KR20060115351A - Method of in vitro differentiation of neural stem cells, motor neurons and dopamine neurons from primate embryonic stem cells - Google Patents
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Abstract
Description
사람 배아 줄기(ES) 세포는 이식전 배아의 내부 세포 매쓰로부터 유래하는 만능세포이다[문헌참조: Thomson, J. A. , et al., Science 282: 1145-1147,1998]. 마우스 ES 세포와 유사하게 이들은 삼배엽층 모두를 갖는 다양한 체세포로 분화하는 잠재력을 유지하면서 다수로 증식될 수 있다[문헌참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998; Reubinoff, B. E. , et al., Nat. Biotech. 18: 399, 2000; Thomson, J. A. and Odorico, J. S., Trends Biotech 18: 53-57,2000 ; Amit, M., et al., Dev. Biol. 227: 271-278,2000]. ES 세포의 시험관내 분화는 이식 치료를 위한 공여체 세포의 초기 발육 및 생성에 대한 세포 및 분자 기작을 연구하기 위한 새로운 전망을 제공한다. 실질적으로, 마우스 ES 세포는, 조혈 세포[문헌참조: Wiles, M. V. and Keller, G. , Development 111: 259-267,1991], 심근세포[문헌참조: Klug, M. G., et al., J. Clin. Invest. 98: 216-224, 1996], 인슐린 분비 세포[문헌참조: Soria, B., et al., Diabetes 49: 157-162, 2000] 및 신경교[문헌참조: Bain, G., et al., Dev. Biol. 168: 342-357,1995 ; Okabe, S., et al., Mech. Dev. 59: 89-102, 1996; Mujtaba, T. , et al., Dev. Biol. 214: 113-127,1999 ; Brustle, O., et al., Science 285 : 754-756, 1999]를 포함하는, 많은 임상적으로 관련된 세포 유형으로 시험관에서 분화하는 것으로 밝혀졌다. 설치류 중추신경계(CNS)로 이식된 후, ES 세포 유래 신경 전구체는 숙주 조직에 통합하고 몇몇 경우에 기능을 개선시키는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: McDonald, J. W., et al., Nat. Med. 5: 1410-1412,1999]. 사람 ES 세포의 임상적 적용은 특정 조직 및 기관에 대한 고도로 순수한 공여체 세포의 생성을 필요로 한다.Human embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of embryos prior to transplantation (Thomson, J. A., et al., Science 282: 1145-1147,1998). Similar to mouse ES cells, they can proliferate in large numbers, maintaining the potential to differentiate into various somatic cells with all three germ layers. Thomson, J. A., et al., Supra, 1998; Reubinoff, B. E., et al., Nat. Biotech. 18: 399, 2000; Thomson, J. A. and Odorico, J. S., Trends Biotech 18: 53-57,2000; Amit, M., et al., Dev. Biol. 227: 271-278, 2000. In vitro differentiation of ES cells provides a new prospect for studying cellular and molecular mechanisms for the early development and production of donor cells for transplantation treatment. Indeed, mouse ES cells include hematopoietic cells (Wires, MV and Keller, G., Development 111: 259-267, 1991), cardiomyocytes (Klug, MG, et al., J. Clin). . Invest. 98: 216-224, 1996, insulin secreting cells (Soria, B., et al., Diabetes 49: 157-162, 2000) and glial cells (Bain, G., et al., Dev) . Biol. 168: 342-357, 1995; Okabe, S., et al., Mech. Dev. 59: 89-102, 1996; Mujtaba, T., et al., Dev. Biol. 214: 113-127,1999; Many clinically relevant cell types, including Brustle, O., et al., Science 285: 754-756, 1999, have been shown to differentiate in vitro. After transplantation into the rodent central nervous system (CNS), ES cell-derived neural precursors have been found to integrate into host tissues and in some cases improve function. McDonald, J. W., et al., Nat. Med. 5: 1410-1412,1999. Clinical application of human ES cells requires the generation of highly pure donor cells for specific tissues and organs.
당업계에서는 분화하는 사람 ES 세포 배양물로부터 이식가능한 신경 세포 및 운동 뉴런 전구체를 분리하기 위한 단순하면서도 효율적인 전략이 요구된다.There is a need in the art for a simple but efficient strategy to separate transplantable neuronal and motor neuron precursors from differentiated human ES cell cultures.
발명의 요약Summary of the Invention
한 양태에서, 본 발명은 조기 로제트(rosette) 형태를 특징으로 하고 Sox1-, Pax6+인 배아 줄기 세포로부터 배양된 동조 세포군을 포함하는 세포군을 생성시키는 방법이다. 한 양태에서, 본 발명은 (a) 배아 줄기 세포를 배상체로 증식시키는 단계 및 (b) 배상체를 신경 관형 로제트 형태의 신경 줄기 동조 세포군으로 증식시키는 단계를 포함하고 여기에서, 증식은 FGF2, FGF8, FGF4 또는 FGF9의 존재하에 수행된다. 배아 줄기 세포의 증식에서 조기 로제트 발육까지의 총 시간은 바람직하게 8일 내지 10일이다. 바람직하게, 전체 Pax6+/Sox1-의 세포군은 총 세포군의 70% 이상이다.A method of generating a cell population comprising a cell population from the culture tuning, Pax6 + of embryonic stem cells In one aspect, the invention features an early rosette (rosette) form and Sox1. In one aspect, the invention includes (a) propagating embryonic stem cells into embryoid bodies and (b) propagating embryonic bodies into neural stem syngeneic cell populations in the form of neural tubular rosettes, wherein proliferation is FGF2, FGF8 , In the presence of FGF4 or FGF9. The total time from the proliferation of embryonic stem cells to early rosette development is preferably 8 to 10 days. Preferably, the total population of Pax6 + / Sox1 − is at least 70% of the total cell population.
본 발명은 또한 당해 방법에 의해 생성되는 세포군에 관한 것이다.The invention also relates to a cell population produced by the method.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 신경 관형 로제트 형태임을 특징으로 하고 Pax6+/Sox1+인 신경 줄기 동조 세포군을 생성하는 방법에 관한 것이고 이러한 방법은 조기 로제트 형태를 특징으로 하고 FGF2, FGF4, FGF8 또는 RA의 존재하에 4 내지 6일동안 Sox1-, Pax6+인 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 당해 방법에 의해 생성되는 세포군에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method for producing a neural stem syngeneic cell population characterized by a neural tubular rosette form, which is Pax6 + / Sox1 + , wherein the method is characterized by an early rosette form and may be FGF2, FGF4, FGF8 or Culturing the cells Sox1 − , Pax6 + for 4-6 days in the presence of RA. The invention also relates to a cell population produced by the method.
한 양태에서, 조기 로제트 세포는 바람직하게 4 내지 7일동안 FGF8과 함께 배양되고 EN1+이다. 또 다른 양태에서, 세포는 바람직하게 4 내지 7일동안 FGF2와 배양되고 Bf1+이다. 또 다른 양태에서, 세포는 바람직하게 4 내지 7일동안 RA와 함께 배양되고 Hox+이다.In one embodiment, the early rosette cells are preferably incubated with FGF8 for 4-7 days and are EN1 + . In another embodiment, the cells are preferably incubated with FGF2 for 4-7 days and are Bf1 + . In another embodiment, the cells are preferably incubated with RA for 4-7 days and are Hox + .
또 다른 양태에서, 본 발명은 중뇌 도파민 뉴런군을 분리하는 방법에 관한 것이고, 당해 방법은 상기된 세포를 FGF8의 존재하에 SHH와 함께 배양하는 단계를 포함하고 여기에서, 수득한 세포는 TH, AADC, EN-1, VMAT2 및 DAT를 발현하지만 DbH 및 PNMT를 발현하지 못한다. 본 발명은 또한 당해 방법에 의해 생성되는 세포군에 관한 것이다.In another aspect, the invention relates to a method for isolating a group of midbrain dopamine neurons, the method comprising culturing the cells described above with SHH in the presence of FGF8, wherein the cells obtained are TH, AADC , EN-1, VMAT2 and DAT but not DbH and PNMT. The invention also relates to a cell population produced by the method.
또 다른 양태에서, 본 발명은,척수 운동 뉴런군을 분리하는 방법에 관한 것이고, 당해 방법은 RA의 존재하에 SHH와 함께 배양하는 단계를 포함하고, 여기에서, 수득한 세포는 HB9, HoxB1, HoxB6, HoxC8, ChAT 및 VAChT를 발현한다. 본 발명은 또한 당해 방법에 의해 생성되는 세포군에 관한 것이다.In another aspect, the invention relates to a method for isolating a group of spinal motor neurons, the method comprising culturing with SHH in the presence of RA, wherein the cells obtained are HB9, HoxB1, HoxB6 , HoxC8, ChAT and VAChT. The invention also relates to a cell population produced by the method.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전뇌 도파민 뉴런군을 분리하는 방법에 관한 것이고 당해 방법은 상기된 세포를 SHH와 함께 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 당해 방법에 의해 생성되는 세포군에 관한 것이다.In another aspect, the invention relates to a method for isolating whole group of brain dopamine neurons and the method comprises culturing the cells described above with SHH. The invention also relates to a cell population produced by the method.
본 발명은 또한 정상 사람 신경 발육에 영향을 미치는 능력에 대해 제제를 스크리닝하기 위한 상기된 세포군 시험 방법에 관한 것이다.The invention also relates to the aforementioned cell population test method for screening agents for their ability to affect normal human neural development.
본 발명의 또 다른 목적, 잇점 및 특징은 명세서, 특허청구범위 및 도면을 검토한 후에 명백해질 것이다.Other objects, advantages and features of the invention will become apparent after a review of the specification, claims and drawings.
도 1A-1은 ES 세포 기원의 신경 전구체의 분화 및 분리를 도시한다. 도 1A에서는 FGF2의 존재하에 5일동안 성장한 부착된 EB가 말초에서 편평 세포이고 중앙에서 응집한 소형 신장된 세포임을 보여준다. 도 1B에서는 7일까지 많은 로제트 형성(화살표)이 분화하는 EB 중앙에서 나타남을 보여준다. 상부 우측 삽입 그림은 톨루이딘 블루로 염색된 로제트의 1㎛ 절편이고 이는 원주 세포가 관형 구조로 배열되어 있음을 보여준다. 막대 = 20㎛. 도 1C-E에서는 로제트 클러스터 세포(하부 좌측) 및 소형성 로제트(중앙)가 네스틴(도 1C) 및 무사쉬-1(도 1D)양성인 반면 주변 편평 세포는 음성임을 보여준다. 도 1E는 도 1C 및 도 1D와 DAPI로 표지된 모든 세포핵의 합성 이미지이다. 도 1F에서는 2분동안 디스파제로 처리한 후, 로제트 형성이 후퇴하는 반면 주변 편평 세포는 부착된 채로 유지되고 있음을 보여준다. 도 1G-I에서는 분리된 세포가 네스틴에 의해 필라멘트 패턴으로 양성으로 염색되고(도 1G), 세포질내에서는 무사쉬-1로 양성으로 염색되고(도 1H) 주로 막에 대해서는 PSA-NCAM으로 양성으로 염색됨(도 1I)을 보여준다. 모든 핵은 DAPI로 염색된다. 막대 = 100㎛.1A-1 depict differentiation and isolation of neural precursors of ES cell origin. FIG. 1A shows attached EBs grown for 5 days in the presence of FGF2 are squamous cells in the periphery and small elongated cells centrally aggregated. 1B shows that by day 7 many rosette formations (arrows) appear in the center of the erupting EB. The upper right inset shows a 1 μm section of a rosette stained with toluidine blue, which shows columnar cells arranged in a tubular structure. Bar = 20 μm. 1C-E show that the rosette cluster cells (bottom left) and miniature rosettes (center) are Nestin (FIG. 1C) and Musash-1 (FIG. 1D) positive while peripheral squamous cells are negative. FIG. 1E is a composite image of all cell nuclei labeled with FIGS. 1C and 1D and DAPI. 1F shows that after treatment with dispase for 2 minutes, rosette formation retreats while peripheral squamous cells remain attached. In FIG. 1G-I, the isolated cells were stained positively with filament pattern by Nestin (FIG. 1G), positively stained with Musash-1 in the cytoplasm (FIG. 1H) and positively with PSA-NCAM for membranes Stained (FIG. 1I). All nuclei are stained with DAPI. Bar = 100 μm.
도 2A-G는 시험관내 ES 세포 유래 신경 전구체의 특성을 나타낸 것이다. 도 2A에서는 해리된 ES 세포 유래 신경 전구체에 의한 BrdU 혼입이 FGF2(20ng/ml)의 존재하에서는 상승되지만 상피 성장 인자(EGF)(20ng/ml) 또는 백혈병 억제 인자(LIF)(5ng/ml)의 존재하에서는 상승되지 않음을 보여준다. 이것은 3회 복제 실험중 하나를 대표하는 데이타이다. *는 실험 그룹과 대조군 그룹간의 차이를 나타낸다(p < 0.01, n = 4, 스튜던트 t-시험). 도 2B는 3주동안의 ES 세포 유래 신경 전구체 클러스터의 분화가 경섬유를 따라 이동하는 세포와의 경섬유 다발을 형성함을 보여준다. 도 2C에서는, 3주 분화 후 면역염색 결과 대다수의 세포가 βIII-튜불린+ 뉴런(적색)이고 단지 몇개의 세포가 GFAP+ 성상세포(녹색)임을 보여준다. 도 2D에서는 45일 분화 후, 보다 많은 GFAP+ 성상세포(녹색)가 NF200+ 경섬유(적색이지만 녹색 GFAP와 중첩됨으로 인해 황색을 나타냄)와 함께 나타남을 보여준다. 도 2E-G에서는 다양한 형태를 갖는 ES 세포 유래된 뉴런이 글루타메이트(도 2E), GABA(도 2F) 및 효소 타이로신 하이드록실라제(도 2G)와 같은 명백한 신경전달물질을 발현함을 보여준다. O4+ 희소돌기아교세포(화살표)는 신경교 분화 배지에서 2주 분화후 관찰된다. 막대 = 100㎛.2A-G show the properties of ES cell derived neural precursors in vitro. In FIG. 2A BrdU incorporation by dissociated ES cell-derived neural precursors is elevated in the presence of FGF2 (20 ng / ml) but of epidermal growth factor (EGF) (20 ng / ml) or leukemia inhibitory factor (LIF) (5 ng / ml). It does not rise in presence. This is data representative of one of three replicate experiments. * Indicates the difference between the experimental and control groups (p <0.01, n = 4, Student's t-test). 2B shows that differentiation of ES cell-derived neural precursor clusters over three weeks forms a bundle of fibrous fibers with cells traveling along the fibrous fiber. In FIG. 2C, immunostaining after 3 weeks of differentiation shows that the majority of cells are β III -tubulin + neurons (red) and only a few cells are GFAP + astrocytes (green). 2D shows that after 45 days of differentiation, more GFAP + astrocytic cells (green) appear with NF200 + hard fibers (red but yellow due to overlapping with green GFAP). 2E-G shows that ES cell-derived neurons of various morphologies express distinct neurotransmitters such as glutamate (FIG. 2E), GABA (FIG. 2F) and enzyme tyrosine hydroxylase (FIG. 2G). O4 + oligodendrocytes (arrows) are observed after 2 weeks of differentiation in glial differentiation medium. Bar = 100 μm.
도 3A-K는 생체내에서 ES 세포 유래 신경 전구체의 혼입 및 분화를 도시한 다. 이식 세포는 프로브와 사람 alu-반복 요소(도 3A-E, G)의 동일계 하이브리드화 또는 사람 특이적 핵 항원(도 3F)에 대한 항체에 의해 검출된다. 도 3A에서는 8주된 수용체(화살표)의 숙주 피질에서의 각각의 공여체 세포를 보여준다. 도 3B에서는 해마 형성체내 ES 세포 유래 신경 전구체의 광범위한 혼입을 보여준다. 사람 alu 프로브와 하이브드화된 세포는 적색 도트(가상 색상)으로 표지된다. 도 3C에서는 P14에서 해마 피라미드 층에 인접하여 혼입된 사람 세포를 보여준다. 도 3D에서는 4주된 수용체 마우스의 격막에서 ES 세포 유래 세포를 보여준다. 도 3E에서는 시상하부에서 각각의 공여체 세포의 고화질 조망을 보여준다. 인접한 비표지된 숙주 세포간의 이음매 없이 통합되어 있음을 주지한다. 도 3F에서는 사람 특이적 핵 항원에 대한 항체로 검출되는 4주된 숙주의 선조에서의 공여체 세포를 보여준다. 도 3G에서는 이식된 세포가 수관으로부터 배측부 중뇌로 광범위하게 이동함을 보여준다. 도 3H에서는 2주된 숙주의 피질에서 사람 ES 세포 유래 뉴런이 극성 형태 및 긴 프로세스를 나타냄을 보여준다. 세포는 사람 특이적 핵 마커(녹색) 및 βIII-튜불린(적색)에 대한 항체로 이중으로 표지된다. 도 3I에서는 사람 신경필라멘트에 대한 항체로 동정되는, 해마 체에서의 공여체 유래 축색돌기의 네트워크를 보여준다. 도 3J에서는 MAP2의 a 및 b 이소형을 인지하는 항체로 중복 표지되는 공여체 유래 다극성 뉴런을 보여준다. 도 3K에서는 사람 특이적 핵 마커(녹색) 및 GFAP애 대한 항체(적색)으로 중복 표지된 4주된 동물의 피질에서 ES 세포 유래 성상세포를 보여준다. 모든 중복 표지는 공초점 이미지이고 단일 광학 컷으 로 확인됨을 주지한다. 막대: 도 3A, 도 3B, 도 3G에서 200㎛; 도 3C, 도 3D에서 100㎛; 도 3E, 도 3F, 도 3H-K에서는 10㎛.3A-K show incorporation and differentiation of ES cell derived neural precursors in vivo. Transplanted cells are detected by in situ hybridization of probes and human alu-repeat elements (FIGS. 3A-E, G) or antibodies to human specific nuclear antigens (FIG. 3F). 3A shows each donor cell in the host cortex of an 8 week old receptor (arrow). 3B shows extensive incorporation of ES cell-derived neural precursors in hippocampus. Human alu probes and hybridized cells are labeled with red dots (virtual colors). 3C shows human cells incorporated adjacent to the hippocampus pyramidal layer at P14. 3D shows ES cell derived cells in the septum of 4 week receptor mice. 3E shows a high quality view of each donor cell in the hypothalamus. Note that seamless integration between adjacent unlabeled host cells. 3F shows donor cells in the ancestors of a four week host detected with antibodies to human specific nuclear antigens. 3G shows that the transplanted cells migrate extensively from the canal to the dorsal midbrain. 3H shows that human ES cell derived neurons exhibit polar morphology and long processes in the cortex of a two week host. Cells are double labeled with antibodies to human specific nuclear markers (green) and β III -tubulin (red). 3I shows a network of donor-derived axons in the hippocampus, identified as antibodies to human neurofilaments. 3J shows donor-derived multipolar neurons overlabeled with antibodies recognizing the a and b isotypes of MAP2. 3K shows ES cell-derived astrocytic cells in the cortex of four week-old animals overlabeled with human specific nuclear markers (green) and antibodies against GFAP (red). Note that all duplicate markers are confocal images and identified as a single optical cut. Bars: 200 μm in FIGS. 3A, 3B, 3G; 100 μm in FIG. 3C, FIG. 3D; 10 micrometers in FIGS. 3E, 3F and 3H-K.
도 4는 신경외배엽 세포의 생성 및 지역적 특수화를 도시한다.4 shows the generation and regional specialization of neuroectodermal cells.
도 4A에서는 원주 세포가 20ng/ml의 FGF2의 존재하에 9일째에 분화하는 ES 세포 콜로니에서 나타남을 보여준다. 도 4B에서는 원주 세포가 14일째에 신경관형 로제트를 형성함을 보여준다. 도 4C에서는 원주 형태를 갖는 로제트에서 세포가 Sox1(적색)에 대해 양성임을 보여준다. 도 4D에서는 FGF2 처리된 배양에서 신경 로제트 세포가 Bf1(적색)을 발현하지만 En-1(녹색)은 발현하지 않음을 보여준다. 도 4E에서는 En-1(녹색) 발현이 9일째에 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8)(100ng/ml)로 6일까지 처리되고 4일동안 FGF8중에서 증식함에 이어서 라미닌 기질에 대해 추가로 6일동안 소닉 헤지호그(SHH)(200ng/ml)로 처리된 네스틴+(적색) 신경외배엽 세포에서 관찰됨을 보여준다. 도 4F에서는 당해 En-1+ 세포(녹색)가 도 4E에서와 같이 처리된 배양에서 Bf1(적색)에 대해 음성임을 보여준다. 세포 핵은 훽스트(c,d: 청색)로 염색된다. 막대: 50㎛.4A shows that columnar cells appear in ES cell colonies that differentiate on day 9 in the presence of 20 ng / ml FGF2. 4B shows that columnar cells form neural tubular rosettes on day 14. 4C shows the cells are positive for Sox1 (red) in rosettes with columnar morphology. 4D shows that neural rosette cells express Bf1 (red) but not En-1 (green) in FGF2 treated cultures. In FIG. 4E, En-1 (green) expression was treated with fibroblast growth factor 8 (FGF8) (100 ng / ml) up to 6 days on day 9 and proliferated in FGF8 for 4 days, followed by an additional 6 days for laminin substrate. It is observed in nestin + (red) neuroectodermal cells treated with Sonic Hedgehog (SHH) (200 ng / ml). 4F shows that En-1 + cells (green) are negative for Bf1 (red) in cultures treated as in FIG. 4E. Cell nuclei are stained with Hoechst (c, d: blue). Bar: 50 μm.
도 5는 DA 뉴런의 분화를 보여준다. 도 5A에서는 분화된 세포의 약 3분의 1이 분화 3주째에 FGF8, SHH 및 아스코르브산(AA)로 처리된 배양에서 타이로신 하이드록실라제(TH) 양성임을 보여준다. 도 5B에서는 배양물중의 모든 TH+ 세포(적색)가 양성으로 신경 마커 βIII-튜블린(녹색)으로 염색됨을 보여준다. 도 5C-E에서는 배양물중의 모든 TH+ 세포가 양성으로 방향족 산 데카복실라제(AADC)(a 및 e, 적색)로 염색되지만 몇몇 AADC+ 세포는 TH-(e, 화살촉)임을 보여준다. 도 5F에서는 TH+ 세포가 노르아드레날린 뉴런 마커 도파민 β-하이드록실라제(DβH)(녹색)에 대해 음성임을 보여준다. 당해 사진은 DβH가 성인 랫트 뇌 줄기에서 세포를 양성으로 염색시킴을 지적한다. 세포핵은 웩스트(a, b, f; 청색)로 염색되었다. 막대 = 50㎛.5 shows the differentiation of DA neurons. 5A shows that about one third of differentiated cells are tyrosine hydroxylase (TH) positive in culture treated with FGF8, SHH and ascorbic acid (AA) at 3 weeks of differentiation. 5B shows that all TH + cells (red) in culture stain positively with neuronal marker β III -tubulin (green). 5C-E shows that all TH + cells in culture are positively stained with aromatic acid decarboxylase (AADC) (a and e, red) but some AADC + cells are TH − (e, arrowhead). 5F shows that TH + cells are negative for noradrenaline neuron marker dopamine β-hydroxylase (DβH) (green). The photo indicates that DβH stains cells positively in adult rat brain stem. Cell nuclei were stained with Hoechst (a, b, f; blue). Bar = 50 μm.
도 6은 사람 ES 세포 유래 DA 뉴런의 특성을 보여준다. 도 6A에서는 분화된 DA 뉴런이 RT-PCR에 의해 밝혀진 중뇌 페이트(fate)를 특정짓는 유전자를 발현함을 보여준다. EB: 배상체; NE: 신경외배엽 세포; 3w: 3주동안 분화된 DA 배양물; NC:음성 대조군. 도 6B에서는 배양물중의 대다수의 TH+ 세포(적색)가 중뇌 마커 En-1(녹색)을 발현함을 보여준다. 도 6C에서는 GABA 발현 세포(적색)가 배양물중에 존재하지만 매우 극소수의 TH+ 세포(녹색)가 GABA(적색, 사진)를 동시발현함을 보여준다. 도 6D에서는 TH+ 세포(적색)가 칼빈딘(녹색)에 대해 음성임을 보여준다. 막대 = 50㎛.6 shows the properties of human ES cell derived DA neurons. 6A shows that differentiated DA neurons express genes that characterize midbrain fat found by RT-PCR. EB: embryoid body; NE: neuroectodermal cells; 3w: DA culture differentiated for 3 weeks; NC: negative control. 6B shows that the majority of TH + cells (red) in culture express the midbrain marker En-1 (green). 6C shows that GABA expressing cells (red) are present in the culture but very few TH + cells (green) co-express GABA (red, photo). 6D shows that TH + cells (red) are negative for calvindine (green). Bar = 50 μm.
도 7은 사람 ES 세포 유래 DA 뉴런에서 수용체 및 수송체의 발현을 보여준다. 도 7A-C에서는 모든 TH+ 세포(a, 녹색)가 c-Ret(적색)을 발현함을 보여준다. 도 7D-F에서는 TH+ 세포(d, 녹색)가 VMAT2(e 및 f; 적색)를 동시 발현함을 보여준 다. 도 7G-I에서는 TH+ 뉴런(j, 녹색)이 신나프토피신(k 및 l, 적색)을 동시 발현함을 보여준다. 막대 = 25㎛.7 shows expression of receptors and transporters in DA neurons derived from human ES cells. 7A-C show that all TH + cells (a, green) express c-Ret (red). 7D-F show that TH + cells (d, green) co-express VMAT2 (e and f; red). 7G-I shows that TH + neurons (j, green) co-express cinnaphtopycin (k and l, red). Bar = 25 μm.
도 8은 시험관내 생성된 DA 뉴런의 기능 특성을 보여준다. 도 8A에서는 자발적 및 탈분극(HBSS중의 56mM KCl)-유도된 DA가 분화 3주째에 대조군 및 처리된 배양물에서 방출됨을 보여준다. 데이타는 3개 실험으로부터 평균 ± SD로서 나타낸다. 쌍을 이루지 않는 스튜던트 t 시험에 의한 *p < 0.05 vs. 대조군. 도 8B에서는 30일동안 분화된 2개의 뉴런에서 탈분극 전류 단계에 의해 유발되는 활동전위를 보여준다. 수동막 성질: (i) V휴지기-49mM, Cm 15.5 pF, Rm 5.0 GΩ; (ii) V휴지기-72mV, Cm 45 pF, Rm 885 GΩ. 도 8C에서는 36일동안 분화된 뉴런에서 자발적 시냅스후 전위를 보여준다. 도 8D에서는 배양물에서 30일동안 유지된 뉴런에서 자발적 시냅스후 전류를 보여준다. 뉴런은 K-글루코네이트 기본 피펫 용액을 사용하여 -40mV 전압에서 구부러진다. 외향 전류는 억제 반응을 반영하고 내향 전류는 당해 낮은 클로라이드 기록 용액에서 자극 반응을 반영한다. (ii) 패널(i)에서 설명되는 세포 기원의 평균 반응. 중량 쇠퇴 시간 상수는 억제(n=17개 반응) 및 자극(n=14개 반응) 전류에 대해 61.4ms 및 9.9ms이다. 도 8E-G에서는 면역염색에 의해, 기록된 뉴런(f, 녹색)이 TH+(e 및 g, 적색)임을 보여준다. 막대 = 50㎛.8 shows the functional properties of DA neurons produced in vitro. 8A shows that spontaneous and depolarization (56 mM KCl in HBSS) -induced DA is released in control and treated cultures at 3 weeks of differentiation. Data is shown as mean ± SD from three experiments. * P <0.05 vs. unpaired Student's t test. Control. 8B shows the action potential induced by the depolarized current step in two neurons differentiated over 30 days. Passive membrane properties: (i) V resting period -49 mM, Cm 15.5 pF, R m 5.0 GΩ; (ii) V resting period -72 mV, C m 45 pF, R m 885 GΩ. 8C shows spontaneous postsynaptic potential in neurons differentiated for 36 days. 8D shows spontaneous postsynaptic currents in neurons maintained for 30 days in culture. Neurons are bent at -40 mV voltage using a K-gluconate base pipette solution. Outward currents reflect an inhibitory response and inward currents reflect a stimulus response in this low chloride recording solution. (ii) average response of cell origin as described in panel (i). The weight decay time constants are 61.4 ms and 9.9 ms for suppression (n = 17 responses) and stimulus (n = 14 responses) currents. 8E-G shows that immunostaining indicates that the recorded neurons (f, green) are TH + (e and g, red). Bar = 50 μm.
도 9는 FGF2 디스플레이 부리 표현형에 의해 유도되는 신경외배엽 세포를 보여준다. 10일동안 FGF2에서 분화된 ES 세포는 콜로니 중심에서 작은 원주 형태를 보여주고 로제트를 형성하도록 구성된다. 로제트내 원주 세포 그러나 주변 편평 세포는 Pax6에 대해 양성이고 Sox1(A)에 대해서 음성이다. 14일까지 원주 세포는 신경관형 로제트(B)를 형성하고 Pax6(C) 및 Sox1(D)에 대해 양성이다. 로제트내 Pax6+ 세포(E)는 또한 Otx2+(F) 또는 En-1-(G)이다. 신경관형 로제트에서 세포는 Otx2에 대해 양성이고 HoxC8(H)에 대해서는 음성이다. 청색은 훽스트 염색된 핵을 나타낸다. 막대 = 50㎛.9 shows neuroectodermal cells induced by FGF2 display beak phenotype. ES cells differentiated from FGF2 for 10 days show small columnar morphology at the colony center and are configured to form rosettes. The columnar but peripheral squamous cells in the rosette are positive for Pax6 and negative for Sox1 (A). By day 14 columnar cells form neural tubular rosettes (B) and are positive for Pax6 (C) and Sox1 (D). Pax6 + cells (E) in rosettes are also Otx2 + (F) or En-1 − (G). In neural tubular rosette, cells are positive for Otx2 and negative for HoxC8 (H). Blue indicates Hoechst stained nuclei. Bar = 50 μm.
도 10은 신경외배엽 세포로부터 운동 뉴런의 생성을 보여준다. (A)는 2주동안(상부 열) Sox1+ 신경외배엽 세포의 분화가 과성장 영역에서 광범위하게 뉴런을 생성시키고 lsl 1를 발현시킴을 보여주지만 HB9+ 세포는 극소수이다. Pax6+/Sox1- 신경외배엽 세포(2nd 열)의 처리는 돌기가 광범위하게 과증식하게 하고 소수의 세포가 이동하고 lsl 1이 발현되고 HB9+ 세포의 비율이 높다. 조기 신경외배엽 세포로부터 분화되는 약 50%의 lsl 1/2+는 또한 HB9+(B)이다. HB9+는 또한 βIII-튜불린(C)에 대해 양성이다. 클러스터중의 세포 약 21%는 배양물이 레티노산(RA) 및 SHH 둘다의 존재하에 분화되는 경우 HB9+인 반면, RA 단독 또는 SHH 단독에서 배양되는 경우 HB9+가 거의 관찰되지 않고 (D)에서도 관찰되지 않는다. 청색은 훽스트 염색된 핵을 나타낸다. 막대 = 50㎛.10 shows the generation of motor neurons from neuroectodermal cells. (A) shows that for two weeks (upper row) Sox1 + neuroectodermal differentiation produces a wide range of neurons and expresses
도 11은 신경외배엽 세포에 대한 RA, FGF2 및 SHH의 효과를 보여준다. (A)에서는 RT-PCR 분석에 의해 지적되는 신경 유도 매질내에서 1주일동안 RA 또는 FGF2 20ng/ml과 함께 배양된 조기 로제트 세포 기원의 문미측 유전자의 변화를 보여준다. (B)에서는 1주일동안 RA 0.1μM로 처리된 조기 및 후기 신경외배엽 세포에서 호메오박스 유전자 발현을 비교한 것이다. RA로 처리되고 이어서 12일동안 분화된 조기 신경외배엽 세포는 대부분 Otx2(C)에 대해 음성이지만 HoxC8(D)에 대해서는 양성이다. 모든 HoxC8+ 세포는 βIII- 튜블린+(E)이다. Pax6-발현 신경외배엽 세포는 Olig2(F)에 대해 음성이다. 1주동안 RA로 처리하고 SHH(100ng/ml)의 존재하에 2주동안 분화시킨 후, 많은 세포는 Olig2(G)를 발현한다. 후기 신경외배엽 세포가 RA로 처리되고 이어서 동일한 배양 조건(H)하에 분화되는 경우 Olig2+ 세포가 거의 관찰되지 않는다. 청색은 훽스트 염색된 핵을 나타낸다. 막대 = 50㎛.11 shows the effect of RA, FGF2 and SHH on neuroectodermal cells. (A) shows changes in the lateral genes of early rosette cell origin incubated with 20ng / ml of RA or FGF2 for one week in neuronal induction media indicated by RT-PCR analysis. (B) compares homeobox gene expression in early and late neuroectodermal cells treated with RA 0.1 μM for one week. Early neuroectodermal cells treated with RA and then differentiated for 12 days are mostly negative for Otx2 (C) but positive for HoxC8 (D). All HoxC8 + cells are β III -tubulin + (E). Pax6-expressing neuroectodermal cells are negative for Olig2 (F). After treatment with RA for 1 week and differentiation for 2 weeks in the presence of SHH (100 ng / ml), many cells express Olig2 (G). Very few Olig2 + cells are observed when late neuroectodermal cells are treated with RA and then differentiated under the same culture conditions (H). Blue indicates Hoechst stained nuclei. Bar = 50 μm.
도 12는 배양물내 운동 뉴런의 성숙과정을 보여준다. ChAT 발현 세포는 주로 클러스터(A)에 위치하고 대형 다극성 세포(B)이다. 공초점 이미지는 3주 배양 후 체세포 및 프로세스내 ChAT 및 핵내 HB9가 동시 위치함을 보여준다. 클러스터내 대부분의 세포는 VChAT(D)를 발현하였다. 많은 ChAT+ 세포는 배양 5주 후(E)에 체세포 및 프로세스에서 시냅신에 대해 양성이다. (F)에서는 42DIV로 유지되는 뉴런에서 탈분극 전류 단계(0.15nA)에 의해 유발되는 AP를 보여준다. 휴지기 막 전위(Vm) -50mV(fi) 및 -70mV(fii). (G)에서는 42DIV, Vm -50mV를 위해 유지되는 뉴 런에서 자발적 AP를 보여준다. (H)에서는 대조군 조건(Hi)하에서 K-글루코네이트-기본 피펫 용액을 사용한 -40mV에서 자발적 내향 및 외향 시냅스 전류를 보여준다. 비쿠쿨린(20μM) 및 스트리크닌(5μM)의 욕조 적용이 외향 전류(IPSC, Hii)를 차단한다. 이어서 AP-5(40 μM) 및 CNQX(20μM)의 후속 적용은 잔류 내향 전류(EPSC, Hiii)를 차단한다. (i)에서는 패널 H에서 설명되는 세포 기원의 평균 sIPSC 및 sEPSC를 보여준다. (J)에서는 비오시틴(기록 전극 유래) 및 ChAT에 대한 이중 면역염색을 보여준다. 청색은 훽스트 염색된 핵을 나타낸다. 막대 = 50-㎛.12 shows the maturation of motor neurons in culture. ChAT expressing cells are predominantly located in clusters (A) and are large multipolar cells (B). Confocal images show co-location of ChAT and intranuclear HB9 in somatic and process cells after 3 weeks of culture. Most of the cells in the cluster expressed VChAT (D). Many ChAT + cells are positive for synapsin in somatic cells and processes 5 weeks after culture (E). (F) shows the AP caused by the depolarized current step (0.15nA) in neurons maintained at 42DIV. Resting membrane potential (Vm) -50 mV (fi) and -70 mV (fii). (G) shows spontaneous AP in neurons maintained for 42DIV, Vm -50mV. (H) shows spontaneous inward and outward synaptic currents at −40 mV with K-gluconate-based pipette solution under control conditions (Hi). Bath application of bicuculin (20 μM) and striknin (5 μM) block outward currents (IPSC, Hii). Subsequent application of AP-5 (40 μΜ) and CNQX (20 μΜ) then blocks residual inward currents (EPSC, Hiii). (i) shows the mean sIPSC and sEPSC of cell origin described in Panel H. (J) shows dual immunostaining for biocitin (derived from recording electrode) and ChAT. Blue indicates Hoechst stained nuclei. Bar = 50-μιη.
도 13은 시험관내 생성된 운동뉴런의 전기생리학적 특징을 보여준다. (A)엑서는 42DIV를 위해 유지되는 뉴런에서 탈분극 전류 단계(0.15nA)에 의해 유발되는 AP를 보여준다. 휴지기 막 전위(Vm)은 -59mV(ai) 및 -70mV(aii)이다. (B)에서는 42DIV, Vm-50mV에 대해 유지되는 뉴런에서 자발적 AP를 보여준다. (C)에서는 대조군 조건(ci)하에 K-글루코네이트 기본 피펫 용액을 사용한 -40mV에서의 자발적 내향 및 외향 시냅스 전류를 보여준다. 비쿠쿨린(20μM) 및 스트리크닌(5μM)의 욕조 적용은 외향 전류(IPSC, cii)를 차단한다. AP-5(40μM) 및 CNQX(20μM)의 후속 적용은 잔류 내향 전류(EPSC, ciii)를 차단한다. (D)에서는 패널 c에서 설명되는 세포 기원의 평균 sIPSC 및 sEPSC를 보여준다. (E-F)에서는 기록 후, 덮개 배양물을 ChAT로 면역염색시켜 비오시틴 충전된 뉴런이 ChAT에 대해 양성임을 보여준다. 막대 =50㎛.13 shows the electrophysiological characteristics of motor neurons generated in vitro. (A) Exer shows AP induced by depolarized current step (0.15nA) in neurons maintained for 42DIV. The resting membrane potential (Vm) is -59 mV (ai) and -70 mV (aii). (B) shows spontaneous AP in neurons maintained for 42DIV, Vm-50mV. (C) shows spontaneous inward and outward synaptic currents at −40 mV using K-gluconate base pipette solution under control conditions (ci). Bath application of bicuculin (20 μM) and striknin (5 μM) blocks outward currents (IPSC, cii). Subsequent application of AP-5 (40 μM) and CNQX (20 μM) blocks the residual inward current (EPSC, ciii). (D) shows the mean sIPSC and sEPSC of cell origin described in panel c. In (E-F), after recording, the cover cultures were immunostained with ChAT to show that the biocithin filled neurons are positive for ChAT. Bar = 50 μm.
여기에서, 본 발명자는 사람 배아 줄기 세포로부터 도파민(전뇌 및 중뇌)의 생성 방법을 기재한다. 바람직한 방법은 일반적으로 하기 표 1 내지 3에 기재되어 있다.Here, we describe a method of producing dopamine (pro brain and midbrain) from human embryonic stem cells. Preferred methods are generally described in Tables 1 to 3 below.
특히, 본 발명자는 배상체 중간체를 통해 ES 세포로부터 조기 로제트(Pax6+/Sox1-)를 분화시키는 방법을 기재한다. 차등 처리에 의해, 본 발명자는 이들 조기 로제트를 3개의 상이한 형태의 신경관형 로제트로 분화시킬 수 있었고 이어서 당해 로제트는 전뇌 도파민 뉴런, 중뇌 도파민 뉴런 또는 운동 뉴런으로의 발육을 위해 적합하다.In particular, we describe a method of differentiating premature rosettes (Pax6 + / Sox1 − ) from ES cells via embryonic intermediates. By differential treatment, we were able to differentiate these early rosettes into three different forms of neural tubular rosettes which were then suitable for development into whole brain dopamine neurons, midbrain dopamine neurons or motor neurons.
본 발명자는 도파민 및 운동 뉴런을 생성하기 위한 1단계 및 2단계를 기재하는 하기의 표 2를 참조한다. 표 2는 또한 출원인이 적합한 발육 마커인 것으로 여기는 다양한 중간체 생성물을 기재하고 있다.We refer to Table 2 below, which describes
상기된 바와 같이, 본 발명은 2개의 주요 양태를 포함한다. 한 양태는 동조 신경 줄기 세포군(또는 신경상피세포)을 신경관형 로제트 형태로 생성하고 신경상피세포 마커 Pax6, Sox1, 네스틴, 무사쉬-1을 발현시키는 과정이다. 본원에 사용된 바와 같이, 동조는 이종성 분화를 유도하는 RA에 의해 유도되는 것(즉, 배양물은 선구체에서 분화된 뉴런까지의 발육 단계에 있는 세포를 포함한다)과 반대로 동일한 발육 단계에 있는 세포군을 의미한다. 이 경우에 본 발명자는 조기 단계에서 Pax6+/Sox1- 조기 신경상피세포를 또는 후기 단계에서 Pax6+/Sox1+ 신경상피세포를 관찰한다. 어느 단계에서든, 본 발명자는 임의의 분화된 뉴런을 관찰하지 못했다. 당해 동조 발육은 본원에 기재된 바와 같이 특정 신경 페이트를 향한 직접적인 분화를 허용한다.As noted above, the present invention encompasses two main aspects. One aspect is the process of generating a synaptic neural stem cell population (or neuroepithelial cells) in neural tubular rosette form and expressing neuroepithelial markers Pax6, Sox1, Nestin, Musash-1. As used herein, tuning is in the same developmental stage as opposed to being induced by RA inducing heterologous differentiation (ie, the culture comprises cells in the developmental stage from precursor to differentiated neurons). Means a cell population. In this case we observe Pax6 + / Sox1 - early neuroepithelial cells at an early stage or Pax6 + / Sox1 + neuroepithelial cells at a later stage. At any stage, we did not observe any differentiated neurons. This tuning development allows direct differentiation towards specific neurons as described herein.
제2 양태는 신경상피 세포를 특정 뉴런, 예를 들어, 중뇌 도파민 뉴런, 전뇌 도파민 뉴런 및 척수 운동 뉴런으로 추가로 분화시키는 방법이다.A second aspect is a method of further differentiating neuroepithelial cells into specific neurons, such as midbrain dopamine neurons, forebrain dopamine neurons, and spinal cord motor neurons.
하기의 표 3은 본 발명의 세포를 수득하기 위한 바람직한 방법을 기재하고 있다. 표 3은 유사한 배양액 및 중요한 성장 인자 및 타이밍 성분에 의해 대체될 수 있는 일반 배양 브로쓰 성분들을 포함한다. 본 발명자가 신경 세포 배양 배지를 언급하는 경우, 많은 배양 성분들이 적합할 수 있다. 하기 부분은 올바른 분화를 위해 필요한 배양 성분들을 강조한다.Table 3 below describes a preferred method for obtaining the cells of the invention. Table 3 contains general culture broth components that can be replaced by similar cultures and important growth factors and timing components. When we refer to nerve cell culture media, many culture components may be suitable. The following section highlights the culture components necessary for proper differentiation.
일반적으로, 적합한 배지는 신경 세포를 성장시키기 위해 사용되는 임의의 배지이다. 문헌[참조: Bain, G., et al., supra, 1995; Okabe, S., et al., supra, 1996; Mujtaba, T., et al., supra, 1999; Bustle, O., et al., supra, 1999; Zhang, S. -C. , et al., J. Neurosci. Res. 59: 421-429,2000 ; Zhang, S. -C. , et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4089-4094,1999 ; Svendsen, C. N. , et al., Exp. Neurol. 137: 376- 388,1996 ; Carpenter, M. K., et al., Exp. Neurol. 158: 265-278, 1999; Vescovi, A. L. , et al., Exp. Neurol. 156: 71-83,1999]은 동일하거나 유사한 매질을 사용한다.In general, a suitable medium is any medium used to grow nerve cells. See Bain, G., et al., Supra, 1995; Okabe, S., et al., Supra, 1996; Mujtaba, T., et al., Supra, 1999; Bustle, O., et al., Supra, 1999; Zhang, S.-C. , et al., J. Neurosci. Res. 59: 421-429,2000; Zhang, S.-C. , et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4089-4094,1999; Svendsen, C. N., et al., Exp. Neurol. 137: 376-388,1996; Carpenter, M. K., et al., Exp. Neurol. 158: 265-278, 1999; Vescovi, A. L., et al., Exp. Neurol. 156: 71-83,1999, use the same or similar media.
1. 사람 ES 세포로부터 신경상피 세포(신경 줄기 세포)의 분화1. Differentiation of neuroepithelial cells (nerve stem cells) from human ES cells
신경상피 세포의 생성은 4-6일동안 현탁 배양물에서 배상체의 형성에 이어서 각각의 콜로니 중앙에서 세포가 원주가 되고 로제트 형태로 구성되는 경우, 성장 인자, 바람직하게 FGF2 또는 FGF8의 존재하에 4 또는 5일동안의 접착 배양을 포함한다(도 1A, 도 4B, 도 9A, B)[문헌참조: Zhang, et al., Nature Biotechnol., 2001]. FGF4 및 FGF9은 또한 적합한 성장 인자이다.The production of neuroepithelial cells is followed by the formation of embryoid bodies in suspension culture for 4-6 days, followed by the presence of growth factors, preferably FGF2 or FGF8, when cells are columnar and composed in rosette form in the center of each colony. Or adhesion culture for 5 days (FIGS. 1A, 4B, 9A, B) (Zhang, et al., Nature Biotechnol., 2001). FGF4 and FGF9 are also suitable growth factors.
이들 로제트에서 원주 세포는 신경 전사인자 Pax6을 발현하지만 또 다른 신경 전사인자 Sox1을 발현하지 않는다(도 9C, D). 본 발명자는 이들 로제트를, 이들이 조기에 나타나고 루멘 없이 단층의 원주 세포에 의해 형성되기때문에 "조기 로제트"라고 부른다. 단일 콜로니 마다 조기 로제트를 소유한다. 총 조기 로제트 세포군은 총 세포의 70% 이상이다.In these rosettes, the columnar cells express the neural transcription factor Pax6 but do not express another neural transcription factor Sox1 (FIG. 9C, D). We call these rosettes "early rosettes" because they appear early and are formed by monolayer columnar cells without lumen. Every single colony owns an early rosette. The total premature rosette cell population is at least 70% of the total cells.
이들 조기 로제트의 4 내지 6일동안의 추가의 배양은 신경관형 로제트 형성을 유도한다(도 1B, 도 4B, 도9E). 신경관형 로제트는 명백한 루멘과 함께 다층의 원주 세포에 의해 형성된다. 로제트내 세포는 Pax6 뿐만 아니라 Sox1을 발현한다(도 4C, 도 9F, G, H). 조기 로제트로부터 신경관형 로제트로의 진행은 10 내지 20ng/ml의 FGF2, FGF4, FGF8, FGF9의 존재하에 또는 0.001 내지 1μM의 존재하에 약 4 내지 6일 걸린다.Further culture of these early rosettes for 4-6 days leads to neural tubular rosette formation (FIGS. 1B, 4B, 9E). Neural tubular rosettes are formed by multiple columnar cells with apparent lumens. Cells in rosette express Pax6 as well as Sox1 (Figures 4C, 9F, G, H). Progression from an early rosette to neural tubular rosette takes about 4-6 days in the presence of 10-20 ng / ml of FGF2, FGF4, FGF8, FGF9 or in the presence of 0.001-1 μM.
ES 세포에서 신경관형 로제트 형성으로의 신경상피 분화 과정은 14 내지 16일 걸린다. 사람 ES 세포는 5.5일된 사람 배아로부터 유래된다(문헌참조: Thomson, J.A., et al., supra. 1998). 따라서, 본 발명의 배양 시스템에서 사람 ES 세포 기원의 신경상피 세포의 발육은 사람 배아에서 19 내지 21일동안 발육된 것에 상응한다. 정상 사람 발육에서, 신경관은 20 내지 21일에서 형성된다. 따라서, 사람 ES 세포로부터 신경상피의 분화는 정상 사람 배아 발육을 반영한다[문헌참조: Zhang, S. C., J. Hematother. Stem Cell Res. 12: 625-634, 2003]The process of neural epithelial differentiation from neural tubular rosette formation in ES cells takes 14-16 days. Human ES cells are derived from 5.5 day old human embryos (Thomson, J.A., et al., Supra. 1998). Thus, the development of neuroepithelial cells of human ES cell origin in the culture system of the present invention corresponds to those developed in human embryos for 19 to 21 days. In normal human development, neural tubes form at 20-21 days. Thus, the differentiation of neuroepithelial cells from human ES cells reflects normal human embryonic development. Zhang, S. C., J. Hematother. Stem Cell Res. 12: 625-634, 2003]
형태적 형질전환 및 명백한 유전자 발현 패턴에 의해 입증되는 바와 같이 2단계 신경상피 발육은 이전에 기술된 적이 없다. Pax6 및 Sox1은 신경관이 개구리, 관상어, 닭 및 마우스에서 동시에 형성하는 경우 신경상피 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Pevny, et al., Development 125: 1967-1978,1998]. 따라서, 본 발명자는 사람 ES 세포에서 신경상피 분화에 따라 연속 Pax6 및 Sox1 발현의 발견이 신규한 것이고 사람에게 유일한 것일 수 있다고 믿고 있다. Pax6+/Sox1- 신경상피 세포는 지금까지 동정된 것중에서 가장 조기의 신경상피 세포이다. 이들 세포의 기능적 중요성은 신경관형 로제트에서 Pax6+/Sox1+ 신경상피 세포가 아니라 조기 로제트에서 Pax6+/Sox1- 신경상피 세포가 중뇌 도파민 뉴런 및 척수 운동 뉴런과 같은 전뇌 이외의 위치적 실체를 갖는 뉴런이 되도록 효율적으로 유도될 수 있다는 점에서 본 발명에 적절하다(상기 표 1 참조).Two-stage neuroepithelial development has not been described previously, as evidenced by morphological transformation and overt gene expression patterns. Pax6 and Sox1 have been found to be expressed by neuroepithelial cells when neural tubes form simultaneously in frogs, ornamental fish, chickens and mice (Pevny, et al., Development 125: 1967-1978,1998). Thus, the inventors believe that the discovery of continuous Pax6 and Sox1 expression upon neuroepithelial differentiation in human ES cells is novel and may be unique to humans. Pax6 + / Sox1- neuroepithelial cells are the earliest neuroepithelial cells identified so far. The functional significance of these cells is to ensure that Pax6 + / Sox1 neuroepithelial cells, not Pax6 + / Sox1 + neuroepithelial cells in neural tubular rosettes, are neurons with positional entities other than forebrain such as midbrain dopamine neurons and spinal cord motor neurons in early rosettes. It is suitable for the present invention in that it can be derived (see Table 1 above).
분화하는 ES 세포 콜로니 마다, 신경관형 로제트를 형성한다. 신경상피 세포는 총 분화 세포중 적어도 70 내지 90%를 차지한다.Every ES cell colony that differentiates forms a neural tubular rosette. Neuroepithelial cells comprise at least 70-90% of total differentiated cells.
신경관형 로제트 형태의 신경상피 세포는 저농도의 디스파제 및 차등 접착에 의한 처리를 통해 정제될 수 있다[미국 특허원 제09/960,382호에 기재됨].Neural epithelial cells in neural tubular rosette form can be purified through treatment with low concentrations of dispase and differential adhesion (described in US Patent Application Serial No. 09 / 960,382).
2. 중뇌 도파민 뉴런의 생성2. Generation of Midbrain Dopamine Neurons
잠재적인 치료학적 응용성을 갖는 기능성 뉴런은 뉴런이 되는 것 뿐만 아니라 2개 이상의 추가의 특징을 가져야만 한다: 특이적 위치적 실체 및 신경 전달물질을 합성하고 분비하고 흡수하는 능력.Functional neurons with potential therapeutic applications must not only become neurons but also have two or more additional features: the ability to synthesize, secrete, and absorb specific positional entities and neurotransmitters.
중뇌 도파민 뉴런을 생성하는 제1 단계는 중뇌 실체의 유도이다. Pax6+/Sox1+ 신경관형 로제트 세포가 아닌 Pax6+/Sox1- 조기 로제트 세포를 FGF8(50 내지 200ng/ml)로 6 또는 7일동안 처리하여 길쭉해진 중뇌 전사 인자 1(En-1) 및 Pax2(도 4E, F)를 발현하고 전뇌 마커 Bf-1(도 4D)을 하향 조절하는 세포를 효율적으로 분화시킨다.The first step in producing midbrain dopamine neurons is the induction of midbrain entities. Pax6 + / Sox1 + non-neural tubular rosette cells Pax6 + / Sox1 - midbrain made early rosette cells FGF8 (50 to 200ng / ml) to the elongated treated for 6 or 7 days a transcription factor 1 (En-1) and Pax2 ( 4E, F) and efficiently differentiate cells that downregulate forebrain marker Bf-1 (FIG. 4D).
제2 단계는 소닉 헤지호그(SHH, 50 내지 250ng/ml)의 존재하에 6 내지 7일동안에 이어서 일반 신경 분화 배지에서(표 3에 기재된 바와 같음) 추가로 2주동안 도파민 뉴런이 발육될때까지 중뇌 선구체를 배양하는 것이다. 바람직하게, 총 분화된 세포의 35% 이상이 도파민 뉴런이 될 것이다.The second stage is the midbrain for 6-7 days in the presence of sonic hedgehog (SHH, 50-250 ng / ml), followed by the development of dopamine neurons for 2 weeks in normal neural differentiation medium (as shown in Table 3). It is to incubate the precursors. Preferably, at least 35% of the total differentiated cells will be dopamine neurons.
바람직한 분화 배지는 표 3에 기재되어 있다.Preferred differentiation media are listed in Table 3.
도파민 뉴런은 TH, AADC를 발현하지만 DbH 및 PNMT를 발현하지 않아(도 5) 도파민은 합성할 수 있지만 노레피네프린 또는 네프린으로의 추가 대사는 발생하지 않는다.Dopamine neurons express TH, AADC but not DbH and PNMT (FIG. 5) so that dopamine can be synthesized but no further metabolism to norepinephrine or nephrin occurs.
도파민 뉴런은 En-1, ptx3, Nurr1 및 Lmx1b(도 6A, B), 중뇌 도파민 뉴런 발육을 위해 요구되는 전사 인자를 발현한다.Dopamine neurons express En-1, ptx3, Nurr1 and Lmx1b (FIGS. 6A, B), transcription factors required for midbrain dopamine neuron development.
도파민 뉴런은 GABA(도 6C)를 발현하지 않는다. GABA와의 동시 발현은 후각망울에서 도파민 뉴런의 특징이다.Dopamine neurons do not express GABA (FIG. 6C). Co-expression with GABA is characteristic of dopamine neurons in olfactory bulbs.
도파민 뉴런은 칼빈딘(도 6D)을 발현하지 않는다. 칼빈딘과의 동시 발현은 중뇌의 외피 영역에서의 도파민 뉴런의 특징이다.Dopamine neurons do not express calvindine (FIG. 6D). Coexpression with calvindine is characteristic of dopamine neurons in the cortical region of the midbrain.
이와 함께, 상기 특징은 본 발명의 배양 시스템에서 생성된 도파민 뉴런이 흑색질에서의 뉴런과 보다 유사한 중뇌 도파민 뉴런이고 이는 파킨슨 질환에서 상실된 도파민 뉴런이다.Together, the feature is that the dopamine neurons produced in the culture system of the present invention are midbrain dopamine neurons more similar to neurons in medulla, which are dopamine neurons lost in Parkinson's disease.
도파민 뉴런은 c-ret, GDNF에 대한 수용체(도 7A, B, C), 도파민 뉴런의 생존 및 기능을 위해 요구되는 성장 인자를 갖는다.Dopamine neurons have growth factors required for the survival and function of c-ret, receptors for GDNF (FIGS. 7A, B, C), dopamine neurons.
도파민 뉴런은 또한 저장 및 분비 도파민을 위해 요구되는 수송체인 VMAT2(도 7D, E,F)를 발현한다. 이들은 또한 방출 후 도파민 흡수에 필요한 수송체인 DAT(도 7G, H, I)를 발현한다. 따라서, 본 발명의 배양 시스템에서 생성된 도파민 뉴런은 전달물질 도파민의 합성, 저장, 방출 및 흡수를 위해 필요한 기구를 갖는다.Dopamine neurons also express VMAT2 (FIGS. 7D, E, F), the transporters required for storage and secretion dopamine. They also express DAT (Fig. 7G, H, I), the transporter required for dopamine absorption after release. Thus, the dopamine neurons produced in the culture system of the present invention have the necessary apparatus for the synthesis, storage, release and uptake of the transporter dopamine.
도파민 뉴런은 시냅스 형성을 위해 시냅토피신(도 7)을 발현한다. 이들은 활동 전위를 개시할 수 있고 자극에 응답하여 도파민을 분비할 수 있다(도 8). 따라서, 도파민 뉴런은 기능적이다.Dopamine neurons express synaptopycin (FIG. 7) for synapse formation. They can initiate action potentials and secrete dopamine in response to stimulation (FIG. 8). Thus, dopamine neurons are functional.
3. 척수 운동 뉴런의 생성3. Generation of Spinal Motor Neurons
척수 운동 뉴런을 생성시키는 제1 단계는 척주(미골) 실체의 유도이다. Pax6+/Sox+ 신경관형 로제트 세포(도 10A)가 아니라 Pax6+/Sox1- 조기 로제트 세포를 RA(0.001 내지 1μM)로 6 내지 7일동안 처리하여 HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8과 같은 척주 전사 인자 Hox 유전자를 발현하지만 전뇌 마커 Otx2 및 Bf-1 또는 중뇌 마커 En-1(도 11A, C, D, E)을 발현하지 않는 선구체로 세포를 효율적으로 분화시킨다.The first step in generating spinal motor neurons is the induction of spinal column (coccal) entities. Spinal transcription factor Hox genes such as HoxB1, HoxB6, HoxC5, and HoxC8 were treated by treating Pax6 + / Sox1- early rosette cells with RA (0.001 to 1 μM) for 6-7 days rather than Pax6 + / Sox + neural tubular rosette cells (FIG. 10A). Cells are efficiently differentiated into precursors that express but do not express the forebrain markers Otx2 and Bf-1 or the midbrain markers En-1 (FIGS. 11A, C, D, E).
제2 단계는 단지 내부 신경 선구체에 의해 발현되는 전사인자인 Olig2의 발현(도 11F, G, H)에 이어서 추가로 7 내지 10일동안 일반 신경 분화 배지에서 척수 운동 뉴런이 발육될때까지 발현시킴에 의해 입증되는 바와 같이 내부화된 선구체의 특징을 유도하기 위해 6 내지 7일동안 소닉 헤지호그(SHH, 50 내지 250ng/ml)의 존재하에 척주 선구체를 배양하는 것이다.The second stage only expresses expression of Olig2, a transcription factor expressed by the internal neural precursors (FIG. 11F, G, H), followed by further development of spinal motor neurons in normal neuronal differentiation medium for 7-10 days. As demonstrated by incubating the spinal precursor in the presence of sonic hedgehog (SHH, 50-250 ng / ml) for 6-7 days to induce the characteristics of the internalized precursor.
바람직한 분화 배지는 표 3에 기재되어 있다.Preferred differentiation media are listed in Table 3.
바람직한 양태에서, 총 분화된 세포의 22% 이상은 척수 운동 뉴런이 된다. 운동 뉴런은 척주 운동 뉴런에 의해 특이적으로 발현되는 전사인자인 HB9, islet1/2 및 Lim3(도 10)을 발현한다. 운동 뉴런은 또한 HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8을 발현하지만 전뇌 마커 Otx2 및 Bf-1 또는 중뇌 마커 En-1(도 11A, C, D, E)를 발현하지 않고 이것은 이들이 척수 운동 뉴런임을 지적한다.In a preferred embodiment, at least 22% of the total differentiated cells become spinal cord motor neurons. Motor neurons express the transcription factors HB9, islet1 / 2 and Lim3 (FIG. 10) specifically expressed by spinal motor neurons. Motor neurons also express HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8 but do not express the forebrain markers Otx2 and Bf-1 or the midbrain marker En-1 (Figures 11A, C, D, E), indicating that these are spinal motor neurons.
운동 뉴런은 운동 뉴런 전달물질 아세틸콜린을 합성하는데 필요한 효소인 ChAT(도 12A, B, C, D)를 발현한다. 운동 뉴런은 또한 VAChT(도 12E)를 발현하고 이것은 운동 뉴런이 전달물질 아세틸콜린을 저장하고 흡수할 수 있음을 제안한다.Motor neurons express ChAT (FIG. 12A, B, C, D), an enzyme required to synthesize motor neuron transporter acetylcholine. Motor neurons also express VAChT (FIG. 12E), suggesting that motor neurons can store and absorb the transporter acetylcholine.
추가로, 운동 뉴런은 시냅스 형성을 위한 시냅신(도 12F)을 발현한다. 이들은 활동 전위를 개시할 수 있다(도 13). 따라서, 운동 뉴런은 기능성이다. 본 발명자는 운동 뉴런이 HPLC에 의해 분석된 바와 같이 아세틸콜린을 방출함을 보여주는 데이타를 갖고 있다.In addition, motor neurons express synapsin (FIG. 12F) for synapse formation. They can initiate action potentials (FIG. 13). Thus, motor neurons are functional. We have data showing that motor neurons release acetylcholine as analyzed by HPLC.
4. 전뇌 뉴런의 생성4. Generation of Whole Brain Neurons
또 다른 양태에서, 본 발명은 영장류 ES 세포(바람직하게는 사람 ES 세포)를 전뇌 도파민 뉴런, 바람직하게는 신경계 복구를 위해 적합한 이식가능한 신경 전구체로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 중뇌 도파민 뉴런 생성을 위해 상기된 바와 같은 방법을 누구나 개시할 것이다. 전뇌 뉴런을 생성하기 위해, Pax6+/Sox1- 세포를 FGF2로 4 내지 6일동안 추가로 처리함에 이어서 SHH로 처리한다. 전뇌 도파민 뉴런을 생성하는 단계 및 도파민 뉴런 특성을 측정하기 위한 분석은 중뇌 도파민 뉴런에 대해 기재된 것들과 유사하다. 주요 차이는 특정 기간에서 모르포겐의 사용 및 도파민 뉴런의 특징이다.In another aspect, the invention relates to a method of differentiating primate ES cells (preferably human ES cells) into forebrain dopamine neurons, preferably implantable neural precursors suitable for nervous system repair. Preferably anyone will disclose a method as described above for midbrain dopamine neuron production. To generate whole brain neurons, Pax6 + / Sox1 − cells are further treated with FGF2 for 4-6 days followed by SHH. The steps for generating whole brain dopamine neurons and the assays for measuring dopamine neuron characteristics are similar to those described for midbrain dopamine neurons. The main difference is the use of morphogens and the characteristics of dopamine neurons in certain periods of time.
전뇌 도파민 뉴런을 생성하는 제1 단계는 중뇌 실체의 유도이다. Pax6+/Sox1- 조기 로제트 세포를 6 또는 7일동안 FGF2(10 내지 20ng/ml)로 처리하여 전뇌 전사인자 Bf-1 및 Otx2를 발현하는 선구체로 세포를 효율적으로 분화시킨다.The first step in producing whole brain dopamine neurons is the induction of midbrain entities. Pax6 + / Sox1-premature rosette cells are treated with FGF2 (10-20 ng / ml) for 6 or 7 days to efficiently differentiate the cells into precursors expressing the whole brain transcription factors Bf-1 and Otx2.
제2 단계는, 6 내지 7일동안 소닉 헤지호그(SHH, 50 내지 250ng/ml)의 존재하에 이어서 추가로 2주동안 일반 뉴런 분화 배지에서 도파민 뉴런이 발육될때까지 전뇌 선구체를 배양하는 것이다. 총 분화된 세포의 35%는 도파민 뉴런이 된다. 미국 특허원 제09/970,382호에서 발췌한 하기의 기재는 바람직한 방법을 기재하고 있다.The second step is to cultivate the whole brain precursors in the presence of sonic hedgehog (SHH, 50-250 ng / ml) for 6-7 days, followed by further development of dopamine neurons in normal neuronal differentiation medium for 2 weeks. 35% of total differentiated cells become dopamine neurons. The following description, taken from US Patent Application Serial No. 09 / 970,382, describes a preferred method.
영장류 ES 세포주, 바람직하게, ES 세포주를 먼저 수득하고 증식시킨다. 문헌[참조: Thomson, J.A., et al., Science 282:1145-1147(1998)] 및 미국 특허 제5,843,780호 및 제6,200,806호에 기재된 바와 같이 또는 핵형이 정상이고 11개월 이상 및 바람직하게는 12개월동안 연속 배양 후 미분화된 상태로 증식하는 능력을 갖는 ES 세포주를 수득하는데 적합한 다른 방법에 의해 ES 세포주를 수득할 수 있다. 배아 줄기 세포는 또한 배양 전반에 걸쳐 외피층을 형성하는 능력 및 모든 삼배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 유래되는 조직으로 분화하는 능력을 보유할 것이다.Primate ES cell lines, preferably ES cell lines, are obtained and propagated first. As described in Thomson, JA, et al., Science 282: 1145-1147 (1998) and US Pat. Nos. 5,843,780 and 6,200,806 or with karyotypes normal and at least 11 months and preferably 12 months ES cell lines can be obtained by other methods suitable for obtaining ES cell lines having the ability to proliferate in undifferentiated state after continuous culture. Embryonic stem cells will also retain the ability to form a cortical layer throughout culture and to differentiate into tissues derived from all trioderm layers (endoderm, mesoderm and ectoderm).
이어서 당해 세포를 배양한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 세포는 바람직하게 하기의 문헌[참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998 및 미국 특허제5,843, 780호 및 제6,200,806호]에 기재된 바와 같이 방사선 조사된 포유동물, 바람직하게 마우스, 배아 섬유아세포의 영양 공급 층상에서 증식시킨다. 본 발명자는 또한 당해 세포가 영양 공급 세포층없이 증식할 수 있음을 고려한다.The cells are then cultured. In a preferred embodiment of the invention, the cells are preferably irradiated mammals as described in Thomson, JA, et al., Supra, 1998 and US Pat. Nos. 5,843, 780 and 6,200,806. Animals, preferably mice, embryonic fibroblasts are grown on the feeding layer. We also contemplate that the cells can proliferate without the nutrient supply cell layer.
ES 세포 콜로니는 전형적으로 디스파제로 처리하여 접착 배양으로부터 온전하게 제거되고 바람직하게 하기된 바와 같이 4일동안 자유 유동 ES 세포 응집체(배상체로 호칭됨)로서 현탁액에서 성장한다.ES cell colonies are typically removed intact from the adhesion culture by treatment with dispase and preferably grown in suspension as free flowing ES cell aggregates (called embryoid bodies) for 4 days as described below.
이어서, EB는 바람직하게 20ng/ml의 FGF2를 함유하는 배지에서 배양하여 조기 로제트 세포를 생성시킨다. 배지의 기타 바람직한 성분은 표 3에 기재된 바와 같다. 그러나, 많은 기타 배지 성분들이 적합할 수 있다. 일반적으로, 적합한 배지는 신경 세포를 성장시키는데 사용되는 임의의 배지이다. 하기의 문헌[참조: Bain, G., et al., supra, 1995; Okabe, S., et al., supra, 1996; Mujtaba, T., et al., supra, 1999; Bustle, O., et al., supra, 1999; Zhang, S. -C. , et al., J. Neurosci. Res. 59: 421-429,2000 ; Zhang, S. -C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4089-4094, 1999; Svendsen, C. N., et al., Exp. Neurol. 137: 376- 388,1996 ; Carpenter, M. K., et al., Exp. Neurol. 158: 265-278, 1999; Vescovi, A. L., et al., Exp. Neurol. 156: 71-83,1999]은 동일하거나 유사한 배지를 사용하고 있다.The EB is then incubated in medium containing preferably 20 ng / ml FGF2 to produce early rosette cells. Other preferred components of the medium are as described in Table 3. However, many other media components may be suitable. In general, a suitable medium is any medium used to grow nerve cells. See Bain, G., et al., Supra, 1995; Okabe, S., et al., Supra, 1996; Mujtaba, T., et al., Supra, 1999; Bustle, O., et al., Supra, 1999; Zhang, S.-C. , et al., J. Neurosci. Res. 59: 421-429,2000; Zhang, S.-C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4089-4094, 1999; Svendsen, C. N., et al., Exp. Neurol. 137: 376-388,1996; Carpenter, M. K., et al., Exp. Neurol. 158: 265-278, 1999; Vescovi, A. L., et al., Exp. Neurol. 156: 71-83,1999] use the same or similar media.
배지에서 약 5일동안 배양 한 후, 분주된 EB는 편평 세포의 과증식을 유발하고 7일까지 중앙이 약간 길어진 세포는 도 1B에 도시된 바와 같이 로제트 형성을 유발한다. 이들 형성은 조기 신경관과 유사하다(도 1B의 사진). 형태 또는 하기에 기재된 바와 같이 네스틴 및 무사쉬 I와 같은 신경 마커 항원을 사용한 면역형광 분석에 의해 신경 전구체의 존재를 확인할 수 있다. 바람직하게, 신경 전구체는 총 세포의 72% 이상을 차지하고 가장 바람직하게는 84% 이상을 차지한다.After incubation in the medium for about 5 days, the aliquots of EB cause hyperproliferation of squamous cells and cells slightly longer in length by 7 days induce rosette formation as shown in FIG. 1B. These formations are similar to the early neural tube (photo in FIG. 1B). The presence of neural precursors can be confirmed by immunofluorescence analysis using neural marker antigens such as Nestin and Musash I as described below. Preferably, the neural precursors comprise at least 72% of the total cells and most preferably at least 84%.
추가로, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 바람직하게 차등 효소적 처리 및 접착에 의해 신경관형 로제트를 분리할 수 있다. 간략하게, 디스파제에 의한 처리는 중앙 신경상피 섬을 우선적으로 탈착시킨다. 로제트 세포의 클러스터를 주변 편평 세포로부터 분리하기 위해, 8일 내지 10일동안 배양된 분화하는 EB는 바람직하게 37℃에서 15 내지 20분동안 0.1 내지 0.2mg/ml의 디스파제(Gibco BRL, Lifetechnologies, Rockville, MD)로 항온처리한다. 또한, 0.2mg/ml의 디스파제를 사용할 수 있다. 로제트 클럼프는 후퇴하는 반면 주변 편평 세포는 접착된 상태로 남아있다. 이 점에서, 로제트 클럼프는 편평 세포가 부착되어 있는 플라스크를 흔들어서 제거될 수 있다. 클럼프는 펠렛화하고 약하게 5ml의 피펫으로 분쇄하고 30분동안 배양 플라스크로 분주하여 오염시키는 각각의 세포를 접착시킨다. 부유 로제트 클럼프를 이어서 바람직하게 폴리-(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)로 피복된 새로운 플라스크로 옮겨서 부착을 차단하고 FGF2(전형적으로 20ng/ml)의 존재와 함께 사람 신경 전구체를 위해 사용되는 배지에서 배양한다. 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 디스파제로 처리함에 이어서 차등 접착시켜 전형적으로 90% 이상 및 가장 바람직하게는 96% 이상으로 신경 전구체 세포군을 고도로 집적시킨다. 추가로, PSA-NCAM에 대한 항체를 사용하는 면역 분리와 같은 기타 방법을 사용하여 신경 전구체 세포를 분리할 수 있다.In addition, neural tubular rosettes can be isolated, preferably by differential enzymatic treatment and adhesion, as described in the Examples below. Briefly, treatment with dispase preferentially desorbs the central neuroepithelial islets. To separate clusters of rosette cells from surrounding squamous cells, differentiated EBs cultured for 8-10 days are preferably 0.1 to 0.2 mg / ml of dispase (Gibco BRL, Lifetechnologies, Incubated with Rockville, MD). Also, 0.2 mg / ml of dispase can be used. Rosette Klump retreats while surrounding squamous cells remain adhered. At this point, the rosette clump can be removed by shaking the flask to which the squamous cells are attached. The clumps are pelleted and ground in a weak 5 ml pipette and aliquoted into culture flasks for 30 minutes to adhere each contaminating cell. Floating rosette clumps are then transferred to a fresh flask, preferably coated with poly- (2-hydroxyethyl-methacrylate) to block adhesion and to be used for human neural precursors with the presence of FGF2 (typically 20 ng / ml). Incubate in the medium. As described in the Examples below, treatment with dispase followed by differential adhesion typically results in high integration of neural precursor cell populations, typically at least 90% and most preferably at least 96%. In addition, other methods, such as immune isolation using antibodies against PSA-NCAM, can be used to separate neural progenitor cells.
하기의 실시예는 사람 ES 세포 유래 신경 전구체가 모든 3개의 CNS 세포 유형을 시험관내에서 생성시킬 수 있음을 입증한다.The following examples demonstrate that human ES cell derived neural precursors can generate all three CNS cell types in vitro.
하기의 표는 본 발명의 당해 양태의 다양한 측면에 대한 흐름도이다.The following table is a flow chart for various aspects of this aspect of the invention.
또 다른 양태에서, 본 발명은 72% 이상 및 바람직하게는 84%의 신경 전구체 세포를 포함하는 세포군이다. 이들 신경 전구체 세포는 네스틴 및 무사쉬 I에 양성임으로 규명될 수 있다. 도 1B는 당해 세포를 특정지우는 로제트 형성을 도시한다. 로제트 형성이란 세포가 원주 형태이고 관형(로제트) 구조로 배열되어 체내 신경관(발육하는 뇌)과 유사함을 의미한다. 원주 세포 형태 및 관형 구조는 도 1B의 사진에 보여진다.In another embodiment, the invention is a cell population comprising at least 72% and preferably 84% neuronal precursor cells. These neural progenitor cells can be identified as being positive for Nestin and Musash I. 1B depicts rosette formation specifying the cells in question. Rosette formation means that the cells are columnar and arranged in a tubular (roset) structure to resemble a neural tube in the body (a developing brain). Columnar cell morphology and tubular structure are shown in the photograph of FIG. 1B.
또 다른 양태에서, 본 발명은 90% 이상 및 바람직하게 96% 이상의 신경 전구체 세포의 세포군이다. 바람직하게, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 차등 효소적 처리 및 접착 후 당해 세포를 수득한다.In another embodiment, the invention is a cell population of at least 90% and preferably at least 96% neural precursor cells. Preferably, the cells are obtained after differential enzymatic treatment and adhesion as described in the Examples below.
5. 본 발명의 세포군의 용도5. Use of Cell Population of the Invention
특이적 전달물질 표현형 및 독특한 위치적 실체를 갖는 특정 사람 신경 세포 유형의 생성은 신경 장애를 치료하기 위한 이식가능한 세포 공급원, 예를 들어, 파킨슨 질환에 대한 중뇌 도파민 뉴런, 정신 질환에 대한 전뇌 도파민 뉴런 및 척주 손상 및 ALS를 포함하는 운동 뉴런 질환에 대한 척수 운동 뉴런을 제공한다.The generation of specific human neuronal cell types with specific transporter phenotypes and unique positional entities is an implantable cell source for treating neurological disorders, for example, midbrain dopamine neurons for Parkinson's disease, whole brain dopamine neurons for mental disorders. And spinal cord motor neurons for motor neuron disease, including spinal cord injury and ALS.
사람 배아 줄기 세포를 먼저 신경 상피 세포에 이어서 특정 뉴런으로 직접 분화시키기 위한 단계적 및 화학적으로 규명된 배양 시스템의 확립은 또한 독성 및 치료학적 제제를 스크리닝하기 위한 전례없는 시스템을 제공한다. 현재, 독성학적 및 치료학적 약물 스크리닝은 동물, 동물 세포 배양 또는 유전학적으로 비정상적인 사람 세포주를 사용하여 수행한다. 사람 배아 줄기 세포 및 특정 뉴런 세포로의 이의 분화는 사람 신경 발육에 정상적인 과정을 나타낸다. 따라서, 본원의 발명은 정상적인 사람 신경 발육에 영향을 주는 제제 또는 잠재적으로 비정상적으로 뇌를 발육시키는 제제 뿐만 아니라 질환 증상에서 신경 유형의 복원을 자극할 수 있는 제제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 추가로, 기재된 시스템은 도파민 뉴런을 사멸시키는 병리학적 과정(예를 들어, 파킨슨 질환) 또는 운동 뉴런을 사멸시키는 병리학적 과정(예를 들어, ALS)과 모사하도록 용이하게 변형될 수 있어 당해 질환들을 치료하기 위해 디자인된 치료학적 제제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.The establishment of a staged and chemically defined culture system for directly differentiating human embryonic stem cells into neural epithelial cells and then to specific neurons also provides an unprecedented system for screening toxic and therapeutic agents. Currently, toxicological and therapeutic drug screening is performed using animal, animal cell cultures or genetically abnormal human cell lines. Its differentiation into human embryonic stem cells and certain neuronal cells represents a normal process for human neural development. Thus, the present invention can be used to screen for agents that affect normal human neurodevelopment or for agents that can stimulate the restoration of nerve types in disease symptoms as well as agents that potentially develop abnormal brains. In addition, the described systems can be readily modified to mimic pathological processes that kill dopamine neurons (eg, Parkinson's disease) or pathological processes that kill motor neurons (eg, ALS), thereby preventing those diseases. It can be used to screen therapeutic agents designed for treatment.
이러한 양태의 본 발명의 바람직한 방법에서, 본 발명의 세포군의 하나를 시험 화합물에 노출시키고 당해 노출 결과를 노출되지 않은 대조 세포군과 비교한다. 배양의 특성을 조사하고 이들을 본원에 포함되는 공지된 발육 특성과 비교하여 특정 시험 화합물이 세포군에 영향을 미치는지의 여부를 이해할 수 있다.In a preferred method of the invention in this aspect, one of the cell populations of the invention is exposed to the test compound and the results of the exposure are compared with the unexposed control cell population. The nature of the cultures can be investigated and compared to the known developmental properties included herein to understand whether a particular test compound affects the cell population.
실시예 1- 전뇌 도파민성 뉴런의 생성Example 1 Generation of Whole Brain Dopaminergic Neurons
결과result
사람 ES 세포는 분화하여 FGF2의 존재하에 신경관형 구조를 형성한다. 사람 ES 세포주, H1, H9, 및 H9로부터 유래하는 클론주 H9.2(문헌참조: Amit, M., et al., supra, 2000)은 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포의 영양 공급층상에서 증식시켰다[문헌참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998]. 분화를 개시하기 위해, ES 세포 콜로니를 탈착시키고 4일동안 배상체로서 현탁액에서 증식시켰다. 이어서 EB를, FGF2를 함유하는 화학적으로 규명된 배지[문헌참조: Zhang, S.-C., et al., J. Neurosci. Res. 59: 421-429,2000 ; Zhang, S. -C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4089-4094, 1999]에서 조직 배양 처리된 플라스크에서 배양하였다. FGF2는 제조원[Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ.]으로부터 구입하였다. FGF2에서 배양한지 5일 후, 분주된 EB는 과성장된 편평 세포를 생성시켰다. 동시에, 증가된 수의 작은 긴 세포가 분화하는 EB의 중앙에 나타났다(도 1A). 규명된 배지에서 7일까지 중심의 작은 긴 세포는 로제트를 형성하였고(도 1B) 이것은 톨루이딘 청색 염색된 부분에 의해 보여지는 바와 같이 조기 신경관과 유사하다(도 1B의 사진). 면역형광 분석은 신경 마커 항원 네스틴 및 무사쉬-1의 발현[문헌참조: Lendahl, U. , et al., Cell 60: 585-595, 1990; Kaneko, Y., et al., Dev. Neurosci. 22: 139-153, 2000]이 대부분 로제트내 세포로 국한되고 분화하는 EB 주 변의 편평 세포(도 1C-E)에서는 발현하지 않는다. 미분화된 ES 세포는 이들 마커에 대해 면역음성이다. 신경관형 구조의 형성은 FGF2의 존재하에 다수의 EB(H9 및 H9.2주로부터 총 350개 EB에서 94%, 3개의 별도 실험)에서 나타났다. FGF2 부재하에 잘 구성된로제트는 관찰되지 않았다. Human ES cells differentiate to form neural tubular structures in the presence of FGF2. Human ES cell lines, H1, H9, and clones H9.2 derived from H9 (Amit, M., et al., Supra, 2000) were propagated on the feeder layer of irradiated mouse embryo fibroblasts. (Thomson, JA, et al., Supra, 1998). To initiate differentiation, ES cell colonies were detached and grown in suspension as embryoid bodies for 4 days. EB was then chemically defined in a medium containing FGF2. Zhang, S.-C., et al., J. Neurosci. Res. 59: 421-429,2000; Zhang, S.-C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4089-4094, 1999] was cultured in tissue culture treated flasks. FGF2 was purchased from Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ. Five days after incubation in FGF2, the dispensed EB produced overgrown squamous cells. At the same time, an increased number of small long cells appeared in the center of the differentiated EBs (FIG. 1A). Small long cells centered up to 7 days in the identified media formed rosettes (FIG. 1B), which are similar to the early neural tube as shown by the toluidine blue stained portion (photo of FIG. 1B). Immunofluorescence assays showed expression of the neural marker antigens Nestin and Musash-1 (Lendahl, U., et al., Cell 60: 585-595, 1990; Kaneko, Y., et al., Dev. Neurosci. 22: 139-153, 2000] are mostly expressed in squamous cells around EB (Fig. 1C-E) that are localized and differentiated into cells in rosettes. Undifferentiated ES cells are immunonegative for these markers. The formation of neural tubular structures was seen in a large number of EBs (94% in total 350 EBs, 3 separate experiments from H9 and H9.2 weeks) in the presence of FGF2. No well-formed rosette was observed in the absence of FGF2.
신경관형 로제트는 차등 효소적 처리 및 접착에 의해 분리될 수 있다. FGF2에 계속 노출시키면서, 원주 로제트 세포는 증식하고 다수층을 형성하였다. 이들은 흔히, EB의 대부분을 구성하고 주변 편평 세포로부터 확실히 구별된다. 디스파제를 사용한 처리는 우선적으로 중심 신경상피 섬을 탈착시켜 주변 세포 대부분은 부착된 채로 남아있다(도 1F). 오염 단일 세포는 세포 배양 접시로 단기 접착에 의해 분리하였다. 세포 계수는 당해 분리 및 집적 과정이 분리된 신경상피 클러스와 연관된 세포가 분화된 EB 배양에서 세포의 72 내지 84%를 차지함을 보인 후 즉시 수행하였다. 면역세포화학적 분석은 분리된 로제트 세포의 96±0.6%가 4개의 별도의 실험에서 조사된 13,324개의 세포를 기준으로 네스틴에 대해 양성으로 염색된다. 대다수의 당해 세포는 또한 무사쉬-1 및 PSA-NCAM(도 1G, H, I)에 대해 양성이었다. Neural tubular rosettes can be separated by differential enzymatic treatment and adhesion. With continued exposure to FGF2, columnar rosette cells proliferated and formed multiple layers. They often make up the majority of the EB and are clearly distinguished from the surrounding squamous cells. Treatment with dispase preferentially detaches the central neuroepithelial islands, leaving most of the surrounding cells attached (FIG. 1F). Contaminated single cells were separated by short-term adhesion into cell culture dishes. Cell counting was performed immediately after this isolation and integration process showed that cells associated with isolated neuroepithelial clusters accounted for 72-84% of cells in differentiated EB cultures. Immunohistochemical analysis showed 96 ± 0.6% of isolated rosette cells stained positive for Nestin based on 13,324 cells examined in four separate experiments. The majority of these cells were also positive for Musash-1 and PSA-NCAM (FIG. 1G, H, I).
사람 ES 세포 유래된 신경 전구체는 모든 3개의 CNS 세포 유형을 시험관내에서 생성한다. 분리된 신경 전구체는 자유 유동 세포 응집체로서 사람 태아 뇌 조직 유래의 "신경구" 배양액과 유사한 현탁 배양액중에서 증식시켰다[문헌참조: Zhang, S.-C., et al., supra, 2000; Svendsen, C. N., et al., supra, 1996; Carpenter, M. K., et al., supra, 1999; Vescovi, A. L., et al., supra, 1999]. BrdU 혼입 연구는 전구체 세포 증식 자극이 FGF2에 의존하고 단독의 EGF 또는 UIF에 의해 유발될 수 없음을 밝혔다. 추가로, FGF2가 EGF 및/또는 LIF와 배합되는 경우(도 2A), 어떠한 부가적 또는 상승작용적 효과가 관찰되지 않았다. Human ES cell derived neural precursors produce all three CNS cell types in vitro. The isolated neural precursors were propagated in suspension cultures similar to "neural bulb" cultures derived from human fetal brain tissue as free-flowing cell aggregates. Zhang, S.-C., et al., Supra, 2000; Svendsen, CN, et al., Supra, 1996; Carpenter, MK, et al., Supra, 1999; Vescovi, AL, et al., Supra, 1999]. BrdU incorporation studies revealed that precursor cell proliferation stimulation was dependent on FGF2 and could not be induced by EGF or UIF alone. In addition, when FGF2 was combined with EGF and / or LIF (FIG. 2A), no additional or synergistic effects were observed.
ES 세포 유래된 신경 전구체의 시험관내 분화는 FGF2를 회수하고 오르니틴 및 라미닌 기질상에 분주하여 유도하였다. 몇일이내에, 개별 세포 및 다수의 성장 원뿔이 구형으로부터 돌출 성장하여 별 폭발 외형을 나타낸다. 분주한지 7일 내지 10일까지 구형으로부터 발산하는 과정은 현저한 섬유 다발을 형성시켰다. 흔히, 작은 이동 세포가 섬유와 연관하여 관찰되었다(도 2B). 분화된 배양물의 면역형광 분석은 과성장 영역에서의 대다수의 세포가 뉴런 마커 MAP2ab 및 βIII-튜불린(도 2C)를 발현함을 밝혔다. 저분자량의 신경필라멘트(NF) 및 고분자량의 NF의 발현은 분주 한 후, 각각 7일 내지 10일 및 10일 내지 14일까지 관찰되었다(도 2D). 다양한 신경전달 물질에 대한 항체를 사용하여 ES 세포 유래 뉴런의 특성을 추가로 분석하였다. 다수의 뉴런은 글루타메이트성 표현형을 나타내는 반면(도 2E), 보다 작은 비율은 GABA에 대한 항체로 표지되었다. 흔히, 이들 뉴런은 극성 형태를 보여주었다(도 2F). 소수의 뉴런은 도파민 합성을 위한 율속 효소인 TH(도 2G)를 발현함을 보여주었다. GFAP+ 성상세포는 성장 인자 회수 후 첫 2주이내에는 거의 관찰되지 않았지만 연장된 시험관내 분화 후 보다 흔하게 나타났다. 4주까지, 이들은 분화된 뉴런 아래에 광범위한 층을 형성하였다(도 2D). 희소돌기아교세포는 표준 배양 조건하에서 관찰되지 않았지만 전형적인 희소돌기아교세포 형태를 갖는 몇 개의 O4-면역반응성 세포가, 혈소판 유래 성장 인자 A의 존재하에 2주 이상동안 배양되는 경우 관찰되었다(도 2H). 따라서, ES 세포 유래 신경 전구체는 모든 3개 주요 유형의 CNS를 생성한다.In vitro differentiation of ES cell derived neural precursors was induced by recovering FGF2 and dispensing on ornithine and laminin substrates. Within a few days, individual cells and a number of growth cones protrude from the sphere to show a star explosion appearance. Dissipation from the spheres by 7-10 days after dispensing produced significant fiber bundles. Frequently, small migration cells were observed in association with the fibers (FIG. 2B). Immunofluorescence analysis of differentiated cultures revealed that the majority of cells in the overgrowth region expressed neuron markers MAP2ab and β III -tubulin (FIG. 2C). Expression of low molecular weight neurofilament (NF) and high molecular weight NF was observed until 7 days to 10 days and 10 days to 14 days after dispensing (FIG. 2D). Antibodies to various neurotransmitters were further used to characterize ES cell derived neurons. Many neurons showed a glutamate phenotype (FIG. 2E), while smaller proportions were labeled with antibodies to GABA. Frequently, these neurons showed a polar form (FIG. 2F). A few neurons were shown to express TH (FIG. 2G), a rate-limiting enzyme for dopamine synthesis. GFAP + astrocytes were rarely observed within the first 2 weeks after growth factor recovery, but were more common after prolonged in vitro differentiation. By 4 weeks, they formed a broad layer under differentiated neurons (FIG. 2D). Rare oligodendrocytes were not observed under standard culture conditions, but several O4-immunoreactive cells with typical oligodendrocyte morphology were observed when cultured for more than two weeks in the presence of platelet derived growth factor A (FIG. 2H). . Thus, ES cell derived neural precursors produce all three major types of CNS.
사람 ES 세포 유래 신경 전구체는 시험관내에서 이동하고 혼입하고 분화한다. 생체내에서 사람 ES 세포 유래 신경 전구체의 분화를 평가하기 위해, 본 발명자는 이들을 새로 태어난 마우스의 외측 뇌실에 이식하였다[문헌참조: Flax, J. D., et al., Nat. Biotech. 16: 1033-1039,1998]. 이식된 세포는 뇌실계의 다양한 영역에 클러스터를 형성하고 다양한 숙주 뇌 영역에 다수로 혼입된다. 이식 후 1주 내지 4주간에 분석된 22개의 뇌중에서, 뇌실내 클러스터 및 혼입된 세포는 19개 및 18개의 수용자 뇌에서 각각 발견되었다. 장시간 후 분석된 각각의 동물은 이식된 세포가 이식한지 적어도 8주동안 검출될 수 있음을 보여주었다. 클러스터내 세포는 네스틴, βIII-튜불린 및 MAP2ab에 대한 항체에 대해 강한 면역반응성을 보여주었다. 응집체에서 단지 몇개의 세포는 GFAP를 발현하였다. 미분화된 ES 세포 및 비신경 상피 세포에서 전형적으로 발현되는 마커인 알칼린 포스파타제 및 사이토케라틴은 당해 클러스터내에서 검출되지 않았다. 어떠한 테라토마 형성이 관찰되지 않았다. Human ES cell derived neural precursors migrate, incorporate and differentiate in vitro. To assess the differentiation of human ES cell derived neural precursors in vivo, we transplanted them into the lateral ventricles of newly born mice. Flax, JD, et al., Nat. Biotech. 16: 1033-1039,1998. The transplanted cells form clusters in various regions of the ventricular system and are incorporated in large numbers in various host brain regions. Of the 22 brains analyzed between 1 and 4 weeks after transplantation, intraventricular clusters and incorporated cells were found in 19 and 18 recipient brains, respectively. Each animal analyzed after a long time showed that the transplanted cells can be detected for at least 8 weeks after transplantation. Intracluster cells showed strong immunoreactivity against antibodies to nestin, β III -tubulin and MAP2ab. Only a few cells in the aggregate expressed GFAP. Alkaline phosphatase and cytokeratin, markers typically expressed in undifferentiated ES cells and non-neural epithelial cells, were not detected in this cluster. No teratoma formation was observed.
사람 특이적 프로브를 사용한 DNA 동일계 하이브리드화 및 사람 핵 특이적 항원의 면역조직화학적 검출은 다수의 뇌 영역에 이식된 세포가 존재함을 밝혔다. 광범위한 공여체 세포 혼입을 나타내는 회색질 영역은 피질(도 3A), 해마(도 3B, C), 후각망울, 격막(도 3D), 시상, 시상하부(도 3E), 선조(도 3F) 및 중뇌(도 3G)를 포함하였다. 백색질 영역으로의 혼입은 뇌량, 속섬유막 및 해마 섬유 트랙에서 가장 명백하다. 형태적으로, 혼입된 사람 세포는 주변 숙주 세포와 구분할 수 없고 단지 사람 특이적 마커를 사용하여 검출될 수 있다(도 3). 세포형 특이적 항체를 사용한 이중 표지는 혼입된 세포가 뉴런 및 교세포 둘다로 분화함을 밝혔다. 사람 ES 세포-유래 뉴런은 βIII-튜불린 및 MAP2ab에 대한 항체를 사용하여 명백하게 묘사될 수 있다(도 3H, J). 흔히, 이들은 긴 프로세스를 갖는 극성 형태를 나타낸다(도 3H). 추가로, 다극성 및 미성숙한 단일극성 형태를 갖는 뉴런이 발견되었다(도 3J). 공여체 유래 뉴런은 회색질 및 백색질 둘다에서 검출되는, 숙주 뇌로 원거리 돌출하는 다수의 축삭을 생성하였다. 이들은 특히, 단일 부분(도 3I)내에 수백 ㎛에서 흔히 추적될 수 있는 뇌량, 전교련 및 해마채와 같은 섬유 트랙내에 풍부하다.DNA in situ hybridization using human specific probes and immunohistochemical detection of human nuclear specific antigens revealed the presence of cells transplanted into multiple brain regions. Gray matter regions showing extensive donor cell incorporation include cortex (FIG. 3A), hippocampus (FIG. 3B, C), olfactory bulb, septum (FIG. 3D), hypothalamus, hypothalamus (FIG. 3E), progenitor (FIG. 3F) and midbrain (FIG. 3G). Incorporation into the white matter region is most evident in the corpus callosum, stromal fibrous membrane, and hippocampal fibrous track. Morphologically, incorporated human cells are indistinguishable from surrounding host cells and can only be detected using human specific markers (FIG. 3). Double labeling with cell type specific antibodies revealed that the incorporated cells differentiate into both neurons and glial cells. Human ES cell-derived neurons can be clearly depicted using antibodies against β III -tubulin and MAP2ab (FIG. 3H, J). Often, they exhibit a polar form with a long process (FIG. 3H). In addition, neurons with multipolar and immature monopolar forms were found (FIG. 3J). Donor-derived neurons produced a number of axons that distantly protrude into the host brain, detected in both gray and white matter. They are particularly abundant in fiber tracks such as cerebral pulmonary, predrill and hippocampus, which can often be traced at several hundred micrometers in a single portion (Figure 3I).
뉴런에 추가로, 소수의 ES 세포 유래 성상세포는 숙주 뇌 조직내에서 검출되었다. 이들은 방사상 형태를 나타내고 GFAP(도 3K)를 강하게 발현한다. 대조적으로, 미엘린 단백질에 대한 항체를 사용한 혼입된 사람 세포의 이중 표지는 성숙한 희소돌기아교세포를 검출하는데 실패하였다. 숙주 뇌로 이동한 몇몇 공여체 세포는 이식 후 4주까지는 네스틴 양성 표현형을 보유하였다. 이들 많은 세포는 혈관 주변 위치에서 발견되었다.In addition to neurons, few ES cell derived astrocytes were detected in host brain tissue. They exhibit radial morphology and strongly express GFAP (FIG. 3K). In contrast, double labeling of human cells incorporated with antibodies to myelin proteins failed to detect mature oligodendrocytes. Several donor cells that migrated to the host brain had a Nestin positive phenotype up to 4 weeks after transplantation. Many of these cells have been found in locations around blood vessels.
토론debate
본 연구는 성숙한 뉴런 및 교세포를 생성할 수 있는 이식가능한 신경 전구체는 사람 ES 세포로부터 고수율로 생성될 수 있음을 지적한다. 성장 인자 매개 증식/분화 및 신경 전구체 세포의 차등 접착을 사용하여, 본원에 기재된 시험관내 분화 과정은 신경 발육 연구 및 신경계 복구를 위한 공여체 세포의 생성에 대한 새로운 발판을 제공한다.The study indicates that implantable neural precursors capable of producing mature neurons and glia can be produced in high yield from human ES cells. Using growth factor mediated proliferation / differentiation and differential adhesion of neural progenitor cells, the in vitro differentiation process described herein provides a new step toward the development of donor cells for neurodevelopment studies and nervous system repair.
본 연구의 주요 발견은 사람 ES 세포로부터 신경 전구체의 분화가 시험관내에서 신경관형 구조 형성과 함께 신경계 발육의 조기 단계를 반복한다는 관찰이다. 당해 현상은 현재 제어 조건하에 사람 신경 발육의 조기 단계를 연구하고 실험적으로 조작하기 위해 사용될 수 있다. 화학적으로 규명된 배양 시스템은 시험관내에서 사람 신경상피 증식 및 세부사항에 대한 단일 인자의 효과를 사용하는 유일한 기회를 제공한다. 발육하는 사람 뇌로부터 유래하는 전구체와 유사하게, 사람 ES 세포 유래 전구체는 FGF2에 대해 강한 증식 반응을 보여준다[문헌참조: Flax, J. D. , et al., supra, 1998]. 그러나, 증식에 대한 어떠한 부가적 또는 상승작용적 효과는 EGF 또는 LIF에 의해 유발될 수 없다. 이러한 발견은 1차 세포로 수득된 데이타와는 차이가 있고[문헌참조: Zhang, S.-C., et al., supra, 2000; Svendsen, C. N., et al., supra, 1996; Carpenter, M. K., et al., supra, 1999; Vescovi, A. L., et al., supra, 1999] 증식하는 ES 세포 유래 신경 전구체는 태아 사람 뇌로부터 유래하는 전구체 세포 보다 미성숙한 단계를 나타냄을 제안할 수 있다. 실질적으로 설치류 세포에 대한 연구는 조기 신경세포발생으로부터 분리된 신경 줄기 세포가 증식을 위해 FGF2에 의존하고 EGF에 대한 응답은 다지 신경 전구체 세포 분 화의 후기 단계에서 획득됨을 지적한다[문헌참조: Kalyani, A. D. , et al., Dev. Bioi. 186: 202-223,1997 ; Fricker, R. A., et ai., J. Neurosci. 19: 5990-6005, 1999].The main finding of this study is the observation that differentiation of neural precursors from human ES cells repeats the early stages of nervous system development with neural tubular structure formation in vitro. This phenomenon can be used to study and experimentally manipulate the early stages of human neural development under current controlled conditions. Chemically defined culture systems offer the only opportunity to use the effect of a single factor on human neuroepithelial proliferation and detail in vitro. Similar to precursors derived from developing human brains, human ES cell derived precursors show a strong proliferative response to FGF2 (Flax, J. D., et al., Supra, 1998). However, no additional or synergistic effects on proliferation can be caused by EGF or LIF. This finding is different from the data obtained with primary cells [Zhang, S.-C., et al., Supra, 2000; Svendsen, C. N., et al., Supra, 1996; Carpenter, M. K., et al., Supra, 1999; Vescovi, A. L., et al., Supra, 1999] It may be suggested that proliferating ES cell derived neural precursors exhibit immature stages than precursor cells derived from the fetal human brain. Practically, studies on rodent cells indicate that neural stem cells isolated from early neurogenesis rely on FGF2 for proliferation and that responses to EGF are obtained in later stages of multidose neural progenitor cell differentiation. Kalyani , AD, et al., Dev. Bioi. 186: 202-223, 1997; Fricker, R. A., et ai., J. Neurosci. 19: 5990-6005, 1999].
신경관형 구조의 시험관내 생성 및 이들의 차등 접착을 기초로 이들 구조물을 분리하기 위한 가능성은 사람 ES 세포 유래 신경 전구체를 고순도로 생성시키기 위한 단순하지만 효율적인 방법을 제공한다. 특히, 구조물내의 강한 세포-세포 접촉 및 조직 배양 기질에 대한 매우 낮은 접착성은 미분화된 ES 세포 또는 또 다른 체세포 계통의 세포의 상당한 오염 없이 선택적인 신경 세포의 분리를 허용한다. 당해 과정의 고효율은 분리된 세포 95% 이상이 네스틴 양성 표현형을 나타내고 어떠한 ES 세포 또는 비신경 상피가 이식된 수용체에서 검출될 수 없다는 사실에 의해 반영된다. 미분화된 ES 세포 및 기타 계통에 대한 전구체는 종양 및 외부조직을 형성할 수 있기 때문에, 고순도의 체세포군의 생성이 ES 세포 기반 신경 이식 전략을 개발하는데 주요 전제조건이다.The potential for separating these structures based on in vitro production of neural tubular structures and their differential adhesion provides a simple but efficient method for generating high purity of human ES cell derived neural precursors. In particular, strong cell-cell contact in the construct and very low adhesion to tissue culture substrates allows for the isolation of selective neurons without significant contamination of undifferentiated ES cells or cells of another somatic lineage. The high efficiency of this process is reflected by the fact that at least 95% of the isolated cells exhibit a Nestin positive phenotype and no ES cell or non-neural epithelium can be detected at the transplanted receptor. Since precursors to undifferentiated ES cells and other lineages can form tumors and external tissues, the generation of high-purity somatic cell populations is a major prerequisite for developing ES cell-based neuronal transplant strategies.
신생태아 마우스 뇌로 이식 후, ES 세포 유래 신경 전구체는 다양한 뇌 영역으로 혼입되고 여기서 뉴런 및 교세포로 분화된다. 생체내에서 성숙한 희소돌기아교세포의 검출 실패는 설치류의 경우와는 반대로 희소돌기아교 분화 효율이 낮기때문일 수 있다[문헌참조: Svendsen, C. N., et al., Brain Pathol. 9: 499-513, 1999]. 주목할만하게, 공여체 유래 뉴런은 출생후 신경세포 발생을 나타내는 부위로 제한되지 않지만 또한 뇌의 많은 다른 영역에서 발견된다. 유사한 데이타는 GNS 유래 전구체의 성인 설치류 뇌로의 이식을 포함하는 연구에서 수득되었다[문헌 참조: Tropepe, V., et al., Dev. Biol. 208:166-188, 1999]. 각각의 전구체 세포의 유사분열 후 뇌 영역으로의 혼입은 특히 성인뇌 및 척주에서의 세포 대체와 관련되어 있다. 혼입된 세포가 영역 특이적 성질을 어느정도로 획득하고 기능적으로 활성이 어느정도로 되는지를 측정하기 위해 보다 세부적인 연구가 요구된다.After transplantation into neonatal mouse brain, ES cell derived neural precursors are incorporated into various brain regions where they differentiate into neurons and glial cells. Failure to detect mature oligodendrocytes in vivo may be due to low efficiency of oligodendrocyte differentiation as opposed to rodents [Svendsen, C. N., et al., Brain Pathol. 9: 499-513, 1999]. Notably, donor derived neurons are not limited to sites showing postnatal neuronal development but are also found in many other areas of the brain. Similar data were obtained in studies involving transplantation of GNS derived precursors into adult rodent brains. Tropepe, V., et al., Dev. Biol. 208: 166-188, 1999. The incorporation of each precursor cell into the brain region after mitosis is particularly associated with cell replacement in the adult brain and spinal column. More detailed studies are needed to determine how much of the incorporated cells acquire region specific properties and how functionally they are active.
성숙하고 미성숙한 신경아세포로 구성된 뇌실내 클러스를 제외하고는 숙주 뇌에서 어떠한 공간 점유 병변이 검출되지 않았다. 가장 명백하게, 어떠한 테라토마 형성이 8주 미만의 수술 후 기간동안에 관찰되지 않았다. 특히, 비 사람 영장류에서 보다 강한 장기 안정성 연구가 잠재적인 임상적 적용을 고려하기 전에 요구된다는 것이 명백하지만 본원 발명의 데이타는 분화하는 사람 ES 세포 배양물로부터 분리된 신경 전구체가 신경 복구를 위한 전망있는 공여체 공급원을 나타냄을 지적한다.No space occupying lesions were detected in the host brain except for intraventricular clusters of mature and immature neuroblasts. Most obviously, no teratoma formation was observed during the postoperative period of less than eight weeks. In particular, although it is clear that stronger long-term stability studies are required before considering potential clinical applications in non-human primates, the data of the present invention suggest that neural precursors isolated from differentiating human ES cell cultures are promising for neural repair. Point out the donor source.
실험 프로토콜Experimental protocol
ES 세포의 배양. ES 세포, H1(계대 16회 내지 33회), H9(계대 34회 내지 55회) 및 H9으로부터 유래된 클론주인 H9.2(계대 34회 내지 46회)(문헌참조: Amit, M., et al., supra, 2000)를 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포의 영영 공급 층상에서 배양하고 이전에 기재된 바와 같은 듈베코 변형 이글 배지(DMEM)/F12, 20% 혈청 대용물(Gibco), 0.1mM β-머캅토에탄올, 2㎍/ml의 헤파린 및 4ng/ml의 FGF2(PeproTech Inc, Rochy Hill, NJ)로 이루어진 배지[문헌참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998]를 매일 교환한다. 핵형 분석은 주어진 계대에서 세포주는 배수체임을 지적했다. Culture of ES Cells. ES cells, H1 (passage 16-33), H9 (passage 34-55) and H9-derived clones H9.2 (passage 34-46) (see Amit, M., et. al., supra, 2000) were cultured on the permanent feed layer of irradiated mouse embryo fibroblasts and Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12, 20% Serum Substitute (Gibco), 0.1 mM β as previously described. -Medium (Thomson, JA, et al., Supra, 1998) consisting of mercaptoethanol, 2 μg / ml heparin and 4 ng / ml FGF2 (PeproTech Inc, Rochy Hill, NJ) is exchanged daily. Karyotyping indicated that the cell line is a drainage at a given passage.
ES 세포의 분화 배양물. ES 세포 배양물을 37℃에서 30분동안 디스파제로 항온처리하고 ES 세포 콜로니를 온전하게 제거하였다. ES 세포 콜로니를 펠렛화하고 FGF2가 없는 ES 세포 배지에 현탁시키고 매일 배지를 갈아주면서 25cm2 조직 배양 플라스크(Nunc)에서 4일동안 배양하였다. ES 세포 콜로니는 부유 EB로서 성장한 반면, 임의의 잔류 영양 공급 세포는 플라스크에 부착되었다. 영양 공급 세포는 EB를 새로운 플라스크로 이동시켜 제거하였다. EB(∼50/플라스크)를 이어서 인슐린(25㎍/ml), 트랜스페린(100㎍/ml), 프로게스테론(20nM), 푸트레신(60μM), 나트륨 셀레나이트(30nM) 및 헤파린(2㎍/ml)이 보충된 DMEM/F12에서 FGF2(20ng/ml)의 존재하에 25-cm2 조직 배양 플라스크(Nunc)에 분주하였다[문헌참조: Zhang, S. -C., et al., supra, 2000; Zhang, S. -C., et al., supra, 1999]. Differentiation Culture of ES Cells. ES cell cultures were incubated with dispase at 37 ° C. for 30 minutes and ES cell colonies were intact. ES cell colonies were pelleted and suspended in ES cell medium without FGF2 and incubated for 4 days in 25 cm 2 tissue culture flasks (Nunc) with daily medium change. ES cell colonies grew as floating EB, while any residual feeder cells were attached to the flask. Feeder cells were removed by transferring EB to a new flask. EB (-50 / flask) followed by insulin (25 μg / ml), transferrin (100 μg / ml), progesterone (20 nM), putrescine (60 μM), sodium selenite (30 nM) and heparin (2 μg / ml ) Was dispensed into 25-cm 2 tissue culture flasks (Nunc) in DMEM / F12 supplemented in the presence of FGF2 (20 ng / ml). Zhang, S.-C., et al., Supra, 2000; Zhang, S.-C., et al., Supra, 1999].
신경 전구체 세포의 분리 및 배양: 주변 편평 세포로부터 로제트 세포 클러스터를 분리하기 위해, 배양물을 15 내지 20분동안 37℃에서 0.1mg/ml 디스파제와 항온처리하였다. 로제트 클럼프는 후퇴하는 반면, 주변 편평 세포는 접착된 상태로 존재한다. 이 점에서, 로제트 클럼프는 플라스크를 흔들어서 제거하고 편평 세포는 여전히 부착되어 있다. 클럼프를 펠렛화하고 5ml의 피펫으로 약하게 분쇄하고 30분동안 배양 플라스크상으로 분주하여 오염시키는 각각의 세포가 부착되도록 한다. 이어서, 부유 로제트 클럼프는 부착을 억제하는 폴리-(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)로 피복된 새로운 플라스크로 옮기고 FGF2(20ng/ml)의 존재하에 사람 신경 전구체를 위해 사용되는 배지에서 배양하였다[문헌참조: Zhang, S.-C., et al., supra, 2000]. 신경 분화 및 분리의 효율성을 정량하기 위해, 새롭게 분리된 세포 클러스트 및 잔류하는 편평 세포를 트립신(0.1% EDTA중에 0.025%)으로 해리하고 계수하였다. ES 세포로부터 분화되는 총 세포중에서 추정 신경 전구체(로제트 세포)의 %는 H9 및 H9.2 세포주에 대한 3개의 독립적인 실험을 기준으로 구하였다. ES 세포 유래된 신경 전구체의 분화 잠재력을 분석하기 위해, 세포를 FGF2 부재하에 DMEM/12, N2 보충물(Gibco), cAMP(100ng/ml) 및 BDNF(10ng/ml, PeproTech)로 이루어진 배지에서 오르니틴/라미닌 기질상에서 배양하였다. 희소돌기아교세포 분화를 위해, ES 세포 유래된 신경 전구체를 문헌[참조: Zhang, -S.-C., et al., supra, 2000]에 기재된 바와 같이, N1(Gibco) 및 혈소판 유래 성장 인자 A(PDGFA)(2ng/ml)이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 형태적 관찰 및 전구체 및 보다 성숙한 신경 세포에 대한 마커를 사용한 면역염색은 분화과정동안에 수행하였다. Isolation and Culture of Neural Precursor Cells: To separate rosette cell clusters from surrounding squamous cells, the cultures were incubated with 0.1 mg / ml dispase at 37 ° C. for 15-20 minutes. Rosette Klump retreats, while surrounding squamous cells remain adhered. At this point, the rosette clump is shaken off the flask and the squamous cells are still attached. The clumps are pelleted and gently ground with a 5 ml pipette and dispensed onto the culture flask for 30 minutes to allow for attachment of each contaminating cell. The floating rosette clumps were then transferred to a new flask coated with poly- (2-hydroxyethyl-methacrylate) that inhibited adhesion and incubated in the medium used for human neural precursors in the presence of FGF2 (20 ng / ml). See Zhang, S.-C., et al., Supra, 2000. To quantify the efficiency of neural differentiation and separation, freshly isolated cell clusters and remaining squamous cells were dissociated with trypsin (0.025% in 0.1% EDTA) and counted. The percentage of putative neural precursors (roset cells) among the total cells differentiated from ES cells was calculated based on three independent experiments on H9 and H9.2 cell lines. To analyze the differentiation potential of ES cell-derived neural precursors, cells were harvested in medium consisting of DMEM / 12, N2 supplement (Gibco), cAMP (100 ng / ml) and BDNF (10 ng / ml, PeproTech) without FGF2. Cultured on chitin / laminin substrate. For oligodendrocyte differentiation, ES cell derived neural precursors are described by N1 (Gibco) and platelet derived growth factors as described in Zhang, -S.-C., et al., Supra, 2000. Cultured in DMEM supplemented with A (PDGFA) (2 ng / ml). Morphological observations and immunostaining with markers for precursors and more mature neurons were performed during differentiation.
조직화학적 및 면역조직화학적 염색. 로제트 형성을 보다 잘 가시화하기 위해, 로제트를 갖는 배양물을 PBS로 세정하고 4%의 파라포름알데하이드 및 0.25%의 글루타르알데하이드중에서 1시간동안 고정화시킨다. 고정화된 세포를 이어서 문헌[참조: Zhang, -S.-C., et al., supra, 1999]에 기재된 바와 같이 플라스틱 수지중에 매립시켜 프로세싱하였다. 이어서 배양된 세포를 1㎛ 두께로 절단하고 톨루이딘 청색으로 염색시켰다. 면역염색을 위해, 커버슬립 배양물을 문헌[참조:Zhang, S.-C., et al., supra, 2000; Zhang, S.-C., et al., supra, 1999]에 상세히 기재된 적당한 형광 2차 항체에 의해 검출되는 하기의 1차 항체: 항-네스틴(문헌참조: polyclonal, gift of Dr. R. McKay of NINDS, 1: 1,000); 항-폴리시알화된 뉴런 세포 접착 분자 (PSA-NCAM, 마우스 IgM, 루곤 지 박사(G. Rougon)(university of Marseille, France)로부터 기증받음 , 1: 200); 항-무사쉬-1 (랫트 IgG, 오카노 에이취 박사(Dr. H. Okano)(University of Tokyo, Japan)로부터 기증받음, 1: 500); 항-GFAP(폴리클로날, Dako, 1: 1,000); 항-사람 GFAP (슈에른베르크 모노클노날(Sternberg monoclonals), 1: 10,000) ; 04 (마우스 IgM, 하이브리도마 상등액, 1: 50); 항-타이로신 하이드록실라제 (TH, Pel 동결, 1: 500)를 사용하여 면역염색시켰다. 나머지 항체는 시그마(Sigma)로부터 구입하였다: 항-ßx 튜불린(마우스 IgG, 1: 500); 항- 신경필라멘트 (NF) 68 (마우스 IgG, 1: 1,000); 항-NF 200 (폴리클로날, 1: 5,000); 항- MAP2ab (마우스 IgG, 1: 250); 항-y-아미노부티르산 (GABA, 폴리클로날, 1: 10,000) ; 항-글루타메이트 (마우스 IgG, 1: 10,000). 브로모데옥시우리딘(BrdU) 혼입을 위해, 각각의 그룹에서 4개의 커버슬립 배양물을 4% 파라포름알데하이드중에 고정화하고 1N HCl로 변성시키고 면역표지화 및 세포 계수를 위해 프로세싱하기전에 16시간동안 2μM의 BrdU로 항온처리하였다[문헌참조: Zhang, S.-C., et al., supra, 2000; Zhang, S.-C., et al., supra, 1999]. Histochemical and immunohistochemical staining. To better visualize rosette formation, the cultures with rosettes are washed with PBS and immobilized in 4% paraformaldehyde and 0.25% glutaraldehyde for 1 hour. Immobilized cells were then embedded and processed in plastic resins as described in Zhang, -S.-C., et al., Supra, 1999. The cultured cells were then cut to 1 μm thick and stained with toluidine blue. For immunostaining, coverslip cultures are described in Zhang, S.-C., et al., Supra, 2000; Zhang, S.-C., et al., Supra, 1999. The following primary antibodies detected by suitable fluorescent secondary antibodies described in detail: anti-nestine (polyclonal, gift of Dr. R. McKay of NINDS, 1: 1,000); Anti-polysialized neuronal cell adhesion molecules (PSA-NCAM, mouse IgM, donated from G. Rougon, University of Marseille, France, 1: 200); Anti-Musash-1 (rat IgG, donated from Dr. H. Okano, University of Tokyo, Japan, 1: 500); Anti-GFAP (polyclonal, Dako, 1: 1,000); Anti-human GFAP (Sternberg monoclonals, 1: 10,000); 04 (mouse IgM, hybridoma supernatant, 1: 50); Immunostaining using anti-tyrosine hydroxylase (TH, Pel freeze, 1: 500). The remaining antibodies were purchased from Sigma: anti-ßx tubulin (mouse IgG, 1: 500); Anti-neural filament (NF) 68 (mouse IgG, 1: 1,000); Anti-NF 200 (polyclonal, 1: 5,000); Anti- MAP2ab (mouse IgG, 1: 250); Anti-y-aminobutyric acid (GABA, polyclonal, 1: 10,000); Anti-glutamate (mouse IgG, 1: 10,000). For bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, 4 coverslip cultures in each group were immobilized in 4% paraformaldehyde, denatured with 1N HCl, 2 μM for 16 hours before processing for immunolabeling and cell counting. Incubated with BrdU of Zhang, S.-C., et al., Supra, 2000; Zhang, S.-C., et al., Supra, 1999].
대뇌뇌실내 이식 및 생체내 분석. 100,00개의 생존 세포/㎕의 현탁액을, 트립신(37℃에서 5 내지 10분동안 0.1% EDTA중에서 0.025%)으로 신경 전구체의 응집체를 해리시킨 후 L15 배지(Gibco)중에서 제조하였다. 머리 이하의 조명을 사용하여 2 내지 3㎕의 세포 현탁액을 냉동마취된 신생 마우스(C3HeB/FeJ)의 외측 뇌실 각각으로 서서히 주사하였다. 이식된 동물을 사이클로스포린 A(10mg/kg, i.p.)을 매일 주사하여 면역억제시킨다. 이식한지 1주, 2주, 4주 및 8주후에 마우스를 링 거액에 이어서 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 관류시킨다. 뇌를 절개하고 사용할때까지 4℃에서 동일한 고정화제에서 고정화시킨다. 공여체 세포는 디곡시게닌 표지된 프로브를 사용하여 사람 alu 반복 요소[문헌참조: Brustle, O., et al., Nat. Biotech. 16: 1040-1044, 1998]에 대한 동일계 하이브리드화에 의해 또는 사람 특이적 핵 항원에 대한 항체[문헌참조: MAB1281, Chemicon, 1:50]를 사용하여 여 50㎛ 코로날 바이브라톰 절개로 동정하였다. 면역양성 세포는 GFAP(1:100), 네스틴, βIII-튜불린(TUJ1, BabCo, 1:500), MAP2ab(Sigma, clones AP-20 및 HM-2, 1: 300) 및 인산화된 배지 분자량 사람 신경필라멘트[클론 HO-14, 1:50, 트로야노브스키 제이 박사(J. Trojanowski)로부터 기증받음]에 대한 항체로 이중 표지시켰다. 1차 항체를 적당한 형광단 접합된 2차 항체로 검출하였다. 절개부를 현미경[Zeiss Axioskop 2 and Leica laser scan microscopes]상에서 분석하였다. Cerebral ventricular transplantation and in vivo analysis. A suspension of 100,00 viable cells / μL was prepared in L15 medium (Gibco) after dissociating aggregates of neural precursors with trypsin (0.025% in 0.1% EDTA for 5-10 minutes at 37 ° C.). 2-3 microliters of cell suspension were slowly injected into each of the outer ventricles of cryoanized newborn mice (C3HeB / FeJ) using sub-head illumination. Implanted animals are immunosuppressed by daily injection of cyclosporin A (10 mg / kg, ip). One, two, four and eight weeks after transplantation, mice were perfused with Ringer's solution followed by 4% paraformaldehyde. The brain is dissected and immobilized in the same fixative at 4 ° C. until use. Donor cells were digested with human alu repeat elements using a digoxigenin labeled probe (Brustle, O., et al., Nat. Biotech. 16: 1040-1044, 1998] or by 50 μm coronal vibratom incision by in situ hybridization or using antibodies against human specific nuclear antigens (MAB1281, Chemicon, 1:50). It was. Immunopositive cells include GFAP (1: 100), Nestin, β III -tubulin (TUJ1, BabCo, 1: 500), MAP2ab (Sigma, clones AP-20 and HM-2, 1: 300) and phosphorylated medium Double labeled with antibody to molecular weight human neurofilament (clone HO-14, 1:50, donated by J. Trojanowski). Primary antibodies were detected with appropriate fluorophore conjugated secondary antibodies. Incisions were analyzed on a microscope (
실시예 2- 중뇌 도파민성 뉴런의 생성Example 2- Generation of Midbrain Dopaminergic Neurons
신경학적 증상에서 줄기 세포 치료의 잠재적인 응용을 위한 제1 단계는 신경 세포의 올바른 위치적 및 전달물질 표현형을 갖는 신경 세포의 직접적인 분화이다. 여기에서 본 발명자는 특정 순서의 모르포겐 작용을 통한 사람 배야 줄기(ES) 세포로부터 기능성 도파민성(DA) 뉴런의 왕성한 생성을 보여준다. Sox1의 발현 전, 조기단계에서 FGF8을 사용한 사람 ES 유래 신경외배엽 세포의 처리는 올바른 중뇌 DA 돌출 뉴런 표현형을 갖는 DA 뉴런의 특수화를 위해 필수적이다. 시험관내 생성된 DA 뉴런은 독성학적 및 약제학적 스크리닝 및 파킨슨 질환에서 잠재적인 세포 치료 를 위해 사용될 수 있다.The first step for potential applications of stem cell therapy in neurological symptoms is the direct differentiation of neurons with the correct positional and transporter phenotype of neurons. Here we show the vigorous production of functional dopaminergic (DA) neurons from human embryonic stem (ES) cells through a specific sequence of morphogen action. Treatment of human ES-derived neuroectodermal cells with FGF8 at an early stage, prior to Sox1 expression, is essential for the specialization of DA neurons with the correct midbrain DA protruding neuron phenotype. In vitro generated DA neurons can be used for toxicological and pharmaceutical screening and potential cell therapy in Parkinson's disease.
파킨슨 질환(PD)은 중뇌, 특히, 흑색질에서 DA 뉴런의 진행성 퇴화로부터 비롯된다. PD를 위한 현재 치료법은 주로 레바도파와 같은 DA 전구체의 전신 투여에 의한 증상 경감에 의지한다. 당해 치료는 처음 몇년동안은 효과적이지만 거의 영구적으로 이의 효능을 상실하고 부작을 유발한다. 교세포주 유래 신경원성 인자(GDNF)와 같은 성장 인자의 투여는 소규모 임상 시험에서 효과적인 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Gill, S. S. , et al., Nat. Med. 9: 589-595,2003]. 이러한 치료는 충분한 수의 생존 DA 뉴런에 의존하고 이의 장기 치료학적 잠재력은 연구과제로 남아있다. 신경 퇴화의 병소 특성 때문에 세포 이식은 또 다른 치료법으로서 제안되었다[문헌참조: Bjorklund, A. and Lindvall, O., Nat. Neurosci. 3: 537-544, 2000]. 몇몇 성공적인 경우에, 이식된 태아 중뇌 세포는 10년 이상동안 생존하고 증상의 경감에 기여[문헌참조:Kowdower, J. H. , et al., N. EnL J. Med. 332: 1118-1124,1995 ; Piccini, P., et al., Nat. Neurosci. 2: 1137-1140, 1999]하지만 최근 조절된 임상 시험은 PD용 태아 조직 이식 치료법의 효능에 대해 의구심을 부여한다[문헌참조: Freed, C. R. , et al., N. Engl. J. Med. 344: 710-719,2001 ; Olanow, C. W. , et al., Ann. Neurol. 54: 403-414, 2003]. 이들 현상은 PD의 복잡한 경향을 지적한다. 신임할 수 있는 새로운 기능적 사람 중뇌 DA 뉴런의 공급원이 DA 뉴런의 생존 및 기능에 영향을 주는 병원성 과정인 DA 시스템의 발생에 대한 시스템 연구 및 및 PD에 대한 장기간 치료법의 개발를 위해 급하게 요구된다.Parkinson's disease (PD) results from the progressive degeneration of DA neurons in the midbrain, especially in melanoma. Current therapies for PD rely primarily on symptomatic relief by systemic administration of DA precursors such as levadopa. This treatment is effective for the first few years but almost permanently loses its efficacy and causes trilogy. Administration of growth factors such as glial cell line derived neurogenic factor (GDNF) has been shown to be effective in small clinical trials. Gill, S. S., et al., Nat. Med. 9: 589-595, 2003. Such treatment relies on a sufficient number of surviving DA neurons and their long-term therapeutic potential remains a challenge. Because of the pathological nature of neurodegeneration, cell transplantation has been proposed as another treatment. Bjorklund, A. and Lindvall, O., Nat. Neurosci. 3: 537-544, 2000]. In some successful cases, transplanted fetal midbrain cells survive for more than 10 years and contribute to alleviation of symptoms [Kowdower, J. H., et al., N. EnL J. Med. 332: 1118-1124, 1995; Piccini, P., et al., Nat. Neurosci. 2: 1137-1140, 1999] However, recently controlled clinical trials doubt the efficacy of fetal tissue transplantation therapy for PD [Freed, C. R., et al., N. Engl. J. Med. 344: 710-719, 2001; Olanow, C. W., et al., Ann. Neurol. 54: 403-414, 2003. These phenomena point to the complex tendency of PD. A reliable source of new functional human midbrain DA neurons is urgently needed for system studies on the development of DA systems, which are pathogenic processes that affect the survival and function of DA neurons, and for the development of long-term therapies for PD.
DA 뉴런은 배반포 단계에서 이식전 배아의 내부 세포 매쓰로부터 유래하는 마우스 ES 세포로부터 효율적으로 생성될 수 있는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Evans, M. J. and Kaufman, M. H. , Nature 292: 154- 156,1981 ; Martin, G. R. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634-7638,1981]. 마우스 ES 세포는 먼저 FGF2에 의해[문헌참조: Lee, S. H. , et al., Nat. Biotechnol. 18: 675-679,2000] 또는 간질 세포 유래 유도 활성에 의해[문헌참조: Kawasaki, H. , et ai., Neuron 28: 31-40,2000 ; Barberi, T., et ai., Nat. Biotechnol. 21: 1200-1207, 2003] 신경외배엽 세포로 유도된다. 이어서 신경외배엽 세포는 DA 뉴런 유도를 위해 FGF8에 이어서 SHH로 노출된다. 당해 연구에서, 본 발명자는 사람 ES 세포를 유도하여[문헌참조:Thomson, J. A., et al., Science 282: 1145-1147,1998] FGF8 및 SHH에 응답하여 중뇌 돌출 특성을 갖는 다수의 DA 뉴런을 생성시키는 신경외배엽 세포로 분화시키는[문헌참조: Zhang, S. C., et al., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133,2001] 강한 시스템을 구축하였다. 본 발명자는 중뇌 돌충 뉴런 표현형을 갖는 DA 뉴런을 생성하기위해, 사람 ES 세포는 전구체 세포가 Sox1+를 발현하는 신경외배엽 세포가 되기 전에 FGF8로 노출되어야함을 밝혔다.It has been found that DA neurons can be produced efficiently from mouse ES cells derived from the inner cell mass of pre-transplanted embryos at the blastocyst stage. Evans, MJ and Kaufman, MH, Nature 292: 154- 156,1981; Martin, GR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634-7638,1981. Mouse ES cells are first described by FGF2 [Lee, SH, et al., Nat. Biotechnol. 18: 675-679, 2000] or by inducing activity derived from stromal cells [Kawasaki, H., et ai., Neuron 28: 31-40,2000; Barberi, T., et ai., Nat. Biotechnol. 21: 1200-1207, 2003] to neuroectodermal cells. Neuroectodermal cells are then exposed to FGF8 followed by SHH for DA neuron induction. In this study, we induced human ES cells (Thomson, JA, et al., Science 282: 1145-1147,1998) to identify a number of DA neurons with midbrain protrusion properties in response to FGF8 and SHH. To differentiate into the resulting neuroectodermal cells. Zhang, SC, et al., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133, 2001] A strong system was built. The inventors have shown that in order to generate DA neurons with the midbrain pluripotent neuron phenotype, human ES cells must be exposed to FGF8 before the precursor cells become neuroectodermal cells expressing Sox1 + .
결과result
사람 ES 유래 신경외배엽 세포는 전뇌 특성을 나타낸다.Human ES derived neuroectodermal cells exhibit whole brain properties.
영양 공급 층으로부터 탈착된 ES 세포 콜로니를 ES 세포 성장 배지에서 4일동안 응집체로서 현탁액중에서 배양함에 이어서 FGF2(20ng/ml)를 함유하는 화학적 으로 규명된 신경 배지에서 접착 배양 접시에서 성장시킨다[문헌참조: Zhang, S. C. , et al., supra, 2001]. 콜로니 중앙의 세포는 원주 형태를 나타내고 정렬하면서 9일경에 로제트를 형성한다(도 4A). 이들 원주 세포는 Pax6에 대해 양성이지만 범 신경 전사 인자 Sox1에 대해서는 음성이고(나타내지 않음) 이것은 조기 신경외배엽 세포임을 지적한다. 추가로 5 또는 6일동안(14일 내지 15일) 원주 세포는 증식하고 신경관형 로제트로 구성되고(도 4B) Sox1을 발현하고(도 4C), 전사인자가 신경관 폐쇄동안에 한정적인 신경외배엽 세포에 의해 발현된다[문헌참조: Pevny, L. H., et al., Development 125: 1967-1978,1998]. 이들은 전뇌 세포에 의해 발현되는 전사 인자인 뇌인자(Bf1)[문헌참조: Tao, W. and Lai, E. , Neuron 8: 057-966,1992]에 대해 양성이지만 중뇌 세포에 의해 발현되는 전사인자인 톱니모양 1(En-1)에 대해서는 음성이고(도 4D)[문헌참조: Davidson, D., et al., Development 104: 305-316,1988 ; Wurst, W., et al., Development 120: 2065-2075, 1994] 이것은 시험관내 전뇌가 신경외배엽 세포를 생성시킴을 제안한다.ES cell colonies detached from the nutrient supply layer are grown in suspension as aggregates for 4 days in ES cell growth medium and then grown in adherent culture dishes in chemically defined neuronal medium containing FGF2 (20 ng / ml). : Zhang, SC, et al., Supra, 2001]. The cells in the center of the colony form a circumferential form and form a rosette on day 9 (FIG. 4A). These columnar cells are positive for Pax6 but negative for pan-neuronal transcription factor Sox1 (not shown) and indicate that they are early neuroectodermal cells. For 5 or 6 additional days (14-15 days) the circumferential cells proliferate and consist of neural tubular rosettes (FIG. 4B) and express Sox1 (FIG. 4C), and transcription factors are restricted to neuroectodermal cells during neural tube closure. Expressed in Pevny, LH, et al., Development 125: 1967-1978,1998. They are positive for brain factor (Bf1), a transcription factor expressed by forebrain cells (Tao, W. and Lai, E., Neuron 8: 057-966,1992), but are transcription factors expressed by midbrain cells. Negative for human jagged 1 (En-1) (FIG. 4D), Davidson, D., et al., Development 104: 305-316,1988; Wurst, W., et al., Development 120: 2065-2075, 1994] This suggests that the in vitro whole brain produces neuroectodermal cells.
중뇌 표현형의 유도는 FGF8의 조기 작용을 요구한다.Induction of the midbrain phenotype requires early action of FGF8.
DA 뉴런으로의 분화를 위해, 신경관형 로제트에서 신경외배엽 세포는 차등 효소 및 접착 처리를 통해 집적시키고[문헌참조:Zhang, S. C., et al., supra, 2001] FGF2와 함께 현탁액중에서 응집체로서 4일동안 증식시킴에 이어서 라미닌 기질상으로 분주하고 6일동안 SHH(50 내지 200ng/ml) 및 FGF8(20 내지 100ng/ml)로 처리하였다. 면역세포화학적 분석은 대다수의 신경외배엽 세포가 En-1에 대해서는(나타내지 않음) 아니지만 Bf1에 대해서는 양성인채로 남아있음을 밝혔다. For differentiation into DA neurons, neuroectodermal cells in neural tubular rosettes were accumulated via differential enzyme and adhesion treatment (Zhang, SC, et al., Supra, 2001) and as agglutinates in suspension with FGF2 for 4 days. Growth was followed by dispensing onto laminin substrate and treated with SHH (50-200 ng / ml) and FGF8 (20-100 ng / ml) for 6 days. Immunocytochemical analysis revealed that the majority of neuroectodermal cells remained positive for Bf1 but not for En-1 (not shown) .
En-1을 발현하도록 Sox1+ 신경외배엽 세포를 유도하기 위한 FGF8의 실패는 Sox1을 발현하는 신경외배엽 세포가 패턴화된 시그날에 저항적일 수 있음을 제안한다. Sox1 발현 세포는 사람 ES 세포(6일된 배아체와 동일한(문헌참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998))의 분화 후 2주째에 생성되고 신경관형 구조를 형성하기 때문에 이들은 신경외배엽 세포가 Sox1을 발현하고 지역적으로 특정화되는 신경관 폐쇄에서 신경외배엽 세포에 상응할 수 있다[문헌참조: Lumsden, A. and Krumlauf, R., Science 274: 1109-1115, 1996]. 이것은 본 발명자로 하여금 FGF8이, 신경외배엽 세포가 Sox1을 발현하기 전에, 중뇌 특정화를 촉진할 수 있다는 가정을 세우도록 하였다. 따라서, 본 발명자는 콜로니 중앙에 세포가 9일째에 원주가 되는 경우 그 시점에서 FGF8(100ng/ml)을 적용하였다. 6일 후, 콜로니 중앙에 세포는 FGF2의 존재하에 보여지는 바와 같이 신경관형 형성체를 생성하였다. 이들 신경외배엽 세포는 유사하게 집적되고 4일동안 FGF8에서 증식하고 이어서 라미닌 기질상에서 6일동안 SHH로 처리된다. 당해 배양 조건하에, En-1 발현은 네스틴 발현 신경외배엽 세포(도 4E)에서 관찰되었지만 Bf1(도 4F)을 여전히 발현하는 세포가 여전히 존재한다. 따라서, 신경외배엽 세포는 이들이 Sox1+이 되기전에 효율적으로 지역화된다.The failure of FGF8 to induce Sox1 + neuroectodermal cells to express En-1 suggests that Sox1 expressing neuroectodermal cells may be resistant to patterned signals. Since Sox1 expressing cells are produced two weeks after differentiation of human ES cells (same as 6-day embryonic bodies (Thomson, JA, et al., Supra, 1998)) and form neural tubular structures, they are neuroectodermal cells May correspond to neuroectodermal cells in neural tube occlusion that express Sox1 and are localized (Lumsden, A. and Krumlauf, R., Science 274: 1109-1115, 1996). This led us to make the assumption that FGF8 can promote midbrain specification before neuroectodermal cells express Sox1. Therefore, the present inventors applied FGF8 (100 ng / ml) at that time when the cells became columnar on the ninth day in the center of the colony. After 6 days, cells in the center of the colony produced neural tubular formation as shown in the presence of FGF2. These neuroectodermal cells similarly accumulate and proliferate in FGF8 for 4 days and then with SHH for 6 days on laminin substrate. Under these culture conditions, En-1 expression was observed in nestin expressing neuroectodermal cells (FIG. 4E) but there are still cells still expressing Bf1 (FIG. 4F). Thus, neuroectodermal cells are efficiently localized before they become Sox1 + .
지역화된 신경외배엽 세포는 DA 뉴런으로 분화한다.Localized neuroectodermal cells differentiate into DA neurons.
신경외배엽 세포는 신경 분화 배지에서 해리되고 분화하였다. 이들은 미분화된 사람 ES 세포에 의해 고도로 발현되는 당단백질인 단계 특이적 배아 항원 4(SSEA4)를 발현하지 않았다. 해체된 신경외배엽 세포는 처음에 고루게 분포하지만 분주 후 3 내지 4일동안 로제트를 형성하였다. 분화한 후 3주째에 총 분화된 세포군의 약 3분의 1(4개의 실험으로부터 계수된 17,965 세포중 31.8±3.1% TH+ 세포)이 타이로신 하이드록실라제(TH)(도 5A)에 양성이었다. TH+ 세포의 유사한 %가 H9 및 H1 사람 ES 세포주로부터 수득되었다. 대부분의 TH 발현 세포는 직경이 10 내지 20㎛이다. 이들은 다극성 형태를 나타내고 분화가능한 축삭 및 수상돌기를 갖는다(도 5A). 모든 TH+ 세포는 뉴런 마커 βIII-튜불린+ 뉴런과 함께 양성으로 염색되고 약 50%가 TH+이었다[도 5B, 4개의 실험으로부터 12,859 βIII-튜불린+ 뉴런중의 6,383 TH+ 세포].Neuroectodermal cells dissociated and differentiated in neural differentiation medium. They did not express stage specific embryonic antigen 4 (SSEA4), a glycoprotein that is highly expressed by undifferentiated human ES cells. Disassembled neuroectodermal cells initially distributed evenly but formed rosettes for 3 to 4 days after dispensing. Three weeks after differentiation, about one third of the total differentiated cell population (31.8 ± 3.1% TH + cells in 17,965 cells counted from four experiments) was positive for tyrosine hydroxylase (TH) (FIG. 5A). . Similar percentages of TH + cells were obtained from H9 and H1 human ES cell lines. Most TH expressing cells are 10-20 μm in diameter. They exhibit a multipolar form and have differentiateable axons and dendrites (FIG. 5A). All TH + cells were stained positive with neuron marker β III -tubulin + neurons and about 50% TH + [FIG. 5B, 6,383 TH + cells in 12,859 β III -tubulin + neurons from 4 experiments] .
모노아민의 생합성에서, TH는 타이로신을 L-DOPA로 하이드록실화하고 이어서 이것은 AADC에 의해 탈카복실화되고 DA가 된다. 또 다른 2개의 효소, DβH 및 페닐에탄올아민 N-메틸트랜스퍼라제(PNMT)는 각각 DA를 노레피네프린으로 전환시키고 노레피네프린을 에피네프린으로 촉매한다. 면역염색은 모든 TH+세포가 AADC(도 5C-E)임을 보여주지만 몇몇 AADC+ 세포는 TH(도 5E)에 대해 음성이다. 그러나, TH+ 세포는 DβH(도 5F) 및 PNMT(나타내지 않음)에 대해 음성이지만 DβH는 성인 랫트에서 및 배아 몽키 뇌 줄기(도 5F의 사진)에서 노르아드레날린성 뉴런을 강하게 염색시켰다. 이들 데이타는 TH 발현 뉴런이 도파민 생합성에 필요한 2개의 효소를 소 유하고 당해 뉴런은 노르아드레날린 뉴런 또는 아드레날린 뉴런이라기 보다는 차라리 DA 뉴런이다.In the biosynthesis of monoamines, TH hydroxylates tyrosine to L-DOPA which is then decarboxylated by AADC and becomes DA. Two other enzymes, DβH and phenylethanolamine N-methyltransferase (PNMT), respectively convert DA into norepinephrine and catalyze norepinephrine to epinephrine. Immunostaining shows that all TH + cells are AADC (FIG. 5C-E) but some AADC + cells are negative for TH (FIG. 5E). However, TH + cells are negative for DβH (FIG. 5F) and PNMT (not shown) while DβH strongly stained noradrenergic neurons in adult rats and in embryonic monkey brain stem (photo in FIG. 5F). These data show that TH expressing neurons possess the two enzymes required for dopamine biosynthesis, which neurons are rather DA neurons rather than noradrenaline neurons or adrenergic neurons.
ES 세포 생성된 DA 뉴런은 중뇌 표현형을 나타낸다.ES cell generated DA neurons exhibit midbrain phenotype.
RT-PCR 분석은 중뇌 DA 뉴런 발육에 관여하는 Nurr1, Limx1b, En-1 및 Ptx3[문헌참조: Zetterstrom, R. H., et al., Science 276: 248-250,1997 ; Smidt, M. P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13305-13310, 1997 ; Saucedo-Cardenas, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4013-4018, 1998; Wallen, A. , et al., Exp. Cell Res. 253: 737-746,1999 ; Smidt, M. P., et ai., Nat. Neurosci. 3: 337-341,2000 ; Simon, H. H. , et al., J. Neurosci. 21: 3126-3134,2001 ; Van den Munckhof, P., et al., Development 130: 2535-2542,2003 ; Nunes, I., et ai., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100: 4245-4250,2003]은 신경외배엽 세포가 DA 뉴런(도 6A)로 분화될때까지 고수준으로 발현되지 않음을 지적했다. 면역염색은 다중 프로세스를 갖는 대부분의 TH+ 세포가 핵에서 중뇌 마커 En-1을 동시발현함을 밝혔다(도 6B). 따라서, 상기 방법을 사용하여 생성된 DA 뉴런은 중뇌 위치적 실체를 소유한다.RT-PCR analysis showed that Nurr1, Limx1b, En-1 and Ptx3 are involved in the development of midbrain DA neurons [see Zetterstrom, RH, et al., Science 276: 248-250,1997; Smidt, MP, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13305-13310, 1997; Saucedo-Cardenas, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4013-4018, 1998; Wallen, A., et al., Exp. Cell Res. 253: 737-746, 1999; Smidt, MP, et ai., Nat. Neurosci. 3: 337-341,2000; Simon, HH, et al., J. Neurosci. 21: 3126-3134,2001; Van den Munckhof, P., et al., Development 130: 2535-2542,2003; Nunes, I., et ai., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100: 4245-4250, 2003] indicated that neuroectodermal cells are not expressed at high levels until they differentiate into DA neurons (FIG. 6A). Immunostaining revealed that most TH + cells with multiple processes coexpressed the midbrain marker En-1 in the nucleus (FIG. 6B). Thus, DA neurons generated using this method possess midbrain positional entities.
후각망울내 DA 뉴런은 흔히, γ-아미노부티르산(GABA)을 동시발현한다[문헌참조: Kosaka, T., et al., Exp. Brain Res. 66: 191-210, 1987; Gall, C. M., et al., J. Comp. Neurol. 266: 307-318, 1987]. TH 및 GABA의 이중 면역염색은 DA 뉴런의 대부분이 GABA에 대해 음성이지만 GABA+ 뉴런은 배양물중에서 발견되었음을 지적했다(도 6C). 모든 TH+ 세포중에서, TH+ 세포의 8%( 8.7±3.9%, 4개의 실험으로부터 계수된 6,520TH+ 세포)는 GABA를 동시발현하였다. 이들 이중 양성 세포의 대부분은 작은 쌍극성 세포이다(도 6C에서의 사진). 몇몇 중뇌 DA 뉴런, 특히, 배쪽 피개부 영역중의 뉴런들은 TH와 함께 콜레시스토키닌 옥타펩타이드(CCK8) 또는 칼빈딘을 도이발현한다[문헌참조: McRitchie, D. A. , et al., J. Comp. Neurol. 364: 121-150, 1996; Hokfelt, T., et al., Neurosci. 5: 2093-2124, 1980]. 면역조직화학적 분석은 TH+ 뉴런이 관찰됨을 지적했다(도 6D). 당해 칼빈딘 뉴런은 대부분 소형 세포이다. 어떠한 CCK8 양성 세포도 배양물중에서 검출되지 않았다.DA neurons in olfactory bulbs frequently co-express γ-aminobutyric acid (GABA). Kosaka, T., et al., Exp. Brain Res. 66: 191-210, 1987; Gall, CM, et al., J. Comp. Neurol. 266: 307-318, 1987. Double immunostaining of TH and GABA indicated that most of the DA neurons were negative for GABA but GABA + neurons were found in culture (FIG. 6C). Of all TH + cells, 8% of TH + cells (8.7 ± 3.9%, 6,520TH + cells counted from four experiments) co-expressed GABA. Most of these double positive cells are small bipolar cells (photo in FIG. 6C). Several midbrain DA neurons, particularly neurons in the ventral overlying region, doi-express the cholecystokinin octapeptide (CCK8) or calvindine along with TH. McRitchie, DA, et al., J. Comp. Neurol. 364: 121-150, 1996; Hokfelt, T., et al., Neurosci. 5: 2093-2124, 1980]. Immunohistochemical analysis indicated that TH + neurons were observed (FIG. 6D). The calvindine neurons are mostly small cells. No CCK8 positive cells were detected in the culture.
ES 세포-생성된 DA 뉴런은 생물학적으로 기능성이다ES cell-generated DA neurons are biologically functional
면역염색은 모든 TH+이 GDNF에 대한 수용체의 성분인 c-Ret를 발현함을 보여주었다(도 7A-C). 다수의 TH+ 세포, 특히 측쇄 신경돌기를 갖는 세포들은 모노아민 뉴런에서 도파민을 아세포 격실로 팩키징하는데 관여하는 다공성 모노아민 수송체 2(VMAT2, 도 7D-F)를 발현하였다[문헌참조: Nirenberg, M. J., et al., J. Neurosci. 16: 4135- 4145, 1996]. 추가로, TH+ 뉴런은 시냅스 형성에 필수적인 막 당단백질인 시냅토피신을 발현하였다[문헌참조: Calakos, N. and Scheller, R. H., J. Biol. Chem. 269: 24534-24537, 1994](도 7A-I).Immunostaining showed that all TH + expresses c-Ret, a component of the receptor for GDNF (FIGS. 7A-C). Many TH + cells, especially those with side chain neurites, expressed porous monoamine transporter 2 (VMAT2, FIG. 7D-F) involved in packaging dopamine into blast compartments in monoamine neurons. Nirenberg, MJ, et al., J. Neurosci. 16: 4135-4145, 1996. In addition, TH + neurons expressed synaptopycin, a membrane glycoprotein essential for synapse formation. See Calakos, N. and Scheller, RH, J. Biol. Chem. 269: 24534-24537, 1994] (FIG. 7A-I).
도파민 방출은 DA 뉴런의 기능적 특징이다. 고수행능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석은 아스코르브산(AA), FGF8 및 SHH로 처리된 배양물중에 230.8±44.0pg/ml로서 AA, FGF8 및 SHH 처리 부재의 대조군 배양물중에서는 46.3 ± 9.2pg/ml로서 DA 분화 배양물 배지중에 도파민이 존재함을 밝혔다(도 8A). 배양된 세포가 세척되고 14분동안 HBSS중에서 항온처리되는 경우, 도파민 수준은 2개 배양물간에 유사하였다(도 8A). 그러나, HBSS중에 55mM KCl에 의한 배양된 뉴런의 탈분극은 DA의 양(AA, FGF8 및 SHH 처리 부재 및 존재하에 각각 35.8±9.2 및 111.0 ±15.0 pg/ml; 도 8A)을 상당히 증가시켰다. 이들 관찰은 시험관내 생성된 DA 뉴런이 DA를 분비할 수 있고 DA의 방출은 활성 의존적임을 제안한다.Dopamine release is a functional feature of DA neurons. High performance liquid chromatography (HPLC) analysis shows 230.8 ± 44.0 pg / ml in ascorbic acid (AA), FGF8 and SHH treated cultures, 46.3 ± 9.2pg in control cultures without AA, FGF8 and SHH treated. Dopamine was present in DA differentiation culture medium as / ml (FIG. 8A). When cultured cells were washed and incubated in HBSS for 14 minutes, dopamine levels were similar between the two cultures (FIG. 8A). However, depolarization of cultured neurons with 55 mM KCl in HBSS significantly increased the amount of DA (35.8 ± 9.2 and 111.0 ± 15.0 pg / ml in the absence and presence of AA, FGF8 and SHH treatment; FIG. 8A). These observations suggest that DA neurons produced in vitro can secrete DA and the release of DA is activity dependent.
전기생리학적 기록을 사용하여 ES 생성된 DNA 뉴런이 기능적으로 활성인지를 측정하였다. 30일 내지 38일동안 계속 배양된 세포에서(n = 14) 휴지기 막 전위(V휴지기) 범위는 32 내지 -72mV(-54±2.9mV)이고 세포 캐패시턴스(Cm)의 범위는 11 내지 45pF(21 ± 2.7pF)이고 입력 저항(Rin)의 범위는 480 내지 3500MQ(1506±282MΩ)이다. 탈분극 전류 단계(0.2nA x 200 내지 500ms)는 일반적으로 단일 작용 전위를 유발하지만 여러 경우에 작용 전위가 계속 감소하는 것으로 관찰되었다(도 8bi 및 ii). 작용 전위(AP)의 역치의 범위는 -26 내지 -5.2mV(-17.4±2.1mV)이고 -9.6 내지 30mV에서 최고에 이른다. 50.2mV 이하의 AP가 관찰되었다(32±2.8mV). AP 지속 범위는 3 내지 20.6ms(7.2±1.3ms)이다. 자발적 개시는 2개의 세포에서 관찰되었다(도 8C).Electrophysiological records were used to determine whether the ES produced DNA neurons were functionally active. In cells continued to be cultured for 30 to 38 days (n = 14), the resting membrane potential (V resting period ) ranges from 32 to -72 mV (-54 ± 2.9 mV) and the cell capacitance (Cm) ranges from 11 to 45 pF (21). ± 2.7 pF) and the input resistance (R in ) ranges from 480 to 3500 MQ (1506 ± 282 MΩ). Depolarization current steps (0.2 nA x 200-500 ms) generally result in a single action potential but in many cases it was observed that the action potential continues to decrease (Figures 8bi and ii). The threshold of action potentials (AP) ranges from -26 to -5.2 mV (-17.4 ± 2.1 mV) and peaks at -9.6 to 30 mV. APs below 50.2 mV were observed (32 ± 2.8 mV). The AP duration ranges from 3 to 20.6 ms (7.2 ± 1.3 ms). Spontaneous initiation was observed in two cells (FIG. 8C).
전압 클램프 모드에서, 내향 및 외향 전류 모두가 모든 세포(나타내지 않음) 에 관찰되었지만 이의 상대적 증폭정도는 상당히 다양하였다. 내향 전류는 신속하게 활성화되고(< 1ms) 1 내지 3ms내에서 최고조에 달한다. 활성화 역치는 -30±1mV이고, 최대 피크 전류 진폭은 -13±1.9mV의 평균 접압에서 수득되었고 당해 전류는 테트로도톡신(TTX, n=3)에 으해 완전히 차단되었다. 이들 성질들은 전압 개폐 나트륨 채널의 존재와 일관성이 있다. 3개의 세포에서, 본 발명자는 신속한 상승 및 보다 느린 감소단계를 포함하는 시냅스 전류의 특징을 갖는 자발적 일시 전류를 관찰하였다. 이들 기록중 하나는 K-글루코네이트 기본 피펫 용액을 사용하여 수행되었고 당해 세포를 -40mV 에서 유지시키면 본 발명자는 외향(억제) 및 내향(자극) 전류 둘다를 관찰할 수 있다(도 8di 및 dii). 모든 14개의 세포에 바이오시틴을 주사하였지만 단지 5개의 세포만이 면역염색 과정 종결 후 회복되었다. 그러나, 5개의 바이오시틴 충전된 세포 모두는 표지시킨 TH(도 8E-G)이었다.In voltage clamp mode, both inward and outward currents were observed in all cells (not shown), but their relative amplification varied considerably. Inward currents are rapidly activated (<1 ms) and peak within 1-3 ms. The activation threshold was -30 ± 1 mV and the maximum peak current amplitude was obtained at an average voltage of -13 ± 1.9 mV and the current was completely blocked by Tetrodotoxin (TTX, n = 3). These properties are consistent with the presence of voltage-gated sodium channels. In three cells, we observed spontaneous transient currents characterized by synaptic currents, including rapid rise and slower decreases. One of these recordings was performed using a K-gluconate base pipette solution and by keeping the cells at -40 mV, we can observe both outward (inhibitory) and inward (stimulatory) currents (FIGS. 8di and dii). . Biocithin was injected into all 14 cells, but only 5 cells recovered after the completion of the immunostaining process. However, all five biocithin filled cells were labeled TH (FIG. 8E-G).
토론debate
본 발명자는 여기에서, 중뇌 뉴런 돌출 특성을 갖는 기능성 DA 뉴런이 3개의 단순한 비유전학적 단계: FGF2를 사용한 신경외배엽 세포의 유도, 신경외배엽 형성동안에 FGF8 및 SHH에 의한 뇌실 중뇌 실체의 특정화 및 지역적으로 특정화된 선구체의 DA 뉴런으로의 분화를 통해 사람 ES 세포로부터 효율적으로 생성될 수 있음을 입증하였다. 중뇌 특성을 갖는 DA 뉴런이 증식된 신경외배엽 세포로부터 생성될 수 있다는 마우스 ES 세포 연구로부터 수득된 발견[문헌참조: Lee, S.H., et al., supra, 2000]과 같지 않게 본 발명자는 전구체 세포가 Sox1+ 신경외배엽 세포 가 되기 전에 FGF8을 사용한 특정화 또는 지역화는 올바른 중뇌 및 기능적 표현형을 갖는 사람 DA 뉴런의 왕성한 생성을 위해 필수적임을 밝혔다.Herein, we present a functional DA neuron with midbrain neuronal protrusion properties in three simple non-genetic steps: induction of neuroectodermal cells using FGF2, specification of ventricular midbrain entities by FGF8 and SHH during neuroectodermal formation, and locally. It has been demonstrated that differentiation of specialized precursors into DA neurons can be produced efficiently from human ES cells. Unlike the findings obtained from mouse ES cell studies that DA neurons with midbrain characteristics can be produced from proliferated neuroectodermal cells (Lee, SH, et al., Supra, 2000), the inventors have found that precursor cells Characterization or localization with FGF8 before becoming Sox1 + neuroectodermal cells has been shown to be essential for the vigorous generation of human DA neurons with the correct midbrain and functional phenotype.
줄기 세포 생물학 관점에서, 마우스 ES 세포를 신경외배엽 세포로 관련시키고 이들을 증식시키고 이들을 FGF8 및 SHH로 지역화하거나 특정화함에 이어서 이들을, 맥케이(McKay) 및 동료들에 의해 개발된 단계적 프로토콜을 사용하여 DA 뉴런으로 분화시키는 것이 매우 논리적인 것 처럼 보인다[문헌참조: Lee, S. H., et al., supra, 2000]. 본 발명자는 동일한 원칙이 사람 영장류에게 적용되어야만 한다고 가정하였다. 실질적으로, 본 발명자는 사람 ES 세포를, FGF2의 존재하에 Sox1을 발현하고 신경관형 로제트를 구성하는 신경외배엽 세포로 분화시키고[문헌참조: Zhang, S.C., et al., supra, 2001] 신경외배엽 세포를 FGF8 및 SHH로 처리하여 배쪽 중뇌 페이트를 유도하고 최종적으로 세포를 뉴런으로 분화시킴에 의해 다수의 DA 뉴런을 생성시킬 수 있다. 그러나, 이러한 방식으로 생성된 DA 뉴런의 대부분은 중뇌 돌출 DA 뉴런의 주요 특성중 일부, 예를 들어, 복합한 형태를 갖는 대형 크기 및 단백질 수준에서 중뇌 전사 인자의 발현이 없다. Sox1 양성 신경외배엽 세포는, FGF8 및 SHH로 처리한 후에도, 여전히 En-1에 대해 음성이지만 Bf1에 대해서는 양성이어서 Sox1 발현 신경외배엽 세포가 중뇌 페이트로의 특정화를 위해 무반응함을 제안한다. 본 발명의 배양 시스템에서 사람 ES 세포로부터 신경외배엽의 분화 과정은 생체내 발육동안에 보여지는 것과 병행한다[문헌참조: Zhang, S.C., supra, 2003]. 생체내에서, 신경관은 사람 임신 3주 말기에 형성하고 Sox1은 마우스 배아 연구를 기초로 신경관 폐쇄 동안에 신경외배엽에 의해 발현된다[문 헌참조: Pevny, L. H., et al., Development 125: 1967-1978,1998]. 배양물에서, 신경외배엽 세포는 신경관형 로제트를 형성하고 6일된 사람 배아와 동일한 사람 ES 세포로부터의 분화 2주 후에 Sox1을 발현한다[문헌참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998]. 중뇌 DA 뉴런을 포함하는 돌출 뉴런은 조기 단계에서 신경관 튜브에서 신경외배엽 세포로부터 분화하고 이들 신경외배엽 세포는 이미 신경관 폐쇄 과정 동안에 지역적으로 특정화되어 있다[문헌참조: Lumsden, A. and Krumlauf, R. , supra, 1996] 이것은 전뇌 표현형을 갖는 사람 ES 세포 생성된 Sox1 발현 신경외배엽 세포가 중뇌 표현형을 갖는 DA 뉴런을 생성시키기 위한 노르포겐에 응답하지 않는 이유를 설명할 수 있다. FGF8이 조기 전구체가 중뇌 실체를 사용하도록 지시할 수 있다는 본 발명자의 가정은, 조기 로제트에서 Sox1- 원주 세포가 FGF8로 처리된 후 중뇌 마커 En1의 복잡한 과정 및 발현과 함께 대형 세포체와 같은 돌출 뉴런의 특성을 갖는 DA 뉴런의 생성에 의해 확인된다.From a stem cell biology perspective, we associate mouse ES cells with neuroectodermal cells and propagate them and localize or characterize them with FGF8 and SHH and then transfer them to DA neurons using a stepwise protocol developed by McKay and colleagues. Differentiation seems to be very logical (Lee, SH, et al., Supra, 2000). We have assumed that the same principle should apply to human primates. Indeed, we differentiate human ES cells into neuroectodermal cells that express Sox1 in the presence of FGF2 and constitute a neural tubular rosette (Zhang, SC, et al., Supra, 2001). Can be treated with FGF8 and SHH to induce ventral midbrain fate and finally differentiate cells into neurons to generate multiple DA neurons. However, most of the DA neurons produced in this manner lack some of the major properties of midbrain protruding DA neurons, for example, the expression of midbrain transcription factors at large size and protein levels with complex morphology. Sox1 positive neuroectodermal cells are still negative for En-1 but positive for Bf1 after treatment with FGF8 and SHH, suggesting that Sox1 expressing neuroectodermal cells are non-responsive for specification to midbrain fat. The differentiation process of neuroectodermal from human ES cells in the culture system of the present invention is parallel to that seen during in vivo development (Zhang, SC, supra, 2003). In vivo, neural tubes are formed at the end of the third week of human gestation and Sox1 is expressed by neuroectodermals during neural occlusion based on mouse embryo studies. Pevny, LH, et al., Development 125: 1967-1978 , 1998]. In culture, neuroectodermal cells form neural tubular rosettes and express Sox1 two weeks after differentiation from the same human ES cells as 6-day-old human embryos (Thomson, JA, et al., Supra, 1998). Protruding neurons, including midbrain DA neurons, differentiate from neuroectodermal cells in neural tube tubes at an early stage and these neuroectodermal cells are already localized during the neural tube closure process. Lumsden, A. and Krumlauf, R., supra, 1996] This may explain why human ES cell generated Sox1 expressing neuroectodermal cells with a whole brain phenotype do not respond to norogens for producing DA neurons with a midbrain phenotype. The assumption that FGF8 can direct early precursors to use midbrain entities suggests that proliferating neurons, such as large cell bodies, with complex processes and expression of the midbrain marker En1 after Sox1 - columnar cells are treated with FGF8 in early rosettes. Confirmed by the generation of DA neurons with characteristics.
현재, 사람 ES 세포 유래된 신경외배엽 세포와는 다르게 FGF2 유도된 마우스 ES 세포 유래된 신경외배엽 세포가 증식후 효율적으로 지역화될 수 있는 이유는 명백하지 않다. 마우스 척주로부터 분리된 신경 선구체의 등쪽 또는 배쪽 실체가 배양시, 특히, FGF2의 존재하에 탈조절될 수 있다는 최근 증거가 있고[문헌참조: Gabay, L., et al., Neuron 40: 485-499,2003] 이것은 증식된 마우스 ES 유래 신경외배엽 세포가 재특정화될 있는 능력을 부분적으로 설명할 수 있다. 척수 운동 뉴런과 같은 기타 돌출 뉴런의 분화에 대한 본 발명자의 연구는 대형 돌출 뉴런의 생 성이 모르포겐의 조기 작용을 요구한다는 본 발명의 관찰과 일치한다.Currently, it is not clear why, unlike human ES cell derived neuroectodermal cells, FGF2-derived mouse ES cell derived neuroectodermal cells can be efficiently localized after proliferation. There is recent evidence that the dorsal or ventral entity of neural precursors isolated from the mouse spinal column can be deregulated in culture, especially in the presence of FGF2 [Gabay, L., et al., Neuron 40: 485- 499,2003] This may partly explain the ability of proliferated mouse ES derived neuroectodermal cells to be respecific. Our study of the differentiation of other protruding neurons, such as spinal motor neurons, is consistent with our observation that the generation of large protruding neurons requires early action of morphogens.
DA 뉴런은 중뇌, 시상하부, 망막 및 후각망울을 포함하는 뇌의 여러 영역에 존재한다. 본 연구에서 사람 ES 세포 생성된 DA 뉴런은 중뇌 돌출 DA 뉴런과 유사하다. DA 뉴런의 대부분은 GABA를 동시 발현하지 않는 반면 GABA 및 TH의 동시 발현은 후각 DA 상호뉴런의 주요 특징이다[문헌참조: Kosaka, T., et ai., supra, 18987; Gall, C. M. , et al., supra, 1987]. 중뇌에는 2개 이상의 DS 뉴런 주요 그룹이 있고 이들 한 그룹은 흑색질(A9)에 있고 또 다른 하나는 배쪽 피개 영역(A10)에 있으며 각각 상이한 표적물을 갖는다[문헌참조: Bjorklund, A. and Lindvall, O., Handbook of Chemical Neuroanatomy, Vol. 2: Classical Transmitters in the CNS (Bjorklund, A. , Hokfelt, T. , eds), Amsterdam, Elsevier Science Publishers, pp. 55-111,1984]. 배쪽 피개 영역에서 대부분의 DA 뉴런은 캘빈딘 또는 CCK를 발현하는 반면 흑색질에서는 거의 나타나지 않는다[문헌참조: McRitchie, D. A., et al., J. Comp. Neurol. 364: 121-150, 1996; Hokfelt, T., et al., Neurosci. 5: 2093-2124, 1980; Haber, S. N., et al., J. Comp. Neurol. 362: 400-410,1995]. 사람 ES 세포 생성된 DA 뉴런은 CCK8 또는 캘빈딘과 함께 TH를 동시발현하지 않는다는 본 발명자의 관찰은 이들 DA 뉴런이 흑색질 DNA 뉴런과 보다 유사함을 제안한다.DA neurons are present in several areas of the brain, including the midbrain, hypothalamus, retina and olfactory bulb. Human ES cell generated DA neurons in this study are similar to midbrain protruding DA neurons. Most DA neurons do not co-express GABA, while co-expression of GABA and TH is a major feature of olfactory DA interneurons. Kosaka, T., et ai., Supra, 18987; Gall, C. M., et al., Supra, 1987]. In the midbrain there are at least two major groups of DS neurons, one in the black matter (A9) and the other in the ventral overlying region (A10), each with a different target. Bjorklund, A. and Lindvall, O., Handbook of Chemical Neuroanatomy, Vol. 2: Classical Transmitters in the CNS (Bjorklund, A., Hokfelt, T., eds), Amsterdam, Elsevier Science Publishers, pp. 55-111,1984]. Most DA neurons in the ventral overlying region express Calvindine or CCK, while they are rarely seen in melanoma (McRitchie, D. A., et al., J. Comp. Neurol. 364: 121-150, 1996; Hokfelt, T., et al., Neurosci. 5: 2093-2124, 1980; Haber, S. N., et al., J. Comp. Neurol. 362: 400-410, 1995. Our observation that human ES cell generated DA neurons do not co-express TH with CCK8 or Calvindine suggests that these DA neurons are more similar to melanocyte DNA neurons.
중뇌 DA 뉴런과 같은 적당한 지역적 실체를 갖는 대형 돌출 뉴런을 생성하는 사람 ES 세포의 왕성한 능력은 사람 ES 세포 시스템을 사용하는 신경 발육의 조기 단계를 해부하기 위한 전례없는 기회를 개방하였다. 본 발명의 데이타는 FGF8과 같은 모르포겐이 조기 출현 중뇌 돌출 DA 뉴런의 생성을 위해 비특정화된 조기 신경외배엽 세포에 작용해야만 한다는 것을 입증한다. 이것은 이미 특정화된 배아 및 성인 포유동물 뇌로부터 분리되고 증식된 줄기 세포 또는 선구체가 돌출 뉴런을 생성하는데 무반응한 이유를 설명할 수 있다[문헌참조: Svendsen, C. N., etai., Exp. Neurol. 148: 135-146,1997 ; Daadi, M. M. and Weiss, S., J. Neurosci. 19: 4484-4497, 1999; Storch, A., et al., EXp. Neurol. 170: 317-325,2001]. 시험관내 생성된 사람 DA 뉴런은 또한 사람 DA 뉴런에 영향을 미칠 수 있는 화학물질 및 약물에 대한 독성학적 및 약제학적 스크리닝을 위한 시스템을 제공한다. 연구는 배양 평판 접시에서 생성된 이들 사람 DA 뉴런이 PD 동물 모델에서 기능적인지를 결정하기 위해 진행중에 있다.The vigorous ability of human ES cells to generate large protruding neurons with appropriate local entities, such as midbrain DA neurons, opens up an unprecedented opportunity to dissect the early stages of neural development using human ES cell systems. The data of the present invention demonstrate that morphogens, such as FGF8, must act on unspecified early neuroectodermal cells for the generation of early emergent midbrain DA neurons. This may explain why stem cells or precursors that have been isolated and expanded from already specified embryonic and adult mammalian brains have been unresponsive to producing overhanging neurons. See Svendsen, C. N., etai., Exp. Neurol. 148: 135-146,1997; Daadi, M. M. and Weiss, S., J. Neurosci. 19: 4484-4497, 1999; Storch, A., et al., EXp. Neurol. 170: 317-325, 2001. In vitro generated human DA neurons also provide a system for toxicological and pharmaceutical screening for chemicals and drugs that may affect human DA neurons. Studies are ongoing to determine whether these human DA neurons generated in culture plate dishes are functional in the PD animal model.
방법Way
ES 세포 배양. 사람 ES 세포주, H9(p21-56) 및 H1(p35-40)은 문헌[참조: Thomson, J.A., et al., supra, 1998]에 기재된 바와 같이 듈베코 변형 이글 배지(DMEM)/F12(Gibco), 20% 혈청 대용물(Gibco), 1mM의 글루타민(Sigma), 0.1M의 비필수 아미노산(Gibco), 2㎍/ml이 헤파린(Sigma), 0.1mM β-머캅토에탄올(Sigma) 및 4ng/ml의 FGF2(R & D Systems)으로 이루어진 ES 세포 성장 배지를 매일 갈아주면서 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)상에서 매주 증식시켰다. 분화된 콜로니는 굴곡 파스테르 피펫을 사용하여 물리적으로 제거하고 미분화된 상태의 ES 세포는 전형적인 형태 및 Oct4 및 SSEA4로 면역염색시켜 확인하였다. ES cell culture. Human ES cell lines, H9 (p21-56) and H1 (p35-40), are described in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 (Gibco) as described in Thomson, JA, et al., Supra, 1998. ), 20% serum substitute (Gibco), 1 mM glutamine (Sigma), 0.1 M non-essential amino acid (Gibco), 2 μg / ml heparin (Sigma), 0.1 mM β-mercaptoethanol (Sigma) and 4 ng ES cell growth medium consisting of / ml of FGF2 (R & D Systems) was propagated weekly on irradiated mouse embryo fibroblasts (MEF) with daily change. Differentiated colonies were physically removed using a curved Paster pipette and the ES cells in undifferentiated state were identified by immunostaining with typical morphology and Oct4 and SSEA4.
신경외배엽 세포의 분화 및 집적. 사람 ES 세포 콜로니는 배양물을 0.2mg/ml의 디스파제(Roche Diagonostics)으로 처리함에 의해 MEF 층으로부터 탈착시키고 ES 세포 배지를 매일 갈아주면서 4일동안 부유 세포 응집체(배상체)로서 성장시킨다. 이들을 이어서 N2(Gibco), 0.1mM의 비필수 아미노산, 2㎍/ml의 헤파린이 보충된 DMEM/F12(2:1)로 이루어진 신경 배지에서 배지를 2일에 1회 갈아주면서 접착 기질로 성장시킨다. ES 세포 응집체는 부착하고 약 6일째에 각각의 콜로니를 형성하였다. 신경관형 로제트를 구성하는 원주 세포에 의해 나타나는 신경외배엽 세포는 약 14일째에 발육하였다[문헌참조: Zhang, S.C., et al., supra, 2001]. 신경 로제트는 차등 효소적 반응을 통해 분리하였다[문헌참조: Zhang, S.C., et al., supra, 2001]. 성장 인자는 분화 과정동안에 첨가하여 지역화에 영향을 준다(결과를 나타냄) Differentiation and accumulation of neuroectodermal cells. Human ES cell colonies are detached from the MEF layer by treatment of the cultures with 0.2 mg / ml of Roche Diagonostics and grown as floating cell aggregates (embryoderm) for 4 days with daily ES cell medium change. They are then grown to an adhesive substrate in a medium of nerve medium consisting of DMEM / F12 (2: 1) supplemented with N2 (Gibco), 0.1 mM non-essential amino acid, and 2 μg / ml heparin. . ES cell aggregates attached and formed respective colonies about 6 days. Neuroectodermal cells, represented by the columnar cells that make up the neural tubular rosette, developed on day 14 (Zhang, SC, et al., Supra, 2001). Neural rosettes were isolated via differential enzymatic reactions (Zhang, SC, et al., Supra, 2001). Growth factors are added during the differentiation process to influence localization (shows results).
DA 뉴런 분화. 집적된 신경외배엽 세포는 37℃에서 10 내지 15분동안 PBS중의 0.025% 트립신 및 0.27mM EDTA에 의해 해리하고 12-mm 커버슬립(100㎍/ml의 폴리오르니틴 및 10㎍/ml의 라미닌으로 예비 피복시킴)상으로 커버슬립당 40,000-50,000의 밀도로 분주한다. 신경분화 배지는 N2, 0.1mM의 비필수 아미노산, 0.5mM의 글루타민, 1㎍/ml의 라미닌, 1μM의 cAMP, 200μM의 AA(Sigma), 10ng/ml의 BDNF(R & D Systems) 및 10ng/ml의 GDNF(R & D Systems)가 보충된 신경기본 배지(Gibco)로 이루어진다. 당해 세포를 2일에 1회 배지를 갈아주면서 3주 내지 4주동안 배양하였다. DA neuron differentiation. Accumulated neuroectodermal cells were dissociated by 0.025% trypsin and 0.27 mM EDTA in PBS for 10-15 minutes at 37 ° C. and preliminary with 12-mm coverslips (100 μg / ml polyornithine and 10 μg / ml laminin). Coating) at a density of 40,000-50,000 per coverslip. Neuronal differentiation medium is N2, 0.1 mM non-essential amino acid, 0.5 mM glutamine, 1 μg / ml laminin, 1 μM cAMP, 200 μM AA (Sigma), 10 ng / ml BDNF (R & D Systems) and 10 ng / Neuronal basal medium (Gibco) supplemented with ml of GDNF (R & D Systems). The cells were cultured for 3-4 weeks with changing medium once every two days.
면역세포화학 및 세포 정량. 커버슬립 배양물을 10 내지 20분동안 PBS중에 또는 5분동안 메탄올(-20℃)중에서 4% 파라포름알데하이드중에 고정화시키고 면역 염색을 위한 처리를 하였다[문헌참조: Zhang, S.C., et al., supra, 2001]. 하기의 1차 항체를 사용하였다: 마우스 항-SSEA4(1:40), 마우스 항-En-1(1:50) 및 마우스 항-Pax6(1:5000, 모두 발육 연구 하이브리도마 뱅크로부터 구함); 래빗 항 DβH(1:400), 마우스 항-시냅토피신(1:5000) 및 래빗 항-CCK8(1:2000, 모두 케미콘(Chemicon)으로부터 구함); 마우스 항-TH(1:1000), 마우스 항-βIII 튜불린(1:5000), 래빗 항-GABA(1:5000) 및 마우스 항-캘빈딘(1:400, 모두 시그마로부터 구함); 래빗 항-TH(1:500) 및 래빗 항-VMAT2(1:500, 모두 펠 프리즈(Pel-Freez)로 부터 구함); 염소 항-c-Ret(1:400) 및 마우스 항-Oct4(1:1000, 둘다 산타 크루즈(Santa Cruz)로부터 구함); 래빗 항-Bf1(1:5000; 로렌즈 스튜더(Lorenz Studer)로부터 기증받음). 항체-항원 반응은 적당한 형광-접합된 2차 항체로 밝혀졌다. 세포 핵은 훽스트 33342로 염색시켰다. 염색은 니콘 형광 현미경으로 가시화하였다. 성인 랫트 및 E38 배아 몽키 기원의 뇌 절편을 신경 유형 및 신경물질에 대한 많은 항체에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 음성 대조군은 또한 면역염색 과정에서 1차 또는 2차 항체를 제외시켜 설정하였다. 세포 계수는 대안렌즈 및 40 x 대물렌즈상에서 그물주머니를 사용하여 맹목적으로 수행하였다. 10개의 가시적 영역에서의 세포는 각각의 커버슬립으로부터 무작위로 선별하고 계수하였다. Immunocytochemistry and Cell Quantitation. Coverslip cultures were immobilized in 4% paraformaldehyde in PBS for 10-20 minutes or in methanol (-20 ° C.) for 5 minutes and treated for immunostaining. Zhang, SC, et al., supra, 2001]. The following primary antibodies were used: mouse anti-SSEA4 (1:40), mouse anti-En-1 (1:50) and mouse anti-Pax6 (1: 5000, all from developmental study hybridoma banks) ; Rabbit anti-DβH (1: 400), mouse anti-synaptopycin (1: 5000) and rabbit anti-CCK8 (1: 2000, all obtained from Chemicon); Mouse anti-TH (1: 1000), mouse anti-βIII tubulin (1: 5000), rabbit anti-GABA (1: 5000) and mouse anti-calvindine (1: 400, all obtained from Sigma); Rabbit anti-TH (1: 500) and rabbit anti-VMAT2 (1: 500, both obtained from Pel-Freez); Goat anti-c-Ret (1: 400) and mouse anti-Oct4 (1: 1000, both obtained from Santa Cruz); Rabbit anti-Bf1 (1: 5000; donated by Lorenz Studer). Antibody-antigen responses have been found to be suitable fluorescently conjugated secondary antibodies. Cell nuclei were stained with Hoechst 33342. Staining was visualized with a Nikon fluorescence microscope. Brain sections of adult rat and E38 embryonic monkey origin were used as positive controls for many antibodies to nerve types and neurons. Negative controls were also set up by excluding primary or secondary antibodies in the immunostaining process. Cell counts were performed blindly using a mesh pocket on the alternative and 40 × objectives. Cells in the ten visible regions were randomly selected and counted from each coverslip.
RT-PCTRT-PCT
총 RNA를 RNA Stat-60(Tel-Test, Friendswood, TX)를 사용함에 이어서 DNaseI(DNA 부재, Ambion)를 사용하여 처리하여 배양된 세포로부터 추출하였다. cDNA의 합성은 제조업자의 지침에 따른 RT-PCR(Invitrogen)용 슈퍼스크립트 제1쇄 합성 시스템을 사용하여 수행하였다. PCR 증폭은 Taq 폴리머라제(Promega)를 사용한 표준 과정을 사용하여 수행하였다. 사이클 수는 특정 풍부한 mRNA에 따라 25 내지 35 사이클로 다양하고 15초동안 94℃에서 변성시키고 프라이머에 따라 55℃ 또는 60℃ 온도에서 30초동안 어닐링시키고 45초동안 72℃에서 연장시킨다. 음성 대조군은 역전사동안에 역전사효소 또는 PCR동안에 cDNA 샘플을 제외시켜 성취하였다. 프라이머 및 생성물 길이는 다음과 같다: GAPDH(5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3', 450 bp); Nurr1 (5'- CGATGCCTTGTGTTCAGGCGCAG-3', 5'-AGCCTTTGCAGCCCTCACAGGTG-3', 858 bp); Ptx3 (5'-GTGGGTGGAGAGGAGAACAA-3', 5'- TTCCTCCCTCAGGAAACAATG-3', 175 bp); Lmx1 b (5'- GGGATCGGAAACTGTTACTGC-3', 5'-GTAGTCACCCTTGCACAGCA-3', 218 bp); En-1 (5'-CCCTGGTTTCTCTGGGACTT-3', 5'-GCAGTCTGTGGGGTCGTATT-3', 162 bp).Total RNA was extracted from cultured cells by treatment using RNA Stat-60 (Tel-Test, Friendswood, TX) followed by DNaseI (DNA free, Ambion). Synthesis of cDNA was performed using a superscript single chain synthesis system for RT-PCR (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. PCR amplification was performed using a standard procedure using Taq polymerase (Promega). The number of cycles varies from 25 to 35 cycles depending on the specific abundant mRNA and is denatured at 94 ° C. for 15 seconds, annealed at 55 ° C. or 60 ° C. temperature for 30 seconds depending on the primer and extended at 72 ° C. for 45 seconds. Negative controls were achieved by excluding cDNA samples during reverse transcriptase or PCR. Primers and product lengths are as follows: GAPDH (5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ′, 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ′, 450 bp); Nurr1 (5'- CGATGCCTTGTGTTCAGGCGCAG-3 ', 5'-AGCCTTTGCAGCCCTCACAGGTG-3', 858 bp); Ptx3 (5'-GTGGGTGGAGAGGAGAACAA-3 ', 5'-TTCCTCCCTCAGGAAACAATG-3', 175 bp); Lmx1 b (5'-GGGATCGGAAACTGTTACTGC-3 ', 5'-GTAGTCACCCTTGCACAGCA-3', 218 bp); En-1 (5'-CCCTGGTTTCTCTGGGACTT-3 ', 5'-GCAGTCTGTGGGGTCGTATT-3', 162 bp).
DA 측정DA measurement
DA 신경 분화한지 21일 후에, 48시간동안 조건화된 배지를 수거하였다. 배양된 세포로부터 활성 의존적 도파민 방출은 15분동안 행크 균염 용액(HBSS)중에서 배양된 세포를 조건함에 이어서 이를 37℃에서 14분동안 56mM KCl을 함유하는 HBSS로 대체하여 측정하였다. 배양 배지 또는 HBSS중의 도파민은 20㎕의 안정화 완충액(10ml의 0.1M NaOH중의 900mg의 EGTA 및 700mg의 글루타티온)을 첨가하여 안정화시키고 샘플을 -80℃에서 저장하였다. HPLC 키트(Chromsystems)를 사용하여 모노아민을 추출하였다. 모노아민 수준은 MD-TM 이동상을 사용하여, 전기화학 검출기(Coulochem II, ESA Inc.)와 커플링된 HPLC(모델 508 자동샘플 채취기 및 모델 118 펌프, Beckman)로 측정하였다. 각각의 그룹내 배양물은 3등분하여 3개의 별도의 실험으로부터 데이타를 수거하였다.21 days after DA neural differentiation, conditioned media was harvested for 48 hours. Activity dependent dopamine release from cultured cells was determined by conditioning the cells incubated in Hank's homogenate solution (HBSS) for 15 minutes, then replacing them with HBSS containing 56 mM KCl for 14 minutes at 37 ° C. Dopamine in culture medium or HBSS was stabilized by the addition of 20 μl stabilization buffer (900 mg EGTA and 700 mg glutathione in 10 ml 0.1 M NaOH) and the samples were stored at -80 ° C. Monoamine was extracted using HPLC kit (Chromsystems). Monoamine levels were measured using HPLC (Model 508 autosampler and Model 118 pump, Beckman) coupled with an electrochemical detector (Coulochem II, ESA Inc.) using an MD-TM mobile phase. Cultures in each group were divided into three and data was collected from three separate experiments.
전기생리학적 기록Electrophysiological record
사람 ES 세포로부터 분화된 DA 뉴런의 전기생리학적 성질은 전세포 패치 클램프 기록 기술을 사용하여 조사하였다[문헌참조: Hammill, O. P., et al., Pflugers Arch. 391: 85-100, 1981]. 피펫에, (mM)KCl 140 또는 K-글루코네이트 140, Na+-HEPES 10, BAPTA 10, Mg2+-ATP 4, (pH 7.2, 290mOsm, 2.3-5.0MΩ)을 함유하는 세포내 용액을 채웠다. 비오시틴(0.5%, Sigma)을 기록 용액에 첨가하고 이어서 스트렙트아비딘-알렉스 플루르 488(1:1000, Molecular Probes) 및 TH에 대한 항체로 표지시켜 DA 뉴런을 동정하였다. 욕조 용액은 mM로 NaCl 127, KH2PO4 1.2, KCl 1.9, NaHCO3 26, CaCl2 2.2, MgSO4 1.4, 글루코스 10, 95% O2/5% CO2(pH 7.3. 300mOsm)을 함유하였다. 몇몇 양태에 대해, TTX(1㎛)를 욕조 용액에 적용하여 전압 개폐 나트륨 전류를 차단하였다.The electrophysiological properties of DA neurons differentiated from human ES cells were investigated using whole cell patch clamp recording techniques. Hammill, OP, et al., Pflugers Arch. 391: 85-100, 1981. The pipette was filled with an intracellular solution containing (mM) KCl 140 or K-gluconate 140, Na + -
전류 클램프 및 전압 클램프 기록은 멀티클램프 700A 증폭기(Axon Instrument)를 사용하여 수행하였다. 시그날을 4kHz에서 거르고 디지데이타 1322A 아날로그-디지탈 컨버터(Axon Instruments)를 사용하여 10kHz에서 샘플링하여 획득하고 시판되는 소프트웨어(pClamp9, Axon Instruments)를 사용하여 컴퓨터 하드 디스크에 저장하였다. 접근 저항성은 전형적으로 818MΩ이고 증폭기 회로를 사용하여 50 내지 80%까지 보상하였다. 전압은 +13mV의 액체 접속 전위에 대해 보정하였 다[문헌참조: Neher, E., Methods Enzymol, 207:123-131, 1992]. V휴지기 및 작용 전위는 전류 클램프 모드로 조사하였다. 자발적 자극(내향) 및 억제(외향) 시냅스 전류는 K-글루코네이트 기본 피펫을 사용한 전압 클램프 모드 및 V유지 = 40mV에서 특성 분석되었다. 시냅스 반응은 주형 검출 알고리듬(소형 분석 프로그램 4.6.28, 시냅토소프트)을 사용하여 검출하였고 불활성화 단계는 레벤베르크-마르쿠아르트(Levenberg-Marquardt) 알고리듬을 사용한 이중 대수 함수로 조정하였다. 데이타는 평균 ± SE로서 제공되었다.Current clamp and voltage clamp recordings were performed using a multiclamp 700A amplifier (Axon Instrument). Signals were filtered at 4 kHz, sampled at 10 kHz using a Digidata 1322A analog-to-digital converter (Axon Instruments) and stored on a computer hard disk using commercially available software (pClamp9, Axon Instruments). Access resistance is typically 818 MΩ and compensated by 50-80% using an amplifier circuit. The voltage was corrected for a liquid connection potential of +13 mV (Neher, E., Methods Enzymol, 207: 123-131, 1992). The V resting period and the action potential were investigated in the current clamp mode. Spontaneous stimulation (inward) and suppression (outward) synaptic currents were characterized at voltage clamp mode and V hold = 40 mV using a K-gluconate base pipette. Synaptic responses were detected using a template detection algorithm (Small Analysis Program 4.6.28, SynaptoSoft) and the inactivation step was adjusted to a double algebraic function using the Levenberg-Marquardt algorithm. Data were given as mean ± SE.
실시예 3- 운동 뉴런의 생성Example 3- Generation of Motor Neurons
척추 동물에서 운동 뉴런의 생성은 3개 이상의 단계가 관여하고 있다: 외배엽 세포의 신경화, 신경외배엽 세포의 꼬리쪽화 및 꼬리쪽화된 신경 선구체의 배쪽화[문헌참조: Jessell, T. M., Nat. Rev. Genet. 1: 20-29,2000]. 본 발명자는 먼저 척추동물의 신경외배엽이 FGF 및/또는 항-BMF(골 형태유전학적 단백질) 시그날에 응답하여 발육한다는 원칙을 기초로[문헌참조:Wilson, S. I. and Edlund, T. , Nat. Neurosci. 4: Suppl. : 1161-1168, 2001] FGF2의 존재하에 접착 콜로니 배양을 사용하여[문헌참조: Zhang, S. C., et ai., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133, 2001] hES 세포로부터 효율적인 신경외피 분화를 위한 배양 시스템[문헌참조: Thomson, J. A., et ai., Science 282: 1145-1147, 1998) (H1 및 H9 주)]을 확립하였다. 신경분화의 제1 징후는 ES 세포가 분화용 영양 공급 세포로부터 제거된 후 8 내지 1일된 콜로니 중앙에서 로제트를 형성하는 원주 세포의 출현이었다. 로제 트내 원주 세포는, 신경관 형성동안에 신경상피 세포에 의해 발현되는 범-신경외배엽 전사 인자 SoxI(도 9A)[문헌참조: Pevny, L. H., et al., Development 125: 1967-1978, 1998]가 아니라 신경외배엽 마커 Pax6을 발현하지만 과성장 영역에서 편평 세포는 발현하지 못했다. 4 또는 5일동안 동일한 배지에서 추가로 배양하면서, 원주 세포는 루멘과 함께 신경관형 로제트를 구성하고(도 9B) Pax6 및 Sox1(도 9C, D) 둘다를 발현시켰다. 따라서, hES 세포로부터 신경외배엽 세포의 분화는 2개 이상의 특징적인 단계를 포함한다: 신경 유도 후 8일 내지 10일째에 조기 로제트내 Pax6+/Sox1- 원주 세포 및 유도 후 14일째에 신경관형 후기 로제트를 형성하는 Pax6+/Sox1+ 세포.The generation of motor neurons in vertebrates involves three or more stages: neurization of ectoderm cells, caudalization of neuroectodermal cells, and embryonicization of caudalized neural precursors. Jessell, TM, Nat. Rev. Genet. 1: 20-29,2000]. We first based on the principle that neuroectodermals of vertebrates develop in response to FGF and / or anti-BMF (bone morphological protein) signals (Wilson, SI and Edlund, T., Nat. Neurosci. 4: Suppl. : 1161-1168, 2001] using adhesive colony cultures in the presence of FGF2. Zhang, SC, et ai., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133, 2001] A culture system for efficient neural envelope differentiation from hES cells (Thomson, JA, et ai., Science 282: 1145-1147, 1998) (H1 and H9) was established. . The first sign of neuronal differentiation was the appearance of columnar cells forming a rosette in the center of colonies 8 to 1 day after ES cells were removed from trophic feed cells for differentiation. The columnar cells in the rosette are not pan-neroderm transcription factor SoxI (FIG. 9A) expressed by neuroepithelial cells during neural tube formation (Pevny, LH, et al., Development 125: 1967-1978, 1998). Expression of the neuroectodermal marker Pax6 but no squamous cells in the overgrowth region. On further incubation in the same medium for 4 or 5 days, the columnar cells formed neural tubular rosettes with lumens (FIG. 9B) and expressed both Pax6 and Sox1 (FIG. 9C, D). Thus, differentiation of neuroectodermal cells from hES cells comprises at least two characteristic steps: Pax6 + / Sox1 - columnar cells in early rosettes on days 8-10 after nerve induction and neural tubular late rosettes on day 14 after induction Pax6 + / Sox1 + cells to form.
면역세포화학적 분석은 Pax6(도 9E), Sox1 및 네스틴을 발현하는 로제트 세포는 전뇌 및 중뇌 세포에 의해 발현되는 호메오도메인 단백질인 Otx2(도 9F, H)에 대해 양성이지만 척주내 세포에 의해 생성되는 호메오도메인 단백질인 HoxC8(도 9H)에 대해서는 음성이다. 이들은 또한 중뇌 세포에 의해 발현되는 En1에 대해 음성이다(도 9G). 이들 결과는 신경외배엽 세포가 조기 생체내 발육동안에 신경외배엽 세포에 의해 초기에 획득되는 것(문헌참조: Stem, D.C., Nat. Rev. Neurosci.2:92-98, 2001)과 유사한 전뇌 표현형을 소유함을 제안한다. Immunocytochemical analysis showed that Rosette cells expressing Pax6 (FIG. 9E), Sox1 and Nestin were positive for Otx2 (FIG. 9F, H), a homeodomain protein expressed by forebrain and midbrain cells, but not by intrathecal cells. It is negative for HoxC8 (FIG. 9H) which is the homeodomain protein produced. They are also negative for En1 expressed by midbrain cells (FIG. 9G). These results indicate that neuroectodermal cells possess a forebrain phenotype similar to that initially obtained by neuroectodermal cells during early in vivo development (Stem, DC, Nat. Rev. Neurosci. 2: 92-98, 2001). Suggests.
신경외배엽 세포로부터 운동 뉴런을 분화시키기 위해, 신경관형 로제트내 Sox1+ 신경외배엽 세포를 효소적 처리를 통해 분리하고[문헌참조: Zhang, S. C., et al., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133, 2001] 레티노산(RA, 0.001 - 1μM), 꼬리쪽 화 시약(문헌참조: Blumberg, B. , et al., Development 124: 373-379,1997) 및 SHH(50 내지 500ng/ml), 배쪽화 모르포겐(문헌참조: Jessell, T. M., Nat. Rev. Genet. 1: 20-29,2000 ; Briscoe, J. and Ericson, J., Curr. Opin. Neurobiol. 11: 43-49, 2001]의 존재하에 라미닌 기질상에서 분화시켰다. 분주한 후 14일까지, 과성장 영역에서 다수의 세포가 이들의 프로세스를 통해 네트워크를 형성하였다(도 10A). 면역염색 분석은 분화된 세포가 신경 마커 βIII-튜불린 및 MAP2에 대해 양성임을 지적하였다. 이들중 대부분(>50%)은 또한 운동 뉴런 발육과 연관된 전사 인자인 Isl1(도 10A) 및 Lim3(보이지 않음)에 양성이다[문헌참조: Jessell, T. M. , supra; Briscoe, J. and Ericson, J., supra, 2001; Shirasaki, R. and Pfaff, S. L., Annu. Rev. Neurosci. 25: 251-281, 2002]. 그러나, 1 내지 3주 사이에 배양물중의 매우 적은 세포가 운동 뉴런-특이적 전사 인자[문헌참조: Arber, S. , et al., Neuron 23: 659-674, 1999]인 HB9(도 10A)를 발현하였다. 이들은 Sox1+ 신경외배엽 세포가 운동 뉴런 유도에 대해 무반응일 수 있음을 시사한다.In order to differentiate motor neurons from neuroectodermal cells, Sox1 + neuroectodermal cells in neural tubular rosettes were isolated via enzymatic treatment, see Zhang, SC, et al., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133, 2001] retinoic acid (RA, 0.001-1 μM), caudalization reagents (Blumberg, B., et al., Development 124: 373-379,1997) and SHH (50-500 ng) / ml), embryonic morphogen (see Jessell, TM, Nat. Rev. Genet. 1: 20-29, 2000; Briscoe, J. and Ericson, J., Curr. Opin. Neurobiol. 11: 43 -49, 2001. On the laminin substrate in the presence of up to 14 days after dispensing, a number of cells in the overgrowth region networked through their processes (FIG. 10A). Is positive for neuronal markers β III -tubulin and MAP2, most of them (> 50%) are also positive for Isl1 (FIG. 10A) and Lim3 (not shown), which are transcription factors associated with motor neuron development [ See Jessell, TM, supra; Briscoe, J. and Ericson, J., supra, 2001; Shirasaki, R. and Pfaff, SL, Annu. Rev. Neurosci. 25: 251-281, 2002. However, 1 Very in culture between 2-3 weeks The small motor neuron cell-specific transcription factors. [Reference:. Arber, S., et al , Neuron 23: 659-674, 1999] was expressed in HB9 (Figure 10A) which Sox1 + neuroectodermal cell movement Suggests that there may be no response to neuronal induction.
Sox-1 발현 세포는 3주된 사람 배아와 동일한 시점에서 신경관형 로제트가 형성되고 Sox1이 발현되는 경우, 신경관내에서 신경외배엽 세포와 상응할 수 있다. 신경관에서 신경외배엽 세포는 지역적으로 특정화된다[문헌참조: Lumsden, A. and Krumlauf, R. , Science 274: 1109-1115,1996]. 이러한 고려는 본 발명자로 하여금 RA가, 신경외배엽 세포가 Sox1을 발현하기 전에, 꼬리쪽화 및/또는 운동 뉴런 특정화를 촉진할 수 있는 것으로 가정할 수 있도록 하였다. 본 발명자는 따라서 조기 단계, 즉 원주 세포가 로제트를 구성하기 시작하여 Pax6을 발현하는 경우에 신경외배엽 세포를 RA(0.001 내지 1μM)로 처리하였다. 6일동안 이러한 방식으로 처리된 배양물은 신경관형 로제트로 발육하고 Sox1을 발현하여 FGF2 처리된 배양물 기원과 구분할 수가 없다. 로제트 클러스터를 분리하고 라미닌 기질로 접착시킨 후, 다수의 돌기세포를 분주 후 24시간 내지 58시간 만큼 일찍이 클러스터로부터 연장시켰다. 분주 후 14일까지, 돌기세포 과성장 영역은 과성장 영역에 제한된 수의 신경 세포체가 있지만(도 10A) 전체(11-mm 직경) 커버슬립을 덮었다. 대다수의 세포는 lsl 1/2에 대해 양성이고 이중에서 약 50%는 또한 HB9+(도 10B)이고 이것은 이들 이중 양성 세포가 운동 뉴런임을 제안한다. lsl 1/2+ 및 HB9_ 세포는 상호뉴런이다.Sox-1 expressing cells may correspond to neuroectodermal cells in the neural tube when neural tubular rosettes are formed and Sox1 is expressed at the same time point as the three week human embryo. Neuroectodermal cells in the neural tube are localized (Lumsden, A. and Krumlauf, R., Science 274: 1109-1115,1996). This consideration allowed us to assume that RA can promote caudalization and / or motor neuron characterization before neuroectodermal cells express Sox1. We therefore treated neuroectodermal cells with RA (0.001-1 μM) at an early stage, ie when the columnar cells began to make up the rosette and expressed Pax6. Cultures treated in this manner for 6 days developed neural tubular rosettes and expressed Sox1, indistinguishable from FGF2 treated culture origin. After detaching the rosette clusters and adhering with laminin substrates, a number of progenitor cells were extended from the clusters as early as 24 to 58 hours after dispensing. By 14 days after dispensing, dendritic cell overgrowth areas covered the entire (11-mm diameter) coverslip, although there was a limited number of neuronal cell bodies in the overgrowth area (FIG. 10A). The majority of cells are positive for
HB9-발현 세포는 먼저 신경 로제틀가 분화를 위해 분주된 후 6일째에 나타나고 약 10일 내지 12일 후에 고비율에 도달하였다. 이들은 크게 클로스터로 국한되었고 클러스터내 총 세포의 약 21%이고 과성장 영역에서는 세포가 거의 없다(도 10A, D). 가장 고비율의 HB9+ 세포는 0.1 내지 1.0μM의 RA의 존재하에 유도하였다. 1.0μM 초과의 용량에서 RA는 화학적으로 규명된 부착 배양물에서 몇몇 세포를 퇴화시킨다. RA 또는 SHH 또는 이 둘다의 부재하에, 매우 적은 수의 HB9+ 세포(도 10D)가 있다. 모든 HB9-발현 세포는 βIII-튜불린(도 10C)으로 염색시켰다. 따라서, 조기 신경외배엽 세포에 대한 RA로의 처리는 운동 뉴런의 효율적 유도를 위 해 요구된다.HB9-expressing cells first appeared 6 days after neural rosettes were dispensed for differentiation and reached high rates after about 10-12 days. They were largely confined to closters and accounted for about 21% of the total cells in the cluster and few cells in the overgrowth region (Figures 10A, D). The highest percentage of HB9 + cells were induced in the presence of 0.1-1.0 μM RA. At doses greater than 1.0 μM, RA degrades some cells in chemically defined attachment cultures. In the absence of RA or SHH or both, there is a very small number of HB9 + cells (FIG. 10D). All HB9-expressing cells were stained with β III -tubulin (FIG. 10C). Thus, treatment with RA for early neuroectodermal cells is required for efficient induction of motor neurons.
RA가 후기가 아니라 조기에 신경외배엽 세포가 운동 뉴런으로 분화하도록 유도하는 이유를 이해하기 위해, 본 발명자는 먼저 신경외배엽 세포의 꼬리쪽화에 대한 RA의 효과를 조사하였다. 7일동안 RA(0.001 내지 1.0μM) 또는 FGF2(20ng/ml)를 사용한 조기 로제트 세포(Pax6+/Soxl-)의 처리는 Otx2의 발현을 감소시키고 용량 의존 방식으로 HoxB1, B6, C5 및 C8과 같은 Hox 유전자의 발현을 증가시켰다(도 11A). 보다 많은 꼬리쪽 세포에 의해 발현되는 유전자는 보다 고용량의 RA에 의해 유도되었다. 1주일동안 RA를 사용한 후기 로제트 세포(Pax6+/Sox1+)의 처리는 FGF2에 의해 유도된 Hox 유전자 발현의 패턴을 변화시키지 않았다(나타내지 않음). 신경 분화 배지에서 분리되고 배양된 RA 처리된 조기 로제트 세포는 처음 6일째 및 대부분은 분화 후 10일 내지 12일째에 HoxC8 단백질을 발현하였고 이것은 면역세포화학에 의해 밝혀졌다(도 11D). 이러한 단계에서의 세포는 Otx2를 발현하지 못한다(도 11C). 모든 HoxC8+ 세포는 βIII-튜불린+ 뉴런(도 11E)이었다. 대조적으로, 1주일동안 RA로 처리되고 이어서 2주동안 분화된 후기 로제트 세포는 약간의 HoxC8+ 세포를 생성시켰지만 Otx-2 발현 세포는 감소하였다(나타내지 않음). 따라서, 후기가 아니라 조기에 RA로 신경외배엽 세포의 처리는 척주 뉴런과 연관된 HoxC 단백질을 발현하면서 효율적인 꼬리쪽화를 유도한다[문헌참조: Liu, J. P., et al., Neuron 32: 997- 1012,2001].To understand why RA induces neuroectodermal cells to differentiate into motor neurons early rather than later, we first examined the effect of RA on caudalization of neuroectodermal cells. Treatment of premature rosette cells (Pax6 + / Soxl − ) with RA (0.001 to 1.0 μM) or FGF2 (20 ng / ml) for 7 days reduced the expression of Otx2 and in a dose dependent manner with HoxB1, B6, C5 and C8 Increased expression of the same Hox gene (FIG. 11A). Genes expressed by more caudal cells were induced by higher doses of RA. Treatment of late rosette cells (Pax6 + / Sox1 + ) with RA for 1 week did not change (not shown) the pattern of Hox gene expression induced by FGF2. RA treated early rosette cells isolated and cultured in neural differentiation medium expressed HoxC8 protein on the first 6 days and mostly on days 10-12 after differentiation, which was revealed by immunocytochemistry (FIG. 11D). Cells at this stage do not express Otx2 (FIG. 11C). All HoxC8 + cells were β III -tubulin + neurons (FIG. 11E). In contrast, late rosette cells treated with RA for 1 week and then differentiated for 2 weeks produced some HoxC8 + cells but decreased Otx-2 expressing cells (not shown). Thus, treatment of neuroectodermal cells with RA early rather than later leads to efficient tailing while expressing HoxC proteins associated with spinal neurons. Liu, JP, et al., Neuron 32: 997-1012,2001 ].
본 발명자는 따라서 배쪽화를 위한 조기 및 후기 신경외배엽 세포에 대한 SHH의 효과를 비교하였다. Pax6+ 또는 Sox1+ 이든 상관없이 hES 세포 유래 신경외배엽 세포는 척주에서 운동 뉴런 및 희소돌기아교세포가 되도록 운명지워진 배쪽 신경 선구체 세포에서 발현되는 호메오도메인 단백질인 Olig2(도 11F)를 발현하지 않았다[문헌참조: Lu, Q. R., et ai., Cell 109: 75-86,2002 ; Zhou, Q., et al., Neuron 31: 791-807,2001]. Pax6+/Sox1- 신경외배엽 세포를 1주동안 RA의 존재하에 배양함에 이어서 분리하고 추가로 SHH 부재하에 2주동안 분화시키는 경우, 극소수의 세포가 Olig2(나타내지 않음)를 발현하였다. 그러나, SHH의 존재(50 - 500ng/ml)하에, 많은 세포가 핵에서 Olig2를 발현하였다(도 11G). 대조적으로, 동일한 조건하에 2주동안 분화된 Pax6+/Sox1+ 신경외배엽 세포는 소수의 Olig2-발현 세포(도 11H)를 생성하였다. 따라서, 후기 단계가 아니라 조기 단계에서 RA로 처리된 신경외배엽 세포는 SHH에 응답하여 배쪽 신경 선구체 페이트로 효율적으로 유도될 수 있다.We therefore compared the effects of SHH on early and late neuroectodermal cells for embryonicization. No matter whether Pax6 + or Sox1 + , hES cell-derived neuroectodermal cells did not express Olig2 (FIG. 11F), a homeodomain protein expressed in ventral neural precursor cells destined to be motor neurons and oligodendrocytes in the spinal column. See Lu, QR, et ai., Cell 109: 75-86,2002; Zhou, Q., et al., Neuron 31: 791-807, 2001. Very few cells expressed Olig2 (not shown) when Pax6 + / Sox1 − neuroectodermal cells were cultured in the presence of RA for 1 week, then isolated and differentiated for another 2 weeks in the absence of SHH. However, in the presence of SHH (50-500 ng / ml), many cells expressed Olig2 in the nucleus (FIG. 11G). In contrast, Pax6 + / Sox1 + neuroectodermal cells differentiated for 2 weeks under the same conditions produced a few Olig2-expressing cells (FIG. 11H). Thus, neuroectodermal cells treated with RA at an early stage, but not at a later stage, can be efficiently induced into ventral neural precursor fate in response to SHH.
FGF2가 또한 꼬리쪽 페이트(도 11A)를 유도한다 하더라도 조기 RA 처리가 운동 뉴런 특정화를 위해 요구되는지의 이유를 추가로 분석하기 위해, 본 발명자는 척주에서 선구체 도메인을 정련하는데 중요한 클래식 I(Irx3, Pax6) 및 클래식 II(Olig2, Nkx2.2, Nkx6.1)의 발현을 조사하였다[문헌참조:Jessell, T. M., supra, 2000; Briscoe, J. , and Ericson, J., supra, 2001]. RA는 후기 신엽외배엽 세포에서 보다 조기에 특히 Olig2 및 Nkx6.1를 보다 강하게 발현하도록 유도한다(도 11B). 따라서,조기 신경외배엽 세포는 운동 뉴런 특정화를 위해 필수적인 SHH의 발현 및 클래식 II 요소의 발현을 상향조절하는데 있어서 RA에 보다 민감성이다.Although FGF2 also induces caudal fate (FIG. 11A), in order to further analyze why early RA treatment is required for motor neuron characterization, the inventors have identified a classic I (Irx3) important for refining the precursor domain in the spinal column. , Pax6) and the expression of Classic II (Olig2, Nkx2.2, Nkx6.1) were examined (Jessell, TM, supra, 2000; Briscoe, J., and Ericson, J., supra, 2001]. RA induces stronger expression of Olig2 and Nkx6.1 earlier, especially in late renal ectoderm cells (FIG. 11B). Thus, early neuroectodermal cells are more sensitive to RA in upregulating the expression of SHH and the expression of Classic II elements, which are essential for motor neuron characterization.
콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)를 발현하는 세포는 꼬리쪽화된 신경외배엽 세포가 운동 뉴런 분화를 위해 분주된 후 3주째에 나타나고 이들 세포는 본 연구에서 분석된 가장 긴 배양 기간인 7주까지동안 안정하게 증가하였다(도 12A). ChAT-발현 세포는 대부분 HB9+ 세포의 국소화에 상응하는 클러스터(도 12A)로 국소화된다. 이들 세포는 주로 다극성 세포이고 직경이 15 내지 20㎛인 대형 체세포이고 몇몇은 30㎛일정도로 크다(도 12A, B). 핵에서 HB9과 체세포 및 프로세스에서 ChAT의 동시발현은 배양 3주 후에 관찰되었다(도 12C). 대부분의 뉴런은 또한 아세틸콜린의 저장 및 분비를 위해 필수적인 다공성 아세틸콜린 수송체(VAChT, 도 12D)에 대해 양성으로 염색되었다. 특히 배양 5주 후에 많은 ChAT+ 세포는 세포체 및 프로세스상에서 시냅신에 대해 양성으로 표지되었다(도 12E).Cells expressing choline acetyltransferase (ChAT) appear three weeks after tailed neuroectodermal cells have been dispensed for motor neuron differentiation and these cells are stable for up to seven weeks, the longest culture period analyzed in this study. Increased (FIG. 12A). ChAT-expressing cells mostly localize into clusters (FIG. 12A) corresponding to localization of HB9 + cells. These cells are predominantly multipolar cells, large somatic cells 15-20 μm in diameter, and some are as large as 30 μm (FIGS. 12A, B). Co-expression of HB9 in the nucleus and ChAT in somatic cells and processes was observed after 3 weeks of culture (FIG. 12C). Most neurons were also stained positive for the porous acetylcholine transporter (VAChT, Figure 12D) which is essential for the storage and secretion of acetylcholine. In particular, after 5 weeks of culture, many ChAT + cells were labeled positive for synapsin on cell bodies and processes (FIG. 12E).
본 발명자는 전기생리학적 기술(n= 28개 세포)을 사용하여 기능적 성숙화를 평가하였다. 평균 휴지기 전위는 ∼36.9±2.6mV이고 입수 저항은 920±57Ω이었다. 단일 활동 전위(AP, 도 12Fi) 또는 계속적인 감소는 시험된 13개의 뉴런중 11개에서 전류 단계(0.15-0.2nA x 1s)를 탈분극시킴에 의해 유발되었다. 자발적 탈분극 시냅스 입수에 의해 유발되는 자발적 AP가 또한 관찰되었다(도 12G). 모든 세포가 기록 및 이에 따른 면역조직화학 분석중에 생존하는 것은 아니지만, 비오시틴 및 ChAT를 사용한 이중 면역염색은 본 발명자가 기록한 많은 세포가 운동 뉴런 임을 입증하였다(도 12J).We assessed functional maturation using electrophysiological techniques (n = 28 cells). The average resting potential was ˜36.9 ± 2.6 mV and the inrush resistance was 920 ± 57 Ω. Single action potential (AP, FIG. 12Fi) or continuous reduction was caused by depolarizing the current phase (0.15-0.2nA × 1s) in 11 of the 13 neurons tested. Spontaneous AP caused by spontaneous depolarized synaptic acquisition was also observed (FIG. 12G). While not all cells survived during recording and thus immunohistochemical analysis, dual immunostaining with biocitin and ChAT demonstrated that many of the cells we recorded were motor neurons (FIG. 12J).
전압 클램프 분석은 나트륨 및 지연된 정류기 칼륨 전류와 일치하는 시간 및 전압 의존성 내향 및 외향 전류를 밝혔다. 내향 전류 및 활동 전위는 0.1μM에 의해 차단됨으로 전압 활성화된 나트륨 채널의 존재를 확인시켜 주는 것이다. 외향 전류의 특징은 추가로 분석되지 않았다. 본 발명자는 또한 자발적인 시냅스 전류를 관찰하였다(도 12H, n= 시험된 23개의 세포중 21). 이들은 1.0μM의 TTX에 의해 주파수가 감소하였으나 제거되지는 않았으며 이것은 기능적으로 온전한 시냅스 신경전달이 존재함을 입증하는 것이다. Cs글루코네이트 기본 피펫 용액을 사용하여, 외향(억제)전류는 서서히 쇠퇴(13.6ms, n = 10 이벤트)하고 스트리크닌 및 비쿠쿨린의 배합물에 의해 차단되는 반면 잔류 내향(자극)전류는 신속하게 쇠퇴(2.1ms, n= 17 이벤트)하고 D-AP5 및 CNQX(도 12H, J)의 배합물에 의해 차단됨으로 이것은 억제(GABA/글라이신) 및 자극(글루타메이트) 신경전달이 온전한 척주에서와 같이 발생함을 입증하는 것이다[문헌참조: Gao, B. X., et al., J. Neurophvsiol. 79: 2277-2287, 1998].Voltage clamp analysis revealed time and voltage dependent inward and outward currents consistent with sodium and delayed rectifier potassium currents. Inward current and action potential are blocked by 0.1 μM to confirm the presence of voltage activated sodium channels. The characteristic of the outward current was not further analyzed. We also observed spontaneous synaptic currents (FIG. 12H, n = 21 of 23 cells tested). These frequencies were reduced but not eliminated by 1.0 μM TTX, demonstrating the existence of functionally intact synaptic neurotransmission. Using the Csgluconate base pipette solution, the outward (inhibition) current slowly declines (13.6 ms, n = 10 events) and is blocked by the combination of striknin and bicuculin, while the residual inward (stimulus) current rapidly declines ( 2.1 ms, n = 17 events) and blocked by the combination of D-AP5 and CNQX (FIG. 12H, J), demonstrating that inhibition (GABA / glycine) and stimulation (glutamate) neurotransmission occurs as in intact spinal column [Gao, BX, et al., J. Neurophvsiol. 79: 2277-2287, 1998].
본 발명의 연구는 기능적 운동 뉴런이 FGF2에 의한 신경외배엽 분화, 신경화의 후기 단계 동안에 RA에 의한 특정화 및/또는 꼬리쪽화 및 이어서 배쪽화 모르포겐 SHH의 존재하에 유사분열 후 운동 뉴런으로 분화함을 통해 사람 ES 세포로부터 효율적으로 생성될 수 있음을 입증한다. 따라서, 동물로부터 터득된 신경 발육의 기본 원리는 사람 영장류에 적용될 수 있고 시험관내에서 반복될 수 있다. 마우스 ES 세포로부터 운동 뉴런 분화의 최근 입증[문헌참조: Wichterle, H. , et al., Cell 110: 385-397, 2002]과는 반대로, 본 발명자는 신경외배엽 분화 과정을 밝혔고 척수 운동 뉴런과 같은 조기 신생 돌출 뉴런의 특정화를 위해 전구체가 Sox1 발현 신경외배엽 세포가 되기 전에 모르포겐으로 처리되어야만 한다는 것을 발견하였다.The study of the present invention allows functional motor neurons to differentiate into mitotic post-mitotic motor neurons in the presence of neuroectodermal differentiation by FGF2, characterization by RA and / or caudalization followed by ventralized morphogen SHH during later stages of neurogenesis. Demonstrates that it can be efficiently generated from human ES cells. Thus, the basic principles of neural development learned from animals can be applied to human primates and repeated in vitro. Contrary to recent evidence of motor neuron differentiation from mouse ES cells (Wichterle, H., et al., Cell 110: 385-397, 2002), we have revealed a process of neuroectodermal differentiation and such as spinal cord motor neurons. It was found that precursors must be treated with morphogens before they can become Sox1 expressing neuroectodermal cells for the characterization of early neonatal overhang neurons.
마우스 ES 세포는 먼저 신경외배엽 세포로 지시되었고 이어서 이것은 도파민성 뉴런으로의 분화를 위해 FGF8 및 SHH[문헌참조: Barberi, T., et al., Nat. Biotechnol. 21: 1200-1207, 2003; Lee, S. H., et al., Nat. Biotechnol. 18: 675-679, 2000] 또는 운동 뉴런 분화를 위해 RA 및 SHH[문헌참조: Wichterle, H. , et al., supra, 2002]와 같은 모르포겐으로 처리된다. 이들 관찰은 뉴런이 상피로부터 뉴런관으로 특정화된다는 개념과 맞는 것처럼 보인다. 본 발명의 관찰은, 또한 전뇌 표현형을 갖는 hES 유래 Sox1 발현 신경외배엽 세포가 척수 운동 뉴런을 생성시키는데 무반응함을 지적한다. 본 발명의 배양 시스템에서 hES 세포로부터 생성된 Sox1 발현 세포는, 이들이 6일된 사람 배아와 동등한 hES 세포로부터 2주 분화 후에 신경관형 구조를 형성하고 Sox1을 발현함으로 신경관의 세포들과 유사하다[문헌참조: Zhang, S. C., J. Hematother. Stem Cell Res. 12: 625-634, 2003]. 생체내에서 신경관은 사람 임신 3주 말기에 형성되고[문헌참조: Wood, H. B. and Episkopou, V. , Mech. Dev. 86: 197-201,1999] Sox1은 동물에서 신경관의 형성동안에 신경외배엽에 의해 발현된다[문헌참조: Pevny, L. H., et al., Development 125: 1967- 1978,1998 ; Wood, H. B. and Episkopou, V., supra, 1999]. 본 발명자의 발견은 한 부류의 뉴런, 운동 뉴런과 같은 적어도 큰 돌출 뉴런의 특정화가, 줄기세포가 Sox1-발현 신경외배엽 세포가 되기전에 개시됨을 제안하고 따라서, 이것은 뇌 유래 신경외배엽 세포가 상이한 지역의 실체의 돌출 뉴런을 생성시키지 못하는 이유를 설명할 수 있다.Mouse ES cells were first directed to neuroectodermal cells, which were then FGF8 and SHH for differentiation into dopaminergic neurons. Barberi, T., et al., Nat. Biotechnol. 21: 1200-1207, 2003; Lee, S. H., et al., Nat. Biotechnol. 18: 675-679, 2000] or with morphogens such as RA and SHH (Wichterle, H., et al., Supra, 2002) for motor neuron differentiation. These observations seem to fit the notion that neurons are specified from the epithelium to neuronal tubes. Observations of the present invention also indicate that hES derived Sox1 expressing neuroectodermal cells with a whole brain phenotype are unresponsive to producing spinal motor neurons. Sox1 expressing cells generated from hES cells in the culture system of the present invention are similar to those of neural tubes by forming neural tubular structures and expressing Sox1 after two weeks of differentiation from hES cells equivalent to 6 day old human embryos. Zhang, SC, J. Hematother. Stem Cell Res. 12: 625-634, 2003. In vivo, neural tubes are formed at the end of the third week of human gestation [Wood, H. B. and Episkopou, V., Mech. Dev. 86: 197-201,1999] Sox1 is expressed by neuroectodermal formation during neural tube formation in animals [Pevny, L. H., et al., Development 125: 1967- 1978, 1998; Wood, H. B. and Episkopou, V., supra, 1999]. The inventors' findings suggest that the specification of at least large protruding neurons, such as a class of neurons, motor neurons, is initiated before the stem cells become Sox1-expressing neuroectodermal cells, thus suggesting that regions of brain-derived neuroectodermal cells differ. The reason for failing to produce overhanging neurons of the entity can be explained.
hES 세포의 새로운 공급원으로부터 기능적 운동 뉴런은 ALS와 같은 운동 뉴런 관련된 장애를 치료하기 위해 디자인된 약제를 스크리닝하기 위한 일반적인 사람 운동 뉴런을 제공한다. 이들 세포는 또한 언젠가는 운동 뉴런 질환 또는 척주 손상을 갖는 환자에게 적용될 수 있는, 운동 뉴런의 실험적 세포 대용물을 위한 유용한 공급원을 제공한다. Functional motor neurons from new sources of hES cells provide general human motor neurons for screening drugs designed to treat motor neuron related disorders such as ALS. These cells also provide a useful source for experimental cell substitutes of motor neurons, which may one day be applied to patients with motor neuron disease or spinal cord injury.
방법Way
ES 세포의 배양 및 신경 분화Culture and Neural Differentiation of ES Cells
사람 ES 세포(세포주 H1 및 H9, 계대 19회 내지 42회)를 배양하고 문헌[참조: Thomson, J. A. , et al., supra, 1998]에 기재된 바와 같이 방사선 조사된 배아 마우스 섬유아세포의 영양 공급 층상에서 주마다 계대하였다. 미분화된 상태의 ES 세포는 전형적인 형태 및 Oct4 및 SSEA4의 발현에 의해 확인하였다. 신경외배엽 분화에 대해, hES 세포는 4일동안 응집하였고 이어서 N2, 헤파린(2ng/ml) 및 FGF2(20ng/ml) 또는 RA가 보충된 F12/DMEM에서 10일동안 접착 플라스틱 표면상에서 배양하였다[문헌참조: Zhang, S. C. , et al., supra, 2001].Nutrient supplying layer of embryonic mouse fibroblasts cultured with human ES cells (cell lines H1 and H9, passages 19-42) and irradiated as described in Thomson, JA, et al., Supra, 1998 The passages were weekly. ES cells in undifferentiated state were confirmed by typical morphology and expression of Oct4 and SSEA4. For neuroectodermal differentiation, hES cells aggregated for 4 days and then cultured on adhesive plastic surfaces for 10 days in F12 / DMEM supplemented with N2, heparin (2 ng / ml) and FGF2 (20 ng / ml) or RA. See Zhang, SC, et al., Supra, 2001.
운동 뉴런 유도를 위해, 모르포겐 처리된 신경외배엽 세포를, 1주일동안 RA(0.1μM) 및 SHH(10-500 ng/ml, R&D)의 존재하에 신경기본 배지(Gibco), N2 보충물 및 cAMP(Sigma, IgM)로 이루어진 신경 분화 배지에서 오르니틴/라미닌-피복된 커버슬립상에 분주하였다. 이후에, BDNF, GDNF 및 인슐린형 성장 인자-1(IGF-1)(10ng/ml, PeproTech Inc.)를 배지에 첨가하고 SHH의 농도를 50ng/ml로 감소시켰다.For motor neuron induction, morphogen-treated neuroectodermal cells were cultured for 1 week in the presence of neuronal medium (Gibco), N2 supplement and in the presence of RA (0.1 μM) and SHH (10-500 ng / ml, R & D). Dispense onto ornithine / laminin-coated coverslips in neural differentiation medium consisting of cAMP (Sigma, IgM). Thereafter, BDNF, GDNF and insulin type growth factor-1 (IGF-1) (10 ng / ml, PeproTech Inc.) were added to the medium and the concentration of SHH was reduced to 50 ng / ml.
면역세포화학 및 현미경(Zhang, S.C., et al., supra, 2001)Immunocytochemistry and Microscopy (Zhang, S.C., et al., Supra, 2001)
본 연구에 사용되는 1차 항체는 신경 부류 III β-튜불린(Covance Research Products, Richmond, CA, 1: 2000), 네스틴 (Chemicon, Temecula, CA, 1: 750), Sox1 (Chemicon, 1: 1000), 시냅신 I (Calbiochem, Darmstadt, German, 1: 500), ChAT (Chemicon, 1: 50), 및 VAChT (Chemicon, 1: 1000), lsll/2 (S. Pfaff), Otx2 (F. Vaccarino), and Olig2 (M. Nakafuku)에 대한 폴리클로날 항체를 포함한다. MNR2 또는 HB9(81.5C10), lsletl(40.2D6), Lim3(67.4E12), Pax6 및 Nkx2.2에 대한 항체는 공급원[Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, lowa City, IA)]으로부터 구입하였고 항-HoxC8는 제조원[Covance Research Products (1: 200)]으로부터 구입하였다. 전기생리학적으로 기록된 세포를 동정하기 위해, 비오시틴(Molecular Probes) 충전된 세포를 스트렙트아비딘-FITC(Sigma, 1:200)로 표지시키고 ChAT에 대해 염색시켰다. 니콘 형광 현미경 600(FRYER INC, Huntley, IL) 또는 고촛점 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)상에 탑재된 스팟 디지탈 카메라를 사용하여 이미지를 수거하였다. 본래에 비영장류 조직에 대해 개발된, 운동 뉴런 전사 인자 및 호메오도메인 단백질에 대한 항체의 특이성은 레서스 몽키 척주 및 뇌 조직(공급원: Wisconsin Primate Research Center)의 배아(E34 또는 E36)에서 입증되었다.Primary antibodies used in this study were neuronal class III β-tubulin (Covance Research Products, Richmond, CA, 1: 2000), Nestin (Chemicon, Temecula, CA, 1: 750), Sox1 (Chemicon, 1: 1000), Synapsin I (Calbiochem, Darmstadt, German, 1: 500), ChAT (Chemicon, 1: 50), and VAChT (Chemicon, 1: 1000), lsll / 2 (S. Pfaff), Otx2 (F. Vaccarino), and Olig2 (M. Nakafuku). Antibodies against MNR2 or HB9 (81.5C10), lsletl (40.2D6), Lim3 (67.4E12), Pax6 and Nkx2.2 were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, lowa City, IA) and anti-HoxC8 Was purchased from Coveance Research Products (1: 200). To identify electrophysiologically recorded cells, Biocithin (Molecular Probes) filled cells were labeled with streptavidin-FITC (Sigma, 1: 200) and stained for ChAT. Images were collected using a spot digital camera mounted on a Nikon Fluorescence Microscope 600 (FRYER INC, Huntley, IL) or High Focus Microscope (Nikon, Tokyo, Japan). Specificity of antibodies to motor neuron transcription factors and homeodomain proteins, originally developed for non-primate tissues, has been demonstrated in rhesus monkey spines and embryos of brain tissue (source: Wisconsin Primate Research Center) (E34 or E36). .
정량dose
총 분화된 세포(훽스트 표지됨)중에서 HB9-발현 세포군은 메타모프(Metamorph) 소프트웨어(Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA)를 사용한 수동적으로 또는 입체학적 측정에 의해 실험 그룹에 대해 알지 못하는 사함에 의해 계수되었다. 측정되는 영역은 추적자에 의해 대략적인 윤곽을 나타내고 계수 프레임의 수를 미리 설정하여 이의 범위는 스테레오 연구자 소프트웨어(MicroBrightField Inc, Williston, VT)에 의해 작동되는 자동화된 단계 이동을 사용하여 무작위로 측정 부위를 샘플 채취하였다. 중첩 세포를 갖는 계수 영역에 대해 현미경을 미리 설정하여 상하로 움직여서 상이한 층내의 양성 세포를 촛점화하고 클러스터내 총 세포수를 소프트웨어로 평가하였다. 각각의 그룹내에 3 내지 4개의 커버슬립을 계수하고 데이타는 평균 ± SD로 표현하였다.Among total differentiated cells (chast labeled), HB9-expressing cell populations were counted by remission unknown to the experimental group, either manually or by stereoscopic measurements using Metamorph software (Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA). It became. The area being measured is roughly outlined by the tracker and the number of coefficient frames is preset so that the range can be measured at random using automated step movements operated by stereo investigator software (MicroBrightField Inc, Williston, VT). Sample was taken. Microscopy was pre-set up and down for counting regions with overlapping cells to focus positive cells in different layers and the total number of cells in clusters was evaluated by software. Three to four coverslips in each group were counted and data expressed as mean ± SD.
RT-PCT 분석RT-PCT Analysis
RT-PCR 증폭은 상이한 단계 및 운동 뉴런 분화 배양물에서 hES 세포 유래 신경외배엽 세포로부터 수행하였다.RT-PCR amplification was performed from hES cell derived neuroectodermal cells in different stages and motor neuron differentiation culture.
하기의 프라이머를 사용하였다:The following primers were used:
HoxC8, 5'-TTTATGGGGCTCAGCAAGAGG-3', 5'- TCCACTTCATCCTTCGGTTCTG-3', 318 bp ; HoxC5, 5'- TCGGGGTGCTTCCTTGTAGC-3', 5'-TTCGTGGCAGGGACTATGGG-3', 290 bp ; HoxB6, 5'-AACTCCACCTTCCCCGTCAC-3', 5'-CTTCTGTCTCGCCGAACACG-3', 340 bp ; Otx2, 5'-CAACAGCAGAATGGAGGTCA-3', 5'- CTGGGTGGAAAGAGAAGCTG-3', 429 bp ; HoxBl, 5'- TCAGAAGGAGACGGAGGCTA-3', 5'-GTGGGGGTGTTAGGTTCTGA-3', 218 bp ; GAPDH, 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3', 450 bp ; Olig2, 5'- AAGGAGGCAGTGGCTTCAAGTC-3', 5'- CGCTCACCAGTCGCTTCATC-3', 315 bp ; Nkx2. 2, 5'- TGCCTCTCCTTCTGAACCTTGG-3', 5'-GCGAAATCTGCCACCAGTTG-3', 337 bp. Irx3, 5'-AAGAACGCCACCAGGGAGAG-3', 5'-TTGGAGTCCGAAATGGGTCC-3', 473 bp ; Pax6, 5'-GGCAACCTACGCAAGATGGC-3', 5'- TGAGGGCTGTGTCTGTTCGG-3', 459 bp ; SHH, 5'-CCAATTACAACCCCGACATC- 3', 5'-CCGAGTTCTCTGCTTTCACC-3', 339 bp ; Nkx6. 1, 5'- ACACGAGACCCACTTTTTCCG-3', 5'-TGCTGGACTTGTGCTTCTTCAAC-3', 335 bp.HoxC8, 5'-TTTATGGGGCTCAGCAAGAGG-3 ', 5'-TCCACTTCATCCTTCGGTTCTG-3', 318 bp; HoxC5, 5'-TCGGGGTGCTTCCTTGTAGC-3 ', 5'-TTCGTGGCAGGGACTATGGG-3', 290 bp; HoxB6, 5'-AACTCCACCTTCCCCGTCAC-3 ', 5'-CTTCTGTCTCGCCGAACACG-3', 340 bp; Otx2, 5'-CAACAGCAGAATGGAGGTCA-3 ', 5'- CTGGGTGGAAAGAGAAGCTG-3', 429 bp; HoxBl, 5'-TCAGAAGGAGACGGAGGCTA-3 ', 5'-GTGGGGGTGTTAGGTTCTGA-3', 218 bp; GAPDH, 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ', 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3', 450 bp; Olig2, 5'- AAGGAGGCAGTGGCTTCAAGTC-3 ', 5'- CGCTCACCAGTCGCTTCATC-3', 315 bp; Nkx2. 2, 5'- TGCCTCTCCTTCTGAACCTTGG-3 ', 5'-GCGAAATCTGCCACCAGTTG-3', 337 bp. Irx3, 5'-AAGAACGCCACCAGGGAGAG-3 ', 5'-TTGGAGTCCGAAATGGGTCC-3', 473 bp; Pax6, 5'-GGCAACCTACGCAAGATGGC-3 ', 5'- TGAGGGCTGTGTCTGTTCGG-3', 459 bp; SHH, 5'-CCAATTACAACCCCGACATC-3 ', 5'-CCGAGTTCTCTGCTTTCACC-3', 339 bp; Nkx6. 1, 5'-ACACGAGACCCACTTTTTCCG-3 ', 5'-TGCTGGACTTGTGCTTCTTCAAC-3', 335 bp.
전기생리학적 기록Electrophysiological record
hES 세포 유래 운동 뉴런의 전기생리학적 성질은 전세포 패취 클램프 기록 기술을 사용하여 5주 내지 6주동안 분화된 배양물에서 연구하였다[문헌참조: Gao, B. X., et al., J. Neurophvsiol. 79: 2277-2287, 1998]. 테트로도톡신(TTX, 1μM, Sigma), 비쿠쿨린(20μM, Sigma), 스트리크닌(5μM, Sigma), D-2-아미노-5-포스포노발레르산(AP-5, 40μM, Sigma) 또는 6-시아노-7-니트로퀴녹살린-2,3-디온(CNQX, 20μM, RBI, Natick, MA)을 욕조 용액에 적용하여 전압 활성화되거나 시냅스 전류의 실체를 확인하였다. 몇몇 실험에 대해, 1% 비오시틴을 기록 용액에 첨가하였다. 전류 및 전압 클램프 기록은 다중클램프 700A 증폭기(Axon Instruments, Union City, CA)를 사용하여 수행하였다. 시그날은 4kHz에서 거르고 디지데이타 1322A 아날로그-디지탈 컨버터(Axon Instument)를 사용하여 10kHz에서 샘플링하여 획득하고 시판되는 소프트웨어(pClamp9, Axon Instruments)를 사용하여 컴퓨터 하드 디스크에 저장하였다. 접근 저항성은 전형적으로 8-15MΩ이고 증폭기 회로를 사용하여 50 내지 80%까지 보상하였다. 자발적 시냅스 전류는 주형 검출 알고리듬(소형 분석 프로그램 5.6.28, 시냅토소프트, 데카투르, GA)을 사용하여 검출하고 레벤베르크-마르쿠아르트 알고리듬을 사용하여 단일 대수적 함수로 조정하였다. 당해 결과는 평균 ± SEM으로 제공한다.The electrophysiological properties of hES cell derived motor neurons were studied in cultures differentiated for 5-6 weeks using whole cell patch clamp recording techniques. Gao, B. X., et al., J. Neurophvsiol. 79: 2277-2287, 1998]. Tetrodotoxin (TTX, 1 μM, Sigma), bicuculin (20 μM, Sigma), striknin (5 μM, Sigma), D-2-amino-5-phosphonovaleric acid (AP-5, 40 μM, Sigma) or 6-cyano -7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX, 20 μΜ, RBI, Natick, MA) was applied to the bath solution to confirm the identity of the voltage activated or synaptic current. For some experiments, 1% biocithin was added to the recording solution. Current and voltage clamp recordings were performed using a multiclamp 700A amplifier (Axon Instruments, Union City, CA). The signal was filtered at 4 kHz, sampled at 10 kHz using a Digidata 1322A analog-to-digital converter (Axon Instument) and stored on a computer hard disk using commercially available software (pClamp9, Axon Instruments). Access resistance is typically 8-15 MΩ and compensated by 50-80% using an amplifier circuit. Spontaneous synaptic currents were detected using the template detection algorithm (Small analysis program 5.6.28, Synaptosoft, Decatur, GA) and adjusted to a single algebraic function using the Levenberg-Marquardt algorithm. The results are given as mean ± SEM.
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