KR20070001885A - 시험관내 단백질 합성의 개선된 방법 - Google Patents

Abstract

생물학적 분자의 시험관내 합성의 개선된 방법이 제공되며, 이것은 수율 개선, 비용 절감, 및 유용성 증진을 제공한다. 수율 개선 및 비용 절감은 외인성 포스페이트의 존재하에서 그리고 선택적으로 외인성 뉴클레오시드 트리포스페이트의 부재하에서 포스페이트-프리 에너지원을 사용함으로써 얻어진다.

생물학적 거대분자, 단백질, 합성, 포스페이트

Description

시험관내 단백질 합성의 개선된 방법{IMPROVED METHODS OF IN VITRO PROTEIN SYNTHESIS}

생물학적 거대분자의 목적지향 합성은 생화학의 위대한 성취들 중 하나이다. 재조합 DNA(rDNA) 기술의 출현과 함께, 원하는 단백질을 생산하기 위해 세포의 촉매 기구를 제어하는 것이 가능하게 되었다. 이것은 세포로부터 유래된 추출물을 사용하여 세포 환경 내에서 또는 시험관내에서 달성될 수 있다.

세포-프리(cell-free) 단백질 합성은 종래의 생체내 단백질 발현법에 비해서 몇몇 이점을 제공한다. 세포-프리 시스템은 1개 단백질의 배타적 생산을 향한 세포의 대사 자원을 전부는 아니지만 대부분을 관리할 수 있다. 더욱이, 시험관내에서 세포벽과 세포막 성분의 부재는 그것이 합성 환경의 제어를 허용하므로 유리하다. 예를 들어, 발현될 유전자의 코돈 사용처를 반영하기 위해서 tRNA 레벨이 변화될 수 있다. 또한, 우리는 세포성장이나 생육력에 대해서는 고려하지 않으므로, 산화환원 전위, pH, 또는 이온강도가 생체내에서보다 더 큰 유연성을 가지고 변경될 수 있다. 더욱이, 정제된 적합하게 접힌 단백질 산물의 직접적 회수가 쉽게 달성될 수 있다.

또한, 시험관내 번역은 비천연 아미노산과 동위원소-표지 아미노산을 결합하는 능력과, 뿐만 아니라 생체내에서 불안정한, 불용성, 또는 세포독성인 단백질을 생산하는 능력에 대해 인정된다. 게다가, 세포-프리 단백질 합성은 혁명적인 단백질 조작 및 프로테오믹 스크리닝 기술에서 어떤 역할을 할 수 있다. 세포-프리 방법은 새로운 유전자 산물의 생체내 발현을 위해 세포를 클로닝하고 트랜스포밍하는데 필요한 어려운 과정을 우회하며, 이 분야에서의 기반 기술이 되고 있다.

세포-프리 단백질 합성의 모든 유망한 특징에도, 그것의 실제적 사용과 대규모 실행은 몇몇 장애물에 의해 제한되었다. 이들 중에서도 최고는 짧은 반응 시간과 낮은 단백질 생산 속도인데, 이것은 불량한 단백질 합성 수율과 과도한 시약 비용을 가져온다. 추가로, 고가의 시약이 필요하며, 종래의 방법은 이들 고가의 시약의 사용에도 비효율적이다.

특히 유용한 반응은 시험관내 전사와 번역을 조합함으로써 DNA 코딩 서열과 단백질 산물 간에 직접적 연결을 제공하는 것이다. 그러나, mRNA를 생산하기 위한 시약에 대한 추가적 필요요건이 반응의 전체적인 비용을 높인다. 최근 간행물들은 시험관내 전사 반응의 비용 절감에 대한 많은 상이한 전략들을 논의했는데, 이들은 DNA 주형을 재사용하고 피드-배치(fed-batch) 프로토콜을 채용하는 것을 포함한다. 예를 들어, Kern 및 Davis (1997) "시험관내 RNA 전사에 용액 평형 분석의 적용", Biotechnology Progress 13:747-756; Kern 및 Davis (1999) "시험관내 전사에 의해 RNA를 생산하기 위한 피드-배치 시스템의 적용", Biotechnology Progress 15:174-184 참조.

시험관내 전사/번역 시스템을 최적화하기 위한 개선이 요구된다. 억제성 부산물(들)의 연속 제거와 합성 기질의 연속 공급은 연속 또는 반-연속 반응 시스템 이 긴 반응 기간에 걸쳐 합성을 지원하는 것을 가능하게 할 수 있다. 그러나, 이들 접근법은 또한 기질의 비효율적인 사용과 그에 따른 고비용을 가져올 수 있다. 억제성 산물의 해명, 및 그들의 합성 방지가 시험관내 합성 시스템의 개발에 있어 큰 관심사이다. 시약 비용의 절감도 또한 중요하다. 현재의 기술에 있어서 주된 시약 비용은 화학적 에너지의 공급원, 효소, DNA 주형, 및 NTP를 포함한다. 이들 비용을 감소시키면서 동시에 수율을 증진시키는 방법이 큰 관심사이다.

관련문헌

미국특허 6,337,191 B1, Swartz 등, Kim 및 Swartz (2000) Biotechnol Prog. 16:385-390; Kim 및 Swartz (2000) Biotechnol Lett. 22:1537-1542; Kim 및 Choi (2000) J Biotechnol. 84:27-32; Kim 등, (1996) Eur J Biochem. 239:881-886; Kim 및 Swartz (2001) Biotechnol Bioeng 74:309-316; Davanloo 등, Proc Nat'l Acad Sci USA 81:2035-2039 (1984); Datsenko 등, Proc Nat'l Acad Sci USA 97:6640-6645(2000); Jewett 등, (2002) 시험관내 발현을 위한 원핵 시스템, Gene Cloning and Expression Technologies(Weiner, M.P. 및 Lu, Q.: 편저), Eaton Publishing, 매사츄세츠주 웨스트보로, p. 391-411; Spirin 등, Science 242:1162-1164 (1998).

Cunningham 및 Ofengand (1990) Biotechniques 9:713-714는 무기 피로포스파타제의 첨가가 축적되는 피로포스페이트를 가수분해함으로써 더 높은 반응 수율을 가져온다는 것을 제안한다. 피로포스페이트는 피로포스페이트가 전사 반응에서 덜 이용되고 남은 유리 마그네슘 이온과 착물을 형성하기 때문에 억제성이다.

Breckenridge 및 Davis, (2000) Biotechnology Bioengineering 69:679-687은 종래의 용액-상 전사와 비슷한 수율로 아가로스 비드와 같은 고체 지지체 위에 고정된 DNA 주형으로부터의 전사에 의해 RNA가 생산될 수 있다고 제안한다. 고정된 DNA의 이점은 이 주형이 반응으로부터 회수되어 여러 번 재사용될 수 있다는 점이며, 불필요한 처분이 제거되고 DNA 주형의 비용이 상당히 줄어든다.

미국특허 no. 6,337,191은 에너지원으로서 해당 중간체를 사용한 시험관내 단백질 합성을 설명하고, 미국특허 no. 6,168,931은 신규 ATP 재생 시스템을 사용한 생물학적 거대분자의 증진된 시험관내 합성을 설명한다.

발명의 개요

개선된 수율, 비용 절감, 및 증진된 유용성을 제공하는, 생물학적 분자의 시험관내 합성을 위한 개선된 방법이 제공된다. 개선된 세포-프리 단백질 합성 방법은 ATP 생산을 위해 포스페이트-프리(phosphate-free) 에너지원을 이용하는데, 이들은 예를 들어 글루코스, 글루타메이트, 피루베이트 등을 포함한다. 뉴클레오시드 트리포스페이트는 선택적으로 뉴클레오시드 모노포스페이트로 대체된다. 이들 개선은 세포-프리 단백질 합성 방법의 비용을 철저히 감소시키고 강인성을 증가시킨다.

도 1은 다양한 농도로 포스페이트가 더해진 에너지원으로서 피루베이트와 뉴클레오시드 모노포스페이트를 사용하는 본 발명의 성분 시스템을 사용한 시험관내 단백질 합성을 레벨을 비교한 막대그래프이다. CAT 발현은 ¹⁴C-로이신 결합으로부 터 측정되었다. 오차 막대는 2회의 개별 실험으로부터의 범위를 나타낸다.

도 2는 다양한 양의 포스페이트 및 뉴클레오시드 트리포스페이트와 함께 에너지원으로서 글루코스를 사용하는 본 발명의 성분 시스템을 사용한 시험관내 단백질 합성의 레벨을 비교한 막대그래프이다. CAT 발현은 ¹⁴C-로이신 결합으로부터 측정되었다. 오차 막대는 3회의 개별 실험으로부터의 표준편차를 나타낸다.

도 3은 에너지원으로서 글루코스와 성공적인 세포-프리 반응을 위한 다양한 성분들을 사용하는 본 발명의 성분 시스템을 사용한 시험관내 단백질 합성의 레벨을 비교한 막대그래프이다. CAT 발현은 ¹⁴C-로이신 결합으로부터 측정되었다. 오차 막대는 3회의 개별 실험으로부터의 표준편차를 나타낸다.

도 4는 NTP 또는 NMP와 함께 에너지원으로서 글루코스를 사용하는 세포-프리 단백질 합성 반응에 대한 10mM 포스페이트 첨가의 효과이다. 오차 막대는 9회 실험(n=9)으로부터의 표준편차를 나타낸다.

도 5는 NTP 또는 NMP와 함께 에너지원으로서 글루코스를 사용하는 세포-프리 반응에서의 ATP 농도이다. 오차 막대는 3회 실험(n=3)으로부터의 표준편차를 나타낸다.

도 6은 포스페이트 첨가 또는 미첨가 시토밈(Cytomim) 시스템을 사용한 CAT의 발현이다. 반응(15㎕)은 6시간 동안 수행되었고, CAT 발현은 ¹⁴C-로이신 결합에 의해 측정되었다. 오차 막대는 11회의 개별 실험으로부터의 표준편차를 나타낸다. 모든 반응은 소듐 피루베이트는 사용하지 않고 NTP를 사용한 시토밈 시스템을 사용 하여 수행되었다.

도 7은 피루베이트는 사용하지 않고 10mM 포스페이트를 첨가한 시토밈 시스템(w/NTP)을 사용했을 때의 시간에 따른 CAT 발현이다. 반응은 37℃에서 6시간 동안 수행되었고, CAT 발현은 ¹⁴C-로이신 결합 및 효소 활성 분석에 의해 측정되었다. 각 시간 지점을 위해 상이한 튜브에 15㎕의 반응 혼합물을 제조했다. 각 시간 지점에서 1개의 튜브를 써서 발현된 단백질의 양을 측정했다. 오차 막대는 7회의 개별 실험으로부터의 표준편차를 나타낸다. (■) 시토밈 시스템에서 ¹⁴C-로이신 결합에 의해 모니터된 CAT의 총 수율. (●) 시토밈 시스템에서 ¹⁴C-로이신 결합에 의해 모니터된 CAT의 가용성 수율. (▲) 효소 분석에 의해 측정된 CAT의 활성 수율.

도 8은 1mL의 버블 칼럼에서 피루베이트는 사용하지 않고 10mM 포스페이트를 사용한 시토밈 시스템을 사용했을 때의 CAT의 발현이다. 반응(1mL)은 37℃에서 5시간 동안 수행되었다. CAT 발현은 ¹⁴C-로이신 결합에 의해 측정되었다. 오차 막대는 2회의 개별 실험의 고저를 나타낸다. 약 3.5시간에서 반응장치는 거품을 내기 시작했는데, 바로 Sigma 0-30 항기포제를 1x10^-4(v/v)로 첨가하여 이 문제를 제어한다.

도 10은 상대적 총 CAT 발현에 기초한 시토밈 시스템에서의 포스페이트 최적화 연구이다. 모든 실험은 소듐 피루베이트는 사용하지 않고 NMP를 사용한 시토밈 시스템으로부터의 조건들을 사용하여 실행되었다. 15㎕의 반응물을 6시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션했다. 차가운 아세트산으로 pH 7.25로 조정한 포타슘 포스페이트(다이베이직, Mallinckrodt; 뉴저지주 필립스버그)를 사용했다.

개선된 수율, 비용 절감, 및 증진된 유용성을 제공하는 생물학적 거대분자의 시험관내 합성을 위한 개선된 방법이 제공된다. 개선된 수율 및 비용 절감이 포스페이트-프리 에너지원의 사용, 외인성 뉴클레오시드 트리포스페이트의 부재, 뉴클레오시드 모노포스페이트의 존재, 및 외인성 유기 포스페이트를 제한 없이 포함하는 반응 조건들의 조합에 의해 얻어진다.

ATP는 세포-프리 반응에서 단백질 합성에 필요하다. 종래에는 포스포엔올피루베이트(PEP)와 같은 고-에너지 포스페이트 결합을 갖는 화합물이 이 목적을 위해 반응에 첨가된다. 그러나, 세포 추출물에는 해당 효소가 또한 존재하므로, 글루코스 및 글루타메이트, 피루베이트 등과 같은 다른 대사 중간체들을 사용하여 훨씬 더 낮은 비용으로 세포-프리 반응을 이끌 수 있으며, 또 산화성 인산화를 활성화하는 방법을 이용한 ATP 생성에 대한 가능성이 더 높아진다. 이런 더욱 천연의 환경을 일으키는 반응 조건은 하기 설명되는 요인들의 조합을 제공한 결과이다. 이 시스템은 시험관내 배치 반응에서 6시간까지 동안 상당한 단백질을 생산할 수 있다. 세포 환경을 모방함으로써 증진된 합성 능력이 제공된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본원에 설명된 반응 혼합물은 에너지원으로서 글루코스, 글루타메이트, 피루베이트 등을 사용하고, 종래의 외인성 뉴클레오시드 트리포스페이트를 뉴클레오시드 모노포스페이트로 대체함으로써 생물학적 거대분자의 시험관내 합성에 사용된다.

외인성 포스페이트, 예를 들어 유기 포스페이트 등의 첨가에 의해 개선된 수율이 제공된다. 통상 포스페이트는 적어도 약 1mM, 바람직하게는 적어도 약 5mM, 그리고 약 20mM 이하, 통상 약 15mM 이하, 그리고 바람직하게는 약 10mM의 농도로 제공된다. 유용한 포스페이트(PO₄) 공급원은 생물학적 반응과 양립할 수 있는 여러 가지 염 및 산들을 포함하며, 예를 들어 포타슘 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 암모늄 포스페이트 등이다. 다른 구체예에서, 포스페이트는 반응 동안, 예를 들어 효소 방출에 의해 소량의 포스페이트가 방출되도록 포스페이트를 함유하는 화합물을 적합한 양으로 첨가함으로써 제공된다.

반응물은 폴리에틸렌 글리콜을 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜의 실질적인 부재하에 합성을 수행하는 것은 산화성 인산화의 활성화를 허용하고 개선된 접힘을 제공하며; 그리고, 예를 들어, 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 no. 6,548,276에 설명된 방법과 더 조합될 수 있다.

본 발명의 방법은 합성을 보충하기 위한 에너지원의 첨가를 사용한 단백질의 생산을 허용하며, 여기서 에너지원은 포스페이트-프리 에너지원, 예를 들어 글루코스, 피루베이트, 글루타메이트 등이다. 에너지원은 아미노산, 예를 들어 글루타메이트, 트리카르복실산(TCA) 고리 형태의 화합물, 시트레이트, 시스-아코니테이트, 이소시트레이트, α-케토글루타레이트, 숙시닐-CoA, 숙시네이트, 푸마레이트, 말레이트, 옥살로아세테이트, 글리옥실레이트, 글리세롤, 그리고 아세테이트 등과 같은 중심 대사에 관련될 수 있는 다른 화합물들을 포함한다. 이러한 에너지원은 적어도 약 10mM, 적어도 약 20mM, 더 통상적으로는 적어도 약 30mM의 농도로 공급될 수 있다. 그러한 화합물은 통상 약 250mM 이상의 농도로는 첨가되지 않으며, 더 통상적으로는 약 150mM 이하의 농도로 첨가된다. 예를 들어, 에너지원은 포타슘 글루타메이트, 암모늄 글루타메이트 등일 수 있다. 어떤 구체예에서, 에너지원들의 칵테일, 예를 들어 포타슘 글루타메이트와 암모늄 글루타메이트의 혼합물, 또는 글루코스와 글루타메이트 공급원들의 조합 등이 사용된다. 에너지원의 추가의 양이 단백질 발현의 진행과정 도중에 반응 혼합물에 첨가될 수 있으며, 이로써 반응 시간이 연장된다. 또는 달리, 더 적은 초기 농도에 이어서 연속적으로 또는 간헐적으로 공급하는 것이 채용될 수 있다.

본원에서 사용된 시험관내 합성은 생물학적 추출물 및/또는 규정 시약을 포함하는 반응 혼합물에서 생물학적 거대분자의 세포-프리 합성을 말한다. 반응 혼합물은, 예를 들어 DNA, mRNA 등의 거대분자의 생산을 위한 주형; 합성될 거대분자에 맞는 모노머, 예를 들어 아미노산, 뉴클레오티드 등; 및 합성에 필요한 보조-인자, 효소 및 다른 시약들, 예를 들어 리보솜, tRNA, 중합효소, 전사인자 등을 포함할 것이다. 그러한 합성 반응 시스템은 본 분야에 잘 공지되어 있으며 문헌에 설명되어 있다. 세포-프리 합성 반응은 본 분야에 공지된 대로, 배치, 연속 흐름 또는 반-연속 흐름으로 수행될 수 있다. 생물학적 거대분자의 시험관내 합성은 mRNA의 번역에 의한 폴리펩티드의 생산을 포함할 수 있거나, 또는 DNA 주형으로부터 mRNA의 전사를 포함할 수 있다.

반응은 글루코스 및 포스페이트를 함유하는 배지에서 성장된 박테리아 세포로부터 유래된 세포 추출물을 이용하는 것이 바람직하며, 여기서 글루코스는 적어도 약 0.25%(중량/부피), 더 통상적으로는 적어도 약 1%, 그리고 통상 약 4% 이하, 더 통상적으로는 약 2% 이하의 농도로 존재한다. 그러한 배지의 예는 2YTPG 배지이지만, 영양물의 규정 및 미규정 공급원을 모두 사용하는 E. coli 같은 박테리아의 성장에 적합한 많은 공개된 배지에 따라, 당업자는 많은 배양 배지, 특히 규정 배지가 본 목적을 위해 적합할 수 있다는 것을 인정할 것이다(예를 들어, 글루코스 함유 배지에 대해, Sambrook, J., E.F. Fritsch, 및 T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판 참조, Cold Spring Harbor University Press, 뉴욕주 콜드 스프링 하버).

이 새로운 기술의 개발에 이용된 특정 박테리아 균주, 예를 들어 E. coli는 최적화될 수 있다. 특히 단백질 합성을 증진시킬 수 있는 유전적 변형이 균주에 만들어질 수 있다. 예를 들어, 상기 설명된 실험에서 이용된 균주는 염색체로부터 결실된 speA, tnaA, sdaA, sdaB, tonA, 및 endA 유전자를 가졌다. 처음의 4개 돌연변이는 반응에서 아르기닌, 트립토판, 및 세린 농도를 안정화하는 것을 돕는다. 나중의 2개 돌연변이는 박테리오파지 감염에 대해 보호하고 시스템 내의 DNA를 안정화한다. 또는 달리, 바람직하지 않은 효소 활성에 대한 대사 억제제가 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.

종래의 반응 혼합물(예를 들어, Kim 및 Swartz, 2001 참조)은 약 2%의 폴리에틸렌 글리콜 8000을 함유하는데, 이것은 수율을 저하한다고 밝혀졌다. 본 방법에서는 분자 스페르미딘 및 퓨트리신이 PEG 대신 사용된다. 스페르민 또는 스페르미딘은 적어도 약 0.5mM, 통상 적어도 약 1mM, 바람직하게는 약 1.5mM, 그리고 약 2.5mM 이하의 농도로 존재한다. 퓨트리신은 적어도 약 0.5mM, 바람직하게는 적어도 약 1mM, 바람직하게는 약 1.5mM, 그리고 약 2.5mM 이하의 농도로 존재한다. 이들 농도는 세포-프리 반응에 사용된 전체 추출물 농도에 매우 의존적이다. 당업자는 추출물 농도가 변할 때, 스페르미딘 및 퓨트리신의 농도도 전형적인 반응 조건에 대한 본원에 설명된 것들을 벗어난 범위까지 변할 수 있다는 것을 인정할 것이다.

반응 혼합물에서 마그네슘의 농도는 전체 합성에 영향을 미친다. 주로 마그네슘은 세포 추출물에 존재하는데, 이것은 이후에 농도를 최적화하기 위한 마그네슘의 첨가에 따라 조정될 수 있다. 그러한 방법에 유용한 마그네슘 염의 공급원이 본 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 마그네슘 공급원은 마그네슘 글루타메이트일 수 있다. 마그네슘의 바람직한 농도는 적어도 약 5mM, 통상 적어도 약 10mM, 그리고 바람직하게 적어도 약 12mM이며, 약 20mM 이하, 통상 약 15mM 이하의 농도이다. 마그네슘 글루타메이트의 사용으로 인한 글루타메이트 농도의 약간의 변화는 수율에 영향을 미치지 않는다.

본 시스템은 호기성 및 혐기성 조건하에서 실행될 수 있다. 특히 15㎕ 이상의 반응에서는 산소가 공급될 수 있으며, 이로써 합성 수율이 증가된다. 반응 챔버의 헤드스페이스가 산소 충전될 수 있거나, 산소가 반응 혼합물에 주입될 수 있거나, 등등이다. 산소는 연속하여 공급될 수 있거나, 또는 오랜 반응 시간 동안의 단백질 발현의 진행과정 중에 반응 챔버의 헤드스페이스가 재충전될 수 있다. 또한, 세포 추출물의 제조와 함께 질산염, 황산염, 또는 푸마레이트와 같은 다른 전자 수용체가 공급될 수 있으며, 이로써 필요한 효소가 세포 추출물 중에서 활성으로 된다.

외인성 보조인자를 첨가하는 것은 필요하지 않다. 니코닌아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH), NAD⁺, 또는 코엔자임 A와 같은 화합물을 사용하여 단백질 합성 수율을 보충할 수 있지만 반드시 필요한 것은 아니다.

세포-프리 단백질 합성의 주형은 DNA가 바람직하다. 일반적으로 E. coli 시스템에서 이용되는 전사 및 번역 커플은 인식가능한 프로모터를 갖는 DNA 주형으로부터 mRNA를 연속적으로 생성한다. 내인성 RNA 중합효소가 사용될 수 있거나, 또는 외인성 파지 RNA 중합효소, 전형적으로는 T7 또는 SP6이 반응 혼합물에 직접 첨가될 수 있다. 또는 달리, mRNA는 RNA 독립적 RNA 중합효소인 QB 레플리카제에 맞추어 주형에 메시지를 삽입함으로써 연속적으로 증폭될 수 있다. mRNA 레벨의 안정화를 돕기 위해서 추출물로부터 뉴클레아제가 제거될 수 있다. 주형은 관심 있는 어떤 특정 유전자를 암호화할 수 있다.

또한, 다른 염들, 특히 망간과 같은 생물학적으로 관련 있는 것들이 첨가될 수 있다. 포타슘은 일반적으로 적어도 약 50mM, 그리고 약 250mM 이하의 농도로 존재한다. 암모늄은 통상 200mM 이하의 농도로, 더 통상적으로는 약 100mM 이하의 농도로, 그리고 바람직하게 약 20mM 이하의 농도로 존재한다. 통상 반응은 약 pH 5-10과 약 20℃-50℃의 온도의 범위에서; 더 통상적으로는 약 pH 6-9와 약 25℃-40℃의 온도의 범위에서 유지된다. 이들 범위는 관심 있는 특정한 조건에 맞추어 확장될 수 있다.

또, 숙주 유기체로부터 정제된 소포(Muller 및 Blobel (1984) "Escherichia Coli의 원형질막을 가로지른 박테리아 단백질의 시험관내 전위", PNAS 81:7421-7425)나 합성된 소포가 시스템에 첨가될 수 있다. 이들을 사용하여 단백질 합성과 접힘을 증진시킬 수 있다. 본원에 설명된 기술은 세포질 막 성분을 이용하는 산화성 인산화 과정을 활성화하는 것으로 나타났다. 호흡사슬 성분 및 F₁F₀ATPase를 함유하는 전화된 막 소포가 산화성 인산화의 활성화를 위해 존재할 수 있다. 또한, 본 방법은 다른 세트의 막 단백질을 활성화하기 위한, 예를 들어 단백질을 삽입 또는 전위시키거나 다른 화합물들을 전위시키기 위한 세포-프리 반응에 사용될 수 있다.

글루코스 시스템에서는 버퍼가 pH 안정화를 위해 중요하다. 예를 들어, 글루코스 반응물에는 비스-트리스 버퍼가 약 10 내지 150mM, 통상 약 50mM로 존재할 수 있다. pKa가 반응에 적합한 한(아마도 6.8에서 7.2 사이) 다른 버퍼들도 사용될 수 있다. pH는 또한 반응 도중에 염기를 직접 첨가함으로써 안정화될 수 있다.

증진된 시험관내 합성을 위한 방법

관심의 합성 시스템은 바이오폴리머의 복제를 위한 시스템을 포함하며, 이것은 DNA 증폭, DNA 또는 RNA 주형으로부터 RNA의 전사, RNA의 폴리펩티드로의 번역, 및 단순 당으로부터 복잡한 탄수화물의 합성을 포함할 수 있다. 증진된 합성은 시스템에서 합성된 폴리펩티드의 총 또는 상대적 양의 증가; 단위 시간 당 합성된 폴리펩티드의 총 또는 상대적 양의 증가; 시스템에서 합성된 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 총 또는 상대적 양의 증가; 시스템에서 합성된 가용성 폴리펩티드의 총 또는 상대적 양의 증가 등을 포함할 수 있다.

반응은 대규모 반응장치, 소규모 반응장치를 이용할 수 있거나, 또는 복수의 합성을 동시에 수행하도록 다중적일 수 있다. 연속 반응은 시약들의 흐름을 도입하기 위한 공급 메커니즘을 사용할 것이며, 이 과정의 일부로서 최종-산물을 분리할 수 있다. 또한, 배치 시스템이 관심 있는데, 여기서는 활성 합성을 위한 시간 기간을 연장하기 위해 추가의 시약이 도입될 수 있다. 반응장치는 배치, 확장 배치, 반-배치, 반-연속, 피드-배치 및 연속식과 같은 어떤 방식으로도 실행될 수 있으며, 이것은 응용 목적에 따라서 선택될 것이다.

반응은 어떤 부피를 가질 수 있으며, 통상 적어도 약 1㎕ 및 약 15㎕ 이하의 소규모이거나, 또는 반응 부피가 적어도 약 15㎕, 통상 적어도 약 50㎕, 더 통상적으로 는 적어도 약 100㎕이고, 500㎕, 1000㎕ 또는 그 이상일 수도 있는 규모가 커진 반응일 수 있다. 대부분의 경우에 개별 반응은 약 10mL 이하일 것이지만, 복수의 반응이 병렬식으로 실행될 수 있다. 그러나, 원칙적으로 충분한 산소(또는 다른 전자 수용체)가 공급되는 한 반응은 어떤 규모로도 수행될 수 있다.

그 중 특히 관심 있는 것은 mRNA를 번역하여 단백질을 생산하는 것인데, 이 번역은 DNA 주형으로부터 mRNA의 시험관내 합성과 조합될 수 있다. 그러한 세포-프리 시스템은 mRNA의 번역에 필요한 모든 인자들, 예를 들어 리보솜, 아미노산, tRNA, 아미노아실 합성효소, 신장 인자, 개시 인자, 및 리보솜 재순환 인자를 함유할 것이다. 본 분야에 공지된 세포-프리 시스템은 E. coli 추출물 등을 포함하며, 이것은 활성 내인성 mRNA를 제거하기 위해 적합한 뉴클레아제로 처리될 수 있다.

세포-프리 추출물, 유전적 주형, 및 아미노산과 같은 상기 성분들에 더하여, 단백질 합성에 특별히 필요한 재료가 반응에 첨가될 수 있다. 이들 재료는 염, 폴린산, 고리형 AMP, 단백질 또는 핵산 분해 효소 억제제, 단백질 합성 억제제 또는 조절제, 산화/환원 전위(들)의 조정제, 비-변성 계면활성제, 버퍼 성분들, 스페르민, 스페르미딘, 퓨트리신 등을 포함한다.

염은 바람직하게는 포타슘, 마그네슘, 및 암모늄 염(예를 들어, 아세트산 또는 황산의)을 포함한다. 그러한 염들 중 한 가지 이상이 반대 음이온으로서 아미노산, 예를 들어 글루탐산을 가질 수 있다. 최적의 농도를 위해서 이온 종들은 상호의존적이다. 이들 이온 종은 전형적으로 단백질 생산에 관하여 최적화된다. 반응 배지의 특정 성분의 농도가 변할 때 다른 성분들의 농도도 그에 따라서 변할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 및 에너지원 화합물과 같은 몇몇 성분의 농도가 다른 성분들의 농도 변화에 따라 동시에 제어될 수 있다. 또한, 반응장치에 있는 성분들의 농도 레벨은 시간에 따라 변화할 수 있다. 산화/환원 전위 조정제는 디티오트레이톨, 아스코르브산, 글루타티온 및/또는 이들의 산화 형태들일 수 있다. 또한, 트리톤 X-100과 같은 비-변성 계면활성제가 약 500mM 이하, 더 통상적으로는 약 250mM 이하의 농도로 선택적으로 포함된다.

연속 작업 방식의 단백질 분리 수단을 사용할 때, 반응장치로부터의 산물 산출은 막을 통해 단백질 분리 수단으로 흐른다. 반-연속 방식에서는 막의 외부 또는 외부 표면이 정해진 순서로 순환 변화되는 정해진 용액과 접촉된 상태로 두어진다. 이들 용액은 아미노산 및 뉴클레오티드와 같은 기질을 함유한다. 이때 반응장치는 투석, 정용여과 배치 또는 피드-배치 방식으로 작동된다. 공급 용액은 동일한 막이나 별도의 주사 유닛을 통해 반응장치에 공급될 수 있다. 합성된 단백질은 반응장치에 축적된 다음, 시스템 작동의 완료 후에 단백질 정제에 대한 통상의 방법에 따라 분리 및 정제된다.

시약의 흐름이 있는 경우, 액체 흐름의 방향은 막에 수직 및/또는 접선 방향일 수 있다. 접선방향 흐름은 ATP를 재순환하고 막이 막히는 것을 방지하는데 효과적이며, 수직방향 흐름 위에 놓일 수 있다. 막에 수직인 흐름은 양압 펌프나 진공 흡인 펌프에 의해 일어나거나 행해질 수 있다. 막의 외부 표면과 접촉하고 있는 용액은 순환 변화될 수 있으며, 막에 관하여 정류상태의 접선방향 흐름일 수 있다. 반응장치는 적합한 교반 수단에 의해 내부적으로 또는 외부적으로 교반될 수 있다.

반응장치에서 단백질이 합성되는 동안 원하는 단백질을 선택적으로 분리하는 단백질 분리 수단은, 항체 분자 또는 합성된 원하는 단백질을 흡착하는 성분과 함께 고정된 다른 분자로 코팅된 입자로 충진된 유닛, 및 적합한 크기의 공극을 갖는 막을 포함할 수 있다. 바람직하게, 단백질 분리 수단은 교대로 사용되는 2개의 칼럼을 포함한다.

번역 반응에서 생산된 단백질의 양은 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 한 방법은 번역된 특정 단백질의 활성을 측정하는 분석의 효용성에 의존한다. 단백질 활성을 측정하는 분석의 예는 루시페라제 분석 시스템, 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제 분석 시스템이다. 이들 분석은 번역 반응으로부터 생산된 기능적으로 활성인 단백질의 양을 측정한다. 활성 분석은 부적합한 단백질 접힘 또는 단백질 활성에 필요한 다른 번역-후 변형의 부재로 인해 비활성인 전장 단백질을 측정하지 않을 것이다.

시험관내 전사 및 번역 커플 반응에서 생산된 단백질의 양을 측정하는 다른 방법은 ³⁵S-메티오닌, ³H-로이신 또는 ¹⁴C-로이신과 같은 방사성 표지된 아미노산을 기지의 양으로 사용하여 반응을 수행하고, 이어서 새로 번역된 단백질에 결합된 방사성 표지된 아미노산의 양을 측정하는 것이다. 결합 분석은 절단된 단백질 산물을 포함하여 시험관내 번역 반응에서 생산된 모든 단백질에서 방사성 표지된 아미노산의 양을 측정할 것이다. 방사성 표지된 단백질은 단백질 겔 상에서 더 분리될 수 있고, 오토라디오그래피에 의해 산물이 적합한 크기인지 그리고 부수적인 단백질 산물이 생산되지 않았는지를 확인한다.

본 발명이 설명된 특정한 방법, 프로토콜, 셀라인, 동물 종이나 속, 구성물, 및 시약에 제한되지 않으며, 물론 그러한 것들은 변할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정한 구체예를 설명하기 위한 목적일 뿐이고 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이라는 점이 이해되어야 한다.

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 어떤 방법, 장치 및 재료도 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 이제 설명된다.

본원에서 언급된 모든 간행물들은, 예를 들어 그 간행물들에 설명된 셀라인, 구성물, 및 방법을 설명 및 개시하기 위해 본원에 참고자료로서 포함되며, 이것은 현재 설명되는 발명과 관련되어 사용될 수 있다. 상기 논의되고 이 텍스트를 통틀어서 논의된 간행물들은 본 출원의 출원일 전에 개시된 것들에 대해서만 제공된다. 본원에서는 어느 것도 선행발명에 의하여 본 발명자들에게 그러한 개시보다 선행하는 권리를 주지 않아도 좋다는 승인으로서 구성되지 않는다.

다음의 실시예들은 본 발명을 어떻게 만들고 사용하는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해서 제시되며, 본 발명에 관련된 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 사용된 숫자들(예를 들어, 양, 온도, 농도 등)과 관련해서는 정확성을 확보하려는 노력이 행했지만, 어떤 실험적 오차와 편차가 허용되어야 한다. 달리 지시되지 않는다면, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압이거나 대기압 근처이다.

실시예 1

에너지원으로서 글루코스

방법 및 재료

합성을 위한 표준 시토밈 환경은 다음 성분들을 함유한다: 1.2mM ATP, GTP, UTP 및 CTP 각각 0.85mM, 1mM DTT, 130mM 포타슘 글루타메이트, 10mM 암모늄 글루타메이트, 8mM 마그네슘 글루타메이트, 34㎍/mL 폴린산, 170.6㎍/mL E. coli tRNA 혼합물, 13.3㎍/mL 플라스미드, 100㎍/mL T7 RNA 중합효소, 20개의 비표지 아미노산 각각 2mM, 11μM [¹⁴C]로이신, 1.5mM 스페르미딘과 1mM 퓨트리신, 0.33mM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 0.26mM 코엔자임 A, 2.7mM 소듐 옥살레이트 및 S30 추출물 0.24 부피. Escherichia coli K12(Michel-Reydellet 등, (2004), Met Eng (6)197-203에 설명된 균주 KC1, 유전자형 A19 ΔtonA ΔtnaA ΔspeA ΔendA ΔsdaA ΔsdaB met+)로부터 유래된 조 S30 추출물을 사용하여 원핵 세포-프리 단백질 합성을 수행하며, Pratt, J.M.(1984)의 프로토콜을 약간 변형하여 사용한다(원핵 세포-프리 시스템에서 전사-번역 커플, In Transcription and translation: a practical approach. Hanes, B.D. 및 S.J. Higgins, (편저), p. 179-209, IRL Press, 뉴욕). 추출물의 세포를 규정 배지에서 성장시킨다(Zawada 등, (2003), Escherichia coli 세포 추출물 생성을 위한 고밀도 규정 배지 배양, In: Saha B, 편저, Fermentation Biotechnology, 워싱턴 디씨: ACS Press. p. 142-156). Davanloo 등(1984)의 과정에 따라서 E. coli 균주 BL21(pAR1219)로부터 T7 RNA 중합효소를 제조했다(박테리오파지 T7 RNA 중합효소를 위한 유전자의 클로닝과 발현, Proc. Rat'l. Acad. Sci. USA 81:2035-2039). 반드시 필요하지는 않지만 이 시스템은 33mM 소듐 피루베이트를 첨가하여 강화될 수 있다. 세포 추출물로부터 기원하는 각 반응에는 대략적으로 3.3mM 마그네슘, 14.4mM 포타슘, 2.4mM 트리스, 및 23.5mM 아세테이트가 첨가되었다.

본 발명의 방법에 따른 변형된 시토밈 합성 환경은 다음과 같다: 10mM 포타슘 포스페이트와 50mM 비스-트리스(pH 7.0)를 첨가했고, [¹⁴C]로이신을 11μM 대신 5μM 사용했다. 이에 더하여, 30mM 글루코스를 첨가했고, 1.2mM ATP 대신에 1.2mM AMP를 사용했고, GTP, UTP 및 CTP 각각 0.85mM 대신에 GMP, UMP 및 CMP를 각각 0.85mM 사용했다. 추가로 옥살산을 제외했다.

반응물을 3-6시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 액체 섬광계수기(Beckman LS3801)를 사용하여 측정된 TCA-불용성 방사성활성으로부터 합성된 단백질의 양을 추정한다(Kim 등, 1996). 이미 설명된 대로 가용성 단백질의 수율을 측정했다(Kim 및 Swartz, 2000).

결과

전사-번역 커플 반응을 위한 표준 반응 혼합물은 Kim 및 Swartz(2001)에 의해 설명된다. 표준 반응에서 에너지원은 포스포엔올피루베이트(PEP)이다. 글루코스에 의한 PEP의 앞선 직접 치환은 사실상 단백질 합성을 가져오지 않는다. 그러나, PEP가 글루코스-6-포스페이트(G6P)로 대체되었을 때 228±13㎍/mL의 상당한 단백질 수율이 관찰되었다(Kim 및 Swartz, 2001). 글루코스-6-포스페이트는 해당작 용 반응 경로에서 글루코스로부터 단지 한 단계 떨어져 있을 뿐이며, 이는 초기 인산화가 제한될 수 있다는 것을 암시한다. 반응물에 헥소키나제나 글루코키나제를 첨가하거나 글루코스를 느리게 공급하는 것을 포함하여, 이 제한을 완화하기 위한 몇몇 실험을 수행했다. 두 접근법 모두 성공적이지 못했다.

G6P 반응은 이 에너지원을 사용하여 단백질 수율이 평균적으로 700㎍/mL 이상 될 때까지 표준 반응 혼합물을 변형하여 최적화되도록 계속된다. 이들 단백질 수율을 얻기 위해서 새로운 pH 버퍼를 사용했고 옥살산은 제거했다. 게다가, G6P 반응에서 NTP는 NMP에 의해 대체될 수 있으며 이것은 유사한 수율을 제공하는 것으로 나타났다. 이 치환은 반응 비용을 비약적으로 감소시켰다. 이들 진전에도 불구하고, 이 최적화된 조건은 G6P가 글루코스로 대체되었을 때는 상당한 단백질 합성을 여전히 허용하지 않았다.

폴리에틸렌 글리콜이 천연 양이온 퓨트리신 및 스페르미딘으로 대체되고 최적 반응물에 포스페이트가 추가로 첨가되었을 때, 그리고 소듐 옥살레이트가 제외되었을 때, 글루코스는 NMP와 함께 에너지원으로서 성공적으로 사용되었다. 포스페이트는 해당작용(글루코스에서 G6P로)의 개시 단계와 NMP의 NTP로의 인산화에 모두 중요하다. 세포-프리 반응은 에너지원으로서 글루코스를 사용했을 때 포스페이트 제한적이었다. 이 제한은 PEP, 크레아틴 포스페이트, 또는 심지어 G6P와 같은 인산화된 에너지원을 전형적으로 이용하는 종래의 세포-프리 반응에는 존재하지 않았다. 800㎍/mL 이상의 단백질 수율을 생산했던 G6P를 사용한 실험과 비교했을 때, 포스페이트가 더해진 글루코스를 사용한 실험은 400㎍/mL 이상의 단백질 수율을 제 공하는 것으로 밝혀졌다. 글루코스와 NMP 반응물은 이들 시약의 감소된 비용과 증가된 안정성 때문에 유리하다.

또한, 또 다른 비인산화 에너지원인 피루베이트는 단지 포스페이트가 추가로 첨가되었을 때에만 세포-프리 단백질 합성에서 NMP와 함께 성공적으로 사용되었다. 글루코스를 피루베이트로 대체하고 NTP를 NMP로 대체한 후에 상기 설명된 혼합물의 3시간 배치 반응을 수행했다. 포스페이트 최적화는 비용 부분에서 NTP에 대해 얻어진 양에 근접한 단백질 수율을 가져왔다(도 1). 어떤 추가적 포스페이트가 없다면 단백질 합성 수율은 실질적으로 더 낮다.

이 새로운 반응에 대한 필요요건을 더 결정하기 위해서, 반응 성분들을 개별적으로 조사했다. 에너지원으로서 NTP와 글루코스를 사용한 반응도 포스페이트 추가로부터 이득을 얻는 것으로 단정되었으며(도 2), NMP 반응물과 유사한 수율을 가져왔다. 또, 성공적인 반응에 중요한 다른 단계들을 결정하기 위해 추가의 실험을 수행했다. PEG 및 옥살산의 제거와, 뿐만 아니라 적합한 버퍼의 사용을 통한 주의 깊은 pH 조절이 단백질 수율에 상당한 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다(도 3).

이전에 세포-프리 단백질 합성 반응은 인산화 에너지원과 뉴클레오티드 트리포스페이트를 사용하는 것에 제한되었었다. 세포-프리 반응에서 이들 화합물은 비교적 고가의 시약이다. 게다가, 인산화된 분자는 변성에 훨씬 민감하며, 무기 인산염 농도와 관련하여 가변적인 반응 환경을 만든다. 글루코스와 뉴클레오티드 모노포스페이트를 사용하면 반응 강인성 및 항상성이 증가하는 동시에 비용도 비약적으로 감소할 것이다. 사실 에너지원 및 뉴클레오티드의 비용을 비교했을 때, 글루 코스 및 NMP는 PEP 및 NTP에 비해 거의 2-차수 크기만큼 덜 비싸다(표 1, 1열).

NMP 및 에너지원으로서 글루코스를 사용한 시험관내 합성 반응의 단백질 합성 수율은 종래 반응의 약 60%이다. 그러나, 글루코스 및 NMP를 사용했을 때의 큰 비용상의 이점은 수율에 있어서의 약간의 감소를 상쇄하며, 상대적 생성물 수율은 비용 기준으로 볼 때 거의 90배 더 낫다.

추출물의 공급원으로서 E. coli 균주 KC1(Reydellet 등, (2004), Metab Eng 6(3):197-203에 의해 설명된)을 사용하고 반응 조건에 관해서는 상기 설명된 대로 추가의 세포-프리 반응을 수행했다. 세포-프리 반응 중에 다양한 시간에서 샘플을 취해서 ATP 농도에 대한 데이터를 얻었다. 5% 트리클로로아세트산(TCA)를 동일한 부피로 사용하여 샘플을 침전시키고, 14000g에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 수집하고 개똥벌레 루시페라제 분석으로 분석하여 ATP 농도를 측정한다(Kim 및 Swartz (2001), 상동).

도 4는 포스페이트를 사용하거나 사용하지 않은 NMP 및 NTP를 갖는 상기 설명된 글루코스 시스템의 비교이다. 도 4의 데이터는 10mM 포스페이트가 글루코스 시스템에서 유리하다는 것을 증명한다. 게다가, 이들 데이터는 단백질 합성 수율에 대한 영향 없이 NMP가 NTP를 대체할 수 있음을 나타낸다.

도 5의 데이터는 NMP를 사용한 세포-프리 시스템이 전사/번역에 필요한 ATP를 재생할 수 있음을 나타낸다. 사실 NMP를 사용했을 때 ATP 농도는 글루코스/NTP 반응물에서 볼 수 있는 것과 동일한 레벨까지 빠르게 도달한다.

실시예 2

에너지원으로서 글루타메이트

하기 설명된 전사-번역 조합 반응을 위한 반응 혼합물은 다음 성분들을 함유한다: 1.2mM ATP, GTP, UTP 및 CTP 각각 0.85mM, 130mM 포타슘 글루타메이트, 10mM 암모늄 글루타메이트, 10mM 마그네슘 글루타메이트, 1.5mM 스페르미딘, 1mM 퓨트리신, 34㎍/mL 폴린산, 170.6㎍/mL E. coli tRNA 혼합물, 13.3㎍/mL 플라스미드, 100㎍/mL T7 RNA 중합효소, 20개의 비표지 아미노산 각각 2mM, 5μM L-[U-¹⁴C]-로이신, 0.33mM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 0.26mM 코엔자임 A, 4.0mM 소듐 옥살레이트 및 S30 추출물 0.24 부피.

피루베이트는 에너지원에서 제외했다. 이 상황에서 10mM 포타슘 포스페이트 pH 7.2(차가운 아세트산으로)로 보충하는 것이 단백질 발현에 유리하다. NTP(ATP, GTP, UTP, 및 CTP)의 사용에 더하여, 또 상기 설명된 것과 동일한 농도로 NMP(AMP, GMP, UTP, 및 CMP)를 사용하여 반응을 수행했다. 세포 추출물로부터 기원하는 각 반응에는 대략적으로 3.3mM 마그네슘, 14.4mM 포타슘, 2.4mM 트리스 pH 8.2, 그리고 23.5mM 아세테이트가 있다. 추출물은 반응 부피의 24%를 구성하며, 그것은 마그네슘, 포타슘, 및 트리스 아세테이트로 제조된 그 자신의 버퍼 중에 있다. 따라서 버퍼가 반응물에 첨가되었을 때 이 버퍼는 이들 항목의 농도를 증가시킨다. 상기 주어진 농도들(3.3mM, 14.4mM 등)은 추출물이 이미 첨가된 후의 최종 농도이다. E. coli 총 tRNA 혼합물은 Roche Molecular Biochemicals(인디애나주 인디애나폴리스)로부터 구입한다. L-[U-¹⁴C]-로이신은 Amersham Pharmacia Biotechnology(스웨덴 웁살라)로부터 구입한다. 모든 다른 시약들은 Sigma(미주리주 세인트루이스)로부터 구입한다.

E. coli K12(균주 KC1, 유전자형 A19 ΔtonA ΔtnaA ΔspeA ΔendA ΔsdaA ΔsdaB met+)로부터 유래된 조 S30 추출물을 사용하여 세포-프리 단백질 합성 반응을 수행했다. 추출물 제조는 이미 설명된 대로 수행했다(Swartz 등, (2004), 원핵 전사-번역 커플을 사용한 세포-프리 단백질 합성, In: Balbas P, Lorence A, 편저, Recombinant Protein Protocols: Methods in Molecular Biology Series: 267권, 뉴저지주 토토와: Humana Press Inc. p. 169-182). 단백질 합성 주형으로서 플라스미드 pK7CAT을 사용했다. pK7CAT은 T7 프로모터 및 터미네이터를 사용하여 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제(CAT)의 서열을 암호화한다. Swartz 등(2004)에 의해 설명된 대로 제조된 T7 중합효소를 반응에 첨가했다. 액체 섬광계수기를 사용하여 측정된 TCA-불용성 방사성 활성과 효소 활성(Shaw(1975) Methods Enzymol. 43:737-755)로부터 합성된 단백질의 양을 계산한다.

본원에서는 포스페이트 보충은 글루타메이트 대사 및 산화성 인산화에 의해 에너지가 제공되는 시토밈 시스템에서의 단백질 생산 수율에 상당히 유리한 것으로 나타난다. 이것을 NTP 또는 NMP를 사용하는 것과 관련하여 설명한다. NTP의 경우 우리는 포스페이트를 첨가하지 않은 반응에 관하여 6시간 발현 후 클루람페니콜 아세틸 트랜스페라제(CAT) 생산(¹⁴C-로이신 결합에 의해 평가)의 상당한 증가를 관찰했다(도 6). 뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용했을 때도 포스페이트 첨가는 수율을 증가시켰다.

글루타메이트/포스페이트 시스템에서의 CAT 발현을 최적화하기 위해서, 시토밈 세포-프리 반응(소듐 피루베이트가 없는)에 대한 포스페이트 농도의 효과를 시험했다. 초기 포스페이트 농도 범위에 걸쳐서 6시간 발현한 후 ¹⁴C-로이신 결합에 의해 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제(CAT) 생산을 평가했다. CAT의 가장 양호한 수율은 10mM 포스페이트를 첨가했을 때 관찰되었다(표 2).

글루타메이트 대사, NTP, 및 포스페이트 보충을 이용하는 이 새로운 접근법을 더 특성화하기 위해서, TCA 침전형 방사성 활성 및 효소 활성에 의해 측정하여 시간에 따른 CAT 축적을 정량했다. 6시간 인큐베이션 후 CAT의 최종 수율은 802±48㎍/mL였다(도 7). CAT의 가용성 및 활성 부분은 약 70±3%였다(도 2). 포타슘 포스페이트 첨가의 저렴한 비용으로 인해(10mM 포타슘 포스페이트에 대해 반응 부피 mL 당 $0.00016), 10mM 포스페이트 보충된 단백질 생산 수율은 반응의 원료 비용에 큰 영향 없이 33%까지 증가한다.

이 새로운 글루타메이트 및 포스페이트 시스템의 유용성을 증명하기 위해서, 1mL 피복된 버블 칼럼 반응을 수행했다. 37℃에서 유지되는 전사 및 번역 조합 반응을 시토밈 조건(피루베이트 없음, NTP를 사용하여 10mM 포스페이트로 보충)을 사용하여 5시간 동안 수행했으며, 단 반응은 0.007%(v/v) Sigma 0-30 항기포제로 보충했다. 이 항기포제를 사용하여 거품형성을 제어했다. 이에 더하여, 세포-프리 반응 챔버 바닥에 직경 약 0.25cm의 순수 산소 버블을 초당 2개 버블의 속도로 공급하여 ATP 재생에 필요한 산소를 송달했다. 각 시간 지점에서 샘플을 취하여 총 CAT의 양을 정량했고, 이것은 ¹⁴C-로이신 결합에 의해 측정했다. 도 8은 2회의 개별 실험으로부터의 평균 CAT 축적(~900㎍/mL)을 나타낸다. 15㎕ 배치 반응(도 7)에 비하여 버블 칼럼 형식은 더 빠른 단백질 합성 속도를 가졌다.

NMP를 NTP로 교체하는 것의 영향을 정량하기 위해서, 표준 초기 농도로 NMP 또는 NTP를 갖는 새로운 시스템(글루타메이트/10mM 포스페이트)에서 CAT 발현을 측정했다. 6시간 동안 단백질 합성 반응을 수행하고 샘플을 취하여 CAT 축적을 정량했다. NTP에 비하여 NMP를 사용했을 때 CAT 수율의 22% 감소가 관찰되었다(도 9). 전체 단백질 수율은 감소하지만, 뉴클레오시드 모노포스페이트를 사용하는 것의 비용적 이점은 NTP를 사용한 반응과 비교했을 때 상당히 더 높은 생산 수율(에너지원 및 뉴클레오티드의 달러 당 단백질 mg)을 가져온다(표 3).

또한, NMP 반응에서 단백질 발현 수율에 대한 포스페이트 농도 범위의 효과를 시험했다. NMP를 이용한 세포-프리 단백질 합성 반응이 포스페이트 제한적임을 증명한 이전의 데이터와 일치하여, 포스페이트 보충이 높은 수율을 위해 중요했다. 최적의 포스페이트 농도는 10mM였다. 10mM 포스페이트의 첨가시 수율은 포스페이트를 사용하지 않은 세포-프리 반응에 비해 400% 이상 증가했다(도 10).

본원에서는 글루타메이트에 의해 에너지가 제공되는 세포-프리 단백질 합성 반응에서 포스페이트 보충이 단백질 합성 수율을 33%까지 증가시키는 것으로 나타났다. 수율을 증진시킴으로써 이 시스템의 유용성이 증가하는 것에 더하여, 이것은 전체적인 원료 경제성(시약 비용)에 대한 영향 없이 수율을 증진시킨다. 특히, 글루타메이트 대사에 의해 에너지가 제공되는 세포-프리 반응은 포스페이트를 사용하지 않는 반응에 비해 4배 이상 증가시킨다.

포스페이트 보충으로 인한 수율 증가의 결과로서, 세포-프리 시약에 관련된 두 가지 우세한 시약 비용(에너지 기질 및 뉴클레오티드)이 적합한 포스페이트 농도로 보충되고 NTP 대신 NMP를 사용한 글루타메이트 대사 및 산화성 인산화에 의해 에너지 제공되는 세포-프리 반응을 사용함으로써 종래의 PANOx-SP 접근법으로부터 2-차수 이상의 크기(160배 증가(59/0.37)까지 감소될 수 있다(표 3). 이들 결과는 세포-프리 rDNA 단백질 합성의 경제적인 실행가능성을 증명한다. 이 새로운 기술에서는 외인성 보조인자의 첨가가 필요하지 않다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH), NAD⁺, 또는 아세틸-코엔자임 A와 같은 화합물을 사용하여 단백질 합성 수율을 보충할 수 있지만 반드시 필요한 것은 아니다.

Claims (18)

1. 외인성 포스페이트의 존재하에서 포스페이트-프리 에너지원을 포함하는 반응 혼합물에서 생물학적 거대분자를 합성하는 것을 포함하는 생물학적 거대분자의 증진된 시험관내 합성을 위한 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 포스페이트-프리 에너지원은 글루코스인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 포스페이트-프리 에너지원은 글루타메이트인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 포스페이트-프리 에너지원은 피루베이트인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 포스페이트는 약 1mM 내지 약 20mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 포스페이트는 포타슘 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 또는 암모늄 포스페이트로서 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 포스페이트는 반응 동안 방출되는 공급원으로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 모노포스페이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 합성은 외인성 뉴클레오티드 트리포스페이트의 부재하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 생물학적 거대분자의 상기 합성은 폴리펩티드를 생산하기 위한 mRNA의 번역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 합성은 DNA 주형으로부터 mRNA의 전사를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항에 있어서, 생물학적 거대분자의 상기 합성은 배치 반응으로서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 생물학적 거대분자의 상기 합성은 연속 반응으로서 수행 하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 글루코스 함유 배지에서 성장시킨 E. coli로부터의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 E. coli는 글루코스 및 포스페이트 함유 배지에서 성장시킨 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 약 5mM 내지 약 20mM의 농도로 마그네슘을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 폴리에틸렌 글리콜을 실질적으로 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 스페르민, 스페르미딘 및 퓨트리신 중 한 가지 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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