KR20070101867A

KR20070101867A - 사이클로스포린 화합물 ｉｓａ247의 생물전환 방법

Info

Publication number: KR20070101867A
Application number: KR1020077016868A
Authority: KR
Inventors: 데릭 지. 프레이탁; 다니엘 제이. 트리파니어
Original assignee: 이소테크니카 인코포레이티드
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2007-10-17
Also published as: WO2006066416A1; AU2005318844A1; JP2008524992A; EP1831389A1; CA2591781A1

Abstract

미생물을 이용하여 생물전환에 의해 생체이물질 화합물의 대사산물을 생산하는 방법으로서, 상기 생체이물질 화합물은 사이클로스포린 ISA247이고 이것은 계면활성제와의 혼합물로서 미생물에게 전달된다. 본 발명의 방법은 예컨대 반응기에서 생물전환에 의해 대사산물을 대량생산하도록 대규모화시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 대사산물은 항체 생산시, 치료약물농도를 감시하는데 있어서 표준물질로서 또는 약학적 응용에 있어서 이용될 수 있다.

생물전환, 사이클로스포린 ISA247, 생체이물질

Description

사이클로스포린 화합물 ＩＳＡ247의 생물전환 방법{METHODS FOR THE BIOTRANSFORMATION OF THE CLYCLOSPORIN COMPOUND ISA247}

본 발명은 화합물의 대사산물의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 생물전환(biotransformation)에 의하여 그러한 대사산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

환자에게 의약품을 투약하는 경우에는 그 환자가 약물의 유효 치료량을 제대로 투약받는지 확인하기 위하여 약물의 혈청 농도를 감시하는 것이 필요한데, 이를 치료약물농도감시 (TDM: therapeutic dose monitoring)라고 한다. TDM은 모화합물 및/또는 그 모화합물의 1종 이상의 대사산물을 측정한다. 대사산물은 약물이 인체로부터 보다 용이하게 제거될 수 있도록 효소, 보통은 간의 효소들이 약물을 분해하거나 변형시키는 작용을 할 때 형성된다. 모화합물이 신속히 대사될 때가, TDM의 목적을 위해 대사산물의 농도를 측정하는데 가장 편리하다. 이러한 측정에는 흔히 면역분석법이 이용된다.

대사산물을 측정하는 TDM 분석법이 면역분석법일 경우, 그 분석법에 사용되는데 요구되는 특이성을 갖는 항체를 생성 및/또는 선별하기 위해, 그 약물이나, 그 약물의 분리, 정제된 대사산물들이 이용될 수 있다. 또는, 모화합물에 특이적인 항체, 즉, 모화합물과 모화합물의 대사산물 사이에 교차반응성을 최소한도로 나타내는 항체를 특정하기 위해 정제된 대사산물을 이용할 수도 있다. 따라서, TDM에 적합한 항체의 생산에 사용하기에 적합한 대사산물을 정량적으로 확보하기 위해서는 분리된 대사산물을 효과적으로 생산하는 방법이 필요하다.

대사산물은 또한 TDM과는 무관한 용도도 갖는다. 대사산물은 약학적으로 중요한 활성을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 대사산물들은 개선된 약동학, 증가된 약리활성 또는 개선된 생체이용성과 같은 이로운 특성들을 나타낼 수 있다. 모약물 화합물의 대사산물은 그 자체로 유용한 치료제일 수 있다. 에컨대, A77 1726은 레플루노마이드의 활성 대사산물이고; 히드록시-3차-부틸아미드는 HIV 약품인 넬피나비어의 활성 대사산물이며; 4-OH-타목시펜은 타목시펜의 활성적인 대사산물이다. 대사산물이 활성을 나타낼 경우, 대사산물을 대량으로 생산하는 효과적인 방법이 요망될 수 있다. 1종 이상의 대사산물이 독성을 나타낼 수도 있다. 따라서, 약물이 대사되는 방법, 그에 따른 대사산물, 및 이러한 대사산물의 활성에 관한 지식은 약물의 활성을 이해하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 정보는 또한 약물을 승인하기 전에 요구될 수도 있다. 대사산물과 그의 특성을 확인하기 위해서는, 대사산물이 충분한 양으로 생산 및 분리되어야 한다.

대사산물을 제조하는 한가지 방법은 약물을 인간과 같은 포유동물에게 투여한 다음 혈액, 뇨, 담즙 또는 기타 체액을 수집한 후 추출, 정제과정을 거쳐 이러한 체액으로부터 대사산물을 분리하는 것이다. 사람 환자에 있어서 약물을 그 약물의 대사산물로 전환시키는 생물전환은 보통 간의 시토크롬 P450 효소 (CYP450 또는 P450)에 의해 간에서 일어난다. P450 효소 집단에는 화합물이 담즙이나 뇨로 분비되도록 잘 용해하게 만드는 역할을 하는 효소들을 70여가지 함유하는 것으로 추정된다. 생물전환에 의한 대사산물의 형성을 감시하기 위해, 대사산물을 인식할 수 있도록 모화합물에 태그를 붙일 수 있다. 또는, 고압 액체 크로마토그래피 분리법과 질량 스펙트럼 분석법에 의해 결과를 모니터링함과 동시에 유사한 구조를 갖는 약물을 분석할 수도 있다. 모화합물의 생물전환을 위한 두번째 방법은 생물전환 시스템으로서 간세포와 같은 배양 세포, 조직 슬라이스, 또는 장기 전체를 사용하여야 한다. 세번째 방법으로는 포유동물의 세포로부터 준비한 마이크로좀을 이용하는 것을 들 수 있다. 이러한 접근법은 동물의 신체 분리물을 이용하므로, 대사산물이 예기치 않게 오염될 수 있는 위험이 있다. 이러한 방법은 1종 이상의 대사산물이 대량으로 요구되는 경우에는 대규모화하기도 어렵다. 뿐만 아니라, 미생물을 이용하여 모화합물을 대사산물로 전환시키는 생물전환법도 이용될 수 있다.

생체이물질(xenobiotic agent)이 고도로 친지성이거나, 또는 대규모 발효법에 사용되는 수성 매질에 대해 고도로 불용성일 경우에는, 대사산물을 대량 생산하는 것이 특히 어려울 수 있다. 따라서, 불용성 생체이물질의 대사산물을 대량으로 효과적으로 생산하는 방법이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 미생물을 이용하여 생체전환에 의해 생체이물질 화합물의 대사산물을 생산하는 방법을 제공한다. 생체이물질 화합물은 계면활성제와의 혼합물 상태로 미생물에게 전달되어진다. 이 방법은 예컨대, 반응기에서의 생물전환에 의해, 대사산물 을 대량으로 생산할 수 있도록 대규모화시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 대사산물은 예컨대, 항체 생산에 사용되거나, 치료제 투여량 감시법에서의 표준 또는 약학적 응용 분야에 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 한가지 측면은 다음의 단계, 즉:

(a) 생체이물질 화합물과 계면활성제와의 혼합물을 제공하는 단계;

(b) 상기 혼합물을 미생물 배양체에 첨가하는 단계; 및

(c) 대사산물이 생성되는데 충분한 기간 동안 상기 배양체를 인큐베이션시키는 단계를 포함하여 이루어지는, 생체이물질 화합물의 대사산물을 1종 이상 생산하는 방법을 제공하는 것이다:

혼합물에는 생체이물질 화합물, 용매 및 계면활성제가 포함될 수 있다.

생체이물질 화합물에 적합한 용매라면 어떠한 것이든 사용가능하다. 예컨대, 용매로서 에탄올과 같은 알코올을 사용할 수 있다. 용매는 복수종일 수 있다. 어떤 구체예에서는 용매에 알코올과 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 모두 포함된다.

미생물은 생체이물질 화합물을 대사시킬 수 있는 여하한 미생물일 수 있으며, 바람직하게는 그 생체이물질 화합물에 대한 대사 경로가 사람의 대사 경로와 동일한 미생물이 바람직하다. 특정 구체예에서, 미생물은 악티노플라네스종(Actinoplanes sp.), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 세토니이(Streptomyces setonii) 및 사카로폴리스포라 에리트라에( Saccharopolyspora erythraea)로 구성된 군 중에서 선택될 수 있다. 또는 커닝햄 엘라에치눌라타(Cunningham ellaechinulata), 네로스포라 크라싸(Nerospora crassa), 또는 악티노플라네스종 (Actinoplanes sp) 중에서 미생물을 선택할 수도 있다.

계면활성제는 현재 지식 수준에 기초해서 당업자가 선택할 수 있는 것이면 어느 것이든 무방하다. 예컨대, 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 400, 카스터유, 이소프로필 미리스테이트, 글리세린, 크레모포어

(폴리옥실 카스터유), 라브라솔

(카프릴카프로일 마크로골글리세라이드) 및 트윈

40으로 구성된 군중에서 선택될 수 있다.

생체이물질 화합물은 수용액에서의 용해도가 낮은 화합물인 것이 바람직하다. 몇몇 구체예에서, 생체이물질 화합물은 면역억제제와 항균 화합물, 바람직하게는 사이클로스포린 화합물, 더욱 바람직하게는 ISA247 또는 사이클로스포린 A로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 좋다. 대사산물은 바람직하게는 Ml-d-1, IMl-d-2, IMl-d-3, IMl-d-4, Ml-c-1, IMl-c-2, IMl-e-1, IMl-e-2, IMl-e-3, IM9, IM4, IM4n, IM6, M46, M69, 및 IM49로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 좋다.

본 발명의 방법은 필요에 따라 배양체로부터 대사산물을 분리시키는 단계를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 a) 대사될 화합물의 구조를 공지의 효소 활성과 비교하는 단계; b) 공지 효소 활성을 발현하는 효소를 동정하는 단계; c) 동정된 효소를 발현하는 미생물을 동정하는 단계; 및 d) 동정된 효소를 발현하는 미생물을 생물전환 시스템에서 사용하여 그 화합물의 대사산물을 만드는 단계를 포함하여 이루어지는, 생물전환 시스템에 사용하는데 적합한 미생물의 동정 방법을 제공한다. 특정 구체예에서는 여러가지 미생물의 게놈 서열을 이미 동정된 효소의 서열과 비교하여 그 효소를 발현시키는 미생물을 1종 이상 동정하는 방법에 의해 미생물을 동정하기도 한다.

본 발명의 한가지 이상의 구체예의 상세를 첨부된 도면과 상세한 설명을 통해 설명하기로 한다. 본 발명의 그 밖의 특징, 목적 및 장점은 이하의 설명과 도면 및 특허청구범위로부터 명백히 이해될 것이다.

본 발명은 미생물을 이용하는 생물전환에 의하여 생체이물질 화합물의 대사산물을 생산하는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로는, 생체이물질 화합물을 계면활성제와의 혼합물로 하여 미생물에 전달한다. 본 발명의 방법을 대규모화시켜 예컨대, 반응기내에서 생물전환에 의해 대사산물을 대량으로 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 대사산물은 에컨대, 항체 생산, 치료제 투여량 감시법에서의 표준 또는 약학적 응용 분야에 이용될 수 있다.

약학적으로 활성이 있는 많은 화합물들은 수용액에 대한 용해도가 저조하다. 예를 들어, 사이클로스포린과 다른 어떤 면역억제제 (라파마이신, 아자티오프린, 미조리바인 및 FK506(타크롤리머스))는 수성 환경에 대해 매우 저조한 용해도를 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 테스트 화합물로서 사이클로스포린 유도체 IS A247을 이용하여, 용해도가 저조한 화합물들의 대사산물을 제조하는데 있어서 미생물 발효법이 성공적으로 이용될 수 있음을 발견하였다. 본 발명을 보다 상세히 설명하기에 앞서, 달리 언급하지 않는 한 본 발명에서 사용된 용어들은 다음과 같은 정의를 갖는 것임을 밝혀둔다.

정의

본 명세서에서 "생물전환"이라는 용어는 살아있는 세포, 특히 미생물 세포에 의해 화합물을 대사되는 과정을 가리키는 것이다.

"생체이물질 화합물(xenobiotic compound)" 또는 "생체이물질(xenobiotic)"이라 함은 어떤 미생물에 있어서 천연적인 것이 아닌 화합물을 가리킨다. 생체이물질 화합물은 약학적으로 활성적인 것일 수 있다. 본 발명의 생체이물질 화합물은 물에 쉽게 용해되지 않는 것이 바람직하다. 예컨대, 본 발명의 화합물의 물에 대한 용해도는 25℃에서 1 mg/ml 이하, 0.75 mg/ml 이하, 0.5 mg/ml 이하, 0.25 mg/ml 이하, 0.1 mg/ml 이하, 0.08 mg/ml 이하, 0.06 mg/ml 이하, 0.04 mg/ml 이하, 또는 0.02 mg/ml 이하일 수 있다.

"사이클로스포린 화합물"은 사이클로스포린이나 또는 면역억제 활성을 갖는 그의 유도체이다. 이 용어에는 자연발생적인 사이클로스포린인 사이클로스포린 A 내지 Z, ISA247, 미국 특허 제 4,108,985호, 4,210,581호 및 4,220,641호에 기재된 바와 같은 합성 및 인공적인 디히드로- 및 이소-사이클로스포린; 미국특허 4,384,996호; 4,703,033호; 4,764,503호; 4,771,122호; 4,798,823호; 4,885,276호; 5,525,590호; 5,643,870호; 5,767,069호에 개시된 바와 같은 유도형 사이클로스포린; 및 WO02069902; WO03033010; WO03030834; 및 WO04050687에 개시된 바와 같은 사이클로스포린 유도체 화합물이 모두 포함된다.

ISA247 및 그의 대사산물

ISA247(ISATX247 또는 ISA) 및 그의 ISA 관련 집단 구성원이 미국특허 6,613,739호 및 6,605,593호에 도시되어 있다. 사이클로스포린 A와 마찬가지로, ISA247은 거의 모두가 소수성 아미노산으로 구성된 사이클릭 운데카펩타이드이다. 이들 아미노산의 대다수는 대개 포유동물의 단백질에서는 발견되지 않는다. 도 1은 ISA247 및 이 분자의 사이클릭 펩타이드 고리를 갖는 11개의 아미노산 잔기의 구조를 도시한 것이다. 그림에 나타난 바와 같이, 아미노산 잔기들은 시계방향으로 넘버링되어 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 11-원 아미노산 고리의 아미노산 121개 중 7개의 아미노산은 N-메틸화되어 있다. 나머지 4개의 양자화된 질소 원자들은 카르보닐기와 함께 분자간 수소 결합을 형성할 수 있는데, 이는 CsA와 ISA247 두가지 모두의 사이클로스포린 골격의 경직성의 실질적 원인이 된다. CsA의 용해도는 25℃에서 약 0.04 mg/ml이다. 이처럼 수용성이 낮기 때문에, 사이클로스포린 A의 생체이용성은 인간에게 경구 투여시 30% 이하인 것으로 알려져 있다. ISA247은 이와 유사하게 낮은 수용성을 갖는다.

ISA247은 사르코신 잔기 (이것의 3문자 약자는 Sar이다; 사르코신은 메틸화된 글라이신 잔기로서 MeGly라고도 약칭된다), D- 및 L-알라닌(Ala) 잔기 하나씩, α-아미노 부티르산 잔기 (Abu), 발린(Val) 잔기, N-메틸 발린 (MeVal) 잔기, 4개의 N-메틸 류신(MeLeu) 잔기, 및 알켄-함유 9-탄소, (4R)-4-β-히드록실화된 아미노산 (4R)-4-[(E)-2-부테닐]-4,N-디메틸-L-트레오닌(MeBmt)로 칭해지는 사이클로스포린에 특이적인 β-히드록실화 아미노산을 함유한다. ISA247의 화학적 명칭은 사이클로{{(E)- 및 (Z)-(2S,3R,4R)-3-히드록시-4-메틸-2-(메틸아미노)-6,8-노노디에노일}-L-2-아미노부티릴-N-메틸-글리실-N-메틸-L-류실-L-발릴-N-메틸-L-류실-L-알라닐-D-알라닐-N-메틸-L-류실-N-메틸-L-류실-N-메틸-L-발릴}이다. 이 화합물의 실험식은 C63H11 INl 1O12.I이다. 이 화합물의 분자량은 약 1214.85이다.

ISA247은 두가지 이성질체 형태, 즉 시스-ISA247 (또는 Z-ISA247)와 트랜스-ISA247 (또는 E-ISA247)로 존재하는 것으로 알려져 있다. 도 2A 및 2B는 ISA247의 트랜스 및 시스 형태를 도시한 것이다. ISA247 화합물의 시스형과 트랜스형의 혼합물은 CsA에 비해 독성은 낮으면서 효능은 더 강한 것으로 밝혀진 바 있다 (미국특허6,605,593호 및 6,613,739호 참조). 또한, ISA247는 트랜스 이성질체를 더 많은 비율로 하여 트랜스형과 시스형과의 혼합물 형태로 할 경우 이 혼합물은 CsA보다 독성이 더 낮고 효능이 더 높은 것으로 밝혀졌다. ISA247라고 칭할 때, 당업자들에게는 ISA247은 시스 이성질체와 트랜스 이성질체의 혼합물로 이해되며, 이 혼합물은 이 화합물의 트랜스 이성질체형이 더 풍부하게 함유된 혼합물로서 이해된다. 이 이성질체 화합물은 1:99의 시스:트랜스 비율부터 99:1의 시스:트랜스의 비율의 혼합물로서 존재할 수 있다.

ISA247 대사산물은 다음과 같이 설명할 수 있다. 화학식 1의 화합물:

식 중, R¹은

중에서 선택되고,

R²는 CH₃ 및 H 중에서 선택되며; R³는 CH₂CH(CH₃)₂ 및 CH₂C(CH₃)₂OH 중에서 선택되고; R⁴는 CH(CH₃)₂및 C(CH₃)₂OH 중에서 선택된다.

ISA247 화합물의 아미노산-1이 변형된 ISA247 대사산물의 구조를 다음 표 1에 나타내었다. 아래의 박스들은 변형된 아미노산-1과 함께 사이클로스포린 구조의 고리 부분을 형성하는 아미노산 2-11을 나타낸다. 도 1 참조. 표 1은 아미노산-1이 변형된 ISA247 대사산물의 유일한 리스트는 아니다. 예컨대, 아미노산 1의 대사산물은 5, 6, 7 또는 8원 고리를 포함할 수도 있다.

ISA247 대사산물에는 예컨대 IM4n (또는 ISA247 Metabolite, N-demethylation at amino acid-4; 즉 아미노산-4에서 N-탈메틸화된 ISA247 대사산물)과 같이, 아미노산의 아미드 결합의 메틸화 질소 1개 이상에서 N-탈메틸화가 일어난 N-탈메틸화 대사산물이 포함된다. N-탈메틸화는 아미노산-3 (IM3n), 아미노산-4 (IM4n), 아미노산-6 (IM6n), 아미노산-9 (IM9n), 아미노산- 10 (IMlOn) 또는 아미노산-11 (IMl In)에서 일어날 수 있다. ISA247 대사산물은 또한 예컨대 아미노산 4, 6, 9, 또는 10 (IM4, IM6, IM9 또는 IMlO)과 같은 하나 이상의 메틸 류신 아미노산, EH는 발린 잔기 5 (IM5) 또는 메틸 발린 잔기 11 (IM11)에서 히드록실화가 일어나는 히드록실화 대사산물도 포함한다. IM46은 아미노산 4와 아미노산 6 모두에서 히드록실화된 것이다. 이와 마찬가지로 IM49는 아미노산 4와 아미노산 9 모두에서 히드록실화된 것이다. 표 1에 도시된 바와 같이, 아미노산-1에서 N-탈메틸화 또는 히드록실화가 교대로 일어나는 대사산물의 조합 뿐만 아니라 N-탈메틸화와 히드록실화된 대사산물의 조합도 일어날 수 있다. ISA247 대사산물은 또한 ISA247의 히드록실화된 대사산물의 글루쿠로나이드, 설포나이드, 글리코실화 및 포스포릴화된 유도체인 대사산물도 포함한다. 미국특허청에 계류중인 본 출원의 또 다른 출원인 미국특허 호(2005년 12월 19일자 출원, 대리인 사무소 정리번호 16593-009001)에는 ISA247 대사산물과 그의 용도가 개시되어 있다.

ISA247 대사산물을 제조하는 방법

ISA247의 대사산물은 처음 시스:트랜스 ISA247를 50:50의 비율로 함유하는 혼합물을 투여받은 인간 대상자의 전혈(whole blood)을 이용하여 분석되었다 (실시예 1). 도 3은 이 대상자의 전혈로부터 분리된 대사산물의 대사산물 프로파일을 도시한 HPLC 스캔도이다. 인간 전혈에 대한 유기 추출을 이용하여, 대사산물을 추출하고, 건조한 다음 메탄올에서 재조성하고 크로마토그래피 기술과 질량 분광광도 분석법의 결합에 의해 동정하였다. 도 3에 도시된 바와같이, 사람의 전혈에서는 적어도 3종의 디올, 2종의 히드록실화 및 3종의 N-탈메틸화된 대사산물을 검출할 수 있었다.

개의 간의 마이크로좀 준비물을 이용하여서도 ISA247 대사산물을 제조하였다 (실시예 2). ISA247 대사산물은 이러한 방식으로 제조할 수 있긴 하지만 수율이 낮고 비용은 많이 든다. 따라서, 이러한 접근법은 ISA247 대사산물을 유의적인 양으로 얻기 위한 실질적인 방법은 아니다.

본 발명자들이 아는 한, 본 발명 전의 종래의 생물전환법으로는 ISA247 및 CsA의 대사산물을 실질적으로 생산하였다는 보고가 없었으며, 이는 아마도 이들 화합물의 친지질적 특성 때문인 듯 하다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 ISA247와 같은 소수성 화합물이, 생성물인 대사산물을 배양 및 처리하기 위해 사용되는 필터, 컬럼 및 기타 하드웨어의 표면에 들러붙는 경향이 문제가 된다고 믿고 있다. 또한, 이와 같이 친지질성이 높은 화합물들은 배양시 미생물의 수성 환경에서 용액으로 되지 않는다. 배양된 미생물은 이들을 대사시키기 위해 이들 친지질성 화합물에 접근할 수 없을 것이다. 어떤 측면에서는, 미생물 성장 프레퍼레이션에 약물을 제공하는 것은 포유동물에게 약물을 제공하는 것과 다르지 않다. 약물의 생체이용성을 증가시키는 포뮬레이션이 필요할 수 있다.

사람에 있어서, 시토크롬 P450 효소는 CsA로부터 대사산물을 형성하는 것으로 알려져 있다. 시토크롬 P450 효소 역시 ISA247 대사산물을 형성하는 것으로 알려져 왔다. 특히, 시토크롬 P450 효소 CYP3A4는 사이클로스포린과 ISA247 대사에 책임이 있는 효소인 것으로 동정된 바 있다. 사람으로부터 얻어진 것과 유사한 대사 프로파일을 생산하기 위해서는, 생물전환 시스템은 미생물의 활발한 성장과 대사에 적합한 미디움 및 언더 배양 조건하에서 성장된, 사람의 시토크롬 P450 효소의 미생물적인 등가를 갖는 미생물을 이용하여야만 한다.

생물전환법이 스미스 등의 문헌에 예시되어 있다 (Arch. Biochem. Biophys. (1974) 161: 551-558). 울라커와 슈미트(Curr Opin Biotechnol. (2002) 13(6):557-64)는 원핵생물 P450 모노옥시게나제 효소를 이용하여 생물전환을 수행할 수 있다고 제안하고 있다. 베니세티와 씨디 (Current Pharmaceutical Biotechnology (2003) 4(3):153-167)는 새로운 약물을 찾기 위해 천연 약물에 미생물을 응용하는 것을 제안한 바 있다.

미국특허 6,255,100호에는 세베키아 베니하나(Sebekia benihana)를 이용하여 메탄올에 용해된 사이클로스포린 A를 [γ-히드록시-MeLeu]⁴-사이클로스포린(AM4) 및 [γ-히드록시-MeLeu]⁴-[γ-히드록시-MeLeu]⁶사이클로스포린(AM46)으로 생물전환시키는 것이 개시되어 있다. 그러나, CsA를 사람에게 투여할 경우, 생산되어 TDM에 대해 감시되는 대부분의 대사산물은 Am1 (아미노산-1에서 히드록실화된 CsA의 대사산물, MeBmt), Am9 (아미노산 위치 9의 MeLeu에서 히드록실화되는 대사산물) 및 Am4n (아미노산 위치 4의 MeLeu에서 탈메틸화되는 CsA의 대사산물)이라는 것을 명심하여야 한다 (LeGatt 외, Clin BIochem. (1994) 27(1)"43-8). 따라서, 세베키아 베니하나(Sebekia benihana)는 CsA의 포유동물의 대사 프로파일을 모방하는 대사 프로파일은 제공하지 못하는 미생물의 예이다.

본 발명자들은 ISA247의 대사산물을 생산하는데 생물전환법을 이용할 수 있음을 입증하였다. 실시예 3에 설명된 바와 같이, ISA247 및 계면활성제인 트윈® 40(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트)를 함유하는 혼합물을 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea)에 전달함으로써, 사람의 혈액 중에서 발견되는 주요 카테고리의 ISA247 대사산물들이 생산되었다. 특히, 7종의 ISA247 대사산물이 검출되었다: IM4n (아미노산-4에서 N-탈메틸화된 ISA247 대사산물), IM9 (아미노산-9에서 히드록실화된 ISA247), IM4 (아미노산-4에서 히드록실화된 ISA247 대사산물), IMl-c-l(표 1 참조), IMl-d-1 (표 1), IMl-d-2 (표 1) 및 IMl-d-3 (표 1). 서로 다른 미생물들은 다양한 종류의 ISA247 대사산물을 여러가지 수와 양으로 생산하며, 그 생산은 배지를 변화시킴으로써 최적화시킬 수 있다 (실시예 5). 뿐만 아니라, 주어진 미생물에 대해, 서로 다른 계면활성제나 용매를 사용함으로써 대사산물의 생산량을 증가시키거나 생산 프로파일을 개선시킬 수 있다. 예컨대, PEG 400과 글리세롤은 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea)를 사용한 경우 대사산물의 생산량을 증가시킨 반면, 트윈® 40은 뷰바리아 하시아나 (Beauvaria hassiana)에 의해 생산되는 대사산물의 종류를 현저히 증가시켰다 (실시예 6).

따라서, 본 발명의 한가지 측면은:

(b) 미생물 배양체에 상기 혼합물을 첨가하는 단계; 및

(c) 대사산물이 생성될 때까지 충분한 시간 동안 배양체를 인큐베이션하는 단계를 포함하여 이루어지는, 미생물에서 생체이물질 화합물의 대사산물을 1종 이상 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 필요에 따라 배양체로부터 대사산물을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예는, 전술한 바와 같이 용해도가 낮은 화합물의 대사산물, 특히 사이클로스포린 (예컨대, ISA247 및 CsA), 마크롤라이드 락톤 (예컨대, FK506) 및 트리엔 마크롤라이드 (예컨대, 라파마이신)과 같은 면역억제 화합물의 대사산물을 대량으로 생산하기 위한 생체내 (in vitro) 생물전환 시스템을 제공한다. 적절한 생체이물질 화합물에 대해 이하에서 상세히 논의하기로 한다.

모화합물-계면활성제 혼합물을 성장 배지에 미생물을 함유하는 생체반응 혼합물에 첨가한 후, 일정 시간 동안 모화합물이 대사되도록 하는 조건 하에서 생체반응이 일어나도록 한다. 필요한 시간이 지난 후, 대사산물을 생체반응 혼합물로부터 추출하고, 예컨대 고압 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 질량 스펙트럼 분석 (HPLC-MS)에 의해 분리 정제한다. 개별적인 대사산물이 상호 분리되었는지 및 구조 입증을 위해 핵자기 공명 분석을 이용할 수 있다. 별개의 화학 물질인 것으로 입증된 바 있는 개별적인 대사산물들을 후속적인 분석에서 표준물질로서 이용할 수 있다.

TDM 분석법에는 정제된 대사산물을 이용할 수 있다. 예컨대, 면역억제를 달성하고 이식된 장기의 거부반응을 방지하는데 충분한 투여량으로 ISA247를 장기이식 환자에게 투여할 수 있다. 환자들이 적정 수준의 약물 농도를 유지하도록 하기 위해, 그에 따라 이식된 장기의 거부반응을 방지하는데 적당한 면역억제 수준을 유지하도록 하기 위해, 일정 간격을 두고 환자로부터 혈액 샘플을 채취할 수 있다. ISA247의 혈중 농도를 측정할 수 있다. 나아가, 적어도 1종의 대사산물의 혈중 농도를 모니터링하여 환자의 신체가 약물을 예측가능한 방식으로 대사시키는지를 확인할 수도 있다. 환자 자신의 대사활동이 환자 체내로부터 약물을 소거시키지 못할 경우에는 대사되지 못한 활성 약물의 혈중 농도가 증가되어, 환자의 약물 투여섭생을 변화시켜야 할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 면역분석법이나 HPLC-MS에 의해 정량화할 수 있다. 마찬가지로, ISA247 또는 그의 대사산물에 대한 항체를 만들 수도 있다.

본 발명의 몇몇 구체예에서는 에탄올 중의 ISA247를 글리세롤과 혼합한 다음 사카로폴리스포라 에리트라에(Saccharopolyspora erythraea) (예컨대, ATCC 11635)를 함유하는 생물전환 시스템에 첨가한다. 또 다른 구체예에서는 ISA247를 생물전환 시스템에 첨가하기에 앞서서 에탄올 중의 ISA247를 PEG400와 혼합한다. 또 다른 구체예에서는 ISA247를 생물전환 시스템에 첨가하기에 앞서서 에탄올 중의 ISA247를 카스터유와 혼합한다. 또 다른 구체예에서는 ISA247를 생물전환 시스템에 첨가하기에 앞서서 에탄올 중의 ISA247를 이소프로필 미리스테이트와 혼합한다. 또 다른 구체예에서는 ISA247를 생물전환 시스템에 첨가하기에 앞서서 에탄올 중의 ISA247를 크레모포어

와 혼합한다. 또 다른 구체예에서는 ISA247를 생물전환 시스템에 첨가하기에 앞서서 에탄올 중의 ISA247를 라브라솔

과 혼합한다. 또 다른 구체예에서는, 또 다른 구체예에서는 ISA247를 생물전환 시스템에 첨가하기에 앞서서 에탄올 중의 ISA247를 트윈

과 혼합한다.

생체이물질 화합물의 또 다른 예

수용액에 대한 용해도가 낮은 약물의 또 다른 예로는 다음을 들 수 있다: 진통제/해열제 (예컨대, 아스피린, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 나프록센 나트륨, 부프레노르핀, 프로폭시펜 히드로클로라이드, 프로폭시펜 나프실레이트, 메페리딘 히드로클로라이드, 히드로모르폰 히드로클로라이드, 모르핀, 옥시코돈, 코데인, 디히드로코데인 바이타르트레이트, 펜타조신, 히드로코돈 바이타르트레이트, 레보르파놀, 디플루니살, 트롤아민 살리실레이트, 날부핀 히드로클로라이드, 메페남산, 부토르파놀, 콜린 살리셀레이트, 부탈비탈, 페닐톨록사민 시트레이트, 디펜히드라민 시트레이트, 메토트리메프라진, 신남메드린 히드로클로라이드 및 메프로바메이트); 항천식제 (예컨대, 케토티펜 및 트락사녹스); 항생제 (예를 들어, 네오마이신, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 세팔로스포린, 암피실린, 페니실린, 테트라사이클린 및 시프로플록사신); 항우울제 (예컨대, 네포팜, 옥시페르틴, 독세핀, 아목사핀, 트라조돈, 아미트립틸린, 마프로틸린, 페넬진, 데시프라민, 노르트립틸린, 트라닐시프로민, 플루옥세틴, 독세핀, 이미프라민, 이미프라민 파모에이트, 이소카르복사지드, 트리미프라민, 및 프로트립틸린); 항당뇨병 제제 (예컨대, 바이구아나이드 및 설포닐우레아 유도체); 항진균제 (예컨대, 그리세오풀빈, 케토코나졸, 이트라코니졸, 암포테리신 B, 니스타틴 및 칸디시딘); 항고혈압제 (예컨대, 프로파놀롤, 프로파페논, 옥시프레놀롤, 니페디핀, 레세르핀, 트리메타판, 페녹시벤자민, 파르길린 히드로클로라이드, 데세르피딘, 디아족사이드, 구아네티딘 모노설페이트, 미녹시딜, 레신나민, 나트륨 니트로프루사이드, 라월피아 세르펜티나, 알세록실론, 및 펜톨아민); 항염제 (예컨대, (비스테로이드계) 인도메타신, 케토프로펜, 플루비프로펜, 나프록센, 이부프로펜, 라미페나존, 피록시캄, (스테로이드계) 코르티손, 덱사메타손, 플루자코트, 셀레콕시브, 로페콕시브, 히드로코르티손, 프레드니솔론, 및 프레드니손); 항신생조직제 (예컨대, 시클로포르파미드, 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 카르보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸 CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 캄토테신 및 그의 유도체, 페네스테린, 파클리탁셀 및 그의 유도체, 도세탁셀 및 그의 유도체, 빈블라스틴, 븐크리스틴, 나콕시펜 및 피포설판); 항불안제 (예컨대, 로라제팜, 프라제팜, 클로르디아제폭사이드, 옥사제팜, 클로라제페이트 이칼륨, 디아제팜, 히드록시진 파모에이트, 피드록시진 히드로클로라이드, 알프라졸람, 드로페리돌, 할라제팜, 클로르메자논 및 단트롤렌); 항편두통제 (예컨대, 에르고타민, 프로파놀롤, 이소메테프텐 뮤케이트, 및 디클로랄페나존); 진정제/수면제 (예컨대, 펜토바르비탈, 펜토바르비탄 및 세코바르비탈과 같은 바르비튜레이트; 및 벤조디아제핀, 예컨대 플루라제팜 히드로클로라이드, 트리아졸람 및 미다졸람); 항협심증제 (예컨대, 베타-아드레날린 차단제; 딜티아젬 및 니페디핀과 같은 칼슘 채널 차단제; 니트로글리세린, 이소소르비드 디니트레이트, 펜타에리트리톨 테트라니트레이트 및 에리트리틸 테트라니트레이트와 같은 니트레이트); 정신병 치료제 (에컨대, 할로헤리돌, 록사핀 석시네이트, 록사핀 히드로클로라이드, 티오리다진, 티오리다진 히드로클로라이드, 티오틱센, 플루페나진, 플루페나진 데카노에이트, 플루페나진 에난테이트, 트리플루오페라진, 클로르프로마진, 페르페나진, 리튬 시트레이트 및 프로클로르페라진); 항부정맥제 (예컨대, 프레틸륜 토실레이트, 에스몰롤, 베라파밀, 아미도다론, 엔카이니드, 디곡신, 디지톡신, 멕실레틴, 디소피라미드 포스페이트, 프로카인아미드, 퀴니딘 설페이트, 퀴니딘 글루코네이트, 퀴니딘 폴리갈락튜로네이트, 플레카이니드 아세테이트, 토카이니드 및 리도카인); 항관절염제 (예컨대, 페닐부타존, 술린닥, 페니실아민, 살사레이트, 피록시캄, 아자티오프린, 인도메타신, 메클로페나메이트, 골드 나트륨 티오말레이트, 케토프로펜, 오라노핀, 오로티오글루코스, 및 톨메틴 나트륨); 항통풍제 (예컨대, 콜히친, 및 알로퓨리놀); 항응고제 (예컨대, 헤파린, 헤파린 나트륨 및 와파린 나트륨); 혈전용해제 (예컨대, 우로키나제, 스트렙토키나제 및 알테플라제); 항섬유소용해제 (예컨대, 아미노카프르산); 헤모레올로지 제제 (예컨대, 펜톡시필린); 항혈소판제제 (예컨대, 아스피린); 항경련제 (예컨대, 발프르산, 디발프로엑스 나트륨, 페니토인, 페니토인 나트륨, 클로나제팜, 프리미돈, 페노바르비톨, 카르바마제핀, 아모바르비탈 나트륨, 메트석시미드, 메타르비탈, 메포바르비탈, 메페니토인, 펜숙시미드, 파라메타디온, 에토토인, 페나세미드, 세코바르비톨 나트륨, 클로라제페이트 이칼륨 및 트리메타디온); 항파킨슨 제제 (예컨대, 에토숙시미드); 항히스타민제/가려움방지약 (예컨대, 히드록시진, 디펜히드라민, 클로르페니라민, 브롬페니라민 말리에이트, 시프로헵타딘 히드로클로라이드, 테르페나딘, 클레마스틴 푸마레이트, 트리프롤리딘, 카르비녹사민, 디페닐피랄린, 페닌다민, 아자타딘, 트리펠렌나민, 덱스클로르페니라민 말리에이트, 메트딜라진, 및); 항균제 (예컨대, 아미카신 설페이트, 아즈트레남, 클로람페니콜, 클로람페니콜 팔미테이트, 시프로플록사신, 클린다마이신, 클린다마이신 팔미테이트, 클린다마이신 포스페이트, 메트로니다졸, 메트로니다졸 히드로클로라이드, 겐타마이신 설페이트, 린코마이신 히드로클로라이드, 토브라마이신 설페이트, 반코마이신 히드로클로라이드, 폴리믹신 B 설페이트, 콜리스티메테이트 나트륨 및 콜리스틴 설페이트); 항바이러스제 (예컨대, 인터페론 알파, 베타 또는 감마, 지도부딘, 아만타딘 히드로클로라이드, 리바비린 및 아시클로버); 항미생물제 (예컨대, 세팔로스포린, 예를 들어 세파졸린 나트륨, 세프라딘, 세파클로, 세파피린 나트륨, 세프티족심 나트륨, 세포페라존 나트륨, 세포테탄 이나트륨, 세퓨록심 아조틸, 세포탁심 나트륨, 세파드록실 모노히드레이트, 세팔렉신, 세팔로틴 나트륨, 세팔렉신 히드로클로라이드 모노히드레이트, 세파만돌 나페이트, 세폭시틴 나트륨, 세포니시드 나트륨, 세포라니드, 세파드록실, 세프라딘 및 세프록심 나트륨; 페니실린류, 예컨대 암피실린, 아목시실린, 페니실린 G 벤자틴, 시클라실린, 암피실린 나트륨, 페니실린 G 칼륨, 페니실린 칼륨, 피페라실린 나트륨, 옥사실린 나트륨, 바캄피실린 히드로클로라이드, 클록사실린 나트륨, 티카실린 이나트륨, 아즐로실린 나트륨, 카르베니실린 인다닐 나트륨, 페니실린 G 프로카인, 메티실린 나트륨 및 타프실린 나트륨; 에리트로마이신류, 예컨대 에리트로마이신 에틸석시네이트, 에리트로마이신, 에리트로마이신 에스톨레이트, 에리트로마이신 락토바이오네이트, 에리트로마이신 스테아레이트, 및 에리트로마이신 에틸석시네이트; 및 테트라사이클린류, 예컨대 테트라사이클린 히드로클로라이드, 독시시클린 하이클레이트, 및 미노사이클린 히드로클로라이드, 아지트로마이신, 클라리트로마이신); 항염제 (예컨대, GM-CSF); 기관지확장제 (예컨대, 심파토미메틱, 예를 들어 에피네프린 히드로클로라이드, 메타프로테레놀 설페이트, 터부탈린 설페이트, 이소에타린, 이소에타린 메실레이트, 이소에타린 히드로클로라이드, 비톨테롤메실레이트, 이소프로테레놀 히드로클로라이드, 테르부탈린 설페이트, 에피네프린 바이타르트레이트, 메타프로테레놀 설페이트, 에피네프린 및 에피네프린 바이타르트레이트;

이프라트로피움 브로마이드와 같은 항콜린제; 잔틴류, 예컨대 아미노필린, 다이필린, 메타프로테레놀 설페이트 및 아미노필린; 예컨대 크로몰린 나트륨과 같은 비만세포 안정화제; 스테로이드계 화합물 및 호르몬류 (예컨대, 다나졸, 테스토스테론 시피오네이트, 플루옥시메스테론, 에틸테스토스테론, 테스토스테론 에나테이트, 메틸테스토스테론, 플루옥시메스테론 및 테스토스테론 시피오네이트와 같은 안드로겐류; 에스트라디올, 에스트로피페이트, 및 공액 에스트로겐과 같은 에스트로겐류; 메톡시프로게스테론 아세테이트, 및 노르에틴드론 아세테이트와 같은 프로게스테론; 코리트코스테로이드류, 예컨대 트리암시놀론, 베타메타손, 베타메타손 나트륨 포스페이트, 덱사메타손, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, 덱사메타손 아세테이트 프레드니손, 메틸프레드니솔론 아세테이트 현탁액, 트리암시놀론 아세토나이드, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 나트륨 포스페이트, 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트, 히드로코르티손 나트륨 숙시네이트, 트리암시놀론 헥사세토나이드, 히드로코르티손, 히드로코르티손 시피오네이트, 프레드니솔론, 플루드로코르티손 아세테이트, 파라메타손 아세테이트, 프레드니솔론 테뷰테이트, 프레드니솔론 아세테이트, 프레드니솔론 나트륨 포스페이트 및 히드로코르티손 나트륨 숙시네이트; 및 레보티록신 나트륨과 같은 갑상선 호르몬류); 혈당강하제 (예컨대, 글리부리드, 클로르포르파미드, 톨부타미드 및 톨라자미드); 저지혈증제 (예컨대, 클로피브레이트, 덱스트로티록신 나트륨, 프로부콜, 프라바스티틴, 아토르바스타틴, 로바스타틴 및 나이아신); 항궤양제/항역류제 (예컨대, 파모티딘, 시메티딘 및 라니티딘 히드로클로라이드); 멀미약/항구토제 (예컨대, 메클리진 히드로클로라이드, 나빌론, 프로클로르페라진, 디멘히드리네이트, 프로메타진 히드로클로라이드, 티에틸페라진 및 스코폴아민); 및 지용성 비타민류. 이들과 같이 용해도가 낮은 대사산물은 본 발명의 방법에 의해 처리될 수 있다.

미생물

모화합물을 대사시킬 수 있는 능력이 있는 시토크롬 P450효소와 같은 미생물 효소의 존재여부를 기초로, 성공적인 생물전환에 적절한 미생물을 선별할 수 있다. 생물전환법에 유용한 미생물로는 시토크롬 P450 활성을 갖는 세균, 진균, 및 방선균을 들 수 있다. 이러한 효소를 갖는 미생물들은 ISA247 투여 후 혈액이나 뇨 중에서 발견되는 대사산물과, 생물전환 또는 미생물적 전환을 통한 제조에 의해 얻어진 대사산물을 비교함으로써 실험적으로 동정할 수 있다. 예컨대, CYP3A4는 테스토스테론을 히드록실화시킴으로써 6β-히드록시테스토스테론을 만들어낼 수 있다는 특징을 갖는 사람의 P450 효소이다. 이 효소는 클로트리마졸 및 나린제닌과 같은 화합물에 의해 저해된다. 이 효소는 카르바마지핀, 페노바르비탈 및 리팜핀에 의해 유도된다. 시토크롬 P450 활성을 갖는 효소를 발현하는, 성장 배지에서 배양중인 미생물은, 배지 중으로 테스토스테론이 도입되면 6β-히드록시테스토스테론을 생산하며, 이러한 생산은 공지의 억제제와 유발제에 의해 영향을 받는다. CYP3A4에 의해 대사되는 다른 기질들로는 예컨대, 아세트아미노펜, 디아제팜, 테로필린, 와르파린, 탁솔 및 니페디핀을 들 수 있다. 마찬가지로, 이들 화합물들이 미생물을 함유하는 배지 내로 도입될 때, 미생물이 그 효소를 발현시키면, 그 기질을 대사시키는 것이다.

공지의 특징화된 효소들이 공지의 특징화된 활성을 갖는다. 대사될 화합물들의 구조를 공지 활성을 갖는 횻와 비교함으로써, 화합물을 대사시키는 활성을 갖는 효소들을 동정해낼 수 있다. 또한 동정된 효소를 갖는 미생물들을 스크리닝할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한가지 측면은 생물전환 시스템에 사용하기에 적합한 미생물을 동정하는 방법을 제공하며, 이 방법은: a) 대사될 화합물의 구조를 공지 효소 활성과 비교하는 단계; b) 원하는 효소 활성을 발현하는 효소를 동정하는 단계; c) 동정된 효소를 발현하는 미생물을 동정하는 단계; 및 d) 동정된 효소를 생물전환 프로세스에서 발현하는 미생물을 이용하여 그 화합물을 대사시키는 단계를 포함하여 이루어진다. 이 방법을 이용함으로써, 어떤 화합물의 대사산물을 생산하는데 유용할 수 있는 미생물을 동정하는 것이 가능하다.

다른 한편으로는, 예컨대 CYP3A4와 같이 시토크롬 효소를 코딩하는 공지의 포유동물 유전자 서열과 어떤 생물의 게놈 서열을 비교함으로써, 잠재적으로 유용한 생물을 동정하는데 있어서 유전 서열 데이터를 이용할 수도 있다. 적절한 조건에서 배양된, 적절한 유전자 서열을 갖는 미생물은 표적 효소를 발현한다. 레퍼런스 화합물에 더해서, 특정한 사람 P450 효소를 저해하거나 유발하는 화합물들을 양 시스템 모두에서 테스트할 수 있다.

특이적인 시토크롬 효소에 의해 대사되는 것으로 알려진 약물로는: (1) CYP1A2에 의해 분해된 아세트아미노펜, 방향족 아민, 카페인, 에스트라디올, 이미프라민, 펜아세틴, 테오필린 및 와파린; (2) CYP2D6에 의해 분해된아미트립틸린, 부푸롤롤, 캅트로필, 클로제핀, 데스리소퓨인, 플레카이니드, 플루옥세틴, 할로페리돌, 메토프롤롤, 멕실레틴, 스파트테인, 티몰롤, 토목세틴, 프로프라놀롤 및 코데인; (3) CYP3A4에 의해 분해된 아세트아미노펜, 디아제팜, 아미오다론, 벤즈페타민, 카르메자핀, 사이클로스포린, 디지톡신, 딜티아젬, 에리트로마이신, 에토포사이드, 플루타미드, 이미프라민, 리도카인, 로라티딘, 니페디핀, 미다졸람, 레틴산, 스테로이드, 타복시펜, 탁솔, 테르페나딘, THC, 베라파밀 및 와파린을 들 수 있다.

CYP3A4 효소를 발현하는 미생물들과 생물전환법에 유용한 미생물들의 예로는: 악티노플라네스종 (Actinoplanes sp: 예컨대, ATCC No. 53771), 스트렙토마이세스 글리세우스 (Streptomyces griseus: 예컨대 ATCC 13273), 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea: 예컨대, ATCC No. 11635), 및 스트렙토마이세스 세토니이 (Streptomyces setonii: 예컨대, ATCC No. 39116)를 들 수 있다. 시토크롬 P450 효소를 발현하는 다른 유용한 미생물에는 아미콜라타 오토트로피카 (Amycolata autotrophica ; 예컨대, ATCC No. 35204), 스트렙토마이세스 칼리포니카 (Streptomyces californica; 예컨대, ATCC No. 15436), 사카로폴리스포라 히르수테 (Saccharopolysora hirsute; 예컨대, ATCC No. 20501), 스트렙토마이세스 라반둘라 (Streptomyces lavandulae: 예컨대, ATCC No. 55209), 스트렙토마이세스 오레오파시엔스 (Stretomyces aureofaciens; 예컨대, ATCC No. 10762), 스트렙토마이세스 리모수스 (Streptomyces rimosus; 예컨대, ATCC No. 28893), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtillis; 예컨대, ATCC No. 55060), 및 노카디아 아스테로이드 (Nocardia asteroids: 예컨대, ATCC No. 3318), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae; 예컨대, ATCC No. 20137 또는 ATCC No. 64667), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans; 예컨대., ATCC No. 32353) 심닝하멜라 에치눌라타 변종 엘레강스 (Cimninghamella echinulata var . elegans; 예컨대, ATCC No.36112), 리조푸스 스톨로니퍼 (Rhizopus stolonifer; 예컨대 ATCC No. 6227b), 칸디다 아피콜라 (Candida apicola; 예컨대., ATCC No. 96134), 코프리누스 시레네우스 (Coprinus cireneus; 예컨대, ATCC No. MYA-727, MYA-726, MYA-728, MYA-729, MYA-730, MYA-731)이 포함된다.

]적절한 배양 기간, 배양 조건, 추출 및 정제법의 선택은 당업자에게 잘 알려져 있다. 선별된 미생물의 배양은 예컨대 탄소 및 질소와 같은 영양소, 완충계, 및 미량 원소를 함유하는 적절한 성장 배지와 적절한 pH, 온도 및 배양에 도움이 되는 통기 조건을 이용함으로써 당업자에 의해 달성될 수 있다. 탄소원의 예로는 글루코스, 말토스, 덱스트린, 전분, 락토스, 수크로스, 당밀, 대두유 등을 들 수 있다. 적절한 질소원으로는 대두밀, 면실유, 어유, 효모, 효모 추출물, 펩톤, 쌀겨, 고기 추출물, 암모늄 니트레이트, 암모늄 설페이트 등을 들 수 있다. 포스페이트, 염화나트륨, 탄산칼슘 등과 같은 무기염류도 첨가할 수 있다. 미생물의 성장 단계에 따라 다른 성장 배지를 이용할 수도 있다.

사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea: 예컨대, ATCC 11635), 사카로폴리스포라 히르수테 (Saccharopolyspora hirsute; 예컨대 ATCC 20501), 아미콜라타 오토트로피카 (Amycolota autotrophica; 예컨대, ATCC 35204)에 의해, 사이클로스포린 및 사이클로스포린 유도체의 바이오전환에 사용하는데 적절한 미생물의 성장을 위한 예시적인 조건 및 배지는 Corconan, Methods in Enzymology 43: 487-498 (1975), 미국특허 5,124,258; 6,043,064호; 및 6,331,622호에 설명되어 있다. 악티노플라네스종 (예컨대 ATCC No. 53771)의 배양 조건은 미국특허 5,270,187호에 설명되어 있다.

미생물에 의하여 마크롤라이드를 그의 히드록실화 및/또는 탈메틸화 대사산물로 바이오전환시키는 배양 조건의 예에는: 1) 미국특허 5,268,370호에 예시된 바와 같이, 악티노마이세테종 (Actinomycete sp.: Merck Culture Collection MA 6474; ATCC No. 53828)을 이용하여 L679,934(FK-506)을 그의 대사산물인 L-683,519로 탈메틸화시키는 방법에 대해 개시된 바와 같은 배양 조건 및 2) 미국특허 5,202,258호에 개시된 바와 같은 배양 조건을 이용하여 악티노플라네스종 (Actinoplanes sp.:ATCC No. 53771)에 의해 L-679,934를 L-682,993으로 또는 L-683,5990을 L-683,742로 탈메틸화시키는 조건이 있다. 악티노플라네스 (Actinoplanes spp . ATCC 53771), 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erthyreae ATCC 11653), 스트렙토마이세스 라반둘라에 (Streptomyces lavandulae ATCC 55209), 스트렙토마이세스 오레오파시엔스 (Stretomyces aureofaciens ATCC 10762), 스트렙토마이세스 리모수스 (Streptomyces rimosus ATCC 28893), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtillis ATCC 55060) 및 노카르디아 아스테로이드 (Nocardia asteroids ATCC 3318)를 이용하여 라파마이신의 히드록실화 대사산물 (예컨대 24-OH 라파마이신) 및/또는 탈메틸화 대사산물 (예컨대, 39-O-탈메틸라파마이신)을 제조할 수 있다 (Kuhnt, M. 외, 1997, Enzyme and Microbial Technology 21: 405-412).

계면활성제

본 발명의 방법의 구체예에 사용하는데 적합한 계면활성제는 미생물 성장 환경에 도입되기에 앞서 오토클라브 처리를 견뎌낼 수 있는 것들이다. 적절한 계면활성제는 생체적합한 계면활성제들로서 PEG 300, PEG 400, PEG 600 (BASF사의 Lutrol® E 300, Lutrol® E 400, Lutrol® E 600, Lutrol® F 127 및 Lutrol® F 68로도 알려져 있음); 라브라솔과 같은 카프릴로카프로일 마크로골-8 글리세라이드 (프랑스 세덱스 소재 Gatte Fosse); 트윈

20, 트윈

21, 트윈

40, 트윈

80, 트윈

80K, 트윈

81 및 트윈

85과 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (뉴저지 브릿지워터 소재 ICI Americas Inc., 위스콘신 밀워키 소재 Aldrich Chemical Company Inc.로부터 구득); 글리세린 (온타리오 토론토 소재BDH Fine Chemicals); 카스터유 (온타리오 런던 소재 Wiler Fine Chemicals Ltd); 이소프로필 미리스테이트 (온타리오 런던 소재 Wiler Fine Chemicals Ltd, London Ont.); 크레모포어

EL (미주리 세인트루이스 소재 Sigma Chemical, St Louis MO); 및 플루로닉스

F127 및 플루로닉스

L108 (BASF)과 같은 폴록사머와 같은 비이온계 계면활성제를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 그 밖에 사용가능한 계면활성제로는 윤활제나 유화제로 작용할 수 있는 것들, 예컨대 틸록사폴 [포름알데히드와 옥시란과의 4-(l,l,3,3-테트라메틸부틸)페놀 폴리머]; BASF사의 크레모포어

A6, 크레모포어

EL, 크레모포어

ELP, 크레모포어

RH 및 Rhone Poulenc Co의 알카물스 EL620; HCO-40과 같은 폴리에톡실화된 수소첨가 카스터유; 및 폴리에틸렌 9 카스터유를 들 수 있다.

사용가능한 그 밖의 계면활성제로는: 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80; 크레모포어

RH; 폴록사머; 플루오닉스 LlO, L31, L35, L42, L43, L44, L61, L62, L63, L72, L81, LlOl, L121, L122; PEG 20 아몬드 글리세라이드; PEG 20 옥수수 글리세라이드; 등을 들 수 있다. 적절한 계면활성제로는 알킬글루코사이드; 알킬말토사이드; 알킬티오글루코사이드; 라우릴 마크로골 글리세라이드; 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르; 폴리옥시에틸렌 알킬페놀; 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르; 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머; 폴리글리세롤 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 글리세라이드; 폴리옥시에틸렌 스테롤; 폴리옥시에틸렌 식물성유; 폴리옥시에틸렌 수소첨가된 식물성유; 폴리옥시에틸렌 알킬에테르; 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르; 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머; 폴리글리세롤 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 글리세라이드; 폴리옥시에틸렌 식물성유; 폴리옥시에틸렌 수소첨가된 식물성유; PEG-10 라우레이트, PEG-12 라우레이트, PEG-20 라우레이트, PEG-32 라우레이트, PEG-32 디라우레이트, PEG-12 올리에이트, PEG-15 올리에이트, PEG-20 올리에이트, PEG-20 디올리에이트, PEG-32 올리에이트, PEG-200 올리에이트, PEG-400 올리에이트, PEG-15 스테아레이트, PEG-32 디스테아레이트, PEG-40 스테아레이트, PEG-100 스테아레이트, PEG-20 디라우레이트, PEG-25 글리세릴 트리올리에이트, PEG-32 디올리에이트, PEG-20 글리세릴 라우레이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-20 글리세릴 스테아레이트, PEG-20 글리세릴 올리에이트, PEG-30 글리세릴 올리에이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-40 글리세릴 라우레이트, PEG-40 팜커넬유, PEG-50 수소첨가된 카스터유, PEG-40 카스터유, PEG-35 카스터유, PEG-60 카스터유, PEG-40 수소첨가된 카스터유, PEG-60 수소첨가된 카스터유, PEG-60 옥수수유, PEG-6 카프레이트/카프릴레이트 글리세라이드, PEG-8 카프레이트/카프릴레이트 글리세라이드, 폴리글리세릴-10 라우레이트, PEG-30 콜레스테롤, PEG-25 피토 스테롤, PEG-30 대두 스테롤, PEG-20 트리올리에이트, PEG-40 소르비탄 올리에이트, PEG-80 소르비탄 라우레이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, POE-9 라우릴 에테르, POE-23 라우릴 에테르, POE-IO 올레일 에테르 POE-20 올레일 에테르, POE-20 스테아릴 에테르, 토코페릴 PEG-100 숙시네이트, PEG-24 콜레스테롤, 폴리글리세릴-10 올리에이트, 수크로스 모노스테아레이트, 수크로스 모노라우레이트, 수크로스 모노팔미테이트, PEG 10-100 노닐 페놀 시리즈, PEG 15-100 옥틸 페놀 시리즈, 폴록사머; PEG-35 카스터유, PEG-40 수소첨가된 카스터유, PEG-60 옥수수유, PEG-25 글리세릴 트리올리에이트, PEG-6 카프레이트/카프릴레이트 글리세라이드, PEG-8 카프레이트/카프릴레이트 글리세라이드, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 토코페릴 PEG-1000 숙시네이트 및 PEG-24 콜레스테롤, 폴록사머와 같은 폴리올의 반응 혼합물을 들 수 있다. 이에 더해, 아몬드유; 바바수유; 보라지유; 블랙커런트씨유; 카놀라유; 코코넛유; 옥수수유; 면실유; 달맞이꽃유; 포도씨유; 땅콩유; 겨자씨유; 올리브유; 팜유; 팜커널유; 피넛유; 채종유; 홍화유; 참기름; 상어간유; 대두유; 해바라기유; 수소첨가된 카스터유; 수소첨가된 코코넛유; 수소첨가된 팜유; 수소첨가된 대두유; 수소첨가된 식물성유; 수소첨가된 면실유 및 카스터유; 특히 수소첨가된 대두유; 대두유; 글리세릴 트리카프로에이트 트리카프로에이트; 글리세릴 트리카프릴레이트; 글리세릴 트리카프레이트; 글리세릴 트리운데카노에이트; 글리세릴 트리라우레이트; 글리세릴 트리올리에이트; 글리세릴 트리리놀리에이트; 글리세릴 트리리놀리네이트; 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/스테아레이트; 포화된 폴리글리콜화 글리세라이드; 리놀레산 글리세라이드; 카프릴산/카프르산 글리세라이드를 사용할 수 있다. 나아가, 계면활성제 및/또는 오일 및/또는 알코올의 혼합물도 이용가능하다.

본 발명의 몇몇 구체예에서는, 선택된 친지성 생체이물질을, 활발하게 성장중인 미생물 배양체에 첨가하기에 앞서 알칸올 및 적절한 비이온계 계면활성제와 혼합한다. 모화합물을 알코올과 혼합하는 경우, 알코올로서 에탄올을 사용할 수 있다. 기타 적합한 알코올로는 메탄올, 이소프로판올, 1-프로판올 및 기타 기술 분야에 공지인 알코올을 들 수 있다.

용매

본 발명의 몇몇 구체예에서, 생체이물질 화합물을 미생물 배양체에 첨가하기 전에 용매와 혼합시킨다. 이러한 용매는 생체이물질 화합물과 혼합시키기 전에 멸균처리할 수 있다. 필요에 따라, 계면활성제 역시 생체이물질 화합물-용매 혼합물에 첨가하기도 한다. 본 발명에 사용하기에 적절한 용매는 미생물의 성장과 대사를 저해하지 않는 한 어떠한 용매이든 무방하다. 용매는 비극성, 극성 비양성자성 또는 극성 양성자성일 수 있다. 예컨대, 용매로는 벤젠, 톨루엔, n-헥산, 시클로헥산 등과 같은 탄화수소계 용매; 디에틸 에테르, 테트라히드로퓨란, 1,4-디옥산, 메틸 t-부틸 에테르, 디메톡시에탄, 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르 등과 같은 에테르계 용매; 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 이소프로판올 등과 같은 알코올류; 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 1,1,1-트리클로로에탄 등과 같은 할로겐 함유 용매; 및 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 헥사메틸포스포로트리아미드 등과 기타 용매를 들 수 있다 용매는 DMSO가 아닌 것이 바람직하다.

다음의 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것들로서 본 발명의 범위가 어떠한 방식으로든 이에 한정되는 것은 아니다. 비록 다음과 같은 일부 바람직한 구체예를 들어 본 발명을 구체화하고 설명하나, 당업자라면 첨부된 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 정신과 범위를 일탈함이 없이 형식면이나 세부면에서 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다.

도 1은 ISA247의 구조를 도시한 도면이다. ISA247의 아미노산 잔기를 숫자로 표시하였다. 그리스 문자는 아미노산 1의 탄소 위치를 가리킨다.

도 2A 및 2B는 각각 ISA247 분자의 트랜스 (E-) 및 시스(Z-) 이성질체를 가리킨다.

도 3은 시스:트랜스 ISA247의 50:50 혼합물을 투여받은 대상자의 인체 전혈로부터 분리된 ISA247 대사산물의 프로파일을 나타내는 HPLC 스캔이다.

도 4는 실시예4에서 설명된 생물전환법으로부터 분리된 ISA247 대사산물의 프로파일을 도시한 HPLC 스캔이다.

도 5는 생물전환 시스템에 있어서 서로 다른 계면활성들이 ISA247 대사산물 생산에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.

도 6은 주로 ISA247의 트랜스-이성질체를 함유하는 ISA247 포뮬레이션이 주입된 대상자의 인체 전혈로부터 분리된 ISA247 대사산물의 LC-MS 프로파일을 도시한 도면이다.

도 7 및 도 8은 배지 3 및 배지 16이 각각 악티노플라네스 sp (Actinoplanes sp: ATCC 53771) 및 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea: ATCC 11635)에 의한 ISA247 대사산물의 생산에 미치는 영향을 비교한 도면이다.

도 9는 여러가지 용매와 계면활성제가 뷰바리아 바시아나 (Beauvaria bassiana)에 의한 ISA247 대사산물의 생산에 미치는 효과를 입증해준다.

이하의 실시예에서, 다음에 설명된 약어는 다음의 의미를 갖는다. 특별히 정의되지 않은 약어들은 일반적으로 통용되는 의미를 갖는다.

℃ = 섭씨

hr = 시간

min = 분

sec 또는 s = 초

μM = 마이크로몰

mM = 밀리몰

M = 몰

ml = 밀리리터

㎕ = 마이크로리터

mg = 밀리그램

㎍ = 마이크로그램

mol = 몰(mole)

pmol = 피코몰

ATCC = Amerian Type Culture Collection

PBS = 포스페이트 완충 식염수

CSA = 사이클로스포린 A

TDM = 치료약물농도 감시

LC = 액체 크로마토그래피

MS = 질량 분광광도측정

PEG = 폴리에틸렌 글리콜

일반적인 재료 및 방법

액체 크로마토그래피 ( LC ) 조건

액체 크로마토그래피 (LC 또는 HPLC)를 위해, 장쇄 탄화수소기를 다공성 실리카 매트릭스에 화학적으로 결합시켜 형성시킨 정상상을 갖는 컬럼, 즉 Perisorb RP-8 (Upchurch Scientific cat # C-601)로 충전된 가드 컬럼 2 x 20 mm (Upchurch Scientific cat# C-130B)이 구비된 Waters Symmetry C8, 2.1X50 mm 3.5 분석 컬럼 (Waters cat # WAT 200624)을 이용하였다. LC 프로그램에 이용된 용매 백분율과 유속을 다음 표 2에 정리하였다.

시간 (분)	0.2% GAA + 10^-5M Na 아세테이트 (%)	MeOH:MtBE (9:1) (%)	유속 (mL/분)
0.00	55	45	0.5
5.00	45	55	0.5
10.00	5	95	0.5
12.00	5	95	0.5
12.01	55	45	0.5
15.00	55	45	0.5

질량 스펙트럼 ( MS ) 조건

[0064] 질량 분광광도측정을 위해, 어플라이드 바이오시스템즈/MDX 사이엑스 API3000 (Analyst software v.1.2) 기기를 이용하였다. 수행 시간은 15 분, 주입 용량은 5 마이크로리터, 가드 컬럼 온도와 분석 컬럼 온도는 60℃였다. 수동 세팅 방식은 다음과 같았다: 터보 이온 스프레이는 8000이었고, 터보 이온 스프레이 수평 세팅은 포지티브 4였으며, 터보 이온 스프레이 측면 세팅은 1.0이었다. 사이엑스 기기를 표 3에 나타낸 변수로 세팅하였다.

MS 세팅:
스캔 유형:	MRM (복수 반응 모니터링)
극성:	양성
피리어드 기간:	15.00분
피리어드 사이클:	1.32초
사이클 #	692
개선된 MS 세팅:
레절류션 Q1:	낮음
Q3:	낮음
강도 역가:	0
고정 시간:	50 밀리초
포즈 시간:	30 밀리초
변수 세팅:
이온 소스:	터보 이온 스프레이
흡입기 가스:	12
커튼 가스:	8
충돌 가스:	12
이온 스프레이 전압:	5000 V
온도:	550℃
화합물 세팅:
탈클러스터링 전위:	60 V
포커싱 전위:	400 V
충돌 에너지:	90 V

표 4는 이온 및 이온-특이적인 장비의 세팅을 나타낸 것이다.

Q1 질량 (amu)	Q3 질량 (amu)	시간 (밀리초)
1222.8	1098.7	100
1236.8	1112.7	100
1252.8	1128.7	100
1252.8	1224.7	100
1270.8	1112.7	100
1254.8	1130.7	100
1268.8	1128.7	100
1268.8	1144.7	100
1238.8	1114.7	100
1268.8	1240.8	100

실시예 1

전혈로부터 ISA247 대사산물을 제조하는 방법

ISA247 (시스:트랜스 ISA247247의 50:50 혼합물)를 투여한 후 인체에서 전혈을 채혈하였다. 터부틸-메틸-에테르 (또는 메틸 터부틸 에테르, MTBE)를 이용하여 전혈로부터 ISA247와 그의 대사산물을 추출하여 건조시킨 다음 메탄올에 재조성시켰다. MTBE (cat No. 7001-2; Caledon) 2 mL를 혈액 200μL에 첨가하고, 10분간 진탕시킨 다음 진공 농축시켰다. 잔사를 메탄올 200 μL에 재조성시켰다. 담즙과 뇨 추출물 역시 마찬가지로 처리할 수 있으며, 마이크로좀 프레퍼레이션과 생물전환 프레퍼레이션으로부터의 추출도 마찬가지이다. 일단 추출되면, 대사산물을 HPLC-MS, NMR 및 기술 분야에 잘 알려진 기타 기술을 이용하여 특징화할 수 있다. 도 3은 일반 재료 및 방법에 설명된 LC-MS의 결과를 도시한 것이다. 전혈로부터 얻은 ISA247 대사산물은 세가지 주요 그룹으로서 디올, 히드록실화 대사산물 및 탈메틸화 대사산물을 포함한다.

실시예 2

개의 간의 마이크로좀 프레퍼레이션에 의한 ISA247 대사산물의 제조 방법

개의 마이크로좀의 제조

다음과 같은 방식으로 개 간의 마이크로좀을 제조하였다: 간을 적출하여 1.5% 염화칼륨 (KCl)로 헹궈내고; 작은 절편이 되도록 다지고 (약 25 g), 15,000 rpm에서 3 내지 5분간 폴리트론 호모지나이저를 이용하여 차가운 분쇄 완충액 (0.1 M 포스페이트 완충액 pH 7.4; 4℃; 간에 대해 1:1 비율로 완충액을 사용함)에 붕해될 때까지 분쇄한 다음, 이를 간의 마이크로좀을 포함하는 막결합 소기관을 함유하는 균질물을 만들었다. 입자물질로부터 상등액을 따라낸 후, 상등액을 100,000 x g에서 90분간 원심분리하여 펠렛과 상등액을 얻었다. 로우리 단백질 분석법을 이용하여 단백질 함량을 측정하였다. 이 마이크로좀 프레퍼레이션의 단백질 농도는 23.2 mg/mL였다. 효소 활성이 손실되는 것을 막기 위해, 마이크로좀을 -80℃에서 4.0 또는 6.0 mL의 분주액 중에 보관하여 냉동 해동 사이클을 회피시킨다.

다음의 성분들을 257 mL 용량의 어얼렌마이어 플라스크에 차례로 첨가하였다: NADP 57.3 mg, 글루코스-6-포스페이트 254 mg, 및 NADPH 23.0 mg을 6.0 mL의 포스페이트 완충액 (pH 7.4로 조정됨)에 첨가하였다. 이어서, 2.0 mL의 MgCl 5.0 mM 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 (10 유닛/mL, 캘리포니아 산디에고에 소재하는 CALBIOCHEM사로부터 구입, Cat. No. 346774) 6.0 mL를 상기 용액에 첨가하였다. 마지막으로, 10 mL의 포스페이트 완충액 (pH 7.4)을 첨가하였다. 상기와 같이 제조한 개 간의 마이크로좀 6 mL 용량을 플라스크에 넣고 ISA247를 첨가한 다음 주변환경에 EK라 조절되는 인큐베이터/진탕기에서 250 rpm의 속도로 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 2시간째쯤, 2M HCl 500 ㎕를 첨가함으로써 반응을 중단시켰다.

이 방법에 의해 생산된 대사산물을 이어서 유기 용매로 추출한 다음, 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 추가 분리하였다. 대사산물을 일렉트로스프레이 질량 스펙트럼 (MS) 및 NMR에 의해 추가로 특징화시켰다. 이렇게 하여 얻어진 대사산물의 프로파일 (데이터 미제시)은 인체 전혈로부터 얻은 것과 유사하였다. 다만, 디올의 경우 개의 마이크로좀에는 훨씬 적었다.

실시예 3

사카로폴리스포라 에리트라에 ( Saccharopolyspora erythrae )를 이용항 생물전환에 의한 ISA247 대사산물의 제조

이 실시예는 사람의 시토크롬 P450 마이크로좀 효소의 미생물 등가물을 함유하는 미생물과 미생물의 활발한 성장에 적합한 배지를 함유하는 생물전환 시스템을 설명한다. 생물전환 시스템에 첨가하기에 앞서 물에 잘 녹지 않는 모화합물을 에탄올과 혼합한 다음 계면활성제와 혼합한다. 이 실시예에서, 에탄올 중 ISA247를 트윈

40과 혼합한 다음 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythrae):ATCC 11635)를 함유하는 생물전환 시스템에 첨가하였다.

출발 배양체는 다음과 같이 제조하였다: 4 g/L 효모 추출물, 10 g/L 몰트 추출물, 4 g/L 덱스트로스 및 2 g/L 한천을 함유하는 ISP2 배지 슬랜트를 시험관으로 15개 (16 x 26 mm; 각각 6 ml) 준비하였다. 이들 성분들을 탈이온수와 1 리터가 되도록 혼합하고, 필요에 따라 NaOH를 이용하여 pH를 중성으로 7로 만들었다. 배지를 100℃에서 30분간 멸균처리하였다. 튜브를 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 각각의 슬랜트에 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea: ATCC 11635)를 접종하였다. 접종된 슬랜트를 멸균 조건 하 실온에서 3주일간 배양시켰다.

예비배양체를 제I상 배지로 옮겼다. 제I상 배지는 10 g/L 덱스트린, 1 g/L 글루코스, 3 g/L 소고기 추출물, 10 g/L 효모 추출물, 5 g/L 마그네슘 설페이트 및 400 mg/L 인산칼륨을 이용하여 제조하였다. 이들 성분들을 탈이온수와 함께 1 리터가 되도록 혼합하고, pH는 필요에 따라 NaOH를 이용하여 pH 7로 만들고 이것 50 mL를 배플이 두개 달린 250 mL 배양 플라스크 각각에 분주하였다. 100℃에서 30분 동안 배지를 멸균처리하였다. 배지 5 mL를 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea: ATCC 11635)를 함유하는 슬랜트 시험관에 분주하였다. 슬랜트 표면으로부터 세포들을 벗겨내고 현탁액 2.5 mL를 각각의 플라스크에 넣었다. 이들 플라스크들을 27℃의 랩라인 인큐베이터에 넣고 250 rpm에서 3일 (72 시간)간 진탕시켰다.

3300 rpm에서 5분간 제I상 플라스크의 내용물을 원심분리함으로써 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea: ATCC 11635)를 제I상 배지로부터 제II상 배지로 옮기고 상등액을 디캔팅시켜서 펠렛을 얻었다. 제2II상 배지 5 mL를 펠렛에 첨가하고 시험관을 보텍싱한다음 3300 rpm 에서 4분간 원시ㅋ분리하였다. 다시 번 상등액을 디캔팅시켰다. 펠렛을 제II상 배지에 재현탁시켰다. 이어성 상등액을 배플이 구비된 배양 플라스크 중 제II상 배지 50 mL에 첨가하였다.

제II상 배지는 10 g/L 글루코스 1 g/L 효모 추출물, 1 g/L 소고기 추출물 및 11.6 g/L의 3-모르폴리노프로판설폰산 (MOPS) 완충액을 함유하였다. 이들 성분들을 1리터가 될 때까지 탈이온화수와 혼합한 다음; 50 mL를 배플이 2개 구비된 배양 플라스크 (250 mL)에 넣었다. 5M NaOH를 이용하여 pH를 7로 만든 후, 배지를 100℃에서 30분간 오토클라브 처리한 다음 냉각시켰다. 트윈

40을 ISA247 및 에탄올과 혼합기 전에 오토클라브로 처리하였다.

ISA247 (E 이성질체 및 Z 이성질체의 ~ 50/50 혼합물 4 mg)를 95% 에탄올 (0.1 ml)에 용해시킨 다음, 트윈

40 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트; Cat No. P1504: 미주리주 세인트루이스 소재 Sigma-Aldrich사) 0.4 ml와 혼합하였다. 모화합물-계면활성제 혼합물을 제II상 배양 배지 중의 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea)에 첨가하였다. 제로타임 시료를 채취해서 동결시켰다. 이어서 각각의 플라스크를 덮은 다음 27℃의 이노바 인큐베이터에 넣고 170 rpm으로 진탕시키면서 120 시간 동안 인큐베이트시켰다.

두번째 시료를 제II상 배양 배지로부터 채취하였다. 제로타임 시료 및 두번째 시료를 3급-부틸-메틸-에테르 (cat No. 7001-2; Caledon)를 이용하여 추출하여 T다 추출된 대사산물을 메탄올 (HPLC 등급)에 재조성시켜 전술한 바와 같이 LC-MS로 분석하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 이 방법에 의해 수득된 대사산물 프로파일은 사람의 전혈로부터 얻어진 것의 프로파일과 비슷하다 (실시예1 참조0. 생물전환 혼합물을 분석하자, 다음과 같은 7종의 대사산물 혼합물이 존재하는 것으로 밝혀졌다: IM4n (아미노산-4에서 N-탈메틸화된 ISA247 대사산물), IM9 (아미노산-9에서 히드록실화된 ISA247 대사산물), IM4 (아미노산-4에서 히드록실화된 ISA247 대사산물), IM1-c-1 (표 1 참조), IM1-d-1 (표 1 참조), IM1-d-2 (표 1 참조) 및 IM1-d-3 (표 1 참조). 따라서, 사람의 혈액에서 발견된 8종의 ISA247 대사산물 중 7종이 이 생물전환 시스템에서 생산된 것이었다.

실시예 4

사카로폴리스포라 에리트라에 ( Saccharopolyspora erythraea )를 이용한 생물전환에 있어서 계면활성제의 변화에 따른 효과

여러가지 계면활성제의 효과를 시험하기 위해, 전술한 바와 같이 활발하게 성장중인 제II상의 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea: ATCC 11635)를 준비하였다. 에탄올 (0.33 ml) 중 ISA247 (56 mg; E 이성질체와 Z 이성질체의 50/50 혼합물)를 각각 함유하는 7개의 시험관을 준비하였다. 계면활성제 (0.67 ml/시험관)를 다음과 같이 각각의 시험관에 첨가하였다:

시험관 1 - PEG 400 (폴리에틸렌 글리콜 400; 카보왁스-뉴저지주 페어론 소재 Fisher Scientific 제품)

시험관 2 - 카스터유 (온타리오 런던 소재 Wiler FIne Chemicals Ltd.제품)

시험관 3 - 이소프로필 미리스테이트 (온타리오 런던 소재 Wiler FIne Chemicals Ltd.제품)

시험관 4 - 글리세린 (온타리오 터론토 소재 BDH Fine Chemicals 제품, Lot # 120343/73865);

시험관 5 - 크레모포어

EL (미주리주 세인트루이스 소재 Sigma Chemical 제품);

시험관 6 - 라브라솔

(프랑스 세덱스 소재 Gatte Fosse 제품); 및

시험관 7 - 트윈

40 (위스콘신 밀워키 소재 Aldrich Chemical Company Inc. 제품).

모화합물-계면활성제 혼합물을 활발하게 성장중인 사카로폴리스포라 배양 배지에 첨가하고 제로타임 시료를 채취하였다. 27℃에서 5일간 진탕시키면서 인큐베이션한 후, 추출하고, 대사산물을 실시예 4에 설명된 바와 같이 정량하였다. HPLC 피크 곡선 아래의 면적은 도 3 및 도 4에 도시된 것들과 유사하였으며, 존재하는 대사산물의 양의 척도로서 측정되었다. HPLC 피크는 IM4n으로서 동정된 N-탈메틸화 대사산물; IM1-c-1으로 동정된 사이클릭 대사산물; 및 IM1-d-1, IM1-d-2 및 IM1-d-3으로서 동정된, ISA247 화합물의 1 아미노산에 형성된 디올인 3가지 디올 대사산물에 대응하였다 (표 1 참조). 7가지 계면활성제들은 생물전환 프레퍼레이션에서 대사산물을 생산량을 증가시키는 활성이 모두 동등하지는 않았다. 도 5에 도시된 바와 같이, 글리세린이나 PEG 400을 생물전환 프레퍼레이션에 첨가하자, 대사산물의 생산량이 크게 증가하였다. 그러나, 카스터유, 이소프로필 미리스테이트, 크레모포어

, 라브라솔

및 트윈

40은 모두 계면활성제 없는 프레퍼레이션 (나타내지 않음)에 있어서의 대사산물 생산보다, 생물전환 프레퍼레이션에서 대사산물 생산량을 증가시켰다.

실시예 5

여러가지 미생물을 이용한 생물전환

쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata: University of Alberta Microfungal Collection and Herbarium (UAMH) 9191; ATCC 12017), 쿠닝하멜라 에키눌라타 변종 엘레강스 (Cunninghamella echinulata var . elegans: UAMH7370; ATCC 36112), 쿠르불라리아 에키눌라타 변종 블라케스리나 (Curvularia echinulata var. blakesleena: UAMH 8718; ATCC 8688a), 쿠닝하멜라 에키눌라타 변종 엘레강스 (Cunninghamella echinulata var . elegans: UAMH 7369; ATCC 26269), 뷰바리아 바시아나 (Beauvaria bassiana: UAMH 8717; ATCC 7159), 악티노마이세테스 (Actinomycetes: ATCC 53828), 악티노플라네스종 (Actinoplanes sp .: ATCC 53771), 쿠닝하멜라 에키눌라타 (Cunninghamella echinulata: UAMH 4144; ATCC36190), 쿠닝하멜라 에키눌라타 (Cunninghamella echinulata: UAMH 7368; ATCC 9246), 쿠닝하멜라 바니에레 (Cunninghamella baniere ( echinulata ): UAMH 4145; ATCC9244) 및 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erythraea: ATCC 11635)를 비롯한 여러가지 미생물들을 ISA247로부터 ISA247 대사산물을 생산하는 것에 대해 평가하였다.

이 미생물들을 대사산물 전환 수율 (생산된 공지 ISA247 대사산물의 양) 및 대사산물의 다양성 (생산된 여러가지 ISA247 대사산물의 종류)에 대해 스크리닝하였다. 미생물들을 제I상으로 배양하여 제II상에서 ISA247과 함께 인큐베이션시켰다. ISA247을 발효 배지에 첨가한 후, 배지로부터 시료를 채취하여 수집된 대사산물을 동정 및 정량하기 위해, 사람의 표준 ISA247 대사산물 프로파일에 대해 LC-MS를 이용하여 분석하였다. 개선된 배지 조성을 선별하기 위하여, 96 시간 생물전환 사이클을 통해 각각의 균주를 일차 시험한 후, 대사산물 전환율과 대사산물의 다양성 조합이 가장 높은 두가지 균주를 배지 조성을 달리하여 제III상에서 시험하였다.

제I상/제 II 상 방법

시험된 각각의 미생물을 배양 특이적인 한천 슬랜트 상에서 유지시켰다. 모든 슬랜트는 오염 방지를 위해 1개월 먼저 제조하였다. 준비된 한천 배지를 123℃에서 오토클라브 처리하고 58분 동안 380 mm Hg의 부분압으로 하여, 서서히 냉각한 다음 6 mL를 취하여 16 x 125 mm의 멸균 배양 시험관에 피펫팅하여 옮겼다. 시험관에 한천을 넣은 후, 시험관을 기울인 상태로 놓아두어 슬랜트를 만들고 한천이 굳을 때까지 냉각시킨 다음, 표지를 붙이고 27℃에서 1-2 주일간 인큐베이션시켰다. ISP 한천 (0.4% 효모 추출물, 1% 몰트 추출물, 0.4% 덱스트로스 및 2% 과립 한천)을 이용하여 ATCC 11635와 ATCC 53771의 포자를 만들었다. ATCC 53828, UAMH 8717 및 UAMH 8718은 감자 덱스트로스 한천 (PDA, 증류수 중 3.9%)을 이용하여 포자를 생성시켰다. UAMH 4145, UAMH 7369, UAMH 7370 및 UAMH 9191은 곡물 슬랜트 (10%% 혼합 곡물, 건조, 바람직하게는 유아용 영양식; 2% 과립 한천; 곡물이 응집되는 것을 방지하고 슬랜트에서 한천이 부적절하게 분포되는 것을 예방하기 위해 멸균 전후로 곡물을 혼합하였다)를 이용하여 포자 생성시켰다. 2주일간 인큐베이션시킨 후, 각각의 미생물을 미생물-특이적인 한천 상에 접종하고 27℃로 유지하였다. 일단 슬랜트 상에 콜로니들이 완전히 덮이면, 바람직하게는 슬랜트를 제I상에서 즉시 사용하거나, 필요하면 4℃에서 보관하였다.

이어서, 멸균된 제I상 배지 2 mL (ISP 종브로쓰(seed broth) 함유: 1%, 덱스트린, 1% 글루코스, 0.27% 소고기 추출물, 1% 효모 추출물, 0.004% 마그네슘 설페이트 및 0.036% 포타슘 디포스페이트, pH 7.0)를 시험하고자 하는 미생물이 들어있는 소스 슬랜트에 첨가하였다. 멸균 접종 루프를 이용하여, 콜로니들을 제거하고, 보텍스 처리한 다음, 얻어진 이 현탁액을, 멸균되 250 mL 용량의 배플달린 배양 플라스크에 함유되어 있는 50 mL의 멸균된 제I상 배지에 첨가하였다. 각각의 플라스크를 96 시간 동안 인큐베이션시켜 제II상에서 ISA247를 첨가하기 전에 바이오매스를 증가시켰다.

제II상으로 옮겨가기 위해 바이오매스를 준비하기 위해, 세포를 철저히 세척하여 제I상 잔사를 제거하였다. 제I상 함유물을 50 mL의 원추형 원심분리 시험관에 무균적으로 옮겨 넣고, 3300 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상등액이 제저되도록 디캔팅시켰다. 세포를 과량의 제II상 배지 5 mL (3.65% MOPS, 0.31% 효모 추출물, 3.14% 글루코스 및 0.31% 소고기 추출물, pH 7.0)로 세척한 다음 3300 rpm에서 다시 5분간 원심분리한 다음, 상등액을 디캔팅시키고 신선한 제II상 배지 5 mL를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 격렬히 보텍스 처리하고 250 mL 용량의 배플이 구비된 배양 플라스크 내의 멸균된 제II상 배지 50 mL에 무균적으로 옮겼다. ISA247 일부분 (0.5 mL, 33.75% 에탄올 (95%): 66.25% 글리세롤에 주로 트랜스 형태로 존재한 ISA247 56 mg/mL)을 배지에 첨가하고 이 혼합물을 격렬히 진탕시켰다. 시료 일정액을 취하여 (0.5 mL, 96 시간의 제II상 발효에 걸쳐 12 시간 증분) LC-MS 분석을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 96 시간 후 발효가 종료되었다.

제 III 상

제III상에서는, ATCC 53771 및ATCC 11635 균주를 종브로쓰로서 배지 C (2% 글루코스, 2% 전분, 0.5% 효모 추출물, 2% 대두 단백질, 0.32% CaCO₃, 0.25% NaCl)에서 96 시간 동안 인큐베이션시킨 다음 별도의 복제 시도로서 배지 3 (2% 글리세롤, 0.5%펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.2% 소고기 추출물, 0.1% (NH₄)₂HPO, 0.1% CaCO₃, 0.3% NaCl, 0.03% MgSO₄-7H₂O, pH 7.0) 또는 배지 16 (2% 글루코스, 1% 글리세린, 1% 펩톤, 1% 고기 추출물, 2% 대두 단백질, 0.5% CaCO₃, 0.5% NaCl, pH 7.0)에 무균적으로 첨가하였다. 발효 배지는 점성이 매우 높기 때문에 LC-MS 분석을 위해 시료를 채취할 때 세심한 주의를 기울였다.

표 5: 실시예 5에서 사용된 배지 및 한천 요약표
	ATCC 11635	ATCC 53771	ATCC 53828	UAMH 4145	UAMH 7369	UAMH 7370	UAMH 8717	UAMH 8718	UAMH 9191
배지	ISP 2	ISP 2	ISP 2	ISP 2	ISP 2	ISP 2	ISP 2	ISP 2	ISP 2
	배지 3	배지 3
	ATCC 11635	ATCC 53771	ATCC 53828	UAMH 4145	UAMH 7369	UAMH 7370	UAMH 8717	UAMH 8718	UAMH 9191
	배지 16	배지 16
한천	ISP	ISP	PDA	CER	CER	CER	PDA	PDA	CER

LC - MS 에 의한 대사산물 분석

-80℃에서 보관중인 시료를 해동시키고 16 x 10 mm 배양 시험관에 표지를 붙여서 분석하고자 하는 시료들을 표시하였다. 각각의 0.5 mL의 시료로부터 200 μL의 분주액을 취하고, CsA (사이클로스포린 A) 1 mg/mL 용액 25 μL를 내부 표준으로서 첨가하였다. 각각의 시료에 HPLC-구배 메탄올 2 mL를 첨가하고 시료에 뚜껑을 덮어서 20분간 진탕시켰다. 시료를 3300 rpm에서 1분 45초 동안 원심분리하였다. 상등액을 표지시킨 깨끗한 16 x 10 mm 배양 시험관에 디캔팅시키고 진공 농축시켜 유기 용매를 제거하였다. 대사산물과 모약물을 모두 함유하는 건조된 층을 200 μL HPLC-등급 메탄올에 재조성하고 오토 샘플러 바이알 내로 정량적으로 옮겼다. 0.01% 아세트산/아세트산 나트륨과 함께 탈이온수 중에서 시료를 15분간 처리하고, m-TBE(메틸 삼급 부틸 에테르)와 HPLC 등급 메탄올을 증가시키며 12분 구배로 분석을 개시하였다.

도 6은 사람 참가자로부터 모은 시료로부터 얻은 전형적인 대사산물치, 대응하는 정량가능한 ISA247 대사산물 및 개략적인 체류 시간을 요약하였다. 정량화된 이온 질량은 1223, 1237, 1239, 1253, 1255, 1267, 및 1271을 포함하였다. 실시예 1에서는 세가지 디올 (IM1-d-1, IM1-d-2 및 IM1-d-3)이 검출된 반면 여기서는 두가지 디올 (IM1-d-1 및IM1-d-4)이 검출된 것이 주목된다. 이러한 차이는 ISA247의 트랜스 형태는 IM1-d-1과 IM1-d-4로 대사되는 반면, ISA247의 시스 형태는 IM1-d-2와 IM1-d-3으로 대사되기 때문이다. 실시예 1에서 사용된 모화합물은 시스와 트랜스의 50:50 혼합물이고, 이 실시예에서의 모하합물은 주로 트랜스-ISA247였기 때문에, 디올과 관련한 대사산물 프로파일이 상이한 것이다.

이온 질량	ISA247로부터의 대사산물	개략적인 체류 시간 (분)
1223	IM4n	9.789
1237	ISA247	10.206
1239	1239	8.340
1253	IM1-c-1;IM9;Im4	8/575;8.939;9.440
1255	1255	8.899
1267	CSA (내부 표준)	10.678
1271	IM1-d-1; IM1-d-4	7.535;8.166

검출된 각각의 정량가능한 대사산물의 피크 곡선 아래의 면적 (AUC: area under the curve)과 내부 CsA 표준 곡선 아래의 면적의 비율로부터의 상대적인 전환 %를 다음 방정식을 이용하여 산출하였다:

% 전환율 = ( 대사산물 AUC )/( CsA 내부 표준 AUC ) x 100

결과

96시간의 생물전환 후 대사 다양성을 표 7에 요약하였다. 체크 표시는 대사산물이 정량가능한 양으로 생산되었음을 가리키는 것이다. 표 8에는 시험된 각각의 미생물에서 생산된 각각의 대사산물의 양을 나타내었다.

따라서, 이 실험에서 시험된 모든 미생물 중 ATCC 11635가 가장 높은 전환 백분율과 가장 큰 대사 다양성을 나타내었다. 공지의 8가지 인체 ISA247 대사산물이 ATCC 11635 시료에서 검출되었다. UAMH 4145는 8종의 대사산물 중 6종을 생산하였다. IM4n (6.66%)을 대량 생산할 수 있는 고유한 능력으로 인해 실험에서 자주 사용되는 ATCC 53771은 8종의 인체 대사산물 가운데서 5종을 생산하였다. ATCC 53828은 8종의 대사산물 가운데 4종을 생산하였다; 비록 이들 대사산물 각각은 소량으로 생산되었지만 희귀한 대사산물은 1239도 생산되었다. UAMH 7369와 UAMH 7370은 각각 4종의 대사산물을 생산하였다. UAMH 9191과 UAMH 8718은 6종의 대사산물을 생산하였다. UAMH 8717은 3종의 대사산물을 생산하였다.

미생물 선별에서 고려되는 또 다른 요소는 ISA247의 "희귀한" 대사산물의 존재 여부이다. "희귀"하다 함은 예컨대, IM1-d-4, 1239 및 1255와 같이, ATCC 11635에 의해 대량으로 생산되지 않는 대사산물인 것으로 정의된다. IM1-d-4는 ATCC 11635, UAMH 8717 및 UAMH 9191에 존재하였으나, ATCC 11635에 의해 가장 많은 양으로 생산되었다. 미생물 균주 ATCC 11635, ATCC 53771, ATCC 53828, UAMN 7370, UAMH 8717, UAMH 8718, UAMH 9191은 모두 1239를 생산하였다. 가장 많은 양으로 생산한 미생물은 UAMH 8717이었다. 이온 1255에 대응하는 대사산물은 ATCC 11635, UAMH 4145, ATCC 53771, UAMH 8717에 의해 생산되었으며, ATCC 11635가 최대 전환율을 나타내었다.

이 실험의 제III상 실험에서, ATCC 11635 및 ATCC 53771을 배지 3 및 배지 16에서 배양하고, 배지의 영향력을 비교하였다. 도 7에 ATCC 11635의 결과를 나타내었다. 배지 3과 배지 16은 IM1-d-1, IM1-d-4 및IM1-c-1을 제외하고 각각의 대사산물을 비슷한 양으로 생산하였다. IM1-d-1 생산은 배지 3의 경우 감소하였으며 배지 16에서는 검출가능한 농도로 존재하지 않았다. IM1-d-4 생산은 배지 3과 배지 16에서 모두 감소되었다. IM1-c-1 생산량은 배지 3에서 10% 증가되었다. 도 8은 ATCC 53771에서 ISA247 대사산물의 생산에 미치는 배지 조성물의 효과를 나타낸 그래프이다. IM1-d-1은 ISP2 배지를 사용했을 때에만 검출되었고 IM9와 IM4는 배지 3과 배지 16을 사용한 경우에만 검출되었다. IM1-d-4를제외한 대부분의 대사산물들은 배지 3과 배지 16을 사용한 경우 그 양이 증가하였다. 따라서, 미생물의 성장 배지는 생물전환 효과를 최적화시키기 위해 변경시킬 수 있다.

실시예 6

뷰바리아 바시아나 ( Beauvaria bassiana )를 이용한 생물전환 에 있어서 계면활성제와 용매의 효과

실시예 5에서, 뷰바리아 바시아나 (Beauvaria bassiana : UAMH 8718)은 ISA247 대사산물을 단지 소량으로 생산하였다. 계면활성제와 용매가 생산 프로파일을 변화시킬 수 있는지 알아보기 위해, 글리세롤 (실시예 5에서 사용됨) 대신 디메틸 설폭사이드 (DMSO)와 트윈

40을 사용하여 비교하였다. 56 mg/mL의 ISA247 용액 (글리세롤 대신 33.75% 에탄올 (95%):66.25% DMSO 또는 트윈

40 중) 0.5 mL를 50 mL의 배지에 첨가하였다. 동일한 제I상 및 제II상 배지와 실시예의 과정은 다음과 같았다.

도 9에 도시된 바와 같이, 계면활성제로서 글리세롤을 사용한 경우 IM1-d-4, 1239 및1255가 생산되었고; DMSO를 사용한 경우에는 IM1-d-1, IM4n 및 IM4가 생산되었으며 트윈

40을 사용한 경우에는 IM1-d-1, IM1-d-4, 1255, IM4n, IM9 및IM4가 생산되었다. 전환량 역시 극적으로 변하였다. 결과적으로, 생물전환의 결과는 모화합물을 전달하기 위해 사용되는 용매나 계면활성제의 종류를 변화시킴으로써 최적화할 수 있으며, 당업자라면 대사산물의 조합의 주어진 대사산물의 생산량을 증가시키기 위해 특정 용매, 계면활성제 및 배지를 선택할 수 있다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그 내용 전체가 본 명세서에 참조로 통합되는 것으로 개별적으로 그리고 특정하여 표시되는 것처럼 그러한 간행물, 특허 및 특허출원의 내용 전체가 본 명세서에 통합된다.

이제까지 본 발명의 일부 구체예를 들어 본 발명을 설명하였다. 그러나, 본 발명의 정신과 범위를 벗어남이 없이 그 밖의 다양한 변형예가 가능하다.

Claims

다음의 단계, 즉:

(a) 생체이물질 화합물과 계면활성제와의 혼합물을 제공하는 단계;

(b) 상기 혼합물을 미생물 배양체에 첨가하는 단계; 및

(c) 대사산물이 생성되는데 충분한 기간 동안 상기 배양체를 인큐베이션시키는 단계를 포함하여 이루어지는, 생체이물질 화합물의 대사산물을 1종 이상 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 혼합물은 생체이물질 화합물, 용매 및 계면활성제를 함유하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 용매는 알코올인 방법.
제3항에 있어서, 알코올은 에탄올인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 용매는 알코올과 DMSO를 두가지 모두 함유하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물은 악티노플라네스 변 종 (Actinoplanes sp .), 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 세토니이 (Streptomyces setonii) 및 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erthyraea)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물은 쿠닝하멜라 에키눌라타 (Cunninghamella echinulata)인 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물은 네로스포라 크라싸(Nerospora crassa)인 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물은 악티노플라네스 변종 (Actinoplanes sp.)인 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 계면활성제는 PEG 400, 카스터유, 이소프로필 미리스테이트, 글리세린, 크레모포어
, 라브라솔
, 및 트윈
40으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생체이물질 화합물은 면역억제제 및 항균 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 생체이물질 화합물은 사이클로스포린 화합물인 것인 방법.
제12항에 있어서, 사이클로스포린 화합물은 ISA247인 방법.
제12항에 있어서, 사이클로스포린 화합물은 사이클로스포린 A인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대사산물은 IM1-d-1, IM1-d-2, IM1-d-3, IM1-d-4, IM1-c-1, IM1-c-2, IM1-e-1, IM1-e-2, IM1-e-3, IM9, IM4, IM4n, IM6, IM46, IM69 및 IM49로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물은 사카로폴리스포라 에리트라에 (Saccharopolyspora erthyraea: ATCC 11635)인 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양체로부터 대사산물을 분리하는 단계를 부가적으로 포함하는 방법.
생물전환 시스템에 사용하는데 적합한 미생물을 동정하는 방법으로서: a) 대사될 화합물의 구조를 공지 효소 활성과 비교하는 단계; b) 공지의 효소 활성을 발현하는 효소를 동정하는 단계; c) 동정된 효소를 발현하는 미생물을 동정하는 단계; 및 d) 동정된 효소를 발현하는 미생물을 생물전환 시스템에서 사용하여 상기 화합물의 대사산물을 만드는 단계를 포함하여 이루어지는 방법.