CN1980686A

CN1980686A - 抗肥胖药

Info

Publication number: CN1980686A
Application number: CNA2005800183567A
Authority: CN
Inventors: 安永邦夫; 山地升; 须田年生; 尾池雄一
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Astellas Pharma Inc; Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-04-05
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2007-06-13

Abstract

一种作为有效成分含有血管生成素相关生长因子(AGF)或将其编码的多核苷酸的抗肥胖药、糖尿病治疗药以及/或高血脂症治疗药。一种AGF作为有效成分的具有肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的改善功能的功能性食品或健康食品。进一步，一种含施用AGF或将其编码的多核苷酸的步骤的治疗或预防肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的方法。另外，AGF或将其编码的多核苷酸在制造抗肥胖药、糖尿病治疗药以及/或高血脂症治疗药中的应用。

Description

抗肥胖药

技术领域

本发明涉及以血管生成素相关生长因子(Angiopoietin-RelatedGrowth Factor；以下称为AGF)、其衍生物或其编码的多核苷酸作为有效成分的抗肥胖药。本发明的抗肥胖药，不仅可作为药物制品施用，也可以以作为健康食品(优选功能性食品)或饮料的饮食品的形式施用。

背景技术

尽管肥胖的有害性公知，但近年来肥胖仍显著增加。公知肥胖，即脂肪组织的过剩蓄积，是引起多种疾病的原因，因此提倡将作为疾病的肥胖症作为治疗对象。以肥胖为原因之一而发病的疾病，例如有腰痛、膝关节痛以及骨关节炎。肥胖引起的体重增加是这些整形外科学疾病的直接原因。伴随着肥胖的脂肪过剩蓄积是引起糖尿病、高血脂症、高血压或动脉硬化疾病的原因。已知特别是内脏脂肪的蓄积与这些疾病的发病有关(非专利文献1)。

作为基本的改善肥胖的方法，有运动疗法和饮食疗法，但任何一种都难以持续进行。又，作为除运动和饮食疗法以外的改善方法为使用药物制品，目前世界上主要使用***和奥利司他。但是它们的效果较弱，任一种都存在副作用。在日本仅认可吗吲哚(mazindol)，但仅限定适用于高度肥胖者，给药期间也有限制(非专利文献2)。

伴随着社会的现代化，不仅日本，全世界的糖尿病患者均急剧增加。已知特别是患者数较多的II型糖尿病，肥胖或脂肪的过剩蓄积与发病有关。作为II型糖尿病的治疗，与肥胖症同样有运动疗法和饮食疗法，但同样难以持续进行，而不得以使用药物制品。重度的糖尿病患者进行胰岛素疗法。但是，胰岛素疗法中常有低血糖副作用的危险性。作为口服降血糖药，较多地使用噻唑烷二酮类药剂或磺脲类(SU)药等。但是，噻唑烷二酮类药剂有肝病·浮肿·心力衰竭的副作用，SU药有助长肥胖的副作用，安全起见，亟待寻求一种不会引起体重增加的改善胰岛素抗性药(非专利文献3)。

肥胖的糖尿病患者的内脏脂肪中可观察到脂肪细胞的肥大化。认为从该肥大化的脂肪细胞产生以及分泌引起胰岛素抗性的脂肪细胞因子，作用于附近的脂肪细胞、肌细胞以及/或肝细胞，而引起胰岛素抗性。这样脂肪组织，在糖尿病状态下，变为增强胰岛素抗性的组织(非专利文献4以及5)。

公知，瘦蛋白是与引起肥胖或糖尿病的原因的脂肪组织的蓄积有关的因素。已知瘦蛋白是体重增加抑制激素，缺失瘦蛋白则食欲亢进，且能量消耗减弱而引起肥胖。这种与脂肪组织的蓄积，以及脂肪细胞的肥大化有关的因素的发现，在肥胖症、糖尿病或高血脂症等疾病的治疗药开发中非常有用(非专利文献6)。

血管生成素相关生长因子(AGF)是N末端具有卷曲螺旋(Coiled-coil)域，C末端具有血纤维蛋白原样(Fibrinogen-like)域的分泌蛋白质。AGF与专利文献1中揭示的NL8相同，有报道称将CHO细胞上稳定表达的NL8移植到裸鼠皮下，则使CHO具有致瘤性。又，使用在利用K14启动子的表皮细胞上强制表达AGF的转基因鼠，发现AGF具有血管新生活性、表皮细胞增殖活性、软骨细胞增殖活性、创伤治愈促进活性以及组织再生活性(专利文献1，非专利文献7)。但是，不知道除上述以外的AGF的生理功能。

非专利文献1：「メタボリズム(Metabolism)」，(米国)，1987年，36卷，p.54-59

非专利文献2：「日本臨床」，2003年，61卷，增刊号6，肥満症，p.649-654

非专利文献3：「日本臨床」，2002年，60卷，增刊号9，新時代の糖尿病学3，p.310-331

非专利文献4：「医学のあゅみ」，2000年，192卷，p.513-518

非专利文献5：「医学のあゅみ」，2000年，192卷，p.541-545

非专利文献6：「トレンズ·イン·モレキュラ一·メデイスン(Trends in Molecular Medicine)」，(オランダ)，2002年，8卷，9号，p.442-447

非专利文献7：「プロシデイング·オブ·ザ·ナシヨナル·アカデミ一·オブ·サイ工ンス·オブ·ザ·ュナイテイツド·ステ一ト·オブ·アメリカ(Proceedings of the national academy of

sciences of the United Statesof America)」，(米国)，2003年，100卷，p.9494-

9499

专利文献1：国际公开WO99/15653号小册子

专利文献2：国际公开WO03/083114号小册子

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种新型的抗肥胖药。

解决技术问题的技术方案

本发明人等潜心研究的结果，通过AGF基因敲除(KO)小鼠以及AGF转基因(Tg)小鼠的制备以及分析，判定AGF具有抗肥胖、抗糖尿病以及抗高血脂症的作用。即，发现AGF基因敲除小鼠显示出显著的肥胖(实施例3)。进一步，AGF基因敲除小鼠，发现伴随着肥胖的脂肪组织的重量增加(实施例4)、脂肪细胞肥大化(实施例5)、骨骼肌以及肝脏组织中甘油三酯的量增加(实施例6)。另一方面，发现AGF转基因小鼠(CAG-AGF Tg小鼠；全身强制表达AGF的小鼠)的体重增加得以抑制(实施例3)、脂肪组织的重量增加得以抑制(实施例4)、脂肪细胞的肥大化得以抑制(实施例5)、骨骼肌以及肝脏组织中甘油三酯量减少(实施例6)，进一步，胰岛素敏感性提高，以及脂质代谢以及糖耐量得以改善(实施例16以及实施例17)。进一步，AGF基因敲除小鼠患上高胰岛素血症，且糖耐量异常(参考例2)。进一步，施用表达AGF的腺病毒小鼠中，体重增加得以抑制，且糖耐量得以改善(实施例15以及实施例20)，其他的AGF转基因小鼠(K14-AGF Tg小鼠；表皮强制表达AGF小鼠)中，发现具有抗肥胖作用、脂肪组织减少作用、胰岛素敏感性亢进作用(实施例18以及实施例19)。

从这些见解，明确AGF是抗肥胖、糖尿病、以及/或高血脂症治疗药的有效成分，完成本发明。

即，本发明关于

[1]一种抗肥胖药、糖尿病治疗药、以及/或高血脂症治疗药，其以选自下述(a)～(d)中的多肽，或编码上述多肽的多核苷酸作为有效成分：

(a)含有序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸序列，或序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位氨基酸序列，并且具有抑制体重增加的活性的多肽；

(b)含有在序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸序列，或序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位氨基酸序列中，置换、缺失、以及/或***1～10个氨基酸残基所得的氨基酸序列，并且具有抑制体重增加的活性的多肽；

(c)由与编码序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸序列，或序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位氨基酸序列的DNA在严格条件下杂交的DNA编码，并且具有抑制体重增加的活性的多肽，以及

(d)含有与序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸序列，或序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，并且具有抑制体重增加的活性的多肽；

[2]一种具有肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的改善功能的功能性食品或健康食品，其以上述多肽作为有效成分；

[3]一种治疗或预防肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的方法，其含有对肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的治疗或预防的必要的对象，施用有效量的上述多肽或编码该多肽的多核苷酸的步骤，以及

[4]一种上述多肽或编码谊多肽的多核苷酸的应用，其用于制造抗肥胖药、糖尿病治疗药以及/或高血脂症治疗药。

本说明书中使用的术语“转基因动物”是指将启动子以及基因引入染色体，使基因在所需的部位强制表达的动物，术语“基因敲除动物”是指，通过在染色体中进行基因操作，而特定基因表达缺失的动物。

发明效果

AGF作为抗肥胖药、糖尿病治疗药以及/或高血脂症治疗药的有效成分有用。

附图说明

[图1]表示质粒pBS-loxP-lox71-mAGF-βgeo的构建的模式图。符号“pro.”以及“pri.”分别表示启动子以及引物。

[图2]表示AGF KO小鼠的体重变化的图。横轴表示周龄(周)，纵轴表示体重(g)。又，符号“WT”、“HTR”以及“HM”分别表示WT小鼠、杂合KO小鼠以及纯合KO小鼠。

[图3]表示CAG-AGF Tg小鼠(标准饮食)的生殖器脂肪(白色脂肪组织)重量变化的图。纵轴表示白色脂肪组织重量(g)/体重(g)。又，符号“WT”以及“Tg”分别表示WT小鼠以及Tg小鼠。

[图4]表示CAG-AGF Tg小鼠(高脂肪饮食负荷)的生殖器脂肪(白色脂肪组织)重量变化的图。纵轴表示白色脂肪组织重量(g)/体重(g)。又，符号“WT”以及“Tg”分别表示WT小鼠以及Tg小鼠。

[图5]表示AGF KO小鼠的生殖器脂肪(白色脂肪组织)重量变化(白色脂肪组织重量)的图。纵轴表示白色脂肪组织重量(g)。又，符号“WT”、“HTR”以及“HM”分别表示WT小鼠、AGF杂合KO小鼠以及AGF纯合KO小鼠。

[图6]表示AGF KO小鼠的生殖器脂肪(白色脂肪组织)重量变化(白色脂肪组织重量/体重)的图。纵轴表示白色脂肪组织重量(g)/体重(g)。又，符号“WT”、“HTR”以及“HM”分别表示WT小鼠、AGF杂合KO小鼠以及AGF纯合KO小鼠。

[图7]表示CAG-AGF Tg小鼠的脂肪细胞形态的图。又，符号“TG”、“NTG”分别表示Tg小鼠以及WT小鼠。

[图8]表示AGF纯合KO小鼠的脂肪细胞形态的图。

[图9]表示同窝WT小鼠的脂肪细胞形态的图。

[图10]表示CAG-AGF Tg小鼠的组织(肝脏)中TG含量的图。横轴表示高脂肪饮食负荷期间(月)，纵轴表示TG含量(mg/g组织)。又，符号“WT”以及“Tg”分别表示WT小鼠以及Tg小鼠。

[图11]表示CAG-AGF Tg小鼠的组织(骨骼肌)中TG含量的图。横轴表示高脂肪饮食负荷期间(月)，纵轴表示TG含量(mg/g组织)。又，符号“WT”以及“Tg”分别表示WT小鼠以及Tg小鼠。

[图12]表示AGF KO小鼠的组织中TG含量的图。纵轴表示TG含量(mg/g组织)。又，横轴的符号“L”以及“SM”分别表示肝脏以及骨骼肌，符号“WT”、“HTR”以及“HM”分别表示WT小鼠、杂合KO小鼠以及纯合KO小鼠。

[图13]表示AGF KO小鼠的糖耐量试验结果(血糖值)的图。横轴表示时间(分钟)，纵轴表示血糖值(mg/dL)。又，符号“WT”以及“HM”分别表示WT小鼠以及纯合KO小鼠。

[图14]表示AGF KO小鼠的糖耐量试验结果(血浆胰岛素)的图。横轴表示时间(分钟)，纵轴表示血浆胰岛素(ng/mL)。又，符号“WT”以及“HM”分别表示WT小鼠以及纯合KO小鼠。

[图15]表示CAG-AGF Tg小鼠的氧消耗量的图。横轴中，柱1为“明期”、柱2为“暗期”、柱3为“24小时”，纵轴表示VO₂(mL/kg/min)。又，符号“WT”以及“Tg”分别表示WT小鼠以及Tg小鼠。

[图16]表示表达小鼠AGF的腺病毒给药小鼠的糖代谢试验的结果的图。黑圆圈表示mAGF-Adeno给药小鼠的结果，白圆圈表示Cont-Adeno给药小鼠的结果。又，横轴为经过时间(分钟)，纵轴为血糖值(mg/dL)。

[图17]表示高脂肪饮食饲养的CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的血浆中胰岛素浓度(纵轴；ng/mL)的示意图。符号“TG”、“NTG”分别表示CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠。

[图18]表示高脂肪饮食饲养的CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的血清胆固醇浓度(纵轴；mg/mL)的图。符号“TG”、“NTG”分别表示CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠。

[图19]表示高脂肪饮食饲养的CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的血清游离脂肪酸浓度(纵轴；μEq/L)的图。符号“TG”、“NTG”分别表示CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠。

[20]表示CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的糖代谢试验的结果的图。符号“TG”以及“NTG”分别表示CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠。又，横轴为经过时间(分钟)，纵轴为血糖值(mg/dL)。

[图21]表示CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的胰岛素敏感性试验结果的图。符号“TG”以及“NTG”分别表示CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠。又，横轴为经过时间(分钟)，纵轴为胰岛素给药后的血糖值对于给药前的血糖值的比例(％)。

[图22]表示K14-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠中内脏脂肪组织重量的图。符号“K14-AGF”以及“NTG”分别表示K14-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠。又，纵轴为单位体重的内脏脂肪组织重量的百分率(％)。

[图23]表示K14-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠中皮下脂肪组织重量的图。符号“K14-AGF”以及“NTG”分别表示K14-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠。又，纵轴为单位体重的皮下脂肪组织重量的百分率(％)。

[图24]表示K14-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的胰岛素敏感性试验结果的图。符号“K14-AGF”以及“NTG”分别表示K14-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠。又，横轴为经过时间(分钟)，纵轴为胰岛素给药后的血糖值对于给药前的血糖值的比例(％)。

[图25]表示表达人AGF的腺病毒给药小鼠的糖代谢试验结果的图。黑圆圈表示hAGF-Adeno给药小鼠的结果，白圆圈表示Cont-Adeno给药小鼠的结果。又，横轴为经过时间(分钟)，纵轴为血糖值(mg/dL)。

实施发明的最佳方式

[1]本发明的药物

本发明的抗肥胖药、糖尿病治疗药、以及/或高血脂症治疗药(以下，总称为本发明的药物)，其中作为有效成分含有选自由下述(a)～(d)中的多肽，或编码该多肽的多核苷酸中的至少1种：

(d)含有与序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸序列，或序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位氨基酸序列具有95％以上同一性的氨基酸序列，并且具有抑制体重增加的活性的多肽。

再者，本说明书中的“抗肥胖药”，含有肥胖患者的治疗用药剂，以及有肥胖倾向的对象的预防用药剂两方面。又，本说明书中的“糖尿病治疗药”，含有糖尿病患者的治疗用药剂，以及有糖尿病倾向的对象的预防用药剂两方面。进一步，本说明书中的“高血脂症治疗药”，含有高血脂症患者的治疗用药剂，以及有高血脂症倾向的对象的预防用药剂两方面。

作为本发明的药物的有效成分的多肽，优选序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸序列行成的人AGF，或序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位氨基酸序列形成成的小鼠AGF。

序列3所示的氨基酸序列，是人AGF前体的氨基酸序列。人AGF，N末端具有信号序列(-20～-1)，分泌表达至细胞外时切除了信号序列。由切除了信号序列的序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸序列行成的人成熟AGF，具有生理活性。

同样，序列5所示的氨基酸序列，是小鼠AGF前体的氨基酸序列。小鼠AGF，N末端具有信号序列(-24～-1)，分泌表达至细胞外时切除了信号序列。由切除了信号序列的序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位的氨基酸形成的序列形成的小鼠成熟AGF，具有生理活性。

可作为本发明的药物的有效成分使用的上述多肽(b)，即作为含有在序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸序列，或序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位氨基酸序列中，置换、缺失以及/或***1～10个(例如，1～数个)氨基酸残基所得的氨基酸序列，并且具有抑制体重增加的活性的多肽，可列举含有上述各序列中，置换、缺失以及/或***优选1～7个，更优选1～5个氨基酸残基的氨基酸序列，并且具有抑制体重增加的活性的多肽。

为了维持多肽的功能，优选置换的氨基酸是与置换前的氨基酸具有相似的性质的氨基酸。例如，属于如下所示的各组的氨基酸，为其组内互相具有相似性质的氨基酸。即使将该等氨基酸置换为组内其他的氨基酸，大多也不会损害蛋白质本质的功能。这样的氨基酸置换，称为保守置换，作为保持多肽的功能并变换氨基酸序列的方法是公知的。

非极性氨基酸：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe以及Trp

不带电的氨基酸：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn以及Gln

酸性氨基酸：Asp以及Glu

碱性氨基酸：Lys、Arg以及His

某多肽是否具有抑制体重增加的活性的判定方法，没有特别的限制，例如可采用实施例3中揭示的方法确认。即，可将使用编码上述多肽的基因制备的转基因动物，用标准饮食或高脂肪饮食饲养，通过将其体重变化与野生型动物进行比较而确认。又，可采用实施例15或实施例20中揭示的方法确认。即，将表达上述多肽的腺病毒施用于用标准饮食或高脂肪饮食饲养的小鼠，通过将其体重变化与施用对照腺病毒的情形进行比较而确认。

可作为本发明的药物的有效成分使用的上述多肽(c)中，作为“严格条件”，包括作为用于杂交的条件的“5xSS PE、5x Denhard’s杂交溶液、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、40％甲酰胺、200μg/mL鲑精DNA、37℃过夜”程度的条件，以及作为更严格的条件的“5xSS PE、5x Denhard’s杂交溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、200μg/mL鲑精DNA、42℃过夜”程度的条件。又，作为用于清洗的条件，包括作为缓和条件的“5xSSC、1％SDS、42℃”，作为一般条件的“0.5xSSC、1％SDS、42℃”程度的条件，作为更严格的条件的“0.2xSSC、0.1％SDS、65℃”程度的条件。再者，5XSSPE的组成，为50mmol/L磷酸钠(pH7.4)、0.75mol/L NaCl、以及5mmol/L EDTA，5XSSC的组成为0.75mol/L NaCl以及75mmol/L柠檬酸钠(pH7.0)。

可作为本发明的药物的有效成分使用的上述多肽(d)中，上述同一性，至少为95％以上，优选显示出97％以上的同一性。再者，氨基酸序列的同一性，可使用BLAST检索算法确定。具体的是，可使用BLAST软件包(sgi32bit版，版本2.0.12；由NCBI得到)的bl2seq程序[Tatiana A.Tatusova，Thomas LMadden，FEMS MicrobiolLett.174：247-250(1999)]，根据***设定参数算出。作为序列配对参数，可使用程序名blastp，使用0为Gap***Cost值、0为Gap伸长Cost值、SEG作为Query序列的过滤器、BLOSUM62作为Matrix。

作为可作为本发明的药物的有效成分使用的多肽，优选上述多肽(a)～(d)的N末端含有信号序列的多肽。作为信号序列，只要是可引导多肽透过膜的序列则并无限制，例如，可使用Biochemistry，28(3)，923-930，1989中揭示的信号序列。更优选上述多肽(a)～(d)的N末端，含有序列号3所示的氨基酸序列中信号序列(-20～-1)或序列号5所示的氨基酸序列中信号序列(-24～-1)的多肽；最优选序列号3所示的氨基酸序列或序列号5所示的氨基酸序列。

可作为本发明的药物的有效成分使用的多肽的起源，不限定于人或小鼠。只要符合上述多肽(a)～(d)中的任一种，例如，来自除人或小鼠以外的生物的多肽，或者以序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸序列，或序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位的氨基酸序列为基础，经基因工程人为的改变的多肽，均可作为本发明的药物的有效成分使用。

又，上述多肽，优选重组体。

编码上述多肽(a)～(d)的多核苷酸，即，可作为本发明的药物的有效成分使用的多核苷酸，含有DNA以及RNA，优选DNA。作为上述多核苷酸，例如含有序列号2所示的碱基序列中第61位～第1410位的碱基序列，或序列号4所示的碱基序列中第73位～第1371位的碱基序列，并且编码具有抑制体重增加的活性的多肽的多核苷酸。优选序列号2所示的碱基序列或序列号4所示的碱基序列的多核苷酸，或者序列号2所示的碱基序列中第61位～第1410位的碱基序列，或序列号4所示的碱基序列中第73位～第1371位的碱基序列的多核苷酸。

本发明中，包含治疗或预防肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的方法，该方法包含对肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的治疗或预防的必要的对象，施用有效量的上述多肽(a)～(d)，或编码上述多肽的多核苷酸中的至少1种的步骤。又，本发明中，包含上述多肽(a)～(d)或编码上述多肽的多核苷酸的应用，其用于制造抗肥胖药、糖尿病治疗药以及/或高血脂症治疗药。

作为本发明的药物的多肽的给药方法，例如可列举：通过片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、微粒剂、散剂或口服液等的口服给药；或者静脉注射或肌肉注射等的注射剂、栓剂、透皮给药制剂或跨粘膜给药制剂等非口服给药。特别是受酶的影响的多肽，优选透皮给药或静注等非口服给药，或者使用可使上述多肽不分解且可传送至消化酶影响较小的胃肠道的下部(例如，空肠、回肠、结肠或大肠)的制剂技术。

上述多肽(a)～(d)作为有效成分的制剂，可使用多肽的制剂中常用的药理学上容许的载体或赋形剂，及其他的添加剂，作为药物组合物进行制备。

作为用于非口服给药的注射剂，包含无菌的水性或非水性的溶液剂、混悬剂或乳剂。水溶性的溶液剂或混悬剂中，作为稀释剂，例如含有注射用蒸馏水或生理盐水等。作为非水溶性的溶液剂或混悬剂的稀释剂，例如含有丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油等植物油、如乙醇等醇类、或者聚三梨醇酯80等。上述组合物中还可进一步含有润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、溶解或溶解辅助剂、或者防腐剂等。组合物，可通过例如，通过细菌滤器过滤、添加杀菌剂、或者照射进行灭菌。又，也可制备无菌的固体组合物，在使用时溶解于无菌水及其他的无菌注射用溶剂中使用。

本发明的药物中，含有充分的，即，治疗有效量或药理学有效量的上述多肽(a)～(d)，从而在肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的治疗或预防中产生所需的效果。实际的给药中有效量的确认，例如可通过测定目标疾病恢复的程度进行。实际的应给药量，依据处理个体的症状、年龄、体重等各种因素，优选确定没有显著的副作用且发挥所需的效果的量给药。关于这样的有效量，或毒性等，操作者可使用公知的模型动物容易地确定。例如，通常成年人的有效成分的量优选每天1μg～2g。更优选每天1μg～200mg。

又，代替上述多肽，编码该多肽的多核苷酸也可在基因治疗中作为抗肥胖药、糖尿病治疗药以及/或高血脂症治疗药给药。一般基因治疗中给药形式大多分类为采用非病毒载体的方法和采用病毒载体的方法[『別册実験医学遺伝子治療の基礎技術』羊土社(1996)；『別册実験医学遺伝子導入&発現解析実験法』羊土社(1997)；日本遺伝子治療学会編『遺伝子治療開発研究ハソドブツク』NTS(1999)]。

作为用非病毒载体的方法，例如可列举：用胶囊型脂质体的方法、用静电型脂质体的方法、利用HVJ-脂质体[J.Clin.Invest.93：1458-1464(1994)等]的方法、受体介导引入法、用粒子枪使多核苷酸与金属粒子等载体一起导入细胞的方法、质粒的直接引入法、或者用正电荷聚合物的引入法等向组织导入基因的方法。作为向细胞导入基因的方法，例如公知的脂质转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、或使用微小玻璃管的DNA直接注入法等。

作为病毒载体，已知反转录病毒、腺病毒、或腺伴随病毒载体。具体地说，例如可向脱毒的反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比病毒、SV40、HIV、或仙台病毒等DNA或RNA病毒中引入编码上述多肽(a)～(d)的多核苷酸，通过病毒感染细胞将基因导入细胞内。

含编码上述多肽(a)～(d)的多核苷酸的抗肥胖药、糖尿病治疗药以及/或高血脂症治疗药，可采用直接向体内导入基因的体内(invivo)法，以及向取出到体外的细胞导入基因，再将导入基因的细胞放入体内的先体外后体内(ex vivo)法中的任一种方法给药。

作为用于体内给药的制剂形态，可列举可使用注射或输液的液体制剂。液体制剂的制备，具体地说，例如于磷酸缓冲生理盐水(PBS)等缓冲液、生理盐水、或灭菌水等溶剂中溶解后，根据需要采用薄膜过滤等灭菌，充填于无菌的溶剂中。根据需要，可为混悬剂、冻干粉针、或离心分离浓缩冻干粉针等形态。又，上述多核苷酸，也可作为含有例如脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、石蜡、液体石蜡、硬膏剂、塑胶、グルルコ一ル類、高级醇、树脂、甘油、乳化剂、或混悬剂的半固体的软膏在疾患部位局部给药。这些软膏，根据需要可与亲水性聚合物混合形成片状，贴于疾患部位。

含上述多核苷酸的抗肥胖药、糖尿病治疗药或者高血脂症治疗药的给药，可根据疾病的种类、症状选择适当的方法·部位进行。作为给药方法优选非口服给药。具体地说，例如可于皮下、皮内、血管内、肌肉内、以及用软膏等于表层给药。于皮下、皮内、血管、肌肉等给药可用注射或导管等进行。

本发明的药物，含有充分的，即，治疗有效量或药理学有效量的编码上述多肽(a)～(d)的多核苷酸，从而在肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的治疗或预防中产生所需的效果。实际的给药中有效量的确认，例如可通过测定目标疾病恢复的程度而进行。实际的应给药量，依据处理个体的症状、年龄、体重等各种因素，优选确定没有显著的副作用且发挥所需的效果的量给药。关于这样的有效量，或毒性等，操作者可使用公知的模型动物容易地确定。例如，通常成年人的有效成分的量优选每天0.1μg～200mg。更优选每天0.1μg～20mg。

[2]本发明的健康食品

本发明中的有效成分上述多肽(a)～(d)，不仅可作为药物制品给药，也可为各种形式，例如作为健康食品(优选功能性食品)或饲料的饮食物形式供给。再者，上述食品中包括饮料。

本说明书中“健康食品”是指对健康具有某些效果，或可期望有效的食品，“功能性食品”是指上述“健康食品”中，设计以及加工的，以至可充分表现各种生物体调节功能(例如，消化***、循环***、内分泌***、免疫***、或神经***等生理***的调节功能)的食品。

作为本发明的健康食品，优选具有肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的治疗功能的食品。

本发明还包括“特征为具有肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的改善效果的含有上述多肽(a)～(d)的多肽的食品用组合物”以及“特征为具有肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的改善效果的含有上述多肽(a)～(d)的多肽的功能性食品原料”。含有上述多肽(a)～(d)的多肽的食品用组合物，可含有食品中可使用的载体，及其他的添加剂。

本发明的健康食品，作为有效成分，除含有上述多肽(a)～(d)以外，可与一般的健康食品同样制备。例如，通过在可作为食品摄取的物质中含有有效量的上述有效成分，可制备本发明的健康食品。上述有效量，可根据食品的形状或种类，或摄取该食品的个体的症状、年龄、体重等各种因素而适宜确定。例如，通常成年人的有效成分的量优选每天1μg～2g。更优选每天1μg～200mg。

实施例

以下，通过实施例具体地说明本发明，但并不限定本发明的范围。再者，没有特别说明的情形，可根据公知的方法(“MolecularCloning”，Sambrook，J等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年等)实施。又，使用市售的试药或试剂盒时，可根据市售品的说明书实施。

关于基因敲除动物以及转基因动物的制备，没有特别说明的情形下，可根据Manipulating the Mouse Embryo.A Laboratory Manual.2ndEdition，B.Hogan，R.Beddington，F.Costantini，E.Lacy，Cold Spring Harbor，New York，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994实施；关于使用ES细胞的嵌合小鼠的制备，可根据AL Joyner：Gene Targeting，A PracticalApproach，OXFORD UNIVERSITY PRESS，1993或バイオマニュアルシリ一ズ8，ジ一ンタ一ゲツテイソグES細胞を用いた変異マウスの作製，相沢慎一/著，羊土社，1994实施。

《(参考例1：AGF KO小鼠的制备》

(1)靶载体的制备

采用以下的方法制备依次具有小鼠AGF基因的5’侧的基因组序列(5’长臂(long arm))、pgk启动子、新霉素抗性基因、含小鼠AGF基因的外显子(exon)2的一部分与外显子3的基因组序列(3’短臂(shortarm))、以及HSV-tk基因的靶载体。

即，与WO03/083114号公报的实施例1同样制备对应于小鼠AGF的蛋白质编码区全长的cDNA。该cDNA作为探针根据所附说明书进行小鼠基因组文库(Mouse Genomic，129 SVJ Library；Stratagene公司)的筛选，分离具有约17.9kbp的序列(含AGF基因，mouse-pub-genome序列ACO73775.2的90644～108544)的噬菌体克隆，于质粒pBlueseript(Stratagene公司)中亚克隆。通过限制酶Sal I以及Mfel I切割该质粒克隆(pBN2)，得到约6.2kbp的5’长臂(含mouse-pub-genome序列ACO73775.2的90664～96900)。又，将上述质粒pBN2作为模板，使用由序列号6(CTAGACTAGTTGCAAAGGCGTGCGGCGG人工序列)以及序列号7(CTAGACTAGTGGATCCGCAGGCTTGCTTTGACTTAC人工序列)所示的碱基序列构成的引物组进行PCR，得到约2.0kbp的3’短臂(含mouse-pub-genome序列ACO73775.2的105903～107914)。将5’长臂以及3’短臂分别***质粒pPNT(Cell，1991，65(7)，1153-1163)的Xho I位点以及Xba I位点，从而完成靶载体。

(2)同源重组ES细胞的制备

用限制酶Not I切割得到的靶载体，用电穿孔法引入ES细胞系R1(Proceedings of the National Academy of Sciences，Vol 90，8424-8428，1993)。用含G418的培养基培养ES细胞，得到抗性品系。从ES细胞提取DNA，由DNA印迹分析鉴定仅发生同源重组的克隆。具体地说，将含AGF的外显子4和外显子5，以序列号8(GCCCATGGAGGGATTGTGCAGAGGCTCACGGGGGAGGTGACTGGCAGAGTGGAGTGTATGACCTGCGGCTGGGCCGTCGTGTAGTAGCCGTGTGGTGTGAACAGCAGCAGGAAGTGGAGGCTGGACTGTCATCCAGAGACGGCAGGACGGCTCTGTCAACTTCTTCACCAACTGGCAGCACTACAAGGTGTGTGCTTGTGGTGGGGGTGTCAGAGACTGCTGGGCAGAGAGGACGCCCCCACCCTCTTCCTCCTACCCTTCCAGGCGGGCTTTGGGCGTCCAGAAGGAGAATACTGGCTGGGCCTGGAACCTGTGCATCAGGTGACAAGCCGTGGGGACCACGAGCTGCTGATACTCCTAGAGGACTGGGGGGGCCGTGCAGCACGCGCCCACTACGACAGCTTCTCCTTGGAGCCTGAGAGTGACCACTACCGTCTGCGGCTTGGCCAGTACCACGGCGATGCCGGAGACTCCCTCTCTTGGCACAATGACAAAACCTTTCAGCACTGTGGATAGGGACAGAGACTCATATTCTG小鼠)

所示的碱基序列形成的DNA作为探针，使用用限制酶Hind III切割的DNA进行DNA印迹分析。其结果，可检出对于野生型的4.6Kb同源重组的6.5Kb的DNA片段。

(3)AGF KO小鼠的制备

将得到的ES细胞系，微量注射入由C57BL/6小鼠和DBA/2小鼠杂交第2代的BDF2小鼠得到的胚细胞中，将操作胚移植到子宫内。由移植操作胚的妊娠的小鼠产出嵌合小鼠。通过将嵌合小鼠与C57BL/6小鼠交配，得到缺失AGF的起始密码子的具有突变等位基因的杂合小鼠(以下称为AGF杂合KO小鼠)。通过AGF杂合KO小鼠之间的交配，得到纯合小鼠(以下称为AGF纯合KO小鼠)。将从子代小鼠的尾部分离的基因组DNA作为模板进行PCR，通过由PCR生成的DNA片段的大小确定小鼠的基因型。即，用蛋白酶K处理尾部，甲醇·氯仿提取DNA。提取的DNA，通过异丙醇沉淀以及乙醇沉淀回收，溶解于Tris-EDTA缓冲液(以下，称为TE溶液)中。基于新霉素抗性基因序列以及因靶向缺失的基因组序列设计由以下碱基序列构成的引物。

(新霉素抗性基因)

正向引物：序列号9(5’-agaggctattcggctatgac-3’人工序列)

反向引物：序列号10(5’-caccatgatattcggcaagc-3’人工序列)

(基因组DNA)

正向引物：序列号11(5’-tggcctctgttatcatgctc-3’小鼠)

反向引物：序列号12(5’-ctacctacatccactcctac-3’小鼠)

关于得到的来自子代小鼠的基因组DNA，使用上述引物进行PCR。PCR，使用DNA聚合酶(ExTaq；Takara公司)，进行95℃(5分钟)的热变性之后，实施30个由95℃(1分钟)、60℃(1分钟)以及72℃(1分钟)的循环，进一步进行72℃(7分钟)的延伸反应，分析扩增片段的大小。有突变等位基因的情形，在检测新霉素抗性基因的PCR中，可检出545bp的带，有野生型等位基因的情形，在检测含小鼠AGF外显子1的基因组DNA的PCR中，可检出322bp的带。由这些结果，判定小鼠的基因型。其结果，AGF纯合KO小鼠中，可检出突变等位基因的带，不能检出野生型等位基因的带；AGF杂合KO小鼠中，可一并检出突变等位基因的带以及野生型等位基因的带；野生型小鼠[以下称为同窝(Littermate)WT小鼠]中不能检出突变等位基因的带，可检出野生型等位基因的带。

又，上述参考例1(2)通过进行DNA印迹分析，考察小鼠的基因型。其结果，AGF纯合KO小鼠中，可检出突变等位基因6.5kbp的带，；AGF杂合KO小鼠中，可一并检出突变等位基因6.5kbp的带以及野生型等位基因4.6kbp的带；同窝WT小鼠中可检出野生型等位基因4.6kbp的带。

进一步，将从AGF KO小鼠采血的血液在37℃下静置30分钟后，离心，自其上清液得到血清。将用裂解缓冲液[0.5mol/LHEPES(pH7.2)，1％TritonX-100，10％甘油，10mmol/L Na4P2O7，0.1mol/L NaF，0.1mmol/L Na₃VO₄，4mmol/L EDTA(pH8)，0.05mg/mL抑酶肽，1mmol/L PMSF，0.1mmol/L亮抑酶肽，0.025mmol/L抑胃酶肽A]稀释血清20倍得到的液体再用2×SDS样品缓冲液稀释一倍。以每泳道20μl在10％丙烯酰胺凝胶中进行电泳，然后进行蛋白质印迹。蛋白质印迹中，作为封闭剂使用含5％牛血清蛋白(BSA)的TBS-T[20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，150mmol/L NaCl，0.05％(W/V)Tween20]，作为初次抗体使用抗小鼠AGF抗体(WO03/083114号公报)，作为二次抗体使用将抗家兔抗体(ALl3404；BIO SourCE公司)用含3％BSA的TBS-T稀释5000倍得到的物质。AGF纯合KO小鼠中，通过缺失AGF的带确认AGF的缺失。

《实施例1：CAG-AGF Tg小鼠的制备》

本实施例中，制备在CAG(modified chicken beta-actin promoterwith CMV-IE enhancer)启动子[GENE，108(1991)193-200]控制下全身强制表达小鼠AGF的AGF转基因小鼠(以下称为CAG-AGF Tg小鼠)。用以下的方法制备在质粒pBlues criptII KS(+)(Stratagene公司)的多克隆位点中依次***CAG启动子(1.7kp)、lox71序列、杀稻瘟素基因(bsr)、Poly A信号序列(0.5kb)、lox P序列、小鼠AGFcDNA序列以及IRES(internal ribosomal entry site)-β-geo-Poly A序列(4.5kb)的质粒。

小鼠AGF全长cDNA(WO03/083114号公报)作为模板，由序列号13(AGAAGCTTCACCATGGGGACCGCCAGGCTAC人工序列)以及序列号14(CCGTCGACATTAGATCTTCACAAGCGCAAGCCGGGTC人工序列)所示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR(95℃反应10分钟后，实施45个由94℃15秒、60℃30秒以及72℃2分钟的反应循环)，将得到的PCR产物亚克隆至pZErO-2克隆载体(Invitrogen公司)中。用限制酶HindIII及SaII切割得到的质粒，并***质粒pBluescriptIISK(Stratagene公司)的HindIII及SaII位点，制备具有小鼠AGF全长基因的质粒pBS-mAGF。然后，为了在质粒pBS-mAGF中引入IRES-β-geo-Poly A基因，将具有该基因的质粒pU-San(Hum Mol Genet8：387-396 1999)用限制酶SaII及BgIII切割得到IRES-β-geo-Poly A基因，并***pBS-mAGF的BgIII及SaII位点，制备具有小鼠AGF cDNA序列以及IRES-β-geo-Poly A序列的质粒pBS-mAGF-βgeo。

于具有CAG启动子、lox71序列、bsr以及Poly A信号序列的质粒pCAGlox71bsr(Nucleic Acids Res.1997；25(4)：868-872)的Poly A信号的3，侧***loxP序列，制备具有在lox71序列与loxP序列之间***bsr以及Poly A信号的构建的质粒。即，将含loxP的磷酸化(kination)处理的81bp片段(序列号15：GATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGACCTGCAGCCCGGGGGATC：人工序列)在用限制酶Sma I切割之后，***BAP(细菌碱性磷酸酶)处理的质粒pCAGlox71bsr中，制备质粒loxP-lox71。为了确认***质粒loxP-lox71中的loxP序列，使用T3引物(序列号16：AATTAACCCTCACTAAAGGG)进行测序，分析含***的loxP序列的区域的碱基序列。其结果，由T3引物测定的碱基序列，与上述序列号15所示的碱基序列一致，确认loxP与lox71为相同的方向。用限制酶Spe I切割质粒loxP-lox71，将得到的含CAG启动子、lox71序列、bsr、Poly A信号序列以及loxP序列的片段***质粒pBS-mAGF-βgeo的Spe I位点，制备目标质粒pBS-loxP-lox71-mAGF-βgeo。得到的质粒pBS-loxP-lox71-mAGF-βgeo的构建如图1所示。用限制酶Not I切割谊质粒，得到直链DNA片段[含有CAG启动子(promoter)、lox71序列、bsr、Poly A信号序列(pA)、loxP序列、小鼠AGF cDNA序列以及IRES-β-geo-Poly A序列(pA)]。

采用电穿孔法于TT2 ES细胞[Anal.Biochem.，1993，214(1)：70-76]中引入上述直链DNA片段(0.8V，3μF)。在4μg/mL杀稻瘟素存在下培养ES细胞，选择导入基因的细胞，建立20个克隆。采用电穿孔法将CAG-Cre载体(Blood，1326-1333，Vol100，2002)以环状引入这些细胞中(0.8V，3μF)。

由CAG启动子表达的Cre重组酶，若除去lox71-loxP间的基因，则AGF以及β-geo将由CAG启动子活性表达。因此，为了选择β-geo表达克隆，在G418(200μg/mL)存在下培养ES细胞，选择具有除去lox71-loxP间的基因的构建的细胞。该阶段选择的15个克隆的细胞，是具有CAG启动子(1.7kb)、lox71序列、小鼠AGF cDNA序列以及IRES-β-geo-Poly A序列(4.5kb)，在CAG启动子的控制下常规地表达AGF的ES细胞。将引入CAG-Cre载体之前的未除去lox71-loxP间区域的各克隆的ES细胞作为阴性对照，使用与参考例1(3)同样的抗AGF抗体采用蛋白质印迹法确认AGF在选择的15个克隆的ES细胞上的表达。即，将用溶菌缓冲液以及2×SDS样品缓冲液2倍稀释ES细胞所得的物质作为样品进行蛋白质印迹，确认AGF的表达。从确认表达AGF的ES细胞中，选择8-1、8-2以及9-1的3株系，将其分别微量注射至胚细胞中，将操作胚移植入子宫。由移植操作胚的妊娠的小鼠产出嵌合小鼠。通过将嵌合小鼠与C57BL/6小鼠交配，得到在CAG启动子控制下的常规地表达AGF的转基因小鼠。为了鉴定转基因小鼠，将从子代小鼠的尾部分离的基因组DNA作为模板进行PCR。用蛋白酶K处理尾部，甲醇·氯仿提取DNA。提取的DNA，通过异丙醇沉淀以及乙醇沉淀回收，溶解于TE溶液中。

基于小鼠AGF cDNA序列以及LacZ序列设计由以下碱基序列构成的引物。

(AGF)

正向引物：序列号17(5’-cccactacgacagcttctcc-3’小鼠)

反向引物：序列号18(5’-agccgggtcaacataacagc-3’小鼠)

(LacZ)

正向引物：序列号19(5’-gcgttacccaacttaatcg-3’人工序列)

反向引物：序列号20(5’-tgtgagcgagtaacaacc-3’人工序列)

由导入基因通过使用该引物的PCR，可扩增出用于检测AGFcDNA的325bp片段，和用于检测LacZ的320bp片段，而从小鼠基因组DNA不能扩增谊等大小的片段。关于得到的来自子代小鼠的基因组DNA，使用上述引物进行PCR。PCR使用DNA聚合酶(ExTaq；Takara公司)，进行94℃(5分钟)的热变性之后，实施28个由94℃(1分钟)、62℃(1分30秒)以及72℃(1分30秒)的循环，再进一步进行72℃(7分钟)的延伸反应，分析扩增的片段的大小。其结果，检测AGF cDNA的PCR以及检测LacZ的PCR中均可确认3株系的带。即，3株系均确认种系传递，可分别确认3株系均为在CAG启动子控制下下常规地表达AGF的转基因小鼠。

《实施例2：CAG-AGF Tg小鼠的AGF基因表达》

考察在实施例1制备的CAG-AGF Tg小鼠中，AGF基因的表达程度。使用Trizol试剂(Invitrogen公司)从CAG-AGF Tg小鼠以及同窝的野生型小鼠(同窝WT小鼠)的白色脂肪(WAT)、褐色脂肪(BAT)、大脑、小脑、丘脑下部、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、骨骼肌以及胰腺各组织制备总RNA。使用市售的RNA纯化试剂(RNeasy；Qiagen公司)以及DNA酶(Qiagen公司)将总RNA进行DNA酶处理以及提纯。使用上标第一链***(RT-PCR用)(LIFETECHNOLOGIES公司)将经DNA酶处理的总RNA0.5μg转化为cDNA。

AGF以及内标18S核糖体RNA(18SrRNA)的表达量由定量PCR法测定。定量PCR，使用序列测定***(ABI PRISM 7900HT SequenceDetection System；Applied Biosystems公司)，通过计测实时荧光量而测定。作为模板使用cDNA，作为引物各基因使用各自设计的引物以及Taq Man探针(Taq Man probe)。AGF基因的表达量测定中，作为引物使用序列号21(TCGTGTAGTAGCCGTGTGGTGT小鼠)及序列号22(CACCTGATGCACAGGTTCCA小鼠)，作为PCR试剂使用市售的试剂(SYBR Green PCR Master Mix；Applied Biosystems公司)进行PCR。18SrRNA的表达量测定中，作为引物使用序列号23(TGGTTGATCCTGCCAGTAG小鼠)及序列号24(CGACCAAAGGAACCATAACT小鼠)，作为Taq Man探针使用序列号25(CCGGTACAGTGAAACTGCGAATG小鼠)，作为PCR试剂使用市售的试剂(Taq Man Universal PCR Master Mix；Applied Biosystems公司)进行PCR。

PCR反应中，在实施95℃(10分钟)的初期变性反应之后，反复操作由94℃(15秒)及60℃(60秒)的循环反应45次。基因表达量算出的标准曲线由使用上述cDNA或小鼠基因组DNA作为模板进行同样的反应而制备，基因的表达量由样品间的相对值算出。

其结果，判定CAG-AGF Tg小鼠的组织与WT小鼠的组织相比，AGF基因的表达量上升。特别是骨骼肌、BAT、心脏中的表达显著上升。

《实施例3：基因修饰小鼠的体重变化》

(1)CAG-AGF Tg小鼠的体重变化

将CAG-AGF Tg小鼠与C57BL/6进行2世代回交，得到F2的CAG-AGF Tg小鼠。采用标准饮食(CE-2；CLEA公司)正常饲养CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠。比较6周龄的雌性小鼠的体重时，CAG-AGF Tg小鼠为15.7g±0.8g(SD)，WT小鼠为17.8g±0.5g(SD)；比较12周龄的雌性小鼠的体重时，CAG-AGF Tg小鼠为19.5g±0.7g(SD)，WT小鼠为23.5g±2.5g(SD)，判定CAG-AGF Tg小鼠的体重较轻。

然后，继续对相同小鼠采用高脂肪饮食负荷饲养，考察体重的变化。以高脂肪饮食(high fat diet 32；CLEA公司)正常饲养12周，考察体重的变化。其结果，12周体重的增加量，CAG-AGF Tg小鼠为7.1g±1g(SD)，WT小鼠为21.8g±4g(SD)。因此，判定CAG-AGF Tg小鼠，其标准饮食时抑制体重增加，高脂肪饮食时显著的抑制体重增加，则判定AGF具有抑制体重增加的作用。

(2)AGF KO小鼠的体重变化

采用标准饮食正常饲养AGF纯合KO小鼠、AGF杂合KO小鼠以及同窝WT小鼠。每周测定各小鼠的体重至24周龄。结果于图2中表示。如图2所示，判定AGF纯合KO小鼠，自约12周龄，与WT小鼠相比体重开始变重，之后体重仍继续增加，成为显著的肥胖。AGF杂合KO小鼠，为AGF纯合KO小鼠和同窝WT小鼠中间的表型。

《实施例4：基因修饰小鼠的脏器重量变化》

(1)CAG-AGF Tg小鼠的脏器重量变化

虽然判定CAG-AGF Tg小鼠抑制体重增加，但是为了明确其原因，故测定脏器的重量。摘取CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的生殖器脂肪(WAT)、褐色脂肪(BAT)、肝脏、心脏、肾脏以及脾脏各组织，测量单位体重的组织重量。考察标准饮食饲养的12周龄的小鼠，以及高脂肪饮食饲养12周龄～24周龄12周的小鼠。其结果，褐色脂肪、肝脏、心脏、肾脏以及脾脏中，标准饮食饲养以及高脂肪饮食饲养的CAG-AGF Tg小鼠及WT小鼠中组织重量均没有变化。另一方面，生殖器脂肪(白色脂肪组织)中，标准饮食饲养以及高脂肪饮食饲养的CAG-AGF Tg小鼠比WT小鼠单位体重的组织重量均减少。即，表明CAG-AGF Tg小鼠抑制体重增加，是由于抑制白色脂肪组织的重量增加。即，判定AGF，对其他的脏器重量没有影响，其具有抑制随着肥胖等脂肪组织重量的增加的作用。关于白色脂肪组织的结果如图3(标准饮食)以及图4(高脂肪饮食)所示。

(2)AGF KO小鼠的脏器重量变化

虽然判定AGF KO小鼠体重增加，但是为了明确其原因，故测定脏器的重量。摘取标准饮食饲养的20周龄雌性的AGF纯化KO小鼠、AGF杂合KO小鼠以及同窝WT小鼠的生殖器脂肪(WAT)、褐色脂肪(BAT)、肝脏、心脏、肾脏以及脾脏各组织，测量单位体重的组织重量。其结果，褐色脂肪、肝脏、心脏、肾脏以及脾脏中，AGF纯化KO小鼠、AGF杂合KO小鼠以及WT小鼠中组织重量没有变化。另一方面，生殖器脂肪中，AGF纯化KO小鼠比WT小鼠每个小鼠以及单位体重的组织重量增加。即，表明AGF KO小鼠中体重增加，是由于生殖器脂肪组织等白色脂肪组织的重量增加.因此，明确AGF KO小鼠是与CAG-AGF Tg小鼠相反的表型，明确作为AGF的生理活性，对其他的脏器重量没有影响，其具有抑制脂肪组织的重量增加的作用。关于生殖器脂肪组织(白色脂肪组织)的结果如图5(白色脂肪组织)以及图6(白色脂肪组织/体重)所示。

《实施例5：基因修饰小鼠的脂肪细胞形态变化》

(1)CAG-AGF Tg小鼠的脂肪细胞形态变化

已知由于高脂肪饮食负荷白色脂肪组织的重量增大，且进一步脂肪细胞肥大化。已知脂肪细胞的肥大化与糖尿病的恶化有关[医学のぁゆみ，192，513-518，2000；医学のぁゅみ，192，541-545，2000]，所以考察CAG-AGF Tg小鼠的脂肪细胞的形态。摘取高脂肪饮食饲养12周龄～24周龄12周的CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的生殖器脂肪组织，用10％中性缓冲***液(Wako)固定，石蜡包埋后，制备薄切片以及进行苏木精-伊红(H & E)染色。结果如图7所示。同窝WT小鼠(NTG)中，脂肪细胞肥大化，而CAG-AGF Tg小鼠中，抑制脂肪细胞的肥大化，维持正常的大小。

(2)AGF KO小鼠的脂肪细胞形态变化

已知糖尿病模型小鼠或肥胖模型小鼠中，脂肪细胞随着脂肪组织的重量增大而肥大化[Diabetologia，14(3)，141-148，1978]。已知脂肪细胞的肥大化与糖尿病的恶化有关，所以考察AGF KO小鼠的脂肪细胞的形态。摘取AGF纯化KO小鼠以及同窝WT小鼠的生殖器脂肪组织(WAT)以及褐色脂肪组织(BAT)，用10％中性缓冲***液固定，石蜡包埋后，制备薄切片以及进行苏木精-伊红(H&E)染色。结果如图8(AGF纯合KO小鼠)以及图9(同窝WT小鼠)所示。判定同窝WT小鼠的WAT，脂肪细胞为正常的大小，但AGF纯合KO小鼠的WAT，脂肪细胞肥大化。进一步，AGF纯合KO小鼠与同窝WT小鼠相比，观察到BAT中脂肪的蓄积。

《实施例6：基因修饰小鼠的组织中甘油三酯含量变化》

(1)CAG-AGF Tg小鼠的组织中甘油三酯含量变化

已知肥胖除引起脂肪组织的增大以外，还引起骨骼肌或肝脏中甘油三酯(TG)含量的增加(日本臨床，1995年，53卷，1995年特别号，肥胖症，p354-p358)。因此考察CAG-AGF Tg小鼠的骨骼肌(腓肠肌)以及肝脏组织中的TG含量。采用高脂肪饮食(high fat diet32；CLEA公司)饲养CAG-AGF Tg小鼠(Tg)以及同窝WT小鼠(WT)1个月以及3个月，使用氯仿-甲醇溶液，从各小鼠的骨骼肌以及肝脏组织中提取组织中的TG(生化学実験講座3、脂質の化学、東京化学同人)。使用试剂盒(トリグリセライドEテストワコ一；和光純薬工業社)测定提取的TG的浓度，求算组织中的TG含量。结果如图10(肝脏)以及图11(骨骼肌)所示。判定CAG-AGF Tg小鼠与同窝WT小鼠相比，骨骼肌和肝脏组织中的TG含量均减少。因此，明确AGF具有减少骨骼肌或肝脏中的TG含量的活性，其中已知骨骼肌或肝脏中的TG含量由于肥胖而增加。

(2)AGF KO小鼠的组织中TG含量

考察AGF KO小鼠的骨骼肌(腓肠肌)以及肝脏组织中的TG含量。用上述(1)的方法从AGF KO小鼠以及同窝WT小鼠的骨骼肌以及肝脏组织中提取组织中的TG。使用试剂盒(甘油三酯E试验Wako；和光純薬工业公司)测定提取的TG的浓度，求算组织中的TG含量。结果如图12所示。判定AGF KO小鼠与WT小鼠相比，骨骼肌和肝脏组织中的TG含量显著增加。AGF KO小鼠是与CAG-AGF Tg小鼠相反的表型，明确AGF的生理活性，即，具有减少骨骼肌或肝脏中的TG含量的活性。

《参考例2：AGF KO小鼠的血糖值以及血中胰岛素浓度变化》

进行AGF纯合KO小鼠以及同窝WT小鼠的糖耐量试验，考察血糖值以及血中胰岛素浓度。小鼠禁食16小时后，由腹腔注射施用1g/kg的D-葡萄糖，给药前，以及给药后15、30、60以及120分钟后，从眼静脉采血。使用GLUTEST ACE(三和化学研究所)测定血糖值，使用RIA 2抗体法(SRL公司)测定血中胰岛素浓度。结果如图13(血糖值)以及图14(血浆胰岛素)所示。

WT小鼠，由于糖负荷而上升的血糖值从给药后30分钟后开始减少，然而AGF纯合KO小鼠由于糖负荷而上升的血糖值进一步大幅上升，给药后60分钟后血糖值仍然没有开始减少。因此，判定AGF纯合KO小鼠表现出糖耐量异常。血中胰岛素浓度，WT小鼠中由于糖负荷胰岛素浓度上升，而AGF纯合KO小鼠，从糖负荷前血中胰岛素浓度即为显著的高值，判定其处于高胰岛素血症的状态。因此，判定缺失AGF基因的AGF纯合KO小鼠，可引发糖尿病，表明AGF具有抗糖尿病作用。

《实施例7：CAG-AGF Tg小鼠的氧消耗量》

测定CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的氧消耗量。使用氧消耗量测定装置(OXYMAX；Columbus Instruments公司)，在禁食下，测量小鼠经过24小时的氧消耗量。测定方法根据氧消耗量测定装置中附加的操作说明书进行。测量CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠各14只的氧消耗量，求算明期的12小时(7:00～19:00)、暗期的12小时(19:00～7:00)，以及24小时的氧消耗量，CAG-AGF Tg小鼠与WT小鼠之间进行比较。结果如图15所示。判定在任何时间段，CAG-AGF Tg小鼠的氧消耗量(VO₂)均比WT小鼠多。其结果表明AGF具有使氧消耗量亢进的活性。由于氧消耗量与能量消耗量相关，所以氧消耗量亢进则具有抗肥胖的作用[FEBS Letters，491(1-2)：154-158，2001]。判定AGF具有使氧消耗量亢进的活性，所以证实AGF具有抗肥胖作用。

《实施例8：CAG-AGF Tg小鼠的组织中的基因表达变化》

考察CAG-AGF Tg小鼠的褐色脂肪组织(BAT)以及骨骼肌中的UCP(Uncoupling Protein)基因以及PPAR(PeroxisomeProliferator-Activated Receptor)基因的表达变化。以与实施例2同样的方法，从CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的BAT以及骨骼肌组织制备总RNA，经DNA酶处理后，合成cDNA。采用定量PCR法进行UCP1、UCP3、PPAR-α、PPAR-δ以及β-肌动蛋白的表达量测定。定量PCR以与实施例2中揭示的方法同样的方法实施。作为各基因在定量PCR中使用的引物，使用表1中记载的引物。又，作为市售的PCR试剂，对于β-肌动蛋白使用SYBR Green PCR MasterMix(Applied Biosystems)，对于UCP1、UCP3、PPAR-α以及PPAR-δ，使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)。

[表1]

基因	正向引物	反向引物	TaqMan引物
基因	正向引物	反向引物	TaqMan引物	UCP1	序列号26	序列号27	序列号28
UCP3	序列号29	序列号30	序列号31	UCP1	序列号26	序列号27	序列号28
UCP3	序列号29	序列号30	序列号31	PPAR-α	序列号32	序列号33	序列号34
PPAR-δ	序列号35	序列号36	序列号37	PPAR-α	序列号32	序列号33	序列号34
PPAR-δ	序列号35	序列号36	序列号37	β-肌动蛋白	序列号38	序列号39	不使用

其结果，判定CAG-AGF Tg小鼠的BAT中诱导UCP1的表达，CAG-AGF Tg小鼠的骨骼肌中诱导UCP3、PPAR-α以及PPAR-δ的表达。即，判定AGF诱导BAT中UCP1表达，诱导骨骼肌中UCP3、PPAR-α以及PPAR-δ表达。因此，表明AGF引起热消耗亢进的UCP的表达亢进，热消耗或脂肪代谢亢进的PPAR的表达亢进，是AGF引起氧消耗量的亢进、抑制体重增加以及抑制脂肪组织重量增加等作用的机制之一。

《实施例9：小鼠AGF和人AGF的表达以及纯化》

按照WO03/083114号公报(实施例19)中揭示的方法表达、纯化人AGF以及小鼠AGF。即，将由PCR得到的约1.4kbp(人)或约1.3kbp(小鼠)的DNA片段***质粒pcDNA-Signal-FLAG中得到表达质粒，将该表达质粒引入HEK293细胞。使用抗FLAG-M2单克隆抗体琼脂糖亲和凝胶(ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody Agarose AffinityGel；Sigma公司)的亲和层析纯化人AGF以及小鼠AGF的表达细胞系的培养上清液，得到人以及小鼠的重组AGF蛋白质。

《实施例10：表达小鼠AGF的腺病毒的制备》

将含有小鼠AGF的全长cDNA的质粒pCR2.1-mNew(WO03/083114号公报的实施例1中制备)作为模板，使用正向引物(AATCTAGACACCATGGGGACCGCCAGGCTACG；序列号40)和反向引物(AAGCGGCCGCCAAGCGCACAAGCCGGGTCAA；序列号41)进行PCR(使用pfu DNA聚合酶，95℃10分钟后，45次94℃15秒、60℃30秒、72℃2分钟的循环)。将得到的PCR产物亚克隆至pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen公司制造)后，用限制酶Xba I及Not I切割，并***Xba I及Not I切割的C末端FLAG附加型表达载体pCEP4dE2-FLAG中(与WO02/42448号公报的实施例2同样制备)，得到pCEP4dE2-mAGF-FLAG。将得到的pCEP4dE2-mAGF-FLAG作为模板，使用正向引物(GAAGATCTACCATGGGGACCGCCAGGCTACGC；序列号42)和反向引物(CCGCTCGAGTGATGGGACAGTCACAAGCGC；序列号43)实施PCR(使用PyroBest DNA聚合酶，95℃2分钟后，20次98℃20秒、60℃30秒、72℃1分30秒的循环，继续72℃7分钟)。将得到的PCR产物亚克隆至pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen公司制造)中之后，用限制酶BgIII和Xho I切割生成约1.4kbp的DNA片段，将该DNA片段***腺病毒制备用穿梭载体pAdTrack-CMV(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2509-2514，1998)的BgIII、Xbo I位点，完成pAdTracK-CMV-mAGF。使用该质粒或作为对照的pAdTrack-CMV(空载体)，制备病毒粒子。具体的根据以下方法制备。

用质粒pAdEasy-1(He T.-C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，2509-2514，1998)转化大肠杆菌BJ5183(stratagene公司制造)，制备含质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183[以下称为大肠杆菌BJ5183(pAdEasy-1)]。用限制酶Pmel I切割先前制备的质粒pAdTracK-CMV-mAGF或pAdTrack-CMV，使用其转化大肠杆菌BJ5183(pAdEasy-1)。为了选择重组质粒pAdEasy-1和质粒pAdTracK-CMV-mAGF或pAdTrack-CMV的克隆，从得到的转化体的克隆制备质粒，考察限制酶Pac I的切割模式。通过选择出现的3kb或4.5kb的额外带(extra band)的克隆，在质粒的臂部位，得到所需的引起重组的克隆。

得到的病毒粒子浓度，以与WO02/42448号公报的实施例15同样的方法求算。

《实施例11：使用腺病毒的小鼠AGF蛋白质的表达》

于人胎儿肾脏细胞系293(ATCC号：CRL-1573)中感染实施例10中制备的小鼠AGF蛋白质表达腺病毒以及pAdTrack-CMV对照腺病毒，使每个细胞约100个病毒粒子。具体地说，在I型胶原蛋白包被的6孔平板(旭TECHNO GLASS)中接种3×10⁵个293细胞，用2mL的10％FBS/青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL/DMEM培养基培养1夜后，添加腺病毒6×10⁷个粒子，1夜培养后，置换为2mL的青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL/DMEM培养基。感染后第2天回收培养上清液，以3,000转/分钟，离心分离5分钟，将上清液使用凝胶浓度4-20％的梯度凝胶(第一化学药品)实施SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)。作为初次抗体使用抗小鼠AGF抗体(WO03/083114号公报的实施例5中制备)，作为二次抗体使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗家兔IgG多克隆抗体(Biosource公司制造)进行蛋白质印迹。由对照腺病毒感染的上清液作为样品的情形未检出，仅由小鼠AGF蛋白质表达腺病毒感染的上清液作为样品的情形，检出预想的小鼠AGF分子量的带，表明由表达实施例10中制备的小鼠AGF蛋白质的腺病毒表达实施例11的方法中的小鼠AGF蛋白质。

《实施例12：表达人AGF的腺病毒的制备》

将含人AGF的全长cDNA的质粒(以WO03/083114号公报的实施例18制备；以下称为pCR2.1-hNew)作为模板，使用正向引物(CCAAGCTTACCATGGGGAAGCCCTGGCTGCGTGCGCTACAG；序列号44)和反向引物(AACTCGAGCAGCTTCAGGGGCCGAATGAGCATGGC；序列号1)实施PCR(使用PyroBest^TM DNA聚合酶(宝酒造)，在5％甲酰胺存在下，反复操作98℃20秒、64℃30秒、74℃3分钟的循环35次)。将得到的PCR产物亚克隆至pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen公司制造)中，用限制酶HindIII及Xho I切割，并***由Hind III及Xho I切割的pCEP4(Invitrogen)中，得到pCEP-hAGF。用限制酶Kpn I以及MluI切割pCEP-hAGF，生成约0.43kbp的DNA片段，用Mlu I以及XhoI切割含全长人AGF cDNA的表达质粒(WO03/083114号公报的实施例19制备；以下称为pcDNA-SF-hAGF)得到约0.98kbp的DNA片段，将该等DNA片段***用于制备腺病毒的穿梭载体pAdTrack-CMV(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2509-2514，1998)的Kpn I、Xho I位点，完成pAdTracK-CMV-hAGF。使用该质粒或作为对照的pAdTrack-CMV，以与WO02/42448号公报的实施例14以及实施例15同样的方法利用pAdEasy体系(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2509-2514，1998)，制备病毒粒子。以与WO02/42448号公报的实施例15同样的方法求算得到的病毒粒子的浓度。

《实施例13：抗人AGF抗体的制备》

将全长人AGF纯化蛋白质(WO03/083114号公报的实施例19)对家兔免疫得到抗体。初次免疫使用500μg，第2次～第4次免疫使用250μg，每2周免疫一次。在最终免疫后的第2周，由采全血得到抗血清。使用A蛋白柱(Amersham Bioscience公司制造)纯化抗血清，得到IgG抗体(以下称为抗SF-YP-030 IgG)。

《实施例14：使用腺病毒的人AGF蛋白质的表达》

以与实施例11同样的方法，于人胎儿肾脏细胞系293中感染实施例10以及实施例12中制备的人AGF蛋白质表达腺病毒以及pAdTrack-CMV对照腺病毒，得到培养上清液。除作为初次抗体使用实施例13中制备的抗SF-YP-030 IgG以外，其他采用与实施例11同样的方法，检测培养上清液中的人AGF蛋白质表达。其结果，以由对照腺病毒感染的上清液作为样品时未检出，仅在由人AGF蛋白质表达腺病毒感染的上清液作为样品时，在预想的人AGF分子量处检出带，表明由实施例12制备的人AGF蛋白质表达腺病毒可表达实施例14的方法得到的人AGF蛋白质。

《实施例15：对高脂肪饮食负荷小鼠施用表达小鼠AGF的腺病毒》

对雌性C57BL/6小鼠(CLEA公司)从8周龄开始以高脂肪饮食(high fat diet 32：CLEA公司)饲养。高脂肪饮食负荷小鼠体重增加，在本试验的病毒给药时即38周龄时约54g，成为肥胖。对该等的小鼠各4只，分别以5×10⁹PFU/小鼠/周，尾静脉注射施用实施例10中制备的表达小鼠AGF的腺病毒(mAGF-Adeno)或对照腺病毒(Cont-Adeno)。最初，腺病毒给药12日后的体重，mAGF-Adeno给药小鼠平均减少7.3g，Cont-Adeno给药小鼠减少1.4g。判定mAGF-Adeno给药小鼠中，由于施用具有AGF基因的病毒而在生物体内表达AGF蛋白质，且该AGF蛋白质引起体重减少。

进一步使用该等病毒，实施糖代谢试验。将该等小鼠禁食16小时后，由腹腔注射(ip)0.4g/kg的D-葡萄糖，给药前以及给药后15、30、60以及120分钟后由眼静脉采血。使用GLUTEST ACE(三和化学研究所)测定血糖值。其结果如图16所示。

判定在葡萄糖给药后的所有时间，mAGF-Adeno给药小鼠均比Cont-Adeno给药小鼠的血糖值低，糖耐量得到改善。即，表明由于mAGF-Adeno给药小鼠高表达的AGF蛋白质的作用，可改善糖耐量。

《实施例16：高脂肪饮食负荷的CAG-AGF Tg小鼠的血中胰岛素以及脂质浓度》

以高脂肪饮食饲养6周龄的CAG-AGF Tg小鼠(实施例1)以及同窝WT小鼠(雌)12周。由眼静脉采血，根据各试剂盒附加的说明书中的方法，使用胰岛素免疫试验(栄研化学)测定血浆中胰岛素浓度，使用L型Wako胆固醇(和光純薬)测定血清胆固醇浓度，以及使用NEFA C-Test Wako(和光純薬)测定血清游离脂肪酸浓度，结果如图17(血浆中胰岛素浓度，ng/mL)、图18(血清胆固醇浓度，mg/dL)、图19(血清游离脂肪酸浓度，μEq/L)所示。

其结果表明，胰岛素浓度、胆固醇浓度、游离脂肪酸浓度的任一种，CAG-AGF Tg小鼠(TG)均比同窝WT小鼠(NTG)低。因此，表明由于CAG-AGF Tg小鼠高表达的AGF蛋白质的作用，使胰岛素敏感性亢进，且改善脂质代谢。

《实施例17：CAG-AGF Tg小鼠的糖代谢试验》

进行CAG-AGF Tg小鼠(实施例1)的糖负荷试验，考察AGF引起的糖耐量改善效果。4个月龄的雌性CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠禁食16小时后，腹腔注射1g/kg的D-葡萄糖，给药前以及给药后15、30、60以及120分钟后由眼静脉采血，使用GLUTEST ACE(三和化学研究所)测定血糖值。结果如图20所示。

表明在葡萄糖给药后的所有时间，CAG-AGF Tg小鼠均比同窝WT小鼠的血糖值低，糖耐量得到改善。即，明确由于CAG-AGF Tg小鼠高表达的AGF蛋白质的作用，可改善糖耐量。

然后，于4个月龄的雌性CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠腹腔注射0.75单位/kg的胰岛素。胰岛素给药后、20、40以及60分钟后由眼静脉采血，使用GLUTEST ACE(三和化学研究所)测定血糖值。胰岛素给药后的血糖值对于给药前的血糖值的比例如图21所示。

判定在胰岛素给药后的所有时间，CAG-AGF Tg小鼠均比同窝WT小鼠的血糖值低很多，胰岛素敏感性亢进。即，明确由于CAG-AGF Tg小鼠高表达的AGF蛋白质的作用，可使胰岛素敏感性亢进。

《实施例18：K14-AGF Tg小鼠的体重以及脂肪重量变化》

制备在K14引物控制下强制表达AGF的转基因小鼠(WO03/083114号公报的实施例8)。

判定该小鼠，在表皮细胞高表达AGF蛋白质，由于表达的AGF的作用引起血管新生、组织再生。使用全身高表达AGF的小鼠，与实施例3、实施例4以及实施例17同样，确认在表皮细胞高表达的AGF显示出抗肥胖以及抗糖尿病的作用。

测定8个月龄雌性的K14-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠各5只的体重，明确K14-AGF Tg小鼠平均约21g，与同窝WT小鼠平均约31g相比，体重减少。然后，从K14-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的隔膜至腹腔最下部的区域以2mm的间隔，用实验动物用X射线CT(Aloka公司制造)照射，测定内脏脂肪组织重量以及皮下脂肪组织重量。结果如图22(内脏脂肪组织重量)以及图23(皮下脂肪组织重量)所示。

明确K14-AGF Tg小鼠与同窝WT小鼠相比，内脏脂肪以及皮下脂肪的脂肪组织重量均显著减少。即，判定与CAG-AGF Tg小鼠的情形一样，表达的AGF具有抗肥胖作用以及减少脂肪组织的作用。

《实施例19：K14-AGF Tg小鼠的胰岛素敏感性试验》

考察K14-AGF Tg小鼠的胰岛素敏感性。于8个月龄雌性的K14-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠腹腔内施用0.75单位/kg的胰岛素。胰岛素给药后、20、40、60、80以及100分钟后由眼静脉采血，使用GLUTEST ACE(三和化学研究所)测定血糖值。胰岛素给药后的血糖值对于给药前的血糖值的比例如图24所示。

判定胰岛素给药后的全部时间，K14-AGF Tg小鼠与同窝WT小鼠相比血糖值低很多，胰岛素敏感性亢进。即，明确由于CAG-AGF Tg小鼠高表达的AGF蛋白质的作用，使胰岛素敏感性亢进。

《实施例20：高脂肪饮食负荷小鼠的表达人AGF的腺病毒给药》

实施例15中，小鼠AGF表现出体重减少抑制作用以及糖耐量改善作用。因此通过实施以下的试验确认人AGF具有同样的作用。将实施例12中制备的表达人AGF的腺病毒(hAGF-Adeno)以及对照腺病毒(Cont-Adeno)与实施例15同样分别施用于各3只小鼠，13天后的体重，hAGF-Adeno给药小鼠平均减少4.6g，Cont-Adeno给药小鼠平均增加0.1g。进一步，除腹腔内注射D-葡萄糖0.5g/kg，给药后30、60、90以及120分钟后进行采血以外，其他与实施例15同样实施糖代谢试验，如图25所示，在葡萄糖给药后的所有时间，hAGF-Adeno给药小鼠比Cont-Adeno给药小鼠血糖值低，糖耐量得到改善。即，明确由于hAGF-Adeno给药小鼠高表达的hAGF蛋白质的作用，引起体重减少，以及改善糖耐量。

《实施例21：CAG-AGF Tg小鼠的血中AGF蛋白质量》

考察CAG-AGF Tg小鼠(实施例1)中，在血中以何种程度表达AGF蛋白质。从4个月龄的雌性CAG-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的眼底采血，根据常规方法得到血清。将得到的血清，以与参考例1(3)相同的方法进行蛋白质印迹，检测AGF蛋白质。用扫描仪读取蛋白质印迹的结果，使用图像分析软件(NIH image 1.62f)将AGF蛋白质的带的浓度数值化。其结果，判定与同窝WT小鼠相比，CAG-AGFTg小鼠的血清中的AGF蛋白质浓度亢进2.4倍。

《实施例22：表达小鼠AGF的腺病毒给药后的小鼠的血中AGF蛋白质量》

考察实施例15中，表达小鼠AGF的腺病毒施用于小鼠时的血中AGF蛋白质量。从表达小鼠AGF的腺病毒以及对照腺病毒给药前(第0日)以及给药后第1～7天的小鼠眼底采血，根据常规方法得到血清。以与参考例1(3)同样的方法进行蛋白质印迹，检测AGF蛋白质。其结果表明施用对照腺病毒时，AGF蛋白质浓度无变化，但施用表达小鼠AGF的腺病毒时，AGF蛋白质浓度经时的上升且第4天达到峰值。以与实施例21同样的方法，将施用表达小鼠AGF的腺病毒的小鼠第0天与第4天的AGF蛋白质的带的浓度数值化。其结果，判定通过施用小鼠AGF腺病毒，AGF蛋白质浓度亢进2.5倍.

《实施例23：K14-AGF Tg小鼠的血中AGF蛋白质量》

考察实施例18以及实施例19中使用的K14-AGF Tg小鼠中，在血中以何种程度表达AGF蛋白质。从8个月龄的雌性K14-AGF Tg小鼠以及同窝WT小鼠的眼底采血，根据常规方法得到血清。将得到的血清，以与参考例1(3)相同的方法进行蛋白质印迹，检测AGF蛋白质，并数值化。其结果，判定与同窝WT小鼠相比，CAG-AGF Tg小鼠的血清中的AGF蛋白质浓度亢进1.8倍。

《实施例24：抗人AGF抗体的制备》

合成以及纯化于人AGF的部分序列的肽(SRMLDPAPEPQRDQTQR；序列号45)的N末端附加Cys残基的肽(CSRMLDPAPEPQRDQTQR；序列号46)(以下称为肽A)。于载体蛋白质的牛甲状腺球蛋白(SIGMA)上结合肽A制备抗原，将100μg的肽每2周共8次对家兔免疫。最终免疫后的第1周进行采全血，得到血清。用肽A制备亲和柱。采用亲和柱将血清进行亲和纯化，得到结合于肽A的IgG抗体(以下，称为抗YP-030-A IgG)。在280nm的吸光度下测定，以分光系数为1.38求算抗体的浓度。

《实施例25：抗SF-YP-030 IgG的HRP标记》

于经0.1mol/L柠檬酸缓冲液透析的抗SF-YP-030 IgG(实施例13中制备)中，边搅拌边添加胃蛋白酶(SIGMA)，37℃下反应1小时，将抗体部分切割。使用经0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的Superdex200 16/60HR柱(Amersham Bioscience)对反应液进行凝胶过滤收集F(ab’)₂。于得到的F(ab’)₂中添加2-巯基乙胺盐酸盐(Nacalai Tesque)后37℃下反应90分钟进行还原，通过使用ULTROGEL ACA54柱(BIOSEPRA公司)凝胶过滤收集Fab’。混合交联剂EMCS[N-(6-马来酰亚胺己酰氧)丁二酰亚胺(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide)；DOJINDO公司]与辣根过氧化物酶(HRP；东洋纺)，37℃下反应60分钟，通过使用经0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的P6-DG柱(BIORAD公司)对反应液进行凝胶过滤收集EMCS和HRP的共扼组分(以下，称为EMCS-HRP)。然后，混合Fab’和EMCS-HRP在4℃下反应16小时后，使用Superdex 200 16/60HR柱进行凝胶过滤收集Fab’与HRP的结合组分，得到HRP标记抗人AGF抗体Fab’断片(HRP-抗SF-YD-030 Fab’)。在280nm的吸光度下测定，以分光系数为1.38求算抗体的浓度。

《实施例26：人AGF检测ELISA***的构建》

于ELISA用微孔(NUNC公司)中以100μL/孔加入20μg/mL的实施例24中制备的抗YP-030-A IgG，4℃下静置一夜。吸除孔内的溶液，用PBS(磷酸缓冲化生理盐水)清洗2次后，以300μL/孔添加封闭液(1％BSA，0.05％NaN₃，PBS)，4℃下静置一夜，封闭。用清洗液(添加0.05％Tween20的10mmol/L磷酸缓冲液)清洗2次后，将标准人AGF纯化蛋白质用稀释液(1％BSA，含0.05％Tween20的PBS)2倍连续稀释至100～0.39ng/mL，以100μL/孔分别添加，37℃下反应1小时。用清洗液清洗7次后，将实施例25中制备的HRP标记抗体(HRP-抗SF-YD-030 Fab’)用稀释液调制至1μg/mL，以100μL/孔分别添加后，37℃下反应5小时。用清洗液清洗9次后，以100μL/孔分别添加TMBZ基质液(IBL公司制备)，室温下反应30分钟。以100μL/孔添加反应停止液(1N H₂SO₄)，停止显色反应。使用吸光计(Spectramax)测定A450nm下的吸光度。用吸光计中附加的程序进行分析，得到的浓度范围具有线性，可作成标准曲线。如上述进行可构筑检测人AGF的ELISA***。

《实施例27：施用表达人AGF的腺病毒的小鼠的血中人AGF蛋白质量》

考察将表达人AGF的腺病毒施用于小鼠时的血中AGF蛋白质量。与实施例20同样，对各6只高脂肪饮食负荷小鼠施用实施例12中制备的表达人AGF的腺病毒(hAGF-Adeno)以及对照腺病毒(Cont-Adeno)。其结果，与实施例20中揭示的情形一样，同样观察到hAGF-Adeno给药小鼠的体重减少，糖耐量改善。腺病毒给药第4天，进行眼底采血根据常规方法得到血清。使用实施例26中构建的ELISA***测定血清中的人AGF蛋白质量。其结果，从施用Cont-Adeno的小鼠的血清中未检出人AGF蛋白质，从施用hAGF-Adeno的小鼠的血清中，可检出0.7～1.2μg/mL浓度的人AGF蛋白质。该结果表明，如果血中的AGF蛋白质浓度为0.7～1.2μg/mL，则可得到期待的体重减少以及糖耐量改善作用。

工业实用性

本发明的药物，适用于肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的治疗以及/或预防。

以上，说明了本发明的特定形式，但本发明还包含操作者明显的变形或改良。

序列表文本

以下的序列表的数字标识符<223>中，揭示有“人工序列(ArtificialSequence)”的说明。序列号1、6、7、9、10、13、14、16、19、20以及40～44的序列所示的各碱基序列，是人工合成的引物序列；序列号15所示的碱基序列，为含loxP的序列。序列号46的序列所示的氨基酸序列为肽A的序列。

序列表

<110>Yamanouchi Pharmaceutical Co.，Ltd

<110>KEIO UNIVERSITY

<120>抗肥胖药

<130>Y05018PCT728

<150>JP 2004-111501

<151>2004-04-05

<150>JP 2004-351813

<151>2004-12-03

<160>46

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<220>

<223>发明人：Yasunaga，Kunio；Yamaji，Noboru；Suda，Toshio

Inventor：Oike，Yuichi

<400>1

aactcgagca gcttcagggg ccgaatgagc atggc 35

<210>2

<211>1413

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1413)

<223>

<220>

<221>mat_peptide

<222>(61)..(1410)

<223>

<400>2

atg ggg aag ccc tgg ctg cgt gcg cta cag ctg ctg ctc ctg ctg ggc 48

Met Gly Lys Pro Trp Leu Arg Ala Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly

-20 -15 -10 -5

gcg tcg tgg gcg cgg gcg ggc gcc ccg cgc tgc acc tac acc ttc gtg 96

Ala Ser Trp Ala Arg Ala Gly Ala Pro Arg Cys Thr Tyr Thr Phe Val

-1 1 5 10

ctg ccc ccg cag aag ttc acg ggc gct gtg tgc tgg agc ggc ccc gca 144

Leu Pro Pro Gln Lys Phe Thr Gly Ala Val Cys Trp Ser Gly Pro Ala

15 20 25

tcc acg cgg gcg acg ccc gag gcc gcc aac gcc agc gag ctg gcg gcg 192

Ser Thr Arg Ala Thr Pro Glu Ala Ala Asn Ala Ser Glu Leu Ala Ala

30 35 40

ctg cgc atg cgc gtc ggc cgc cac gag gag ctg tta cgc gag ctg cag 240

Leu Arg Met Arg Val Gly Arg His Glu Glu Leu Leu Arg Glu Leu Gln

45 50 55 60

agg ctg gcg gcg gcc gac ggc gcc gtg gcc ggc gag gtg cgc gcg ctg 288

Arg Leu Ala Ala Ala Asp Gly Ala Val Ala Gly Glu Val Arg Ala Leu

65 70 75

cgc aag gag agc cgc ggc ctg agc gcg cgc ctg ggc cag ttg cgc gcg 336

Arg Lys Glu Ser Arg Gly Leu Ser Ala Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala

80 85 90

cag ctg cag cac gag gcg ggg ccc ggg gcg ggc ccg ggg gcg gat ctg 384

Gln Leu Gln His Glu Ala Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Asp Leu

95 100 105

ggg gcg gag cct gcc gcg gcg ctg gcg ctg ctc ggg gag cgc gtg ctc 432

Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Glu Arg Val Leu

110 115 120

aac gcg tcc gcc gag gct cag cgc gca gcc gcc cgg ttc cac cag ctg 480

Asn Ala Ser Ala Glu Ala Gln Arg Ala Ala Ala Arg Phe His Gln Leu

125 130 135 140

gac gtc aag ttc cgc gag ctg gcg cag ctc gtc acc cag cag agc agt 528

Asp Val Lys Phe Arg Glu Leu Ala Gln Leu Val Thr Gln Gln Ser Ser

145 150 155

ctc atc gcc cgc ctg gag cgc ctg tgc ccg gga ggc gcg ggc ggg cag 576

Leu Ile Ala Arg Leu Glu Arg Leu Cys Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gln

160 165 170

cag cag gtc ctg ccg cca ccc cca ctg gtg cct gtg gtt ccg gtc cgt 624

Gln Gln Val Leu Pro Pro Pro Pro Leu Val Pro Val Val Pro Val Arg

175 180 185

ctt gtg ggt agc acc agt gac acc agt agg atg ctg gac cca gcc cca 672

Leu Val Gly Ser Thr Ser Asp Thr Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro

190 195 200

gag ccc cag aga gac cag acc cag aga cag cag gag ccc atg gct tct 720

Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln Arg Gln Gln Glu Pro Met Ala Ser

205 210 215 220

ccc atg cct gca ggt cac cct gcg gtc ccc acc aag cct gtg ggc ccg 768

Pro Met Pro Ala Gly His Pro Ala Val Pro Thr Lys Pro Val Gly Pro

225 230 235

tgg cag gat tgt gca gag gcc cgc cag gca ggc cat gaa cag agt gga 816

Trp Gln Asp Cys Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly His Glu Gln Ser Gly

240 245 250

gtg tat gaa ctg cga gtg ggc cgt cac gta gtg tca gta tgg tgt gag 864

Val Tyr Glu Leu Arg Val Gly Arg His Val Val Ser Val Trp Cys Glu

255 260 265

cag caa ctg gag ggt gga ggc tgg act gtg atc cag cgg agg caa gat 912

Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Gln Asp

270 275 280

ggt tca gtc aac ttc ttc act acc tgg cag cac tat aag gcg ggc ttt 960

Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Thr Trp Gln His Tyr Lys Ala Gly Phe

285 290 295 300

ggg cgg cca gac gga gaa tac tgg ctg ggc ctt gaa ccc gtg tat cag 1008

Gly Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro Val Tyr Gln

305 310 315

ctg acc agc cgt ggg gac cat gag ctg ctg gtt ctc ctg gag gac tgg 1056

Leu Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asp Trp

320 325 330

ggg ggc cgt gga gca cgt gcc cac tat gat ggc ttc tcc ctg gaa ccc 1104

Gly Gly Arg Gly Ala Arg Ala His Tyr Asp Gly Phe Ser Leu Glu Pro

335 340 345

gag agc gac cac tac cgc ctg cgg ctt ggc cag tac cat ggt gat gct 1152

Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His Gly Asp Ala

350 355 360

gga gac tct crt tcc tgg cac aat gac aag ccc ttc agc acc gtg gat 1200

Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser Thr Val Asp

365 370 375 380

agg gac cga gac tcc tat tct ggt aac tgt gcc ctg tac cag cgg gga 1248

Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr Gln Arg Gly

385 390 395

ggc tgg tgg tac cat gcc tgt gcc cac tcc aac ctc aac ggt gtg tgg 1296

Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp

400 405 410

cac cac ggc ggc cac tac cga agc cgc tac cag gat ggt gtc tac tgg 1344

His His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly Val Tyr Trp

415 420 425

gct gag ttt cgt ggt ggg gca tat tct ctc agg aag gcc gcc atg ctc 1392

Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Leu

430 435 440

att cgg ccc ctg aag ctg tga 1413

Ile Arg Pro Leu Lys Leu

445 450

<210>3

<211>470

<212>PRT

<213>智人

<400>3

Met Gly Lys Pro Trp Leu Arg Ala Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly

-20 -15 -10 -5

Ala Ser Trp Ala Arg Ala Gly Ala Pro Arg Cys Thr Tyr Thr Phe Val

-1 1 5 10

Leu Pro Pro Gln Lys Phe Thr Gly Ala Val Cys Trp Ser Gly Pro Ala

15 20 25

Ser Thr Arg Ala Thr Pro Glu Ala Ala Asn Ala Ser Glu Leu Ala Ala

30 35 40

Leu Arg Met Arg Val Gly Arg His Glu Glu Leu Leu Arg Glu Leu Gln

45 50 55 60

Arg Leu Ala Ala Ala Asp Gly Ala Val Ala Gly Glu Val Arg Ala Leu

65 70 75

Arg Lys Glu Ser Arg Gly Leu Ser Ala Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala

80 85 90

Gln Leu Gln His Glu Ala Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Asp Leu

95 100 105

Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Glu Arg Val Leu

110 115 120

Asn Ala Ser Ala Glu Ala Gln Arg Ala Ala Ala Arg Phe His Gln Leu

125 130 135 140

Asp Val Lys Phe Arg Glu Leu Ala Gln Leu Val Thr Gln Gln Ser Ser

145 150 155

Leu Ile Ala Arg Leu Glu Arg Leu Cys Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gln

160 165 170

Gln Gln Val Leu Pro Pro Pro Pro Leu Val Pro Val Val Pro Val Arg

175 180 185

Leu Val Gly Ser Thr Ser Asp Thr Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro

190 195 200

Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln Arg Gln Gln Glu Pro Met Ala Ser

205 210 215 220

Pro Met Pro Ala Gly His Pro Ala Val Pro Thr Lys Pro Val Gly Pro

225 230 235

Trp Gln Asp Cys Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly His Glu Gln Ser Gly

240 245 250

Val Tyr Glu Leu Arg Val Gly Arg His Val Val Ser Val Trp Cys Glu

255 260 265

Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Gln Asp

270 275 280

Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Thr Trp Gln His Tyr Lys Ala Gly Phe

285 290 295 300

Gly Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro Val Tyr Gln

305 310 315

Leu Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asp Trp

320 325 330

Gly Gly Arg Gly Ala Arg Ala His Tyr Asp Gly Phe Ser Leu Glu Pro

335 340 345

Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His Gly Asp Ala

350 355 360

Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser Thr Val Asp

365 370 375 380

Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr Gln Arg Gly

385 390 395

Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp

400 405 410

His His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly Val Tyr Trp

415 420 425

Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Leu

430 435 440

Ile Arg Pro Leu Lys Leu

445 450

<210>4

<211>1374

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1374)

<223>

<220>

<221>mat_peptide

<222>(73)..(1371)

<223>

<400>4

atg ggg acc gcc agg cta cgc aag ctg caa ctg ctg ctt ctg ctg ggc 48

Met Gly Thr Ala Arg Leu Arg Lys Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly

-20 -15 -10

gct tgg agg gcg ctc gga ggt gcc gcg cgt tgc cgc gtc acc cta gtt 96

Ala Trp Arg Ala Leu Gly Gly Ala Ala Arg Cys Arg Val Thr Leu Val

-5 -1 1 5

ttg tcc ccg cag aag gca act agc gcc gtc tgc agg agc tca gag gcc 144

Leu Set Pro Gln Lys Ala Thr Ser Ala Val Cys Arg Ser Set Glu Ala

10 15 20

acc caa gac agc gaa ctg gcc acg ctg cgc atg cgc ctg ggt cgc cac 192

Thr Gln Asp Ser Glu Leu Ala Thr Leu Arg Met Arg Leu Gly Arg His

25 30 35 40

gag gag ctg ctg cgc gcg ctg caa agg cgt gcg gcg gag ggt ggt gcg 240

Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Gln Arg Arg Ala Ala Glu Gly Gly Ala

45 50 55

ctc gcg gac gag gtg cgc gca ctg cgc gag cac agt ctc acc ctg aac 288

Leu Ala Asp Glu Val Arg Ala Leu Arg Glu His Ser Leu Thr Leu Asn

60 65 70

acg cgc ctg ggc cag ctg cgc gcg caa ttg cag cag gag gcg agg gcg 336

Thr Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala Gln Leu Gln Gln Glu Ala Arg Ala

75 80 85

gag cct gac ctg ggg gcg gag cct gct gct gca ctt ggt ttg cta gcc 384

Glu Pro Asp Leu Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Gly Leu Leu Ala

90 95 100

gag cgc gcg ctg gac gct gag gcc gaa gcg cgc cgg acg acg gca cgc 432

Glu Arg Ala Leu Asp Ala Glu Ala Glu Ala Arg Arg Thr Thr Ala Arg

105 110 115 120

ctg cag cag ctg gac gca cag ctc cgt gag cat gcg cag ctc atg agc 480

Leu Gln Gln Leu Asp Ala Gln Leu Arg Glu His Ala Gln Leu Met Ser

125 130 135

cag cat agc agc ctc ctc ggc cgc ctg caa cgc gcg tgc gcg ggc ccg 528

Gln His Ser Ser Leu Leu Gly Arg Leu Gln Arg Ala Cys Ala Gly Pro

140 145 150

gaa cgg gga cag cag cag gtc ctg cca ctg ccc ctg gcg cct ctg gtg 576

Glu Arg Gly Gln Gln Gln Val Leu Pro Leu Pro Leu Ala Pro Leu Val

155 160 165

cct ctg agc ctc gtg ggc agt gcc agc aac acc agc agg agg ctg gac 624

Pro Leu Ser Leu Val Gly Ser Ala Ser Asn Thr Ser Arg Arg Leu Asp

170 175 180

caa act cca gag cac cag aga gag cag agc ttg aga cag cag ggg cct 672

Gln Thr Pro Glu His Gln Arg Glu Gln Ser Leu Arg Gln Gln Gly Pro

185 190 195 200

cca tct tct ctg ctg ccc aca ggg cac ctt gct gtc ccc aca agg cca 720

Pro Ser Ser Leu Leu Pro Thr Gly His Leu Ala Val Pro Thr Arg Pro

205 210 215

gtg ggc cca tgg agg gat tgt gca gag gct cac ggg gca ggt cac tgg 768

Val Gly Pro Trp Arg Asp Cys Ala Glu Ala His Gly Ala Gly His Trp

220 225 230

cag agt gga gtg tat gac ctg cgg ctg ggc cgt cgt gta gta gcc gtg 816

Gln Ser Gly Val Tyr Asp Leu Arg Leu Gly Arg Arg Val Val Ala Val

235 240 245

tgg tgt gaa cag cag cag gaa ggt gga ggc tgg act gtc atc cag aga 864

Trp Cys Glu Gln Gln Gln Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg

250 255 260

cgg cag gac ggc tct gtc aac ttc ttc acc aac tgg cag cac tac aag 912

Arg Gln Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Asn Trp Gln His Tyr Lys

265 270 275 280

gcg ggc ttt ggg cgt cca gaa gga gaa tac tgg ctg ggc ctg gaa cct 960

Ala Gly Phe Gly Arg Pro Glu Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro

285 290 295

gtg cat cag gtg aca agc cgt ggg gac cac gag ctg ctg ata ctc cta 1008

Val His Gln Val Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Ile Leu Leu

300 305 310

gag gac tgg ggg ggc cgt gca gca cgc gcc cac tac gac agc ttc tcc 1056

Glu Asp Trp Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala His Tyr Asp Set Phe Ser

315 320 325

ttg gag cct gag agt gac cac tac cgt ctg cgg ctt ggc cag tac cac 1104

Leu Glu Pro Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His

330 335 340

ggc gat gcc gga gac tcc ctc tct tgg cac aat gac aaa cct ttc agc 1152

Gly Asp Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser

345 350 355 360

act gtg gat agg gac aga gac tca tat tct ggt aac tgt gcc ctg tac 1200

Thr Val Asp Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr

365 370 375

cat cgt ggg ggc tgg tgg tac cat gcc tgt gcc cac tct aac ctc aat 1248

His Arg Gly Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn

380 385 390

gga gta tgg tat cat gga ggt cat tac cgg agc cga tac cag gac ggg 1296

Gly Val Trp Tyr His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly

395 400 405

gtc tac tgg gcc gag ttc cgt ggt ggg gcg tac tct ctg aag aaa gct 1344

Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Lys Lys Ala

410 415 420

gtt atg ttg acc cgg ctt gtg cgc ttg tga 1374

Val Met Leu Thr Arg Leu Val Arg Leu

425 430

<210>5

<211>457

<212>PRT

<213>小鼠

<400>5

Met Gly Thr Ala Arg Leu Arg Lys Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly

-20 -15 -10

Ala Trp Arg Ala Leu Gly Gly Ala Ala Arg Cys Arg Val Thr Leu Val

-5 -1 1 5

Leu Ser Pro Gln Lys Ala Thr Ser Ala Val Cys Arg Ser Ser Glu Ala

10 15 20

Thr Gln Asp Ser Glu Leu Ala Thr Leu Arg Met Arg Leu Gly Arg His

25 30 35 40

Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Gln Arg Arg Ala Ala Glu Gly Gly Ala

45 50 55

Leu Ala Asp Glu Val Arg Ala Leu Arg Glu His Ser Leu Thr Leu Asn

60 65 70

Thr Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala Gln Leu Gln Gln Glu Ala Arg Ala

75 80 85

Glu Pro Asp Leu Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Gly Leu Leu Ala

90 95 100

Glu Arg Ala Leu Asp Ala Glu Ala Glu Ala Arg Arg Thr Thr Ala Arg

105 110 115 120

Leu Gln Gln Leu Asp Ala Gln Leu Arg Glu His Ala Gln Leu Met Ser

125 130 135

Gln His Ser Ser Leu Leu Gly Arg Leu Gln Arg Ala Cys Ala Gly Pro

140 145 150

Glu Arg Gly Gln Gln Gln Val Leu Pro Leu Pro Leu Ala Pro Leu Val

155 160 165

Pro Leu Ser Leu Val Gly Ser Ala Ser Asn Thr Ser Arg Arg Leu Asp

170 175 180

Gln Thr Pro Glu His Gln Arg Glu Gln Ser Leu Arg Gln Gln Gly Pro

185 190 195 200

Pro Ser Ser Leu Leu Pro Thr Gly His Leu Ala Val Pro Thr Arg Pro

205 210 215

Val Gly Pro Trp Arg Asp Cys Ala Glu Ala His Gly Ala Gly His Trp

220 225 230

Gln Ser Gly Val Tyr Asp Leu Arg Leu Gly Arg Arg Val Val Ala Val

235 240 245

Trp Cys Glu Gln Gln Gln Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg

250 255 260

Arg Gln Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Asn Trp Gln His Tyr Lys

265 270 275 280

Ala Gly Phe Gly Arg Pro Glu Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro

285 290 295

Val His Gln Val Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Ile Leu Leu

300 305 310

Glu Asp Trp Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala His Tyr Asp Ser Phe Ser

315 320 325

Leu Glu Pro Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His

330 335 340

Gly Asp Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser

345 350 355 360

Thr Val Asp Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr

365 370 375

His Arg Gly Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn

380 385 390

Gly Val Trp Tyr His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly

395 400 405

Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Lys Lys Ala

410 415 420

Val Met Leu Thr Arg Leu Val Arg Leu

425 430

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>6

ctagactagt tgcaaaggcg tgcggcgg 28

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>7

ctagactagt ggatccgcag gcttgctttg acttac 36

<210>8

<211>536

<212>DNA

<213>小鼠

<400>8

gcccatggag ggattgtgca gaggctcacg gggcaggtca ctggcagagt ggagtgtatg 60

acctgcggct gggccgtcgt gtagtagccg tgtggtgtga acagcagcag gaagtggagg 120

ctggactgtc atccagagac ggcaggacgg ctctgtcaac ttcttcacca actggcagca 180

ctacaaggtg tgtgcttgtg gtgggggtgt cagagactgc tgggcagaga ggacgccccc 240

accctcttcc tcctaccctt ccaggcgggc tttgggcgtc cagaaggaga atactggctg 300

ggcctggaac ctgtgcatca ggtgacaagc cgtggggacc acgagctgct gatactccta 360

gaggactggg ggggccgtgc agcacgcgcc cactacgaca gcttctcctt ggagcctgag 420

agtgaccact accgtctgcg gcttggccag taccacggcg atgccggaga ctccctctct 480

tggcacaatg acaaaacctt tcagcactgt ggatagggac agagactcat attctg 536

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>9

agaggctatt cggctatgac 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>10

caccatgata ttcggcaagc 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>小鼠

<400>11

tggcctctgt tatcatgctc 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>小鼠

<400>12

ctacctacat ccactcctac 20

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>13

agaagcttca ccatggggac cgccaggcta c 31

<210>14

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>14

ccgtcgacat tagatcttca caagcgcaag ccgggtc 37

<210>15

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：包含loxP的序列

<400>15

gatccggaac ccttaatata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta ttaggtccct 60

cgacctgcag cccgggggat c 81

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>16

aattaaccct cactaaaggg 20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>小鼠

<400>17

cccactacga cagcttctcc 20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>小鼠

<400>18

agccgggtca acataacagc 20

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>19

gcgttaccca acttaatcg 19

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>20

tgtgagcgag taacaacc 18

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>小鼠

<400>21

tcgtgtagta gccgtgtggt gt 22

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>小鼠

<400>22

cacctgatgc acaggttcca 20

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>小鼠

<400>23

tggttgatcc tgccagtag 19

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>小鼠

<400>24

cgaccaaagg aaccataact 20

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>小鼠

<400>25

ccggtacagt gaaactgcga atg 23

<210>26

<211>19

<212>DNA

<213>小鼠

<400>26

acagaaggat tgccgaaac 19

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>小鼠

<400>27

agctgatttg cctctgaatg 20

<210>28

<211>17

<212>DNA

<213>小鼠

<400>28

cagcggtctg cctgcgg 17

<210>29

<211>19

<212>DNA

<213>小鼠

<400>29

catggttgga cttcagccc 19

<210>30

<211>17

<212>DNA

<213>小鼠

<400>30

ggcccccagg aacttca 17

<210>31

<211>22

<212>DNA

<213>小鼠

<400>31

ccgaagtgcc tcccacaacg gt 22

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>小鼠

<400>32

acgatgctgt cctccttgat g 21

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>小鼠

<400>33

gtgtgataaa gccattgccg t 21

<210>34

<211>23

<212>DNA

<213>小鼠

<400>34

acaaagacgg gatgctgatc gcg 23

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>小鼠

<400>35

gaccctcctc aagtatggcg t 21

<210>36

<211>21

<212>DNA

<213>小鼠

<400>36

gtctttgttg acgatggagg c 21

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>小鼠

<400>37

cacgaggcca tctttgccat gct 23

<210>38

<211>22

<212>DNA

<213>小鼠

<400>38

tgagagggaa atcgtgcgtg ac 22

<210>39

<211>22

<212>DNA

<213>小鼠

<400>39

aagaaggaag gctggaaaag ag 22

<210>40

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>40

aatctagaca ccatggggac cgccaggcta cg 32

<210>41

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>41

aagcggccgc caagcgcaca agccgggtca a 31

<210>42

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>42

gaagatctac catggggacc gccaggctac gc 32

<210>43

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>43

ccgctcgagt gatgggacag tcacaagcgc 30

<210>44

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>44

ccaagcttac catggggaag ccctggctgc gtgcgctaca g 41

<210>45

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>45

Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln

1 5 10 15

Arg

<210>46

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：肽A

<400>46

Cys Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr

1 5 10 15

Gln Arg

Claims

1.一种抗肥胖药、糖尿病治疗药、以及/或高血脂症治疗药，其以选自下述(a)～(d)中的多肽、或编码该多肽的多核苷酸作为有效成分：

(c)由与编码序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸的序列、或序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位氨基酸的序列的DNA在严格条件下杂交的DNA编码，并且具有抑制体重增加的活性的多肽，以及

(d)含有与序列号3所示的氨基酸序列中第1位～第450位的氨基酸序列，或序列号5所示的氨基酸序列中第1位～第433位氨基酸序列具有95％以上同一性的氨基酸序列，并且具有抑制体重增加的活性的多肽；

2.一种具有肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的改善功能的功能性食品或健康食品，其以权利要求1所述的多肽作为有效成分；

3.一种治疗或预防肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的方法，其含有对有待治疗或预防肥胖、糖尿病以及/或高血脂症的对象，施用有效量的权利要求1所述多肽或编码上述多肽的多核苷酸的步骤。

4.权利要求1所述多肽或编码上述多肽的多核苷酸在制备抗肥胖药、糖尿病治疗药以及/或高血脂症治疗药中的应用。