KR20070053659A

KR20070053659A - 쓴맛 수용체의 작용제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20070053659A
Application number: KR1020067024311A
Authority: KR
Inventors: 마이크 베렌스; 안네 브로크호프; 베른트 부페; 크리스티안 쿤; 울프강 메이어호프; 마르셀 뷔니히
Original assignee: 도이체스 인스티튜트 퓌어 에른에룬그스포슝
Priority date: 2004-04-20
Filing date: 2005-04-20
Publication date: 2007-05-25
Also published as: US20100056621A1; EP1737442B1; JP2007533313A; WO2005102311A1; JP4812752B2; US8158372B2; EP1737442A1

Abstract

본 발명은 쓴맛 전달(bitter-taste transduction)에서 hTAS2R14 쓴맛 수용체(bitter-taste receptor)의 작용제 및 그것의 역할에 관련된 것이다. 본 발명은 또한 예를 들어, hTAS2R14 쓴맛 전달 또는 쓴맛 반응의 차단 또는 억제를 조절하는 분자를 선별하기 위한 검정법과 관련된 것이다.

쓴맛, 쓴맛 전달, 쓴맛 수용체, 작용제, 길항제, hTAS2R14

Description

쓴맛 수용체의 작용제 및 그의 용도{AGONISTS OF A BITTER TASTE RECEPTOR AND USES THEREOF}

본 발명은 쓴맛 전달(bitter-taste tr0ansduction)에서 hTAS2R14 쓴맛 수용체(bitter-taste receptor)의 작용제 및 그것의 역할에 관련된 것이다. 본 발명은 또한 예를 들어, hTAS2R14 쓴맛 전달 또는 쓴맛 반응의 차단 또는 억제를 조절하는 분자를 선별하기 위한 검정법과 관련된 것이다.

발명자들은 최근 맛, 바람직하게는 쓴맛의 생물학적 메카니즘의 이해에 그들의 주의를 돌리고 있다. 예를 들어, 문헌 Caicedo A. and Roper S.D.(2001) Science 291:1557-1560; Dulac C.(2000) Cell 100:607-610; Kinnamon S.C.(2000) Neuron 25:507-510; Lindemann B.(2001) Nature 413:219-225 및 Margolskee RF.(2001) J. Biol. Chem. 277:1-4를 참조할 수 있다.

쓴맛은 혐오감을 갖게 하고, 일반적으로 쓴맛이 나는 화합물인 독성 물질에 대한 방어 메카니즘을 인간에게 제공한다. 더욱 민감하게는, 쓴맛-미각자극물질(tastants) 또한 식품, 음료의 기호성(palatability)에 영향을 주며, 그것이 인간의 영양학적 습관에 영향을 준다는 것이 드루노우스키("The Science and Complexity of Bitter Taste", (2001) Nutr. Rev. 59: 163-169)에 의해 더욱 충분 히 토론되었다. 그들은 또한 경구 투여된 약제 및 건강식과 같은 다른 섭취가능한 것에 대한 기호성에 영향을 준다. 쓴맛 전달의 메카니즘에 대한 이해는 식품 및 제약 산업과 밀접한 관계를 가진다. 만일 쓴맛 전달 경로를 조작할 수 있다면, 식품을 더욱 맛이 좋게 하고 경구용 약의 환자 순응도를 증가시키기 위하여 쓴맛의 제거 또는 억제가 가능할지도 모른다.

맛의 전달은 분자의 상호작용 즉, 혀의 유두(papillae)에 위치한 미뢰(taste buds)에 존재하는 맛 수용체-발현 세포(taste receptor-expressing cells)를 포함한다. 미뢰는 식품의 영양소 함량 및 독의 존재에 대하여 뇌로 정보를 중계하여 전달한다. 생화학 및 생리학 연구에서 최근의 진전은 연구자들이 쓴맛 전달은 소위 G-단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptor; GPCRs)라고 불리는 것에 의해 매개된다고 추론할 수 있게 하였다. GPCRs는 7개의 막 통과부위 세포 표면 단백질(transmembrane domain cell surface proteins)이며, 수용체가 리간드(미각자극물질)와 결합할 때 세포 표면에서 발생된 시그널을 증폭하고 그 결과 이질성 삼단위체 G-단백질(heterotrimeric G-proteins)을 활성화시킨다. 상기 G-단백질은 알파 및 베타-감마 서브유닛으로 구성된 단백질 복합체이다. 그들은 보통 그들의 알파 서브유닛으로 언급되며 일반적으로 4 그룹으로 분류된다: G_alpha _{s, i, q} 및 ₁₂. G_alpha _q 타입은 세포질의 Ca² ⁺ 증가를 유도하는 포스포리파제 C(phospholipase C)를 활성화시키기 위하여 GPCRs와 결합한다. 많은 G_q-타입 G-단백질이 무차별적이며 맛 수용체를 포함한 GPCRs와 결합할 수 있고, 이것들은 소위 "무차별적(promiscuous)" G-단 백질이라고 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 G-단백질들은 활성화에 의하여 알파 및 베타-감마 서브유닛으로 분리되며, 그 결과 칼슘 이온과 같은 2차 전달자를 생산하는 세포에서 초래되는 세포질 반응의 복합 캐스케이드는 세포가 쓴맛 반응을 나타내는 신호를 뇌로 보내는 것을 가능하게 한다.

또한 GPCRs가 쓴맛 전달을 매개한다는 해부학상의 증거가 있다: 이러한 수용체들의 클러스터는 거스트듀신(gustducin)을 포함하는 포유류의 맛 세포에서 발견되었다. 거스트듀신은 포유류에서 쓴맛의 인식과 관련된 G-단백질 서브유닛으로 예를 들어, Chandrashekar, J. et al. (2000) Cell 100: 703-711; Matsunami H. et al. (2000) Nature 404:601-604; 또는 Adler E. et al. (2000) Cell 100:693-702.를 참조할 수 있다. 상기 GPCRs를 암호화하는 cDNAs가 확인되고, 분리되며 다른 연관된 수용체들을 확인하기 위하여 인실리코 데이터마이닝 방법(in- silico data-mining techniques)을 사용한 DNA 라이브러리와의 비교를 위해 주형으로서 사용된다. 이러한 방법으로 소위 T2R 패밀리 수용체라고 불리는 연관된 수용체 패밀리의 확인이 가능해졌으며 쓴맛 수용체로 추정되었다.

인간은 천여 개의 상이한 쓴맛 화합물의 약 30개 수용체 유전자의 제한된 유전자 레퍼토리를 인지 가능하다. 2000년도에 그들의 발견(Adler E. et al. (2000) 상기 논문, Chandrashekar J. et al. (2000) 상기 논문; Matsunami H. et al (2000) 상기 논문) 이래로 단지 몇몇 포유류의 TAS2Rs의 리간드가 확인되었고(deorphanised), 특히 작용제가 확인되었다. 생쥐의 mTAS2R5(Chandrashekar J. et al (2000) 상기 논문) 및 쥐의 rTAS2R9(Bufe B. et al. (2002) Nature Genetics 32:397-401)은 독성의 쓴맛 물질 시클로헥시미드(cycloheximide)에 반응하며, 마우스의 mTAS2R8 및 사람의 hTAS2R4는 높은 농도의 디나토늄(denatonium) 및 덜 확장하여 6-n-프로필-2-티오우라실(6-n-propyl-2-thiouracil; Chandrashekar J. et al. (2000) 상기 논문)에 반응하고, 사람의 hTAS2R10 및 hTAS2R16은 각각 선택적으로 스트리크닌(strychnine) 및 쓴맛 베타-글루코피라노시드(β-glucopyranosides)에 반응한다(Bufe B. et al. (2002) 상기 논문). 비록 몇몇의 TAS2Rs에 있어서, 제한된 무차별한 혼합(promiscuity)(mTAS2R8 및 hTAS2R4) 또는 화학적으로 연관된 화합물 그룹의 특이성(hTAS2R16)이 보고되었으나, 지금까지 그렇게 발표된 수용체에 의한 리간드 인식의 상대적인 선택성은 단연 포유류 미각 시스템에 의해 인식된 쓴맛 미각자극물질의 막대한 수를 설명할 수 없다. 제한된 수의 맛 수용체 유전자에 의해 인식되는 미각자극물질의 수를 증가시키기 위해 생각할 수 있는 몇가지 가능한 메카니즘이 있으며, 가장 간단한 방법은 많은 수의 구조적으로 다른 리간드를 광범위하게 조정하는 수용체를 가지는 것이다.

본 발명자는 지금 놀랍게도 인간의 쓴맛 수용체 hTAS2R14가 다양한 쓴맛 화합물에 반응하며, 따라서 그것이 그러한 광범위한 조정을 하는 쓴맛 수용체라는 것을 보여준다. 이것은 광범위의 상이한 쓴맛 미각자극물질이 감소되거나 차단될 수 있다는 것에 의해 이끌어내진 hTAS2R14 수용체 쓴맛 지각력을 차단하는 것으로 생각할 수 있기 때문에, 이 수용체를 특히 끌어당기는 길항제의 확인을 가능하게 했다.

달리 정의하지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속하는 해당분야 통상의 지식에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 대립되는 경우에는, 정의를 포함한 본 문서는 조정될 수 있다. 바람직한 방법 및 물질은 하기에 설명되며, 비록 여기에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질일지라도 본 발명의 실행 및 시험에 사용될 수 있다. 여기에 언급된 공개, 특허 출원, 출원 및 다른 참고문헌들은 그 전체가 참고자료로서 본원에서 인용된다. 여기에 설명된 물질, 방법 및 실시예들은 단지 실례가 되는 것이며 제한하려는 의도는 아니다.

본 발명자는 hTAS2R14 쓴맛 수용체의 작용제를 확인하였고, 그것이 식품 및 제약산업에 중요한 여러가지 종류의 쓴맛 화합물에 대한 특이성에 반응한다는 것을 발견하였다. 본 발명자에 의해 제공된 작용제는 이 수용체들의 쓴맛 반응에 대한 길항제(antagonists)를 위한 종합 화합물 라이브러리(ingelligent compound libraries)를 설계하기 위하여 사용가능하며, 결국 화합물 및 식품 특히 동물성 식품, 영양분 및 식이 보충제 및 피토-케미칼(phyto-chemicals)과 같은 것을 포함하는 약제학적 또는 동종 요법 조제품의 쓴맛이 나는 화합물을 제거하거나 억제하는 조성물을 개발할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명은 또한 추가적인 쓴맛 리간드의 선별 또는 예컨대 식품 산업에 유용할지 모르는 쓴맛 반응을 강화하는 화합물의 선별을 위해 당업자가 사용가능하다.

그러므로, 본 발명의 제1의 특징은 hTAS2R14 쓴맛 수용체 활성의 작용제 또는 길항제를 분리하는 방법을 제공하며, 여기에서 hTAS2R14 쓴맛 수용체는

(a) SEQ ID No.1으로 나타낸 연역된(deduced) 아미노산 서열을 가지는 적어도 성숙형(mature form) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 적어도 성숙형 hTAS2R14 폴리펩티드를 암호화하는 SEQ ID NO:2로 나타낸 코딩 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;

(c) (a)와 (b) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기에서 상기 유도체에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 상기 폴리펩티드와 비교하여 보전적으로 치환되었고, 상기 단편 또는 유도체는 hTAS2R14 쓴맛 수용체 활성을 가진다;

(d) (a)와 (c) 중의 어느 하나로 정의된 폴리뉴클레오티드와 적어도 50% 동일하고 hTAS2R14 쓴맛 수용체 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(e) 바람직하게는 극한 조건 하에서 (a)와 (d) 중 어느 하나로 정의된 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 상보적 가닥이며 hTAS2R14 쓴맛 수용체 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드:

로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되고,

(1) 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 유전학적으로 제조된 숙주세포 또는 잠재적 길항제 또는 잠재적 작용제로 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 암호화된 폴리펩티드와 접촉하는 것

(2) 상기 폴리펩티드의 쓴맛 수용체 활성을 잠재적 길항제가 중화시키거나 잠재적 작용제가 작용시키는 것을 결정하는 것을 포함하며, 여기에서 우선, 부수적 및/또는 단계 (1) 후에 상기 폴리펩티드, 상기 숙주세포 또는 상기 벡터는 1,8-나프탈데히딕 산(1,8-naphthaldehydic acid), 1-나프토에산(1-naphthoic acid), 1-니트로나프탈렌(1-nitronaphthalene), 피크로틴(picrotin), 피크로톡시닌(picrotoxinin), 피페로닉산(piperonylic acid), 벤조산나트륨(sodium benzoate), (-)-α-튜존(thujone), 파테놀리드(parthenolide), 허볼리드 A(herbolide A), 허볼리드 D 아세테이트(herbolide D acetate), 히드록실-8α-파테놀리드, 슈도-아르탑신(pseudo-artabsine), 및 그들의 기능적 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 작용제와 접촉된다.

이 방법에서 사용된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 암호화하며, 여전히 성숙한 hTAS2R14 쓴맛 수용체 즉, "쓴맛 수용체 활성"과 같은 동일한 활성을 필수적으로 나타낸다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 적어도 20%(예를 들어, 적어도: 20%; 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%, 95%; 98%; 99%; 99.5%; 또는 100% 또는 그 이상)의 전장 hTAS2R14의 활성을 갖는다. hTAS2R14의 활성을 측정하는 하나의 방법은 미각자극물질에 반응하여 예를 들어 무차별적인 G-단백질의 알파-서브유닛을 안정적으로 발현하는 HEK293/15와 같은 이종의 세포 발현 시스템, 예를 들어 마우스 G₁₅ 서브유닛 또는 그들의 키메라 변형과 같은 것에서 세포내 칼슘을 방출하게 할 수 있고, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화된 폴리펩티드의 발현에 의존한다. 방출된 세포내 칼슘의 양은 예를 들어, 여기에 설명된 시험관내 FLIPR 검정(in vitro FLIPR assay)에 의해서 관찰될 수 있을 뿐만 아니라 예를 들어, IP₃ 또는 cAMP를 포함하는 다양한 다른 매개변수 중 하나의 측정에 의해서도 관찰될 수 있다. G-단백질 결합 수용체 활성을 측정하는 추가적인 방법은 공지되어 있으며, 전기생리학적 방법, 예컨대 CAT 또는 LUC를 포함하는 리포터 단백질과 같은 각각의 G-단백질 결합 신호경로를 통하여 조절된 조절 서열과 결합된 리포터 유전자의 재발현 또는 활성화를 측정하는 전사 검정법(transcription assays) 또는 차례로 외생적으로 발현된 수용체에 G-단백질을 통해 결합된(예를 들어, McClintock T.S. et al. (1993) Anal. Bio-초드 209:298-305; McClintock T.S. and Lerner M.R. (1997) Brain Res. Brain, Res. Protoc. 2:59-68, Potenza MN (1992) Pigment Cell Res. 5:372-328, and Potenza M.N. (1992) Anal. Bio-chem 206:315-322를 보라) 흑색소포에서의 색소 움직임이 아데닐산 고리화효소(adenylate cyclase) 또는 포스포리파아제 C(phospholipase C; PLC)의 활성을 읽어내는데 사용되는 개구리 흑색소포 시스템에서의 검정(frog melanophore system)에 제한없이 포함된다.

상기 용어 "잠재적 길항제(potential antagonist)"는 비정제된, 부분적으로 정제된 또는 정제된 상태에서 인지될 수 있는 어떠한 화학적 물질 또는 그들의 결합을 포함하지만, hTAS2R14 쓴맛 수용체 활성의 길항제는 쓴맛 수용체와 적어도 10%(예를 들어, 적어도 1%; 15%; 20%; 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99.5%; 및 100%) 정도 접촉함으로써 길항제의 부재시에 결정된 hTAS2R14 쓴맛 수용체 활성보다 낮은 물질이다. 바람직하게는, 길항제는 부수적으로 또는 hTAS2R14 폴리펩티드 길항제와 접촉한 후에 이전의 이 반응에 영향을 미치며, hTAS2R14 폴리펩티드를 포함하는 hTAS2R14 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포 또는 벡터는 확인된 hTAS2R14 길항제 중 하나와 접촉하게 된다.

상기 용어 "잠재적 작용제(potential agonist)"는 비정제된, 부분적으로 정제된 또는 정제된 상태에서 인지될 수 있는 어떠한 화학적 물질 또는 그들의 결합을 포함하고 쓴맛 수용체 활성을 이끌어내며, 쓴맛 수용체 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% 또는 그 이상이 1,8-나프탈데히딕 산(1,8-naphthaldehydic acid), 1-나프토에산(1-naphthoic acid), 1-니트로나프탈렌(1-nitronaphthalene), 피크로틴(picrotin), 피크로톡시닌(picrotoxinin), 피페로닉산(piperonylic acid), 벤조산나트륨(sodium benzoate), (-)-α-튜존(thujone), 파테놀리드(parthenolide), 허볼리드 A(herbolide A), 허볼리드 D 아세테이트(herbolide D acetate), 히드록실-8α-파테놀리드 또는 슈도-아르탑신(pseudo-artabsine) 및 상기 폴리펩티드, 상기 숙주세포 또는 벡터에 접촉된 그들의 기능적 유도체의 몰농도와 동일할 때 검출된다. 잠재적 작용제의 활성은 바람직하게는 만약 (-)-α-튜존, 허볼리드 A 또는 히드록실-8α-파테놀리드와 비교한다면 청구된 범위 안에 있다.

본 발명의 방법에서 사용가능한 hTAS2R14 폴리뉴클레오티드 분자들은 DNA, cDNA, 지노믹 DNA, 합성 DNA 또는 RNA가 될 수 있으며, 이중 나선 또는 단일 나선, 센스(sense) 및/또는 안티센스(antisense) 가닥이 될 수 있다. 이러한 분자들의 조각은 또한 본 발명의 범위내에 있으며, 예를 들어 중합 효소 연쇄반응법(polymerase chain reaction; PCR) 또는 하나 또는 그 이상의 제한효소(restriction endonucleases) 처리에 의해 생성된 것에 의해 제조될 수 있다. 리보핵산(ribonucleic acid; RNA) 분자는 시험관내(in vitro) 전사에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용가능한 폴리뉴클레오티드 분자들은 자연적으로 존재하는 서열 또는 자연적으로 존재하지만 동일한 폴리펩티드(예를 들어, SEQ ID NO:1의 폴리펩티드)의 유전암호(genetic code), 암호화(encode)의 퇴화에 의해 그들과 상이한 서열을 포함할 수 있다. 게다가, 이러한 핵산 분자들은 예를 들어 코딩 서열로부터 상위 또는 하위에 있는 몇몇 또는 모든 비암호(non-coding) 서열을 포함할 수 있는 코딩 서열에 제한되지는 않는다.

발명의 폴리뉴클레오티드 분자들은 시험관내에서 합성(예를 들어, 포스포라미다이트에 기초한 합성)될 수 있거나 박테리아, 포유류 세포와 같은 세포로부터 얻어질 수 있다. 핵산은 인간 뿐만 아니라 상기 설명한 기준을 만족시키기만 하면 비-인간 영장류, 마우스, 랫트, 기니아피그, 암소, 양, 말, 돼지, 토끼, 개 또는 고양이로부터 유래된 것일 수 있다. 이러한 타입의 핵산 안에 있는 뉴클레오티드의 결합 및 변형(modification) 또한 포함한다.

게다가, 본 발명의 방법에서 사용가능한 폴리뉴클레오티드는 자연 상태에서는 발견할 수 없는 조각을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스성 벡터) 또는 이종세포의 게놈(또는 자연의 염색체 위치와는 다른 위치에 있는 상동 세포의 게놈)에 편입된 재조합 핵산 분자를 포함한다. 재조합 핵산 분자 및 그 사용 결과는 하기에 더 언급하였다.

특정의 바람직한 실시예로, 본 발명의 방법은 (a) SEQ ID NO:2의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 ; (b) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열; 및 (C) SEQ ID NO:1의 적어도 30(예컨대, 적어도 30, 40, 50, 60, 80, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 850, 900, 951) 뉴클레오티드의 조각을 포함하는 핵산 분자와 적어도 50%(또는 55%, 65%, 75%, 85%, 95% 또는 98%) 동일한 분리된 핵산분자를 사용한다.

두 서열간의 동일성 비율의 측정은 칼린 및 앨트슐의 수학적 알고리즘을 사용하여 수행하였다(Karlin and Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 5873-5877). 이러한 알고리즘은 앨트슐 등의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램에 통합되어있다(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). BLAST 뉴클레오티드 검색은 HIN-1-암호화 핵산과 상동의 뉴클레오티드 서열을 얻기 위하여 BLASTN 프로그램(스코어=100, 단어 길이=12)으로 수행되었다. BLAST 단백질 검색은 hTAS2R14 폴리펩티드와 상동의 아미노산 서열을 얻기 위하여 BLASTP 프로그램(스코어=50, 단어 길이=3)으로 수행되었다. 비교 목적의 갭트 얼라인먼트(gapped alignment)를 얻기 위하여, 갭트 BLAST는 앨트슐 등에 기술되어 있는대로 이용되었다(Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). BLAST 및 갭트 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각기 프로그램의 디폴트 매개변수(default parameters)가 사용되었다.

혼성화(hybridization) 또한 두 핵산 서열간의 상동성을 측정하는데 사용될 수 있다. hTAS2R14를 암호화하는 핵산 서열 또는 그들의 일부분은 표준 혼성화 기술에 따라 혼성화 프로브로 사용될 수 있다. 실험용 재료(예컨대, 포유류 세포)로부터의 DNA 또는 RNA에 대한 hTAS2R14 프로브 혼성화는 실험 재료 안의 hTAS2R14 DNA 또는 RNA 발현의 증거이다. 혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 "Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991)"에서 알 수 있다. 적당한 혼성화 조건은 30℃ 2X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서 혼성화하고, 그 뒤 50℃ 1X SSC, 0.1% SDS에서 세정하는 것과 동일하게 정의된다. 매우 극한 조건은 45℃ 6X 염화나트륨/구연산 나트륨(SSC)에서 혼성화하고, 이어서 65℃ 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 세정하는 것과 동일하게 정의된다.

본 발명의 방법에서 폴리뉴클레오티드 또는 단백질은 상기 언급된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 상기 용어 "벡터"는 세포 안으로 거기에 포함된 단백질 및/또는 핵산이 도입할 수 있거나 도입될 수 있는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 또는 그들의 혼합물을 말한다. 도입된 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화된 단백질은 벡터의 도입에 의해 세포 안에서 발현되는 것이 바람직하다.

바람직한 실시예로, 본 발명의 방법은 플라스미드(plasmids), 파지미드(phagemids), 파지(phages), 코스미드(cosmids), 인공 포유류 염색체(artificial mammalian chromosomes), 넉아웃(knock-out) 또는 넉인(knock-in) 구조물, 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스(adenoviruses), 우두 바이러스(vaccinia viruses), 약독화 우두 바이러스(attenuated vaccinia viruses), 카나리 폭스 바이러스(canary pox viruses), 바람직하게는 단순포진바이러스(Herpes simplex virus; HSV-1, Carlezon, W.A. et al. (2000) Crit. Rev. Neurobiol. 14: 47-67), 바큘로바이러스(baculovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated-virus; AAV, Carter, P.J. and Samulski, R.J. (2000) J. Mol. Med. 6: 17-27), 리노바이러스(rhinovirus), 후천성 면역결핍 증후군(human immune deficiency virus; HIV), 필로바이러스(filovirus) 및 그들의 가공된 형태(예를 들어, Cobinger G.P. et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:225-30를 보시오), 비로좀(virosomes), "네이키드(naked)" DNA 리포좀 및 바람직하게는 금빛 구체의 입자로 코팅된 핵산을 포함한다. 특히 바람직한 것은 아데노바이러스성 벡터 또는 레트로바이러스성 벡터와 같은 바이러스성 벡터이다(Lindemann et al. (1997) Mol. Med. 3: 466-76 및 Springer et al. (1998) Mol. Cell. 2: 549-58). 리포좀은 주로 예를 들어, 리포좀 현탁액의 초음파 처리에 의한 양이온, 중성 및/또는 음이온 지질로 만들어진 작은 단일라멜라(unilamellar) 또는 다중라멜라(multilamellar) 소포체(vesicles)이다. DNA는 예를 들어, 리포좀의 표면에 이온적으로 결합할 수 있거나 리포좀의 내부에 둘러싸여질 수 있다. 적합한 지질 혼합물은 공지되어 있으며, 예를 들어 DOTMA(1,2-dioleyloxpropyl-3-trimethylammoniumbromid) 및 DPOE(Dioleoyl-phosphatidyl-ethanolamin)가 여러가지 세포주에서 모두 사용된다.

입자로 코팅된 핵산은 세포 안으로 핵산을 주입하기 위한 다른 수단으로 소위 "유전자 총(gene guns)"이라 불리는 것을 사용하며, 이것은 세포 안으로 입자를 기계적으로 주입할 수 있게 한다. 바람직하게는 입자 그 자체는 부동(inert)이고, 따라서 바람직한 실시예는 금빛 구체로 만들어진다.

본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 또 다른 특징은 원핵생물 및/또는 진행생물의 숙주 세포에서 발현할 수 있는 발현 조절 서열과 효과적으로 연결되어 있다. 상기 언급된 전사/번역 조절 인자는 유도성(inducible), 비-유도성, 구성적인(constitutive), 세포 주기가 조절된, 대사적으로 조절된 프로모터, 강화제(enhancers), 작동 유전자(operator), 잠재 요소(silencers), 억제제(repressors) 및 당업자에게 잘 알려진 다른 요소 및 구동(drive) 또는 다른 방법으로 유전자 발현을 조절하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 조절 인자는 지속 발현을 유도하는 조절 인자, 예를 들어 RNA 폴리머라아제 Ⅲ와 같은,예컨대 snRNA U6 또는 scRNA 7SK 유전자, 사이토메갈로바이러스 hCMV 조기발현유전자(immediate early gene), SV40 아데노바이러스의 초기 또는 후기 프로모터, 예를 들어 NBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, MMTV 또는 HIV로부터 유래된 바이러스성 프로모터 및 활성자(activator) 서열같은 것에 의해 전사된 프로모터와 같은 것을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 조절인자는 예를 들어, CUP-1 프로모터, 예를 들어 테트-온(Tet-on) 또는 테트-오프(tet-off) 시스템, lac 시스템, trp 시스템 안에서 사용된 tet-억제자, 조직 특이적 발현을 유도하는 조절 인자, 바람직하게는 미뢰 특이적 발현 예컨대, PLCβ2 프로모터 또는 거스트듀신 프로모터, 예를 들어 cdc2, cdc25C 또는 사이클린 A와 같은 세포 주기 특이적 발현을 유도하는 조절 인자; 또는 TAC 시스템, TRC 시스템, 주요 작동 유전자 및 파지 A(phage A)의 프로모터 부위, fd 피막 단백질(coat protein)의 조절 부위, 3-포스포글리세린 키나아제(3-phosphoglycerate kinase)의 프로모터, 산성 포스파타아제(acid phosphatase)의 프로모터 및 효모 α- 또는 a-교배 인자(a-mating factor)의 프로모터와 같은 유도성 발현을 가능하게 한다.

여기에서 사용된 "효과적으로 연결된(operatively linked)"은 유전적 구조물(genetic construct)에 편입된 것을 의미하며, 발현 조절 서열은 효과적으로 관심 코딩 서열의 발현을 조절한다.

마찬가지로, 본 발명의 방법에서 사용가능한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 마커(marker) 또는 리포터(reporter)로서 기능하는 부가적인 폴리펩티드 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 부분을 형성할 수 있다. 예를 들어 마커 또는 리포터 유전자는 β-락타마아제(β-lactamase), 클로람페니콜 아세틸트렌스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase; CAT), 아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase; ADA), 아미노글리코사이드 포스포트렌스퍼라아제(aminoglycoside phosphotransferase; neo^r, G418^r), 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase; DHFR), 하이그로마이신-B-포스포트렌스퍼라아제(hygromycin-B-phosphotransferase; HPH), 티미딘 키나제(thymidine kinase; TK), lacZ(β-갈락토시다아제를 암호화하는) 및 크산틴 구아닌 포스포리보실트렌스퍼라아제(xanthine guanine phosphoribosyltransferase; XGPRT)를 포함한다. 발명의 방법의 실천과 관련된 많은 표준 방법으로서, 당업자들은 부가적으로 유용한 시약, 예를 들어 마커 또는 리포터의 기능을 제공할 수 있는 부가적인 서열을 알고 있을 것이다. 일반적으로, 하이브리드 폴리펩티드는 첫 번째 부분 및 두 번째 부분; 하나 또는 그 이상의 hTAS2R14 폴리펩티드로 존재하는 첫 번째 부분 및 예를 들어, 상기 설명된 리포터 또는 Ig 불변영역(constant region) 또는 Ig 불변영역의 부분, 예컨대 IgG2a 중연쇄(heavy chain)의 CH2 및CH3 도메인으로 존재하는 두 번째 부분을 포함할 수 있다. 다른 하이브리드는 정제 및/또는 검출을 용이하게 하기 위한 항원성 태그(tag) 또는 His 태그를 포함할 수 있다. 재조합 핵산 분자는 또한 비상동성의 신호 서열과 효과적으로 연결된 hTAS2R14 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 신호 서열은 세포 안의 다른 구획으로 단백질을 유도할 수 있으며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 신호 서열은 결과 단백질의 분비를 용이하게 하는 서열이다.

본 발명의 또 다른 특징은 상기에서 기술한 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 유전적으로 설계된 숙주세포의 사용이다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 숙주 세포는 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 박테리아(예를 들어, E coli 및 B. subtilis)와 같은 원핵 세포; 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 효모(예를 들어, Saccharomyces 및 Pichia)와 같은 다루기 쉬운 진핵 세포; 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염시킬 수 있는 Hi5 세포의 Sf9과 같은 곤충 세포 시스템; 예를 들어, 플라스미드를 주입할 수 있는 제노퍼스 미숙란(Xenopus oocytes); 예를 들어, 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus; CaMV 또는 타바코 모자이크 바이러스; TMV)로 감염시킬 수 있거나 hTAS2R14 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환할 수 있는 식물 세포 시스템; 또는 예를 들어, 포유류 세포의 게놈(예를 들어, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터) 및 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터 및 우두 바이러스7.5K 프로모터) 또는 박테리아 세포(예를 들어, tet-온 또는 tet-오프 시스템에서사용된 것과 결합하는 tet-억제자)로부터 유래된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구조물로 형질전환될 수 있는 포유류 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, HEK293, VERO, Hela, MDCK, Wi38 및 NIH 3T3 세포)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 숙주세포로서 유용한 것은 플라스미드 벡터로 형질전환되거나 바이러스성 벡터로 감염된 포유류로부터 직접적으로 얻어진 일차 또는 이차 세포이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위해 사용된 각각의 벡터 및 숙주세포에 의존하며, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 염색체 또는 미토콘드리아성 DNA 안에 통합될 수 있거나 또는 예를 들어, 에피솜 모양(episomally)과 같은 비염색체로 유지될 수 있거나 또는 단지 세포 안에 일시적으로 포함되어질 수 있다.

바람직한 실시예로, 그러한 세포들에 의해 발현된 hTAS2R14는 기능적, 즉 하나 또는 그 이상의 쓴맛 분자와 결합하여 세포 안에서 활성 경로를 유발한다. 세포는 바람직하게는 포유류(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 말, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 염소, 토끼, 마우스, 랫트, 기니아피그, 햄스터 또는 저빌) 세포, 곤충 세포, 세균성 세포 또는 곰팡이(효모를 포함하여) 세포이다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 폴리펩티드는 여기에 기술된 모든 것 및 이러한 폴리펩티드의 기능적 단편들을 포함한다. "폴리펩티드" 및 "단백질"은 서로 바꾸어 사용될 수 있으며, 길이 또는 단백질의 번역 후 수식(posttranslational modification)에 상관없는 어떠한 아미노산의 펩티드-결합 사슬을 의미한다. 여기에서 사용된 것으로, hTAS2R14의 기능적 단편은 전장 hTAS2R14 보다 짧지만 여기에서 확인된 쓴맛 물질 중의 하나에 의해서 자극되는 전장 hTAS2R14의 적어도 20%(예를 들어, 적어도: 20%; 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99.5%; 또는 100% 또는 그 이상)의 능력을 가진다. 결합 검정 및 쓴맛 물질은 하기에 더욱 상세하게 설명되어진다. 폴리펩티드는 또한 전장 hTAS2R14 폴리펩티드 또는 언급되지 않은(unrelated) 아미노산 서열과 융합된 그것의 기능적 단편을 모두 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 언급되지 않ㅇ은 서열은 부가적인 기능적 도메인 또는 시그널 펩티드일 수 있다. 시그널 펩티드는 하기의 예시에 의하여 더욱 상세하게 설명된다.

폴리펩티드는 상기에 설명된 것 중의 어떠한 것도 될 수 있지만 50(예를 들어, 많아야 50, 45, 35, 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1)개의 보존적 치환(conservative substitutions)보다 많지 않아야 한다. 보존적 치환은 전형적으로 하기의 그룹: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 쓰레오닌; 라이신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신의 안에 치환을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 보존적 치환을 가지는 폴리펩티드에 요구되는 것은 각각의 쓴맛 물질에 의해 자극되는 전장 hTAS2R14의 능력의 적어도 20%(예를 들어, 적어도: 20%; 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99.5%; 또는 100% 또는 그 이상)를 가지는 것이다.

본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 폴리펩티드의 단편 및 폴리펩티드는 예를 들어, 생체 내에서(in vivo) 적절한 폴리펩티드의 존속을 용이하게 하기 위해 아미노 및/또는 카르복시-터미널 말단에 차단제(blocking agents)를 추가함으로써 생체 내에서의 사용을 위해 변경되어질 수 있다. 이것은 세포내에서 흡수(cellular uptake)되기 전에 프로테아제에 의해서 분해되는 경향이 있는 펩티드 말단과 같은 상황에서 유용할 수 있다. 이러한 차단제는 부가적으로 투여될 펩티드의 아미노 및/또는 카르복실 말단 잔기에 첨가될 수 있는 관련되거나 관련되지 않은 펩티드 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 이것은 펩티드의 합성 동안에 화학적으로 또는 당업자가 잘 알고 있는 방법인 재조합 DNA 기술에 의해 수행될 수 있다.

여기에서 확인된 쓴맛 수용체의 길항제 또는 작용제는 각각의 주어진 쓴맛 수용체의 특정 자극 및 그것을 중화시키는 물질의 확인이 매우 중요하다.

본 발명의 관점에서 상기 용어 "접촉"은 폴리펩티드 또는 숙주세포와 길항제 및/또는 작용제 사이의 어떠한 상호작용을 의미하며, 그로써 적어도 2개의 구성요소 중 하나는 액체상(liquid phase), 예를 들어 용액 또는 현탁액에서 서로 따로 존재할 수 있거나 고체상(solid phase), 예를 들어 본질적으로 평평한 표면 또는 입자, 진주 또는 그와 같은 형태의 것과 결합할 수 있다. 바람직한 예로 다수의 상이한 화합물은 예를 들어, 화합물 라이브러리 칩(compoud library chip)과 같은 고체상에 고정되고, 본 발명의 단백질은 그 후 칩과 접촉된다. 또 다른 바람직한 예로, hTAS2R14로 암호화된 폴리뉴클레오티드 또는 세포 표면에서 hTAS2R14 쓴맛 수용체를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 유전학적으로 제조된 숙주 세포는 작은 용기, 예를 들어 마이크로 플레이트(microtitre plates)에서 다양한 화합물들과 각각 접촉된다.

상기 용어 "그들의 기능적 유도체"는 작용제를 말하며, 그들은 화학적 변경에 의하여 각각의 바람직한 작용제, 예를 들어 쓴맛 물질로부터 유도된 것이며, 만약 각각의 변경되지 않은 쓴맛 물질과 비교한다면 쓴맛 수용체 활성의 적어도 20%(예를 들어, 적어도: 20%; 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99.5% 또는 100% 또는 그 이상)를 이끌어낸다. 화학적 변경은 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 두개, 세개 또는 네개의 신규한 측쇄 또는 잔기의 도입 또는 예를 들어, H; 선형 또는 측쇄 알킬, 특히 하부 알킬(C₁, C₂, C₃, C₄ 및 C₅, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸 또는 이소펜틸); 치환된 선형 또는 측쇄 알킬, 특히 하부 치환된 알킬; 선형 또는 측쇄 알케닐, 특히 하부 알케닐(C₂, C₃, C₄ 및 C₅, 예를 들어 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 이소-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐); 치환된 선형 또는 측쇄 알케닐, 특히 하부 치환된 알케닐; 선형 또는 측쇄 알키닐, 특히 하부 알키닐(C₂, C₃, C₄ 및 C₅); 치환된 선형 또는 측쇄 알키닐, 특히 하부 치환된 알키닐; 선형 또는 측쇄 알카놀, 특히 하부 알카놀(C₁, C₂, C₃, C₄ 및 C₅); 선형 또는 측쇄 알카날, 특히 하부 알카날(C₁, C₂, C₃, C₄ 및 C₅, 예를 들어 COH, CH₂COH, CH₂CH₂COH); 아릴, 특히 페닐; 치환된 아릴, 특히 치환된 헤테로아릴; 알킬아릴, 특히 벤질; 치환된 알킬아릴, 특히 치환된 벤질; 알킬헤테로아릴; 치환된 알킬헤테로아릴; 아미노알킬(C₁, C₂, C₃, C₄ 및 C₅, 예를 들어 -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂); 치환된 아미노알킬; 아미노케톤, 특히 -NHCOCH₃; 치환된 아미노케톤; 아미노아릴, 특히 -NH-Ph; 치환된 아미노아릴, 특히 치환된 -NH-Ph; CN; NH₂; 할로겐, 특히 F, Cl 및 Br; NO₂; OH; SH; NH; CN 또는 COOH 그룹의 도입 또는 교환과 같은 하나 또는 그 이상의 기능적 그룹의 교환을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

hTAS2R14 쓴맛 수용체에 결합하는 바람직한 화합물은 화학식(Ⅰ)에 의해 정의된다:

시험관내(in vitro)에서 연구된 이 화합물들은(하기 표1을 보라) 하기에 상세하게 설명된다. 이 연구로부터 특정한 추론이 hTAS2R14 수용체의 활성에 대한 화합물의 친화력에 관해서 이끌어내질 수 있다. R₁은 바람직하게는 수소를 의미하지만, 그것은 또한 R₁은 치환기를 나타내는 것이 아니라 음으로 하전된 "O" 잔기의 자유 원자가일 수 있고, 그것의 변화는 알칼리 또는 알칼리 금속 이온, 바람직하게는 Na⁺, K⁺, Li⁺, Mg² ⁺ 또는 Ca² ⁺에 의해 만족된다. 따라서, 바람직한 실시예에서 화학식 (Ⅰ)에 따르는 화합물은 hTAS2R14 기능을 작동시키거나(agonizing) 중화시키는데(antagonizing) 사용된다.

이 화학식에서 R₂, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 수소, C₁-C₁₀ 알킬은 적당하게는 측쇄, 선형 또는 고리형일 수 있고, 특히 바람직하게 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸 또는 이소펜틸 잔기이며; 하부 알케닐 잔기는 바람직하게는 두개, 세개, 네개 또는 다섯개의 탄소원자를 가지고; 하부 알키닐 잔기는 바람직하게는 두개, 세개, 네개 또는 다섯개의 탄소원자를 가지고; 하부 알콕시(C₁-C₁₀ 알콕시)는 바람직하게는 메톡시, 에톡시, 프로폭시 또는 부톡시이고, 이는 바람직한 실시예에서 F, Cl, Br, NH₂, NO₂, OH, SH, NH, CN, 아릴, 헤테로아릴, COH 또는 COOH 그룹으로 더 치환될 수 있으며; 헤테로 아릴, 예를 들어 벤조퓨란 및 쿠마린; 아릴, 예를 들어 페닐, 나프틸; F, Cl, Br, NH₂, NO₂, OH, SH, NH, CN, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, COH 또는 COOH 그룹을 의미할 수 있다. 또 다른 실시예에서 R₂ 및 R₃ 또는 R₃ 및 R₄ 잔기는 부가적인 C 및/또는 헤테로원자, 바람직하게는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10원자 고리 구조를 유도하는 고리구조를 촉진하는 N, S 또는 O, 바람직하게는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, 바람직하게는 5 또는 6원자 고리 구조와 함께 형성될 수 있다. R2 및 R3 또는 R3 및 R4에 의해 결합된 하나 또는 그 이상의 고리는 위에서 설명한대로 그들 자신이 치환될 수 있다.

잠재적인 길항제 또는 작용제의 중화 효과를 측정한 후와 적어도 두개의 상이한 잠재적인 길항제 또는 작용제의 쓴맛의 감소 또는 증가가 측정된 후의 단계로서, 적어도 하나의 잠재적인 길항제 또는 작용제는 예를 들어, 알려진 작용제 단독으로 접촉할 때와 비교하여 측정된 칼슘의 세포내 방출의 감소를 바탕으로 선별될 수 있다.

이와 같이 선별된 (잠재적인) 길항제 또는 작용제는 그 후 바람직한 실시예로 그 이후의 단계에서 변경된다. 변경은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해서 영향을 받을 수 있으며, 이것은 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 두 개, 세 개 또는 네 개의 신규한 측쇄 또는 잔기 또는 예를 들어 할로겐, 특히 F, Cl 또는 Br의 교환 또는 도입; 바람직하게는 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸 또는 이소-펜틸잔기와 같은 하나 내지 다섯개의 탄소원자를 가지는 하부 알킬 잔기의 교환 또는 도입; 바람직하게는 두개, 세개, 네개 또는 다섯개의 탄소 원자를 가지는 하부 알케닐 잔기; 바람직하게는 두 개, 세개, 네개 또는 다섯개의 탄소 원자를 가지는 하부 알키닐 잔기, 이는 바람직한 실시예에서 F, Cl, Br, NH₂, NO₂, OH, SH, NH, CN, 아릴, 헤테로아릴, COH 또는 COOH 그룹으로 더 치환된 것일 수 있으며; 또는 예를 들어, NH2, NO2, OH, SH, NH, CN, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, COH 또는 COOH 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 잔기의 도입을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

이와 같이 변경된 (잠재적인) 길항제 및 작용제는 그 후 본 발명의 방법, 즉 폴리펩티드 그 자체 또는 숙주세포에서 발현된 폴리펩티드와 접촉되어 개별적으로 테스트되며, 이것은 확인된 작용제 또는 그들의 유도체 중의 하나와 부수적으로 또는 단계(1) 후에 접촉되기 전에 변경된 작용제 또는 길항제에 의해서 쓴맛 수용체 활성의 순차적인 활성화가 측정된다. hTAS2R14 단백질 기능의 이러한 효과는 예를 들어, 세포내 칼슘 방출 매개자에 의해서 측정될 수 있다. 만일 길항제 또는 작용제를 선별하고, 화합물을 변경하고, 폴리펩티드 또는 숙주세포와 길항제 또는 작용제를 접촉시키는 단계 및 쓴맛 수용체 활성의 활성화를 측정하는 단계가 필요하다면, 필수적으로 세 번 또는 어떤 주어진 수만큼 반복될 수 있다. 상기 설명된 방법은 또한 길항제 또는 작용제의 "직접적인 진화(direct evolution)"라 부르고, 따라서 그것은 변경과 선별을 포함하는 다중의 단계를 포함하고, 따라서 화합물을 중화시키거나 작용시키는 것은 개개의 특성 예를 들어, 특히 칼슘의 세포내 방출을 저해 또는 자극하는 hTAS2R14의 활성을 저해, 활성 또는 조절하는 그들의 능력에 대 하여 그들의 능력을 최적화하는 "진화적인(evolutionary)" 방법에 의해 선별된다.

수용체를 암호화하는 cDNAs의 발현을 위하여, 하나의 전형적인 서브클론 수용체 cDNA를 전사를 유도하기 위한 강력한 프로모터, 전사/번역 터미네이터 및 번역 개시를 위한 리보솜-결합 사이트를 포함하는 발현벡터에 넣는다. 적합한 세균성 프로모터는 당업계에 잘 알려진, 예를 들어 E. coli, Bacillus sp., 및 Salmonella 및 이러한 발현 시스템을 위한 키트가 상업적으로 이용가능하다. 진핵 발현 벡터는 예를 들어, 아데노바이러스성 벡터, 아데노-관련 벡터 또는 레트로바이러스성 벡터일 수 있다.

게다가 프로모터, 발현 벡터는 전형적으로 숙주세포에서 수용체를 암호화하는 핵산의 발현에 필수적인 모든 부가적인 인자를 포함하는 전사 유닛(transcription unit) 또는 발현 카세트(expression cassette)를 포함한다. 따라서 전형적인 발현 카세트는 수용체를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된(operatively linked) 프로모터 및 전사체의 효과적인 폴리아데닐화(polyadenylation)에 필수적인 시그날, 리보솜 결합 사이트 및 번역 종결을 포함한다. 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 전형적으로 재조합 수용체의 효과적인 세포-표면 발현을 촉진하기 위하여 랫트의 소마토스타틴-3(Somatostatin-3) 수용체 서열의 N-말단 45 아미노산과 같은 막-표적 시그날(membrane-targeting signal)과 연결될 수 있다. 카세트의 부가적인 요소는 예를 들어, 강화제가 포함될 수 있다.

카세트의 발현은 또한 효과적인 종결을 제공하기 위한 구조적 유전자의 하부에 전사 종결 부위(transcription termination region)을 포함해야 한다. 종결 부 위는 프로모터 서열로서 동일한 유전자로부터 얻어지거나 상이한 유전자로부터 얻어질 수 있다.

세포 안으로 유전 정보를 운반하는데 사용된 각각의 발현 벡터는 특별히 중요하지는 않다. 진핵 또는 원핵 세포에서 발현을 위해 사용된 어느 통상적인 발현 벡터라도 사용될 수 있다. 표준 세균성 발현 벡터는 플라스미드에 기초한 pBR322, pSKF, pET23D와 같은 플라스미드 및 GST 및 LacZ와 같은 융합 발현 시스템을 포함하지만 당업계에서 통상의 지식을 가진자가 많이 알고 있는 것들이 유용하게 사용될 수 있다.

진핵성 바이러스로부터 조절 인자를 포함하는 발현 벡터는 전형적으로 원핵 발현 벡터, 예를 들어 SV20 벡터, 유두종 바이러스 벡터 및 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)로부터 유래된 벡터가 사용된다. 또 다른 전형적인 원핵 벡터는 pMSG, pAV009/A⁺, pMTO10/A⁺, pMAMneo^-5, 바큘로바이러스 pDSVE, pcDNA3.1, pIRES 및 진핵 세포에서 발현을 위해 효과적으로 나타나는 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 생쥐의 유선종양 바이러스(murine mammary virus) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터, 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터 또는 다른 프로모터의 지배하에서 단백질의 발현을 가능하게 하는 어느 다른 벡터를 포함한다.

몇몇의 발현 시스템은 티미딘 키나아제(thymidine kinase), 하이그로마이신 B 트렌스퍼라아제(hygromycin B phosphotransferase) 및 디하이드로폴레이트 리덕 타아제(dihydrofolate reductase)와 같은 유전자 증폭을 제공하는 마커를 가진다.

발현 벡터 안에 전형적으로 포함된 인자는 또한 E. coli에서 작동하는 레플리콘(replicon), 재조합 플라스미드를 가지는 박테리아의 선별을 가능하게 하기 위한 약제 내성을 암호화하는 유전자, 및 진핵생물의 서열 삽입을 가능하게 하기 위한 플라스미드의 비필수 부위에서의 독특한 제한 부위를 포함한다. 각각의 약제 내성 유전자의 선별은 결정적인 것은 아니며, 당업계에 알려져 있는 어느 많은 약제 내성 유전자라도 적합하다. 원핵생물의 서열은 만일 필요하다면 진핵 세포에서 DNA의 레플리콘을 방해하지 않는 정도에서 임의대로 선택된다.

표준 트렌스펙션 방법은 다수의 수용체를 발현하는 세균성, 포유류, 효모 또는 곤충 세포주를 생산하기 위해 사용될 수 있으며, 그 후 표준 기술을 이용하여 정제된다.

숙주 세포에 외부 뉴클레오티드 서열을 도입하기 위한 어떤 잘 알려진 방법이 사용될 수 있다. 이것들은 인산칼슘 트렌스펙션, 폴리브렌(polybrene), 원형질체 융합(protoplast fusion), 전기 천공법(electroporation), 리포솜, 미량주사법(microinjection), 플라스마 벡터, 바이러스성 벡터 및 숙주 세포 안에 클론된 지노믹 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외부 유전 물질을 도입하기 위한 어떤 다른 잘 알려진 방법의 사용을 포함한다. 그것은 단지 수용체 발현이 가능한 숙주 세포 안으로 적어도 하나의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있게 사용된 특별한 유전공학 기술이 필요하다.

발현 벡터가 세포 안으로 도입된 후에, 트렌스펙션된 세포는 수용체의 발현 에 유리한 조건 하에서 배양될 수 있으며, 표준 기술을 사용하여 배양물로부터 회수된다. 예를 들어 세포는 침전 및 크로마토그래피 단계에 노출되기 전에 기계적으로 또는 삼투압 충격(osmotic shock)에 의해 파쇄(burst open)될 수 있고, 각각의 재조합 물질에 의존할 수 있는 세포의 천연상태 및 서열이 회수되어진다. 대안적으로, 재조합 단백질은 재조합 세포가 배양된 배양액으로부터 회수될 수 있다.

여기에 설명된 수용체의 활성은 예를 들어 리간드 결합, 2차 전달자(secondary messengers; 예를 들어, cAMP, cGMP, IP₃, DAG 또는 CA² ⁺) 이온 플럭스, 인산화반응 수준, 전사 수준, 신경전달물질의 농도 및 그와 같은 기능적, 화학적 및 신체적 효과를 측정하기 위한 다양한 시험관내(in vitro) 및 신체내(in vivo) 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 검정은 수용체의 억제제를 테스트하기 위해 본 발명의 방법에서 사용된다.

테스트 화합물로 처리된 샘플 또는 분석물은 조절의 범위를 시험하기 위해 테스트 화합물로 처리되지 않은 대조군 샘플과 비교될 수 있다. 알려진 작용제 및 길항제를 가지거나 가지지 않고 테스트 화합물로 처리되지 않은 대조군 샘플은 100의 상대 수용체 활성치로 정해진다. 수용체 활성의 저해는 수용체 활성치가 대조군과 비례하여 낮을 때 이루어지고, 반대로 수용체의 활성은 활성치가 대조군과 비례하여 높을 때 증가된다.

수용체의 기능에 있어서 테스트 화합물의 효과는 상기에 기술된 매개 변수 중의 하나를 검사함으로써 측정될 수 있다. 수용체 활성에 영향을 주는 어떤 적합 한 생리학적인 변화는 본 발명의 수용체에 있어 테스트 화합물의 영향을 평가하는데 사용될 수 있다. 기능적인 결과가 곤충 세포 또는 동물을 사용해서 측정될 때, 이것은 Ca² ⁺, IP₃ 또는 cAMP와 같은 세포내 2차 전달자의 변화와 같은 다양한 효과를 측정할 수 있다.

G-단백질 결합 수용체의 바람직한 검정은 수용체 활성을 기록하기 위하여 이온 민감성 염색제로 로딩한 세포를 포함한다. 조절 화합물의 확인을 위한 검정에서, 세포질 또는 막 전압(membrane voltage)에서 이온 농도의 변화는 각각 이온 민감성 또는 막 전압 형광 표지자를 사용하여 관찰될 수 있다. G-단백질 결합 수용체, G_α15 및 G_α16 및 키메라 G-단백질과 같은 무차별적인 G-단백질은 선택 검정(assay of choice)에서 사용될 수 있다(예를 들어, Wilkie et al. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:10049-10053을 보라). 이러한 무차별적인 G-단백질은 수용체의 넓은 범위의 결합을 가능하게 한다.

수용체 활성화는 전형적으로 다음의 예를 들어, IP₃와 같은 2차 전달자를 증가시키고 세포내 저장소의 칼슘 이온을 방출하는 세포내 사건을 개시한다. 몇몇의 G-단백질 결합 수용체의 활성화는 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)의 포스포리파아제 C-매개 가수분해(phospholipase C-mediated hydrolysis)를 통한 이노시톨 트리포스페이트(inositol triphosphate)(1133)의 형성을 자극한다(Berridge & irvine (1984) Nature 312: 315-21). 차례로 IP₃는 세포내 칼슘 이온 저장소로부터 의 방출을 자극한다. 따라서, 세포질 칼슘 이온 농도의 변화 또는 IP₃와 같은 2차 전달자의 농도 변화는 G-단백질 결합 수용체 기능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 G-단백질 결합 수용체를 발현하는 세포는 세포내 저장소 및 이온 채널의 활성화의 결과로서 증가된 세포질 칼슘 농도를 보일 수 있고, 이 경우에 그것은 비록 필수적이지는 않더라도, 임의적으로 EGTA와 같은 킬레이트 시약이 부가된 칼슘이 제외된 완충액에서의 검정을 수행하기 위하여, 내부 저장소로부터 방출된 칼슘으로부터 나타나는 형광 반응을 구별하는데 이상적일 수 있다.

바람직한 실시예에서, 수용체 활성은 포스포리파아제 C 신호전달 경로의 수용체와 연결하는 G_α15 및 G_α16 또는 키메라 G-단백질과 같은 무차별적인 G-단백질과 함께 비상동성 세포에서 hTAS2R14 수용체의 발현에 의해 측정된다. 대안적으로 세포주는 HEK-293이지만, CHO 및 COS 세포와 같은 다른 포유류 세포 또한 바람직하다. 맛의 신호전달의 조절은 수용체와 관련된 분자의 투여를 통하여 수용체 신호전달 경로의 조절에 대하여 변하는 세포내 Ca² ⁺ 농도의 변화를 측정함으로써 검정된다. Ca² ⁺ 농도의 변화는 임의대로 형광 Ca² ⁺표시염색제 또는 형광 이미지화(fluorometric imaging)를 사용하여 측정된다.

신호 분자(signalling molecule)의 활성과 잠재적인 작용제 또는 길항제에 대한 그것의 활성의 증가 또는 감소는 위에서 언급한 쓴맛 수용체 활성의 확인에 관하여 측정될 수 있다. 각각 나타난 활성의 증가 또는 감소 비율은 길항제 또는 작용제로서 적합해야만 하여, 필요한 변경을 가하여 적용한다. 부가적으로 상기 용어 "접촉"은 위에서 언급된 의미를 갖는다. 바람직하게는 상기 신호 분자 및/또는 무차별적인 G-단백질은 세포 안으로 도입되어야 한다. 바람직한 세포형은 하기에 나타내었다.

또 다른 실시예로, 수용체의 리간드-결합 도메인은 리간드 결합을 검정하기 위하여 시험관내(in vitro) 가용성 또는 고체 상태 반응에 사용될 수 있다. 수용체에서 리간드 결합, 또는 수용체의 도메인은 용액에서, 지질 단일층(lipid monolayer) 또는 소포에서 고상(solid phase)에 부착된 이중층 막(bilayer membrane)에서 테스트될 수 있다. 그것에 의하여, 수용체 또는 도메인의 조절자(modulator)의 결합은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있는 예를 들어, 형광, 흡수 또는 반사 지표(index)와 같은 분광학적 특성 또는 유체 역학(예를 들어, 형태), 크로마토그래피 또는 용해도 특성의 변화를 사용하여 관찰될 수 있다.

수용체의 조절자로서 테스트된 화합물은 어떤 작은 화학 화합물, 또는 단백질, 당, 핵산 또는 지질과 같은 생물학적 물질일 수 있다. 전형적으로, 테스트 화합물은 작은 화학 분자일 수 있다. 본질적으로 어떤 화학 화합물이라도 본 발명의 검정에서 잠재적인 조절자 또는 리간드로서 사용될 수 있지만, 각각의 수용체의 리간드 특이성에 대한 지식은 당업자가 관심 화합물의 효과적인 선별을 위해 사용할 수 있다. 검정은 검정 단계를 자동화하고 검정을 위한 어떤 알맞은 소스로부터 화합물을 제공함으로써 큰 화학 라이브러리를 선별하기 위해 설계될 수 있고, 그것은 전형적으로 평행선상에 있다(예를 들어, 로봇을 이용하는 검정에서 마이크로타이터 플레이트 상의 마이크로타이터의 형태). 당업자는 많은 화학 화합물 라이브러리의 제공자가 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

고효율(high throughput) 선별 방법으로 사용될 수 있는 검정은 다수의 잠재적 치료상 물질 또는 미각자극물질 화합물(잠재적 리간드 화합물)을 포함하는 조합 화학 또는 펩티드 라이브러리 제공을 포함한다. 이러한 라이브러리는 그 후 바람직한 특유의 활성을 나타내는 그들의 라이브러리 구성원(각각의 화학 종 또는 서브클래스)을 확인하기 위하여 상기에서 기술된 하나 또는 그 이상의 검정으로 선별된다. 따라서 확인된 화합물은 최종 산물을 위한 조절자를 더욱 개발하기 위해 선도물질(lead compounds)로서 제공될 수 있거나, 그 자체가 실질적인 조절자로서 사용될 수 있다.

조합 화학 라이브러리(combinational chemical library)는 시약과 같은 다수의 화학 "기본 요소(building blocks)"의 조합에 의해 화학적 합성 또는 생물학적 합성 모두에 의해 생성된 다양한 화학 화합물의 집합이다. 예를 들어, 폴리펩티드 라이브러리와 같은 선형 조합 화학 라이브러리는 주어진 화합물의 길이(즉, 폴리펩티드 화합물의 아미노산 수)에 대한 모든 가능한 방법으로 일련의 화학 기본 요소(아미노산)의 조합에 의해 형성된다. 다수의 화학 화합물은 이러한 화학 기본 요소의 조합 혼합물을 통해서 합성되어질 수 있다.

조합 화학 라이브러리의 제조 및 선별은 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있고 여기에서 더 명시할 필요는 없다.

본 발명의 고효율 검정에서, 검정은 하루 안에 수천개의 상이한 조절자 또는 리간드를 선별하는 것이 가능하다. 특히, 마이크로타이터 플레이트의 각 웰은 선별된 잠재적 조절자에 대한 각각의 검정을 수행하는데 사용될 수 있고, 또는 만약 농도 또는 배양 시간 효과가 관찰될 수 있다면 각 5-10 웰은 단일 조절자를 테스트할 수 있다. 따라서, 단일 표준 마이크로타이터 플레이트는 약 100(예를 들어, 96)개의 조절자를 검정할 수 있다. 만일 1536 웰 플레이트가 사용된다면, 단일 플레이트는 약 100 내지 약 1500개의 상이한 화합물로부터 쉽게 검정될 수 있다. 그것은 하루 당 여러 개의 상이한 플레이트를 검정할 수 있으며; 약 6,000-20,000 상이한 화합물을 선별하기 위한 검정은 본 발명의 조직화된 시스템을 사용하는 것이 가능하다.

여기에서 상기 설명된 검정 기술에 의해 발견된 선도물질, 또는 그러한 선도물질로부터 형성된 개발 화합물은 쓴맛을 조절하기 위하여 인간 피험자에게 직접적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 이러한 화합물은 예를 들어 동물 식품을 포함한 식품 및 음료, 조제약 또는 건강식 또는 동종요법의 조제품과 같은 경구적으로 섭취할 수 있는 조제품의 다른 성분으로 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 특징은 hTAS2R14의 길항제 또는 작용제의 확인을 위한 상기 기술된 과정의 단계 및 식료품의 제조에서 사용된 확인된 화합물 또는 식료품의 길항제 또는 어떤 전구 물질 또는 첨가제를 혼합하는 그 이후의 단계를 포함하는 식료품의 제조에서 사용된 어떤 전구물질 또는 첨가제 또는 식료품의 제조를 위한 방법이다.

쓴맛은 종종 불쾌한 쓴맛을 가지는 약제를 경구적으로 투여할 때 일어나는 특유의 문제이다. 특히 노인, 아이 및 만성적 질환을 가진 환자에게서, 이러한 맛은 치료요법에 대한 승낙의 결여를 야기할 수 있다. 게다가 수의학에서 쓴맛을 내는 약제의 경구 투여의 적용은 문제의 여지가 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 특징은 hTAS2R14의 길항제 또는 작용제의 확인을 위한 단계 및 약제학적으로 허용가능한 형태의 활성 물질을 가지는 화합물 또는 길항제를 제조하는 그 이후의 단계를 포함하는 건강식 또는 약제학적 조성물의 제조 방법이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 특징은 본 발명의 방법에 따라 제조된 식료품의 제조에서 사용된 식료품, 특히 동물 식품, 또는 어떤 전구 물질 또는 첨가제이다.

또한 본 발명의 방법에 따라 제조된 건강식 또는 약제학적 조성물 및 적어도 하나의 활성 물질 및 임의적인 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조제를 포함한다.

경구적으로 섭취할 수 있는 화합물의 양은 인간 피험자에서 효과적인 반응을 나타내기에 충분해야만 하며, 각각의 맛 조절자의 효능 및 각각의 화합물의 투여에 수반되는 어떤 해로운 부작용의 존재, 특징 및 범위에 의해 결정되어질 것이다.

본 발명의 다른 특징은 1,8-나프탈데히딕 산, 1-나프토에산, 1-니트로나프탈렌, 피크로틴, 피크로톡시닌, 피페로닉산, 벤조산나트륨, (-)-α-튜존, 파테놀리드, 허볼리드 A, 허볼리드 D 아세테이트, 히드록실-8α-파테놀리드, 슈도-아르탑신 및 쓴맛을 증가시키기 위한 그들의 기능적 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 hTAS2R14 활성 작용제의 사용이다.

본 발명의 다른 특징은 1,8-나프탈데히딕 산, 1-나프토에산, 1-니트로나프탈 렌, 피크로틴, 피크로톡시닌, 피페로닉산, 벤조산나트륨, (-)-α-튜존, 파테놀리드, 허볼리드 A, 허볼리드 D 아세테이트, 히드록실-8α-파테놀리드, 슈도-아르탑신 및 그들의 기능적 유도체에 의해 유도될 수 있는 쓴맛의 감소를 위한 본 발명의 방법으로 확인된 hTAS2R14의 길항제의 사용이다.

하기의 도면 및 실시예는 단지 본 발명에 대한 설명이며 어떤 방법으로 추가된 청구항에 의해 나타난 것으로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지는 않는다.

도1은 상이한 인간 조직에서의 hTAS2R14 유전자 발현의 RT-PCR 분석이다.

A) hTAS2R14에 특이적인 PCR 산물

B) 양성 대조군으로서 사용된 GAPDH-특이적인 올리고뉴클레오티드에 의해 검출된 cDNA의 존재

M : 분자량 표준

1 : 유곽유듀(circumvallate papilla)

2 : 맛을 느낄 수 없는 유두(papillae)를 포함한 혀상피(lingual epithelium)

3 : 침샘(salivary gland)

4 : 소뇌(cerebellum)

5 : 신장

6 : 정소(testis)

7 : 유곽유두-RT(오염된 지노믹 DNA를 검토하기 위해 생략된 역전사효소)

8 : 혀상피-RT

9 : 침샘-RT

10 : 소뇌-RT

11 : 신장-RT

12 : 정소-RT

13 : H₂O 대조군

도2는 인간 유곽유두에서 hTAS2R14 mRNA의 인시츄(in situ) 혼성화이다. 인간 유곽유두의 20㎛ 크라이오스태트 횡단면(cryostat cross section)은 디곡시제닌(digoxigenin) 표지된 안티센스(A) 또는 센스(B) 리보프로브로 혼성화된다. 미뢰는 원형이다. 스케일 바 = 50㎛.

도3은 피크로톡시닌 및 1-나프토에산의 용량반응곡선(Dose-response curves)이다. 1-나프토에산(A) 및 피크로톡시닌(B)의 상이한 농도는 hTAS2R14로 트렌스펙션된 세포에 적용되었다. 용량반응곡선과 피크로톡시닌 및 1-나프토에산의 효과에 대응하는 EC₅₀ 값은 시그마 플롯(sigma plot)을 사용하여 측정되었다.

hTAS2R14 의 조건부 발현

랫트의 소마토스타틴 수용체 3 및 카르복시 말단 HSV-태그의 아미노산 1-45에 대응하는 아미노 말단 전파 태그(export tag)로 보충된 hTAS2R14의 cDNA는 리포 펙타민2000(Invitrogen)을 사용하여 키메라 G-단백질 서브유닛 Gα16gust44(Ueda T. et al. (2003) J. Neurosci. 23: 7376-7380)을 안전하게 발현하는 HEK-293T 세포 안으로 일시적으로 트렌스펙션되었다. 자동화된 형광 영상판 판독기(automated fluorometric imaging plate reader, Molecular Devices)를 사용한 리간드 선별은 상기 기술된 것으로 트렌스펙션된 후 24-32 시간에 완료되었다(Bufe B. et al. (2002) Nature Genetics 32: 397-401). 간단히 말해: 세포는 140mL NaCl, 5mM KCl, 2.5mM CaCl₂, 10mM Hepes, 10mM 글루코스 및 2.5mM 프로베니시드(Probenicide), pH 7.4의 HBS(hepes-buffered saline)에서 37℃ 1시간 동안 4㎛ FLUO-4/AM(Molecular Probes) 및 0.04% Pluronic F-127(Molecular Probes)으로 로딩되었다. 그 후, 세포는 자동화된 판 세척기(automated plate washer; Denley Cell-wash, Labsystems)에 의해 HBS에서 부드럽게 세척되고, FLIPR(Molecular Devices)로 이동되었다. FLIPR은 아르곤레이저 여기원(argon laser excitation source), 96-웰 피페터(pipettor) 및 전자결합소자 카메라(Charged Coupled Device imaging camera)를 이용한 검출 시스템을 통합한다. 96 웰로부터의 형광 방출은 488nm(F488)에서 여기 후 510nm의 방출파장에서 관찰되었다. 형광 데이타는 자극 전 1분 및 자극 후 10분에 수집되었다. 데이타는 작용제 자극 매회 6초 전 및 매회 1초 후에 수집되었다. C1 용액(130mM NaCl, 5mM KCl, 10mM Hepes, 2mM CaCl₂, 10mM 글루코스(pH 7.4) 및 최종 DMSO의 농도가 1%(v/v)를 넘지 않는 DMSO)의 적절한 혼합물에 용해된 3 x 농축된 작용제(Sigma) 5μl는 100μl HBS를 포함하는 웰에 조직화된 96-웰 피페터에 의해 2초 안에 옮겨졌다. 작용제 반응은 형광 피크의 폭을 사용하여 정량화되었다. 동일한 수용체를 발현하는 세포를 포함한 5개 웰 및 동일한 자극물을 받아들인 웰의 반응이 평균화되었다. 데이타는 3중으로 수행된 2개의 독립된 실험으로부터 수집되었다. 용량반응곡선은 관찰된 최고의 반응으로 표준화되었다.

인간 조직의 RT- PCR 분석

인간 성곽유두(vallate papillae) 및 유두가 없는 혀상피의 표본은 지원자의 동의하에 획득되었고, 지역 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 추출되었다. 인간 소뇌, 침샘, 신장 및 정소로부터 얻어진 총 RNAs는 BD 바이오사이언스 클론테크(BD biosciences Clontech)로부터 구입되었다. RNAs는 RNAse가 없는 DNAse Ⅰ(Invitrogen)으로 분해되었고, 스마트 cDNA 합성 키트(smart cDNA synthesis kit, Clontech)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. hTAS2R14의 증폭을 위해서 R14_for 5'-GGCCAATTGGAATTCATGGGTGGTGTCATAAAGAGCATATTTACA-3'(SEQ ID NO.3)의 및 R14_rev 5'-TCCTCAATTGTCATCAGCGGCCGCCAGATGATTCTCTAAATTCTTTGT-3'(SEQ ID NO.4) 올리고뉴클레오티드가 사용되었다. 대조군으로 cDNA GAPDH가 GAPDH_for 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'(SEQ ID NO.5) 및 GAPDH_rev 5'-TCCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(SEQ ID NO.6) 올리고뉴클레오티드로 증폭되었다. 음성 대조군을 위해 역전사효소는 cDNA 합성 동안에 생략되었다. hTAS2R14의 PCR 조건은 : 94℃에서 5분 전처리(predenaturation), 64℃에서 1분, 72℃에서 1.5분, 94℃에서 0.5분 3 사이클, PCR 산물의 연마(polishing)를 위하여 72℃에서 2.5분, 94℃에서 0.5분, 72℃에서 15간의 35 사이클을 따랐다. GAPDH 증폭을 위해 하기의 프로토콜이 사용되었다 : 94℃에서 5분, 28 사이클; 58℃에서 45초, 72℃에서 45초, 94℃에서 30초, 58℃에서 5분, 72℃에서 10분이다.

인간 성곽유두의 인시츄 (in situ) 혼성화

인시츄 혼성화는 이전에 주로 다루어졌다(Behrens et al. (2000) Europ. J. Neurosci. 12: 1372-1384). 간단히 말하면 : 인간 혀의 유곽유두의 20μm 의 박편이 처리되었고 양이온으로 하전된 유리 글라스에 올려졌다. 혼성화를 하기 전에 박편은 후고정되고(postfixated), 투과성화되고(permeabilised) 아세틸화(acetylated)되었다. 전혼성화(prehybridization)은 50℃에서 하룻밤 동안 혼성화가 50℃에서 5시간 동안 수행되었다. 혼성화 후에 슬라이드는 RNAse를 사용하여 낮은 극한 조건으로(low stringency) 여러번 세척되었다. 처리 및 높은 극한조건은 50℃에서 0.4 x SSC 완충액을 사용하여 세척하였다. 혼성화된 리보프로브는 항-디곡시제닌 항체 및 비색법(colorimetry)을 사용하여 검출되었다. 현미경사진(photomicrograph)은 광학현미경(Zeiss Axioplan microscope)에 부착된 CCD 카메라(RT slider, Diagnostic Instruments Inc.)가 사용되었다

<110> Deutsches Institut fur Ernahrungsforschung <120> Agonists of a bitter taste receptor and uses thereof <130> PI06-0130 <150> EP04009346.0 <151> 2004-04-20 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Gly Val Ile Lys Ser Ile Phe Thr Phe Val Leu Ile Val Glu 1 5 10 15 Phe Ile Ile Gly Asn Leu Gly Asn Ser Phe Ile Ala Leu Val Asn Cys 20 25 30 Ile Asp Trp Val Lys Gly Arg Lys Ile Ser Ser Val Asp Arg Ile Leu 35 40 45 Thr Ala Leu Ala Ile Ser Arg Ile Ser Leu Val Trp Leu Ile Phe Gly 50 55 60 Ser Trp Cys Val Ser Val Phe Phe Pro Ala Leu Phe Ala Thr Glu Lys 65 70 75 80 Met Phe Arg Met Leu Thr Asn Ile Trp Thr Val Ile Asn His Phe Ser 85 90 95 Val Trp Leu Ala Thr Gly Leu Gly Thr Phe Tyr Phe Leu Lys Ile Ala 100 105 110 Asn Phe Ser Asn Ser Ile Phe Leu Tyr Leu Lys Trp Arg Val Lys Lys 115 120 125 Val Val Leu Val Leu Leu Leu Val Thr Ser Val Phe Leu Phe Leu Asn 130 135 140 Ile Ala Leu Ile Asn Ile His Ile Asn Ala Ser Ile Asn Gly Tyr Arg 145 150 155 160 Arg Asn Lys Thr Cys Ser Ser Asp Ser Ser Asn Phe Thr Arg Phe Ser 165 170 175 Ser Leu Ile Val Leu Thr Ser Thr Val Phe Ile Phe Ile Pro Phe Thr 180 185 190 Leu Ser Leu Ala Met Phe Leu Leu Leu Ile Phe Ser Met Trp Lys His 195 200 205 Arg Lys Lys Met Gln His Thr Val Lys Ile Ser Gly Asp Ala Ser Thr 210 215 220 Lys Ala His Arg Gly Val Lys Ser Val Ile Thr Phe Phe Leu Leu Tyr 225 230 235 240 Ala Ile Phe Ser Leu Ser Phe Phe Ile Ser Val Trp Thr Ser Glu Arg 245 250 255 Leu Glu Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ser Gln Val Met Gly Met Ala Tyr 260 265 270 Pro Ser Cys His Ser Cys Val Leu Ile Leu Gly Asn Lys Lys Leu Arg 275 280 285 Gln Ala Ser Leu Ser Val Leu Leu Trp Leu Arg Tyr Met Phe Lys Asp 290 295 300 Gly Glu Pro Ser Gly His Lys Glu Phe Arg Glu Ser Ser 305 310 315 <210> 2 <211> 951 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgggtggtg tcataaagag catatttaca ttcgttttaa ttgtggaatt tataattgga 60 aatttaggaa atagtttcat agcactggtg aactgtattg actgggtcaa gggaagaaag 120 atctcttcgg ttgatcggat cctcactgct ttggcaatct ctcgaattag cctggtttgg 180 ttaatattcg gaagctggtg tgtgtctgtg tttttcccag ctttatttgc cactgaaaaa 240 atgttcagaa tgcttactaa tatctggaca gtgatcaatc attttagtgt ctggttagct 300 acaggcctcg gtacttttta ttttctcaag atagccaatt tttctaactc tatttttctc 360 tacctaaagt ggagagttaa aaaggtggtt ttggtgctgc ttcttgtgac ttcggtcttc 420 ttgtttttaa atattgcact gataaacatc catataaatg ccagtatcaa tggatacaga 480 agaaacaaga cttgcagttc tgattcaagt aactttacac gattttccag tcttattgta 540 ttaaccagca ctgtgttcat tttcataccc tttactttgt ccctggcaat gtttcttctc 600 ctcatcttct ccatgtggaa acatcgcaag aagatgcagc acactgtcaa aatatccgga 660 gacgccagca ccaaagccca cagaggagtt aaaagtgtga tcactttctt cctactctat 720 gccattttct ctctgtcttt tttcatatca gtttggacct ctgaaaggtt ggaggaaaat 780 ctaattattc tttcccaggt gatgggaatg gcttatcctt catgtcactc atgtgttctg 840 attcttggaa acaagaagct gagacaggcc tctctgtcag tgctactgtg gctgaggtac 900 atgttcaaag atggggagcc ctcaggtcac aaagaattta gagaatcatc t 951 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of hTAS2R14, which introduces a restriction site <400> 3 ggccaattgg aattcatggg tggtgtcata aagagcatat ttaca 45 <210> 4 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backword primer for amplification of hTAS2R14, which introduces a restriction site <400> 4 tcctcaattg tcatcagcgg ccgccagatg attctctaaa ttctttgtga cctgag 56 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tcccaccacc ctgttgctgt a 21

Claims

hTAS2R14 쓴맛 수용체 활성의 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist)를 분리하기 위한 방법으로,

여기에서 hTAS2R14 쓴맛 수용체는

(a) SEQ ID NO:1로 나타낸 연역된 아미노산 서열을 가지는 적어도 성숙형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 적어도 성숙형 폴리펩티드를 암호화하는 SEQ ID NO:2로 나타낸 코딩 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;

(c) (a)와 (b) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기에서 상기 유도체에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 상기 폴리펩티드와 비교하여 보전적으로 치환되었고, 상기 단편 또는 유도체는 hTAS2R14 쓴맛 수용체 활성을 가진다;

(d) (a)와 (c) 중 어느 하나로 정의된 폴리뉴클레오티드와 적어도 50% 동일하며 hTAS2R14 쓴맛 수용체 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(e) 바람직하게는 극한 조건 하에서 (a)와 (d) 중 어느 하나로 정의된 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 상보적 가닥이며 hTAS2R14 쓴맛 수용체 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되고,

(1) 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 유전학적으로 제조된 숙주세포 또는 잠재적 길항제 또는 잠재적 작용제로 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 암호화된 폴리펩티드와 접촉하고;

(2) 상기 폴리펩티드의 쓴맛 수용체 활성을 잠재적 길항제가 중화시키거나 잠재적 작용제가 작용시키는 것을 결정하는 것을 포함하되,

여기에서 우선, 부수적 및/또는 단계 (1) 후에 상기 폴리펩티드, 상기 숙주세포 또는 상기 벡터는 1,8-나프탈데히딕 산(1,8-naphthaldehydic acid), 1-나프토에산(1-naphthoic acid), 1-니트로나프탈렌(1-nitronaphthalene), 피크로틴(picrotin), 피크로톡시닌(picrotoxinin), 피페로닉산(piperonylic acid), 벤조산나트륨(sodium benzoate), (-)-α-튜존(thujone), 파테놀리드(parthenolide), 허볼리드 A(herbolide A), 허볼리드 D 아세테이트(herbolide D acetate), 히드록실-8α-파테놀리드, 슈도-아르탑신(pseudo-artabsine), 및 그들의 기능적 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 작용제와 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법의 단계 및 식료품의 제조에서 사용된 식료품 또는 전구물질 또는 첨가물에 대해 확인된 길항제 또는 작용제를 혼합하는 그 이후의 단계를 포함하는 식료품의 제조에서 사용된 식품, 전구물질 또는 첨가물질의 제조 방법.
제1항의 방법의 단계 및 약제학적으로 허용가능한 형태의 활성 물질에 대한 길항제 또는 작용제를 제조하는 그 이후의 단계를 포함하는 건강식 또는 약제학적 조성물의 제조 방법.
제2항에 따라 제조된 식료품의 제조에서 사용된 식료품, 어떤 전구물질 또는 첨가물.
제3항에 따라 제조된 건강식 또는 약제학적 조성물 및 적어도 하나의 활성 물질 및 임의적으로 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조제.
1,8-나프탈데히딕 산(1,8-naphthaldehydic acid), 1-나프토에산(1-naphthoic acid), 1-니트로나프탈렌(1-nitronaphthalene), 피크로틴(picrotin), 피크로톡시닌(picrotoxinin), 피페로닉산(piperonylic acid), 벤조산나트륨(sodium benzoate), (-)-α-튜존(thujone), 파테놀리드(parthenolide), 허볼리드 A(herbolide A), 허볼리드 D 아세테이트(herbolide D acetate), 히드록실-8α-파테놀리드, 슈도-아르탑신(pseudo-artabsine), 및 쓴맛을 증가시키기 위한 그들의 기능적 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 hTAS2R14 작용제의 용도.
1,8-나프탈데히딕 산(1,8-naphthaldehydic acid), 1-나프토에산(1-naphthoic acid), 1-니트로나프탈렌(1-nitronaphthalene), 피크로틴(picrotin), 피크로톡시닌(picrotoxinin), 피페로닉산(piperonylic acid), 벤조산나트륨(sodium benzoate), (-)-α-튜존(thujone), 파테놀리드(parthenolide), 허볼리드 A(herbolide A), 허볼리드 D 아세테이트(herbolide D acetate), 히드록실-8α-파테놀리드, 슈도-아르탑신(pseudo-artabsine), 및 그들의 기능적 유도체로 유도할 수 있는 쓴맛 감소를 위하여 제1항에 따른 방법으로 확인된 hTAS2R14 작용제의 용도.
1,8-나프탈데히딕 산(1,8-naphthaldehydic acid), 1-나프토에산(1-naphthoic acid), 1-니트로나프탈렌(1-nitronaphthalene), 피크로틴(picrotin), 피크로톡시닌(picrotoxinin), 피페로닉산(piperonylic acid), 벤조산나트륨(sodium benzoate), (-)-α-튜존(thujone), 파테놀리드(parthenolide), 허볼리드 A(herbolide A), 허볼리드 D 아세테이트(herbolide D acetate), 히드록실-8α-파테놀리드, 슈도-아르탑신(pseudo-artabsine), 및 그들의 기능적 유도체로 유도할 수 있는 쓴맛을 감소하거나 증가시키기 위한 화학식 (Ⅰ)에 따른 구조를 가지는 화합물의 용도.