, 각 시설에서 독자적으로 합성한, 또는 세포로부터 분리된, 또는 시판되는 핵산 수용액 또는 동결 건조품, 또는 플레이트 상에 핵산이 도포된 것에 이 수용액을 첨가하는 것만으로, 핵산과 콜라겐의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체를 형성시킬 수 있다.
이 양태에서의 수용액은, 바람직하게는,
(1) 첨가제의 총 농도가 1 ∼ 20％,
(2) 콜라겐의 농도가 0.01％ ∼ 2％ 이고,
보다 바람직하게는, 첨가제가 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 모노에탄올아민, 트리에탄올아민, 시트르산, 타르타르산 및 이들의 염 중에서 선택되는 수용액이며, 더욱 바람직하게는, 첨가제가 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는 수용액이고, 보다 더 바람직하게는, 첨가제가 아르기닌, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는 수용액이다.
(3) 건조 제제를 용액 제제로 재구성하기 위한 수용액
일반적으로, 주사제 형태로 투여되는 의약은, 활성 성분의 안정성을 고려하여 동결 건조품으로서 제공되며, 그것은 주사용 증류수 등에 의해 용액 제제로 사용시 조제된다. 본 발명자들은, 건조 제제를 용액 제제로 재구성하기 위해 사용하는 용액에 본 발명의 첨가제를 함유시키면, 핵산 분자 및 콜라겐의 복합체를 원하는 미세 입자로 변환시킬 수 있다는 것을 알아냈다.
이 양태로서, 본 발명은, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 건조 제제를 용액 제제로 재구성하기 위한, 본 발명의 첨가제를 함유하는 수용액으로서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 수용액을 제공한다.
이 양태에서의 수용액은, 바람직하게는,
(1) 첨가제의 총 농도가 1 ∼ 10％, 및/또는
(2) 수용액의 pH 가 5 ∼ 9 인 수용액이다.
보다 바람직하게는, 첨가제가 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 모노에탄올아민, 트리에탄올아민, 시트르산, 타르타르산 및 이들의 염 중에서 선택되는 수용액이고, 더욱 바람직하게는, 첨가제가 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는 수용액이며, 보다 더 바람직하게는, 첨가제가 아르기닌, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는 수용액이다.
(4) 첨가제, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 제제
본 발명은 또한, 본 발명의 첨가제, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 제제로서, 핵산 분자와 콜라겐이 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체를 형성하고 있는 제제를 제공한다.
본 발명에 사용되는 「핵산 분자」는, 콜라겐과 핵산 분자의 복합체 형성이 중성 pH 영역에서의 정 (正) 으로 하전된 폴리카티온으로서의 콜라겐과의 정전적 상호 작용에 의한 것이기 때문에, 중성 pH 영역에 있어서 폴리아니온으로서의 성질을 갖는 것이라면, 폴리뉴클레오티드이어도 되고 올리고뉴클레오티드이어도 되며, 또한 DNA 일수도 있고, RNA, 천연형 또는 수식형 중 어느 것일 수도 있다. DNA 분자인 경우, 플라스미드 DNA, cDNA, 게노믹 DNA 또는 합성 DNA 이어도 된다. DNA 및 RNA 는 모두 이중 사슬일수도 있고, 단사슬일 수도 있다. 단사슬인 경우, 코드 사슬 또는 비코드 사슬일 수 있다. 또한, 「핵산 분자」는 합성품 또는 세포로부터 분리된 것 중 어느 것이어도 되고, 기능적으로는, 유전자로서의 플라스미드 DNA (pDNA 라고 칭하는 경우도 있다) 나, 유전자 변환에 사용하는 RNA/DNA 키메라올리고뉴클레오티드 또는 DNA 올리고뉴클레오티드, 또는 유전자의 발현을 조절하는 안티센스 DNA 나, siRNA (small interfering RNA) 등의 올리고뉴클레오티드, 자기 자신이나 다른 RNA 를 절단하는 리보자임, 전사 인자 결합 부위와 동일한 서열을 포함하는 이중 사슬 DNA 인 디코이올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 수식형 핵산 분자로서 DNA 유도체 또는 RNA 유도체가 포함되고, 그 유도체란 효소에 의한 분해를 피하기 위해 인터뉴클레오티드의 인산 부위, 당 부분, 염기 부분에 화학 수식을 한 핵산을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레아제에 대한 안정성을 높일 목적으로 화학적으로 수식한 것, 예를 들어, 인산디에스테르 결합의 산소 원자 1 개를 황으로 치환한 포스포로티오에이트, 메틸기로 치환한 메틸포스포네이트, 또는 아미노기로 치환한 포스포로아미데이트를 갖는 핵산 분자가 있고, 인산디에스테르 결합의 산소 원자 2 개를 황으로 치환한 포스포로디티오네이트, 또는 황과 메틸기로 각각 치환한 메틸포스포로티오에이트를 갖는 핵산 분자를 들 수 있다. 이 밖에, 당의 부분을 수식한 2'-O-methyl RNA, 2'-O-methoxyethyl RNA 또는 Locked nucleic acid (상품명) (LNA) 등을 들 수 있다. 또한, 핵산 분자에는 아데노바이러스, 레트로바이러스 등의 바이러스도 포함된다.
사슬 길이에 대해서도 특별히 제한은 없다. 구체적으로는, 사슬 길이는 통상적으로 핵산 분자가 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임인 경우, 바람직하게는 5mer 이상 100mer 이하, 보다 바람직하게는 5mer 이상 30mer 이하이다. 안티센스 또는 siRNA 로서 사용되는 올리고뉴클레오티드에서는 20mer 정도이고, 유전자 변환용 RNA/DNA 키메라올리고뉴클레오티드 또는 DNA 올리고뉴클레오티드에서는 수십 내지 100mer 정도이다. 본 발명의 핵산으로서의 플라스미드 DNA 의 사이즈에는 특별히 제한은 없으며, 유전자 공학적 수법으로 효율적으로 생산할 수 있고, 세포에 도입되었을 경우, 효율적으로 코드한 유전 정보를 세포 내에서 발현시킬 수 있는 사이즈 중에서 적당히 선택할 수 있으며, 통상적으로 수천 ∼ 수만 염기쌍의 고분자가 된다.
또한, 본 발명에 있어서의 「핵산 분자」에서는 서열은 특별히 제한되지 않기 때문에, 시판품 또는 향후 개발되는 것도 포함된다. 이하에 「핵산 분자」의 예로서, 현재 임상에서 사용되고 있는 안티센스 DNA 를 열거한다.
Isis Pharmaceuticals 사의 VitraveneTM (5'-GCG TTT GCT CTT CTT CTT GCG-3', 서열 번호 1), AffintakTM (5'-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3', 서열 번호 2), AlicaforsenTM ISIS2302 (5'-GCC CAA GCT GGC ATC CGT CA-3', 서열 번호 3), ISIS2503 (5'-TCC GTC ATC GCT CCT CAG GG-3', 서열 번호 4), ISIS14803 (5'-GTG CTC ATG GTG CAC GGT CT-3', 서열 번호 5), ISIS104838 (5'-GCT GAT TAG AGA GAG GTC CC-3', 서열 번호 6),
GENA 사의 GenasenseTM (5'-TCT CCC AGC GTG CGC CAT-3', 서열 번호 7),
Hybridon 사의 GEMTM 231 (5'-GCG UGC CTC CTC ACU GGC-3', 서열 번호 8),
Epigenesis 사의 EPI-2010 (5'-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3', 서열 번호 9).
본 발명에 사용되는 「콜라겐」은 포유 동물의 전체 단백질의 대략 1／3 을 차지하는 주요한 단백질로서, 기본 구조로서 3 개가 나선을 감은 3 중 나선 구조를 형성하고 있으며, 적어도 19 종류의 분자종 (형) 과 33 종류의 α 사슬이 있다. 이 중 가죽, 뼈, 힘줄의 주성분인 것은 I 형 콜라겐이고, 이것은 분자량 약 30 만이고, 분자량이 약 10 만인 폴리펩티드 사슬의 α1 사슬 (I 형) 2 개와 α2 사슬 (I 형) 1 개로 이루어지는 길이 약 300㎚, 직경 1.5㎚ 의 막대상 분자이다. 콜라겐은, 생리적 조건하에서는 옆에 이웃하는 분자와 67㎚ 만큼 위상이 어긋나게 규칙적으로 배열되어 미소 섬유 (microfibril) 를 형성하고, 그것이 집합되어 섬유상 물질 (fibril, fiber) 이 되며, 이것은 불용성이다. 본 발명에서는, 콜라겐은 단분자 분산 상태 또는 미세 섬유 상태가 되며, 용액 상태에서 양호하게 분산되는 것을 특징으로 한다.
여기서, 콜라겐은 특별히 그 기원 및 분자종 (형) 이 한정되는 것이 아니라, 콜라겐의 기본 물성을 유지한 것이라면 콜라겐 유도체이어도 되고, 일반적으로는 소, 돼지, 인간 등의 포유류 및 조류, 어류 유래 (배양 세포 유래 및 유전자 재조합품을 포함한다) 의 I 형 콜라겐을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 유전자 재조합품으로서, 임의의 α 사슬 3 개를 선택하여 신규 콜라겐 분자를 생성시킬 수도 있지만, 보다 현실적으로는 1 종류의 α 사슬만으로 이루어지는 호모 3 량체를 조제하여 사용해도 된다. 원래 콜라겐은 항원성이 낮은 단백질인데, 이종 (異種) 유래의 콜라겐을 사용하는 경우, 콜라겐 분자의 양단에 존재하고 주된 항원 결정 부위가 존재하는 텔로펩티드 부분을 효소 소화에 의해 제거한 아테로콜라겐은 항원성이 거의 문제가 되지 않기 때문에, 의약품으로 인체에 투여하는 콜라겐으로서 아테로콜라겐이 적합하다.
콜라겐 유도체로는, 측사슬을 수식한 콜라겐, 가교한 콜라겐 등을 사용할 수 있다. 측사슬을 수식한 콜라겐으로는 예를 들어, 메틸화시킨 콜라겐 등을 들 수 있으며, 가교한 콜라겐으로는, 예를 들어, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌디이소시아네이트 또는 폴리에폭시 화합물 등으로 처리한 콜라겐 등을 들 수 있다 (프레그런스·저널 1989-12, 104-109, 일본 특허공보 평7-59522호).
핵산 분자 및 콜라겐은 양자를 조합하면 정전적으로 및/또는 물리적으로 상호 작용하여 복합체를 형성하고, 그것이 핵산 분자의 세포에 대한 도입을 촉진하며, 또한 유전자를 장기간 발현시킬 수 있다는 것이 알려져 있다 (비특허 문헌 3). 본 발명에 있어서 「제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체」란, 빠르게 침강되지 않고 분산 상태를 유지할 수 있는 사이즈의 복합체로서, 투여시에 통상의 주사 바늘의 통과가 방해받지 않는 것을 의미한다. 통상의 주사 바늘로서 사용되는 30 내지 16 게이지 중, 바람직하게는 정맥·동맥 내, 근육 내 투여에 사용되는 23 내지 21 게이지 (내경 약 0.4 내지 0.6㎜), 더욱 바람직하게는 피내·피하 투여용으로 사용되는 27 내지 24 게이지 (내경 약 0.2 내지 0.4㎜) 를 통과하는 것이다. 그러한 복합체에 있어서, 제어된 사이즈란 100㎛ 이하, 바람직하게는 10㎛ 이하의 입자를 의미하고, 여기서 사이즈가 10㎛ 이하란, 현미경으로 관찰되는 입자의 장경이 10㎛ 를 초과하지 않는 것, 또는 구멍 직경이 10㎛ 인 필터 (예를 들어, isopore filter, Millipore 제조) 를 통과하는 것을 말한다.
따라서, 「핵산 분자와 콜라겐이, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체를 형성하고 있다」란 바람직하게는, 제제 중의 콜라겐과 핵산 분자의 복합체가 100㎛ 이하의 미세 입자로서, 100㎛ 를 초과하는 복합체 응집물이 혼재하지 않는 것, 또는 10㎛ 이하의 미세 입자가 대부분을 차지하는 것, 즉 복합체의 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상이 10㎛ 이하의 사이즈인 것, 보다 바람직하게는 제제 중의 콜라겐과 핵산 분자의 복합체의 70％ 이상이 5㎛ 이하의 사이즈인 것, 특히 혈관 내로 투여하는 경우, 보다 바람직하게는 80％ 이상이 5㎛ 이하의 사이즈인 것을 의미한다.
「빠르게 침강되지 않고 분산 상태를 유지할 수 있는 사이즈의 복합체」란, 투여시에 통상의 주사 바늘의 통과가 방해받지 않는 것으로서, 주사 바늘의 게이지로 규정하면, 23 내지 21 게이지 (내경 약 0.4 내지 0.6㎜) 등의 주사 바늘을 통과하는 사이즈의 복합체를 말한다. 이 상태의 복합체란, 대략 10㎛ 이하의 것이 대부분이라고 사료된다.
상세하게는, 본 발명의 제제는, 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 히스티딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 숙신산, 시트르산, 타르 타르산, 락트산 및 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 첨가제, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 제제로서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체가, 제어된 사이즈, 예를 들어, 그 70％ 이상이 10㎛ 이하의 사이즈를 갖는 미세 입자를 형성하고 있는 제제이다. 여기서, 특히 바람직한 첨가제는 아르기닌, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는 것이다.
본 발명의 제제에는 하나의 양태로서, 바람직하게는,
(1) 핵산 분자의 농도가 0.001 ∼ 100㎎/㎖, 바람직하게는 0.001 ∼ 50㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.001 ∼ 10㎎/㎖,
(2) 콜라겐의 농도가 0.001％ ∼ 10％, 보다 바람직하게는 0.01％ ∼ 2％,
(3) 첨가제의 총 농도가 1 ∼ 10％, 및/또는
(4) 수용액의 pH 가 5 ∼ 9, 보다 바람직하게는 pH 가 6 ∼ 8 인 용액 제제를 들 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은, 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 트리에탄올아민 및 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 첨가제, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 제제로서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체가 제어된 사이즈, 예를 들어, 그 70％ 이상이 10㎛ 이하의 사이즈를 갖는 미세 입자를 형성하고 있는 제제를 들 수 있다. 여기서, 특히 바람직한 첨가제는 아르기닌, 리신 및 이들의 염 중에서 선택되는 것이다.
이 제제로는 용액 제제 및 건조 제제를 들 수 있다. 건조 제제를 얻기 위한 건조 방법은 핵산의 안정성이 유지되는 방법이라면 특별히 한정은 없고, 예를 들어, 동결 건조법, 풍건법, 스프레이 드라이법을 들 수 있다. 건조 제제로서 바람직하게는, 동결 건조법으로 얻어진 동결 건조 제제이다.
이 양태에 있어서의 용액 제제는, 본 발명의 상기 유기 염기 첨가제의 작용에 의해 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 응집이 방지되어, 양호하게 분산되어 있다. 또한, 건조 제제는, 그 건조 제제로 재구성되는 용액 제제에서도 미세 입자의 응집 방지 및 양호한 분산성이 유지되는 제제로서 유용하다.
여기에서, 「미세 입자의 응집이 방지되어, 양호하게 분산」이란, 실온에서부터 체온 부근의 비냉장 상태에 있어서, 3 시간 이상, 적어도 12 시간 응집되지 않고, 10㎛ 이하의 미세 상태를 유지하고, 적어도 100㎛ 를 초과하는 응집물이 존재하지 않는 상태를 유지하고 있는 것을 의미한다.
특히 동결 건조 제제에 있어서의 유용성은, 동결 건조 후의 재구성시 (복수 (復水) 시) 에 응집되지 않고 분산성이 유지되어 있는 것이다.
본 발명의 제제는, 핵산 분자와 콜라겐 복합체의 미세 입자 외에, 필요에 따라 의약상 허용되는 첨가제를 함유할 수 있다. 의약상 허용되는 첨가제로는, 복합체 미세 입자를 주사제로서 사용하는 경우의 등장화제, pH 조절제, 무통화제, 또는 고형제로서 사용하는 경우의 부형제, 붕괴제 등을 들 수 있으며, 일본에서는 의약품 첨가물 사전 (일본 의약품 첨가제 협회 편집) 에 기술되어 있는 것이다. 구체적으로는 pH 를 6 ∼ 8 로 유지하기 위해, 또는 부하되는 세포와 등장으로 유지하기 위해 사용되는 염류나 당류를 들 수 있다.
핵산 분자와 콜라겐의 복합체가 제어된 사이즈인 효과는, 복합체 입자의 사이즈가 투여 후의 생체 내에서의 분포나 약효에 주는 영향뿐만 아니라, 응집을 방지하여 제제 조제시 및 사용시의 균일성을 개선할 수 있기 때문에, 의약품으로서 품질 관리면에서의 의의가 매우 크다. 본 발명의 제제는 복합체 입자의 분산성이 안정되어, 실온이나 체온 부근의 비냉장 상태에 방치해도 대개 3 시간 이상에 걸쳐 응집되지 않고 안정적으로 유지할 수 있다. 이것은, 사용시의 제제 준비 개시부터 투여까지의 동안 엄밀한 온도 관리를 필요로 하지 않으며, 핸들링을 용이하게 한다. 또한, 제조 공정에서의 엄밀한 온도 관리를 필요로 하지 않기 때문에, 공업화에 있어서의 메리트는 크다. 한편, 본 발명을 사용하지 않는 핵산 분자와 콜라겐의 복합체 제제에서는, 종종 온도 상승에 의해 바로 큰 응집 덩어리가 발생하여 백탁되는 등, 성상이 크게 변화할 뿐만 아니라, 주사 바늘에 의한 투여가 곤란해지거나, 제조시의 균일성을 확보할 수 없거나 하는 문제가 발생한다.
또한, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체가 제어된 사이즈인 효과는, 추가로 제제 가공을 실시하는 데에 적합한 복합체를 제공하는 것에 있다. 예를 들어, 다른 제제 캐리어 중에 함유시키는 경우, 그 중에서도 마이크로 캡슐이나 마이크로 스페어, 나노 캡슐이나 나노 스페어, 리포솜, 에멀젼 등의 DDS 에 사용되는 미립자 내에 밀봉하는 경우, 복합체는 이들이 밀봉하고자 하는 미립자보다 작고 또한 균일한 사이즈의 입자를 형성할 필요가 있다. 종래의 복합체는 불균일하고 또한 밀봉하고자 하는 미립자보다 큰 사이즈이기 때문에 미립자 내에 넣을 수 없었지만, 본 발명의 미세 복합체는, 예를 들어 Arg 를 첨가제로서 사용한 경우에서는 복합체 대 부분이 400㎚ 의 필터를 통과하는 미세한 사이즈의 것이 얻어지기 때문에, 미립자 내에도 밀봉할 수 있다. 조제에는, 본 발명의 복합체를 수용액 상태 또는 건조 상태로 하여 사용함으로써, 통상의 제제화 방법을 응용할 수 있다.
(5) 핵산 분자를 원하는 세포로 운반하기 위한 제제
본 발명의 제제는 핵산 분자를 원하는 세포로 운반하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 제제가 고체상인 경우, 정제수, 생리적 식염수, 생체와 등장인 완충액 등을 사용하여 용액상으로 하고, 원하는 세포에 부하한다.
원하는 세포로는 통상의 실험에서 사용되는 동물 세포나, 유전자 치료의 대상이 되는 세포, 조직, 장기 등을 들 수 있다. 핵산 분자는 단독으로는 인비트로의 세포에 혈청 존재하에서 투여해도 거의 세포에 도입할 수 없지만, 콜라겐 복합체 미세 입자를 형성함으로써, 비로소 효율적으로 핵산을 세포에 도입할 수 있다. 이 때문에, 본 발명 제제는 스크리닝 방법이나 그것에 사용하는 시제에 사용될 뿐만 아니라, 유전자 치료를 위한 제제로서 사용할 수 있다.
핵산 분자가 플라스미드 DNA 또는 바이러스 등의 유전자 치료에 사용되는 벡터인 경우, 세포 내에 도입되었을 때, 코드된 유전 정보를 세포 내에서 발현시키도록 구성된 형태가 바람직하고, 프로모터 등, 목적으로 하는 유전자의 발현에 필요한 요소를 함유하거나, 또는 염색체에 대한 도입을 가능하게 하는 요소를 함유하는 벡터 등이다.
플라스미드 DNA 및 안티센스 DNA, siRNA 등을 세포에 도입하는 경우, 세포에 영향을 최대한 주지 않는 방법으로 실시하는 것은 필수이다. 그러나, 일반적인 도입 방법에서는, 세포 장해성이 높은 방법인 것이 많다고 사료된다. 한편, 본 발명의 제제는 원래 생체 내에 존재하고, 세포와 접촉하고 있는 물질인 콜라겐을 복합체로서 사용하기 때문에, 세포에 대한 영향은 매우 낮아, 도입된 핵산 분자의 기능을 노이즈 없이 측정할 수 있다.
본 발명 제제의 구체적인 사용 방법으로는, 기능을 해명하고자 하는 유전자를 발현시키는 플라스미드 DNA, 아데노바이러스 또는 기능을 해명하고자 하는 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 와의 콜라겐 복합체 미세 입자로 이루어지는 제제를, 배양 플레이트 고상 상에 도포, 정렬하여 배치한다. 여기서 사용하는 고상 플레이트는 96 웰의 멀티 웰 플레이트나, 더욱 마이크로한 플레이트 등이다. 도포한 복합체 입자를 건조시켜 고상 상에 고정한 후, 세포를 파종하고, 수 일간 플레이트 상에서 배양한다. 도포된 복합체 입자는 도포된 부분에 접착된 세포에 효율적으로 도입되어, 기능을 조사하고자 하는 유전자를 발현시키거나 또는 그 발현을 장기간 억제한다. 수 일후, 세포의 형태나 세포 내에서의 유전자 발현 상태, 또는 세포로부터 생성된 단백질의 종류나 양을 조사함으로써 표적으로 한 유전자의 기능을 분명히 할 수 있다.
이하에 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
아르기닌에 의한 올리고뉴클레오티드와 콜라겐 복합체의 미세화 효과
첨가제로서 아르기닌 염산염을 사용하고, 올리고뉴클레오티드로서 세포 접착 인자 중 하나인 마우스 ICAM-1 에 대한 포스포로티오에이트형 안티센스 DNA (5'-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3' (서열 번호 10)) 와 콜라겐으로서 아테로콜라겐 (2％ 아테로콜라겐 용액) 을 사용하여 각각 최종 농도를 아르기닌으로서 2％, 안티센스를 DNA 0.1㎎/㎖, 콜라겐을 0.05％ 가 되도록 PBS (pH 7.4) 중에서 혼합하고, 냉장고 (4 ∼ 10℃) 에서 하룻밤 정치하여, 콜라겐과 안티센스 DNA 의 복합체를 얻었다.
동일하게 비교예로서, 아르기닌을 함유시키지 않고 올리고뉴클레오티드와 아테로콜라겐을 혼합한 복합체를 얻었다.
동일하게, 안티센스 DNA 로서, 염증성 사이토카인인 TNF-α 에 대한 포스포로티오에이트형 안티센스 DNA (5'-AACCCATCGGCTGGCACCAC-3' (서열 번호 11)) 를 사용한 경우에 대해서도, 아르기닌을 2％ 함유하는 본 발명의 복합체와 함유하지 않은 비교예의 복합체를 얻었다.
이들 복합체의 사이즈를 조사하기 위해, 구멍 직경이 10㎛ 인 isopore filter (Millipore 제조) 로 여과하고, 여과액 중의 아테로콜라겐량을 측정하였다. 표 1 에 결과를 나타낸다.
[표 1]
샘플 No. 첨가제의 종류와 농도 올리고뉴클레오티드의 종류와 농도 아테로 콜라겐 농도 용매 육안 관찰 구멍직경10 ㎛ 필터 통과 아테로콜라겐의 비율
실시예 1-1 아르기닌 2% 안티센스ICAM-1 0.1mg/ml 0.05% PBS 맑고 깨끗함 88%
비교예 1-2 - 안티센스ICAM-1 0.1mg/ml 0.05% PBS 다소 백탁 36%
실시예 1-3 아르기닌 2% 안티센스TNF-α 0.1mg/ml 0.05% PBS 맑고 깨끗함 88%
비교예 1-4 - 안티센스TNF-α 0.1mg/ml 0.05% PBS 다소 백탁 27%
표 1 에 나타낸 바와 같이, 실시예인 샘플 1-1 및 1-3 은 액이 맑고 깨끗하였으며, 구멍 직경 10㎛ 의 필터로 여과한 결과, 아테로콜라겐의 대략 90％ 가 통과하였다. 한편, 비교예로서 조제한 샘플 1-2 및 1-4 는 액이 다소 백탁되어 있으며, 구멍 직경 10㎛ 의 필터를 통과한 아테로콜라겐은 30％ 정도에 불과했다.
본 실시예의 조건에서는, 안티센스 DNA 를 아테로콜라겐의 약 10 배의 몰 농도로 사용하고 있기 때문에, 과잉으로 존재하는 안티센스 일부는 프리체로서 존재하지만, 아테로콜라겐 전부는 안티센스 DNA 와 복합체를 형성하고 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 복합체는 아테로콜라겐량으로서 대략 90％ 가 10㎛ 이하의 미세 입자를 형성하고 있으며, 한편, 비교예에서는 약 70％ 가 10㎛ 이상의 큰 응집물로서 존재하고 있다고 할 수 있다.
실시예 2
각종 첨가제에 의한 올리고뉴클레오티드와 콜라겐 복합체의 미세화 효과
본 발명 첨가제 (염산염 사용 또는 다양한 산에 의해 중화) 를 사용하고, 마우스 ICAM-1 에 대한 포스포로티오에이트형 안티센스 DNA 와 아테로콜라겐을 중성 수용액 중에서 혼합하고, 냉장고 (4 ∼ 10℃) 에서 하룻밤 정치하여 복합체를 얻었 다. 첨가물의 종류 및 각 성분의 최종 농도를 표 2 에 정리하였다.
이들 샘플에 단사슬 핵산 형광 염색 시약 YOYO (Molecular Probes) 를 첨가하여 안티센스 DNA 를 형광 염색하고, 형광 현미경으로 관찰하였다. 형광 현미경에서는 수 ㎛ 이상 사이즈의 입자를 판별할 수 있지만, 어느 예에서나 균일한 염색 이미지가 되어, 10㎛ 를 초과하는 복합체는 관찰되지 않았다.
[표 2-1]
Figure 112007075883417-PCT00001
[표 2-2]
Figure 112007075883417-PCT00002
실시예 3
첨가제의 종류와 온도에 대한 복합체 미세 입자의 응집 방지 효과
첨가제로서 아르기닌 및 트로메타몰 (전자는 염산염을 사용하고, 후자는 염 산에 의해 중화시킨 것을 사용) 을 사용하고, 올리고뉴클레오티드로서 마우스 ICAM-1 에 대한 포스포로티오에이트형 안티센스 DNA 와 아테로콜라겐을 각각 최종 농도 2％, 0.125㎎/㎖, 0.3％ 가 되도록 중성의 0.1M 인산 완충액 (pH 6.5 ∼ 7.9) 중에서 혼합하고, 냉장고 (4 ∼ 10℃) 에서 2 일간 정치하여 복합체를 얻었다. 동일하게 비교예로서, 첨가제를 함유시키지 않은 것 또는 요소 (단백 변성제이며 가용화제), 글리세린 (글리세롤, 특허 문헌 4 에서의 콜라겐 섬유 분해제로서 대표적), 아세틸트립토판 Na (단백 제제의 안정화제), Tween80 (계면 활성제) 을 선택하여, 각각 첨가한 것을 조제하였다. 실시예 및 비교예의 샘플에 있어서의 각 성분의 최종 농도는 표 3 과 같다. 실온에서의 응집 방지 효과를 평가하기 위해, 각 복합체를 실온에서 18 시간 정치하고, 정치 전후의 입자 상태를 비교하였다. 표 3 에 정치 후의 육안 관찰의 결과, 도 1 에 정치 전후의 형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 1 로부터, 실온 정치 전의 냉장 조건하에서도, 첨가제를 함유하지 않은 비교예의 샘플 3-3 에서는 100㎛ 를 초과하는 큰 복합체가 형성된 반면, 아르기닌 (실시예 3-1), 트로메타몰 (실시예 3-2), 요소 (비교예 3-4), 아세틸트립토판 Na (비교예 3-6) 에서는, 큰 복합체는 거의 없어 미세화 효과가 인정되었다. 그러나, 요소, 아세틸트립토판 Na 에서는, 실온 정치 후에 입자의 응집이 관찰되었다. 또한, 글리세린 (비교예 3-5) 에서는, 콜라겐과 DNA 혼합 후에 응집 (＞ 10㎛) 이 관찰되었고, 실온 보존 후에는 더욱 응집이 커졌다. 동일하게 Tween80 (비교예 3-7) 도 효과는 없었고, 실온 정치 후에 더욱 입자의 응집이 진행되어 거대화 되는 경향이 인정되었다.
한편, 아르기닌 (실시예 3-1) 또는 트로메타몰 (실시예 3-2) 을 함유시킨 샘플에서는, 실온 정치 후에도 미세하고 균일한 복합체가 유지되어 있어, 실온에서도 응집 방지 효과가 있다는 것이 나타났다.
[표 3]
Figure 112007075883417-PCT00003
실시예 4
동결 융해에 대한 첨가제의 효과
동결 융해시의 복합체 입자 상태에 대한 본 발명의 첨가제의 효과를 확인하기 위해, 실시예의 샘플 2-6 및 비교예의 샘플 1-2 를 －20℃ 에서 동결하고, 완전히 동결된 것을 확인한 후, 실온에서 융해하였다. 융해 후, 샘플이 실온으로 되돌아가기 전에 5℃ 로 냉동 보관하고, 입자 사이즈의 평가를 실시하였다. 이 조작을 2 회 반복한 결과, 실시예의 샘플 2-6 에서는, 동결 융해 처리 전후의 형광 현미경 이미지에 있어서 10㎛ 를 초과하는 복합체는 관찰되지 않았고, 또한 구멍 직경 0.4㎛ 의 필터를 사용하여 여과한 결과, 콜라겐의 90％ 이상이 통과하여, 동결 융해 후에도 복합체의 미세한 입자 상태가 유지되고 있다는 것을 알 수 있었다. 한편, 비교예의 샘플 1-2 에서는, 동결 전후 모두 100㎛ 를 초과하는 큰 응집물이 관찰되었고, 또한 구멍 직경 10㎛ 의 필터 여과에서는, 통과한 콜라겐은 동결 전에 20％ 정도이었고, 동결 융해 후에는 10 ∼ 17％ 로 다소 감소하는 경향이 인정되었으며, 동결 융해에 의해 복합체 입자의 응집이 촉진될 가능성이 사료되었다.
[표 4]
샘플No. 동결전의 입자상태 동결 융해후의 입자 상태
형광 현미경 이미지 필터 여과 형광 현미경 이미지 필터 여과
실시예 2-6 응집물(＞10㎛) 관찰되지 않음 φ0.4㎛통과 콜라겐 90% 이상 응집물(＞10㎛) 관찰되지 않음 φ0.4㎛통과 콜라겐 90% 이상
비교예 1-2 응집물(＞100㎛) 있음 φ10㎛통과 콜라겐 20% 응집물(＞100㎛) 있음 φ10㎛통과 콜라겐 10~17%
실시예 5
동결 건조에 대한 첨가제의 효과
동결 건조시의 입자 상태에 대한 첨가제의 효과를 조사할 목적에서, 표 5 에 나타내는 조성으로 실시예 1 과 동일한 방법으로 복합체를 조제하였다. 실시예 5-2, 5-3 에서는 당류를 부형제로서 함유시켰다.
평가는, 각 복합체를 조제한 후 동결 건조를 실시하고, 동결 건조 전후에서의 복합체 입자 상태를 형광 현미경으로 관찰하였다. 어느 실시예의 동결 건조 제제에서나 물을 첨가하여 복수한 결과, 빠르게 용해되어 맑고 깨끗한 수용액이 되었다. 현미경 관찰 결과를 표 5 에 나타낸다.
[표 5]
샘플No. 첨가제의 종류와 농도 염 또는 중화용의 산 당류 안티센트ICAM-1 아테로 콜라겐 용매 동결 건조 전의 형광 현미경 이미지 동결 건조 후의 형광 현미경 이미지
실시예 5-1 아르기닌4% HCl - 0.25 mg/ml 0.1% 물 응집물(＞10㎛)관찰되지 않음 응집물(＞10㎛)관찰되지 않음
실시예 5-2 아르기닌4% HCl 수크로오즈 2% 0.25 mg/ml 0.1% 물 응집물(＞10㎛)관찰되지 않음 응집물(＞10㎛)관찰되지 않음
실시예 5-3 아르기닌4% HCl 트레할로즈 2% 0.25 mg/ml 0.1% 물 응집물(＞10㎛)관찰되지 않음 응집물(＞10㎛)관찰되지 않음
실시예 6
플라스미드 DNA 와 콜라겐의 복합체에 대한 미세화 그리고 온도와 동결 융해 처리에 대한 응집 방지 효과
플라스미드 DNA (pCMV-LacZ, 4079kb, 분자량 약 250 만) 를 사용하고, 실시예 1 의 안티센스 DNA 와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA 와 콜라겐의 복합체를 조제하였다. 조성은 표 6-1 과 같다. 각 복합체를 5℃ 또는 실온에서 정치 1 일, 또는 －40℃ (1 일) 에서 동결시킨 후에 실온에서 융해시키고, 복합체의 입자 상태를 형광 현미경으로 관찰하였다. 플라스미드 DNA 의 형광 염색은 picoGreen dsDNA Quantitation Reagent (Molecular Probes) 를 사용하였다. 결과를 표 6-2 및 도 2 에 나타낸다.
[표 6-1]
샘플No. 첨가제의 종류와 농도 염 또는 중화용의 산 pDNA 아테로 콜라겐 용매
실시예 6-1 아르기닌4% HCl 0.1mg/ml 0.05% PBS
비교예 6-2 - HCl 0.1mg/ml 0.05% PBS
[표 6-2]
샘플No. 5℃정치 1일후 실온 정치 1일후 동결 융해 1 회후
실시예 6-1 입자(＞10㎛)관찰되지 않음 입자(＞10㎛)관찰되지 않음 입자(＞10㎛)관찰되지 않음
비교예 6-2 ＞10㎛의 입자가 존재 ＞100㎛의 응집물이 존재 ＞100㎛의 응집물이 존재
플라스미드 DNA 와 콜라겐의 복합체 형성에 있어서, 비교예 샘플 6-2 에서는 10㎛ 이상의 복합체 입자나 그 응집물이 관찰된 반면, 실시예 샘플 6-1 은 미세 입자의 응집이 방지되어, 양호하게 분산된 복합체를 제공하는 것이 나타났다. 또한, 비교예에서는 실온 1 일 정치나 동결 융해 처리에 의해, 응집이 촉진되는 경향이 인정되었지만, 실시예에서는 이들 처리에 의해서도 응집이 발생하지 않고, 미세한 입자 상태를 유지하는 효과가 인정되었다.
실시예 7
첨가제의 종류에 대한 복합체 미세 입자의 응집 방지 효과
이하의 표 7 에 나타내는 조성으로 실시예 3 과 동일한 방법으로 복합체를 조제하였다. 즉, 첨가제로서 히스티딘 (염산으로 중화), 타르타르산 (NaOH 에 의해 중화) 및 시트르산 (Na 염) 을 사용하고, 올리고뉴클레오티드로서 마우스 ICAM-1 에 대한 포스포로티오에이트형 안티센스 DNA 와 아테로콜라겐을 각각 최종 농도 2％, 0.125㎎/㎖, 0.3％ 가 되도록 중성의 0.1M 인산 완충액 (pH 6.5 ∼ 7.9) 중에서 혼합하고, 냉장고 (4 ∼ 10℃) 에서 2 일간 정치하여 복합체를 얻었다. 동일하게 비교예로서, 첨가제를 함유시키지 않은 것, 또는 특허 문헌 4 에서의 콜 라겐 섬유 분해제로서 대표적인 프로필렌글리콜을 첨가한 것을 조제하였다. 복합체의 상태를 육안 관찰 및 형광 현미경 관찰에 의해 평가를 하였다. 표 7 에 육안 관찰의 결과를 나타내고, 도 3 에 형광 현미경 이미지를 나타낸다.
[표 7]
샘플 No. 첨가제의 종류와 농도 첨가제의 염 또는 중화의 산 또는 염기 올리고뉴클레오티드의 종류와 농도 콜라겐의 농도 용매 육안 관찰
실시예 7-1 히스티딘1.5% HCl 안티센스 ICAM-1 0.125mg/ml 0.3% 0.1M PB 맑고 깨끗함
실시예 7-2 타르타르산2% NaOH 안티센스 ICAM-1 0.125mg/ml 0.3% 0.1M PB 맑고 깨끗함
실시예 7-3 시트르산2% NaOH 안티센스 ICAM-1 0.125mg/ml 0.3% 0.1M PB 맑고 깨끗함
비교예 7-4 - 안티센스 ICAM-1 0.125mg/ml 0.3% 0.1M PB 백탁
비교예 7-5 프로필렌글리콜2% 안티센스 ICAM-1 0.125mg/ml 0.3% 0.1M PB 백탁
육안 관찰의 결과는, 실시예의 샘플 7-1 내지 7-3 은 모두 맑고 깨끗한 반면, 비교예의 샘플 7-4 및 7-5 에서는 백탁되고 불균일하였다.
또한, 현미경 관찰 (도 3) 로부터, 첨가제를 함유하지 않은 비교예의 샘플 7-4 에서는 100㎛ 를 초과하는 큰 복합체가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 동일하게, 비교예 7-5 의 프로필렌글리콜은 특허 문헌 4 의 대표적인 콜라겐 섬유 분해제인데, 콜라겐과 DNA 혼합 후에 100㎛ 를 초과하는 큰 복합체가 다수 관찰되어, 콜라겐과 DNA 복합체에 대한 미세화 효과는 인정되지 않았다. 이에 대하여, 본 발명의 첨가제인 히스티딘 (실시예 7-1), 타르타르산 (실시예 7-2), 시트르 산 (실시예 7-3) 에서는, 큰 복합체는 거의 없어 미세화 효과가 인정되었다.
실시예 8
아르기닌에 의한 고농도 올리고뉴클레오티드와 콜라겐 복합체의 미세화 효과
실시예 2 와 동일한 방법에 의해, 표 8 에 기재된 첨가제 등을 사용하고, 이하의 조건하에서 제제를 조제하고, 형광 현미경으로 응집물의 유무를 관찰하였다. 현미경 관찰 결과를 표 8 및 도 4 에 나타낸다. 현미경 이미지는 균일한 염색 이미지가 되었으며, 10㎛ 를 초과하는 복합체의 응집물은 관찰되지 않았다.
[표 8]
샘플 No. 첨가제의 종류와 농도 중화의 산 올리고뉴클레오티드의 종류와 농도 아테로 콜라겐 농도 용매 형광 현미경 이미지
실시예8 아르기닌4% HCl 안티센스 ICAM-1 40mg/ml 0.05% 물 응집물(＞10㎛)관찰되지 않음
시험예 1
마우스 피부염 모델에 있어서의 효과
본 발명 제제의 약효를 조사하기 위해, 핵산 분자로서 안티센스 ICAM-1 을 함유하는 제제 (표 9) 를 실시예 2 와 동일한 방법으로 조제하고, 마우스 피부염 모델 (Hum Gene Ther. 2004 Mar ; 15 (3) : 263 에 평가계의 기재 참조) 에 투여하여 항염증 효과를 평가하였다.
[표 9]
샘플 No. 첨가제의 종류와 농도 중화의 산 올리고뉴클레오티드의 종류와 농도 아테로 콜라겐 농도 용매
실시예 9-1 아르기닌 4% HCl 안티센스ICAM-1 0.1mg/ml 0.1% 물
실시예 9-2 아르기닌 4% HCl 안티센스ICAM-1 0.1mg/ml 0.05% 물
비교예(대조) 9-3 - - 안티센스ICAM-1 0.1mg/ml - PBS
비교예(대조) 9-4 아르기닌 4% HCl - 0.05% 물
마우스 피부염 모델에 의한 약효 평가는 이하의 방법으로 실시하였다.
8 주령의 마우스 (BALB/c Cr Slc, ♂) 의 복부를 전기 바리캉 및 면도칼로 제모하였다. 제모 부위에 0.5％ 2,4-Dinitorofluorobenzene (DNFB ; 용매는 아세톤 : 올리브 오일 ＝ 4 : 1) 25㎕ 를 2 일간 연속으로 도포하여, 마우스를 감작시켰다. 2 회째 감작의 6 일 후에, 마취하에서 씨크니스게이지 (peacock 제조) 를 사용하여 오른쪽 귓바퀴의 두께 전 (前) 값을 측정하였다. 그 후, 0.2％ DNFB 를 오른쪽 귓바퀴에 15㎕ 도포하여 피부염을 야기하고, 15 분 후에 제제 (실시예 9-1 또는 실시예 9-2) 를, 안티센스 ICAM-1 로서 10㎖/kg 의 투여량으로 꼬리 정맥 내에 투여하였다. 시험 대조로는, 생리 식염수를 투여하는 군 외에, 아테로콜라겐을 함유하지 않은 안티센스 ICAM-1 용액 (비교예 9-3) 또는 안티센스 ICAM-1 을 함유하지 않은 아테로콜라겐액 (비교예 9-4) 을 투여하는 군을 설정하였다. DNFB 도포 24 시간 후에 다시 오른쪽 귓바퀴의 두께를 측정하고, 피부염 야기 전후의 차이를 산출하여 종창 지수 [귓바퀴 종창도 ; Ear swelling index (× 10-3㎜)] 로 하였다. 각 군 (n ＝ 5) 의 평균값 (± S.E.) 을 산출하여 도 5 에 나타냈다.
마우스 피부염 모델에 의한 약효 평가의 결과, 안티센스 ICAM-1 단독 (비교예 9-3) 또는 아테로콜라겐 단독 (비교예 9-4) 을 투여한 경우에는, 생리 식염수를 투여한 군 (대조) 과 비교하여 유의한 귓바퀴 종창 억제 효과를 나타내지 않은 반면, 본 발명 제제 (실시예 9-1, 9-2) 를 투여한 군에서는 유의한 귓바퀴 종창 억제 효과를 나타냈다. 이로부터, 본 발명 제제는 핵산 분자와 콜라겐의 미세 복합체로서, 안티센스 ICAM-1 을 단독으로 투여하는 것 이상의 약효를 갖는 것을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
시험예 2
본 발명의 동결 건조 제제의 약효를 조사하기 위해, 핵산 분자로서 안티센스 ICAM-1 을 함유하는 동결 건조 제제 (표 10) 를 실시예 5 와 동일한 방법으로 조제하고, 시험예 1 과 동일하게 마우스 피부염 모델에 투여하여 항염증 효과를 평가하였다.
[표 10]
샘플 No. 첨가제의 종류와 농도 중화의 산 올리고뉴클레오티드의 종류와 농도 아테로 콜라겐 농도 용매
실시예 (동결건조 제제) 10-1 아르기닌 4% HCl 안티센스ICAM-1 0.1mg/ml 0.05% 물
마우스 피부염 모델에 의한 약효 평가는 이하의 방법으로 실시하였다.
8 주령의 마우스 (BALB/c Cr Slc, ♂) 의 복부를 전기 바리캉 및 면도칼로 제모하였다. 제모 부위에 0.5％ 2,4-Dinitorofluorobenzene (DNFB ; 용매는 아세톤 : 올리브 오일 ＝ 4 : 1) 100㎕ 를 1 회 도포하여, 마우스를 감작시켰다. 감작 6 일 후에, 마취하에서 씨크니스게이지 (peacock 제조) 를 사용하여 좌우의 귓바퀴의 두께 전 값을 측정하였다. 그 후, 0.2％ DNFB 를 양 귓바퀴에 20㎕ 도포하여 피부염을 야기하고, 15 분 후에 동결 건조 제제 (실시예 10-1) 에 물을 첨가하여 복수한 것을 안티센스 ICAM-1 로서 10㎖/kg 의 투여량으로 꼬리 정맥 내에 투여하였다. 시험 대조로는 생리 식염수를 투여하는 군을 설정하였다. DNFB 도포 24 시간 후에 다시 양 귓바퀴의 두께를 측정하고, 피부염 야기 전후의 차이를 산출하여 종창 지수 [귓바퀴 종창도 ; Ear swelling index (× 10-3㎜)] 로 하였다. 각 군 (n ＝ 6) 의 평균값 (± S.E.) 을 산출하였다. 결과를 도 6 에 나타낸다.
마우스 피부염 모델에 의한 약효 평가의 결과, 본 발명의 동결 건조 제제 (실시예 10-1) 를 투여한 군은, 생리 식염수 투여군 (대조) 에 대하여 유의한 귓바퀴 종창 억제 효과를 나타냈다. 이로부터, 본 발명의 미세 복합체는 동결 건조 제제로 해도 유효하다는 것이 나타났다.
본 발명에 의해, 기본적으로 핵산 분자와 콜라겐으로 이루어지는 복합체를 함유하는, 균일한 분산성을 안정적으로 유지할 수 있는, 바꾸어 말하면, 균일하고 분산성이 우수한 실용적인 미세 입자 제제가 제공된다. 즉, 본 발명은, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체 형성에 있어서, 콜라겐에 대하여 첨가제로서 특정 종류의 유기 염기 또는 산을 공존시킴으로써 중성 수용액 중에서의 콜라겐 자체의 응집을 억제하고, 또한 콜라겐과 핵산 분자의 복합체 형성에 있어서, 콜라겐과 핵산 분자 를 통한 복합체끼리의 응집이 진행되는 것에 의한 거대화를 방지하여, 제어된 사이즈를 갖는 복합체 미세 입자 함유 제제를 제공하는 것이다. 본 발명의 제제는, 핵산 의약에 대한 응용 이외에, 핵산 분자 관련 시약이나 진단약, 키트류에 대한 응용도 가능하다.
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Claims (20)

  1. 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 히스티딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 숙신산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 및 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 첨가제로서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 첨가제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로서, 70％ 이상을 10㎛ 이하의 사이즈로 조정할 수 있는, pH 5 ∼ 9 의 적어도 1％ 이상의 함량의 수용액을 조제하기 위해 사용되는 첨가제.
  3. 제 1 항에 기재된 첨가제 및 콜라겐을 함유하는 수용액으로서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 수용액.
  4. 제 1 항에 기재된 첨가제 및 콜라겐을 함유하는 수용액으로서, 그 수용액에 핵산을 첨가함으로써, 제어된 사이즈를 갖는 핵산 분자와 콜라겐의 미세 입자의 복합체를 조제하기 위한 수용액.
  5. 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 건조 제제를 용액 제제로 재구성하기 위한, 제 1 항에 기재된 첨가제를 함유하는 수용액으로서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 수용액.
  6. 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로서, 70％ 이상을 10㎛ 이하의 사이즈로 조정할 수 있는, pH 5 ∼ 9 의 적어도 1％ 이상의 함량으로 제 1 항에 기재된 첨가제를 함유하는 수용액.
  7. 제 1 항에 기재된 첨가제, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 제제로서, 핵산 분자와 콜라겐이, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체를 형성하고 있는 제제.
  8. 제 7 항에 있어서,
    제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체가 그 70％ 이상이 10㎛ 이하의 사이즈인 제제.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    용액 제제인 제제.
  10. 아르기닌, 트로메타몰, 메글루민, 리신, 트리에탄올아민 및 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 첨가제로서,
    (1) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키고,
    (2) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자를 함유하는 용액 제제에 있어서, 그 미세 입자의 응집을 방지하고, 또한 양호하게 분산시키며, 및/또는
    (3) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자를 함유하는 건조 제제로 재구성한 용액 제제에 있어서, 그 미세 입자의 응집 방지 및 양호한 분산성을 유지시키기 위한 첨가제.
  11. 제 10 항에 기재된 첨가제 및 아테로콜라겐을 함유하는, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키기 위한 수용액.
  12. 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 건조 제제를 용액 제제로 재구성하기 위한, 제 10 항에 기재된 첨가제를 함유하는 수용액으로서,
    (1) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체를, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자로 변환시키고,
    (2) 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자를 함유하는, 재구성된 용액 제제에 있어서, 그 미세 입자의 응집을 방지하고, 또한 양호하게 분산시키기 위한 수용액.
  13. 제 10 항에 기재된 첨가제, 핵산 분자 및 콜라겐을 함유하는 제제로서, 핵산 분자와 콜라겐이, 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체를 형성하고 있는 제제.
  14. 제 13 항에 있어서,
    제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 복합체가 그 70％ 이상이 10㎛ 이하의 사이즈인 제제.
  15. 제 10 항에 기재된 첨가제를 함유하는 용액 제제인, 제 13 항 또는 제 14 항에 기재된 제제로서, 핵산 분자와 콜라겐의 복합체의 제어된 사이즈를 갖는 미세 입자의 응집이 방지되고, 또한 양호하게 분산되어 있는 제제.
  16. 제 10 항에 기재된 첨가제를 함유하는 건조 제제인, 제 13 항 또는 제 14 항에 기재된 제제로서, 그 건조 제제로 재구성되는 용액 제제에 있어서도, 미세 입자의 응집 방지 및 양호한 분산성이 유지되어 있는 제제.
  17. 제 7 항 내지 제 9 항, 및 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분자를 원하는 세포로 운반하기 위한 제제.
  18. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 10 항에 있어서,
    콜라겐이 아테로콜라겐인 첨가제.
  19. 제 3 항 내지 제 6 항, 제 11 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    콜라겐이 아테로콜라겐인 수용액.
  20. 제 7 항 내지 제 9 항, 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    콜라겐이 아테로콜라겐인 제제.
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