KR20070008519A

KR20070008519A - 패혈증 및 유착 형성의 치료 및 예방용 조직 보호성사이토카인

Info

Publication number: KR20070008519A
Application number: KR1020067008389A
Authority: KR
Inventors: 마이클 브린스; 안토니 세라미; 오스만 일마즈; 토마스 콜만
Original assignee: 워렌 파마슈티칼즈 인코포레이티드; 더 케네쓰 에스. 워렌 인스티튜트 인코포레이티드
Priority date: 2003-09-29
Filing date: 2004-09-29
Publication date: 2007-01-17
Also published as: IS8359A; IL174577A0; EA200600695A1; WO2005032467A2; WO2005032467A3; JP2007517769A; EA010650B1; CA2539440A1; AU2004277954A1; EP1670492A4; US7645733B2; CN1897959A; US20070129293A1; ZA200603396B; EP1670492A2; BRPI0414887A; MXPA06003234A; NO20061866L

Abstract

본 발명은 패혈증, 유착 형성, 상처, 기관장애, 만성 질병, 감염으로 생성되는 일반적인 염증 상태, 상처 및 절개로부터 생성되는 흉터 형성 및 그의 조합을 포함하는(단, 이에 한정되지 않음) 증상에서 염증전 사이토카인의 효과를 감소시키고/거나 발병을 지연시키고, 예방하고, 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

패혈증 및 유착 형성의 치료 및 예방용 조직 보호성 사이토카인{TISSUE PROTECTIVE CYTOKINES FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF SEPSIS AND THE FORMATION OF ADHESIONS}

본 발명은 패혈증 및 관련된 합병증의 효과를 감소시키고/거나 발병을 지연시키거나, 예방하거나, 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 패혈증, 유착 형성 및 기관 장애에 관련된 합병증의 치료, 예방, 지연 및/또는 감소를 위한, 조직 보호성 사이토카인의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 감염으로부터 발생되는 일반적인 염증 상태의 합병증의 치료, 예방, 지연 및/또는 감소를 위한 것으로 고려된다.

숙주에서는 감염, 면역 시험감염, 염증 및 외상에 반응하기 위한 몇몇 전략이 존재한다. 이들 시험감염에 반응하기 위한 숙주의 시도에 의한 하나의 기전은 사이토카인, 세포사이 조절자로서 작용하는 비항체 단백질의 업레귤레이션을 통한 것이다. 염증전 사이토카인으로 공지되어 있는 몇몇 사이토카인은 시험감염에 의해 손상 입은 숙주 세포 및 숙주에서 시험감염이 제거되기로 기대되는 질병의 숙주 에 대한 시험감염을 방해하는 것이다. 염증전 사이토카인으로는 인터루킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-6, IL-8 및 IL-18 및 종양 괴사 인자(TNF)가 포함되나, 이로써 한정되지 않는다.

방출될 때, 염증전 사이토카인은 손상 부위에서 항체 및 이들의 보체의 방출을 증가시키고, T 및 B 세포를 활성화하고, 혈관 벽에 혈소판을 유착시키고, 림프구 및 대식구를 외-혈관화하는 손상 부위에 영향을 미친다. 이들 변화는 열, 조직 손상, 종양 괴사, 다른 사이토카인의 유도 및 면역조절 및 세포사를 포함하는 손상 부위에서 국소화된 환경을 초래한다. 이 국소화된 반응은 숙주에 대한 시험감염의 원천일 뿐만 아니라 염증전 사이토카인 반응의 반영이다. 그러므로, 예를 들어 숙주에게 압도적인 감염 또는 심각한 외상동안 숙주에게 발생할 수도 있는 전신 수준상에서 이들 염증성 사이토카인의 많은 것이 열, 염증, 조직 파괴, 및 몇몇 경우에서 쇼크 및 사망을 초래하는 해로운 것이다.

다양한 염증전 사이토카인의 작용의 대표는 TNF이다. TNF는 염증, 감염 및 다른 환경적 시험감염에 반응하는 대식구, 단핵구, 림프구 세포 및 섬유모세포를 포함하는 많은 세포 유형에 의해 제조된다. TNF는 열, 쇼크, 조직 손상, 종양 괴사, 식욕부진, 다른 사이토카인의 유도 및 면역 제어 분자, 세포 증식, 분화 및 세포사를 포함하는 다양한 세포성 반응을 유도한다. 방출될 때, TNF는 항체 및 이들의 보체의 방출을 증가시키고, T 및 B 세포를 활성화하고, 혈소판을 혈관벽으로 유착화하고, 림프구 및 대식구를 외-혈관화하는 손상 부위에서 효과를 지닌다. 전신상으로, TNF는 시상하부 및 간에서 작용한다. TNF는 호르몬을 방출하고, 식욕을 억제하고 열을 유도하는 코르티코트로핀을 방출하기 위해 시상 하부를 자극한다. TNF에 반응하여, 간은 C-반응성 단백질, 응고 요소 및 보체 요소를 포함하는 수 개의 단백질의 합성을 초래하는 급성 상 반응을 개시한다. 또한, TNF는 인슐린 저항성을 유도한다. 손상 또는 감염 영역에서, TNF는 특정 감염제를 제거하고 특정 손상에 반응하는 신체의 면역 반응을 순응시키기 위해 중요하다.

그러나, 전신 수준에서, TNF 및 염증전 사이토카인은 연장된 시간동안 보다 높은 농도로 존재할 수도 있고, TNF는 신체에 불리한 영향을 미칠 수 있다. 고농도의 TNF는 카켁시아(소모병)을 초래하는 IL-1과 IL-6의 캐스캐이드를 활성화한다. 추가로, TNF는 파종혈관외응고를 초래하여 결국 기관 장애를 일으킬 수 있는 전신 부종, 저단백혈증, 및 호중성백혈구감소증다중을 유도할 수 있다. 만성 질병, 예컨대 암에서, TNF는 숙주 내의 중요한 내인성 기능을 방해할 수 있다. 예를 들어, TNF는 숙주의 허마토크릿을 유지하기 위한 내인성 에리트로포이에틴의 능력을 방해할 수 있고, 만성 질병(ACD)의 빈혈로서 지칭되는 상태를 초래한다. 재조합 에리트로포이에틴으로 치료하는 전형적인 과정은 염증전 사이토카인의 효과를 방해하지 못하고, 이로 인해 숙주의 정상적인 허마토크릿을 유지하기 위한 재조합 에리트로포이에틴의 증가된 투여량의 투여가 요구된다. 증가된 투여량과 연계된 추가의 비용 이외에, 에리트로포이에틴의 증가된 투여량으로부터의 부작용, 예컨대 혈전증이 있다. 하기 상세한 상태 외에도, TNF를 포함하나, 이에 한정되지 않는 염증전 사이토카인은 질병, 예컨대 만성 염증, 박테리아성 패혈쇼크, 박테리아성 독소쇼크, 이식 대 숙주 질병, 및 HIV 감염 및 AIDS와 연계되어 있다.

패혈증

패혈증은 임의의 종류의 감염(예: 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균류)에 대한 신체 반응이다. 감염의 부위는 전형적으로 폐, 요도관, 복부 및 골반이다. 그러나, 몇몇 경우에서, 감염의 정확한 부위는 인지되지 않을 수 있다. 패혈증이 전신 염증 반응을 통해 한번이라도 발생하면, 패혈증 또한 프로트롬보틱 경향 및 감소된 섬유소용해를 포함한다는 것이 현재 알려져 있다.

일단 패혈증이 시작되면, 널리 퍼진 염증 및 응고가 몸 전체에 걸쳐 발생한다. 반면, 건강한 신체에서, 면역 매개제는 신체를 치료하고 감염과 싸우기 위해 방출되고, 패혈증에서, 면역 조절자의 과다량이 방출된다. 염증 사이토카인, 예컨대 TNF, 인터루킨-1 및 인터루킨-18의 방출은 심부 온도, 식욕 상실, 및 빈혈의 증가, 내피 내층의 감염을 유도한다. 추가로, 혈관의 내층의 감염은 혈액 응고 공정을 활성화한다. 패혈증은 단백질 C의 신체의 천연 생산을 감소시키기 때문에, 이는 혈액 응고를 조절하고 염증을 조절하고, 형성된 혈액 응고를 깨는 신체의 능력이 억제된다. 이러한 억제는 기관, 사지, 손가락 및 발가락에 차례로 기관 장애 또는 괴저를 유도한다.

패혈증은 다양한 정도로 그 자체에서 존재할 수도 있다. 예를 들어, 급성 기관 장애 또는 실패가 발생할 때 생기는 심각한 패혈증의 경우에, 신체의 정상적인 방어 반응은 혹사되거나, 신체를 통한 미세혈관내의 혈관 응고 및 널리 퍼진 염증을 유도할 수 있는 사건의 캐스케이트를 겪는다. 패혈쇼크는 환자가 심혈관 전신 장애를 겪는 심각한 패혈증을 겪을 때 발생한다. 이 실패는 적절한 산소화된 혈액 공급의 중요한 기관을 차례로 저하시키고 빼앗기 위한 혈압을 야기한다. 패혈증은 그 자체의 혈류에서 감염을 갖는 패혈증이다. 사실, 패혈증은 허혈, 즉 하나 이상의 기관으로의 조악한 혈액 공급을 야기할 수도 있다. 예를 들어, 상당한 시기동안 신장으로 혈액 공급이 낮은 수준으로 감소되는 것은 위험하고, 허혈 급성 장애(ARF)가 발전될 수도 있다. 또한, 감소된 혈류량은 감염된 기관에서 괴사, 또는 조직사를 초래한다.

동정될 수 있는 패혈증의 원천을 제공하면, 패혈증의 많은 경우가 치료에 반응한다. 일단 단리되면, 감염의 경우에 특정 치료 처방계획이 시작된다. 공지된 치료는 항산화제, 감염되거나 외과 절개 또는 조직 괴사, 활성화된 단백질을 증가시키는 약물, 및 스테로이드(패혈쇼크의 경우)의 사용을 포함한다. 예를 들어, 패혈증 치료의 전형적인 과정은 감염의 원인이 단리될 때까지 넓은 범위를 항산화제로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 패혈증 환자의 사망률은 원인 및/또는 감염 부위가 확인될 수 없는 곳의 패혈증인 경우에 상대적으로 매우 높다.

패혈증, 항-감염제, 배수 기술, 유동액, 평균 동맥 혈압(MAP)을 올리는 약물, 예컨대 노르에피네프린 및 페닐에프린, 콩팥 기능을 향상시키는 약물, 예컨대 도파민, 산소 전달 및 산소 소비를 증가시키는 약물, 예컨대 도부타민 및 에피네프린, 호흡기를 지지하는 인공호흡기, 및 신장 장애를 위한 투석기는 치료의 과정에 사용될 수도 있다. 추가로, 충격 및 패혈증에 따른 면역 반응상의 유리한 효과를 나타내 온 약제로는 ATP-MgCl₂, 비-항응고제 헤파린, 칼슘 채널 차단제, 클로로퀸, 사이클로옥시게나제 저해제, PAF 길항제, 항염증성 사이토카인, 성장 인자, 식이 조작, 항 TNF 항체, 활성화된 단백질 C(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 엘리 릴리(Lilly)제 자이그리스(Xigris, 등록상표)), 및 성 호르몬이 포함된다. 상태가 신속하게 진단되고 즉시 치료되는 것이 패혈증으로부터 가장 잘 회복된다.

프로크릿(PROCRIT, 상표명)(제조원: 미국 뉴저지주 라리탄 소재의 오르쏘 바이오테크 인코포레이티드(Ortho Biotech Inc.), 에포겐(EPOGEN, 등록상표)(제조원: 미국 캘리포니아주 싸우샌드 오크 소재의 암젠 인코포레이티드(Amgen, Inc.)) 및 네오레코몬(NEORECOROMON)(제조원: 스위스 바젤 소재의 로슈(Roche))으로 시판되는 재조합 에리트로포이에틴(rhu-EPO)은 패혈증 관련된 다양한 상태의 치료에 관련되어 조사되어 왔다. 추가로, 미국 특허 공개 제 2003/0083251 호는 일반적으로 허혈성 ARF의 환자를 치료하기 위해 콩팥뇨세관 세포의 세포사를 예방하고 콩팥뇨세관 세포의 재생성을 돕기 위해 rhu-EPO의 사용을 개시하고 있다. 추가로, 미국 특허 공개 제 2002/0061849 호는 일반적으로 하나 이상의 기관에서 비-허혈성 상태로 염증의 치료를 돕기 위한 rhu-EPO의 사용을 개시하고 있다. 그러나, 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과, 즉 증가된 허마토크릿, 혈관수축, 혈소판의 과활성화, 프로-항응고 활성, 트롬보사이트의 증가된 생성 때문에, rhu-EPO로 치료하는 것은 패혈증과 연계된 기관, 사지, 손가락 및 발가락에 널리 퍼진 응고를 제공할 추가의 위험을 갖는다.

유착

패혈증 외에도, 염증전 사이토카인, 예컨대 TNF는 유착의 형성, 비정상적인 섬유성 밴드 또는 기관과 신체의 다른 구조 사이의 연결 등의 형성에 연관되어 있다. 유착은 패혈증에 관련된 합병증일수도 있고, 독립적으로 발생할 수도 있다. 예를 들어, 유착은 외과수술, 외상, 감염, 화학요법 및 방사선의 결과로서 형성될 수도 있다. 사실, 유착은 대부분의 외과수술의 부득이한 결과이고, 즉 환자의 약 93%가 어느 정도의 유착을 겪는 복부 수술을 한다(이전의 복부 수술을 하지 않은 환자의 약 10.4%의 유착 형성과 비교됨). 문헌[D. Menzies and H. Ellis, Intestinal Obstruction from Adhesions - How Big is the Problem?, ANN. R. COLL. SURG. ENGL. 72 : 60-3 (1990)]을 참조한다.

유착의 형성은 심각한 통증을 야기하고, 환자의 기관 또는 다른 구조상에 부자연스러운 압력 또는 긴장을 형성할 수 있다. 예를 들어, 신체의 복부에서의 유착은 환자의 장이 신체의 기관 또는 다른 구조 사이에서 트랩되거나 짜여지는 것을 야기할 수도 있다. 몇몇 경우에서, 장은 인접한 유착 때문에 차단되거나 현저하게 방해될 수도 있다.

신체의 2개의 부분 사이의 비정상적인 연결의 형성은 다른 상태의 숙주에 야기될 수도 있다. 예를 들어, 제왕절개술은 보다 통상적인 출산 방법이 되고 있고, 주요 복부 수술을 받는 여자들은 유착이 형성되기 쉽고, 그 결과, 만성 골반 통증에 시달리고 있다. 추가로, 여성 생식 기관을 포함하는 유착은 불임 및 성교통증을 야기할 수도 있다.

작용제의 많은 것, 예컨대 덱스트란, 코르티코스테로이드, 포스파티다일콜린, 포스폴리파제 저해제, 비-스테로이드성 항염증 약물, 프로테오글리칸, 헤파린 및 조직 플라스미노겐 활성제가 유착을 치료하고 예방하는 것과 관련되어 조사되어 왔다. 예를 들어, 문헌[C.L. Kowalczyk and M.P. Diamond, The Management of Adhesive Disease, in PERITONEAL ADHESIONS 315 - 324 (K.H. Treutner and V. Schumpelick, eds., 1997)]을 참조한다. 이들 작용제의 전부가 아닌 몇몇은 응고 및 섬유소용해를 방해하는 능력 때문에 유착의 치료에 효과적인 것으로 여겨진다. 그러나, 이들 작용제 대부분의 임상 실험은 피가 나는 합병증 때문에 제한적이다. 추가로, 하이할루론산 유도체는 특히 복부내 영역에서의 수술 후 유착을 예방하기 위해 제시되어 왔다. 예를 들어, 문헌[J.M. Becker et al., Prevention of Postoperative Abdominal Adhesions by a Sodium Hyaluronate-based Bioresorbable Membrane: A Prospective, Randomized, Double-blind Multicenter Study, in J. AM. COLL. SURG. 183 297-306(1996)]을 참조한다. 추가로, 경쟁적인 방법으로 모노사이트 및 뉴트로필상의 수용체와 높은 친화도를 갖고 결합하는 글루코스 중합체인 베타-글루칸은 위스타(Wistar) 쥐에서 복부내 패혈증을 실험적으로 발전시킨 후 유착의 발생횟수를 감소시키는 효과를 갖는 다는 것을 제시해왔다. 문헌[A. Bedirli et al., Prevention of Intraperitoneal Adhesion Formation Using Beta-Glucan After Ileocolic Anastomosis in a Rat Bacterial Peritonitis Model, in Am. J. SURG. 185 339-343 (2003)].

또한, 외과 수술은 유착을 위한 치료의 과정으로서 사용될 수도 있다. 일반적으로, 의사는 기관 또는 다른 기관으로부터 유착을 절단하기 위해 외과 수술을 한다. 그러나, 유착이 외과수술의 합병증으로 주어지면, 자주 유착을 제거하기 위 한 외과수술은 새로운 유착의 형성을 초래한다. 몇몇 외과수술의 과정이 외과수술에 의해 영향 받은 영역에 근접한 기관에 걸쳐 슬리브의 대체를 포함하는 동안, 따라서 이들 기관을 포함하는 유착의 형성을 예방하는 것을 돕고, 그러한 과정은 혼합된 결과를 갖는다. 추가로, 상기 기관 슬리브는 또한 슬리브를 제거하기 위해 추가의 외과수술을 요구한다.

그러므로, 유착과 관련된 인식의 증가에도 불구하고, 치료방법의 연구는 제한된 성공으로 충족되어왔다. 많은 의사들은 유착의 치료를 어드레싱할 수 없고, 많은 보험 회사들은 이윤을 극대화하기 위해 치료를 위한 보험비를 지불하지 않으려 한다.

상처 치유

치유는 손상된 조직의 통합성을 재설립하는 신체의 필수적인 방법이다. 이 방법은 다양한 원인, 예컨대 외상, 외과수술, 압력(욕창), 화상, 당뇨 등으로부터 생긴 피부의 상처, 궤양 또는 병변에 의하여 자주 검증된다. 상처의 심각성은 피부를 관통하는 상처의 정도를 특징으로 한다. 단계 I 상처는 발적, 탈색, 온기 및 팽창 또는 딱딱함을 특징으로 한다. 부분적인 두께의 상처인 단계 II 상처는 피부의 표피 및 표면 진피를 관통한다. 완전히 두꺼운 상처인 단계 III 상처는 피부의 진피를 관통하나, 더 깊은 기관으로부터 피부를 분리하는 막을 관통하지는 않는다. 단계 IV 상처는 아래에 놓인 근육 또는 뼈의 손상을 포함한다.

모든 상처는 염증, 상피화, 혈관신생 및 매트릭스의 축적이라는 동일한 방법을 통해 치유되나, 상처 치유가 상처의 심각성 및 상처 난 개개의 건강에 기초를 두고 있다. 일반적으로, 단계 I 및 단계 II 상처 치유는 아래 놓인 진피에 의해 상피세포의 재성성을 통해 치유된다. 반면, 단계 III 및 IV 상처 치유는 흉터의 생성을 통해 치유된다. 염증전 사이토카인, 예컨대 TNF는 상처의 이유에서 중요한 역할을 하나, TNF가 궁극적으로 수선되는 조직의 강도 및 상처가 치유되는 시점에서 상처 치유에서 콜라겐의 축적에 반대 효과를 미칠 수도 있는 것으로 추측된다.

여러 치료 및 치료 방법은 상처를 치유하는데 신체를 돕기 위해 개발되어 왔다. 수 개의 화합물은 성장 인자(표피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 인간 성장 호르몬, 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 인터루킨-6, 및 인터루킨-10), 영양 보충(아기닌, 글루타민, 비타민 C, 비타민 B5, 브로멜라인(Bromelain), 쿠르쿠민(Curcumin), 아연, 구리) 및 본초 보충(알로에 베라, 센텔라(Centella))을 포함하는(이에 한정되지 않음) 상처상에 치료 효과를 갖는 것으로 여겨진다. 추가로, 고압산소 요법, 소용돌이 요법, 초음파 요법, 전기 자극 및 자기 요법을 포함하는(이에 한정되지 않음) 다양한 치료 방법이 상처를 치유하는데 신체를 보조하기 위해 사용되어 왔다.

상처가 적절하게 치유되지 않거나 치유가 전혀 되지 않은 경우, 흉터 및 감염으로 인한 수 개의 합병증을 유도할 수 있다. 상처의 심각성에 따라, 신체는 상처를 치유하는 흉터 조직을 생성할 수도 있다. 흉터의 미관상 문제와는 별개로, 흉터는 그의 심각성에 따라 개개의 움직임을 감소시킬 수도 있다. 추가로, 상처는 신체로 들어가는 박테리아 및 다른 감염성 약제의 기회이다. 감염의 심각성에 따라, 널리 퍼지거나 전신 패혈증(sepsis 또는 septicemia)을 초래할 수도 있다.

또한, rhu-EPO는 무작위 허혈 판의 쥐 모델에서 가능한 치유 효과를 위해 조사되어 왔다. 예를 들어, rhu-EPO는 괴사를 감소시키고, 뉴트로필 침윤을 감소시키고, 허혈성 피부판 손상에 관한 온도 증가를 예방한다. 문헌[M.Buemi et al., Recombinant Human Erythropoitein Influences Revsacularization and Healing in a Rat Model of Random Ischaemic Flaps, ACTA DERMVENEREOL, 82 : 411-417(2002)]을 참조한다. 상기 발견은, 염증 반응을 감소시키고, 허혈 판중의 모세혈관의 밀도를 증가시킨 후, 손상 영역의 수선을 보다 신속하게 함으로써 rhu-EPO 투여가 손상의 초기 및 후기 둘 다에서 상처 치료 공정을 개선시킬 수 있다는 것을 제시한다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이, rhu-EPO가 적혈구 생성 활성을 가지기 때문에, 이들 상태의 치료를 위한 rhu-EPO의 사용은 치유 방법에 의해 이미 개시되는 것보다 응고 또는 합병증의 정도를 보다 크게 유발할 수 있다.

요약하면, 패혈증, 유착 형성, 상처 치료 또는 일반적인 염증 상태를 포함하는 패혈증 경우의 관리를 위한 충분한 값을 나타내는 약제 또는 치료 전략이 없다. 사실, 패혈증 및 관련된 상태와 연계된 치사율은 여전히 높다. 매년, 약 215,000 명의 사람들이 심각한 패혈증으로 인해 사망하고, 패혈증을 발전시킨 환자 3명중 1명은 한달 이내로 사망한다. 그리고, 증가하는 상태의 인식 및 진단의 심각성, 면역저하자의 수, 침략 과정의 사용, 저항성 미생물의 수, 및 노인 인구의 성장 덕분에 패혈증은 상승될 전망이다. 추가로, 유착 및 일반적인 염증 상태와 연계된 만성 통증은 성공적인 치료 전략의 부족 때문에 자주 치료되어지지 않는다.

그러므로, 당분야에서 이들의 조직성 효과를 추가로 어드레싱하고 그들의 작 용의 경계영역을 제한하는 목적의 염증전 사이토카인의 효과를 감소시키고, 발병을 지연시키고, 예방하고, 치료하기 위한 치료법 및 방법이 요구된다. 특히, 패혈증, 유착, 상처, 만성 질병의 상태 및 일반적인 염증 상태에서 염증전 사이토카인의 효과를 감소시키고, 발병을 지연하고, 예방하고, 치료하는 것이 요구된다. 추가로, 허혈 상태에서 조직에 손상을 예방하고 고치는 능력을 갖는 방법론을 제공하는 것이 이롭다.

발명의 요약

본 발명은 조직 보호성 사이토카인 하나 이상을 치료학적 유효량으로 투여함으로써, 패혈증, 유착, 일반적인 염증 증상 및 그의 조합의 효과를 감소시키고/거나 발병을 지연시키고, 예방하고, 치료하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 하나 이상의 조직 보호성 사이토카인을 사용하는 상처 및 절개에 관련된 상처의 감소 또는 예방에 관한 것이다. 하나 이상의 조직 보호성 사이토카인은 조직 보호 기능을 갖는 임의의 조직 보호성 사이토카인일 수도 있다. 그러나, 하나의 양태에서, 하나 이상의 조직 보호성 사이토카인은 화학적으로 변형된 EPO이다. 다른 양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 카바밀화된 EPO이다.

본 발명의 하나의 양태는 포유동물에서 염증전 사이토카인의 효과를 감소시키거나, 발병을 지연시키거나, 예방하거나, 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 양태는 염증전 사이토카인과 연계된 상태의 발병을 지연시키거나, 예방하거나, 치료하는 방법에 관한 것이다. 염증전 사이토카인의 효과와 연계된 증상의 몇몇 예 로는 패혈증, 유착, 상처, 염증 또는 만성 질병이 포함된다. 이들 방법은 약학 담체중의 조직 보호성 사이토카인 하나 이상의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수도 있다.

추가로, 본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 사용될 수도 있는 약학 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 하나의 양태는 포유동물에서 염증전 사이토카인의 효과를 감소시키거나, 이의 발명을 치료하거나, 예방하거나, 지연시키는데 효과적인 양으로 조직 보호성 사이토카인 하나 이상을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 다른 양태는 포유동물에서 염증전 사이토카인과 연계된 상태의 발병을 치료하고, 예방하고, 지연시키는데 효과적인 양으로 조직 보호성 사이토카인 하나 이상을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 조직 보호성 사이토카인은 화학적으로 변형된 에리트로포이에틴 또는 유전자 변형된 에리트로포이에틴일 수도 있다.

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 사용되는 몇몇 양태에서, 화학적으로 변형된 에리트로포이에틴은 하기중 하나 이상을 포함할 수도 있다:

i) 시알산 잔기가 부족한 에리트로포이에틴;

ii) 적어도 시알산 잔기가 없는 에리트로포이에틴;

iii) 적어도 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물이 없는 에리트로포이에틴;

iv) 하나 이상의 글라이코시다제를 갖는 천연 에리트로포이에틴의 처리로 인한 적어도 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴;

v) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴;

vi) 화학적으로 감소된 산화된 탄수화물 하나 이상을 갖는 에리트로포이에틴;

vii) 하나 이상의 변형된 아기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

viii) 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 갖거나 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기의 변형을 갖는 에리트로포이에틴;

ix) 적어도 변형된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

x) 적어도 변형된 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

xi) 적어도 변형된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

xii) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴;

xiii) 에리트로포이에틴 분자내의 시스틴 결합 하나 이상의 오프닝을 갖는 에리트로포이에틴; 또는

xiv) 결절된 에리트로포이에틴.

다른 양태에서, 화학적으로 변형된 에리트로포이에틴은 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과가 결여되어 있다. 또한, 화학적으로 변형된 적혈구 생성 인자는 카바밀화된 에리트로포이에틴을 포함할 수도 있다.

유사하게, 돌연변이화된 적혈구 생성 인자는 하기 돌연변이중 하나 이상으로부터 선택될 수도 있다:

C7S, RlOI, V11S, L12A, E13A, R14A, R14B, R14E, R14Q, Y15A, Y15F, Y15I, K20A, K20E, E21A, C29S, C29Y, C33S, C33Y, P42N, T44I, K45A, K45D, V46A, N47A, F48A, F48I, Y49A, Y49S, W51F, W51N, Q59N, E62T, L67S, L70A, D96R, K97D, S100R, S100E, S100A, S100T, G101A, G101I, L102A, R103A, S104A, S104I, L105A, T106A, T106I, T107A, T107L, L108K, L108A, S126A, F142I, R143A, S146A, N147K, N147A, F148Y, L149A, R150A, G151A, K152A, L153A, L155A, C160S, I6A, C7A, B13A, N24K, A30N, H32T, N38K, N83K, P42A, D43A, K52A, K97A, K116A, T132A, I133A, T134A, K140A, P148A, R150B, G151A, K152W, K154A, G158A, C161A 및/또는 R162A.

다른 양태에서, 돌연변이된 에리트로포이에틴은 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과가 결여되어 있다.

염증전 사이토카인의 2가지 예로는 인터루킨 및 TNF가 있다. 염증전 사이토카인의 하나 이상의 효과로는 열, 소모병, 기면, 빈혈, 부종, 허혈, 기관장애 및 인슐린 저항성이 포함될 수도 있다. 본 발명의 추가의 특징 및 이점은 하기에 상세하게 설명한다.

본 발명의 추가의 특징은 후술되는 도면과 연계되어 제공되는 발명의 상세한 설명으로부터 확인될 수 있다.

도 1은 맹장 결찰 및 천자(CLP) 및 후속적으로 본 발명의 조직 보호성 사이토카인 또는 염분으로 처리한 후, 스프라규 대울리(Sprague-Dawley) 쥐의 생존률을 나타낸 그래프이다.

도 2는 CLP 및 후속적으로 본 발명의 조직 보호성 사이토카인 또는 염분으로 처리한 후, 스프라규 대울리 쥐의 유착 원천을 나타내는 그래프이다.

도 3은 CLP 및 후속적으로 본 발명의 조직 보호성 사이토카인 또는 염분으로 처리한 후, 스프라규 대울리 쥐의 질병의 원천을 나타내는 그래프이다.

도 4는 패혈증의 도입 및 비도입하에 CLP 및 후속적으로 본 발명의 조직 보호성 사이토카인 또는 염분으로 처리한 후, 스프라규 대울리 쥐의 유착 원천을 나타내는 그래프이다.

도 5는 패혈증의 도입 및 비도입하에 CLP 및 후속적으로 본 발명의 조직 보호성 사이토카인 또는 염분으로 처리한 후, 스프라규 대울리 쥐의 혈청 TNF 수준을 나타내는 그래프이다.

도 6은 24시간동안 도입된 패혈증에 대해 리포폴리사카라이드(LPS) 후, 조직성 사이토카인 또는 또는 염분으로 처리하는 것은 스프라규 대울리 쥐에 대한 색힘 처리를 나타내는 차트이다.

도 7a 및 7b는 LPS 도입된 패혈증 후 조직 보호성 사이토카인 또는 염분으로 스프라규 대울리 쥐의 혈청에서 IL-6(도 7a) 또는 TNF(도 7b)의 수준을 나타내는 차트이다.

도 8a 및 8b는 PLS 유도된 패혈증 후, 조직 보호성 사이토카인 사이토카인을 말초적으로(도 8a) 또는 중심적으로(도 8b) 처리한 스프라규 대울리 쥐의 심부 체온을 나타내는 차트이다.

도 9는 허열 피부판 시험 및 후속적으로 염분 또는 조직 보호성 사이토카인으로 처리한 후, 34일의 스프라규 대울리 쥐에서 치료된 레젼의 %를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 패혈증 및 패혈증-관련된 상태, 유착, 상처 치료 및 만성 질병을 포함하는 상태(이에 한정되지 않음)에서 염증전 사이토카인, 예컨대 TNF의 효과를 감소시키거나, 지연시키고, 예방하고, 치료하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 조직 보호성 사이토카인에 의해 어드레싱되는 염증전 사이토카인의 효과는 열, 소모병, 기면, 빈혈, 부종, 허혈, 기관장애 및 인슐린 저항성을 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 감염, 예컨대 수막염의 경우에, 감염으로부터 생성된 기관 또는 조직 하나 이상의 염증 상태의 효과의 감소 또는 지연, 예방, 치료를 위해 고려된다. 특히, 본 발명은 패혈증, 유착, 상처 치료, 만성 질병 및 염증 상태를 포함하는 상태에서 염증전 사이토카인의 효과의 치료에 성공적인 조직 보호성 사이토카인을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

추가로, 본 발명의 조성물은 상처로부터의 흉터의 출현을 감소하고/하거나 예방하고, 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인이 복부 수술과 관련되어 사용될 때, 흉터는 실질적으로 감소될 수도 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 외과적인 절개로부터의 흉터를 예방하는데 사용된다.

발명의 조성물

조직 보호 성능을 나타내는 임의의 사이토카인은 본 발명에 사용되는 것으로 고려된다. 본 발명의 조성물은 에리트로포이에틴을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 적합한 조직 보호성 사이토카인은 EPO 분자일 수도 있고, 이는 다양한 형태, 예를 들어 α, β, 아시알로 및 기타 형태로 존재할 수도 있다. α 및 β 형태는 동일한 잠재력, 생물학적 활성 및 분사 중량을 가지나, 탄수화물 성분에서 약간 상이하고, 아시알로 형태는 탄수화물 성분으로부터 말단의 시알산이 제거된 α 또는 β 형태이다.

또한, 임의의 조직 보호성 사이토카인은 패혈증, 패혈증-관련된 상태, 및 일반적인 염증 상태로 고려되는 것의 효과를 감소시키고/거나 발병을 지연하고, 예방하고, 치료할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "조직 보호성 사이토카인"이란 에리트로포이에틴의 조직 보호성 활성을 갖는 에리트로포이에틴의 유도체인 임의의 사이토카인을 지칭한다. 바람직하게는, 조직 보호성 사이토카인은 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과 하나 이상이 결핍되어 있다. 보다 바람직하게는, 조직 보호성 사이토카인은 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과 모두가 결핍되어 있다. 이는 예를 들어, 약리학적 특질(반감기의 감소) 또는 에리트로포이에틴 수용체 동종이합체에 결합하는 구조적 능력에 영향을 미치는 화학적 또는 돌연변이적 공정을 통해 에리트로포이에틴을 변형시킴으로써 달성될 수도 있다. 본 발명에 사용되는 적합한 조직 보호성 사이토카인의 비제한적 예로는 본원에 그 전체가 참조로 혼입되어 있는 국제 공개 공보 제 WO/02053580 호 및 미국 특허 공보 제 2002/0086816 호 및 제 2003/0072737 호에 개시되어 있는 조직 보호성 사이토카인이 포함된다.

추가로, 본 발명에 사용되는 조직 보호성 사이토카인으로는 하나 이상의 아기닌, 리신, 티로신, 트립토판 또는 시스테인 잔기 또는 본 발명에 따른 조직 보호성 사이토카인으로서 사용되는 것으로 고려되는 카복실기가 변형된 EPO 분자가 포함된다. 이들 잔기는 국제 공개 공보 제 WO/02053580 호에 개시된 바와 같이 구아니딘화, 아미딘화, 카바밀화, 트리니트로페닐화, 아실화(아세틸화 또는 석시닐화), 질소화 또는 그의 혼합에 의해 화학적으로 변형될 수도 있다.

그러므로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 카바밀화된 EPO일 수도 있다. 본 발명의 배경기술에서 논의된 바와 같이, rhu-EPO는 패혈증의 가능한 합병증인 급성 신부전증의 치료와 연계되어 조사되어 왔다. 그러나, rhu-EPO는 신체 내에서 허마토크릿 수준 및 혈소판의 과활성을 유지하는 능력인 적혈구 생성 활성을 갖기 때문에, 적혈구 세포가 증가되고 혈소판이 투여동안 과활성이고 혈전증의 증가된 위험 및 농후된 피에서 생성된다. 그러므로, rhu-EPO의 사용은 패혈증의 결과로서 발생하는 넓은 범위의 응고를 악화시킬 수 있다.

rhu-EPO 및 선택된 다른 변형된 EPO 분자와는 달리, 카바밀화된 EPO는 적혈구 생성 활성을 보유하지 않고, 본원에 그 전체가 참조로 혼입된 2004년 4월 26일에 출원된 PCT 출원 제 PCT/US04/013099 호에 나타난 바와 같은 전통적인 동종이량체 에리트로포이에틴과 결합하지 못한다. 그러나, 카바밀화된 EPO는 내인성 EPO의 조직 보호성 기능을 유지하는 것이 유리하다. 카바밀화된 EPO의 조직 보호성 기능은 PCT 출원 제 PCT/US04/013099 호에 개시되어 있는 바와 같은 조직 보호성 수용체 착물과 연계를 통해 중재되는 것으로 여겨진다. 그러므로, 카바밀화된 EPO는 에리트로포이에틴의 투여와 연계된 추가의 응고의 위험 없이 패혈증, 유착, 상처 치료, 만성 질병 및 일반적인 염증 상태를 포함하는 상태(이에 한정되지 않음) 내에서 염증전 사이토카인, 예컨대 TNF의 효과를 감소시키고/거나 발병을 지연하고, 예방하고, 치료하는데 사용될 수도 있다. 추가로, 본 발명의 카바밀화된 EPO 분자가 괴사에 대한 보호에 효과적이기 때문에, 본 발명의 카바밀화된 EPO 분자는 발작, 심근경색증, 정신 능력의 퇴보 및 노화 관련 상태의 환자에서 패혈증, 유착 및 일반적인 염증 상태의 효과를 감소시키고/거나 발병을 지연시키고, 예방하고, 치료하는데 특히 이롭다.

그러므로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 본 출원의 목적인 "부위"로서 지칭될 수도 있는 EPO 분자의 N-말단기 또는 리신 잔기 하나 이상의 변경으로 변형된 EPO일 수도 있다. 변형은 리신 잔기 또는 N-말단 아미노기와 아미노기 변형제의 반응으로부터 생성될 수도 있다. 예를 들어, 카바밀레이트 단백질, 예컨대 EPO로의 유전학적 반응식으로는 하기가 있다:

다른 양태에서, EPO 분자상의 하나 이상의 리신 잔기는 시아네이트 이온과의 반응에 의해 카바밀화될 수도 있다. 예를 들어, 하나 이상의 리신 잔기는 4-설포페닐아이소싸이오시아네이트와 배양함으로써 변형될 수도 있다. 다른 양태에서, EPO 분자상의 하나 이상의 리신 잔기는 알킬-카바밀화된, 아릴-카바밀화된, 또는 알킬 아이소시아네이트와 아릴-싸이오카바밀화된 것, 아릴 아이소시아네이트, 또는 아릴-싸이오아이소시아네이트 각각이 있다. 다른 양태에서, 하나 이상의 리신 잔기는 반응성 알킬카복실산 또는 아릴카복실산 유도체, 예를 들어 아세트 무수물, 석시닉 무수물, 또는 프탈릭 무수물에 의해 알킬화된다. 또한, 변형된 리신 잔기는 화학적으로 환원될 수도 있다.

또한, 하나 이상의 리신 잔기는 잔기와 트라이니트로벤젠설폰산 또는 그의 염을 반응시킴으로써 카바밀화될 수도 있다. 다른 양태에서, 하나 이상의 리신 잔기는 글라이옥살 유도체, 예를 들어 메틸글라이옥살 이르 3-데옥시글루코손과 반응시킴으로써 변형시켜 상응하는 α-카복시알킬 유도체를 형성할 수도 있다.

카바밀화의 다른 방법은 본 발명에 따라 사용될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Plappet al., J.BIOL. CHEM., 246 : 939-945(1971)]에서 개시되어 있는 방법은 본 발명에 따른 카바밀화된 EPO를 제조하는 적합한 방식이다. 카바밀화의 방법의 다른 예는 문헌[Satake et al, 1990, Biochim. Biophys. Acta 1038 : 125-9]에 논의되어 있고, 에리트로포이에틴 내의 6개의 리신 잔기가 카바밀화된다.

그리고, 상기 언급된 바와 같이, EPO의 임의의 형태는 본 발명에 따라 사용될 수도 있다. 그러므로, 하나의 양태에서 카바밀화처리된 EPO 분자는 α형태이고, 다른 양태에서 카바밀화처리된 EPO 분자는 β형태이고, 다른 형태에서 카바밀화처리된 EPO 분자는 아시알릭 형태이다.

카바밀화 공정은 바람직하게는 적혈구 생성 활성을 실질적으로 감소시키거나 완전하게 제거하기에 충분한 시간동안 수행된다. 하나의 양태에서, 카바밀화 공정은 사이트의 약 90% 이상을 제거하기에 충분한 시간동안 수행된다. 다른 양태에서, 카바밀화 공정은 사이트의 약 95% 이상을 제거하기에 충분한 시간동안 수행된다. 다른 양태에서, 카바밀화 공정은 사이트를 100% 제거하기에 충분한 시간동안 수행된다. 선택적으로, 이는 하나의 양태에서 6개 이상의 리신 잔기에서, 다른 양태에서 7개 이상의 리신 잔기, 다른 양태에서 8개 이상의 리신 간기에서 카바밀화되기에 충분한 시간동안 카바밀화 에리트로포이에틴으로서 고려될 수도 있다. 카바밀화가 일어나기에 충분한 시간은 다양할 수도 있다. 예를 들어, 충분한 카바밀화는 약 6 내지 24시간 이하, 약 10 내지 20시간 이하, 또는 약 16시간 이하의 기간에 걸쳐 발생할 수 있다.

또한, 본 발명에 사용되기 위한 조직 보호성 사이토카인은 본원에 참조로 혼입되어 있는 문헌[Satake et al, 1990, Biochim. Biophys. Acta1038 :125-9]에 개시되어 있는 바와 같은 문자 생물학 기술에 의해, 아기닌, 리신, 티로신, 트립토판 또는 시스테인 잔기의 돌연변이적 치환 및/또는 아미노기의 제거, 제한된 단백질분해에 의해 수득될 수도 있다. 예를 들어, 적합한 조직 보호성 사이토카인은 하기에서 사이트 돌연변이를 갖는 돌연변이된 EPO 하나 이상을 포함한다:

상기 참조된 변형의 예로는 본원에 참조로 혼입된 동시 계속 출원인 미국 특허 공보 제 2003/0104988 호, 제 2002/0086816 호 및 제 2003/0072737 호에 기재되어 있다. 본원에 사용된 뮤테인 명명법에서, 변화된 아미노산은 본래의 아미노산의 첫 번째 문자 코드로 나타내고, EPO 분자 내에서 그의 위치를 나타내고, 대체된 아미노산의 하나의 문자 코드를 나타낸다. 예를 들어 S100E는 아미노산 100에서 글루탐산으로 변화된 세린인 인간 EPO 분자를 지칭한다.

다른 양태에서, 조직 보호성 사이토카인은 상기 돌연변이 사이트의 하나 이상을 포함할 수도 있고, 단 그 사이트 돌연변이는 하기를 포함하지 않는다:

MA, C7A, K20A, P42A, D43A, K45D, K45A, F48A, Y49A, K52A, K49A, S100B, R103A, K116A, T132A, I133A, K140A, N147K, N147A R150A, R150E, G151A, K152A, K154A, G158A, C161A, 또는 R162A.

다른 양태에서, 조직 보호성 사이토카인은 하기의 사이트 돌연변이의 조합을 포함할 수도 있다:

K45D/S1OOE, K97D/Sl00E, A30N/H32T, K45D/R150E, 8103E/L108S, K140A/K52A, Kl40A/K52A/K45A, K97A/K152A, K97A/K152A/K45A, K97A/K152A/K45A/K52A, K97A/K152A/K45A/K52A/K140A, K97A/K152A/K45A/K52A/K140A/K154A, N24K/N38K/N83K, 및 N24K/Y15A. 다른 양태에서, 조직 보호성 사이토카인은 상기 조합의 임의의 것을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 조직 보호성 사이토카인은 하기 치환의 조합중 임의의 것을 포함하지 않는 사이트 돌연변이를 제공하는 상기 참조의 사이트 돌연변이중 임의의 것을 포함하지 않는다:

N24K/N38K/N83K 및/또는 A30N/H32T.

특정 변형 또는 변형의 조합은 그의 수용체, 예컨대 EPO 수용체 또는 2차 수용체와 결합하는 뮤테인의 능력의 유연성에 영향을 미친다. 그러한 변형 또는 변형의 조합의 예로는 하기가 포함되나, 이로써 제한되지 않는다:

K152W, R14A/Yl5A, 16A, C7A, D43A, P42A, F48A, Y49A, T132A, I133A, T134A, N147A, P148A, R150A, G151A, G158A, C161A, 및 162A. 상응하는 돌연변이는 인산 성장호르몬에서 불리한 당업자에게 공지되어 있는 것들이다. 그러므로, 하나의 양태에서, 조직 보호성 사이토카인은 그의 수용체와 결합하는 뮤테인의 능력의 유연성에 영향 미칠 수도 있는 변형 또는 변형의 조합을 포함하지 않는다. 추가로, 그러한 조직 보호성 사이토카인의 논의는 본원에 참조로 혼입된 공동 출원되어 있는 미국 특허 제 10/612,665 호(2003년 7월 1일 출원됨, 대리인 번호 제 10165-022-999 호, 발명의 명칭 "응답 세포, 조직 및 기관을 보호, 회복 및 향상시키기 위한 재조합 조직 보호 사이토카인 및 이를 코딩하는 핵산")에 포함된다.

추가로, 본 발명에 사용되기에 적합한 조직 보호성 사이토카인으로는 본원에 참조로 혼입된 국제 특허 출원 제 US03/028073 호(2003년 9월 9일 출원됨, 대리인 번호 제 20528.0006 호, 발명의 명칭"내인성 에리트로포이에틴의 조직 보호 활성을 유지하는 장기 작용성 에리트로포이에틴")에 개시되어 있는 장기 작용성인 화학적으로 변형된 EPO 분자가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 적합한 조직 보호성 사이토카인으로는 N-연결된 올리고사카라이드 쇄 또는 O-연결된 올리고사카라이드 쇄 하나 이상으로 하나 이상의 화학적 변형에서 수행되어 온 EPO를 포함하고, 이때 화학적 변형은 산화, 황화, 인화, PEG화, 또는 그의 조합을 포함한다. 하나의 양태에서, 화학적 변형처리된 EPO 분자는 β형태이다. 다른 양태에서, 화학적 변형처리된 EPO 분자는 아시알릭 형태이다. 다른 양태에서, 화학적 변형처리된 EPO 분자는 ARANESP(미국 캘리포니아주 싸우샌드 오크 소재의 앰겐(Amgen)) 또는 CERA(미국 뉴저지주 뉴틀리 소재의 호프만-라 로슈 인코포레이티드(Hoffmann-La Roche Inc.))일 수도 있다.

숙주-발현 벡터의 다양성은 본 발명의 조직 보호성 사이토카인을 제조하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 조직 보호성 사이토카인이 EPO 분자상에서 기초로 하는 경우, 다양한 숙주-발현 시스템이 사용될 수도 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 흥미 있는 에리트로포이에틴을 제조한 다음 정제할 수 있는 비히클을 제공하지만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염될 때 원위치에서 개질된 에리트로포이에틴 유전자 생성물을 나타낼 수 있는 세포도 제공한다. 이들은, 개질된 에리트로포이에틴 생성물 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 에리트로포이에틴-관련 분자 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나, 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터(예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유도된 프로모터(예: 아데노바이러스 말기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구조물을 갖는 인간 세포 시스템을 비롯한 포유동물 세포 시스템(예: HT1080, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)과 같은(그러나, 이들로 한정되지는 않음) 세균, 곤충, 식물, 인간을 비롯한 포유동물 숙주 시스템을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 목적하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 개질 및 처리하는 숙주 세포주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 개질 및 처리는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 처리 및 개질에 특이적인 특징적 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질을 확실히 올바르게 개질 및 처리하는데 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이를 위해, 유전자 생성물의 1차 전사, 당화 및 포스포릴화의 적절한 처리를 위한 세포 기관을 갖는 진핵 숙주 세포를 이용할 수 있다. 이러한 인간 숙주 세포를 비롯한 포유동물 숙주 세포는 HT1080, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 및 WI38을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다.

재조합 단백질의 장기 고수율 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 에리트로포이에틴-관련 분자 유전자 생성물을 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스성 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는 적절한 발현 제어 요소(예: 프로모터, 증진인자, 서열, 전사 종결제, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 조절되는 DNA로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포를 풍부한 배지에서 1 내지 2일간 생육시킨 다음 선택적인 배지에 바꿔 넣는다. 재조합 플라스미드 내의 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하며, 세포가 플라스미드를 염색체로 안정되게 통합하고 생육하도록 함으로써 다시 클로닝되어 세포주 내로 전개시킬 수 있는 포커스를 형성하도록 한다. EPO 뮤테인-관련 분자 유전자 생성물을 발현하는 세포주를 조작하는데 이 방법을 유리하게 사용할 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 EPO-관련 분자 유전자 생성물의 내인성 활성에 영향을 끼치는 화합물의 선별 및 평가에 특히 유용할 수 있다.

다르게는, 삽입된 조절 요소가 내인성 EPO 뮤테인 유전자와 작동가능하게 연결되도록, 안정한 세포주 또는 클로닝된 미생물의 게놈내로 이종 DNA 조절 요소를 삽입함으로써, 세포주 또는 미생물 내에서 내인성 에리트로포이에틴 뮤테인 유전자의 발현 특징을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 통상 "전사 면에서 표시나지 않는" 내인성 EPO 뮤테인 유전자, 즉 통상 발현되지 않거나 또는 세포주에서 매우 낮은 수준으로만 발현되는 EPO 유전자는, 그 세포주 또는 미생물에서 통상적으로 발현되는 유전자 생성물의 발현을 촉진시킬 수 있는 조절 요소를 삽입함으로써 활성화될 수 있다. 다르게는, 세포 유형에 관계없이 작용하는 혼잡스러운 조절 요소를 삽입함으로써, 전사 면에서 표시나지 않는 내인성 EPO 유전자를 활성화시킬 수 있다.

당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 각각 본원에 참고로 인용되어 있는 프랑스 특허 제 2646438 호; 미국 특허 제 4,215,051 호; 미국 특허 제 5,578,461 호; 국제 특허원 제 WO 93/09222 호; 및 국제 특허원 제 WO 91/06667 호에 기재되어 있는 표적화된 동종 재조합 같은 기법을 이용하여, 이종 조절 요소가 내인성 에리트로포이에틴 유전자와 작동가능하게 연결되도록 이 조절 요소를 안정한 세포주 또는 클로닝된 미생물 내로 삽입할 수 있다.

약학 조성물

또한, 본 발명은 본 발명의 조직 보호성 사이토카인을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 염증전 사이토카인, 예컨대 TNF의 효과를 개선시키는 능력 및 세포사로부터 조직을 보호하는 능력을 갖는 것이 유리하고, 상기 사이토카인은 손상, 예컨대 발작 및 심근경색에서 다양한 조직에 대한 위험에서 개별적인 패혈증, 유착, 상처, 만성 질병 및 염증 상태의 치료를 위해 고려되는 것이다.

추가로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 정신 능력의 감퇴, 예컨대 알츠하이머, 파킨슨병 등을 나타내는 개개인에서 패혈증, 상처 및 일반적인 염증 상태의 치료를 위해 고려되는 것이다.

본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 조직 보호성 사이토카인의 치료학적 유효량을 바람직하게는 정제된 형태로 함유한다. 본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"이란 임의의 의학 치료를 유지하는 합당한 이익/위험 비율에서 목적 효과 및 성능을 제공하기에 충분하고 비독성인 조직 보호성 사이토카인의 양을 의미한다.

제형은 투여의 방식에 적합하다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 염증전 사이토카인의 표제 효과, 즉 열, 소모병, 기면, 빈혈, 부종, 허혈, 기관장애 및 인슐린 저항성 또는 염증 사이토카인 관련된 상태, 즉 패혈증, 유착, 상처 치료, 만성 질병 또는 염정 상태가 적절하게 투여된 투여량 및 사용된 전략으로 제공된 치료가능하게 되도록 본 발명의 조직 보호성 사이토카인의 양을 포함한다. 그리고, 하기 상세한 바와 같이, 약학 조성물은 비독성 투여량으로 전달되어야만 한다.

하나의 양태에서, 화학적으로 변형되거나 돌연변이된 에리트로포이에틴은 본 발명의 약학 조성물중에 포함되어 있다. 다른 양태에서, 화학적으로 변형된 에리트로포이에틴은 카바밀화된 EPO이다. 카바밀화된 EPO는 하나 이상의 변형된 리신 또는 변형된 N-말단기를 갖는 EPO 분자이다. 다른 양태에서, 돌연변이된 에리트로포이에틴은 S100E일 수도 있다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물중에서 상기 기술된 본 발명의 임의의 방법에 의해 제조되는 조직 보호성 사이토카인의 혼합물을 사용하는 것을 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 리신 잔기를 변형하는 결과인 카바밀화된 EPO 하나 이상을 포함할 수도 있고, 에리트로포이에틴 내에서 아미노기를 변형시킨 결과인 돌연변이된 EPO, 예컨대 S100E 하나 이상을 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체의 적합한 양 및 조직 보호성 사이토카인의 치료학적 효과량을 포함할 수도 있고, 환자에게 적절한 투여를 위한 형태로 제공된다. 특정 양태에서, 용어 "약학적으로 허용가능한"이란, 동물, 더욱 특히 인간에 사용하는 것으로 연방정부 또는 주정부의 규제국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 통상적으로 인정되는 외국 약전에 기재되어 있음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다.

이러한 약학 담체는 석유, 동물유, 식물유 또는 합성유를 비롯한 오일(예: 땅콩유, 대두유, 광유, 호마유 등) 및 물중 염수 용액과 같은 멸균 액체일 수 있다. 약학 조성물이 정맥내 투여되는 경우에는, 염수 용액이 바람직한 담체이다. 염수 용액, 및 덱스트로즈 및 글라이세롤 수용액도 특히 주사 용액용 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글라이세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글라이세롤, 프로필렌, 글라이콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제도 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 서방성 제제 등의 형태를 취할 수 있다.

본 발명의 화합물은 중성 형태 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 유리 아미노기로 형성된 것, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도되는 것과 같은 유리 카복실기로 형성된 것을 포함한다.

치료 방법 및 투여 방법

상기 언급한 조직 보호성 사이토카인 및 조직 보호성 사이토카인을 포함하는 약학 조성물은 염증전 사이토카인, 예컨대 TNF의 효과의 치료학적 또는 예방학적 치료, 예방, 지연 및 감소로 의도된 것이다. 이들 효과는 열, 소모병, 기면, 빈혈, 부종, 허혈, 기관장애 및 인슐린 저항성을 포함한다. 예를 들어, 하기 실시예 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 염증전 사이토카인의 방출에 연계된 열, 즉 신체의 정상 심부 온도 초과의 신체의 심부 온도 증가를 감소시킨다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 조직 보호성 사이토카인인 카바밀화된 에리트로포이에틴의 투여는 쥐에게 LPS 처리의 결과로서 생긴 열을 50% 초과로 감소시킨다. 조직 보호성 사이토카인은 염증전 사이토카인에 관련된 상태, 예컨대 패혈증 및 패혈증 관련된 상태, 예컨대 유착을 치료하고, 예방하고, 지연시키거나 감소시키기 위해 투여될 수도 있다.

추가로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 하나 이상의 기관 또는 조직에서 염증 상태의 치료 및 예방을 위해 고려되는 것이다. 기관은 기관지 및 폐, 신장 및 요도관계, 및 프로스트레이트를 포함하나, 이로써 한정되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "염증 상태"는 염증 세포 및 내인성 중재 화합물의 순환을 야기하는 항원을 갖는 특정 T 림프구 또는 항체의 반응과 같은 기전에서의 상태를 지칭한다. 몇몇 경우에, 기관 또는 조직의 정상 기능은 혈간 투과성의 증가 및/또는 내장 민무뉘근에 의해 변경될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 기관 또는 조직이 변경되는 정상적인 기능인 염증 상태를 치료하고/거나 예방하기 위해 사용될 수도 있다. 이들 상태는 허혈-관련된 상태, 및 비-허혈-관련된 상태, 예컨대 알레르기, 류마티스 질병, 및 바이러스, 진균 및 박테리아 감염을 포함하는 감염을 포함한다. 추가로, 손상 또는 감염은 급성 또는 만성일 수도 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 허혈 상태하의 염증 상태를 치료하고/예방하는 것, 즉 본건의 기관 및/또는 조직에 공급되는 실질적으로 정상 혈액 상태로 만드는 것으로 고려될 수 있다.

추가로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 상처의 치료를 증강시키는데 사용될 수도 있다. 이는 치료의 양을 개선시키는 않는 한, 합병증의 위함을 감소시키고, 외관상으로 흉터를 완전하게 제거하는 치료하는데 필요한 시간을 감소시킴으로써 달성될 수도 있다. 예를 들어, 절개가 일어나기 전, 중, 후에 본 발명의 조직 보호성 사이토카인이 사용될 때, 완전하게 피해질 수 없는 경우, 현저하게 감소된다. 수술 과정 외에도, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 외상(둔기 손상), 압력(욕창), 화상 및 질병, 예컨대 당뇨 또는 혈관 부족을 포함하나 이에 한정되지 않는 상태로부터 생기는 상처를 어드레싱하는데 유용하다.

더욱이, 조직 보호성 사이토카인 및 본 발명의 약학 조성물은 염증성 사이토카인, 예컨대 TNF의 효과를 어드레싱하는데 사용될 수도 있다. 도 7a 및 7b에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 염증성 사이토카인의 업레귤레이션을 감소시킬 수 있다. IL-6 및 TNF는 각각 손상 또는 감염제에 반응한다. 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 염증전 사이토카인의 효과, 예컨대 열, 소모병, 기면, 빈혈, 부종, 허혈, 기관장애 및 인슐린 저항성을 제거하거나, 감소하고, 예방하고 치료하기 위한 치료학적 투여량으로 투여될 수도 있다. 염증전 사이토카인의 업레귤레이션으로 방해받은 조직 보호성 사이토카인이 주어지면, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 이들의 내인성 기능에 직접적으로 영향 미치지 않고 염증 사이토카인에 의해 방해받는 내인성 기능을 저장할 수도 있다. 추가로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 상승 효과를 제공하기 위해 염증 사이토카인에 관련된 상태를 위한 치료학적 치료와 연계되어 투여될 수도 있다. 예를 들어, 암 또는 다른 만성 질병과 연계된 빈혈은 염증 사이토카인의 효과를 방해하는 본 발명의 조직 보호성 사이토카인의 치료학적 투여량 및 환자의 허마토크릿을 보존하기 위한 재조합 에리트로포이에틴의 전형적인 치료학적 투여량의 투여를 포함한다. 이는 만성 질병이로 인해 트로볼릭 사건의 위험을 크게 감소되는 재조합 에리트로포이에틴의 낮은 투여량의 사용을 허락한다.

본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 전신 또는 만성 투여, 급성 치료 및/또는 간헐적인 투여를 위해 사용될 수도 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 표적 세포, 조직 또는 기관을 보호하거나 증강시키기 위해 만성적으로 투여된다. 다른 양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 손상동안 단일 치료를 위해 급성 투여될 수도 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 순환성 본질로 투여된다.

본 발명의 조성물은 손상 전에 투여될 수도 있다. 그 자체로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 패혈증의 예방, 패혈증의 발병 지연, 및/또는 패혈증으로부터 합병증의 감소를 위한 외과 과정 전에 투여될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 복부 수술전에 환자에게 주어질 수도 있다. 상기 간단히 언급된 바와 같이, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 패혈증, 유착 및 일반적인 염증 상태뿐만 아니라, 수술로부터의 흉터를 외관적으로 감소시키거나 완전하게 제거할 수도 있다.

추가로, 본 발명의 조성물은 손상시에 또는 직후에 투여될 수도 있다. 그러므로, 주요 복부 수술을 한 환자에게 패혈증, 유착, 또는 일반적인 염증 상태로부터의 합병증을 감소하거나, 발병의 지연, 예방을 위해 외과 과정 또는 직후에 본 발명의 조직 보호성 사이토카인을 주어질 수도 있다. 또한, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 손상 동안 또는 후에 투여되는 경우 수술로부터 흉터를 외관적으로 감소시키거나 완전하게 없앨 수도 있다.

예를 들어, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 관개 목적을 위해 사용될 수도 는 반면, 예를 들어 상처를 깨끗이 하는 것은 본 발명의 조직 보호성 사이토카인을 포함하는 염수 용액이 패혈증, 유착 또는 일반적인 염증 상태로부터의 합병증을 감소시키거나, 발병을 지연시키고, 예방하고, 치료하기 위해 투여될 수도 있다. 추가로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 패혈증, 유착, 및/또는 일반적인 염증 상태로부터 합병증을 감소시키고/거나 발병을 지연하고, 예방하고, 치료하기 위해 임산부의 제왕절개에서 주어질 수도 있다. 다른 예로서, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 패혈증, 유착 또는 일반적인 염증 상태의 화학요법동안 환자에게 주어질 수도 있다.

하나의 양태에서, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 패혈증, 유착 또는 일반적인 염증 상태로부터의 합병증을 감소시키거나, 발병을 지연하고, 예방하기 위해 손상의 시점에서 정맥내 투여되고, 직후에는 결정된 시간동안 피하에 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 손상 시점에 정맥내로 약 10㎍/kg의 양으로 투여된 후, 할당 시간동안 정맥내로 10㎍/kg의 양으로 투여될 수도 있다.

양성 패혈증 검사법의 경우에서, 본 발명의 조성물은 보다 많은 심각한 단계, 예를 들어 심각한 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 진행하는 패혈증 상태를 예방하고, 환자를 안정시키고, 패혈증을 치료하기 위해 매일 투여될 수도 있다. 추가로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 공지된 항생제, 항진균제, 항바이러스제 등과 함께 투여될 수도 있고, 이들로는 본원에 참조로 혼입된 국제 공개 공보 제 WO 2004/004656 호에 나열된 것들이 포함된다.

조성물의 투여는 비경구, 즉 소화관을 통하는 것 외의 방법일 수도 있다. 비경구 투여로는 예를 들어, 비경구 투여는 정맥내 주사, 복강내 주사, 동맥내, 근육내, 피내 및 피하 투여가 포함된다. 또한, 조성물은 예를 들어, 경구, 비강, 직장, 질내, 설하, 점막하 및 경피로 투여될 수도 있다. 추가로, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 예컨대, 관류액의 사용; 국소 적용, 예를 들어 외과수술 후 상처 드레싱과 연결된 것; 주사; 카테터; 좌약; 또는 이식물에 의해 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여될 수도 있고, 상기 이식물은 막, 예컨대 실라스틱(silastic) 막, 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질이다. 상기 논의된 투여 방법의 조합도 본 발명의 것으로 고려된다.

하나의 양태에서, 본 발명의 약학 조성물의 투여는 비경구이다. 그러한 투여는 약 0.01 pg 내지 약 5 mg, 바람직하게는 약 1 pg 내지 약 5 mg의 투여량으로 투여될 수도 있다. 하나의 양태에서, 투여량은 약 500 pg 내지 약 5 mg이다. 다른 양태에서, 투여량은 약 1 ng 내지 약 5 mg이다. 다른 양태에서, 투여량은 약 500 ng 내지 약 5 mg이다. 다른 양태에서, 투여량은 약 1 ㎍ 내지 약 5 mg이다. 예를 들어 투여량은 약 500 ㎍ 내지 약 5 mg이다. 다른 양태에서, 투여량은 약 1 mg 내지 약 5 mg이다. 그러한 조성물은 항산화제, 완충액, 정균제 및 고려되는 수령자의 혈액과 혼합될 때 조성물을 실질적으로 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액 또는 현탁액을 포함한다. 본 발명의 이러한 태양에서, 약학 조성물은 물, 알콜, 폴리올, 글라이세린, 식물유 및 그의 혼합물을 포함할 수도 있다.

비경구 투여에 적합한 약학 조성물은 단위 투여량 용기 또는 다회 투여량 용기, 예컨대 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제공될 수 있으며, 동결건조 조건에서 저장될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체(예: 주사용 멸균 염수 용액)만 첨가하면 된다. 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 임시처방 주사 용액 및 현탁액을 제조할 수 있다. 한 양태에서는, 앰뷸런스, 응급실 및 전쟁상황에서 응급용으로, 및 깎는 기계에 의한 위급상황시 사용되기 위해 본 발명의 장기 활성 EPO의 주사 용액을 포함하는 자동주사기가 제공될 수 있다.

정맥내 투여

하나의 양태에서, 통상적인 절차에 따라 본 발명의 약학 조성물을 인간으로의 정맥내 투여에 적합한 약학 조성물로서 제형화시킨다. 예를 들어, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액중 용액이다. 필요한 경우, 약학 조성물은 또한 주사 부위에서의 통증을 경감하기 위하여 리도카인과 같은 국부 마취제 및 가용화제를 추가로 포함할 수 있다. 성분을 별도로 공급하거나, 또는 단위 투여 형태로, 예를 들어 활성 약제의 양을 나타내는 앰풀 또는 사쉐(sachette)와 같은 밀폐된 용기 내의 동결건조된 분말 또는 무수 농축제로서 함께 혼합하여 공급한다. 주입에 의해 본 발명의 조성물을 투여해야 하는 경우에는, 멸균 약제 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입용 병을 사용하여 분배할 수 있다. 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 투여 전에 성분들을 혼합할 수 있도록 멸균 염수의 앰풀을 제공할 수 있다.

경구 투여

당업자는 본 발명의 약학 조성물은 캡슐 또는 정제로서; 분말 또는 과립으로서; 용액, 시럽 또는 현탁액(수성 또는 비수성 액체중)으로서; 식용 포움 또는 휩(whip)으로서; 또는 유화액으로서 제공될 수 있다는 것을 인지한다. 경구 제형은 활성 성분 약 10 내지 약 95중량%를 포함할 수도 있다. 하나의 양태에서, 활성 성분은 경구 제형 내에 약 20 내지 약 80중량%의 양으로 포함된다. 다른 양태에서, 경구 제형은 활성 성분 약 25 내지 약 75중량%를 포함한다.

정제 또는 경질 젤라틴 캡슐은 락토즈, 전분 또는 그의 유도체, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘, 스테아르산 또는 그의 염을 포함할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 식물유, 왁스, 지방, 반고체, 액체 폴리올 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 용액 및 시럽은 물, 폴리올, 당 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다.

추가로, 경구 투여에 의도되는 활성 약제는 위장관에서 활성 약제의 붕해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질로 코팅되거나 상기 물질과 혼합될 수 있다. 예를 들어, 활성 약제는 글라이세릴 모노스테아레이트, 글라이세릴 다이스테아레이트 또는 그의 조합으로 혼합하거나 코팅할 수 있다. 이렇게 하여, 활성 약제가 수시간에 걸쳐 서서히 방출될 수 있고, 필요한 경우 활성 약제를 위 내에서 분해되지 않도록 보호할 수 있다. 경구 투여용 약학 조성물은 특정 pH 또는 효소 조건으로 인해 위장관의 특정 위치에서 활성 약제의 방출이 촉진되도록 제형화될 수 있다.

경피 투여

경피 투여에 적합한 약학 조성물은 장기간동안 수령자의 피부와 긴밀하게 접촉되어 유지되는 별도의 패치로서 제공될 수 있다. 추가로, 국부 투여에 적합한 약학 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸, 오일, 점안액, 로젠지, 향정, 및 구강세척액 및 그의 조합으로서 제공될 수 있다. 피부, 입, 눈 또는 다른 외부 조직으로의 국부 투여의 경우에는, 국부 연고 또는 크림을 바람직하게 사용한다. 연고로 제형화되는 경우에는, 활성성분을 파라핀 또는 수혼화성 연고 기제와 함께 사용할 수 있다. 다르게는, 활성성분을 수중유적형 기제 또는 유중수적형 기제와 함께 크림으로 제형화시킬 수 있다. 점안액의 형태로 국부 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 활성성분이 적합한 담체, 예를 들어 수성 용매에 용해 또는 현탁되어 있는 활성 성분을 포함한다.

비강 투여 및 폐로의 투여

비강 투여 및 폐로의 투여에 적합한 약학 조성물은 분말(바람직하게는 20 내지 500μ의 입자 크기를 가짐)과 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 코 가까이에 둔 분말의 용기로부터 코를 통해 빨리 흡입함으로써, 코로 들이마시는 방식으로 분말을 투여할 수 있다. 선택적인 양태에서, 비강 투여에 적합한 조성물은 액체 담체를 포함할 수 있다(예컨대, 비강 스프레이 또는 비강 점적약제). 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 비강으로 직접 투여된다.

직접 폐 내로 흡입은 깊이 흡입하거나 또는 마우스피스, 및 흡입에 의해 투여하기 위한 조성물은 소정 투여량의 활성성분을 제공하기 위하여 제작될 수 있는 가압된 에어로졸, 연무기 또는 취입기를 비롯한(이들로 한정되지는 않음) 특별하게 맞춤한 장치에 의해 달성될 수 있다. 폐로의 흡입을 위한 약학 조성물은 활성성분의 수용액 또는 오일 용액을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 입인두 내로 넣음으로써 직접 흡입할 수 있다.

직장 투여 및 질강 투여

직장 투여에 적합한 약학 조성물은 좌약 또는 관장약으로서 제공될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 좌약은 활성 성분 약 0.5% 내지 10%를 포함한다. 다른 양태에서, 조약은 활성 성분 약 1% 내지 8%를 포함한다. 다른 양태에서, 활성 성분은 좌약중에 약 2% 내지 약 6%로 존재한다. 본 발명의 이 태양에서 본 발명의 조성물은 결합제 및 담체, 예컨대 트라이글리세라이드를 포함할 수도 있다.

질강 투여에 적합한 약학 조성물은 질좌제, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포움 또는 스프레이 제형으로서 제공될 수 있다.

관류 투여

본 발명의 약학 조성물은 기관 또는 조직(특히, 혈관에 의해)으로 액체를 펌핑하는 관류액을 사용하여 투여될 수도 있다. 그러한 양태에서, 약학 조성물은 본 발명의 조직 보호성 사이토카인 약 0.01 pM 내지 약 30 pM, 바람직하게는 약 15 pM 내지 약 30 nM을 갖는다. 하나의 양태에서, 관류 용액은 약 1 내지 약 25U/ml의 에리트로포이에틴, 5% 하이드록시에틸 전분(약 200,000 내지 약 300,000의 분자량을 갖고, 에틸렌 글라이콜, 에틸렌 클로로하이드린, 염화나트륨 및 아세톤을 실질적으로 함유하지 않음), 25mM KH₂PO₄, 3mM 글루타티온, 5mM 아데노신, 10mM 글루코즈, 10mM HEPES 완충액, 5mM 글루콘산마그네슘, 1.5mM CaCl₂, 105mM 글루콘산나트륨, 200,000단위 페니실린, 40단위 인슐린, 16mg 덱사메타손, 12mg 페놀 레드를 함유하고, 약 7.4 내지 약 7.5의 pH 및 약 320mOsm/l의 삼투압을 갖는 위스콘신 대학(UW) 용액이다. 상기 UW 용액은 본원에 그 전체가 참조로 혼입된 미국 특허 제 4,798,824 호에 상세히 논의되어 있다.

국소 투여

본 발명의 약학 조성물은 치료를 필요로 하는 부위에 국소적으로 투여되는 것이 바람직하다. 그러한 투여는 수술 후 상처 드레싱과 함께 국부 투여, 주사, 카테터, 좌약 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으며, 상기 이식물은 막, 예컨대 실라스틱(silastic) 막, 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질이다.

방출-제어 시스템

추가로, 경피 투여에 과해 상기 간단히 논의된 바와 같이, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 방출-제어 시스템으로 전달될 수도 있다. 예를 들어, 조직 보호성 사이토카인은 정맥내 주입, 이식가능한 삼투압 펌프, 경피 패치, 리포좀 또는 다른 투여 방식을 이용하여 투여될 수도 있다. 그러한 방출-제어 시스템은 치료학적 표적, 즉 표적 세포, 조직 또는 기관의 근접하게 놓여져 전신 투여량의 분율만을 요구할 수도 있다.

투여량

상기 투여방법에서 바람직하고 효과적이고 비독성인 투여량의 선택은 당업자에게 공지된 요소에 따라 당업자에 의해 결정된다. 이들 요소의 예로는 조직 보호성 사이토카인의 형태; 조직 보호성 사이토카인의 약물 동력학적 매개변수, 예컨대 생체이용성, 대사, 반감기 등(당업자에게 제공됨); 치료될 상태; 정상인에서 달성되는 이점; 환자의 체중; 투여 방법; 투여 횟수, 즉 만성, 급성, 간헐적; 수반 약물; 및 투여될 약제의 효능에 영향을 미치는 기타 요소가 있다. 그러므로, 정확한 투여량은 의사의 실시 및 환경을 고려한 판단에 따라 결정되어야만 한다.

치료 키트

또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 콘테이너를 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공한다. 하나의 양태에서, 조직 보호성 사이토카인의 효과량 및 약학적으로 허용가능한 담체는 투여량 비알 또는 기타 용기로 포장될 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물이 비경구 투여에 응용될 때, 예를 들어 동결건조된 상태에서 저장될 수도 있다. 그러므로, 키트는 동결건조 조성물, 무균 액체 담체, 및 주사용 주사기를 포함할 수도 있다.

하나의 양태에서, 키트는 각각의 치료 세션을 위한 담체의 특정량을 첨가하고, 물질의 특정량을 투여하도록 수 개의 치료를 위한 충분한 동결건조 물질을 함유하는 앰풀을 포함한다. 다른 양태에서, 키트는 건조동결된 물질의 특정량 및 담체의 특정량을을 함유하는 용기의 다수를 함유하는 다수의 앰풀을 하나의 앰풀의 내용물과 측정 또는 중량 측정 없는 각각의 치료 세션을 위한 담체 용기 하나와 혼합하는 것을 요구하도록 함유할 수도 있다. 다른 양태에서, 키트는 본 발명의 조직 보호성 사이토카인의 주사 용액을 포함하는 자동주사기를 함유한다. 다른 양태에서, 키트는 동결건조된 조성물을 갖는 앰풀 하나 이상, 담체 용액의 용기 하나 이상, 국소 마취제 갖는 용기 하나 이상, 및 주사기 하나 이상( 등)을 함유한다. 앰퓰 및 용기는 바람직하게는 밀폐되어 있다.

본 발명의 약학 조성물이 관류에 의해 투여될 때, 키트는 바람직하게는 약학 조성물을 갖는 앰풀 하나 이상 및 무균의 약학 등급 수 또는 염수를 갖는 관류 병이상을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 키트는 하나 이상의 마우스피스 또는 특정하게 응용된 직접적으로 폐 흡입을 위한 장치, 예컨대 가압된 에어로졸, 연무기 또는 취입기를 포함할 수도 있다. 본 발명의 이러한 태양에서, 키트는 직접적인 폐 흡입을 위한 장치를 포함할 수도 있고, 이는 약학 조성물, 또는 상기 장치 및 하나 이상의 본 발명의 조직 보호성 사이토카인의 수용액 또는 오일 용액의 앰플을 함유한다.

본 발명의 조직 보호성 사이토카인이 경구, 경피, 직장, 질, 또는 비강용으로 적합하게 될 때, 키트는 바람직하게는 활성 성분을 함유하는 앰풀 하나 이상 및 투여 보조제 하나 이상을 포함한다. 투여 보조제의 예로는 계량 스푼(구강 투여용), 무균의 클리닝 패드(경피 투여용 및 비강 흡인기(비강 투여용))가 포함되나, 이로써 한정되지 않는다. 그러한 키트는 조직 보호성 사이토카인(급성 치료) 또는 다량의 투여량(연장 치료)의 단일 투여량을 포함할 수도 있다.

추가로, 키트는 용액의 하나 이상의 유형을 갖출 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인은 알부민 용액 및 폴리소르베이트 용액으로 제조될 수도 있다. 키트가 폴리소르베이트 용액을 포함하는 경우, 용어 "알부민-미함유"는 용기 라빌 및 키트 메인 패널상에 나타내는 것이 바람직하다.

더욱이, 키트는 약학적 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 정한 형태로 통지될 수 있으며, 상기 통지는 인간 투여에 대해 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영하는 것이다.

패혈증을 결정하기 위한 평가/염증 치료가능성

또한, 본 발명은 조직 보호성 사이토카인이 감염으로부터 생기는 패혈증, 유착 및 염증의 합병증을 감소시키거나, 발병을 지연하고, 예방하고, 치료하는데 효과적일 수 있는지 없는지를 결정하기 위해 평가된다. 실험실용 제어된 패혈증 유도, 유착 유도 또는 염증 반응 유도를 포함하는 평가는 본 발명을 위한 것으로 고려된다.

예를 들어, 본 발명에 따른 적절한 평가는 스프라규 대울리 쥐의 맹장을 장폐색을 피하기 위해 돌막창자판막에 노출시키고 바로 말단으로 결찰하는 블라인드 연구를 포함할 수도 있다. 그 후, 맹장은 배설물의 소량으로 배출하도록 강요되어 뚫어져 짜여진 후, 복강으로 되돌아온다. 기관으로의 배설물의 방출은 차례로, 패혈증, 유착, 염증 또는 그의 조합을 포함하는 감염을 유도한다. 그 후, 복부를 봉합한다. 쥐들을 2개의 그룹으로 나누는데, 하나의 그룹은 염수를 받아들이는 그룹이고, 다른 그룹은 시험된 조직 보호성 사이토카인을 받아들이는 그룹이다. 결찰의 시점에서, 동물들의 다양한 군이 염수 또는 조직 보호성 사이토카인의 소정의 양이 바람직하게는 정맥내로 주어진다. 선택된 처리, 즉 염수 또는 조직 보호성 사이토카인의 피하 투여는 하기 결절 과정에 따른 조성의 시간동안 수행될 수도 있다. 추가로, 연구는 오픈된 쥐의 그룹을 포함하나, 감염으로 처리되지 않을 수도 있다.

그 후, 동물들은 유착 및 질병 점수를 위해 감독될 수도 있다. 하기 표 1은 유착의 형성을 기초로 하는 점수 방법을 제공한다:

각각의 유착에 대한 1점 및 누적 유착 점수를 측정하였다. 하나의 양태에서, 누적 유착 점수는 바람직하게는 8 이하이다. 다른 양태에서, 누적 유착 점수는 약 5 이하이다. 다른 양태에서, 누적 유착 점수는 약 3 이하이다.

또한, 질병 점수는 다양한 요소를 기초로 할 수도 있다. 본 점수에 사용되는 요소는 걷는 자세, 밧줄 거는 능력, 환경에 관한 조사 행동양식, 벽을 따른 거품 패드를 오르는 것, 신체 반응, 예컨대 머리의 세움, 및 산화를 포함하나, 이로써 제한되지 않고, 많은 유착을 형성한다. 예를 들어, 쥐가 아픈 경우, 동물들은 그 주변을 걸으면서 등을 둥그렇게 만다. 추가로, 건강한 쥐의 전형적인 맥박수가 약 300비트/분인 반면, 병든 쥐의 맥박수는 부정확하다. 하기 표 2는 치료를 위해 사용되는 조직 보호성 사이토카인의 효과를 평가하기 위해 질병에 관련한 각각의 동물의 점수를 매기는 방법을 제공한다:

연속적으로, 14 이상의 누적 질병 점수는 동물의 죽음을 나타내고, 훨씬 적은 점수일수록 동물이 상대적으로 건강하다는 것을 나타낸다. 하나의 양태에서, 패혈증-유도된 동물은 본 발명의 조직 보호성 사이토카인 하나 이상으로 8일 이상의 치료 후 약 5 이하의 질병 점수를 갖는다. 다른 양태에서, 치료 후 약 4 이항의 질병 점수를 갖는다. 다른 양태에서, 치료 후 약 2 이하의 질병 점수를 갖는다. 다른 양태에서, 치료 후 약 1 이하의 질병 점수를 갖는다.

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 단지 예로서 든 것이고, 첨부된 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명 및 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 파악되어서는 안 된다.

실시예 1

복부 패혈증 쥐 모델을 사용하는 블라인드 연구

스프라규 대울리 쥐의 맹장을 노출하고, 장폐쇄(증)을 피하기 위해 돌막창자판막에 직접적으로 결절시키고, 18-게이지 바늘로 2회 구멍 뚫고, 배설물의 소량이 배출되도록 조심스럽게 짜낸 후, 복강으로 되돌린다(감염을 유도하는 복막으로 도입된 배설물).

동물을 2개의 그룹으로 나눈다:

그룹 1: 패혈증이 유도됨, 염수로 치료함(n=8). 결절의 시점에서, 그룹 1의 동물들은 정맥 내로 염수 100㎕를 제공한다. 1일 피하 염수 투여(100㎕)를 8일동안 또는 죽을 때까지 실시한다.

그룹 2: 패혈증이 유도됨, 카바밀화된 EPO로 치료함(n=8). 결절의 시점에서, 동물들에게 염수 100㎕중의 카바밀화된 EPO 10㎍/kg을 정맥 내로 제공한다. 100㎕염수중의 10㎍/kg의 투여량에서 1일 피하 투여를 8일동안(또는 죽을때까지) 실시한다.

질병률 및 사망률

그룹 1에서, 동물의 약 50% 미만이 8일 후 생존했다. 그러나, 그룹 2에서는 생존률이 도 1에 도시된 바와 같이 약 50% 초과였다. 특히, 치료 후 어느 날은 그룹 1의 동물들에 대한 생존률이 약 60%였을 때, 그룹 2에 대한 동물들의 생존률은 약 80%였다. 그러나, 3일 후, 그룹 1의 생존률은 약 25%의 생존률로 급격하게 떨어진 반면, 그룹 2의 동물들의 생존률은 약 60% 초과였다. 그러므로, 본 발명의 카바밀화된 EPO를 받아들이는 동물은 염수를 받아들이는 동물보다 훨씬 더 높은 생존율을 갖는다.

누적 유착 점수

표본을 유산소 및 무산소 배양을 위해 복막액 및 종기로부터 취하였다. 유산소 배양을 위해, 시료를 37℃에서 24시간동안 EMB상의 혈액상에서 배향하였다. 무산소 배양을 위해, 시료를 무산소 혈액 한천 상에서 층화하고 37℃에서 가스-팍(Gas-Pak) 항아리 중에서 배양하였다. 콜로니를 성장시키는 것을 미생물학적인 표준 기술로 동정하였다.

죽은 동물을 4시간 내에 부검하고, 사망의 원인을 기록하였다. 본원에 전술된 상기 표 1을 이용하여, 24시간 상처 후의 각각의 동물에 대해 누적 유착 점수를 계산한 후, 그룹에 대해 평균을 내었다(도 2에 도시됨). 특히, 그룹 1의 평균 총 점수는 약 10이였고, 본 발명의 카바밀화된 EPO는 염수를 받아들이는 동물보다 적은 유착 점수를 가졌다.

질병 점수

본원에 전술된 상기 표 2에 따라 질병 점수를 계산하고, 결과를 도 3에 도시하였다. 특히, 치료 1일 후, 그룹 1 동물의 평균 질병 점수는 약 9인 반면, 그룹 2 동물의 질병 점수는 약 3이였다. 5일 후, 그룹 1 동물은 약 12의 질병 점수를 갖는 반면, 그룹 2 동물은 약 5 이하의 질병 점수를 가졌다.

흉터

또한, 감염으로부터의 쥐의 흉터를 시각적으로 조사하였다. 그룹 2의 쥐는 그룹 1의 쥐보다 흉터가 작았다.

실시예 2

복부 패혈증 쥐 모델의 블라인드 연구

스프라규 대울리 쥐의 맹장을 노출하고, 장폐쇄(증)을 피하기 위해 돌막창자판막에 직접적으로 결절시키고, 18-게이지 바늘로 2회 구멍 뚫고, 배설물의 소량이 배출되도록 조심스럽게 짜낸 후, 복강으로 되돌린다(감염을 유도하는 복막으로 도입된 배설물). 복부를 3-0 실크 봉합으로 봉합한다.

동물을 3개의 그룹으로 나눈다:

그룹 1: 전술된 바와 같이 오픈되나, 패혈증이 유도되지 않음(n=6).

그룹 2: 패혈증이 유도됨, 염수로 치료함(n=8). 결절의 시점에서, 그룹 2의 동물들은 정맥 내로 염수 100㎕를 제공한다. 1일 피하 염수 투여(100㎕)를 8일동안(또는 죽을 때까지) 실시한다.

그룹 3: 패혈증이 유도됨, 카바밀화된 EPO로 치료함(n=8). 결절의 시점에서, 동물들에게 염수 100㎕중의 카바밀화된 EPO 10㎍/kg을 정맥 내로 제공한다. 100㎕염수중의 10㎍/kg의 투여량에서 1일 피하 투여를 8일동안(또는 죽을때까지) 실시한다.

누적 유착 점수

표본을 유산소 및 무산소 배양을 위해 복막액 및 종기로부터 취하였다. 유산소 배양을 위해, 시료를 37℃에서 24시간동안 EMB상의 혈액상에서 배향하였다. 무산소 배양을 위해, 시료를 무산소 혈액 한천 상에서 층화하고 37℃에서 가스-팍 항아리 중에서 배양하였다. 콜로니를 성장시키는 것을 미생물학적인 표준 기술로 동정하였다.

죽은 동물을 4시간 내에 부검하고, 사망의 원인을 기록하였다. 본원에 전술된 상기 표 1을 이용하여, 24시간 상처 후의 각각의 동물에 대해 누적 유착 점수를 계산한 후, 그룹에 대해 평균을 내었다(도 4에 도시됨). 특히, 그룹 1, 2 및 3의 총 평균 점수는 각각 약 2, 약 10 및 약 6 미만이었다. 그러므로, 본 발명의 카바밀화된 EPO는 염수를 받아들이는 동물보다 적은 유착 점수를 가졌다.

종양 괴사 요소 연구

패혈증의 감소시킬 수 있는 카바밀화된 EPO의 능력 기전을 결정하기 위해서, 일정 시간 후 동물의 혈액중에서 존재하는 종양 괴사 요소(TNF)의 수준을 각각의 그룹에서 TNF-α를 검출할 수 있는 알앤디 시스템즈(R&D Systems)(#RTA00)제 엘리사를 사용하여 시험하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 24시간 후의 TNF의 양은 3개의 그룹 사이에서 현저하게 차이가 났다. 3시간(최대 염증) 후, 시스템에서의 TNF의 양은 모든 3개의 그룹에서 감소되었다. 이들 결과는 유착 뒤의 수용된 기전, 즉 염증 반응이 정확한 기전이 아닐 수도 있다는 것을 제시한다. 사실, TNF 연구는 유착 뒤의 기전이 세포사 때문일 수도 있고, 본 발명의 카바밀화된 EPO가 조직 보호 기능을 갖기 때문에, 세포 괴사로 인해 투여에 따라 유착이 감소될 수도 있다는 것을 제시한다.

흉터

시각적인 시험에서, 그룹 3의 쥐는 그룹 1 및 2의 쥐 보다 흉터가 실질적으로 적다.

실시예 3

복부 패혈증 모델을 사용하는 블라인드 연구

동물을 4개의 그룹으로 나눈다:

그룹 3: 패혈증이 유도됨, rhu-EPO로 치료함(n=8). 결절의 시점에서, 동물들에게 염수 100㎕중의 rhu-EPO 10㎍/kg을 정맥 내로 제공한다. 100㎕염수중의 10㎍/kg의 투여량에서 1일 피하 투여를 8일동안(또는 죽을때까지) 실시한다.

그룹 4: 패혈증이 유도됨, 카바밀화된 EPO로 치료함(n=8). 결절의 시점에서, 동물들에게 염수 100㎕중의 카바밀화된 EPO 10㎍/kg을 정맥 내로 제공한다. 100㎕염수중의 10㎍/kg의 투여량에서 1일 피하 투여를 8일동안(또는 죽을때까지) 실시한다.

질병률 및 사망률

그룹 1(허위 개복수술)에서, 동물들 모두가 생존한 반면, 그룹 2의 동물들은 모두 죽었다. 그룹 3(rhu-EPO)에서 오직 2마리만 생존한 반면, 그룹 4에서는 5마리가 생존했다. 그러므로, 본 발명의 카바밀화된 EPO를 받아들이는 동물이 rhu-EPO를 받아들이는 동물보다 훨씬 높은 생존률을 갖는다.

흉터

시각적인 시험에서, 그룹 4의 쥐는 그룹 1 내지 3의 쥐 보다 흉터가 실질적으로 적다.

실시예 4

쥐에서 반응을 유도하는 리포폴리사카라이드

본 실시예의 목적은 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 유도된 패혈증-유사 증 상에서 카바밀화된 에리트로포이에틴의 효과를 결정하고자 함이다. LPS는 동물에서 패혈증-유사 반응(심부 온도 증가 및 사이토카인 유도)을 유도하는 박테리아의 표면상에 존재하는 내독소이다. 수컷 스프라규 대울리 쥐(300 내지 350 g)에 240 ug/kg로 복강내(i.p.)로 투여하였다. 그 후, 동물을 10 ug/kg로 정맥내(i.v.)로 염수로 처리(n=6)하거나, 카바밀화된 에리트로포이에틴으로 처리(n=6)하였다. 그 후, 농도에 의존적인 심부 체온상의 LPS의 효과를 결정하였다. 다르게는, 카바밀화된 에리트로포이에틴(2 ul중에서 5 ug/kg)의 뇌실새의 직접적인 적용(문헌[Seeley et al, (1996) Horm Metab Res. 28 : 664-8])을 적용의 루트가 심부 온도를 상이하게 변경하는지를 결정하기 위해 투여하였다. 심부 온도를 첫 번째 24시간동안 감독하였다. 두 번째 경우에서, 혈액을 후속적인 사이토카인(예: TNF, IL-6) 분석을 위해 혈액을 제거하였다. 문헌[Seeley et al, (1996) Horm Metab Res. 28 : 664-8]

심부 온도

LPS에 의해 유도된 패혈증-유사 상태와는 달리, LPS를 투여한 동물은 2상 열을 겪는다. 고열이 첫 번째 상은 고통 받는 개개의 혈압 및 각성에서 증가에 의해 수반되는 정밀한 온도 증가를 특징으로 한다. 반면, 열의 두 번째 상은 덜 정밀하고, 정상압 또는 저혈압 ,및 기면증 및 졸음증중 하나에 의해 수반된다. 이론적으로, 천이를 나타내는 열의 상은 질병과 싸우기 위해 몸이 이용하는 전략이다(문헌[Romanovsky et al., Am. J. Physiol, 271 : R244-R253, 1996]). 본 실시예에서, 카바밀화된 에리트로포이에틴을 LPS로 치료될 동물에게 투여하는 것은 도 6에 도시된 바와 같이 열의 상 둘 다를 감소시키는 결과를 초래한다.

TNF 및 IL-6의 혈청 수준

LPS에 반응하는 열을 중재하기 위한 카바밀화된 에리트로포이에틴의 능력은 도 7a 및 7b에 도시된 바와 같이 발열성 사이토카인, 예컨대 TNF 및 IL-6의 존재를 억제하는 그의 능력에 의해 상호관련되어 있다. 엘리사는 쥐로부터 샘플링된 혈청 내에서 TNF 및 IL-6의 존재를 결정하는데 사용된다. 도 7a 및 7b는 카바밀화된 에리트로포이에틴으로 처리하는 것이 염증전 사이토카인, IL-6 및 TNF의 존재를 현저하게 감소시킨다는 것을 나타낸다.

카바밀화된 에리트로포이에틴의 말단 투여 대 중심 투여

시상하부상의 카바밀화된 에리트로포이에틴의 직접적인 효과를 배제하기 위해, 카바밀화된 에리트로포이에틴을 상기 언급된 방법으로 정맥 내로 투여하였다. 도 8a 및 8b에 도시된 바와 같이, 카바밀화된 에리트로포이에틴을 말단에 투여하는 것과 중심에 투여하는 것의 심부 온도 감소에는 상관관계가 없다. 발열성 사이토카인상의 카바밀화된 에리트로포이에틴의 효과면에서 보면, 카바밀화된 에리트로포이에틴은 발열성 사이토카인의 억제를 통해 심부 온도에 영향을 미치는 것으로 보인다. 이는 조직 보호성 사이토카인, 예컨대 카바밀화된 에리트로포이에틴이 만성 질병(소모졍, 기면증, 빈혈 등)에서 이들 사이토카인의 효과를 중재하고, 경감시키거나 예방하는데 유용하다는 것을 제시한다.

실시예 5

쥐에서 허혈성 피부판상에서의 에리트로포이에틴 유사체의 효과

허혈성 피부판 상처 회복상에서 카바밀화된 에리트로포이에틴의 효과를 측정하기 위해 허혈성 상처판 모델을 수행하였다. 수컷 스파라구 다울리 쥐(300 내지 350 g)을 아이소플루란을 사용하여 마취하였다. 그 후, 쥐의 등에서 길이 9 cm 및 폭 3 cm의 피부판을 잘라냈다. 이 판은 피부, 피하층 및 피부밑근육층을 포함하고 있었다. 문헌[Buemi, M., et al., (2002) Acta Derm. Venereol. 82 : 411-417; Sarrau, A., et al., (2003) Laryngoscope. 113 : 85-89]에 기술된 바와 같은 절개법에 따라 상기 판을 들어올린 직후 다시 침상에서 봉합하였다. 수술 후 즉시 에리트로포이에틴 유사체, 카바밀화된 EPO를 동물에게 투여(0.3㎍/kg 피하내)하고, 1일, 2일 및 이어서 2주간 분석하였다. 동물의 몸무게를 측정하고 상처를 매주 사진찍었다. 문헌[Buemi, M., et al., (2002) Acta Derm. Venereol. 82 : 411-417]. 그 후, 치료된 상처의 면적을 하기 과정에 따라 34일동안의 동물 사진을 기초로 하여 정량화하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 카바밀화된 에리트로포이에틴을 받아들이는 쥐는 동일한 기간의 염수로 치료된 쥐들보다 더 높은 %로 상처가 치료되었다.

전술된 본 발명 및 첨부된 청구의 범위는 본원에 개시된 특정 양태에 의해 그 범위가 제한되지 않으며, 이들 양태는 본 발명의 몇몇 태양을 설명하기 위해 의도된 것이다. 특히, 당업자는 카바밀화된 EPO를 사용하여 상기 실시예를 수행할지라도, 본 발명의 조직 보호성 사이토카인을 사용하는 것과 유사한 결과가 예상된다는 것을 숙지해야 한다. 임의의 등가의 양태는 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다. 실로, 본원에 기술되고 제시된 것들 외에도 상기 기술로부터 본 발명의 다 양한 변형이 당업자에게 명백하다. 또한, 그러한 변형은 첨부된 청구의 범위의 범위 내로 의도되는 것이다. 상기 인용된 모든 특허 및 특허 출원은 그 전체가 본원에 참조로 혼입되어 있다.

Claims

약학 담체중의 조직 보호성 사이토카인 하나 이상의 치료학적 효과량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 염증전 사이토카인의 효과를 감소시키거나, 이의 발병을 지연시키거나, 예방하거나, 치료하는 방법.
제 1 항에 있어서,

하나 이상의 조직 보호성 사이토카인이 화학적으로 변형된 에리트로포이에틴 또는 돌연변이된 에리트로포이에틴을 포함하는 방법.
제 2 항에 있어서,

에리트로포이에틴이 하기로 구성된 군에서 선택되는 방법:

i) 시알산 잔기가 부족한 에리트로포이에틴;

ii) 적어도 시알산 잔기가 없는 에리트로포이에틴;

iii) 적어도 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물이 없는 에리트로포이에틴;

iv) 하나 이상의 글라이코시다제를 갖는 천연 에리트로포이에틴의 처리로 인해 적어도 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴;

v) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴;

vi) 화학적으로 감소된 산화된 탄수화물 하나 이상을 갖는 에리트로포이에틴;

vii) 하나 이상의 변형된 아기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

viii) 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 갖거나 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기의 변형을 갖는 에리트로포이에틴;

ix) 적어도 변형된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

x) 적어도 변형된 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

xi) 적어도 변형된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

xii) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴;

xiii) 에리트로포이에틴 분자내의 시스틴 결합 하나 이상의 오프닝을 갖는 에리트로포이에틴; 또는

xiv) 결절된 에리트로포이에틴.
제 3 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과가 부족한 방법.
제 4 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 카바밀화된 에리트로포이에틴인 방법.
제 2 항에 있어서,

돌연변이화된 에리트로포이에틴이 하기로 구성된 군에서 선택된 방법:

C7S, RlOI, V11S, L12A, E13A, R14A, R14B, R14E, R14Q, Y15A, Y15F, Y15I, K20A, K20E, E21A, C29S, C29Y, C33S, C33Y, P42N, T44I, K45A, K45D, V46A, N47A, F48A, F48I, Y49A, Y49S, W51F, W51N, Q59N, E62T, L67S, L70A, D96R, K97D, S100R, S100E, S100A, S100T, G101A, G101I, L102A, R103A, S104A, S104I, L105A, T106A, T106I, T107A, T107L, L108K, L108A, S126A, F142I, R143A, S146A, N147K, N147A, F148Y, L149A, R150A, G151A, K152A, L153A, L155A, C160S, I6A, C7A, B13A, N24K, A30N, H32T, N38K, N83K, P42A, D43A, K52A, K97A, K116A, T132A, I133A, T134A, K140A, P148A, R150B, G151A, K152W, K154A, G158A, C161A 및/또는 R162A.
제 6 항에 있어서,

돌연변이된 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과가 부족한 방법.
제 1 항에 있어서,

염증전 사이토카인이 인터루킨 또는 TNF를 포함하는 방법.
제 8 항에 있어서,

염증전 사이토카인이 TNF인 방법.
제 1 항에 있어서,

염증전 사이토카인 효과가 열, 소모병, 기면, 빈혈, 부종, 허혈, 기관장애 및 인슐 린 저항성을 포함하는 방법.
약학 담체중의 하나 이상의 보호성 사이토카인의 치료학적 효과량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 염증전 사이토카인의 효과와 연계된 상태의 발병을 치료하고, 예방하고, 지연시키는 방법.
제 11 항에 있어서,

하나 이상의 조직 보호성 사이토카인이 화학적으로 변형된 에리트로포이에틴 또는 돌연변이된 에리트로포이에틴을 포함하는 방법.
제 12 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 하기로 구성된 군에서 선택되는 방법:

i) 시알산 잔기가 부족한 에리트로포이에틴;

ii) 적어도 시알산 잔기가 없는 에리트로포이에틴;

iii) 적어도 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물이 없는 에리트로포이에틴;

iv) 하나 이상의 글라이코시다제를 갖는 천연 에리트로포이에틴의 처리로 인해 적어도 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴;

v) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴;

vi) 화학적으로 감소된 산화된 탄수화물 하나 이상을 갖는 에리트로포이에틴;

vii) 하나 이상의 변형된 아기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

viii) 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 갖거나 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기의 변형을 갖는 에리트로포이에틴;

ix) 적어도 변형된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

x) 적어도 변형된 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

xi) 적어도 변형된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

xii) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴;

xiii) 에리트로포이에틴 분자내의 시스틴 결합 하나 이상의 오프닝을 갖는 에리트로포이에틴; 또는

xiv) 결절된 에리트로포이에틴.
제 13 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과가 부족한 방법.
제 14 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 카바밀화된 에리트로포이에틴인 방법.
제 12 항에 있어서,

돌연변이화된 에리트로포이에틴이 하기로 구성된 군에서 선택된 방법:

C7S, RlOI, V11S, L12A, E13A, R14A, R14B, R14E, R14Q, Y15A, Y15F, Y15I, K20A, K20E, E21A, C29S, C29Y, C33S, C33Y, P42N, T44I, K45A, K45D, V46A, N47A, F48A, F48I, Y49A, Y49S, W51F, W51N, Q59N, E62T, L67S, L70A, D96R, K97D, S100R, S100E, S100A, S100T, G101A, G101I, L102A, R103A, S104A, S104I, L105A, T106A, T106I, T107A, T107L, L108K, L108A, S126A, F142I, R143A, S146A, N147K, N147A, F148Y, L149A, R150A, G151A, K152A, L153A, L155A, C160S, I6A, C7A, B13A, N24K, A30N, H32T, N38K, N83K, P42A, D43A, K52A, K97A, K116A, T132A, I133A, T134A, K140A, P148A, R150B, G151A, K152W, K154A, G158A, C161A 및/또는 R162A.
제 16 항에 있어서,

돌연변이된 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과가 부족한 방법.
제 11 항에 있어서,

염증전 사이토카인의 효과와 연계된 상태가 패혈증, 유착, 상처, 염증 또는 만성 질병을 포함하는 방법.
포유동물에서 염증전 사이토카인의 효과를 감소시키거나, 발병을 지연시키거나 예방하거나 치료하는데 효과적인 양의 하나 이상의 조직 보호성 사이토카인을 포함하는 약학 조성물.
제 19 항에 있어서,

하나 이상의 조직 보호성 사이토카인이 화학적으로 변형된 에리트로포이에틴 또는 돌연변이된 에리트로포이에틴을 포함하는 약학 조성물.
제 20 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 하기로 구성된 군에서 선택되는 약학 조성물:

i) 시알산 잔기가 부족한 에리트로포이에틴;

ii) 적어도 시알산 잔기가 없는 에리트로포이에틴;

iii) 적어도 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물이 없는 에리트로포이에틴;

iv) 하나 이상의 글라이코시다제를 갖는 천연 에리트로포이에틴의 처리로 인해 적어도 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴;

v) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴;

vi) 화학적으로 감소된 산화된 탄수화물 하나 이상을 갖는 에리트로포이에틴;

vii) 하나 이상의 변형된 아기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

viii) 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 갖거나 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기의 변형을 갖는 에리트로포이에틴;

ix) 적어도 변형된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

x) 적어도 변형된 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

xi) 적어도 변형된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

xii) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴;

xiii) 에리트로포이에틴 분자내의 시스틴 결합 하나 이상의 오프닝을 갖는 에리트로포이에틴; 또는

xiv) 결절된 에리트로포이에틴.
제 21 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과가 부족한 약학 조성물.
제 22 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 카바밀화된 에리트로포이에틴인 약학 조성물.
제 20 항에 있어서,

돌연변이화된 에리트로포이에틴이 하기로 구성된 군에서 선택된 약학 조성물:

C7S, RlOI, V11S, L12A, E13A, R14A, R14B, R14E, R14Q, Y15A, Y15F, Y15I, K20A, K20E, E21A, C29S, C29Y, C33S, C33Y, P42N, T44I, K45A, K45D, V46A, N47A, F48A, F48I, Y49A, Y49S, W51F, W51N, Q59N, E62T, L67S, L70A, D96R, K97D, S100R, S100E, S100A, S100T, G101A, G101I, L102A, R103A, S104A, S104I, L105A, T106A, T106I, T107A, T107L, L108K, L108A, S126A, F142I, R143A, S146A, N147K, N147A, F148Y, L149A, R150A, G151A, K152A, L153A, L155A, C160S, I6A, C7A, B13A, N24K, A30N, H32T, N38K, N83K, P42A, D43A, K52A, K97A, K116A, T132A, I133A, T134A, K140A, P148A, R150B, G151A, K152W, K154A, G158A, C161A 및/또는 R162A.
제 24 항에 있어서,

돌연변이된 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과가 부족한 약학 조성물.
제 19 항에 있어서,

염증전 사이토카인이 인터루킨 또는 TNF를 포함하는 약학 조성물.
제 26 항에 있어서,

염증전 사이토카인이 TNF인 약학 조성물.
제 19 항에 있어서,

염증전 사이토카인 효과가 열, 소모병, 기면, 빈혈, 부종, 허혈, 기관장애 및 인슐린 저항성을 포함하는 약학 조성물.
포유동물에서 염증전 사이토카인의 효과와 연계된 상태의 발병을 치료하고, 예방하고, 지연시키는데 효과적인 양의 하나 이상의 조직 보호성 사이토카인을 포함하는 약학 조성물.
제 29 항에 있어서,

하나 이상의 조직 보호성 사이토카인이 화학적으로 변형된 에리트로포이에틴 또는 돌연변이된 에리트로포이에틴을 포함하는 약학 조성물.
제 30 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 하기로 구성된 군에서 선택되는 약학 조성물:

i) 시알산 잔기가 부족한 에리트로포이에틴;

ii) 적어도 시알산 잔기가 없는 에리트로포이에틴;

iii) 적어도 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물이 없는 에리트로포이에틴;

iv) 하나 이상의 글라이코시다제를 갖는 천연 에리트로포이에틴의 처리로 인해 적어도 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴;

v) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴;

vi) 화학적으로 감소된 산화된 탄수화물 하나 이상을 갖는 에리트로포이에틴;

vii) 하나 이상의 변형된 아기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

viii) 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 갖거나 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기의 변형을 갖는 에리트로포이에틴;

ix) 적어도 변형된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

x) 적어도 변형된 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

xi) 적어도 변형된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴;

xii) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴;

xiii) 에리트로포이에틴 분자내의 시스틴 결합 하나 이상의 오프닝을 갖는 에리트로포이에틴; 또는

xiv) 결절된 에리트로포이에틴.
제 31 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과가 부족한 약학 조성물.
제 32 항에 있어서,

화학적으로 변형된 에리트로포이에틴이 카바밀화된 에리트로포이에틴인 약학 조성물.
제 30 항에 있어서,

돌연변이화된 에리트로포이에틴이 하기로 구성된 군에서 선택된 약학 조성물:

C7S, RlOI, V11S, L12A, E13A, R14A, R14B, R14E, R14Q, Y15A, Y15F, Y15I, K20A, K20E, E21A, C29S, C29Y, C33S, C33Y, P42N, T44I, K45A, K45D, V46A, N47A, F48A, F48I, Y49A, Y49S, W51F, W51N, Q59N, E62T, L67S, L70A, D96R, K97D, S100R, S100E, S100A, S100T, G101A, G101I, L102A, R103A, S104A, S104I, L105A, T106A, T106I, T107A, T107L, L108K, L108A, S126A, F142I, R143A, S146A, N147K, N147A, F148Y, L149A, R150A, G151A, K152A, L153A, L155A, C160S, I6A, C7A, B13A, N24K, A30N, H32T, N38K, N83K, P42A, D43A, K52A, K97A, K116A, T132A, I133A, T134A, K140A, P148A, R150B, G151A, K152W, K154A, G158A, C161A 및/또는 R162A.
제 34 항에 있어서,

돌연변이된 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 효과가 부족한 약학 조성물.
제 29 항에 있어서,

염증전 사이토카인의 효과와 연계된 상태가 패혈증, 유착, 상처, 염증 또는 만성 질병을 포함하는 약학 조성물.