JP2007503811A - Method for in vitro differentiation of neural stem cells, motor neurons and dopamine neurons from primate embryonic stem cells - Google Patents

Abstract

胚幹細胞を神経及び運動細胞へと分化させる方法が開示される。一実施の形態では、本発明は、初期ロゼット形態を特徴とし、且つＳｏｘ１^-／Ｐａｘ６⁺である大多数の細胞を含む細胞の集団を、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９又はＲＡの存在下で培養することを含み、ここで細胞は、神経管様ロゼット形態を特徴とし、且つＰａｘ６⁺／Ｓｏｘ１^-である。A method for differentiating embryonic stem cells into nerve and motor cells is disclosed. In one embodiment, the present invention has an initial rosette form characterized by, and Sox1 ^- / Pax6 a population of cells comprising the majority of the cells that are ^+, cultured in the presence of FGF2, FGF4, FGF8, FGF9 or RA Where the cell is characterized by a neural tube-like rosette morphology and is Pax6 ⁺ / Sox1 ⁻ .

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２００１年１０月３日に出願された米国特許出願第０９／９７０，３８２号（本明細書中に援用される）の一部継続出願であり、同様に２００３年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／４９８，８３１号（本明細書中に援用される）及び２００３年９月２日に出願された米国仮特許出願第６０／４９９，５７０号（本明細書中に援用される）に対して優先権を主張する。 [Cross-reference of related applications]
This application is a continuation-in-part of US patent application Ser. No. 09 / 970,382 filed Oct. 3, 2001 (incorporated herein), and similarly August 29, 2003. US Provisional Patent Application No. 60 / 498,831 (incorporated herein) and US Provisional Patent Application No. 60 / 499,570 filed September 2, 2003 (herein). Insist on priority).

［連邦政府により後援される研究又は開発に関する記述］
本発明は、米国政府の後援を受けずに行われた。 [Research or development statement sponsored by the federal government]
This invention was made without government support.

［発明の背景］
ヒト幹細胞（ＥＳ）細胞は、着床前の胚の内細胞塊に由来する多分化能性細胞である（Thomson，J.A.，et al.，Science 282：1145-1147，1998）。マウスＥＳ細胞に類似して、ヒトＥＳ細胞は、様々な体細胞タイプの３つすべての胚葉へ分化するそれらの潜在性を維持しながら多数に増殖させることができる（上述のThomson，J.A.，et al.，1998；Reubinoff，B.E.，et al.，Nat．Biotech．18：399，2000；Thomson，J.A. and Odorico，J.S.，Trends Biotech 18：53-57，2000；Amit，M.，et al.，Dev．Biol．227：271-278，2000）。ＥＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化は、初期発生の細胞上及び分子機構及び移植治療用の供与細胞の産生について、新たな展望を提供するものである。実際に、マウスＥＳ細胞は、造血細胞（Wiles，M.V. and Keller，G.，Development 111：259-267，1991）、心筋細胞（Klug，M.G.，et al.，J．Clin．Invest．98：216-224，1996）、インスリン分泌細胞（Soria，B.，et al.，Diabetes 49：157-162，2000）並びにニューロン及びグリア（Bain，G.，et al.，Dev．Biol．168：342-357，1995；Okabe，S.，et al.，Mech．Dev．59：89-102，1996；Mujtaba，T.，et al.，Dev．Biol．214：113-127，1999；Brustle，O.，et al.，Science 285：754-756，1999）を含む多くの臨床的に意義ある細胞型へｉｎ ｖｉｔｒｏで分化することがわかっている。げっ歯類中枢神経系（ＣＮＳ）への移植後に、ＥＳ細胞由来の神経前駆体(precursor)は、宿主組織へ統合し、場合によっては、機能的改善をもたらすことがわかっている（McDonald，J.W.，et al.，Nat．Med．5：1410-1412，1999）。ヒトＥＳ細胞の臨床的用途は、特定の組織及び器官用の高度純度のドナー細胞の産生を要する。 [Background of the invention]
Human stem cells (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of embryos before implantation (Thomson, JA, et al., Science 282: 1145-1147, 1998). Similar to mouse ES cells, human ES cells can be expanded in large numbers while maintaining their potential to differentiate into all three germ layers of various somatic cell types (Thomson, JA, et al., Supra). al., 1998; Reubinoff, BE, et al., Nat.Biotech.18: 399, 2000; Thomson, JA and Odorico, JS, Trends Biotech 18: 53-57, 2000; Amit, M., et al., Dev. Biol. 227: 271-278, 2000). Differentiation of ES cells in vitro provides a new perspective on early-onset cellular and molecular mechanisms and production of donor cells for transplantation therapy. In fact, mouse ES cells are hematopoietic cells (Wiles, MV and Keller, G., Development 111: 259-267, 1991), cardiomyocytes (Klug, MG, et al., J. Clin. Invest. 98: 216). -224, 1996), insulin secreting cells (Soria, B., et al., Diabetes 49: 157-162, 2000) and neurons and glia (Bain, G., et al., Dev. Biol. 168: 342- Okabe, S., et al., Mech. Dev. 59: 89-102, 1996; Mujtaba, T., et al., Dev. Biol. 214: 113-127, 1999; , Et al., Science 285: 754-756, 1999) have been shown to differentiate in vitro into many clinically significant cell types. After transplantation into the rodent central nervous system (CNS), ES cell-derived neural precursors have been shown to integrate into host tissues and in some cases lead to functional improvements (McDonald, JW Et al., Nat. Med. 5: 1410-1412, 1999). The clinical use of human ES cells requires the production of high purity donor cells for specific tissues and organs.

分化ヒトＥＳ細胞培養物からの移植可能な神経及び運動ニューロン前駆体の単離に関する簡素でさらには効率的な戦略が、当該技術分野で必要とされている。   There is a need in the art for simple and more efficient strategies for the isolation of transplantable neural and motor neuron precursors from differentiated human ES cell cultures.

［発明の概要］
一実施の形態では、本発明は、胚幹細胞から培養され、初期ロゼット形態を特徴とし、且つＳｏｘ１^-，Ｐａｘ６⁺である細胞の同調性集団を含む細胞の集団を創出する方法である。一実施の形態では、上記方法は、以下の：（ａ）胚幹細胞を胚様体へと増殖させる工程、及び（ｂ）胚様体を神経管様ロゼットの形態の神経幹細胞の同調集団へと増殖させる工程（ここで、この増殖は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８、ＦＧＦ４又はＦＧＦ９の存在下である）を含む。胚幹細胞の増殖から初期ロゼットの発達までの間の総期間が８〜１０日であることが好ましい。Ｐａｘ６⁺／Ｓｏｘ１^-細胞の総集団（比率：population）は、総細胞集団の少なくとも７０％であることが好ましい。 [Summary of Invention]
In one embodiment, the present invention is cultured from embryonic stem cells, characterized by initial rosette form, and Sox1 ^-, is a method to create a population of cells comprising a tuning population of cells that are Pax6 ^+. In one embodiment, the method comprises the following: (a) expanding embryonic stem cells into embryoid bodies, and (b) transforming embryoid bodies into a synchronized population of neural stem cells in the form of neural tube-like rosettes. A step of growing, wherein the growth is in the presence of FGF2, FGF8, FGF4 or FGF9. It is preferred that the total time from embryonic stem cell proliferation to early rosette development is 8-10 days. The total population of Pax6 ⁺ / Sox1 ⁻ cells (ratio: population) is preferably at least 70% of the total cell population.

本発明はまた、この方法により創出される細胞の集団である。   The present invention is also a population of cells created by this method.

別の実施の形態では、本発明は、神経管様ロゼット形態を特徴とし、且つＰａｘ６⁺／Ｓｏｘ１⁺である同調化した神経幹細胞の集団を創出する方法である。初期ロゼット形態を特徴とし、且つＳｏｘ１^-，Ｐａｘ６⁺である細胞を、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８又はＲＡの存在下で４〜６日間培養する工程を含む方法。本発明はまた、この方法により創出される細胞の集団である。 In another embodiment, the invention is a method of creating a synchronized population of neural stem cells characterized by neural tube-like rosette morphology and being Pax6 ⁺ / Sox1 ⁺ . A method comprising culturing cells characterized by an initial rosette morphology and being Sox1 ⁻ , Pax6 ⁺ in the presence of FGF2, FGF4, FGF8 or RA for 4-6 days. The present invention is also a population of cells created by this method.

一実施の形態では、初期ロゼット細胞は、ＦＧＦ８を用いて、好ましくは４〜７日間培養され、ＥＮ１⁺である。別の実施の形態では、細胞は、ＦＧＦ２を用いて、好ましくは４〜７日間培養され、Ｂｆ１⁺である。別の実施の形態では、細胞は、ＲＡを用いて、好ましくは４〜７日間培養され、Ｈｏｘ⁺である。 In one embodiment, the early rosette cells are cultured with FGF8, preferably for 4-7 days, and are EN1 ⁺ . In another embodiment, the cells are cultured with FGF2, preferably 4-7 days, and are Bf1 ⁺ . In another embodiment, the cells are cultured with RA, preferably 4-7 days, and are Hox ⁺ .

別の実施の形態では、本発明は、上記の細胞をＦＧＦ８の存在下でＳＨＨを用いて培養する工程を含む、中脳ドーパミンニューロンの集団を単離する方法である。得られる細胞は、ＴＨ、ＡＡＤＣ、ＥＮ−１、ＶＭＡＴ２及びＤＡＴを発現するが、ＤｂＨ及びＰＮＭＴを発現しない。本発明はまた、この方法により創出される細胞の集団である。   In another embodiment, the present invention is a method of isolating a population of midbrain dopamine neurons comprising culturing the above cells with SHH in the presence of FGF8. The resulting cells express TH, AADC, EN-1, VMAT2 and DAT, but do not express DbH and PNMT. The present invention is also a population of cells created by this method.

別の実施の形態では、本発明は、上記の細胞をＳＨＨを用いてＲＡの存在下で前述の細胞を培養する工程を含む、脊髄運動ニューロンの集団を単離する方法である。得られる細胞は、ＨＢ９、ＨｏｘＢ１、ＨｏｘＢ６、ＨｏｘＣ５、ＨｏｘＣ８、ＣｈＡＴ及びＶＡＣｈＴを発現する。本発明はまた、この方法により創出される細胞の集団である。   In another embodiment, the present invention is a method for isolating a population of spinal motoneurons comprising culturing the aforementioned cells with SHH in the presence of RA using SHH. The resulting cells express HB9, HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8, ChAT and VAChT. The present invention is also a population of cells created by this method.

別の実施の形態では、本発明は、上記の細胞をＳＨＨを用いて培養する工程を含む、前脳ドーパミンニューロンの集団を単離する方法である。本発明はまた、この方法により創出される細胞の集団である。   In another embodiment, the present invention is a method for isolating a population of forebrain dopamine neurons comprising the step of culturing the above cells with SHH. The present invention is also a population of cells created by this method.

本発明はまた、正常なヒト神経発達に影響を及ぼす能力に関して作用物質をスクリーニングするための、上記の細胞集団を試験する方法である。 The present invention is also a method of testing a cell population as described above for screening an agent for the ability to affect normal human neural development.

本発明の他の目的、利点及び特徴は、明細書、特許請求の範囲及び図面を参照した後に明らかとなるであろう。   Other objects, advantages and features of the present invention will become apparent after reference to the specification, claims and drawings.

［発明の詳細な説明］
本発明における出願人等は、ヒト胚幹細胞からのドーパミン（前脳及び中脳）並びに運動神経の発生方法を開示する。好ましい方法は概して、以下に、及び表１〜表３に記載される。 Detailed Description of the Invention
Applicants in the present invention disclose a method for generating dopamine (forebrain and midbrain) and motor nerves from human embryonic stem cells. Preferred methods are generally described below and in Tables 1-3.

具体的には、出願人等は、ＥＳ細胞から、胚様体中間体を通じて初期ロゼット（Ｐａｘ６⁺／Ｓｏｘ１^-）を分化させる方法を開示する。差次的処理(differential treatment)により、出願人等は、これらの初期ロゼットを、３つの異なる形態の神経管様ロゼットへ分化させることができ、続いて３つの異なる形態の神経管様ロゼットは、前脳ドーパミンニューロン、中脳ドーパミンニューロン又は運動ニューロンへの発達に適している。 Specifically, Applicants disclose a method of differentiating early rosettes (Pax6 ⁺ / Sox1 ⁻ ) from ES cells through embryoid body intermediates. The differential treatment allows Applicants to differentiate these initial rosettes into three different forms of neural tube-like rosettes, followed by three different forms of neural tube-like rosettes: Suitable for development into forebrain dopamine neurons, midbrain dopamine neurons or motor neurons.

出願人等は、ドーパミン及び運動ニューロンを産生するための相１及び相２について記載している以下の表２について言及する。表２はまた、出願人等が適切な発達のマーカーであるとみなす様々な中間産生物についても記載している。   Applicants refer to Table 2 below, which describes Phase 1 and Phase 2 for producing dopamine and motor neurons. Table 2 also describes various intermediate products that we consider to be appropriate markers of development.

上述のように、本発明は、２つの主な実施形態を包含する。１つの実施形態は、神経管様ロゼットの形態の神経幹細胞（又は神経上皮細胞）の同調集団の産生、及び神経上皮マーカーＰａｘ６、Ｓｏｘ１、ネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ−１の発現に関する手順である。本明細書中で使用する場合、「同調する」は、異種分化をもたらすＲＡにより誘導されるものに対比して、同じ発達段階にある細胞の集団を意味する。すなわち、培養物は、前駆体(progenitor)から分化ニューロンへの発達段階にある細胞を含有する。本発明の場合では、本発明者等は、初期段階にあるＰａｘ６⁺／Ｓｏｘ１^-初期神経上皮細胞、又は後期段階にあるＰａｘ６⁺／Ｓｏｘ１⁺神経上皮細胞のいずれかを想定する。いずれの段階でも、本発明者等は、いかなる分化ニューロンも想定しない。この同調化された発生は、本願で記載されるように、特殊ニューロンへ直接の分化を可能にする。 As mentioned above, the present invention includes two main embodiments. One embodiment is a procedure for the production of a synchronized population of neural stem cells (or neuroepithelial cells) in the form of neural tube-like rosettes and the expression of the neuroepithelial markers Pax6, Sox1, Nestin, Musashi-1. As used herein, “synchronize” refers to a population of cells that are in the same developmental stage as compared to those induced by RA that result in heterogeneous differentiation. That is, the culture contains cells in the developmental stage from progenitors to differentiated neurons. In the case of the present invention, we envisage either Pax6 ⁺ / Sox1 ⁻ early neuroepithelial cells in the early stage or Pax6 ⁺ / Sox1 ⁺ neuroepithelial cells in the late stage. At no stage do we envisage any differentiated neurons. This synchronized generation allows direct differentiation into specialized neurons, as described herein.

第２の実施形態は、特殊ニューロン（例えば、中脳ドーパミンニューロン、前脳ドーパミンニューロン及び脊髄運動ニューロン）への神経上皮細胞のさらなる分化方法である。   The second embodiment is a method for further differentiation of neuroepithelial cells into special neurons (eg, midbrain dopamine neurons, forebrain dopamine neurons and spinal motor neurons).

以下の表３は、本発明の細胞を得る好ましい方法について記載している。表３は、類似した培養ブロスで置き換えることができる一般的な培養ブロス構成成分、並びに重要な成長因子及びタイミング構成成分の両方を包含する。出願人等が神経細胞培地について言及する場合、多くの培養構成成分が適切である。以下のセクションは、正確な分化に必要な培養構成成分を強調している。   Table 3 below describes preferred methods for obtaining the cells of the invention. Table 3 includes both common culture broth components that can be replaced with similar culture broths, as well as important growth factors and timing components. When applicants refer to neural cell culture media, many culture components are suitable. The following section highlights the culture components required for accurate differentiation.

概して、適切な培地は、神経細胞を成長させるのに使用される任意の培地である。以下の参照文献（上述のBain，G.，et al，1995；上述のOkabe，S.，et al.，1996；上述のMujtaba，T.，et al.，1999；上述のBrustle，O.，et al.，1999；Zhang，S.-C.，et al.，J．Neurosci．Res．59：421-429，2000；Zhang，S.-C.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 96：4089-4094，1999；Svendsen，C.N.，et al.，Exp．Neurol．137：376-388，1996；Carpenter，M.K.，et al.，Exp．Neurol．158：265-278，1999；Vescovi，A.L.，et al.，Exp．Neurol．156：71-83，1999）は、同じか、又は類似した培地を使用している。   In general, a suitable medium is any medium used to grow nerve cells. The following references (Bain, G., et al., 1995 mentioned above; Okabe, S., et al., 1996 mentioned above; Mujtaba, T., et al., 1999 mentioned above; Brustle, O., mentioned above, et al., 1999; Zhang, S.-C., et al., J. Neurosci.Res.59: 421-429, 2000; Zhang, S.-C., et al., Proc.Natl.Acad. Sci. USA 96: 4089-4094, 1999; Svendsen, CN, et al., Exp. Neurol. 137: 376-388, 1996; Carpenter, MK, et al., Exp. Neurol. 158: 265-278, 1999 Vescovi, AL, et al., Exp. Neurol. 156: 71-83, 1999) uses the same or similar media.

１．ヒトＥＳ細胞からの神経上皮細胞（神経幹細胞）の分化
神経上皮細胞の産生は、初期コロニーの中心にある細胞が円柱状となり、且つロゼット形態へ体系化する(organize)場合に、４〜６日間の懸濁培養、続く成長因子、好ましくはＦＧＦ２又はＦＧＦ８の存在下で４〜５日間の付着培養における胚様体の形成に関与する（図１Ａ、図４Ａ、図９Ａ、図９Ｂ）（Zhang，et al.，Nature Biotechnol.，2001を参照）。ＦＧＦ４及びＦＧＦ９もまた、適切な成長因子である。 1. Differentiation of neuroepithelial cells (neural stem cells) from human ES cells Neuroepithelial cells are produced for 4-6 days when the cells in the center of the initial colony are cylindrical and organize into a rosette form. (Fig. 1A, Fig. 4A, Fig. 9A, Fig. 9B) involved in the formation of embryoid bodies in suspension cultures followed by 4-5 day adherent cultures in the presence of growth factors, preferably FGF2 or FGF8 (Zhang, et al., Nature Biotechnol., 2001). FGF4 and FGF9 are also suitable growth factors.

これらのロゼットにおける円柱状細胞は、神経転写因子Ｐａｘ６を発現するが、別の神経転写因子Ｓｏｘ１を発現しない（図９Ｃ、図９Ｄ）。本発明者等は、これらのロゼットが初期に出現して、管腔なしの円柱状細胞の単層により形成されるため、「初期ロゼット」と称する。あらゆる単一コロニーは、初期ロゼットを保有する。これらの初期ロゼットの総比率(total population)は、総細胞の少なくとも７０％である。   Cylindrical cells in these rosettes express the neural transcription factor Pax6, but do not express another neural transcription factor Sox1 (FIGS. 9C, 9D). The inventors refer to these rosettes as “early rosettes” because they appear early and are formed by a monolayer of columnar cells without lumens. Every single colony carries an initial rosette. The total population of these initial rosettes is at least 70% of the total cells.

これらの初期ロゼットの４〜６日間のさらなる培養は、神経管様ロゼットの形成を招く（図１Ｂ、図４Ｂ、図９Ｅ）。神経管様ロゼットは、明らかな管腔を伴う円柱状細胞の多層により形成される。ロゼットにおける細胞は、Ｐａｘ６のほかにＳｏｘ１を発現する（図４Ｃ、図９Ｆ、図９Ｇ、図９Ｈ）。初期ロゼットから神経管様ロゼットへの進行には、本発明者等の無血清培養条件下で、１０〜２０ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９又は０．００１〜１μＭでのＲＡの存在下で、約４〜６日かかる。   Further culture of these initial rosettes for 4-6 days leads to the formation of neural tube-like rosettes (FIGS. 1B, 4B, 9E). A neural tube-like rosette is formed by a multilayer of cylindrical cells with a clear lumen. Cells in the rosette express Sox1 in addition to Pax6 (FIGS. 4C, 9F, 9G, 9H). The progression from early rosette to neural tube-like rosette is the presence of RA at 10-20 ng / ml FGF2, FGF4, FGF8, FGF9 or 0.001-1 μM under our serum-free culture conditions Below, it takes about 4-6 days.

ＥＳ細胞から神経管様ロゼットの形成への神経上皮分化のプロセスには、１４〜１６日かかる。ヒトＥＳ細胞は、５．５日齢のヒト胚に由来する（上述のThomson，J.A.，et al.，1998）。したがって、本発明者等の培養系におけるヒトＥＳ細胞からの神経上皮細胞の発達は、ヒト胚において発達にかかる１９〜２１日に十分に匹敵する。正常なヒト発達では、神経管は、２０〜２１日目に形成される。したがって、ヒトＥＳ細胞からの神経上皮分化は、正常なヒト胚発達を反映する（Zhang，S.C.，J．Hematother．Stem Cell Res．12：625-634，2003）。   The process of neuroepithelial differentiation from ES cells to the formation of neural tube-like rosettes takes 14-16 days. Human ES cells are derived from 5.5 day old human embryos (Thomson, J.A., et al., 1998, supra). Therefore, the development of neuroepithelial cells from human ES cells in our culture system is sufficiently comparable to the 19-21 days of development in human embryos. In normal human development, neural tubes are formed on days 20-21. Thus, neuroepithelial differentiation from human ES cells reflects normal human embryo development (Zhang, S.C., J. Hematother. Stem Cell Res. 12: 625-634, 2003).

形態変化及び明快な遺伝子発現パターンにより明らかであるような２段階の神経上皮発達は、先に記載されていない。Ｐａｘ６及びＳｏｘ１は、神経管がカエル、ゼブラフィッシュ、ヒヨコ及びマウスにおいて同時に形成される場合、神経上皮細胞により発現されることが示されている（Pevny，et al.，Development 125：1967-1978，1998）。したがって、本発明者等は、ヒトＥＳ細胞における神経上皮分化に沿った順次Ｐａｘ６及びＳｏｘ１発現の見解は新規であり、ヒトにとって特有であり得ると考える。Ｐａｘ６＋／Ｓｏｘ１−神経上皮細胞は、最古の神経上皮細胞を表し、したがってはるかに（far）同定されている。これらの細胞の機能的有意性は、初期ロゼットにおけるＰａｘ６＋／Ｓｏｘ１−神経上皮細胞が前脳以外のニューロン保有位置的(carrying positional)アイデンティティー（例えば、中脳ドーパミンニューロン及び脊髄運動ニューロン）となるように効率的に誘導され得るが、神経管様ロゼットにおけるＰａｘ６＋／Ｓｏｘ１＋神経上皮細胞は、効率的に誘導され得ない（表１、上記を参照）という点で、本発明に関連している。   Two-stage neuroepithelial development, as evidenced by morphological changes and distinct gene expression patterns, has not been described previously. Pax6 and Sox1 have been shown to be expressed by neuroepithelial cells when neural tubes are formed simultaneously in frogs, zebrafish, chicks and mice (Pevny, et al., Development 125: 1967-1978, 1998). Thus, we believe that the view of sequential Pax6 and Sox1 expression along neuroepithelial differentiation in human ES cells is novel and may be unique to humans. Pax6 + / Sox1-neuroepithelial cells represent the oldest neuroepithelial cells and have therefore been far identified. The functional significance of these cells is such that Pax6 + / Sox1-neuroepithelial cells in the early rosette have a carrying positional identity (eg, midbrain dopamine neurons and spinal motoneurons) other than the forebrain Relevant to the present invention in that Pax6 + / Sox1 + neuroepithelial cells in neural tube-like rosettes cannot be efficiently induced (see Table 1, above).

あらゆる分化しているＥＳ細胞コロニーは、神経管様ロゼットを形成する。神経上皮細胞は、総分化した細胞の少なくとも７０〜９０％を表す。   Every differentiated ES cell colony forms a neural tube-like rosette. Neuroepithelial cells represent at least 70-90% of the total differentiated cells.

神経管様ロゼットの形態の神経上皮細胞は、低濃度のディスパーゼによる処理及び差次的接着により精製することができる（米国特許第０９／９６０，３８２号に記載）。   Neuroepithelial cells in the form of neural tube-like rosettes can be purified by treatment with low concentrations of dispase and differential adhesion (described in US patent application Ser. No. 09 / 960,382).

２．中脳ドーパミンニューロンの産生
潜在的な治療上の用途を有する機能的ニューロンは、ニューロンであることのほかに、少なくとも２つのさらなる特徴を保有しなくてはならない：特異的な位置的アイデンティティー並びに神経伝達物質を合成、放出及び取り込む能力。 2. Production of midbrain dopamine neurons Functional neurons with potential therapeutic uses must possess at least two additional features in addition to being neurons: specific positional identities as well as nerves Ability to synthesize, release and incorporate transmitter substances.

中脳ドーパミンニューロンを産生する際の第１の工程は、中脳アイデンティティーの誘導である。ＦＧＦ８（５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）による６〜７日間のＰａｘ６⁺／Ｓｏｘ１^-初期ロゼット細胞の処理は、中脳転写因子エングレイルド１（Ｅｎ−１）及びＰａｘ２を発現し（図４Ｅ、図４Ｆ）、且つ前脳マーカーＢｆ−１をダウンレギュレートする（図４Ｄ）前駆体への細胞の効率的な分化をもたらすが、Ｐａｘ６⁺／Ｓｏｘ１⁺神経管様ロゼット細胞はもたらさない。 The first step in producing midbrain dopamine neurons is the induction of midbrain identity. FGF8 of (50~200ng / ml) in accordance 6-7 days Pax6 ⁺ / Sox1 ^- treatment early rosette cells express midbrain transcription factor Engrailed 1 (En-1) and Pax2 (FIG. 4E, FIG. 4F), And downregulate forebrain marker Bf-1 (FIG. 4D), leading to efficient differentiation of cells into precursors, but not Pax6 ⁺ / Sox1 ⁺ neural tube-like rosette cells.

第２の工程は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ、５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で６〜７日間、続いて正規のニューロン分化培地（例えば、表３に記載するもの）中でさらに２週間、ドーパミンニューロンが発生するまで中脳前駆体を培養することである。好ましくは、総分化細胞の少なくとも３５％が、ドーパミンニューロンとなる。   The second step consists of 6-7 days in the presence of sonic hedgehog (SHH, 50-250 ng / ml), followed by a further 2 weeks in normal neuronal differentiation medium (eg as described in Table 3), To culture midbrain progenitors until dopamine neurons develop. Preferably, at least 35% of the total differentiated cells become dopamine neurons.

好ましい分化培地は、表３に記載している。   Preferred differentiation media are listed in Table 3.

ドーパミンニューロンは、ドーパミンの合成を可能にするが、ノルエピネフリン又はネフリンへのさらなる代謝を可能にしないＴＨ、ＡＡＤＣを発現するが、ＤｂＨ及びＰＮＭＴを発現しない（図５）。   Dopamine neurons express TH, AADC that do not allow further metabolism to norepinephrine or nephrin, but do not express DbH and PNMT, although they allow for the synthesis of dopamine.

ドーパミンニューロンは、中脳ドーパミンニューロン発達に必要とされる転写因子であるＥｎ−１、ｐｔｘ３、Ｎｕｒｒ１及びＬｍｘ１ｂを発現する（図６Ａ、図６Ｂ）。   Dopamine neurons express En-1, ptx3, Nurr1 and Lmx1b, which are transcription factors required for midbrain dopamine neuron development (FIGS. 6A and 6B).

ドーパミンニューロンは、ＧＡＢＡを発現しない（図６Ｃ）。ＧＡＢＡとの共発現は、嗅球におけるドーパミンニューロンの特徴である。   Dopamine neurons do not express GABA (FIG. 6C). Co-expression with GABA is a feature of dopamine neurons in the olfactory bulb.

ドーパミンニューロンは、カルビンジンを発現しない（図６Ｄ）。カルビンジンとの共発現は、中脳の被蓋(tegamental)野におけるドーパミンニューロンの特徴である。   Dopamine neurons do not express calbindin (FIG. 6D). Co-expression with calbindin is a feature of dopamine neurons in the tegamental area of the midbrain.

総合して、上記特徴は、本発明者等の培養系で産生されるドーパミンニューロンが中脳ドーパミンニューロン、パーキンソン病において損失されるドーパミンニューロンである黒質のより綿密に類似した中脳ドーパミンニューロンである。   Collectively, the above features are the dopamine neurons produced in our culture system are midbrain dopamine neurons, dopamine neurons lost in Parkinson's disease, more closely related to the substantia nigra of midbrain dopamine neurons. is there.

ドーパミンニューロンは、ドーパミンニューロンの生存及び機能に必要とされる成長因子であるＧＤＮＦに対する受容体であるｃ−ｒｅｔを保有する（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ）。   Dopamine neurons possess c-ret, a receptor for GDNF, a growth factor required for dopamine neuron survival and function (FIGS. 7A, 7B, and 7C).

ドーパミンニューロンはまた、ドーパミンの貯蔵及び放出に必要とされる輸送体であるＶＭＡＴ２を発現する（図７Ｄ、図７Ｅ、図７Ｆ）。ドーパミンニューロンはまた、放出後のドーパミン取り込みに必要な輸送体であるＤＡＴ（図７Ｇ、図７Ｈ、図７Ｉ）を発現する。したがって、本発明者等の培養系において産生されるドーパミンニューロンは、伝達物質ドーパミンの合成、貯蔵、放出及び取り込みに必須の機構を保有する。   Dopamine neurons also express VMAT2, a transporter required for dopamine storage and release (FIGS. 7D, 7E, 7F). Dopamine neurons also express DAT (FIG. 7G, FIG. 7H, FIG. 7I), a transporter required for dopamine uptake after release. Thus, dopamine neurons produced in our culture system possess essential mechanisms for the synthesis, storage, release and uptake of the transmitter dopamine.

ドーパミンニューロンは、シナプスの形成のためのシナプトフィジンを発現する（図７）。ドーパミンニューロンは、刺激に応答して、活動電位を興奮（誘発：fire）させることができ、ドーパミンを分泌することができる（図８）。したがって、ドーパミンニューロンは機能的である。   Dopamine neurons express synaptophysin for synapse formation (FIG. 7). In response to stimulation, dopamine neurons can excite action potentials and secrete dopamine (FIG. 8). Thus, dopamine neurons are functional.

３．脊髄運動ニューロンの産生
脊髄運動ニューロンを産生する際の第１の工程は、脊髄（仙骨）アイデンティティーの誘導である。ＲＡ（０．００１〜１μＭ）で６〜７日間のＰａｘ６＋／Ｓｏｘ１−初期ロゼット細胞の処理は、ＨｏｘＢ１、ＨｏｘＢ６、ＨｏｘＣ５、ＨｏｘＣ８のような脊髄転写因子であるＨｏｘ遺伝子を発現するが、前脳マーカーであるＯｘｔ２及びＢｆ−１又は中脳マーカーであるＥｎ−１を発現しない（図１１Ａ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ）前駆体への細胞の効率的な分化をもたらすが、Ｐａｘ６＋／Ｓｏｘ１＋神経管様ロゼット細胞はもたらさない（図１０Ａ）。 3. Production of spinal motor neurons The first step in producing spinal motor neurons is the induction of spinal cord (sacral) identity. Treatment of Pax6 + / Sox1-early rosette cells with RA (0.001-1 μM) for 6-7 days expresses the Hox gene, a spinal transcription factor such as HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8, but forebrain markers OX2 and Bf-1, which are cerebral markers, or En-1, which is a midbrain marker, are not expressed (FIGS. 11A, 11C, 11D, and 11E), leading to efficient differentiation of cells into precursors, but Pax6 + / Sox1 + neurons It does not result in tube-like rosette cells (FIG. 10A).

第２の工程は、唯一腹側神経前駆体により発現される転写因子であるＯｌｉｇ２の発現から明らかであるような腹側化前駆体の特質を誘導するためにソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ、５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で６〜７日間、続いて正規のニューロン分化培地中でさらに７〜１０日間、脊髄運動ニューロンが発生するまで脊髄前駆体を培養することである。   The second step is Sonic hedgehog (SHH, 50-250 ng) to induce ventralized progenitor characteristics as evident from the expression of Olig2, a transcription factor expressed only by ventral neural precursors. Spinal cord progenitors are cultured for 6-7 days in the presence of / ml) followed by an additional 7-10 days in normal neuronal differentiation medium until spinal motoneurons develop.

好ましい分化培地は、表３に記載している。   Preferred differentiation media are listed in Table 3.

好ましい実施形態では、総分化細胞の少なくとも２２％が、脊髄運動ニューロンとなる。運動ニューロンは、脊髄運動ニューロンにより特異的に発現される転写因子であるＨＢ９、ｉｓｌｅｔ１／２及びＬｉｍ３を発現する（図１０）。運動ニューロンはまた、ＨｏｘＢ１、ＨｏｘＢ６、ＨｏｘＣ５、ＨｏｘＣ８を発現するが、前脳マーカーであるＯｔｘ２及びＢｆ−１又は中脳マーカーであるＥｎ−１は発現しない（図１１Ａ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ）ことから、運動ニューロンは脊髄運動ニューロンであることを示す。   In a preferred embodiment, at least 22% of the total differentiated cells are spinal motor neurons. Motor neurons express HB9, islet1 / 2 and Lim3, which are transcription factors specifically expressed by spinal motor neurons (FIG. 10). Motor neurons also express HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8 but not forebrain markers Otx2 and Bf-1 or midbrain marker En-1 (FIGS. 11A, 11C, 11D, FIG. 11E) indicates that the motor neuron is a spinal motor neuron.

運動ニューロンは、運動ニューロン伝達物質アセチルコリンを合成するのに必要な酵素であるＣｈＡＴを発現する（図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ）。運動ニューロンはまた、ＶＡＣｈＴを発現し（図１２Ｅ）、運動ニューロンが、伝達物質アセチルコリンを貯蔵することができ、且つ取り込むことができることを示唆する。   Motor neurons express ChAT, an enzyme required to synthesize the motor neuron transmitter acetylcholine (FIGS. 12A, 12B, 12C, and 12D). Motor neurons also express VAChT (FIG. 12E), suggesting that motor neurons can store and take up the transmitter acetylcholine.

さらに、運動ニューロンは、シナプスの形成のためのシナプシン（図１２Ｆ）を発現する。運動ニューロンは、活動電位を興奮させることができる（図１３）。したがって、運動ニューロンは機能的である。本発明者等は、運動ニューロンが、ＨＰＬＣにより分析されるように、アセチルコリンを放出することを示すデータを有する。   Furthermore, motor neurons express synapsin (FIG. 12F) for synapse formation. Motor neurons can excite action potentials (FIG. 13). Thus, motor neurons are functional. We have data showing that motoneurons release acetylcholine as analyzed by HPLC.

４．前脳ニューロンの産生
別の実施形態では、本発明は、前脳ドーパミンニューロン、好ましくは神経系修復に適した移植可能な神経前駆体へと霊長類ＥＳ細胞（好ましくは、ヒトＥＳ細胞）を分化させる方法である。好ましくは、中脳ドーパミンニューロン産生に関して上述するような方法を開始するであろう。前脳ニューロンを産生するために、Ｐａｘ６⁺／Ｓｏｘ１^-細胞をＦＧＦ２でさらに４〜６日間処理した後、ＳＨＨで処理する。前脳ドーパミンニューロンを産生する際の工程及びドーパミンニューロンの特質を決定するための分析は、中脳ドーパミンニューロンに関して記載するものと同様である。主な差異は、特定の期間でのモルフォゲンの使用及びドーパミンニューロンの特徴である。 4). Production of Forebrain Neurons In another embodiment, the present invention differentiates primate ES cells (preferably human ES cells) into forebrain dopamine neurons, preferably transplantable neural precursors suitable for neural repair. It is a method to make it. Preferably, the method as described above with respect to midbrain dopamine neuron production will be initiated. To produce forebrain neurons, Pax6 ⁺ / Sox1 ⁻ cells are treated with FGF2 for an additional 4-6 days, followed by treatment with SHH. The steps in producing forebrain dopamine neurons and the analysis to determine the characteristics of dopamine neurons are similar to those described for midbrain dopamine neurons. The main difference is the use of morphogens and the characteristics of dopamine neurons during a specific period.

前脳ドーパミンニューロンを産生する際の第１の工程は、中脳アイデンティティーの誘導である。ＦＧＦ２（１０〜２０ｎｇ／ｍｌ）による６〜７日間のＰａｘ６＋／Ｓｏｘ１−初期ロゼット細胞の処理は、前脳転写因子であるＢｆ−１及びＯｔｘ２を発現する前駆体への細胞の効率的な分化をもたらす。   The first step in producing forebrain dopamine neurons is the induction of midbrain identity. Treatment of Pax6 + / Sox1-early rosette cells with FGF2 (10-20 ng / ml) for 6-7 days results in efficient differentiation of the cells into precursors expressing the forebrain transcription factors Bf-1 and Otx2. Bring.

第２の工程は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ、５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で６〜７日間、続いて正規のニューロン分化培地中でさらに２週間、ドーパミンニューロンが発生するまで前脳前駆体を培養することである。総分化細胞の３５％が、ドーパミンニューロンとなる。米国特許出願第０９／９７０，３８２号から得た以下の説明は、好ましい方法について記載している。   The second step is forebrain progenitor until dopamine neurons develop in 6-7 days in the presence of sonic hedgehog (SHH, 50-250 ng / ml), followed by an additional 2 weeks in normal neuronal differentiation medium. Is to culture. 35% of the total differentiated cells become dopamine neurons. The following description from US patent application Ser. No. 09 / 970,382 describes a preferred method.

まず、霊長類ＥＳ細胞系、好ましくはヒトＥＳ細胞系を獲得して増殖させる。Thomson，J.A.，et al.，Science 282：1145-1147（1998）並びに米国特許第５，８４３，７８０号及び同第６，２００，８０６号に記載される方法で、ＥＳ細胞（系）を得てもよいし、または、正常な核型（karyotype)を有しており、少なくとも１１ヶ月、好ましくは１２ヶ月間の連続培養後に未分化状態で増殖する能力を有するＥＳ細胞系を得るのに適した他の方法により、ＥＳ細胞（系）を得てもよい。胚幹細胞系はまた、培養全体にわたって、トロホブラスト（栄養芽細胞）を形成し、且つ３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）に由来する組織へ分化する能力を保持する。   First, a primate ES cell line, preferably a human ES cell line, is acquired and expanded. ES cells (lines) are obtained by the methods described in Thomson, JA, et al., Science 282: 1145-1147 (1998) and US Pat. Nos. 5,843,780 and 6,200,806. Or suitable for obtaining an ES cell line having a normal karyotype and capable of growing in an undifferentiated state after continuous culture for at least 11 months, preferably 12 months ES cells (systems) may be obtained by other methods. The embryonic stem cell line also retains the ability to form trophoblasts (trophoblasts) throughout the culture and to differentiate into tissues from all three germ layers (endoderm, mesoderm and ectoderm).

続いて、細胞を培養する。本発明の好ましい実施形態では、細胞は、好ましくは以下にまた上述のThomson，J.A.，et al.，1998並びに米国特許第５，８４３，７８０号及び同第６，２００，８０６号に開示されるように、照射した哺乳類、好ましくはマウス胚線維芽細胞のフィーダー（支持）細胞層上で増殖させる。本発明者等はまた、細胞がフィーダー細胞層なしで増殖され得ることも想定する。   Subsequently, the cells are cultured. In a preferred embodiment of the invention, the cells are preferably disclosed below and also in Thomson, JA, et al., 1998 and US Pat. Nos. 5,843,780 and 6,200,806 as described above. As such, they are grown on feeder (supporting) cell layers of irradiated mammals, preferably mouse embryonic fibroblasts. We also envision that cells can be grown without a feeder cell layer.

ＥＳ細胞コロニーは通常、ディスパーゼによる処理により接着細胞から無傷で取り出され、以下に記載するように胚様体（ＥＢ）と呼ばれる浮動性ＥＳ細胞凝集体として懸濁液中で好ましくは４日間成長される。   ES cell colonies are usually removed intact from adherent cells by treatment with dispase and grown as suspension ES cell aggregates called embryoid bodies (EBs) in suspension, preferably as described below, for 4 days. The

続いて、ＥＢを、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌでＦＧＦ２を含有する培地中で培養して、初期ロゼット細胞を産生する。培地の他の好ましい構成成分は、表３に記載している。しかしながら、多くの他の培地構成成分が適切である。概して、適切な培地は、神経細胞を成長させるのに使用される任意の培地である。以下の参照文献（上述のBain，G.，et al，1995；上述のOkabe，S.，et al.，1996；上述のMujtaba，T.，et al.，1999；上述のBrustle，O.，et al.，1999；Zhang，S.-C.，et al.，J．Neurosci．Res．59：421-429，2000；Zhang，S.-C.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 96：4089-4094，1999；Svendsen，C.N.，et al.，Exp．Neurol．137：376-388，1996；Carpenter，M.K.，et al.，Exp．Neurol．158：265-278，1999；Vescovi，A.L.，et al.，Exp．Neurol．156：71-83，1999）は、同じか、又は類似した培地を使用している。   Subsequently, EBs are cultured in a medium containing FGF2, preferably at 20 ng / ml, to produce early rosette cells. Other preferred components of the medium are listed in Table 3. However, many other media components are suitable. In general, a suitable medium is any medium used to grow nerve cells. The following references (Bain, G., et al., 1995 mentioned above; Okabe, S., et al., 1996 mentioned above; Mujtaba, T., et al., 1999 mentioned above; Brustle, O., mentioned above, et al., 1999; Zhang, S.-C., et al., J. Neurosci.Res.59: 421-429, 2000; Zhang, S.-C., et al., Proc.Natl.Acad. Sci. USA 96: 4089-4094, 1999; Svendsen, CN, et al., Exp. Neurol. 137: 376-388, 1996; Carpenter, MK, et al., Exp. Neurol. 158: 265-278, 1999 Vescovi, AL, et al., Exp. Neurol. 156: 71-83, 1999) uses the same or similar media.

培地中のおよそ５日の培養後に、平板培養されたＥＢは、扁平な細胞の成長(outgrowth)を生み出し、７日目までには、中心小伸長細胞は、図１Ｂに見られるようなロゼット形成を生み出す。これらの形成は、初期神経管に類似している（図１Ｂの挿入図）。以下に記載するように、形態学により、又はネスチン及びＭｕｓａｈｉ Ｉのような神経マーカー抗原を用いた免疫蛍光分析により、神経前駆体の存在を確認し得る。好ましくは、神経前駆体は、総細胞の少なくとも７２％、最も好ましくは少なくとも８４％を構成する。   After approximately 5 days in culture, the plated EBs produced flat cell outgrowth and by day 7 the central small elongated cells had rosette formation as seen in FIG. 1B. Produce. These formations are similar to the early neural tube (inset in FIG. 1B). As described below, the presence of neural progenitors can be confirmed by morphology or by immunofluorescence analysis using neural marker antigens such as nestin and Musahi I. Preferably, neural progenitors constitute at least 72%, most preferably at least 84% of the total cells.

以下で実施例に記載するように、好ましくは差次的酵素処理及び接着により、神経管様ロゼットをさらに単離し得る。簡潔に述べると、ディスパーゼによる処理は、中枢神経上皮島の優先的な脱離を招く。ロゼット細胞のクラスターを、周辺扁平細胞から分離するために、８〜１０日間培養した分化ＥＢを、好ましくは０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌ ディスパーゼ（Gibco BRL，Lifetechnologies，Rochville，MD）とともに、３７℃で１５〜２０分間インキュベートする。あるいは、０．２ｍｇ／ｍｌのディスパーゼを使用してもよい。ロゼットクランプは退縮するのに対して、周辺扁平細胞は、接着したままである。この時点で、ロゼットクランプは、フラスコを揺らすことにより取り外され(dislodge)得て、扁平細胞は接着した状態のままである。クランプをペレット化して、５ｍｌピペットで穏かに粉砕して、培養フラスコへ３０分間平板培養し、混入している個々の細胞を接着させる。続いて、浮遊しているロゼットクランプを、好ましくは結合を妨げるためにポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）でコーティングされた新たなフラスコへ移して、ヒト神経前駆体で使用される培地中で、ＦＧＦ２（通常２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養する。以下で実施例に記載するように、ディスパーゼによる処理、続く差次的接着は、通常少なくとも９０％で、最も好ましくは少なくとも９６％で、神経前駆体細胞の高度に濃縮された集団を生じる。さらに、ＰＳＡ−ＮＣＡＭに対する抗体を使用した免疫分離のような他の方法を使用して、神経前駆体細胞を分離してもよい。   As described below in the examples, neural tube-like rosettes can be further isolated, preferably by differential enzyme treatment and adhesion. Briefly, dispase treatment leads to preferential detachment of central neuroepithelial islands. To separate rosette cell clusters from surrounding squamous cells, differentiated EBs cultured for 8-10 days, preferably with 0.1-0.2 mg / ml dispase (Gibco BRL, Lifetechnologies, Rochville, MD), 37 Incubate at 20 ° C for 15-20 minutes. Alternatively, 0.2 mg / ml dispase may be used. Rosette clamps retreat, while peripheral squamous cells remain attached. At this point, the rosette clamp can be dislodged by shaking the flask and the squamous cells remain attached. Pellet the clamp, gently grind with a 5 ml pipette and plate for 30 minutes in a culture flask to allow the contaminating individual cells to adhere. Subsequently, the floating rosette clamp is transferred to a new flask, preferably coated with poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) to prevent binding, in the medium used for human neural precursors, Incubate in the presence of FGF2 (usually 20 ng / ml). As described in the Examples below, treatment with dispase followed by differential adhesion usually results in a highly enriched population of neural precursor cells, at least 90%, most preferably at least 96%. In addition, neural progenitor cells may be isolated using other methods such as immunosegregation using antibodies against PSA-NCAM.

以下の実施例は、ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体が３つすべてのＣＮＳ細胞型をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生することができることを実証する。   The following examples demonstrate that human ES cell-derived neural progenitors can produce all three CNS cell types in vitro.

以下の表は、本発明の本実施形態の様々な態様のフローチャートである：   The following table is a flowchart of various aspects of this embodiment of the invention:

別の実施形態では、本発明は、少なくとも７２％、好ましくは８４％の神経前駆体細胞を含む細胞集団である。これらの神経前駆体細胞は、ネスチン及びＭｕｓａｓｈｉ Ｉ陽性であることにより規定され得る。図１Ｂは、これらの細胞を特性化しているロゼット形成を示す。ロゼット形成とは、本発明者等は、細胞が円柱形状であり、管状（ロゼット）構造に整列され、身体中の神経管（発達中の脳）に類似していることを意味する。円柱状細胞形態及び管状構造は、図１Ｂの挿入図に示される。   In another embodiment, the invention is a cell population comprising at least 72%, preferably 84% neural precursor cells. These neural progenitor cells can be defined by being nestin and Musashi I positive. FIG. 1B shows rosette formation characterizing these cells. By rosette formation we mean that the cells are cylindrical, aligned in a tubular (rosette) structure, and resemble a neural tube in the body (the developing brain). Cylindrical cell morphology and tubular structure are shown in the inset of FIG. 1B.

別の実施形態では、本発明は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の神経前駆体細胞を含む細胞集団である。好ましくは、以下で実施例に記載するように、差次的酵素処理及び接着後にこれらの細胞を得る。   In another embodiment, the invention is a cell population comprising at least 90%, preferably at least 96% neural precursor cells. Preferably, these cells are obtained after differential enzyme treatment and adhesion, as described in the Examples below.

５．本発明の細胞集団の使用
特異的な伝達物質表現型及び特有の位置的アイデンティティーを有する特殊ヒトニューロン細胞型の産生は、神経障害における治療のための移植可能な細胞の供給源、例えばパーキンソン病のための中脳ドーパミンニューロン、精神的疾患のための前脳ドーパミンニューロン、脊髄障害及び運動ニューロン疾患（ＡＬＳを含む）のための脊髄運動ニューロンを提供する。 5). Use of the Cell Populations of the Invention Production of specialized human neuronal cell types with specific transmitter phenotypes and unique positional identities is the source of transplantable cells for treatment in neurological disorders, such as Parkinson's disease Provide midbrain dopamine neurons for, forebrain dopamine neurons for mental disorders, spinal motor neurons for spinal cord disorders and motor neuron diseases (including ALS).

ヒト胚幹細胞をまず神経上皮細胞へ、続いて特殊ニューロンへと指向性分化させるための段階的且つ化学的に規定される培養系の確立はまた、毒性及び治療剤のスクリーニングに前例のない新しい系を提供する。現在では、毒物学的及び治療用薬物のスクリーニングは、動物、動物細胞培養物又は遺伝的に異常なヒト細胞系を用いて実施される。ヒト胚幹細胞及び特殊ニューロン細胞へのそれらの分化は、ヒト神経発達の正常なプロセスを表す。したがって、本明細書中に記載する本発明は、正常なヒト神経発達に影響を及ぼす作用物質、又は異常な脳発達を潜在的にもたらす作用物質、並びに罹患状態におけるニューロン型の再生を刺激し得る作用物質をスクリーニングに適しているであろう。さらに、上述の系は、ドーパミンニューロンの死（パーキンソン病で見られるような）又は運動ニューロンの死（ＡＬＳで見られるような）を招く病理学的プロセスを模倣するように容易に修飾することができ、これらの疾患を治療するように設計される治療用作用物質をスクリーニングするのに有効に使用され得る。   Establishing a stepwise and chemically defined culture system for directed differentiation of human embryonic stem cells first into neuroepithelial cells and then into special neurons is also a new system unprecedented in screening for toxicity and therapeutic agents I will provide a. Currently, toxicological and therapeutic drug screening is performed using animals, animal cell cultures or genetically abnormal human cell lines. Their differentiation into human embryonic stem cells and special neuronal cells represents the normal process of human neural development. Thus, the invention described herein can stimulate agents that affect normal human neurodevelopment, or agents that potentially lead to abnormal brain development, as well as neuronal-type regeneration in diseased states. Agents will be suitable for screening. Furthermore, the system described above can easily be modified to mimic pathological processes that lead to death of dopamine neurons (as seen in Parkinson's disease) or death of motor neurons (as seen in ALS). Can be used effectively to screen for therapeutic agents designed to treat these diseases.

本発明のこの実施形態の好ましい方法では、本発明の細胞集団の１つを試験化合物に接触させて、かかる接触の結果を、接触させていない対照細胞集団と比較する。培養物の特徴を検査すること及びそれらを本出願内に含まれる既知の発達的特徴と比較することにより、特定の試験化合物が細胞集団に影響を及ぼしたかどうかを理解することができる。   In a preferred method of this embodiment of the invention, one of the cell populations of the invention is contacted with a test compound and the result of such contact is compared to a non-contacted control cell population. By examining the characteristics of the cultures and comparing them to the known developmental characteristics contained within this application, one can understand whether a particular test compound has affected the cell population.

前脳ドーパミン作動性ニューロンの産生
結果
ヒトＥＳ細胞は、ＦＧＦ２の存在下で分化して、神経管様構造を形成する。ヒトＥＳ細胞系であるＨ１、Ｈ９及びＨ９に由来するクローン細胞であるＨ９．２（上述のAmit，M.，et al.，2000）を、照射したマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で増殖させた（上述のThomson，J.A.，et al.，1998）。分化を開始させるために、ＥＳ細胞コロニーを剥離させて、胚様体（ＥＢ）として懸濁液中で４日間成長させた。続いて、ＥＢを組織培養処理フラスコにおいて、ＦＧＦ２を含有する化学的に規定される培地（Zhang，S.-C.，et al.，J．Neurosci．Res．59：421-429，2000；Zhang，S.-C.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 96：4089-4094，1999）中で培養した。ＦＧＦ２は、Peprotech，Inc.，Rocky Hill，NJから入手した。ＦＧＦ２中での５日の培養後に、平板培養されたＥＢは、扁平な細胞の成長をもたらした。同時に、小伸長細胞の数の増大が、分化ＥＢの中心で観察された（図１Ａ）。規定培地中で７日までには、中心小伸長細胞は、ロゼット形成を生み出し(generate)（図１Ｂ）、トルイジンブルー染色した切片により示されるように、初期神経管に類似していた（図１Ｂの挿入図）。免疫蛍光分析は、神経マーカー抗原ネスチン及びＭｕｓａｓｈｉ−１（Lendahl，U.，et al.，Cell 60：585-595，1990；Kaneko，Y.，et al.，Dev．Neurosci．22：139-153，2000）の発現が、ロゼット中の細胞に主として制限されるが、分化ＥＢ細胞の周辺における扁平細胞には制限されないことを明らかにした（図１Ｃ〜図１Ｅ）。未分化ＥＳ細胞は、これらのマーカーに対して免疫陰性であった。神経管様構造の形成は、ＦＧＦ２の存在下でＥＢの大部分で観察された（Ｈ９及びＨ９．２系から総３５０ＥＢの９４％、３回の別個の実験）。ＦＧＦ２の非存在下では、十分体系化された(organized)ロゼットは観察されなかった。 Results of production of forebrain dopaminergic neurons Human ES cells differentiate in the presence of FGF2 to form neural tube-like structures. H9.2 (Amit, M., et al., 2000), a clonal cell derived from the human ES cell line H1, H9 and H9, was applied on the feeder cell layer of irradiated mouse embryo fibroblasts. Proliferated (Thomson, JA, et al., 1998, supra). To initiate differentiation, ES cell colonies were detached and grown as embryoid bodies (EB) in suspension for 4 days. Subsequently, EBs were cultured in tissue culture treated flasks in a chemically defined medium containing FGF2 (Zhang, S.-C., et al., J. Neurosci. Res. 59: 421-429, 2000; Zhang S.-C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4089-4094, 1999). FGF2 was obtained from Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ. After 5 days of culture in FGF2, plated EBs resulted in flat cell growth. At the same time, an increase in the number of small elongated cells was observed in the center of differentiated EBs (FIG. 1A). By 7 days in defined medium, central small elongated cells generate rosette formation (FIG. 1B) and resemble early neural tubes as shown by toluidine blue stained sections (FIG. 1B). Inset). Immunofluorescence analysis was performed using the neural marker antigens nestin and Musashi-1 (Lendahl, U., et al., Cell 60: 585-595, 1990; Kaneko, Y., et al., Dev. Neurosci. 22: 139-153. , 2000) was found to be mainly restricted to cells in rosettes, but not to squamous cells around differentiated EB cells (FIGS. 1C-1E). Undifferentiated ES cells were immunonegative for these markers. The formation of neural tube-like structures was observed in the majority of EBs in the presence of FGF2 (94% of total 350 EB from H9 and H9.2 systems, 3 separate experiments). In the absence of FGF2, no well organized rosettes were observed.

神経管様ロゼットは、差次的酵素処理及び接着により単離することができる。ＦＧＦ２への連続接触により、円柱状ロゼット細胞は増殖して、多層を形成した。円柱状ロゼット細胞は、高い頻度で、ＥＢの大部分を構成し、周辺扁平細胞とはっきり分けられた。ディスパーゼによる処理は、中枢神経上皮島の優先的な脱離を招き、周辺細胞は主として接着したままであった（図１Ｆ）。混入している単細胞は、細胞培養皿への短期間の接着により分離した。この単離及び濃縮手順直後に実施した細胞計数により、単離された神経上皮クラスターに関連する細胞が、分化ＥＢ培養物における細胞の７２〜８４％を構成することが示された。免疫細胞化学分析により、４回の別個の実験で検査された１３，３２４個の細胞に基づいて、単離ロゼット細胞の９６±０．６％が、ネスチンに関して陽性に染色されることが示された。これらの細胞の大多数はまた、Ｍｕｓａｓｈｉ−１及びＰＳＡ−ＮＣＡＭに関しても陽性であった（図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ）。   Neural tube-like rosettes can be isolated by differential enzyme treatment and adhesion. With continuous contact with FGF2, cylindrical rosette cells proliferated and formed multiple layers. Cylindrical rosette cells frequently constituted the majority of EBs and were clearly separated from surrounding squamous cells. Dispase treatment resulted in preferential detachment of central neuronal epithelial islands, and surrounding cells remained largely attached (FIG. 1F). Contaminated single cells were separated by brief adhesion to cell culture dishes. Cell counts performed immediately after this isolation and enrichment procedure indicated that the cells associated with the isolated neuroepithelial cluster comprised 72-84% of the cells in differentiated EB cultures. Immunocytochemical analysis shows that 96 ± 0.6% of the isolated rosette cells stain positive for nestin based on 13,324 cells examined in 4 separate experiments. It was. The majority of these cells were also positive for Musashi-1 and PSA-NCAM (FIGS. 1G, 1H, 1I).

ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体は、３つすべてのＣＮＳ細胞型をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する。単離した神経前駆体細胞は、ヒト胎児脳組織に由来する「ニューロスフェア」培養物に類似して、懸濁培養で浮動性細胞凝集体として増殖させた（上述のZhang，S.-C.，et al.，2000；上述のSvendsen，C.N.，et al.，1996；上述のCarpenter，M.K.，et al.，1999；上述のVescovi，A.L.，et al.，1999）。ＢｒｄＵ取り込み試験は、前駆体細胞増殖の刺激が、ＦＧＦ２に依存性であり、ＥＧＦ又はＬＩＦ単独により誘発され得ないことを明らかにした。さらに、ＦＧＦ２をＥＧＦ及び／又はＬＩＦと組み合わせた場合、相加効果又は相乗効果は観察されなかった（図２Ａ）。   Human ES cell-derived neural progenitors produce all three CNS cell types in vitro. Isolated neural progenitor cells were grown as floating cell aggregates in suspension culture, similar to “neurosphere” cultures derived from human fetal brain tissue (see Zhang, S.-C., supra). , Et al., 2000; Svendsen, CN, et al., 1996 as described above; Carpenter, MK, et al., 1999 as described above; Vescovi, AL, et al., 1999 as described above. The BrdU incorporation test revealed that stimulation of precursor cell proliferation is dependent on FGF2 and cannot be induced by EGF or LIF alone. Furthermore, no additive or synergistic effects were observed when FGF2 was combined with EGF and / or LIF (FIG. 2A).

ＥＳ細胞由来の神経前駆体のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化は、ＦＧＦ２の除去並びにオルニチン及びラミニン基質上での平板培養により誘導された。数日以内に、個々の細胞及び無数の成長円錐体が球体から生じ、スターバーストの外観を呈した。平板に播種後７〜１０日までには、球体から発した突起は、顕著な線維束を形成した。高い頻度で、小遊走細胞は、線維と密接に関連して観察された（図２Ｂ）。分化した培養物の免疫蛍光分析は、成長領域における細胞の大多数が、ニューロンマーカーであるＭＡＰ２ａｂ及びβ_III−チューブリンを発現したことを明らかにした（図２Ｃ）。低分子量神経線維（ＮＦ）と高分子量ＮＦの発現が、平板培養後７〜１０日目まで及び１０〜１４日目までのそれぞれにおいて観察された（図２Ｄ）。様々な神経伝達物質に対する抗体を使用して、ＥＳ細胞由来のニューロンをさらに特性化した。ニューロンの大部分がグルタミン酸作動性表現型を示した（図２Ｅ）のに対して、より小比率が、ＧＡＢＡに対する抗体で標識された。高い頻度で、これらのニューロンは、極形態を示した（図２Ｆ）。少数のニューロンが、ドーパミン合成に関する律速酵素であるＴＨを発現することがわかった（図２Ｇ）。ＧＦＡＰ⁺アストロサイトは、成長因子退薬後の最初の２週間以内にはまれにしか見出されなかった（図２Ｃ）が、長期にわたるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化後にはより頻繁になった。４週までには、ＧＦＡＰ⁺アストロサイトは、分化されたニューロンの真下に広範囲にわたる層を形成した（図２Ｄ）。オリゴデンドロサイトは、標準的な培養条件下では観察されなかったのに対して、細胞を血小板由来成長因子Ａ（上述のZhang，S.-C.，et al.，2000）の存在下で２週間以上培養した場合に、典型的なオリゴデンドロサイト形態を有するわずかなＯ４−免疫反応性細胞が観察された（図２Ｈ）。したがって、ＥＳ細胞由来の神経前駆体は、ＣＮＳの３つすべての主要な細胞型を産生する。 In vitro differentiation of ES cell-derived neural progenitors was induced by removal of FGF2 and plating on ornithine and laminin substrates. Within a few days, individual cells and myriad growth cones emerged from the spheres and appeared starburst. By 7-10 days after seeding on the flat plate, the protrusions emanating from the sphere formed a remarkable fiber bundle. Frequently, micromigrated cells were observed in close association with the fibers (FIG. 2B). Immunofluorescence analysis of differentiated cultures revealed that the majority of cells in the growth region expressed neuronal markers MAP2ab and β _III -tubulin (FIG. 2C). Expression of low molecular weight nerve fibers (NF) and high molecular weight NF was observed up to 7-10 days and 10-14 days after plating (FIG. 2D). Antibodies to various neurotransmitters were used to further characterize ES cell-derived neurons. Most of the neurons showed a glutamatergic phenotype (FIG. 2E), whereas a smaller proportion was labeled with an antibody against GABA. Frequently, these neurons showed polar morphology (FIG. 2F). A few neurons were found to express TH, the rate-limiting enzyme for dopamine synthesis (FIG. 2G). GFAP ⁺ astrocytes were rarely found within the first 2 weeks after withdrawal of growth factors (FIG. 2C), but became more frequent after prolonged in vitro differentiation. By 4 weeks, GFAP ⁺ astrocytes formed a broad layer beneath differentiated neurons (FIG. 2D). Oligodendrocytes were not observed under standard culture conditions, whereas the cells were 2 in the presence of platelet-derived growth factor A (Zhang, S.-C., et al., 2000, supra). When cultured for over a week, few O4-immunoreactive cells with typical oligodendrocyte morphology were observed (FIG. 2H). Thus, ES cell-derived neural progenitors produce all three major cell types of the CNS.

ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体は、ｉｎ ｖｉｖｏで遊走し、合体して、且つ分化する。ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体のｉｎ ｖｉｖｏでの分化を評価するために、本発明者等は、ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体を新生マウスの側脳室へ移植した（Flax，J.D.，et al.，Nat．Biotech．16：1033-1039，1998）。移植された細胞は、脳室系の様々な領域でクラスターを形成し、大量に各種宿主脳領域へ取り込まれた。移植の１週後と４週後との間で分析した２２個の脳のうち、脳室内クラスター及び取り込まれた細胞は、それぞれ１９個及び１８個のレシピエント脳において見出された。より長期間後に分析した個々の動物により、移植された細胞が、移植の少なくとも８週間後に検出可能であることが示された。クラスター内の細胞は、ネスチン、β_III−チューブリン及びＭＡＰ２ａｂに対する抗体に対して強力な免疫反応性を示した。凝集体におけるほんのわずかな細胞がＧＦＡＰを発現した。未分化ＥＳ細胞及び非神経上皮で通常発現されるマーカーであるアルカリホスファターゼ及びサイトケラチンは、クラスター内では検出されなかった。奇形腫形成は観察されなかった。 Human ES cell-derived neural precursors migrate in vivo, coalesce and differentiate. In order to evaluate in vivo differentiation of human ES cell-derived neural progenitors, the present inventors transplanted human ES cell-derived neural progenitors into the lateral ventricle of newborn mice (Flax, JD, et al., Nat. Biotech. 16: 1033-1039, 1998). The transplanted cells formed clusters in various regions of the ventricular system, and were taken up in large amounts by various host brain regions. Of the 22 brains analyzed between 1 and 4 weeks after transplantation, intraventricular clusters and incorporated cells were found in 19 and 18 recipient brains, respectively. Individual animals analyzed after a longer period showed that the transplanted cells were detectable at least 8 weeks after transplantation. Cells in a cluster, nestin, beta _III - showed strong immunoreactivity against antibodies to tubulin and MAP2ab. Only a few cells in the aggregates expressed GFAP. Alkaline phosphatase and cytokeratin, markers normally expressed in undifferentiated ES cells and non-neural epithelium, were not detected in the cluster. Teratoma formation was not observed.

ヒト特異的プローブによるＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法及びヒト核特異的抗原の免疫組織化学的検出は、多数の脳領域において移植された細胞の存在を明らかにした。広範囲に及ぶドナー細胞取り込みを示す灰白質領域は、皮質（図３Ａ）、海馬（図３Ｂ、図３Ｃ）、嗅球、中隔（図３Ｄ）、視床、視床下部（図３Ｅ）、線条（図３Ｆ）及び中脳（図３Ｇ）を包含した。白質領域への取り込みは、脳梁、内包及び海馬線維路で最も顕著であった。形態学的には、取り込まれたヒト細胞は、周辺宿主細胞と区別できず、ヒト特異的マーカーを用いることでのみ検出可能であった（図３）。細胞型特異的抗体による二重標識は、取り込まれた細胞が、ニューロン及びグリアの両方へ分化したことを明らかにした。ヒトＥＳ細胞由来のニューロンは、β_III−チューブリン及びＭＡＰ２に対する抗体を用いてはっきりと描写することができた（図３Ｈ、図３Ｊ）。高い頻度で、ヒトＥＳ細胞由来のニューロンは、長い突起を伴う極形態を示した（図３Ｈ）。さらに、多極及び未熟単極形態を有するニューロンが見出された（図３Ｊ）。ドナー由来のニューロンは、宿主脳へと長距離を突出させる無数の軸索を産生し、灰白質及び白質の両方で検出された。ドナー由来のニューロンは、脳梁、前交連及び海馬采のような線維路内で特に豊富であり、そこではドナー由来のニューロンは、しばしば、単一切片内の数百マイクロメートルにわたって見出され得た（図３Ｉ）。 DNA in situ hybridization with human specific probes and immunohistochemical detection of human nuclear specific antigens revealed the presence of transplanted cells in multiple brain regions. The gray matter regions showing extensive donor cell uptake are cortex (Fig. 3A), hippocampus (Figs. 3B, 3C), olfactory bulb, septum (Fig. 3D), thalamus, hypothalamus (Fig. 3E), striatum (Fig. 3F) and midbrain (FIG. 3G) were included. Uptake into the white matter region was most prominent in the corpus callosum, endothelium and hippocampal fiber tract. Morphologically, the incorporated human cells were indistinguishable from surrounding host cells and could only be detected using human-specific markers (FIG. 3). Double labeling with cell type-specific antibodies revealed that the incorporated cells differentiated into both neurons and glia. Neurons derived from human ES cells could be clearly delineated using antibodies against β _III -tubulin and MAP2 (FIG. 3H, FIG. 3J). Frequently, human ES cell-derived neurons showed polar morphology with long processes (FIG. 3H). In addition, neurons with multipolar and immature monopolar morphology were found (FIG. 3J). Donor-derived neurons produced a myriad of axons that project long distances into the host brain and were detected in both gray matter and white matter. Donor-derived neurons are particularly abundant in fiber tracts such as corpus callosum, anterior commissures, and hippocampus, where donor-derived neurons can often be found over hundreds of micrometers in a single section. (FIG. 3I).

ニューロンのほかに、少数のＥＳ細胞由来のアストロサイトが、宿主脳組織内に検出された。少数のＥＳ細胞由来のアストロサイトは、星状形態を示し、ＧＦＡＰの強力な発現を示した（図３Ｋ）。対比して、ミエリンタンパク質に対する抗体による取り込まれたヒト細胞の二重標識は、成熟オリゴデンドロサイトを検出することができなかった。宿主脳へ遊走したドナー細胞の幾つかは、移植の最大４週間でさえ、ネスチン陽性表現型を保持した。これらの細胞の多くは、血管周囲位置に見られた。   In addition to neurons, a small number of ES cell-derived astrocytes were detected in host brain tissue. A small number of ES cell-derived astrocytes showed an astral morphology and showed strong expression of GFAP (FIG. 3K). In contrast, double labeling of incorporated human cells with antibodies to myelin protein failed to detect mature oligodendrocytes. Some of the donor cells that migrated to the host brain retained a nestin-positive phenotype even up to 4 weeks after transplantation. Many of these cells were found around the blood vessels.

論考
本研究は、成熟ニューロン及びグリアを産生することが可能な移植可能な神経前駆体が、高収率でヒトＥＳ細胞から産生することができることを示している。本明細書中に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化手順である成長因子媒介性増殖／分化、並びに神経前駆体細胞の差次的接着を利用することは、神経発達の研究に関する新たな土台、及び神経系修復のためのドナー細胞の産生を提供する。 Discussion This study shows that transplantable neural precursors capable of producing mature neurons and glia can be produced from human ES cells in high yield. Utilizing the in vitro differentiation procedure described herein, growth factor-mediated proliferation / differentiation, and differential adhesion of neural precursor cells is a new foundation for the study of neurodevelopment and the nervous system Providing production of donor cells for repair.

この研究の重要な見解は、ヒトＥＳ細胞からの神経前駆体の分化が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経管様構造の形成を伴う神経系発達の初期工程を反復するようであるということの観察である。この現象はここでは、制御された条件下でヒト神経発達の初期段階を研究及び実験的に操作するのに利用することができる。化学的に規定された培養系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト神経上皮増殖及び特定化に対する単一因子の影響を探索するための特有の機会を提供する。発達中のヒト脳に由来する前駆体と同様に、ヒトＥＳ細胞由来の前駆体は、ＦＧＦ２に対して強力な増殖性応答を示す（上述のFlax，J.D.，et al.，1998）。しかしながら、増殖に対する相加効果も相乗効果も、ＥＧＦ又はＬＩＦにより誘発され得ない。この見解は、初代細胞を用いて得られるデータ（上述のZhang，S.-C.，et al.，2000；上述のSvendsen，C.N.，et al.，1996；上述のCarpenter，M.K.，et al.，1999；上述のVescovi，A.L.，et al.，1999）と異なり、ＥＳ細胞由来の神経前駆体の増殖が、胎児ヒト脳に由来する前駆体細胞よりも多くの未熟段階を表すということを示唆することができる。げっ歯類細胞に関する研究は実際に、初期神経発生から単離された神経幹細胞が、増殖に関してＦＧＦ２に依存し、ＦＧＦに対する応答性が、神経前駆体細胞分化の後期段階でのみ獲得されるということを示している（Kalyani，A.D.，et al.，Dev．Biol．186：202-223，1997；Fricker，R.A.，et al.，J．Neurosci．19：5990-6005，1999）。   An important view of this study is the observation that differentiation of neural progenitors from human ES cells appears to repeat the initial steps of nervous system development with the formation of neural tube-like structures in vitro. This phenomenon can now be used to study and experimentally manipulate the early stages of human nerve development under controlled conditions. Chemically defined culture systems provide a unique opportunity to explore the effects of single factors on human neuroepithelial proliferation and specification in vitro. Similar to precursors from the developing human brain, precursors from human ES cells show a strong proliferative response to FGF2 (Flax, J.D., et al., 1998, supra). However, neither additive nor synergistic effects on proliferation can be induced by EGF or LIF. This view is based on data obtained using primary cells (Zhang, S.-C., et al., 2000, supra; Svendsen, CN, et al., 1996, supra; Carpenter, MK, et al., Supra. , 1999; unlike the above-mentioned Vescovi, AL, et al., 1999), suggests that ES cell-derived neural precursors represent more premature stages than precursor cells derived from fetal human brain can do. Studies on rodent cells actually show that neural stem cells isolated from early neurogenesis are dependent on FGF2 for proliferation, and responsiveness to FGF is acquired only at later stages of neural precursor cell differentiation. (Kalyani, AD, et al., Dev. Biol. 186: 202-223, 1997; Fricker, RA, et al., J. Neurosci. 19: 5990-6005, 1999).

神経管様構造のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生及びそれらの差次的接着に基づいてこれらの構造を単離することができることは、ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆体を高純度で産生するための簡素だが効率的なアプローチを提供する。具体的には、神経上皮構造内の強力な細胞間及び組織培養基材へのそれらの低い接着性が、未分化ＥＳ細胞又は他の体細胞系の細胞の著しい混入を伴わずに神経細胞の選択的単離を可能にする。この手順の高い効率は、単離細胞の９５％以上がネスチン陽性表現型を示し、ＥＳ細胞又は非神経上皮が移植レシピエントにおいて検出不可能であるという事実により反映される。未分化ＥＳ細胞及び他の系統に対する前駆体は、腫瘍及び外来組織を形成し得るため、精製された体細胞集団の産生が、ＥＳ細胞ベースの神経移植戦略の開発にとって重要な前提条件である。   The ability to isolate these structures based on the in vitro production of neural tube-like structures and their differential adhesion is simple for producing human ES cell-derived neural precursors in high purity. Provide an efficient approach. Specifically, their strong intercellular structure within the neuroepithelial structure and their low adhesion to tissue culture substrates is associated with neuronal cell proliferation without significant contamination of undifferentiated ES cells or other somatic cell lines. Allows selective isolation. The high efficiency of this procedure is reflected by the fact that more than 95% of the isolated cells show a nestin positive phenotype and ES cells or non-neuroepithelium are undetectable in transplant recipients. Since precursors to undifferentiated ES cells and other lineages can form tumors and foreign tissues, production of purified somatic cell populations is an important prerequisite for the development of ES cell-based neural transplant strategies.

新生児マウス脳への移植後、ＥＳ細胞由来の神経前駆体は、多種多様の脳領域へ取り込まれ、そこでＥＳ細胞由来の神経前駆体は、ニューロン及びグリアへ分化した。ｉｎ ｖｉｖｏで成熟をオリゴデンドロサイト検出することができないことは、それらのげっ歯類相当物と対比して、ヒト神経前駆体の低いオリゴデンドロサイト分化効率に起因する可能性が高い（Svendsen，C.N.，et al.，Brain Pathol．9：499-513，1999）。意外にも、ドナー由来のニューロンは、生後の神経発生を示す部位に制限されず、脳の多くの他の領域にも見出された。同様のデータが、成体げっ歯類脳へのヒトＣＮＳ由来の前駆体の移植に関与する研究で得られた（Tropepe，V.，et al.，Dev．Biol．208：166-188，1999）。有糸***後脳領域への個々の前駆体細胞の取り込みは、成体脳及び脊髄における細胞置換に関して特に関連性が高い。さらに、取り込まれた細胞が、領域特異的特性を獲得して、機能的に活性となるかどうか、並びに取り込まれた細胞が、どの程度まで領域特異的特性を獲得して、機能的に活性となるかを決定するのに、より詳細な研究が必要とされる。   After transplantation into the neonatal mouse brain, ES cell-derived neural progenitors were taken up into a wide variety of brain regions, where ES cell-derived neural progenitors differentiated into neurons and glia. The inability to detect oligodendrocytes for maturation in vivo is likely due to the low oligodendrocyte differentiation efficiency of human neural precursors compared to their rodent counterparts (Svendsen, CN , Et al., Brain Pathol. 9: 499-513, 1999). Surprisingly, donor-derived neurons were not restricted to sites that showed postnatal neurogenesis, but were also found in many other areas of the brain. Similar data were obtained in studies involving the transplantation of human CNS-derived precursors into the adult rodent brain (Tropepe, V., et al., Dev. Biol. 208: 166-188, 1999). . The uptake of individual precursor cells into the postmitotic brain region is particularly relevant for cell replacement in the adult brain and spinal cord. Furthermore, whether the incorporated cells acquire region-specific properties and become functionally active, and to what extent the incorporated cells acquire region-specific properties and become functionally active. More detailed research is needed to determine what will happen.

成熟及び未熟の神経上皮細胞から構成される脳室内クラスターを除いて、占拠性病変は、宿主脳内では検出されなかった。最も顕著なことに、奇形腫形成は、最大８週間の術後期間中観察されなかった。特に非ヒト霊長類におけるより厳格な長期安全性研究が、潜在的な臨床用途を検討するまえに必要とされることが明らかであるが、本発明者等のデータは、分化ヒトＥＳ細胞培養物から単離された神経前駆体が神経修復用の有望なドナー供給源を表すことを示している。   Except for intraventricular clusters composed of mature and immature neuroepithelial cells, no occupying lesions were detected in the host brain. Most notably, teratoma formation was not observed during a post-operative period of up to 8 weeks. Although it is clear that more rigorous long-term safety studies, especially in non-human primates, are needed before considering potential clinical uses, our data are from differentiated human ES cell cultures. 2 shows that a neural precursor isolated from represents a promising donor source for nerve repair.

実験プロトコル
ＥＳ細胞の培養。ＥＳ細胞であるＨ１（継代１６〜３３）、Ｈ９（ｐ３４〜５５）及びＨ９に由来するクローン細胞であるＨ９．２（ｐ３４〜４６）（上述のAmit，M.，et al.，2000）を、過去に記載されたように（上述のThomson，J.A.，et al.，1998）、照射したマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２、２０％血清代替物（Gibco）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール、２μｇ／ｍｌヘパリン、及び４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Pepro Tech Inc.，Rochy Hill，NJ）から構成される培地を毎日交換して培養した。核型分析により、所定の継代での系は二倍体であることが示された。 Experimental Protocol ES cell culture. ES cell H1 (passage 16-33), H9 (p34-55) and H9-derived clonal cell H9.2 (p34-46) (Amit, M., et al., 2000, supra) On the feeder cell layer of irradiated mouse embryo fibroblasts as previously described (Thomson, JA, et al., 1998, supra) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12, 20% Culture medium consisting of serum replacement (Gibco), 0.1 mM β-mercaptoethanol, 2 μg / ml heparin, and 4 ng / ml FGF2 (Pepro Tech Inc., Rochy Hill, NJ) was changed daily and cultured. Karyotype analysis showed that the system at a given passage was diploid.

ＥＳ細胞培養物の分化。ＥＳ細胞培養物を、ディスパーゼ（Gibco BRL、０．１ｍｇ／ｍｌ）とともに３７℃で３０分間インキュベートし、無傷のＥＳ細胞コロニーを取り出した。ＥＳ細胞コロニーをペレット化して、ＦＧＦ２なしのＥＳ細胞培地中に再懸濁させて、毎日培地交換しながら２５ｃｍ²組織培養フラスコ（Nunc）において４日間培養した。ＥＳ細胞コロニーは、浮遊ＥＢとして成長したのに対して、あらゆる残存フィーダー細胞は、フラスコに接着した。ＥＢを新たなフラスコへ移すことにより、フィーダー細胞を除去した。続いて、ＥＢ（およそ５０個／フラスコ）を２５ｃｍ²組織培養フラスコ（Nunc）において、インスリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレシン（６０μＭ）、亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）及びヘパリン（２μｇ／ｍｌ）を補充（添加）したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で平板培養した（上述のZhang，S.-C.，et al.，2000、上述のZhang，S.-C.，et al.，1999）。 Differentiation of ES cell cultures. ES cell cultures were incubated with dispase (Gibco BRL, 0.1 mg / ml) for 30 minutes at 37 ° C. to remove intact ES cell colonies. ES cell colonies were pelleted, resuspended in ES cell medium without FGF2, and cultured for 4 days in 25 cm ² tissue culture flasks (Nunc) with daily medium changes. ES cell colonies grew as floating EBs, whereas any remaining feeder cells adhered to the flask. Feeder cells were removed by transferring EB to a new flask. Subsequently, EB (approximately 50 / flask) was added to insulin (25 μg / ml), transferrin (100 μg / ml), progesterone (20 nM), putrescine (60 μM), sodium selenite in a 25 cm ² tissue culture flask (Nunc). (Zhang, S.-C., et al., Supra) in DMEM / F12 supplemented with (added) (30 nM) and heparin (2 μg / ml) in the presence of FGF2 (20 ng / ml). 2000, Zhang, S.-C., et al., 1999, supra).

神経前駆体細胞の単離及び培養：周辺扁平細胞からロゼット細胞のクラスターを分離するために、培養物を０．１ｍｇ／ｍｌのディスパーゼとともに３７℃で１５〜２０分間インキュベートした。ロゼットクランプは退縮したのに対して、周辺扁平細胞は、付着したままであった。この時点で、ロゼットクランプは、フラスコを揺らすことにより取り外され、扁平細胞は接着した状態のままであった。クランプをペレット化して、５ｍｌピペットで穏かに粉砕して、培養フラスコへ３０分間平板培養して、混入している個々の細胞を接着させた。続いて、浮遊しているロゼットクランプを、結合を妨げるためにポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）でコーティングされた新たなフラスコへ移して、ヒト神経前駆体で使用される培地中（上述のZhang，S.-C.，et al.，2000）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。神経分化及び単離の効率を定量化するために、分離したての細胞クラスター及び残された扁平細胞をトリプシン（０．１％ＥＤＴＡ中０．０２５％）で解離（分離）させて、計数した。ＥＳ細胞から分化した総細胞間での推定神経前駆体（ロゼット細胞）の割合は、Ｈ９及びＨ９．２系に関する３回の別個の実験に基づいて得られた。ＥＳ細胞由来の神経前駆体の分化潜在性の分析のために、細胞をオルニチン／ラミニン基質上で、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２サプリメント（Gibco）、ｃＡＭＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、PeproTech）から構成される培地中で、ＦＧＦ２の存在なしで培養した。突起膠細胞分化に関しては、記載されるように（上述のZhang，S.-C.，et al.，2000）、ＥＳ細胞由来の神経前駆体を、Ｎ１（Gibco）及び血小板由来成長因子Ａ（ＰＤＧＦＡ）（２ｎｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。形態学的観察並びに前駆体及びより成熟した神経細胞に関するマーカーによる免疫染色は、分化の過程中に実施された。   Isolation and culture of neural progenitor cells: To separate rosette cell clusters from surrounding squamous cells, the cultures were incubated with 0.1 mg / ml dispase at 37 ° C. for 15-20 minutes. Rosette clamps regressed while peripheral squamous cells remained attached. At this point, the rosette clamp was removed by shaking the flask and the squamous cells remained attached. Clamps were pelleted, gently crushed with a 5 ml pipette and plated for 30 minutes in culture flasks to allow adherent individual cells to adhere. Subsequently, the floating rosette clamp is transferred to a new flask coated with poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) to prevent binding, in the medium used for human neural precursors (Zhang as described above). S.-C., et al., 2000) and FGF2 (20 ng / ml). To quantify the efficiency of neural differentiation and isolation, freshly separated cell clusters and remaining squamous cells were dissociated (separated) with trypsin (0.025% in 0.1% EDTA) and counted. . The proportion of putative neural progenitors (rosette cells) among total cells differentiated from ES cells was obtained based on three separate experiments on the H9 and H9.2 systems. For analysis of the differentiation potential of ES cell-derived neural progenitors, cells were cultured on ornithine / laminin substrate on DMEM / F12, N2 supplement (Gibco), cAMP (100 ng / ml) and BDNF (10 ng / ml, PeproTech ) In the presence of FGF2. For oligodendrocyte differentiation, as described (Zhang, S.-C., et al., 2000, supra), ES cell-derived neural progenitors were transformed into N1 (Gibco) and platelet-derived growth factor A ( The cells were cultured in DMEM supplemented with (PDGFA) (2 ng / ml). Morphological observations and immunostaining with markers for precursors and more mature neurons were performed during the differentiation process.

組織化学的及び免疫組織化学的染色。ロゼット形成をより良好に可視化するために、ロゼットを伴う培養物を、ＰＢＳ中ですすいで、４％パラホルムアルデヒド及び０．２５％グルタルアルデヒド中で１時間固定した。続いて、記載されるように（上述のZhang，S.-C.，et al.，1999）、固定した細胞をプラスチック樹脂中に包埋するために加工した。続いて、培養細胞を１μｍ厚に切片化して、トルイジンブルーで染色した。免疫染色に関して、他の箇所で詳述される適切な蛍光二次抗体（上述のZhang，S.-C.，et al.，2000、Zhang，S.-C.，et al.，1999）により検出される以下の一次抗体で、カバーガラス培養物を免疫染色した：抗ネスチン（ポリクローナル、ＮＩＮＤＳのDr．R．McKayから贈与、１：１，０００）、抗ポリシアル酸化ニューロン細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、マウスＩｇＭ、フランスのマルセイユ大学のDr．G．Rougonから贈与、１：２００）、抗Ｍｕｓａｓｈｉ−１（ラットＩｇＧ、日本の東京大学のDr．H．Okanoから贈与、１：５００）、抗ＧＦＡＰ（ポリクローナル、Dako、１：１，０００）、抗ヒトＧＡＦＰ（スタンバーグポリクローナル、１：１０，０００）、Ｏ４（マウスＩｇＭ、ハイブリドーマ上清、１：５０）、抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、Pel Freez、１：５００）。残りの抗体は、Sigmaからのものであった：抗β_III−チューブリン（マウスＩｇＧ，１：５００）、抗神経フィラメント（ＮＦ）６８（マウスＩｇＧ、１：１，０００）、抗ＮＦ２００（ポリクローナル、１：５，０００）、抗ＭＡＰ２ａｂ（マウスＩｇＧ、１：２５０）、抗γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ、ポリクローナル、１：１０，０００）、抗グルタメート（マウスＩｇＧ、１：１０，０００）。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みに関して、各群における４つのカバーガラス培養物を２μＭのＢｒｄＵとともに１６時間インキュベートした後、培養物を４％パラホルムアルデヒド中で固定して、１Ｎ ＨＣｌで変性させて、免疫標識及び細胞計数用に加工した（上述のZhang，S.-C.，et al.，2000、Zhang，S.-C.，et al.，1999）。 Histochemical and immunohistochemical staining. In order to better visualize rosette formation, cultures with rosettes were rinsed in PBS and fixed in 4% paraformaldehyde and 0.25% glutaraldehyde for 1 hour. Subsequently, the fixed cells were processed for embedding in plastic resin as described (Zhang, S.-C., et al., 1999, supra). Subsequently, the cultured cells were sectioned to a thickness of 1 μm and stained with toluidine blue. For immunostaining, with appropriate fluorescent secondary antibodies detailed elsewhere (Zhang, S.-C., et al., 2000, Zhang, S.-C., et al., 1999, above) Cover glass cultures were immunostained with the following primary antibodies detected: anti-nestin (polyclonal, a gift from Dr. R. McKay of NINDS, 1: 1,000), anti-polysialylated neuronal cell adhesion molecule (PSA- NCAM, mouse IgM, donated by Dr. G. Rougon, Marseille University, France, 1: 200), anti-Musashi-1 (rat IgG, donated by Dr. H. Okano, University of Tokyo, Japan, 1: 500), anti GFAP (polyclonal, Dako, 1: 1,000), anti-human GAFP (Stamburg polyclonal, 1: 10,000), O4 (mouse IgM, hybridoma supernatant, 1:50), anti-tyrosine hydroxylase (T , Pel Freez, 1: 500). The remaining antibodies were from Sigma: anti-β _III -tubulin (mouse IgG, 1: 500), anti-neurofilament (NF) 68 (mouse IgG, 1: 1,000), anti-NF200 (polyclonal). , 1: 5,000), anti-MAP2ab (mouse IgG, 1: 250), anti-γ-aminobutyric acid (GABA, polyclonal, 1: 10,000), anti-glutamate (mouse IgG, 1: 10,000). For bromodeoxyuridine (BrdU) uptake, four coverslip cultures in each group were incubated with 2 μM BrdU for 16 hours, after which the cultures were fixed in 4% paraformaldehyde, denatured with 1N HCl, and immunized. Processed for labeling and cell counting (Zhang, S.-C., et al., 2000, Zhang, S.-C., et al., 1999, supra).

脳室内移植及びｉｎ ｖｉｖｏ分析。神経前駆体の凝集体をトリプシンで解離させた後（０．１％ＥＤＴＡ中０．０２５％、３７℃で５〜１０分間）、１００，０００個の生細胞／μｌの懸濁液を、Ｌ１５培地（Gibco）中に調製した。頭部の下方から照明を使用して、寒冷麻酔をした新生マウス（Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ）の側脳室それぞれに、細胞懸濁液２〜３μｌをゆっくりと注射した。移植された動物を、シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の毎日の注射により免疫抑制した。移植の１週後、２週後、４週後及び８週後に、リンゲル液、続いて４％パラホルムアルデヒドを経心的にマウスに灌流させた。脳を切開して、使用するまで同じ固定液中で４℃にて後固定させた。ドナー細胞は、ヒトａｌｕ反復要素に対するジゴキシゲニン標識プローブ（Brustle，O.，et al.，Nat．Biotech．16：1040-1044，1998）又はヒト特異的核抗原に対する抗体（ＭＡＢ１２８１、Chemicon、１：５０）を使用して、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼイションにより、５０μｍの冠状ビブラトーム切片で同定された。免疫陽性細胞を、ＧＦＡＰ（１：１００）、ネスチン、β_III−チューブリン（ＴＵＪ１、BabCo、１：５００）、ＭＡＰ２ａ（Sigma、クローンＡＰ−２０及びＨＭ−２、１：３００）及びリン酸化中程度分子量ヒト神経フィラメント（クローンＨＯ−１４、１：５０、J．Trojanowskiから贈与）に対する抗体で二重標識した。一次抗体を、適切なフルオロフォア結合二次抗体で検出した。切片を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ２及びＬｅｉｃａレーザスキャン顕微鏡上で分析した。 Intraventricular transplantation and in vivo analysis. After dissociating neuroprogenitor aggregates with trypsin (0.025% in 0.1% EDTA, 5-10 minutes at 37 ° C.), a suspension of 100,000 live cells / μl was added to L15 Prepared in medium (Gibco). Using illumination from below the head, 2-3 μl of cell suspension was slowly injected into each lateral ventricle of a cold-anesthetized newborn mouse (C3HeB / FeJ). The transplanted animals were immunosuppressed by daily injection of cyclosporin A (10 mg / kg, ip). Mice were perfused transcardially with Ringer's solution followed by 4% paraformaldehyde one week, two weeks, four weeks and eight weeks after transplantation. The brain was dissected and postfixed at 4 ° C. in the same fixative until use. Donor cells are digoxigenin labeled probes against human alu repeat elements (Brustle, O., et al., Nat. Biotech. 16: 1040-1044, 1998) or antibodies against human specific nuclear antigen (MAB1281, Chemicon, 1:50). ) Was used to identify 50 μm coronary vibratome sections by in situ hybridization. Immune positive cells were phosphorylated during GFAP (1: 100), nestin, β _III -tubulin (TUJ1, BabCo, 1: 500), MAP2a (Sigma, clone AP-20 and HM-2, 1: 300) Double-labeled with an antibody against a medium molecular weight human neurofilament (clone HO-14, 1:50, a gift from J. Trojanowski). Primary antibody was detected with an appropriate fluorophore-conjugated secondary antibody. Sections were analyzed on a Zeiss Axioskop2 and Leica laser scanning microscope.

中脳ドーパミンニューロンの産生
神経学的状態における幹細胞療法の潜在的適用に対する第１の工程は、正確なアイデンティティー及び伝達物質の表現型を有する神経細胞の有向性分化である。ここでは、本発明者等は、モルフォゲン作用の特異的配列によるヒト胚幹（ＥＳ）細胞からの機能的ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの頑強な産生を示す。Ｓｏｘ１を発現する前に、初期段階でヒトＥＳ由来の神経外胚葉細胞をＦＧＦ８によって処理することは、正確な中脳ＤＡ突出ニューロン表現型を有するＤＡニューロンの特定化に必須である。ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＤＡニューロンは、毒物学的且つ薬学的スクリーニングに、及びパーキンソン病における潜在的細胞療法に使用され得る。 Production of midbrain dopamine neurons The first step towards the potential application of stem cell therapy in neurological conditions is the directed differentiation of neurons with the correct identity and transmitter phenotype. Here, we show robust production of functional dopaminergic (DA) neurons from human embryonic stem (ES) cells with a specific sequence of morphogen action. Treating human ES-derived neuroectodermal cells with FGF8 at an early stage before expressing Sox1 is essential for the specification of DA neurons with an accurate midbrain DA protruding neuron phenotype. DA neurons generated in vitro can be used for toxicological and pharmaceutical screening and for potential cell therapy in Parkinson's disease.

パーキンソン病（ＰＤ）は、中脳、特に黒質におけるＤＡニューロンの進行性退化に起因する。ＰＤに対する現在の療法は、主として、レバドパのようなＤＡ前駆体の全身投与による症状軽減に依存する。かかる療法は、最初の数年間は有効であるが、ほぼ必ずその有効性を失い、重症の副作用を生じる。グリア細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような成長因子の投与は、小規模の臨床試験において有効であることが示されている（Gill，S.S.，et al.，Nat．Med．9：589-595，2003）。この療法は、十分数の生存ＤＡニューロンに依存し、その長期にわたる治療上の可能性は、いまだ調査されていない。ニューロン退化の限局的性質のため、細胞移植が代替的療法として提唱されている（Bjorklund，A．and Lindvall，O.，Nat．Neurosci．3：537-544，2000）。幾つかの成功事例では、移植された胎児中脳細胞は、１０年にわたって生存し、症状の軽減に寄与する（Kowdower，J.H．et al.，N．Engl．J．Med．332：1118-1124，1995；Piccini，P.，et al.，Nat．Neurosci．2：1137-1140，1999）が、最近規制された臨床試験では、ＰＤに対する胎児組織移植療法の有効性に疑問を投じている（Freed，C.R.，et al.，N．Engl．J．Med．344：710-719，2001；Olanow，C.W.，et al.，Ann．Nuerol．54：403-414，2003）。これらの現象は、ＰＤの複雑さを示している。機能的ヒト中脳ＤＡニューロンの信頼性高い再生可能な供給源は、ＤＡ系の起源、ＤＡニューロンの生存及び機能に影響を及ぼす発病プロセス並びにＰＤに対する持続可能な治療法の開発に関する系統だった研究に緊急に必要とされる。   Parkinson's disease (PD) results from the progressive degeneration of DA neurons in the midbrain, particularly the substantia nigra. Current therapies for PD rely primarily on symptom relief by systemic administration of DA precursors such as levadopa. Such therapy is effective for the first few years, but almost always loses its effectiveness and produces severe side effects. Administration of growth factors such as glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) has been shown to be effective in small clinical trials (Gill, SS, et al., Nat. Med. 9: 589-595, 2003). This therapy relies on a sufficient number of surviving DA neurons, and its long-term therapeutic potential has not yet been investigated. Cell transplantation has been proposed as an alternative therapy because of the localized nature of neuronal degeneration (Bjorklund, A. and Lindvall, O., Nat. Neurosci. 3: 537-544, 2000). In some successful cases, transplanted fetal mesencephalic cells survive for 10 years and contribute to symptom relief (Kowdower, JH. Et al., N. Engl. J. Med. 332: 1118-1124). , 1995; Piccini, P., et al., Nat. Neurosci. 2: 1137-1140, 1999) have questioned the effectiveness of fetal tissue transplantation for PD in recently regulated clinical trials ( Freed, CR, et al., N. Engl. J. Med. 344: 710-719, 2001; Olanow, CW, et al., Ann. Nuerol. 54: 403-414, 2003). These phenomena indicate the complexity of PD. A reliable and reproducible source of functional human midbrain DA neurons is a systematic study on the origin of the DA system, pathogenic processes affecting the survival and function of DA neurons and the development of sustainable treatments for PD Is urgently needed.

ＤＡニューロンは、マウスＥＳ細胞から効率的に産生することができることが示されており、マウスＥＳ細胞は、胚盤胞段階での着床前胚の内細胞塊に由来する（Evans，M.J．and Kaufman，M.H.，Nature 292：154-156，1981；Martin，G.R.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78：7634-7638，1981）。マウスＥＳ細胞はまず、ＦＧＦ２により（Lee，S.H.，et al.，Nat．Biotechnol．18：675-679，2000）、或いは間質細胞由来の誘導活性により（Kawasaki，H．，et al.，Neuron 28：31-40，2000；Barberi，T.，et al.，Nat．Biotechnol．21：1200-1207，2003）、神経外胚葉細胞へと誘導される。続いて、神経外胚葉細胞を、ＤＡニューロン誘導のためにＦＧＦ８、続いてＳＨＨに接触させる。この研究では、本発明者等は、ヒトＥＳ細胞（Thomson，J.A.，et al.，Science 282：1145-1147，1998）を誘導して、ＦＧＦ８及びＳＨＨに応答して中脳突出特徴を有する大比率のＤＡニューロンを産生する神経外胚葉細胞（Zhang S.C.，et al.，Nat．Biotechnol．19：1129-1133，2001）へ分化させるための頑強な系を確立した。本発明者等は、中脳突出ニューロン表現型を有するＤＡニューロンを産生するために、前駆体細胞がＳｏｘ１⁺発現神経外胚葉細胞となる前に、ヒトＥＳ細胞をＦＧＦ８へ接触することが必要であることを見出した。 It has been shown that DA neurons can be efficiently produced from mouse ES cells, which are derived from the inner cell mass of preimplantation embryos at the blastocyst stage (Evans, MJ. And Kaufman, MH, Nature 292: 154-156, 1981; Martin, GR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634-7638, 1981). Murine ES cells are first produced by FGF2 (Lee, SH, et al., Nat. Biotechnol. 18: 675-679, 2000) or by inducing activity derived from stromal cells (Kawasaki, H., et al., Neuron). 28: 31-40, 2000; Barberi, T., et al., Nat. Biotechnol. 21: 1200-1207, 2003), induced into neuroectodermal cells. Subsequently, neuroectodermal cells are contacted with FGF8 followed by SHH for DA neuron induction. In this study, the inventors induced human ES cells (Thomson, JA, et al., Science 282: 1145-1147, 1998) and have large mesencephalic features in response to FGF8 and SHH. A robust system was established to differentiate into neuroectodermal cells (Zhang SC, et al., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133, 2001) that produced a proportion of DA neurons. In order to produce DA neurons with a midbrain protruding neuron phenotype, we need to contact human ES cells to FGF8 before the precursor cells become Soxl ⁺ expressing neuroectodermal cells. I found out.

結果
ヒトＥＳ由来の神経外胚葉細胞は、前脳特質を示す
フィーダー細胞層から剥離させたＥＳ細胞コロニーを、ＥＳ細胞成長培地中で４日間、凝集体として懸濁液中で培養した後、接着性培養器で、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含有する化学的に規定される神経細胞用培地中で成長させた（上述のZhang，S.C．et al.，2001）。コロニー中心における細胞は、円柱状形態を現し、およそ９日目にロゼット形成で整列した（図４Ａ）。これらの円柱状細胞は、Ｐａｘ６に対して陽性であったが、汎神経転写因子であるＳｏｘ１に対して陰性であり（図示せず）、初期神経外胚葉細胞を示している。さらに５〜６日にわたって（１４〜１５日目）、円柱状細胞は増殖して、神経管様ロゼットへと体系化して（図４Ｂ）、神経管閉鎖中に最終的な神経外胚葉細胞により発現される転写因子であるＳｏｘ１（Pevny，L.H.，et al.，Development 125：1967-1978，1998）を発現した（図４Ｃ）。円柱状細胞は、前脳細胞により発現される転写因子である脳因子（Ｂｆ１）（Tao．W．and Lai，E．Neuron 8：057-966，1992）に対して陽性であったが、中脳により発現される転写因子であるエングレイルド１（Ｅｎ−１）（Davidson，D.，et al.，Development 104；305-316，1988；Wurst，W.，et al.，Development 120：2065-2075，1994）に対して陰性であり（図４Ｄ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された神経外胚葉細胞の前脳アイデンティティーを示唆した。 Results Human ES-derived neuroectodermal cells adhere to ES cell colonies exfoliated from the feeder cell layer exhibiting forebrain characteristics after being cultured in suspension as an aggregate for 4 days in an ES cell growth medium. Grow in a chemically defined neuronal medium containing FGF2 (20 ng / ml) in a sex incubator (Zhang, SC. Et al., 2001, supra). Cells in the center of the colony exhibited a cylindrical morphology and were aligned by rosette formation at approximately day 9 (FIG. 4A). These cylindrical cells were positive for Pax6 but negative for Sox1, a pan-neural transcription factor (not shown), indicating early neuroectodermal cells. Over an additional 5-6 days (days 14-15), columnar cells proliferated and organized into neural tube-like rosettes (FIG. 4B) and expressed by the final neuroectodermal cells during neural tube closure. Sox1 (Pevny, LH, et al., Development 125: 1967-1978, 1998) was expressed (FIG. 4C). Cylindrical cells were positive for brain factor (Bf1) (Tao. W. and Lai, E. Neuron 8: 057-966, 1992), a transcription factor expressed by forebrain cells. Engrailed 1 (En-1), a transcription factor expressed by the brain (Davidson, D., et al., Development 104; 305-316, 1988; Wurst, W., et al., Development 120: 2065-2075 1994) (FIG. 4D), suggesting the forebrain identity of neuroectodermal cells produced in vitro.

中脳表現型の誘導は、ＦＧＦ８の初期作用を要する
ＤＡニューロンの分化のために、神経管様ロゼットにおける神経外胚葉細胞は、差次的酵素及び接着処理により濃縮され（上述のZhang，S.C.，et al.，2001）、ＦＧＦ２を用いて懸濁液中で凝集体として４日間増殖(expansion)させた後、ラミニン基質上に平板培養し、ＳＨＨ（５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ８（２０〜１００ｎｇ／ｍｌ）で６日間処理した。免疫細胞化学分析により、大多数の神経外胚葉細胞が、Ｂｆ１に対して依然として陽性であるが、Ｅｎ−１対しては陽性でないことが示された（図示せず）。 Induction of the midbrain phenotype is due to the differentiation of DA neurons that require an initial action of FGF8. Neuroectodermal cells in neural tube-like rosettes are enriched by differential enzymes and adhesion treatment (Zhang, SC, supra). et al., 2001), 4 days expansion as aggregates in suspension with FGF2, then plated on laminin substrate, SHH (50-200 ng / ml) and FGF8 (20- 100 ng / ml) for 6 days. Immunocytochemical analysis showed that the majority of neuroectodermal cells were still positive for Bf1, but not for En-1 (not shown).

ＦＧＦ８が、Ｓｏｘ１⁺神経外胚葉細胞にＥｎ−１を発現させるよう誘導することができないことは、Ｓｏｘ１−発現神経外胚葉細胞が、パターニングシグナルに対して不応性であり得ることを示唆する。Ｓｏｘ１−発現細胞は、ヒトＥＳ細胞の分化の２週後（６日齢の胚に相当（上述のThomson，J.A.，et al.，1998）に産生され、神経管様構造を形成するため、Ｓｏｘ１−発現細胞は、神経外胚葉細胞がＳｏｘ１を発現し、且つ局所的に特定化される神経管閉鎖での神経外胚葉細胞に相当し得る（Lumsden，A．and Krumlauf，R.，Science 274：1109-1115，1996）。このことは、本発明者等に、神経外胚葉細胞がＳｏｘ１を発現する前にＦＧＦ８が中脳特定化を促進し得ると仮定するに至らせた。したがって、本発明者等は、コロニー中心における細胞が９日目に円柱状になった時点で、ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ）を適用した。６日後に、コロニー中心における細胞は、ＦＧＦ２の存在下で見られるように、神経管様細胞に発生した。これらの神経外胚葉細胞は同様に濃縮されて、ＦＧＦ８中で４日間増殖された(expanded)後、ラミニン基質上で６日間、ＳＨＨで処理した。この培養条件下では、Ｅｎ−１発現は、ネスチン発現神経外胚葉細胞で観察された（図４Ｅ）が、依然としてＢｆ１を発現する細胞が存在した（図４Ｆ）。したがって、神経外胚葉細胞は、それらがＳｏｘ１⁺となる前に、効率的に局所化された。 The inability of FGF8 to induce Sox1 ⁺ neuroectodermal cells to express En-1 suggests that Sox1-expressing neuroectodermal cells may be refractory to patterning signals. Since Sox1-expressing cells are produced 2 weeks after human ES cell differentiation (corresponding to 6-day-old embryos (Thomson, JA, et al., 1998, described above) and form neural tube-like structures, Sox1 -Expressed cells may correspond to neuroectodermal cells with neural tube closure where the neuroectodermal cells express Sox1 and are locally specified (Lumsden, A. and Krumlauf, R., Science 274: 1109-1115, 1996) This led us to assume that FGF8 can promote midbrain specification before neuroectodermal cells express Sox1. They applied FGF8 (100 ng / ml) when the cells in the colony center became columnar on day 9. After 6 days, the cells in the colony center were seen in the presence of FGF2. These neural ectoderm cells developed in neural tube-like cells. After being expanded for 4 days in FGF8 and then treated with SHH on laminin substrate for 6 days, En-1 expression is observed in nestin-expressing neuroectodermal cells under this culture condition Although (Figure 4E), there were still cells expressing Bf1 (Figure 4F), so neuroectodermal cells were efficiently localized before they became Soxl ⁺ .

局所化された神経外胚葉細胞は、ＤＡニューロンへ分化する
神経外胚葉細胞を解離して、神経分化培地中で分化させた。神経外胚葉細胞は、未分化ヒトＥＳ細胞により高度に発現される糖タンパク質である段階特異的胚抗原４（ＳＳＥＡ４）を発現しなかった。最初に均一に分布させた脱凝集神経外胚葉細胞は、平板培養の３〜５日後に、ロゼットを再形成した。続いて、脱凝集神経外胚葉細胞は、突起を伸長して、極形態を示した。分化後３週目に、総分化細胞集団の約３分の１（４回の実験から計数された１７，９６５個の細胞のうち３１．８±３．１％のＴＨ⁺細胞）が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対して陽性であった（図５Ａ）。同様の割合のＴＨ⁺細胞が、Ｈ９及びＨ１ヒトＥＳ細胞系の両方から得られた。たいていのＴＨ発現細胞は、直径が１０〜２０μｍであった。たいていのＴＨ発現細胞は、分化可能な軸索及び樹状突起を有する極形態を示した（図５Ａ）。ＴＨ⁺細胞はすべて、ニューロンマーカーであるβ_III−チューブリン⁺ニューロンで陽性に染色され、約５０％がＴＨ⁺であった（図５Ｂ、４回の実験からの１２，８５９個のβ_III−チューブリン⁺ニューロンのうち６，３８３個がＴＨ⁺細胞）。 Localized neuroectodermal cells differentiate into DA neurons. Neuroectodermal cells were dissociated and differentiated in neuronal differentiation medium. Neuroectodermal cells did not express stage-specific embryonic antigen 4 (SSEA4), a glycoprotein that is highly expressed by undifferentiated human ES cells. The initially uniformly distributed disaggregated neuroectodermal cells reshaped rosettes 3-5 days after plating. Subsequently, the disaggregated neuroectodermal cells extended their processes and showed a polar morphology. At 3 weeks after differentiation, approximately one third of the total differentiated cell population (31.8 ± 3.1% TH ⁺ cells out of 17,965 cells counted from 4 experiments) was tyrosine. Positive for hydroxylase (TH) (FIG. 5A). Similar proportions of TH ⁺ cells were obtained from both H9 and H1 human ES cell lines. Most TH-expressing cells were 10-20 μm in diameter. Most TH-expressing cells showed polar morphology with differentiating axons and dendrites (FIG. 5A). All TH ⁺ cells stained positively with the neuronal marker β _III -tubulin ⁺ neurons, approximately 50% were TH ⁺ (FIG. 5B, 12,859 β _III − from 4 experiments). 6,383 of tubulin ⁺ neurons are TH ⁺ cells).

モノアミンの生合成において、ＴＨは、チロシンをＬ−ＤＯＰＡへと加水分解し、続いてＬ−ＤＯＰＡは、ＡＡＤＣにより脱カルボキシル化されてＤＡとなる。別の２つの酵素であるＤβＨ及びフェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ）は、それぞれ、ＤＡをノルエピネフリンへ変換し、ノルエピネフリンをエピネフリンへと触媒する。免疫染色により、ＴＨ⁺細胞はすべて、ＡＡＤＣである（図５Ｃ〜図５Ｅ）が、幾つかのＡＡＤＣ⁺細胞は、ＴＨに対して陰性である（図５Ｅ）ことが示された。しかしながら、ＴＨ⁺細胞は、ＤβＨ（図５Ｅ）及びＰＮＭＴ（図示せず）に対して陰性であったが、ＤβＨは、成体ラット及び胚サル脳幹においてノルアドレナリン作動性ニューロンを強力に染色した（図５Ｆにおける挿入図）。これらのデータは、ＴＨ発現ニューロンが、ドーパミン合成に必要である両方の酵素を保有すること、及びこれらのニューロンが、ノルアドレナリン作動性及びアドレナリン作動性ニューロンではなくＤＡニューロンであることを示唆する。 In monoamine biosynthesis, TH hydrolyzes tyrosine to L-DOPA, which is subsequently decarboxylated by AADC to DA. Two other enzymes, DβH and phenylethanolamine N-methyltransferase (PNMT), each convert DA to norepinephrine and catalyze norepinephrine to epinephrine. Immunostaining showed that all TH ⁺ cells were AADC (FIGS. 5C-5E), but some AADC ⁺ cells were negative for TH (FIG. 5E). However, TH ⁺ cells were negative for DβH (FIG. 5E) and PNMT (not shown), but DβH strongly stained noradrenergic neurons in adult rat and embryonic monkey brainstem (FIG. 5F). Inset). These data suggest that TH-expressing neurons carry both enzymes necessary for dopamine synthesis and that these neurons are DA neurons rather than noradrenergic and adrenergic neurons.

ＥＳ細胞により産生されたＤＡニューロンは、中脳表現型を示す
ＲＴ−ＰＣＲ分析により、中脳ＤＡニューロン発達に関与するＮｕｒｒ１、Ｌｉｍｘ１ｂ、Ｅｎ−１及びＰｔｘ３（Zetterstrom，R.H.，et al.，Science 276：248-259，1997；Smidt，M.P.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 94：13305-13310，1997；Saucedo-Cardenas，O.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 95：4013-4018，1998；Wallen，A.，et al.，Exp．Cell Res．253：737-746，1999；Smidt，M.P.，et al.，Nat．Neurpsci．3：337-341．2000；Simon，H.H.，et al.，J．Neruosci．21：3126-3134，2001；Van den Munckhof，P.，et al.，Development 130：2535-2542，2003；Nunes，I.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 100：4245-4250，2003）は、神経外胚葉細胞がＤＡニューロンに分化されるまで、高レベルでは発現されなかったことが示された（図６Ａ）。免疫染色は、多数の突起を有するほとんどのＴＨ⁺細胞が、核において中脳マーカーＥｎ−１を共発現することを明らかにした（図６Ｂ）。したがって、上記アプローチを用いて産生されたＤＡニューロンは、中脳位置的アイデンティティーを保有する。 DA neurons produced by ES cells show a midbrain phenotype by RT-PCR analysis, Nurr1, Limx1b, En-1 and Ptx3 (Zetterstrom, RH, et al., Science 276 involved in midbrain DA neuron development. : 248-259, 1997; Smidt, MP, et al., Proc, Natl. Acad. Sci, USA 94: 13305-13310, 1997, Saucedo-Cardenas, O., et al., Proc, Natl. Acad. USA 95: 4013-4018, 1998; Wallen, A., et al., Exp.Cell Res.253: 737-746, 1999; Smidt, MP, et al., Nat.Neurpsci.3: 337-341. 2000; Simon, HH, et al., J. Neruosci. 21: 3126-3134, 2001; Van den Munckhof, P., et al., Development 130: 2535-2542, 2003; Nunes, I., et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 4245-4250, 2003) showed that neuronal ectoderm cells were not expressed at high levels until differentiated into DA neurons (FIG. 6A). Immunostaining revealed that most TH ⁺ cells with a large number of processes co-expressed the midbrain marker En-1 in the nucleus (FIG. 6B). Thus, DA neurons generated using the above approach possess a midbrain positional identity.

嗅球におけるＤＡニューロンは、多くの場合、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を共発現する（Kosaka，T.，et al.，Exp．Brain Res．66：191-210，1987；Gall，C.M.，et al.，J．Comp．Neurol．266：307-318，1987）。ＴＨ及びＧＡＢＡの二重免疫染色により、ＤＡニューロンのほとんどが、ＧＡＢＡに対して陰性であるが、ＧＡＢＡ⁺ニューロンは、培養物中に見出されることが示された（図６Ｃ）。すべてのＴＨ⁺細胞のうち、８％のＴＨ⁺細胞（８．７±３．９％、４回の実験から計数される６，５２０個のＴＨ⁺細胞）がＧＡＢＡを共発現した。これらの二重陽性細胞の多くが、小さな二極細胞であった（図６Ｃにおける挿入図）。幾つかの中脳ＤＡニューロン、特に腹側被蓋領域における中脳ＤＡニューロンは、ＴＨと一緒にコレシストキニンオクタペプチド（ＣＣＫ８）又はカルビンジンを共発現する（McRitchie，D.A.，et al.，J．Comp．Neurol．364：121-150，1996；Hokfelt，T.，et al.，Neurosci．5：2093-2124，1980）。免疫組織化学分析により、ＴＨ⁺ニューロンが観察されることが示された（図６Ｄ）。これらのカルビンジンニューロンは、主として小さな細胞であった。ＣＣＫ８陽性細胞は、培養物中で検出されなかった。 DA neurons in the olfactory bulb often co-express γ-aminobutyric acid (GABA) (Kosaka, T., et al., Exp. Brain Res. 66: 191-210, 1987; Gall, CM, et al J. Comp. Neurol. 266: 307-318, 1987). Double immunostaining of TH and GABA showed that most DA neurons were negative for GABA, but GABA ⁺ neurons were found in the culture (FIG. 6C). Of all TH ⁺ cells, 8% TH ⁺ cells (8.7 ± 3.9%, 6,520 TH ⁺ cells counted from 4 experiments) co-expressed GABA. Many of these double positive cells were small bipolar cells (inset in FIG. 6C). Some midbrain DA neurons, particularly those in the ventral tegmental region, co-express cholecystokinin octapeptide (CCK8) or calbindin with TH (McRitchie, DA, et al., J. Biol. Comp. Neurol. 364: 121-150, 1996; Hokfelt, T., et al., Neurosci. 5: 2093-2124, 1980). Immunohistochemical analysis showed that TH ⁺ neurons were observed (FIG. 6D). These calbindin neurons were mainly small cells. CCK8 positive cells were not detected in the culture.

ＥＳ細胞により産生されるＤＡニューロンは、生物学的に機能的である
免疫染色により、すべてのＴＨ⁺ニューロンが、ＧＤＮＦ用の受容体の構成成分であるｃ−Ｒｅｔを発現した（図７Ａ〜図７Ｃ）。ＴＨ⁺細胞の大部分、特に分岐状神経突起を有するＴＨ⁺細胞は、モノアミンニューロンにおける細胞内コンパートメントへドーパミンをパッケージングすることに関与する小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２、図７Ｄ〜図７Ｆ）（Nirenberg，M.J.，et al.，J．Neurosci．16：4135-4145，1996）を発現した。さらに、ＴＨ⁺ニューロンは、シナプス形成に必須の膜糖タンパク質であるシナプトフィジン（Calakos，N．and Scheller，R.H.，J．Biol．Chem．269：24534-24537，1994）を発現した（図７Ａ〜図７Ｉ）。 DA neurons produced by ES cells are biologically functional. By immunostaining, all TH ⁺ neurons expressed c-Ret, a component of the receptor for GDNF (FIGS. 7A-FIG. 7). 7C). Most of the TH ⁺ cells, particularly branched neuronal TH ⁺ cells with projections, vesicular monoamine responsible for packaging dopamine into subcellular compartments in monoamine neurons transporter 2 (VMAT2, FIG 7D~ Figure 7F) (Nirenberg, MJ, et al., J. Neurosci. 16: 4135-4145, 1996). Furthermore, TH ⁺ neurons expressed synaptophysin (Calakos, N. and Scheller, RH, J. Biol. Chem. 269: 24534-24537, 1994), which is a membrane glycoprotein essential for synapse formation (FIG. 7A to FIG. 7). 7I).

ドーパミン放出は、ＤＡニューロンの機能的特徴である。高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析は、アスコルビン酸（ＡＡ）、ＦＧＦ８及びＳＳＨで処理した培養物中では２３０．８±４４．０ｐｇ／ｍｌで、またＡＡ、ＦＧＦ８及びＳＨＨの処理なしの対照培養物中では４６．３±９．２ｐｇ／ｍｌで、ＤＡ分化培養物の培地中におけるドーパミンの存在を明らかにした（図８Ａ）。培養細胞を洗浄して、ＨＢＳＳ中で１４分間インキュベートした場合、ドーパミンレベルは、２つの培養物間で類似していた（図８Ａ）。しかしながら、ＨＢＳＳ中での５６ｍＭ ＫＣｌによる培養ニューロンの脱分極は、ＤＡの量を有意に増加させた（ＡＡ、ＦＧＦ８及びＳＨＨ処理なし及びありで、それぞれ培養物中に３５．８±９．２及び１１１．０±１５．０ｐｇ／ｍｌ、図８Ａ）。これらの観察は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＤＡニューロンがＤＡを分泌することができ、ＤＡの放出が活性依存的であることを示唆する。   Dopamine release is a functional feature of DA neurons. High performance liquid chromatography (HPLC) analysis was performed at 230.8 ± 44.0 pg / ml in cultures treated with ascorbic acid (AA), FGF8 and SSH, and in control cultures without treatment with AA, FGF8 and SHH. 46.3 ± 9.2 pg / ml revealed the presence of dopamine in the medium of DA differentiation cultures (FIG. 8A). When cultured cells were washed and incubated for 14 minutes in HBSS, dopamine levels were similar between the two cultures (FIG. 8A). However, depolarization of cultured neurons with 56 mM KCl in HBSS significantly increased the amount of DA (with and without AA, FGF8 and SHH treatments, 35.8 ± 9.2 and 111.0 ± 15.0 pg / ml, FIG. 8A). These observations suggest that DA neurons produced in vitro can secrete DA and that the release of DA is activity dependent.

電気生理学的記録を使用して、ＥＳにより産生されたＤＡニューロンが機能的に活性であるかどうかを決定した。３０〜３８日間培養物中に維持した細胞（ｎ＝１４）において、静止膜電位（Ｖ_rest）は、−３２〜−７２ｍＶ（−５４±２．９ｍＶ）の範囲であり、細胞静電容量（Ｃ_m）は、１１〜４５ｐＦ（２１±２．７ｐＦ）の範囲であり、入力抵抗（Ｒ_in）は、４８０〜３５００ＭΩ（１５０６±２８２ＭΩ）の範囲であった。脱分極性電流段階（０．２ｎＡ×２００〜５００ｍｓ）は通常、単一活動電池を誘発したが、幾つかの場合では、減少しつつある一連の活動電位が観察された（図８ｂｉ及び図８ｂｉｉ）。活動電位（ＡＰ）閾値は、−２６〜ー５．２ｍＶ（−１７．４±２．１ｍＶ）の範囲であり、−９．６〜３０ｍＶでピークに達した。最大５０．２ｍＶのＡＰが観察された（３２±２．８ｍＶ）。ＡＰ持続期間は、３〜２０．６ｍｓ（７．２±１．３ｍｓ）の範囲であった。自発興奮が、２つの細胞で観察された（図８Ｃ）。 Electrophysiological recordings were used to determine whether DA neurons produced by ES were functionally active. In cells maintained in culture for 30-38 days (n = 14), resting membrane potential (V _rest ) is in the range of −32 to −72 mV (−54 ± 2.9 mV) and cell capacitance ( C _m ) ranged from 11 to 45 pF (21 ± 2.7 pF) and the input resistance (R _in ) ranged from 480 to 3500 MΩ (1506 ± 282 MΩ). The depolarizing current phase (0.2 nA × 200-500 ms) typically induced a single action cell, but in some cases a decreasing series of action potentials was observed (FIGS. 8bi and 8bi). ). The action potential (AP) threshold ranged from −26 to −5.2 mV (−17.4 ± 2.1 mV) and peaked at −9.6 to 30 mV. A maximum of 50.2 mV of AP was observed (32 ± 2.8 mV). The AP duration ranged from 3 to 20.6 ms (7.2 ± 1.3 ms). Spontaneous excitation was observed in two cells (FIG. 8C).

電圧クランプ様式では、内向き及び外向き電流の両方が、細胞すべてにおいて観察された（図示せず）が、それらの相対規模は、大幅に変化した。内向き電流は、迅速に活性化され（１ｍｓ未満）、１〜３ｍｓ以内にピークに達した。活性化閾値は、−３０±１．１ｍＶであり、最大ピーク電流振幅は、−１３±１．９ｍＶの平均電圧で得られ、電流は、テトロドトキシン（ＴＴＸ、ｎ＝３）により完全に阻止された。これらの特性は、活動電位発生を引き起こす電圧作動型ナトリウムチャネルの存在と一致した。３つの細胞において、本発明者等は、迅速な上昇及びよりゆっくりとした減衰相を含むシナプス電流の特徴を有する自発的過渡電流を観察した。３つの記録のうちの１つは、Ｋ−グルコネートベースのピペット溶液を用いて行われ、この細胞を−４０ｍＶで保持することにより、本発明者等は、外向き（阻害性）及び内向き（興奮性）電流の両方を観察することが可能であった（図８ｄｉ及び図８ｄｉｉ）。１４個の細胞すべてにビオシチンを注入したが、免疫染色手順の完了後、たった５個の細胞が回収されたに過ぎなかった。しかしながら、５個のビオシチン充填細胞はすべて、ＴＨ標識された（図８Ｅ〜図８Ｇ）。   In the voltage clamp mode, both inward and outward currents were observed in all cells (not shown), but their relative magnitudes varied significantly. Inward current was rapidly activated (less than 1 ms) and peaked within 1-3 ms. The activation threshold was −30 ± 1.1 mV, the maximum peak current amplitude was obtained with an average voltage of −13 ± 1.9 mV, and the current was completely blocked by tetrodotoxin (TTX, n = 3). . These characteristics were consistent with the presence of voltage-gated sodium channels that cause action potential generation. In three cells, we observed spontaneous transients with synaptic current characteristics including a rapid rise and a slower decay phase. One of the three recordings was made with a K-gluconate based pipette solution, and by holding the cells at -40 mV, we made the outward (inhibitory) and inward It was possible to observe both (excitatory) currents (FIGS. 8di and 8di). All 14 cells were injected with biocytin, but only 5 cells were recovered after completion of the immunostaining procedure. However, all 5 biocytin-loaded cells were TH labeled (FIGS. 8E-8G).

論考
本発明者等は、中脳ニューロン突出特徴を有する機能的ＤＡニューロンが、３つの簡素な非遺伝的工程：ＦＧＦ２による神経外胚葉細胞の誘導、神経外胚葉形成中のＦＧＦ８及びＳＳＨによる腹側中脳アイデンティティーの特定化及び局所的に特定化された前駆体のＤＡニューロンへの分化により、ヒトＥＳ細胞から効率的に産生することができることを実証した。中脳特徴を有するＤＡニューロンが、増殖された神経外胚葉細胞から産生することができるというマウスＥＳ細胞研究から得られる見解（上述のLee，S.H.，et al.，2000）と異なり、本発明者等は、前駆体細胞がＳｏｘ１⁺神経外胚葉細胞となる前にＦＧＦ８により特定化又は局所化することが、正確な中脳及び機能的表現型を有するヒトＤＡニューロンの頑強な産生に必須であることを見出した。 DISCUSSION We have found that functional DA neurons with midbrain neuron protruding features are expressed in three simple non-genetic steps: induction of neuroectodermal cells by FGF2, ventral by FGF8 and SSH during neuroectodermal formation. It has been demonstrated that the specification of midbrain identity and the differentiation of locally specified precursors into DA neurons can be efficiently produced from human ES cells. Unlike the view obtained from mouse ES cell studies where DA neurons with midbrain features can be produced from expanded neuroectodermal cells (Lee, SH, et al., 2000, supra), the present inventors Et al., It is essential for robust production of human DA neurons with precise midbrain and functional phenotypes that progenitor cells are identified or localized by FGF8 before becoming Sox1 ⁺ neuroectodermal cells I found out.

幹細胞生物学の観点から、Mckayと共同研究者等によって開発された段階的プロトコルであるマウスＥＳ細胞を神経外胚葉細胞へ誘導し(direct)、それらを増殖させて、それらをＦＧＦ８及びＳＨＨにより局所化又は特定化し、続いてそれらをＤＡニューロンへ分化させることは、非常に論理的であるように思われる（上述のLee，S.H.，et al.，2000）。本発明者等は、同じ原理がヒト霊長類に適用できるはずであると仮定した。実際に、本発明者等は、Ｓｏｘ１を発現し、且つＦＧＦ２の存在下で神経管様ロゼットへと体系化する神経外胚葉細胞へヒトＥＳ細胞を分化させること（上述のZhang，S.C.，et al.，2001）、神経外胚葉細胞をＦＧＦ８及びＳＨＨで処理して、腹側中脳発生運命を誘導すること、及び最終的に細胞をニューロンへ分化させることにより、多数のＤＡニューロンを産生することが可能である。しかしながら、このようにして産生されたＤＡニューロンの多くは、中脳突出ＤＡニューロンの重要な特徴、例えば、複雑な形態を伴う大きなサイズ、及びタンパク質レベルでの中脳転写因子の発現を欠如している。Ｓｏｘ１陽性神経外胚葉細胞は、ＦＧＦ８及びＳＨＨによる処理後でさえも、依然としてＥｎ−１に対して陰性であるが、Ｂｆ１に対しては陽性であり、Ｓｏｘ１発現神経外胚葉細胞が、中脳発生運命への特定化に不応性であることを示唆している。本発明者等の培養系中でのヒトＥＳ細胞からの神経外胚葉細胞分化のプロセスは、ｉｎ ｖｉｖｏ発達中に見られるものに匹敵する（上述のZhang，S.C.，2003）。ｉｎ ｖｉｖｏでは、神経管は、ヒト妊娠の３週目の最後に形成し、Ｓｏｘ１は、マウス発生学的研究に基づいて、神経管閉鎖中に神経外胚葉細胞により発現される（Pevny，L.H.，et al.，Development 125：1967-1978，1998）。培養では、神経外胚葉細胞は、神経管様ロゼットを形成し、６日齢のヒト胚に相当するヒトＥＳ細胞からの２週間の分化後に、Ｓｏｘ１を発現する（上述のThomson，J.A.，et al.，1998）。中脳ＤＡニューロンを含む突出ニューロンは、初期段階で神経管において神経外胚葉細胞から分化され、これらの神経外胚葉細胞細胞は、神経管閉鎖のプロセス中にすでに局所的に特定化されている（上述のLumsden，A．and Krumlauf，R.，1996）。このことは、前脳表現型を保有するヒトＥＳ細胞により産生されたＳｏｘ１発現神経外胚葉細胞が、中脳表現型を有するＤＡニューロンを産生するためのモルフォゲンに反応しない理由を説明し得る。ＦＧＦ８が、中脳アイデンティティーを選択(adopt)するように初期前駆体を指示し得るという本発明者等の仮定は、初期ロゼットにおけるＳｏｘ１^-円柱状細胞をＦＧＦ８で処理した後の、突出ニューロンの特徴（例えば、複雑な突起を有する大きな細胞体及び中脳間マーカーであるＥｎ１の発現）を有するＤＡニューロンの産生により確認される。 From the viewpoint of stem cell biology, mouse ES cells, a step-by-step protocol developed by Mckay and collaborators, are directed to neuroectodermal cells, proliferated, and they are localized by FGF8 and SHH. It appears that it is very logical to make or specify and subsequently differentiate them into DA neurons (Lee, SH, et al., 2000, supra). We hypothesized that the same principle should be applicable to human primates. In fact, we have differentiated human ES cells into neuroectodermal cells that express Sox1 and systematize into neural tube-like rosettes in the presence of FGF2 (Zhang, SC, et al, supra). ., 2001), treating neuroectodermal cells with FGF8 and SHH to induce ventral midbrain development fate, and ultimately to differentiate the cells into neurons to produce a large number of DA neurons. Is possible. However, many of the DA neurons thus produced lack important features of midbrain projecting DA neurons, such as large size with complex morphology, and expression of midbrain transcription factors at the protein level. Yes. Sox1-positive neuroectodermal cells are still negative for En-1 even after treatment with FGF8 and SHH, but positive for Bf1, and Sox1-expressing neuroectodermal cells are It suggests that it is refractory to the specification to destiny. The process of neuroectodermal cell differentiation from human ES cells in our culture is comparable to that seen during in vivo development (Zhang, SC, 2003, supra). In vivo, the neural tube forms at the end of the third week of human pregnancy and Sox1 is expressed by neuroectodermal cells during neural tube closure based on mouse embryological studies (Pevny, LH, et al., Development 125: 1967-1978, 1998). In culture, neuroectodermal cells form neural tube-like rosettes and express Sox1 after 2 weeks of differentiation from human ES cells corresponding to 6-day-old human embryos (Thomson, JA, et al, supra). ., 1998). Protrusive neurons, including midbrain DA neurons, are differentiated from neuroectodermal cells in the neural tube at an early stage, and these neuroectodermal cell cells have already been locally identified during the process of neural tube closure ( Lumsden, A. and Krumlauf, R., 1996, supra). This may explain why Soxl-expressing neuroectodermal cells produced by human ES cells possessing a forebrain phenotype do not respond to morphogens to produce DA neurons with a midbrain phenotype. Our hypothesis that FGF8 can direct early progenitors to adopt midbrain identity is that the Sox1 ^- cylindrical cells in the early rosette after treatment with FGF8 Confirmed by production of DA neurons with characteristics (eg, large cell bodies with complex processes and expression of En1, an intermesencephalic marker).

ＦＧＦ２により誘導されるマウスＥＳ細胞由来の神経外胚葉細胞が、増殖後に効率的に局所化され得るが、ヒトＥＳ細胞由来の神経外胚葉細胞はそうではない理由は現在明らかではない。マウス脊髄から単離された神経前駆体の背側又は腹側アイデンティティーが、特にＦＧＦ２の存在下で、培養時に調節解除され得るという最近の徴候が見られ（Gabay，L.，et al.，Neuron 40：485-499，2003）、これは、増殖したマウスＥＳ細胞由来の神経外胚葉細胞が再び特定化する能力を一部について説明し得るかもしれない。脊髄運動神経のような他の突出したニューロンの分化に関する本発明者らの研究は、大きな突出したニューロンの産生がモルフォルゲンの初期の作用を必要とするという今回の観察と一致する。   While mouse ES cell-derived neuroectodermal cells induced by FGF2 can be efficiently localized after expansion, the reason why human ES cell-derived neuroectodermal cells are not currently not clear. There are recent signs that the dorsal or ventral identity of neural progenitors isolated from mouse spinal cord can be deregulated during culture, especially in the presence of FGF2 (Gabay, L., et al., Neuron 40: 485-499, 2003), which may explain in part the ability of expanded mouse ES cell-derived neuroectodermal cells to respecify. Our study on the differentiation of other protruding neurons such as spinal motor neurons is consistent with our observation that the production of large protruding neurons requires the initial action of morphogens.

ＤＡニューロンは、中脳、視床下部、網膜及び嗅球を含む脳の幾つかの領域に存在する。この研究におけるヒトＥＳ細胞により産生されるＤＡニューロンは、中脳突出ＤＡニューロンに類似している。ＤＡニューロンのほとんどが、ＧＡＢＡを共発現しないが、ＧＡＢＡ及びＴＨの共発現は、嗅覚ＤＡ介在ニューロンの主な特徴である（上述のKosaka，T.，et al.，18987；上述のGall，C.M.，et al.，1987）。中脳では、ＤＡニューロンの少なくとも２つの主要な群、すなわち黒質におけるもの（Ａ９）及び腹側被蓋領域におけるもの（Ａ１０）（それぞれ異なる標的を有する）が存在する（Bjorklund，A．and Lindvall，O.，Handbook of Chemical Neuroanatomy，Vol.2：Classical Transmitters in the CNS（Bjorklund，A.，Hokfelt，T.，eds），Amsterdam，Elsevier Science Publishers，pp.55-111，1984）。腹側被蓋領域におけるほとんどのＤＡニューロンは、カルビンジン又はＣＣＫを発現するのに対して、黒質におけるものは、ほとんど発現しない（McRitchie，D.A.，et al.，J．Comp．Neurol．364：121-150，1996；Horkfelt，T.，et al.，Neurosci．5：2093-2124，1980；Haber，S.N.，et al.，J．Comp．Neurol．362：400-410，1995）。ヒトＥＳ細胞により産生されるＤＡニューロンが、ＣＣＫ８又はカルビンジンとともにＴＨを共発現しないという本発明者等の観察は、これらのＤＡニューロンが、黒質ＤＮＡニューロンとより密接に類似していることを示唆する。   DA neurons are present in several areas of the brain, including the midbrain, hypothalamus, retina and olfactory bulb. DA neurons produced by human ES cells in this study are similar to midbrain protruding DA neurons. Most DA neurons do not co-express GABA, but co-expression of GABA and TH is a major feature of olfactory DA interneurons (Kosaka, T., et al., 18987, supra; Gall, CM, supra). , Et al., 1987). In the midbrain, there are at least two major groups of DA neurons, one in the substantia nigra (A9) and one in the ventral tegmental region (A10), each with a different target (Bjorklund, A. and Lindvall). , O., Handbook of Chemical Neuroanatomy, Vol. 2: Classical Transmitters in the CNS (Bjorklund, A., Hokfelt, T., eds), Amsterdam, Elsevier Science Publishers, pp. 55-111, 1984). Most DA neurons in the ventral tegmental region express calbindin or CCK, whereas those in the substantia nigra (McRitchie, DA, et al., J. Comp. Neurol. 364: 121). Horkfelt, T., et al., Neurosci. 5: 2093-2124, 1980; Haber, SN, et al., J. Comp. Neurol. 362: 400-410, 1995). Our observation that DA neurons produced by human ES cells do not co-express TH with CCK8 or calbindin suggests that these DA neurons are more closely similar to nigra DNA neurons. To do.

ヒトＥＳ細胞の、適切な局所的アイデンティティーを有する大きな突出ニューロン（例えば、中脳ＤＡニューロン）を産生する頑強な能力は、ヒトＥＳ細胞系を使用して神経発達の初期段階を精査するための空前の機会を広げる。本発明者等のデータは、初期に生み出される中脳突出ＤＡニューロンの産生に関して、特定化されていない初期神経外胚葉細胞に作用するモルフォゲン（例えば、ＦＧＦ８）に対する要件を示している。このことは、すでに特定化されている胚及び成体哺乳類脳から単離並びに増殖させた幹細胞又は前駆体は、突出ニューロンを産生するのに不応性である（Svendsen，C.N.，et al.，Exp．Neurol．148：135-146，1997；Daadi，M.M．and Weiss，S.，J．Neurosci．19：4484-4497，1999；Storch，A.，et al.，Exp．Neurol．170：317-325，2001）理由を説明し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたヒトＤＡニューロンはまた、ヒトＤＡニューロンに影響を及ぼし得る化学物質及び薬物に関する毒物学的並びに薬学的スクリーニング用の系を提供する。培養ペトリ皿中で産生されたこれらのヒトＤＡニューロンが、ＰＤ動物モデルにおいて機能的であるかどうかを決定するための研究は進行中である。   The robust ability of human ES cells to produce large protruding neurons (eg, midbrain DA neurons) with appropriate local identities is useful for probing early stages of neurodevelopment using human ES cell lines. Expand unprecedented opportunities. Our data indicate a requirement for a morphogen (eg, FGF8) that acts on unspecified early neuroectodermal cells for the production of early-generated midbrain protruding DA neurons. This means that stem cells or progenitors isolated and expanded from previously specified embryos and adult mammalian brain are refractory to produce protruding neurons (Svendsen, CN, et al., Exp. Neurol.148: 135-146, 1997; Daadi, MM. And Weiss, S., J. Neurosci.19: 4484-4497, 1999; Storch, A., et al., Exp.Neurol.170: 317-325 , 2001) Can explain the reason. Human DA neurons generated in vitro also provide a system for toxicological and pharmaceutical screening of chemicals and drugs that can affect human DA neurons. Studies are ongoing to determine whether these human DA neurons produced in cultured Petri dishes are functional in PD animal models.

方法
ＥＳ細胞培養。ヒトＥＳ細胞系である、Ｈ９（ｐ２１〜５６）及びＨ１（ｐ３５〜４０）を、Thomsonにより記載されるように（上述のThomson，J.A.，et al．1998）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（Gibco）、２０％血清代替物（Gibco）、１ｍＭ グルタミン（Sigma）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Gibco）、２μｇ／ｍｌのヘパリン（Sigma）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Sigma）及び４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（R＆D Systems）から構成されるＥＳ細胞成長培地を毎日交換しながら、照射したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で週に１度、培養（細胞）を継代した。分化したコロニーは、湾曲状のパスツールピペットを用いて物理的に取り出して、未分化状態のＥＳ細胞は、典型的な形態学並びにＯｃｔ４及びＳＳＥＡ４による免疫染色により確認した。 Methods ES cell culture. Human ES cell lines, H9 (p21-56) and H1 (p35-40), as described by Thomson (Thomson, JA, et al. 1998, supra), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 (Gibco), 20% serum replacement (Gibco), 1 mM glutamine (Sigma), 0.1 mM non-essential amino acid (Gibco), 2 μg / ml heparin (Sigma), 0.1 mM β-mercaptoethanol (Sigma) Cultures (cells) were passaged once a week on irradiated mouse embryo fibroblasts (MEF) with daily replacement of ES cell growth medium composed of 4 ng / ml FGF2 (R & D Systems). Differentiated colonies were physically removed using a curved Pasteur pipette, and undifferentiated ES cells were confirmed by typical morphology and immunostaining with Oct4 and SSEA4.

神経外胚葉細胞の分化及び濃縮。ヒトＥＳ細胞コロニーは、０．２ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（Roche Diagnostitics）による培養物の処理により、ＭＥＦ層から剥離させ、ＥＳ細胞培地を毎日交換しながら、４日間、浮遊性細胞凝集体（胚様体）として成長させた。続いて、それらを、Ｎ２（Gibco）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２μｇ／ｍｌヘパリンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（２：１）から構成される神経培地中で、１日おきに培地を交換しながら、接着基材において成長させた。ＥＳ細胞凝集体は、結合して、およそ６日目に個々のコロニーを形成した。神経管様ロゼットへ体系化する円柱状細胞により示される神経外胚葉細胞は、およそ１４日目に発生した（上述のZhang，S.C.，et al.，2001）。神経ロゼットを、差次的酵素応答により単離した（上述のZhang，S.C.，et al.，2001）。成長因子は、分化の過程中に添加して、局所化に影響を与えた（結果を参照）。   Differentiation and enrichment of neuroectodermal cells. Human ES cell colonies were detached from the MEF layer by treatment of the culture with 0.2 mg / ml dispase (Roche Diagnostitics), and suspended cell aggregates (embryo-like) for 4 days while changing the ES cell medium daily. Body). Subsequently, the medium was changed every other day in a nerve medium composed of DMEM / F12 (2: 1) supplemented with N2 (Gibco), 0.1 mM non-essential amino acid, 2 μg / ml heparin. While grown on an adhesive substrate. ES cell aggregates combined to form individual colonies on approximately day 6. Neuroectodermal cells, represented by columnar cells that organized into neural tube-like rosettes, developed on approximately day 14 (Zhang, S.C., et al., 2001, supra). Nerve rosettes were isolated by differential enzyme response (Zhang, S.C., et al., 2001, supra). Growth factors were added during the differentiation process to influence localization (see results).

ＤＡニューロン分化。濃縮された神経外胚葉細胞は、ＰＢＳ中、３７℃で１０〜１５分間の０．０２５％トリプシン及び０．２７ｍＭ ＥＤＴＡにより解離させ、１２ｍｍカバーガラス（１００μｇ／ｍｌのポリオルニチン及び１０μｇ／ｍｌのラミニンで予めコーティングした）上へ、４０，０００〜５０，０００個の細胞／カバーガラスの密度で播取た。ニューロン分化培地は、Ｎ２、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭグルタメート、１μｇ／ｍｌのラミニン、１μＭのｃＡＭＰ、２００μＭのＡＡ（Sigma）、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（R＆D Systems）及び１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ（R＆D Systems）を補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Gibco）から構成された。細胞を、１日おきに培地交換しながら３〜４週間培養した。   DA neuron differentiation. Concentrated neuroectodermal cells were dissociated with 0.025% trypsin and 0.27 mM EDTA in PBS at 37 ° C. for 10-15 minutes and 12 mm coverslips (100 μg / ml polyornithine and 10 μg / ml laminin). Seeded at a density of 40,000 to 50,000 cells / cover glass. Neuronal differentiation medium consists of N2, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.5 mM glutamate, 1 μg / ml laminin, 1 μM cAMP, 200 μM AA (Sigma), 10 ng / ml BDNF (R & D Systems) and 10 ng / ml. It consisted of neurobasal medium (Gibco) supplemented with GDNF (R & D Systems). Cells were cultured for 3-4 weeks with medium changes every other day.

免疫細胞化学及び細胞定量化。カバーガラス培養物をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド中で１０〜２０分間、又はメタノール（−２０℃）中４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定化して、免疫染色用に加工した（上述のZhang，S.C.，et al.，2001）。以下の一次抗体を使用した：マウス抗ＳＳＥＡ４（１：４０）、マウス抗Ｅｎ−１（１：５０）及びマウス抗Ｐａｘ６（１：５０００、すべてDevelopmental studies hybridoma bankから）、ウサギ抗Ｓｏｘ１（１：５００）、ウサギ抗ヒトネスチン（１：２００）、ウサギ抗ＡＡＤＣ（１：１，０００）、ヒツジ抗ＤβＨ（１：４００）、マウス抗シナプトフィジン（１：５００）及びウサギ抗ＣＣＫ８（１：２０００、すべてChemiconから）、マウス抗ＴＨ（１：１，０００）、マウス抗βＩＩＩチューブリン（１：５００）、ウサギ抗ＧＡＢＡ（１：５０００）及びマウス抗カルビンジン（１：４００、すべてSigmaから）、ウサギ抗ＴＨ（１：５００）及びウサギ抗ＶＭＡＴ２（１：５００、すべてPel-Freezから）、ヤギ抗ｃ−Ｒｅｔ（１：４００）及びマウス抗Ｏｃｔ４（１：１，０００、ともにSanta Cruzから）、ウサギ抗Ｂｆ１（１：５０００、Lorenz Studerから贈与）。抗体−抗原反応は、適切な蛍光結合二次抗体により明らかとなった。細胞核は、ヘキスト３３３４２で染色した。染色は、Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡で可視化した。成体ラット及びＥ３８胎性サルからの脳切片を、ニューロンタイプ及び神経伝達物質に対する多くの抗体に対する陽性対照として使用した。陰性対照はまた、免疫染色手順における一次又は二次抗体を省略することにより設定した。細胞計数は、接眼レンズ上のレチクル及び４０×対物レンズを使用することにより無分別(randomly)に達成された。１０個の視野における細胞を無作為に選択して、各カバーガラスから計数した。   Immunocytochemistry and cell quantification. Cover glass cultures were fixed for 10-20 minutes in 4% paraformaldehyde in PBS or 5% in 4% paraformaldehyde in methanol (−20 ° C.) and processed for immunostaining (Zhang, SC, supra). , Et al., 2001). The following primary antibodies were used: mouse anti-SSEA4 (1:40), mouse anti-En-1 (1:50) and mouse anti-Pax6 (1: 5000, all from Developmental studies hybridoma bank), rabbit anti-Sox1 (1: 500), rabbit anti-human nestin (1: 200), rabbit anti-AADC (1: 1,000), sheep anti-DβH (1: 400), mouse anti-synaptophysin (1: 500) and rabbit anti-CCK8 (1: 2000, all Chemicon), mouse anti-TH (1: 1,000), mouse anti-βIII tubulin (1: 500), rabbit anti-GABA (1: 5000) and mouse anti-calbindin (1: 400, all from Sigma), rabbit anti TH (1: 500) and rabbit anti-VMAT2 (1: 500, all from Pel-Freez), goat anti-c-Ret (1: 400) and Mouse anti-Oct4 (1: 1,000, both from Santa Cruz), rabbit anti-Bf1 (1: 5000, gift from Lorenz Studer). The antibody-antigen reaction was revealed by an appropriate fluorescent-conjugated secondary antibody. Cell nuclei were stained with Hoechst 33342. Staining was visualized with a Nikon fluorescent microscope. Brain sections from adult rats and E38 embryonic monkeys were used as positive controls for many antibodies to neuronal type and neurotransmitter. Negative controls were also set up by omitting primary or secondary antibodies in the immunostaining procedure. Cell count was achieved randomly by using a reticle on the eyepiece and a 40 × objective. Cells in 10 fields were randomly selected and counted from each cover glass.

ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Tel-Test，Friendswood，TX）を用いて培養細胞から抽出し、続いてＤＮａｓｅＩ（ＤＮＡフリー、Ambicon）で処理した。ｃＤＮＡの合成は、ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を用いて、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ増幅は、Ｔａｑポリメラーゼ（Promega）により、標準的な手順を用いて実施した。サイクル数は、特定のｍＲＮＡ存在量(abundance)に応じて、９４℃で１５秒間の変性、プライマーにより５５℃又は６０℃の温度で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で４５秒間の伸長を伴って、２５〜３５サイクルまで様々であった。陰性対照は、逆転写中の転写酵素又はＰＣＲ中のｃＤＮＡサンプルを省略することにより達成した。プライマー及び産生物長は、以下の通りであった：

RT-PCR
Total RNA was extracted from cultured cells using RNA Stat-60 (Tel-Test, Friendswood, TX) and subsequently treated with DNase I (DNA free, Ambicon). The synthesis of cDNA was performed using Superscript First-Strand Synthesis System (Invitrogen) for RT-PCR according to the manufacturer's instructions. PCR amplification was performed with Taq polymerase (Promega) using standard procedures. The number of cycles depends on the specific mRNA abundance, with denaturation at 94 ° C for 15 seconds, annealing at 55 ° C or 60 ° C for 30 seconds with primers, and extension at 72 ° C for 45 seconds. It varied from 25 to 35 cycles. Negative controls were achieved by omitting transcriptase during reverse transcription or cDNA samples during PCR. Primers and product lengths were as follows:

ＤＡ測定
ＤＡニューロン分化の２１日後に、４８時間のコンディションメディウムを収集した。培養細胞からの活性依存性ドーパミン放出は、まずハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で１５分間、培養細胞を調整し、続いて５６ｍＭのＫＣｌを含有するＨＢＳＳでそれを３７℃で１４分間取り換えることにより測定した。培地中又はＨＢＳＳ中のドーパミンは、安定化緩衝液（０．１ＭのＮａＯＨ１０ｍｌ中ＥＧＴＡ９００ｍｇ及びグルタチオン７００ｍｇ）２０μｌを添加することにより安定化し、サンプルを−８０℃で保管した。ＨＰＬＣキット（Chromsystems）を使用して、モノアミンを抽出した。モノアミンのレベルは、電気化学的検出器（ＣｏｕｌｏｃｈｅｍＩＩ，ESA Inc.）に結合させたＨＰＬＣ（モデル５０８オートサンプラー及びモデル１１８ポンプ、Beckman）により、ＭＤ−ＴＭ移動相（ESA Inc.）を使用して決定した。各群における培養は三重反復され、データは、３回の別個の実験から収集された。 DA Measurement 48 hours of conditioned medium was collected 21 days after DA neuron differentiation. Activity-dependent dopamine release from cultured cells is achieved by first preparing the cultured cells for 15 minutes in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) and then replacing it with HBSS containing 56 mM KCl for 14 minutes at 37 ° C. It was measured. Dopamine in the medium or in HBSS was stabilized by adding 20 μl of stabilization buffer (900 mg EGTA and 700 mg glutathione in 10 ml 0.1 M NaOH) and samples were stored at −80 ° C. Monoamine was extracted using an HPLC kit (Chromsystems). Monoamine levels were measured using an MD-TM mobile phase (ESA Inc.) by HPLC (model 508 autosampler and model 118 pump, Beckman) coupled to an electrochemical detector (Culochem II, ESA Inc.). Were determined. Cultures in each group were repeated in triplicate and data was collected from 3 separate experiments.

電気生理学的記録
ヒトＥＳ細胞から分化したＤＡニューロンの電気生理学的特性は、全細胞パッチ−クランプ記録技法を用いて調べた（Hammill，O.P.，et al.，Pflugers Arch．391：85-100，1981）。ピペットに、（ｍＭ）ＫＣｌ １４０又はＫ−グルコネート １４０、Ｎａ⁺−ＨＥＰＥＳ １０、ＢＡＰＴＡ １０、Ｍｇ²⁺−ＡＴＰ ４を含有する細胞内溶液（ｐＨ７．２、２９０ｍＯｓｍ、２．３〜５．０ＭΩ）を充填した。ビオシチン（０．５％、Sigma）を記録溶液に添加して、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒ ４８８（１：１０００、Molecular Probes）による続く標識及びＴＨに対する抗体を使用して、ＤＡニューロンを同定した。バス溶液は、（ｍＭで）ＮａＣｌ １２７、ＫＨ₂ＰＯ₄ １．２、ＫＣｌ １．９、ＮａＨＣＯ₃ ２６、 ＣａＣｌ₂ ２．２、ＭｇＳＯ₄ １．４、グルコース １０、９５％Ｏ₂／５％ＣＯ₂を含有していた（ｐＨ７．３、３００ｍＯｓｍ）。幾つかの実験に関して、ＴＴＸ（１μｍ）をバス溶液中で適用して、電圧作動型ナトリウム電流を阻止した。 Electrophysiological recordings The electrophysiological properties of DA neurons differentiated from human ES cells were investigated using a whole cell patch-clamp recording technique (Hammill, OP, et al., Pflugers Arch. 391: 85-100, 1981). ). Intracellular solution (pH 7.2, 290 mOsm, 2.3-5.0 MΩ) containing (mM) KCl 140 or K-gluconate 140, Na ⁺ -HEPES 10, BAPTA 10, Mg ²⁺ -ATP 4 in a pipette Filled. Biocytin (0.5%, Sigma) was added to the recording solution and DA neurons were identified using subsequent labeling with streptavidin-Alex Flur 488 (1: 1000, Molecular Probes) and antibodies to TH. The bath solution was (in mM) NaCl 127, KH ₂ PO ₄ 1.2, KCl 1.9, NaHCO ₃ 26, CaCl ₂ 2.2, MgSO ₄ 1.4, glucose 10, 95% O ₂ /5%. It contained CO ₂ (pH 7.3, 300 mOsm). For some experiments, TTX (1 μm) was applied in bath solution to block voltage-gated sodium current.

電流クランプ及び電圧クランプ記録は、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ａ増幅器（Axon Instruments）を用いて実施した。シグナルは、４ｋＨｚでフィルタリングして、Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａアナログ−ディジタル変換器（Axon Instruments）を用いて１０ｋＨｚでサンプリングして、市販のソフトウェア（ｐＣｌａｍｐ９、Axon Instruments）を用いて、コンピュータハードディスクに蓄積(acquire)及び格納された。アクセス抵抗は通常、８〜１８ＭΩであり、増幅器回路を用いて５０〜８０％相殺した。電圧は、＋１３ｍＶの液相界面電位に関して補正した（Neher，E.，Methods Enzymol．207：1213-131，1992）。Ｖ_rest及び活動電位は、電流クランプモードで検査した。自発的興奮性（内向き）及び阻害性（外向き）シナプス電流は、Ｋ−グルコネートベースのピペット溶液及びＶ_hold＝−４０ｍＶを用いて、電圧クランプモードで特性化した。シナプス事象は、テンプレート検出アルゴリズム（Ｍｉｎｉ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ ４．６．２８、Synaptosoft）を用いて検出し、脱活性化相は、Levenberg-Marquardtアルゴリズムを用いて、二重指数関数へ適合させた。データは、平均値±ＳＥとして提示される。 Current clamp and voltage clamp recordings were performed using a MultiClamp 700A amplifier (Axon Instruments). The signal is filtered at 4 kHz, sampled at 10 kHz using a Digidata 1322A analog-to-digital converter (Axon Instruments), and stored on a computer hard disk using commercially available software (pClamp9, Axon Instruments) and Stored. The access resistance was typically 8-18 MΩ and offset by 50-80% using an amplifier circuit. The voltage was corrected for a liquid phase interface potential of +13 mV (Neher, E., Methods Enzymol. 207: 1213-131, 1992). V _rest and action potential were examined in current clamp mode. Spontaneous excitability (inward) and inhibitory (outward) synaptic currents were characterized in voltage clamp mode using a K-gluconate based pipette solution and V _hold = -40 mV. Synaptic events were detected using a template detection algorithm (Mini Analysis Program 4.6.28, Synaptosoft) and the deactivation phase was fitted to a double exponential function using the Levenberg-Marquardt algorithm. Data are presented as mean ± SE.

運動ニューロンの産生
脊椎動物における運動ニューロンの産生は、少なくとも３つの工程：外胚葉細胞の神経誘導、神経外胚葉細胞の尾側化(caudalization)及び尾側化された神経前駆体の腹側化(ventralization)を包含する（Jessell，T.M.，Nat．Rev．Genet．1：20-29，2000）。本発明者等はまず、脊椎動物神経外胚葉がＦＧＦ及び／又は抗ＢＭＰ（骨形成タンパク質）シグナルに応答して発生するという原理（Wilson，S.I.and Edlund，T.，Nat．Neurosci．4：Suppl.：1161-1168，2001）に基づいて、ＦＧＦ２の存在下での接着コロニー培養（Zhang，S.C.，et al.，Nat．Biotechnol．19：1129-1133，2001）を用いて、ｈＥＳ細胞（Thomson，J.A.，et al.，Science 282：1145-1147，1998）（Ｈ１及びＨ９系統）からの効率的な神経神経外胚葉分化のための培養系を樹立した。神経分化の最初の徴候は、ＥＳ細胞を分化のためにフィーダー細胞から取り外した８〜１０日後に、コロニーの中心でロゼットを形成する円柱状細胞の出現であった。ロゼットにおける円柱状細胞は、神経外胚葉マーカーであるＰａｘ６を発現したが、神経管形成中に神経上皮細胞により発現される汎神経外胚葉転写因子であるＳｏｘＩを発現しなかったが（Pevny，L.H.，et al.，Development 125：1967-1978，1998）、成長領域における平坦細胞はそうではなかった（図９Ａ）。同じ培地中でさらに４〜５日間のさらなる培養により、円柱状細胞は、管腔を伴う神経管様ロゼットへと体系化して（図９Ｂ）、Ｐａｘ６及びＳｏｘ１の両方を発現した（図９Ｃ、図９Ｄ）。したがって、ｈＥＳ細胞からの神経外胚葉細胞の分化は、少なくとも２つの特徴的な段階、すなわち神経誘導の８〜１０日後の初期ロゼットにおけるＰａｘ６⁺／Ｓｏｘ１^-円柱状細胞、及び誘導の１４日後の神経管様後期ロゼットを形成するＰａｘ６⁺／Ｓｏｘ１⁺細胞を包含する。 Production of motoneurons Production of motoneurons in vertebrates involves at least three steps: neural induction of ectodermal cells, caudalization of neuroectodermal cells and ventralization of caudalized neural precursors ( ventralization) (Jessell, TM, Nat. Rev. Genet. 1: 20-29, 2000). The inventors firstly described the principle that vertebrate neuroectodermal development occurs in response to FGF and / or anti-BMP (bone morphogenetic protein) signals (Wilson, SIand Edlund, T., Nat. Neurosci. 4: Suppl. : 1161-1168, 2001) using adherent colony cultures in the presence of FGF2 (Zhang, SC, et al., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133, 2001) using hES cells (Thomson, JA, et al., Science 282: 1145-1147, 1998) (H1 and H9 strains) was established for a culture system for efficient neuronal ectoderm differentiation. The first sign of neuronal differentiation was the appearance of columnar cells forming rosettes in the center of the colony 8-10 days after the ES cells were removed from the feeder cells for differentiation. Cylindrical cells in rosette expressed Pax6, a neuroectodermal marker, but did not express SoxI, a pan-neural ectoderm transcription factor expressed by neuroepithelial cells during neural tube formation (Pevny, LH) Et al., Development 125: 1967-1978, 1998), flat cells in the growth area were not (FIG. 9A). With further culture for an additional 4-5 days in the same medium, columnar cells organized into neural tube-like rosettes with lumens (FIG. 9B) and expressed both Pax6 and Sox1 (FIG. 9C, FIG. 9). 9D). Thus, differentiation of neuroectodermal cells from hES cells, at least two distinct stages, namely neural induction of 8 to 10 days after the initial rosettes in Pax6 ⁺ / Sox1 ^- columnar cells, and nerve after 14 days of induction Includes Pax6 ⁺ / Sox1 ⁺ cells that form tube-like late rosettes.

免疫細胞化学分析は、Ｐａｘ６（図９Ｅ）、Ｓｏｘ１及びネスチンを発現するロゼット細胞が、前脳及び中脳細胞により発現されるホメオドメインタンパク質であるＯｔｘ２に対して陽性である（図９Ｆ、図９Ｈ）であるが、脊髄における細胞により生産されるホメオドメインタンパク質であるＨｏｘＣ８に対しては陰性である（図９Ｈ）ことを明らかにした。これらのロゼット細胞は、中脳細胞により発現されるＥｎ１に対しても陰性であった（図９Ｇ）。これらの結果は、神経神経外胚葉細胞が、初期のｉｎ ｖｉｖｏでの発達中に神経外胚葉細胞により初期に獲得される前脳表現型に類似した前脳表現型を保有することを示唆する（Stem，D.C.，Nat．Rev．Neurosci．2：92-98，2001）。   Immunocytochemical analysis revealed that rosette cells expressing Pax6 (FIG. 9E), Sox1 and nestin are positive for Otx2, a homeodomain protein expressed by forebrain and midbrain cells (FIGS. 9F, 9H). ) But was negative for HoxC8, a homeodomain protein produced by cells in the spinal cord (FIG. 9H). These rosette cells were also negative for En1 expressed by midbrain cells (FIG. 9G). These results suggest that neuronal ectoderm cells possess a forebrain phenotype that is similar to the forebrain phenotype initially acquired by neuroectodermal cells during early in vivo development ( Stem, DC, Nat. Rev. Neurosci. 2: 92-98, 2001).

神経外胚葉細胞から運動ニューロンを分化させるために、神経管様ロゼットにおけるＳｏｘ１⁺神経外胚葉細胞を、酵素処理（Zhang，S.C.，et al.，Nat．Biotechnol．19：1129-1133，2001）により単離して、レチノイン酸（ＲＡ、０．００１〜１μＭ）、尾側化試薬（Blumberg，B.，et al.，Development 124：373-379，1997）及びＳＨＨ（５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）、腹側化モルフォゲン（Jessell，T.M.，Nat．Rev．Genet．1：20-29，2000；Briscoe，J．and Ericson，J.，Curr．Opin．Neurobiol．11：43-49，2001）の存在下で、ラミニン基質上で分化させた。平板に播種後１４日目までに、成長領域における多数の細胞が、それらの突起を通じてネットワークを形成した（図１０Ａ）。免疫染色分析により、分化細胞が、ニューロンマーカーであるβ_III−チューブリン及びＭＡＰ２に対して陽性であることが示された。それらの大部分（５０％を超える）はまた、運動ニューロン発生に関連する転写因子であるＩｓｌ １（図１０Ａ）及びＬｉｍ３（図示せず）に対しても陽性であった（上述のJessell，T.M.；上述のBriscoe，J．and Eriscon，J.，2001；Shirasaki，R．and Pfaff，S.L.，Annu．Rev．Neurosci．25：251-281，2002）。しかしながら、１〜３週間の培養物におけるほんの数少ない細胞が、運動ニューロン特異的転写因子であるＨＢ９を発現した（Arber，S.，et al.，Neuron 23：659-674，1999）（図１０Ａ）。これらは、Ｓｏｘ１⁺神経外胚葉が、運動ニューロン誘導に対して不応性であり得ることを示唆する。 To differentiate motor neurons from neuroectodermal cells, Sox1 ⁺ neuroectodermal cells in neural tube-like rosettes were treated with enzymes (Zhang, SC, et al., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133, 2001). Isolated, retinoic acid (RA, 0.001-1 μM), caudalization reagent (Blumberg, B., et al., Development 124: 373-379, 1997) and SHH (50-500 ng / ml), abdomen In the presence of a lateralized morphogen (Jessell, TM, Nat. Rev. Genet. 1: 20-29, 2000; Briscoe, J. and Ericson, J., Curr. Opin. Neurobiol. 11: 43-49, 2001) Differentiated on laminin substrate. By day 14 after seeding the plate, a large number of cells in the growth area formed a network through their protrusions (FIG. 10A). Immunostaining analysis showed that differentiated cells were positive for neuronal markers β _III -tubulin and MAP2. Most of them (greater than 50%) were also positive for Isl 1 (FIG. 10A) and Lim3 (not shown), transcription factors associated with motor neuron development (Jessell, TM described above). Briscoe, J. and Eriscon, J., 2001; Shirasaki, R. and Pfaff, SL, Annu. Rev. Neurosci. 25: 251-281, 2002). However, only a few cells in the 1-3 week culture expressed HB9, a motor neuron-specific transcription factor (Arber, S., et al., Neuron 23: 659-674, 1999) (FIG. 10A). . These suggest that Soxl ⁺ neuroectoderm can be refractory to motor neuron induction.

Ｓｏｘ１発現細胞は、３週齢のヒト胚に相当する時期での神経管様ロゼットの形成及びＳｏｘ１の発現を仮定すると、神経管における神経外胚葉細胞に相当し得る。神経管における神経外胚葉細胞は、局所的に特定化される（Lumsden，A．and Krumlauf，R.，Science 274：1109-1115，1996）。この考慮により、本発明者等に、神経外胚葉細胞がＳｏｘ１を発現する前に、ＲＡが尾側化及び／又は運動ニューロン特定化を促進し得るということを仮定するに至らせた。したがって、本発明者等は、より初期段階で、すなわち円柱状細胞がロゼットへ体系化し始め、且つＰａｘ６を発現した場合に、神経外胚葉細胞をＲＡ（０．００１〜１μＭ）で処理した。このようにして６日間処理した培養物は、神経管様ロゼットへと発生して、Ｓｏｘ１を発現し、ＦＧＦ２処理した培養物と区別できなかった。ロゼットクラスターを単離して、ラミニン基質へ接着させた後、平板に播種後の２４〜４８時間程度と初期に、無数の神経突起(neurites)がクラスターから伸長した。平板に播種後１４日目までに、神経突起成長領域は、カバーガラスをほぼ全体（直径１１ｍｍ）覆ったが、成長領域におけるニューロン細胞体の数は限られていた（図１０Ａ）。細胞の大部分が、Ｉｓｌ １／２に対して陽性であり、それらのうち、約５０％はまた、ＨＢ９⁺であり（図１０Ｂ）、これらの二重陽性細胞が運動ニューロンであることを示唆した。Ｉｓｌ １／２⁺及びＨＢ９^-細胞は、介在ニューロンである可能性が高かった。 Sox1-expressing cells can correspond to neuroectodermal cells in the neural tube, assuming neural tube-like rosette formation and Sox1 expression at a time corresponding to a 3-week-old human embryo. Neuroectodermal cells in the neural tube are locally identified (Lumsden, A. and Krumlauf, R., Science 274: 1109-1115, 1996). This consideration led the inventors to assume that RA can promote caudalization and / or motor neuron specification before neuroectodermal cells express Sox1. Therefore, we treated neuroectodermal cells with RA (0.001-1 μM) at an earlier stage, ie when columnar cells began to systemize into rosettes and expressed Pax6. Cultures treated in this way for 6 days developed into neural tube-like rosettes that expressed Sox1 and were indistinguishable from cultures treated with FGF2. After isolating the rosette cluster and adhering it to the laminin substrate, innumerable neurites extended from the cluster about 24 to 48 hours after seeding on the plate. By 14 days after seeding on a flat plate, the neurite growth region covered almost the entire cover glass (diameter 11 mm), but the number of neuronal cell bodies in the growth region was limited (FIG. 10A). Most of the cells are positive for Isl 1/2, of which about 50% are also HB9 ⁺ (FIG. 10B), suggesting that these double positive cells are motor neurons. did. Isl 1/2 ⁺ and HB9 ⁻ cells were likely to be interneurons.

ＨＢ９発現細胞はまず、６日目に出現して、神経ロゼットを分化のために平板に播種後したおよそ１０〜１２日後に、高比率に到達した。ＨＢ９発現細胞は、主としてクラスターへと局在化され、クラスターでは総細胞の約２１％であり、成長領域では数少ない細胞が見られた（図１０Ａ、図１０Ｄ）。最も高い比率のＨＢ９⁺細胞は、０．１〜１．０μＭのＲＡの存在下で誘導された。１．０μＭを超える用量でのＲＡは、本発明者等の化学的に規定される接着培養において、幾つかの細胞に退化（又は変質）をもたらした。ＲＡ又はＳＨＨ、或いは両方の非存在下では、ほんわずかなＨＢ９⁺細胞しか存在しなかった（図１０Ｄ）。ＨＢ９発現細胞はすべて、β_III−チューブリンで染色された（図１０Ｃ）。したがって、初期神経外胚葉に対するＲＡによる処理は、運動ニューロンの効率的な誘導に必要とされる。 HB9-expressing cells first appeared on day 6 and reached a high ratio approximately 10-12 days after seeding neural rosettes on plates for differentiation. HB9-expressing cells were mainly localized into clusters, about 21% of the total cells in the clusters, and few cells in the growth region (FIGS. 10A and 10D). The highest proportion of HB9 ⁺ cells was induced in the presence of 0.1-1.0 μM RA. RA at doses above 1.0 μM resulted in degeneration (or alteration) in some cells in our chemically defined adhesion culture. In the absence of RA or SHH, or both, there were very few HB9 ⁺ cells (FIG. 10D). All HB9 expressing cells were stained with β _III -tubulin (FIG. 10C). Thus, treatment of early neuroectoderm with RA is required for efficient induction of motor neurons.

ＲＡが初期神経外胚葉細胞を運動ニューロンへと分化させるが、後期神経外胚葉細胞は分化させない理由を理解するために、本発明者等はまず、神経外胚葉細胞の尾側化に対するＲＡの影響を検査した。ＲＡ（０．００１〜１．０μＭ）又はＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）による７日間の初期ロゼット細胞（Ｐａｘ６⁺／Ｓｏｘ１^-）の処理は、用量依存的様式で、Ｏｔｘ２の発現の減少、並びにＨｏｘ遺伝子（例えば、Ｈｏｘ Ｂ１、Ｂ６、Ｃ５及びＣ８）の発現の増加をもたらした（図１１Ａ）。より多くの尾側細胞により発現される遺伝子が、より高い用量のＲＡにより誘導された。ＲＡによる１週間の後期ロゼット細胞（Ｐａｘ６⁺／Ｓｏｘ１⁺）の処理は、ＦＧＦ２により誘導されるＨｏｘ遺伝子発現パターンを変更させなかった（図示せず）。ニューロン分化培地中で単離及び培養したＲＡ処理した初期ロゼット細胞は、免疫細胞化学により明らかであるように、まず分化の６日後に、及び大部分が分化の１０〜１２日後にＨｏｘＣ８タンパク質を発現した（図１１Ｄ）。この段階の細胞は、Ｏｔｘ２発現を欠如していた（図１１Ｃ）。ＨｏｘＣ８⁺細胞はすべて、β_III−チューブリン⁺ニューロンであった（図１１Ｅ）。対比して、ＲＡで１週間処理した後、２週間分化させた後期ロゼット細胞は、数少ないＨｏｘＣ８⁺細胞を生じたが、Ｏｔｘ２発現細胞は減少した（図示せず）。したがって、ＲＡによる初期神経外胚葉細胞の処理は、脊髄運動ニューロンに関連するＨｏｘＣタンパク質の発現を伴う効率的な尾側化をもたらすが、ＲＡによる後期神経外胚葉細胞の処理はもたらさない（Liu，J.P.，et al.，Neuron 32：997-1012，2001）。 To understand why RA differentiates early neuroectodermal cells into motor neurons but not late neuroectodermal cells, we first consider the effect of RA on caudalization of neuroectodermal cells. Inspected. Treatment of early rosette cells (Pax6 ⁺ / Sox1 ⁻ ) for 7 days with RA (0.001-1.0 μM) or FGF2 (20 ng / ml) reduced Otx2 expression as well as the Hox gene in a dose-dependent manner. This resulted in increased expression of (eg, Hox B1, B6, C5 and C8) (FIG. 11A). Genes expressed by more caudal cells were induced by higher doses of RA. Treatment of late rosette cells (Pax6 ⁺ / Sox1 ⁺ ) for 1 week with RA did not alter the Hox gene expression pattern induced by FGF2 (not shown). RA-treated early rosette cells isolated and cultured in neuronal differentiation medium expressed HoxC8 protein first after 6 days of differentiation and mostly after 10-12 days of differentiation, as evidenced by immunocytochemistry. (FIG. 11D). Cells at this stage lacked Otx2 expression (FIG. 11C). HoxC8 ⁺ All cells, beta _III - was tubulin ⁺ neurons (Figure 11E). In contrast, late rosette cells treated for 1 week with RA and differentiated for 2 weeks gave rise to few HoxC8 ⁺ cells, but decreased Otx2-expressing cells (not shown). Thus, treatment of early neuroectodermal cells with RA results in efficient caudalization with the expression of HoxC protein associated with spinal motor neurons, but does not result in treatment of late neuroectodermal cells with RA (Liu, JP, et al., Neuron 32: 997-1012, 2001).

続いて、本発明者等は、腹側化に関する初期及び後期神経外胚葉細胞に対するＳＨＨの影響を比較した。ｈＥＳ細胞由来の神経外胚葉細胞は、それらがＰａｘ６⁺であってもＳｏｘ⁺であっても、脊髄において運動ニューロン及びオリゴデンドロサイトとなる運命にある腹側神経前駆体細胞において発現されるホメオドメインタンパク質であるＯｌｉｇ２を発現しなかった（Lu，Q.R.，et al.，Cell 109：75-86，2002；Zhou，Q.，et al.，Neuron 31：791-807，2001）（図１１Ｆ）。Ｐａｘ６⁺／Ｓｏｘ^-神経外胚葉細胞をＲＡの存在下で１週間培養した後、単離して、ＳＨＨの非存在下でさらに２週間、さらに分化させた場合、ほんの数少ない細胞が、Ｏｌｉｇ２を発現した（図示せず）。しかしながら、ＳＨＨ（５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下では、多くの細胞が、核においてＯｌｉｇ２を発現した（図１１Ｇ）。対比して、同条件下で２週間分化させたＰａｘ６⁺／Ｓｏｘ⁺神経外胚葉細胞は、数少ないＯｌｉｇ２発現細胞を産生した（図１１Ｈ）。したがって、初期段階でＲＡにより処理した神経外胚葉細胞は、ＳＨＨに応答して、腹側神経前駆体発生運命へと効率的に誘導させることができるが、後期段階でＲＡにより処理した神経外胚葉細胞はできない。 Subsequently, the inventors compared the effect of SHH on early and late neuroectodermal cells for ventralization. hES cell-derived neuroectodermal cells are homeodomains expressed in ventral neural precursor cells destined to become motor neurons and oligodendrocytes in the spinal cord, whether they are Pax6 ⁺ or Sox ⁺ The protein Olig2 was not expressed (Lu, QR, et al., Cell 109: 75-86, 2002; Zhou, Q., et al., Neuron 31: 791-807, 2001) (FIG. 11F). Pax6 ⁺ / Sox ^- after the neuroectodermal cells were cultured for one week in the presence of RA, isolated, additional 2 weeks in the absence of SHH, if allowed to further differentiate, only few cells expressed Olig2 (Not shown). However, in the presence of SHH (50-500 ng / ml), many cells expressed Olig2 in the nucleus (FIG. 11G). In contrast, Pax6 ⁺ / Sox ⁺ neuroectodermal cells differentiated for 2 weeks under the same conditions produced few Olig2 expressing cells (FIG. 11H). Thus, neuroectodermal cells treated with RA at an early stage can be efficiently induced to ventral neural precursor development fate in response to SHH, but neuroectodermal treated with RA at a later stage. The cell can not.

ＦＧＦ２も尾側発生運命を誘導する（図１１Ａ）にもかかわらず、運動ニューロン特定化に初期ＲＡ処理が必要とされる理由をさらに認識するために、本発明者等は、脊髄において前駆体ドメインを精製するのに重要であるクラスＩ（Ｉｒｘ３、Ｐａｘ６）及びクラスＩＩ（Ｏｌｉｇ２、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１）分子の発現を検査した（上述のJessell，T.M.，2000；上述のBriscoe，J.，and Ericson，J.，2001）。ＲＡは、後期神経外胚葉細胞よりも初期神経外胚葉細胞において、ＳＨＨ及びクラスＩＩ遺伝子、特にＯｌｉｇ２及びＮｋｘ６．１のかなり活発な(robust)発現を誘導した（図１１Ｂ）。したがって、初期神経外胚葉細胞は、運動ニューロン特定化に必須であるＳＨＨ及びクラスＩＩ因子の発現をアップレギュレートする際に、ＲＡに対してより応答性である。   To further recognize why FGF2 also induces caudal developmental fate (FIG. 11A), early RA treatment is required for motor neuron specification, we have identified the precursor domain in the spinal cord. The expression of class I (Irx3, Pax6) and class II (Olig2, Nkx2.2, Nkx6.1) molecules, which are important for purifying the protein, was examined (Jessell, TM, 2000, above; Briscoe, J., above). , And Ericson, J., 2001). RA induced more robust expression of SHH and class II genes, particularly Olig2 and Nkx6.1, in early neuroectodermal cells than in late neuroectodermal cells (FIG. 11B). Thus, early neuroectodermal cells are more responsive to RA in up-regulating the expression of SHH and class II factors essential for motor neuron specification.

コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現する細胞は、尾側化された神経外胚葉細胞を運動ニューロン分化のために平板に播種した３週後に出現し、これらの細胞は、本研究で分析した最長の培養期間である７週間に至るまで着実に増加した（図１２Ａ）。ＣｈＡＴ発現細胞は、主としてクラスターへと局在化され（図１２Ａ）、ＨＢ９⁺細胞の局在化に相当する。これらの細胞は、主に多極細胞であり、直径１５〜２０μｍの大きな細胞体(somas)を有し、幾つかは、３０μｍ程度と大きかった（図１２Ａ、図１２Ｂ）。核におけるＨＢ９及び体細胞と突起におけるＣｈＡＴの共発現が、培養３週間後に観察された（図１２Ｃ）。ニューロンの多くはまた、アセチルコリンの貯蔵及び放出に必須である小胞アセチルコリン輸送体（ＶＡＣｈＴ、図１２Ｄ）に関して陽性に染色された。多くのＣｈＡＴ⁺細胞は、特に培養の５週後に、細胞体及び突起上のシナプシンに関して陽性に標識された（図１２Ｅ）。 Cells expressing choline acetyltransferase (ChAT) appeared 3 weeks after plating caudalized neuroectodermal cells on motor plates for motor neuron differentiation, these cells were the longest analyzed in this study. It increased steadily up to the culture period of 7 weeks (FIG. 12A). ChAT-expressing cells are mainly localized into clusters (FIG. 12A), corresponding to the localization of HB9 ⁺ cells. These cells were mainly multipolar cells, had large somas with a diameter of 15 to 20 μm, and some were as large as 30 μm (FIGS. 12A and 12B). Co-expression of HB9 in the nucleus and ChAT in somatic cells and processes was observed after 3 weeks in culture (FIG. 12C). Many of the neurons also stained positive for the vesicular acetylcholine transporter (VAChT, FIG. 12D), which is essential for acetylcholine storage and release. Many ChAT ⁺ cells were labeled positive for synapsin on cell bodies and processes, especially after 5 weeks of culture (FIG. 12E).

本発明者等は、電気生理学的技法を用いて機能的成熟を評価した（ｎ＝２８個の細胞）。平均静止電位は、−３６．９±２．６ｍＶであり、入力抵抗は、９２０±５７ＭΩであった。単一活動電位（ＡＰ、図１２Ｆｉ）又は減少する過程（図１２Ｆｉｉ）は、試験した１３個のニューロンのうち１１個において、脱分極性電流工程（０．１５〜０．２ｎＡ×１ｓ）より誘発された。自発的脱分極性シナプス入力により誘発される自発的ＡＰも観察された（図１２Ｇ）。すべての細胞が、記録、続く免疫組織化学分析を生き残るわけではないが、ビオシチン及びＣｈＡＴによる二重免疫染色により、本発明者等が記録した細胞の多くは、運動ニューロンであることが実証された（図１２Ｊ）。   We evaluated functional maturation using electrophysiological techniques (n = 28 cells). The average static potential was −36.9 ± 2.6 mV, and the input resistance was 920 ± 57 MΩ. Single action potential (AP, FIG. 12Fi) or decreasing process (FIG. 12Fii) is evoked by the depolarizing current process (0.15-0.2 nA × 1s) in 11 out of 13 neurons tested It was done. Spontaneous AP induced by spontaneous depolarizing synaptic input was also observed (FIG. 12G). Not all cells survive recording and subsequent immunohistochemical analysis, but double immunostaining with biocytin and ChAT demonstrated that many of the cells we recorded are motor neurons. (FIG. 12J).

電圧クランプ分析により、ナトリウム及び遅延整流性カリウム電流と一致した時間及び電圧依存性内向き並びに外向き電流が示された。内向き電流及び活動電位は、１．０μＭのテトロドトキシン（ＴＴＸ、ｎ＝３）により阻止され、電圧作動型ナトリウムチャネルの存在を確認した。外向き電流は、さらに特性化されなかった。本発明者等はまた、シナプス電流も観察した（図１２Ｈ、試験した２３個の細胞のうちｎ＝２１）。これらは、１．０μＭのＴＴＸにより、振動数が減少されたが、排除はされず、機能的に無傷のシナプス神経伝達の存在を実証した。Ｃｓグルコネートベースのピペット溶液を用いると、外向き（阻害性）電流はゆっくりと減衰し（１３．６ｍｓ、ｎ＝１０回の事象）、ストリキニーネ及びビククリンの組合せにより阻止されたのに対して、残存する内向き（興奮性）電流は、迅速に減衰し（２．１ｍｓ、ｎ＝１７回の事象）、Ｄ−ＡＰ５及びＣＮＱＸの組合せにより阻止され（図１２Ｈ、図１２Ｊ）、阻害性（ＧＡＢＡ／グリシン）及び興奮性（グルタメート）神経伝達が、無傷脊髄で見られるのと同様に行われることを実証した（Gao，B.X.，et al.，J．Neurophysiol．79：2277-2287，1998）。   Voltage clamp analysis showed time and voltage dependent inward and outward currents consistent with sodium and delayed rectifier potassium currents. Inward current and action potential were blocked by 1.0 μM tetrodotoxin (TTX, n = 3), confirming the presence of voltage-gated sodium channels. The outward current was not further characterized. We also observed synaptic currents (FIG. 12H, n = 21 out of 23 cells tested). These were reduced in frequency by 1.0 μM TTX but were not eliminated, demonstrating the presence of functionally intact synaptic neurotransmission. With the Cs gluconate based pipette solution, the outward (inhibitory) current decays slowly (13.6 ms, n = 10 events), whereas it was blocked by the combination of strychnine and bicuculline, The remaining inward (excitatory) current decays rapidly (2.1 ms, n = 17 events) and is blocked by the combination of D-AP5 and CNQX (FIG. 12H, FIG. 12J) and inhibitory (GABA / Glycine) and excitatory (glutamate) neurotransmission has been demonstrated to occur in a manner similar to that seen in the intact spinal cord (Gao, BX, et al., J. Neurophysiol. 79: 2277-2287, 1998).

本発明者等の本研究は、機能的運動ニューロンが、ＦＧＦ２による神経外胚葉分化、神経誘導の後期相中のＲＡによる特定化及び／又は尾側化、並びに腹側化用モルフォゲンＳＨＨの存在下での有糸***後運動ニューロンへの続く分化により、ヒトＥＳ細胞から効率的に産生することができることを実証する。したがって、動物から学んだ神経発達の基本原理をヒト霊長類へ適用させて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで反復させ得る。マウスＥＳ細胞からの運動ニューロン分化の最近の実証（Wichterle，H.，et al.，Cell 110：385-397，2002）と対比して、本発明者等は、神経外胚葉分化のプロセスを細かく調べて、前駆体がＳｏｘ１^-発現神経外胚葉細胞となる前に、初期に生み出される突出ニューロン（例えば、脊髄運動ニューロン）の特定化がモルフォゲンによる処理を必要とすることを発見した。 Our present study shows that functional motor neurons are in the presence of morphogen SHH for neuroectodermal differentiation by FGF2, specification and / or caudalization by RA during the late phase of neural induction, and ventralization We demonstrate that subsequent differentiation into postmitotic motor neurons in can efficiently produce human ES cells. Thus, the basic principles of neurodevelopment learned from animals can be applied to human primates and repeated in vitro. In contrast to the recent demonstration of motor neuron differentiation from mouse ES cells (Wichterle, H., et al., Cell 110: 385-397, 2002), we have detailed the process of neuroectodermal differentiation. Upon examination, it was discovered that the specification of early-generated protruding neurons (eg, spinal motoneurons) requires treatment with morphogens before the precursors become Soxl ^- expressing neuroectodermal cells.

マウスＥＳ細胞はまず、神経外胚葉細胞へと導かれた。続いて、神経外胚葉は、ドーパミン作動性ニューロンへの分化に関してはＦＧＦ８及びＳＨＨ（Barberi，T.，et al.，Nat．Biotechnol．21：1200-1207，2003；Lee，S.H.，et al.，Nat．Biotechnol．18：675-679，2000）又は運動ニューロン分化に関してはＲＡ及びＳＨＨ（上述のWichterle，H.，et al.，2002）のようなモルフォゲンで処理する。これらの観察は、ニューロンが神経管における上皮から特定化されるという概念に適合するようである。本発明者等の本観察により、前脳表現型も保有するｈＥＳ由来のＳｏｘ１発現神経外胚葉細胞は、脊髄運動ニューロンを産生するのに不応性であることが示される。本発明者等の培養系においてｈＥＳ細胞から産生されるＳｏｘ１発現細胞は、それらが神経管様構造を形成し、且つ６日齢のヒト胚に相当するｈＥＳ細胞からの分化の２週後に、Ｓｏｘ１を発現するため、神経管におけるものと類似している（Zhang，S.C.，J．Hematother．Stem Cell Res．12：625-634，2003）。ｉｎ ｖｉｖｏでは、神経管は、ヒト妊娠の第３週目の最後に形成され（Wood，H.B．and Episkopou，V.，Mech．Dev．86：197-201，1999）、Ｓｏｘ１は、動物において神経管の形成中に神経外胚葉により発現される（Pevny，L.H.，et al.，Development 125：1967-1978，1998；上述のWood，H.B．and Episkopou，V.，1999）。本発明者等の見解は、幹細胞がＳｏｘ１−発現神経外胚葉細胞となる前に、ニューロンの種類、すなわち少なくとも大きな突出ニューロン（例えば、運動ニューロン）の特定化が開始することを示唆し、したがって脳由来の神経上皮細胞が、異なる局所的アイデンティティーの突出ニューロンを産生することができない理由を説明し得る。   Mouse ES cells were first led to neuroectodermal cells. Subsequently, neuroectodermal cells are FGF8 and SHH (Barberi, T., et al., Nat. Biotechnol. 21: 1200-1207, 2003; Lee, SH, et al., For differentiation into dopaminergic neurons. Nat. Biotechnol. 18: 675-679, 2000) or for motoneuron differentiation, treat with morphogens such as RA and SHH (Wichterle, H., et al., 2002, supra). These observations seem to fit the concept that neurons are specified from the epithelium in the neural tube. Our present observations indicate that hES-derived Sox1-expressing neuroectodermal cells that also possess a forebrain phenotype are refractory to produce spinal motor neurons. Sox1 expressing cells produced from hES cells in our culture system are sox1 after 2 weeks of differentiation from hES cells they form neural tube-like structures and correspond to 6 day old human embryos. Is similar to that in the neural tube (Zhang, SC, J. Hematother. Stem Cell Res. 12: 625-634, 2003). In vivo, a neural tube is formed at the end of the third week of human pregnancy (Wood, HB. and Episkopou, V., Mech. Dev. 86: 197-201, 1999), and Sox1 is a neuron in animals. It is expressed by the neuroectoderm during tube formation (Pevny, LH, et al., Development 125: 1967-1978, 1998; Wood, HB. And Episkopou, V., 1999, supra). Our view suggests that before the stem cells become Soxl-expressing neuroectodermal cells, the specification of the type of neuron, i.e. at least large protruding neurons (e.g., motor neurons), begins, and thus the brain It may explain why the derived neuroepithelial cells cannot produce protruding neurons with different local identities.

ｈＥＳ細胞の再生可能な供給源からの機能的運動ニューロンは、ＡＬＳのような運動ニューロン関連障害を治療するように設計される医薬品をスクリーニングするための包括的なヒト運動ニューロンを提供する。これらの細胞はまた、運動ニューロンに対する実験的細胞代替物のための有用な供給源を提供し、将来、運動ニューロン疾患又は脊髄障害を伴う患者における適用を導き得る。   Functional motoneurons from a renewable source of hES cells provide a comprehensive human motoneuron to screen for drugs designed to treat motor neuron related disorders such as ALS. These cells also provide a useful source for experimental cell replacements for motor neurons, which may lead to future applications in patients with motor neuron disease or spinal cord disorders.

方法
ＥＳ細胞の培養及び神経分化
ヒトＥＳ細胞（系統Ｈ１及びＨ９、継代１９〜４２）を、記載されるように（上述のThomson，J.A.，et al.，1998）、照射した胚マウス線維芽細胞のフィーダー層上で週に１度継代培養した。未分化状態のＥＳ細胞は、典型的な形態並びにＯｃｔ４及びＳＳＥＡ４の発現により確認された。神経外胚葉は分化に関して、ｈＥＳ細胞を４日間凝集させた後、Ｎ２、ヘパリン（２ｎｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）又はＲＡを補充したＦ１２／ＤＭＥＭ中で１０日間、接着性プラスチック表面上で培養した（上述のZhang，S.C.，et al.，2001）。 Methods ES cell culture and neuronal differentiation Human ES cells (lines H1 and H9, passages 19-42) were irradiated as described (Thomson, JA, et al., 1998, supra), and embryonic mouse fibroblasts irradiated. Subcultured once a week on the feeder layer of cells. Undifferentiated ES cells were confirmed by typical morphology and expression of Oct4 and SSEA4. Neuroectoderm for differentiation, after aggregating hES cells for 4 days, then on adhesive plastic surface for 10 days in F12 / DMEM supplemented with N2, heparin (2 ng / ml) and FGF2 (20 ng / ml) or RA (Zhang, SC, et al., 2001, described above).

運動ニューロン誘導に関して、モルフォゲン処理した神経外胚葉細胞を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Gibco）、Ｎ２サプリメント及びｃＡＭＰ（Sigma、ＩｇＭ）から構成されるニューロン分化培地中のオルニチン／ラミニンコーティングしたカバーガラス上へ、ＲＡ（０．１μＭ）及びＳＨＨ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌ、R＆D）の存在下で１週間平板培養した。その後、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ及びインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ１）（１０ｎｇ／ｍｌ、PeproTech Inc.）を培地に添加して、ＳＨＨの濃度を５０ｎｇ／ｍｌへ低減させた。   For motoneuron induction, morphogen-treated neuroectodermal cells were transferred onto ornithine / laminin-coated coverslips in neuronal differentiation medium composed of Neurobasal medium (Gibco), N2 supplement and cAMP (Sigma, IgM). 0.1 μM) and SHH (10-500 ng / ml, R & D) for 1 week. Thereafter, BDNF, GDNF and insulin-like growth factor-1 (IGF1) (10 ng / ml, PeproTech Inc.) were added to the medium to reduce the concentration of SHH to 50 ng / ml.

免疫細胞化学及び顕微鏡法（上述のZhang，S.C.，et al.，2001）
この研究で使用される一次抗体としては、ニューロンクラスＩＩＩβ−チューブリンに対するポリクローナル抗体（Convance Research Products，Richmond，CA、１：２，０００）、ネスチン（Chemicon，Temecula，CA、１：７５０）、Ｓｏｘ１（Chemicon、１：１０００）、シナプシンＩ（Calbiochem，Darmstadt，German、１：５００）、ＣｈＡＴ（Chemicon、１：５０）及びＶＡＣｈＴ（Chemicon、１：１０００）、Ｉｓｌｌ／２（S．Pfaff）、Ｏｔｘ２（F．Vaccarino）及びＯｌｉｇ２（M．Nakafuku）が挙げられる。ＭＮＲ２又はＨＢ９（８１．５Ｃ１０）、Ｉｓｌｅｔ１（４０．２Ｄ６）、Ｌｉｍ３（６７．４Ｅ１２）、Ｐａｘ６及びＮｋｘ２．２に対する抗体は、Developmental Studies Hybridoma Bank（ＤＳＨＢ、Iowa City，IA）から購入し、抗ＨｏｘＣ８は、Convance Research Products（１：２００）から購入した。電気生理学的に記録される細胞の識別のために、ビオシチン（Molecular Probes）充填細胞を、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Sigma、１：２００）で標識して、ＣｈＡＴで染色した。画像は、Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡６００（FRYER INC，Huntley，IL）又は共焦点顕微鏡（Nikon，Tokyo，Japan）上へ取り付けたＳｐｏｔディジタルカメラを使用して収集した。本来は非霊長類組織に対して開発された運動ニューロン転写因子及びホメオドメインタンパク質に対する抗体の特異性を、胎性（Ｅ３４又はＥ３６）アカゲザル脊髄及び脳組織（Wisconsin Primate Research Centerにより提供）において確証された。 Immunocytochemistry and microscopy (Zhang, SC, et al., 2001, supra)
Primary antibodies used in this study include polyclonal antibodies against neuron class III β-tubulin (Convance Research Products, Richmond, CA, 1: 2,000), nestin (Chemicon, Temecula, CA, 1: 750), Sox1 (Chemicon, 1: 1000), Synapsin I (Calbiochem, Darmstadt, Germany, 1: 500), ChAT (Chemicon, 1:50) and VAChT (Chemicon, 1: 1000), Isll / 2 (S. Pfaff), Otx2 (F. Vaccarino) and Olig2 (M. Nakafuku). Antibodies against MNR2 or HB9 (81.5C10), Islet1 (40.2D6), Lim3 (67.4E12), Pax6 and Nkx2.2 were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA) and anti-HoxC8 Was purchased from Convance Research Products (1: 200). For the identification of electrophysiologically recorded cells, biocytin (Molecular Probes) loaded cells were labeled with streptavidin-FITC (Sigma, 1: 200) and stained with ChAT. Images were collected using a Spot digital camera mounted on a Nikon fluorescent microscope 600 (FRYER INC, Huntley, IL) or a confocal microscope (Nikon, Tokyo, Japan). The specificity of antibodies against motor neuron transcription factors and homeodomain proteins originally developed against non-primate tissues has been confirmed in fetal (E34 or E36) rhesus spinal cord and brain tissues (provided by Wisconsin Primate Research Center). It was.

定量化
総分化細胞のうちのＨＢ９発現細胞の集団（ヘキスト標識した）は、Ｍｅｔｈａｍｏｒｐｈソフトウェア（Universal Imaging Corporation，Downingtown，PA）を用いて手動により、或いは立体解析学的測定により、実験群を知らされていない人物により計数された。測定されるべき面積は、トレーサーにより輪郭が描かれ、Ｓｔｅｒｅｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（MicroBrightField Inc，Williston，VT）により作動される自動段階移動(automated stage movement)を用いて、スコープが無作為に測定部位をサンプリングするように、計数用フレームの数を予め設定した。重複細胞を伴う計数領域に関しては、顕微鏡は、異なる層における陽性細胞上で上下に移動して焦点を合わせるように予め設定され、クラスターにおける総細胞数は、ソフトウェアにより推定された。各群における３〜４個のカバーガラスを計数し、データは、平均値±ＳＤとして表した。 Quantification The population of HB9-expressing cells (Hoechst labeled) among the total differentiated cells is informed of the experimental group either manually using Methomorph software (Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA) or by stereological measurements. It was counted by a person who was not. The area to be measured is outlined by a tracer and the scope randomly samples the measurement site using automated stage movement activated by Stereo Investigator software (MicroBrightField Inc, Williston, VT) Thus, the number of counting frames was set in advance. For counting areas with overlapping cells, the microscope was preset to move up and down on positive cells in different layers to focus and the total number of cells in the cluster was estimated by the software. Three to four cover slips in each group were counted and data were expressed as mean ± SD.

ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、異なる段階でのｈＥＳ細胞由来の神経外胚葉細胞及び運動ニューロン分化培養物から実施した。

RT-PCR assay RT-PCR amplification was performed from hES cell-derived neuroectodermal cells and motor neuron differentiation cultures at different stages.

電気生理学的記録
ｈＥＳ細胞由来の運動ニューロンの電気生理学的特性は、全細胞パッチ−クランプ記録技法（Gao，B.X.，et al.，J．Neurophysiol．79：2277-2287，1998）を用いて、５〜６週間分化させた培養物において研究した。テトロドトキシン（ＴＴＸ、１μＭ、Sigma）、ビククリン（２０μＭ、Sigma）、ストリキニーネ（５μＭ、Sigma）、Ｄ−２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰ−５、４０μＭ、Sigma）又は６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン（ＣＮＱＸ、２０μＭ、RBI，Natick，MA）をバス溶液に適用させて、電圧作動型又はシナプス電流のアイデンティティーを確認した。幾つかの実験に関して、１％ビオシチンを記録溶液に添加した。電流及び電圧クランプ記録は、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ａ増幅器（Axon Instruments，Union City，CA）を用いて実施した。シグナルは、４ｋＨｚでフィルタリングして、Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａアナログ−ディジタル変換器（Axon Instruments）を用いて１０ｋＨｚでサンプリングして、市販のソフトウェア（ｐＣｌａｍｐ９、Axon Instruments）を用いて、コンピュータハードディスクに蓄積及び格納された。アクセス抵抗は通常、８〜１５ＭΩであり、増幅器回路を用いて５０〜８０％相殺した。自発的シナプス電流は、テンプレート検出アルゴリズム（Ｍｉｎｉ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ ５．６．２８、Synaptosoft，Decatur，GA）を用いて検出し、Levenberg-Marquardtアルゴリズムを用いて、単一指数関数へ適合させた。結果は、平均値±ＳＥとして提示される。 Electrophysiological recordings The electrophysiological properties of hES cell-derived motoneurons were measured using a whole cell patch-clamp recording technique (Gao, BX, et al., J. Neurophysiol. 79: 2277-2287, 1998). Studies were performed on cultures differentiated for ~ 6 weeks. Tetrodotoxin (TTX, 1 μM, Sigma), bicuculline (20 μM, Sigma), strychnine (5 μM, Sigma), D-2-amino-5-phosphonovaleric acid (AP-5, 40 μM, Sigma) or 6-cyano-7- Nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX, 20 μM, RBI, Natick, MA) was applied to the bath solution to confirm the identity of the voltage-gated or synaptic current. For some experiments, 1% biocytin was added to the recording solution. Current and voltage clamp recordings were performed using a MultiClamp 700A amplifier (Axon Instruments, Union City, Calif.). The signal was filtered at 4 kHz, sampled at 10 kHz using a Digidata 1322A analog-to-digital converter (Axon Instruments), and stored and stored on a computer hard disk using commercially available software (pClamp9, Axon Instruments). . The access resistance was typically 8-15 MΩ and offset by 50-80% using an amplifier circuit. Spontaneous synaptic currents were detected using a template detection algorithm (Mini Analysis Program 5.6.28, Synaptosoft, Decatur, GA) and fitted to a single exponential function using the Levenberg-Marquardt algorithm. Results are presented as mean ± SE.

図１Ａ〜図１。ＥＳ細胞からの神経前駆体の分化及び単離。（図１Ａ）ＦＧＦ２の存在下で５日間成長させた付着ＥＢは、外縁での扁平な細胞を及び中心に集まった小伸長細胞を示す。（図１Ｂ）７日目までには、多くのロゼット形成（矢印）が分化ＥＢ中心に出現した。右上部の挿入図は、トルイジンブルーで染色したロゼットの１μｍ切片であり、管状構造に整列された円柱状細胞を示す。バー＝２０μｍ。（図１Ｃ〜図１Ｅ）ロゼットのクラスター（左下）及び小形成ロゼット（中心）における細胞は、ネスチン（図１Ｃ）及びＭｕｓａｓｈｉ−１（図１Ｄ）に関して陽性であるのに対して、周辺扁平細胞は陰性である。（図１Ｅ）図１Ｃ及び図１Ｄと、ＤＡＰＩで標識したすべての細胞核との複合画像である。（図１Ｆ）ディスパーゼで２０分間処理した後、ロゼット形成は退縮したのに対して、周辺扁平細胞は、付着したままであった。（図１Ｇ〜図１Ｉ）単離細胞は、繊維状パターンにおいてネスチン（図１Ｇ）、細胞質においてＭｕｓａｓｈｉ−１（図１Ｈ）及び主として膜上でＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図１Ｉ）に関して陽性に染色される。核をすべて、ＤＡＰＩで染色する。バー＝１００μｍ。1A to 1. Differentiation and isolation of neural progenitors from ES cells. (FIG. 1A) Adherent EBs grown for 5 days in the presence of FGF2 show flat cells at the outer edge and small elongated cells gathered in the center. (FIG. 1B) By day 7, many rosette formations (arrows) appeared at the center of differentiated EBs. The inset in the upper right is a 1 μm section of rosette stained with toluidine blue, showing columnar cells aligned in a tubular structure. Bar = 20 μm. (FIGS. 1C-1E) Cells in the cluster of rosettes (bottom left) and the small-forming rosette (center) are positive for nestin (FIG. 1C) and Musashi-1 (FIG. 1D), whereas peripheral squamous cells are Negative. FIG. 1E is a composite image of FIGS. 1C and 1D and all cell nuclei labeled with DAPI. (FIG. 1F) After treatment with dispase for 20 minutes, rosette formation was regressed whereas peripheral squamous cells remained attached. (FIGS. 1G-1I) Isolated cells stain positive for nestin (FIG. 1G) in the fibrous pattern, Musashi-1 (FIG. 1H) in the cytoplasm and PSA-NCAM (FIG. 1I) primarily on the membrane. All nuclei are stained with DAPI. Bar = 100 μm. 図２Ａ〜図２Ｇ。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＳ細胞由来の神経前駆体の特性化。（図２Ａ）解離されたＥＳ細胞由来の神経前駆体によるＢｒｄＵ取り込みは、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で上昇するが、上皮成長因子（ＥＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）又は白血病阻害因子（ＬＩＦ）（５ｎｇ／ｍｌ）を用いた場合は上昇しない。これは、３回の反復実験のうちの１つからの代表データである。^*は、実験群と対照群との間の差を示す（ｐ＜０．０１、ｎ＝４、スチューデントｔ検定）。（図２Ｂ）ＥＳ細胞に由来する神経前駆体のクラスターの３週間の分化は神経突起束を示し、細胞はそれらと一緒に遊走する。（図２Ｃ）３週の分化後の免疫染色は、細胞の大部分がβ_III−チューブリン⁺ニューロン（赤色）であること、またほんのわずかな細胞がＧＦＡＰ⁺アストロサイト（緑色）であることを示す。（図２Ｄ）４５日の分化後、さらに多くのＧＦＡＰ⁺アストロサイト（緑色）が、ＮＦ２００⁺神経突起（赤色、緑色のＧＦＡＰとの重複のため黄色がかっている）と一緒に出現する。（図２Ｅ〜Ｇ）様々な形態を有するＥＳ由来のニューロンは、グルタメート（図２Ｅ）、ＧＡＢＡ（図２Ｆ）及び酵素チロシンヒドロキシラーゼ（図２Ｇ）のような別個の神経伝達物質を発現する。Ｏ４⁺オリゴデンドロサイト（矢印）は、グリア分化培地における２週の分化後に観察される。バー＝１００μｍ。2A-2G. Characterization of neural progenitors derived from ES cells in vitro. (FIG. 2A) BrdU incorporation by dissociated ES cell-derived neural progenitors is elevated in the presence of FGF2 (20 ng / ml), but epidermal growth factor (EGF) (20 ng / ml) or leukemia inhibitory factor (LIF) ) (5 ng / ml) does not increase. This is representative data from one of three replicate experiments. ^* Indicates difference between experimental group and control group (p <0.01, n = 4, student t test). (FIG. 2B) Three-week differentiation of clusters of neural precursors derived from ES cells shows neurite bundles, and the cells migrate with them. (FIG. 2C) Immunostaining after 3 weeks of differentiation shows that most of the cells are β _III -tubulin ⁺ neurons (red) and only a few cells are GFAP ⁺ astrocytes (green). Show. (FIG. 2D) After 45 days of differentiation, more GFAP ⁺ astrocytes (green) appear with NF200 ⁺ neurites (red, yellowish due to overlap with green GFAP). (FIGS. 2E-G) ES-derived neurons with various morphologies express distinct neurotransmitters such as glutamate (FIG. 2E), GABA (FIG. 2F) and the enzyme tyrosine hydroxylase (FIG. 2G). O4 ⁺ oligodendrocytes (arrows) are observed after 2 weeks of differentiation in glial differentiation medium. Bar = 100 μm. 図３Ａ〜図３Ｋ。ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＳ細胞由来の神経前駆体の取り込み及び分化。移植細胞は、ヒトａｌｕ反復要素に対するプローブ（図３Ａ〜図３Ｅ、図３Ｇ）又はヒト特異的核抗原に対する抗体（図３Ｆ）を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法により検出される。（図３Ａ）８週齢のレシピエントの宿主皮質における個々のドナー細胞（矢印）。（図３Ｂ）海馬形成におけるＥＳ細胞由来の神経前駆体の広範囲にわたる取り込み。ヒトａｌｕプローブとハイブリダイズさせた細胞は、赤色ドットで標識される（偽性有色）。（図３Ｃ）Ｐ１４での海馬錐体層の近傍で取り込まれたヒト細胞。（図３Ｄ）４週齢のレシピエントマウスの中隔におけるＥＳ細胞由来の細胞。（図３Ｅ）視床下部における個々のドナー細胞の高倍率図である。隣接する未標識宿主細胞間のとぎれのない取り込みに留意されたい。（図３Ｆ）ヒト特異的核抗原に対する抗体を用いて検出される４週齢の宿主の線条におけるドナー細胞。（図３Ｇ）水道から背側中脳への移植細胞の広範囲にわたる遊走。（図３Ｈ）極形態及び長い突起を示す２週齢の宿主の皮質におけるヒトＥＳ細胞由来のニューロン。細胞は、ヒト特異的核マーカー（緑色）及びβ_III−チューブリン（赤色）に対する抗体で二重標識される。（図３Ｉ）ヒト神経フィラメントに対する抗体で同定した海馬の采におけるドナー由来の軸索のネットワーク。（図３Ｊ）ＭＡＰ２のａ及びｂアイソフォームを認識する抗体で二重標識したドナー由来の多極ニューロン（図３Ｋ）ヒト特異的核マーカー（緑色）及びＧＦＡＰに対する抗体（赤色）で二重標識した４週齢の動物の皮質におけるＥＳ細胞由来のアストロサイト。二重標識はすべて、共焦点画像であり、単一光切断により確認されることに留意されたい。バー：図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｇ ２００μｍ、図３Ｃ、図３Ｄ １００μｍ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｈ〜図３Ｋ １０μｍ。3A-3K. In vivo uptake and differentiation of ES cell-derived neural progenitors. Transplanted cells are detected by in situ hybridization using probes for human alu repetitive elements (FIGS. 3A-3E, FIG. 3G) or antibodies to human specific nuclear antigen (FIG. 3F). (FIG. 3A) Individual donor cells (arrows) in the host cortex of 8 week old recipients. (FIG. 3B) Extensive uptake of ES cell-derived neural precursors in hippocampal formation. Cells hybridized with the human alu probe are labeled with red dots (false color). (FIG. 3C) Human cells taken up in the vicinity of the hippocampal cone layer at P14. (FIG. 3D) ES cell-derived cells in the septum of 4 week old recipient mice. (FIG. 3E) High magnification view of individual donor cells in the hypothalamus. Note the continuous uptake between adjacent unlabeled host cells. (FIG. 3F) Donor cells in the striae of 4 week old hosts detected using antibodies against human specific nuclear antigen. (FIG. 3G) Extensive migration of transplanted cells from the tap to the dorsal midbrain. (FIG. 3H) Human ES cell-derived neurons in the cortex of a 2 week old host showing polar morphology and long processes. Cells human specific nuclear marker (green) and beta _III - is dual-labeled with antibodies to tubulin (red). (FIG. 3I) A network of donor-derived axons in hippocampal wings identified with antibodies to human neurofilaments. (FIG. 3J) Donor-derived multipolar neurons double-labeled with antibodies recognizing MAP2 a and b isoforms (FIG. 3K) double-labeled with human-specific nuclear markers (green) and antibodies to GFAP (red) ES cell-derived astrocytes in the cortex of 4 week old animals. Note that all double labels are confocal images and are confirmed by a single light section. Bars: FIGS. 3A, 3B, 3G 200 μm, FIGS. 3C, 3D 100 μm, FIGS. 3E, 3F, 3H to 3K 10 μm. 神経外胚葉細胞の産生及び局所的特定化。図４Ａ。円柱状細胞は、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２の存在下での９日目に分化ＥＳ細胞コロニーにおいて出現した。図４Ｂ。円柱状細胞は、１４日目に神経管様ロゼットを形成した。図４Ｃ。円柱状形態を有するロゼットにおける細胞は、Ｓｏｘ１（赤色）に対して陽性であった。図４Ｄ。ＦＧＦ２で処理した培養物における神経ロゼット細胞は、Ｂｆ１（赤色）を発現したが、Ｅｎ−１（緑色）は発現しなかった。図４Ｅ。Ｅｎ−１（緑色）発現は、９日目に線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）（１００ｎｇ／ｍｌ）で６日間処理し、ＦＧＦ８中で４日間増殖させた後、ラミニン基質上でさらに６日間ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理したネスチン⁺（赤色）神経外胚葉細胞において観察された。図４Ｆ。これらのＥｎ−１⁺細胞（緑色）は、図４Ｅのように処理した培養物においてＢｆ１（赤色）に対して陰性であった。細胞核は、ヘキスト（ｃ、ｄ；青色）で染色した。バー＝５０μｍ。Production and local specification of neuroectodermal cells. FIG. 4A. Cylindrical cells appeared in differentiated ES cell colonies on day 9 in the presence of 20 ng / ml FGF2. FIG. 4B. Columnar cells formed neural tube-like rosettes on day 14. FIG. 4C. Cells in rosettes with a columnar morphology were positive for Sox1 (red). FIG. 4D. Neurological rosette cells in cultures treated with FGF2 expressed Bf1 (red) but not En-1 (green). FIG. 4E. En-1 (green) expression was treated with fibroblast growth factor 8 (FGF8) (100 ng / ml) on day 9 for 6 days, grown in FGF8 for 4 days, and then on laminin substrate for an additional 6 days. Observed in nestin ⁺ (red) neuroectodermal cells treated with sonic hedgehog (SHH) (200 ng / ml). FIG. 4F. These En-1 ⁺ cells (green) were negative for Bf1 (red) in cultures treated as in FIG. 4E. Cell nuclei were stained with Hoechst (c, d; blue). Bar = 50 μm. ＤＡニューロンの分化。図５Ａ。分化した細胞の約１／３は、３週間の分化後にＦＧＦ８、ＳＨＨ及びアスコルビン酸（ＡＡ）で処理した培養物においてチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性であった。図５Ｂ。培養物におけるＴＨ⁺細胞（赤色）はすべて、ニューロンマーカーβ_III−チューブリン（緑色）で陽性に染色された。図５Ｃ〜図５Ｅ。培養物におけるＴＨ⁺細胞（ｄ、緑色）はすべて、芳香族酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）（ｄ及びｅ、赤色）で陽性に染色されたが、幾つかのＡＡＤＣ⁺細胞は、ＴＨ^-であった（ｅ、矢じり）。図５Ｆ。ＴＨ⁺細胞は、ノルアドレナリン作動性ニューロンマーカードーパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ＤβＨ）（緑色）に対して陰性であった。挿入図は、ＤβＨが成体ラット脳幹の切片における細胞を陽性に染色することを示した。細胞核は、ヘキスト（ａ、ｂ、ｆ；青色）で染色した。バー＝５０μｍ。Differentiation of DA neurons. FIG. 5A. About 1/3 of the differentiated cells were tyrosine hydroxylase (TH) positive in cultures treated with FGF8, SHH and ascorbic acid (AA) after 3 weeks of differentiation. FIG. 5B. All TH ⁺ cells (red) in culture stained positively with the neuronal marker β _III -tubulin (green). 5C-5E. All TH ⁺ cells in culture (d, green) stained positive with aromatic acid decarboxylase (AADC) (d and e, red), but some AADC ⁺ cells were TH ⁻ (E, arrowhead). FIG. 5F. TH ⁺ cells were negative for the noradrenergic neuronal marker dopamine β-hydroxylase (DβH) (green). The inset shows that DβH positively stains cells in adult rat brainstem sections. Cell nuclei were stained with Hoechst (a, b, f; blue). Bar = 50 μm. ヒトＥＳ細胞由来のＤＡニューロンの特性化。図６Ａ。分化ＤＡニューロンは、ＲＴ−ＰＣＲにより現される中脳発生運命の特徴である遺伝子を発現した。ＥＢ：胚様体、ＮＥ：神経外胚葉細胞、３ｗ：３週間分化させたＤＡ培養物、ＮＣ：陰性対照。図６Ｂ。培養物におけるＴＨ⁺細胞（赤色）の大部分は、中脳マーカーＥｎ−１（緑色）を発現した。図６Ｃ。ＧＡＢＡ発現細胞（赤色）は、培養物中に存在したが、極わずかのＴＨ⁺細胞（緑色）がＧＡＢＡ（赤色、挿入図）を共発現した。図６Ｄ。ＴＨ⁺細胞（赤色）は、カルビンジン（緑色）に対して陰性であった。バー＝５０μｍ。Characterization of DA neurons derived from human ES cells. FIG. 6A. Differentiated DA neurons expressed genes characteristic of midbrain developmental fate as revealed by RT-PCR. EB: embryoid body, NE: neuroectodermal cell, 3w: DA culture differentiated for 3 weeks, NC: negative control. FIG. 6B. The majority of TH ⁺ cells (red) in culture expressed the midbrain marker En-1 (green). FIG. 6C. GABA expressing cells (red) were present in the culture, but very few TH ⁺ cells (green) co-expressed GABA (red, inset). FIG. 6D. TH ⁺ cells (red) were negative for calbindin (green). Bar = 50 μm. ヒトＥＳ細胞由来のＤＡニューロンにおける受容体及び輸送体の発現。図７Ａ〜図７Ｃ。ＴＨ⁺細胞（ａ、緑色）はすべて、ｃ−Ｒｅｔ（赤色）を発現した。図７Ｄ〜図７Ｆ。ＴＨ⁺細胞（ｄ、緑色）は、ＶＭＡＴ２（ｅ及びｆ；赤色）を共発現した。図７Ｇ〜Ｉ。ＴＨ⁺ニューロン（ｊ、緑色）は、シナプトフィジン（ｋ及びｌ、赤色）を共発現した。バー＝２５μｍ。Receptor and transporter expression in DA neurons from human ES cells. 7A-7C. All TH ⁺ cells (a, green) expressed c-Ret (red). 7D-7F. TH ⁺ cells (d, green) co-expressed VMAT2 (e and f; red). 7G-I. TH ⁺ neurons (j, green) co-expressed synaptophysin (k and l, red). Bar = 25 μm. ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生したＤＡニューロンの機能的特徴。図８Ａ。三週間の分化後の対照及び処理培養物における自発的及び脱分極（ＨＢＳＳ中の５６ｍＭ ＫＣｌ）誘導性ＤＡ放出。データは、３回の実験からの平均値±ＳＤとして提示した。^*ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントｔ検定により対照に対して）。図８Ｂ。３０日間分化させた２つのニューロンにおいて電流段階（０．２ｎＡ）を脱分極させることにより誘起される活動電位。受動膜特性：（ｉ）Ｖ_rest−４９ｍＶ、Ｃ_m １５．５ｐＦ、Ｒ_m ５．０ＧΩ、（ｉｉ）Ｖ_rest−７２ｍＶ、Ｃ_m ４５ｐＦ、Ｒ_m ８８５ＧΩ；図８Ｃ。３６日間分化させたニューロンにおける自発的シナプス後電位。図８Ｄ。培養に３０日間維持されたニューロンにおける自発的なシナプス後電位。ニューロンは、Ｋ−グルコナートベースのピペット溶液を用いて−４０ｍＶで電圧固定した。外向き電流は、阻害性事象を反映し、内向き電流は、この低塩化物記録溶液において興奮性事象を反映する。（ｉｉ）パネル（ｉ）で示される細胞からの平均事象。加重減衰時間定数は、阻害（ｎ＝１７事象）及び興奮性（ｎ＝１４事象）電流に関して、６１．４ｍｓ及び９．９ｍｓである。図８Ｅ〜図８Ｇ。免疫染色は、記録されたニューロン（ｆ、緑色）がＴＨ⁺（ｅ及びｇ、赤色）であることを示した。バー＝５０μｍ。Functional characteristics of DA neurons produced in vitro. FIG. 8A. Spontaneous and depolarization (56 mM KCl in HBSS) induced DA release in control and treated cultures after 3 weeks of differentiation. Data were presented as mean ± SD from 3 experiments. ^* p <0.05 (vs. control by unpaired Student t test). FIG. 8B. Action potential evoked by depolarizing the current stage (0.2 nA) in two neurons differentiated for 30 days. Passive membrane properties: (i) V _rest −49 mV, C _m 15.5 pF, R _m 5.0 GΩ, (ii) V _rest −72 mV, C _m 45 pF, R _m 885 GΩ; FIG. 8C. Spontaneous postsynaptic potential in neurons differentiated for 36 days. FIG. 8D. Spontaneous post-synaptic potential in neurons maintained for 30 days in culture. Neurons were voltage clamped at -40 mV using a K-gluconate based pipette solution. The outward current reflects an inhibitory event and the inward current reflects an excitatory event in this low chloride recording solution. (Ii) Mean events from cells shown in panel (i). The weighted decay time constants are 61.4 ms and 9.9 ms for inhibition (n = 17 events) and excitatory (n = 14 events) currents. 8E-8G. Immunostaining showed that the recorded neurons (f, green) were TH ⁺ (e and g, red). Bar = 50 μm. ＦＧＦ２により誘導される神経外胚葉細胞は、吻状表現型を示す。ＦＧＦ２中で１０日間分化させたＥＳ細胞は、コロニー中心で小円柱状形態を示し、ロゼット形成へと体系化した。ロゼットにおける円柱状細胞は、Ｐａｘ６に対して陽性であり、Ｓｏｘ１に対して陰性であったが、周辺の扁平細胞はそうではなかった（Ａ）。１４日目までに、円柱状細胞は、神経管様ロゼットを形成し（Ｂ）、Ｐａｘ６（Ｃ）及びＳｏｘ１（Ｄ）の両方に対して陽性であった。ロゼットにおけるＰａｘ６⁺細胞（Ｅ）はまた、Ｏｔｘ２⁺（Ｆ）であったが、Ｅｎ−１^-（Ｇ）であった。神経管様ロゼットにおける細胞は、Ｏｔｘ２に対して陽性であり、ＨｏｘＣ８に対して陰性であった（Ｈ）。青色は、ヘキスト染色した核を示す。バー＝５０μｍ。Neuroectodermal cells induced by FGF2 exhibit a snout phenotype. ES cells differentiated in FGF2 for 10 days showed a small cylindrical shape at the center of the colony and organized into rosette formation. Cylindrical cells in the rosette were positive for Pax6 and negative for Sox1, but the surrounding squamous cells were not (A). By day 14, columnar cells formed neural tube-like rosettes (B) and were positive for both Pax6 (C) and Sox1 (D). Pax6 ⁺ cells (E) in the rosette were also Otx2 ⁺ (F) but En-1 ⁻ (G). Cells in neural tube-like rosettes were positive for Otx2 and negative for HoxC8 (H). Blue indicates a Hoechst stained nucleus. Bar = 50 μm. 神経外胚葉細胞からの運動ニューロンの産生。（Ａ）２週間のＳｏｘ１⁺神経外胚葉細胞の分化（一番上の行）は、成長領域における広範囲にわたるニューロン産生、Ｉｓｌ１の発現を明らかにしたが、ＨＢ９⁺細胞はわずかであることを明らかにした。Ｐａｘ６⁺／Ｓｏｘ１^-神経外胚葉細胞の処理（二番目の行）は、わずかに遊走している細胞を伴う広範囲にわたる神経突起成長、Ｉｓｌ１の発現及び大比率のＨＢ９⁺細胞をもたらした。初期神経外胚葉細胞から分化したＩｓｌ１／２⁺の約５０％はまた、ＨＢ９⁺であった（Ｂ）。ＨＢ９⁺細胞はまた、β_III−チューブリンに対して陽性であった（Ｃ）。クラスターにおける細胞の約２１％は、培養物がレチノイン酸（ＲＡ）及びＳＨＨの両方の存在下で分化された場合にはＨＢ９⁺であったのに対して、ＲＡ単独若しくはＳＨＨ単独で、又はともに存在せずに培養される場合にはわずかなＨＢ９⁺細胞が観察された。青色は、ヘキスト染色した核を示す。バー＝５０μｍ。Production of motor neurons from neuroectodermal cells. (A) 2 weeks of Sox1 ⁺ neuroectodermal cell differentiation (top row) revealed extensive neuronal production in the growth region, Isl1 expression, but few HB9 ⁺ cells I made it. Treatment of Pax6 ⁺ / Sox1 ⁻ neuronal ectoderm cells (second row) resulted in extensive neurite outgrowth with slightly migrating cells, Isl1 expression and a large proportion of HB9 ⁺ cells. Approximately 50% of Isl1 / 2 ⁺ differentiated from early neuroectodermal cells was also HB9 ⁺ (B). HB9 ⁺ cells were also positive for β _III -tubulin (C). Approximately 21% of the cells in the cluster were HB9 ⁺ when the culture was differentiated in the presence of both retinoic acid (RA) and SHH, whereas RA alone or SHH alone or both. A few HB9 ⁺ cells were observed when cultured in the absence. Blue indicates a Hoechst stained nucleus. Bar = 50 μm. 神経外胚葉細胞におけるＲＡ、ＦＧＦ２及びＳＨＨの影響。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＲＡ又は２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を用いて神経誘導培地中で１週間培養された初期ロゼット細胞からの吻側尾側遺伝子の変動を示した。（Ｂ）ＲＡ０．１μＭで１週間処理した初期及び後期神経外胚葉細胞におけるホメオボックス遺伝子発現の比較。ＲＡで処理した後、１２日間分化させた初期神経外胚葉細胞は、Ｏｔｘ２に対して大部分陰性となった（Ｃ）が、ＨｏｘＣ８に対して陽性となった（Ｄ）。ＨｏｘＣ８⁺細胞はすべて、β_III−チューブリン⁺（Ｅ）であった。Ｐａｘ６発現神経外胚葉細胞は、Ｏｌｉｇ２に対して陰性であった（Ｆ）。ＲＡによる１週間の処理及びＳＨＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下での２週間の分化後に、多くの細胞は、Ｏｌｉｇ２を発現した（Ｇ）。後期神経外胚葉細胞をＲＡで処理した後、同培養条件下で分化させた場合、わずかなＯｌｉｇ２⁺細胞が観察された（Ｈ）。青色は、ヘキスト染色した核を示す。バー＝５０μｍ。Effect of RA, FGF2 and SHH on neuroectodermal cells. (A) RT-PCR analysis showed changes in rostral caudal genes from early rosette cells cultured for 1 week in nerve induction medium with RA or 20 ng / ml FGF2. (B) Comparison of homeobox gene expression in early and late neuroectodermal cells treated with RA 0.1 μM for 1 week. Early neuroectodermal cells differentiated for 12 days after treatment with RA were mostly negative for Otx2 (C) but positive for HoxC8 (D). All HoxC8 ⁺ cells, beta _III - was tubulin ⁺ (E). Pax6-expressing neuroectodermal cells were negative for Olig2 (F). After 1 week of treatment with RA and 2 weeks of differentiation in the presence of SHH (100 ng / ml), many cells expressed Olig2 (G). When late neuroectodermal cells were treated with RA and then differentiated under the same culture conditions, few Olig2 ⁺ cells were observed (H). Blue indicates a Hoechst stained nucleus. Bar = 50 μm. 培養における運動ニューロンの成熟。ＣｈＡＴ発現細胞は、クラスターにおいて大部分は局在化され（Ａ）、大きな多極細胞であった（Ｂ）。共焦点画像は、３週間の培養物において、神経細胞体及び突起内のＣｈＡＴ、並びに核におけるＨＢ９の共局在化を示した（Ｃ）。クラスターにおけるほとんどの細胞が、ＶＣｈＡＴを発現した（Ｄ）。多くのＣｈＡＴ⁺細胞はまた、培養における５週間後に神経細胞体及び突起内のシナプシンに対して陽性であった（Ｅ）。（Ｆ）４２ＤＩＶに関して維持されるニューロンにおける電流段階（０．１５ｎＡ）を脱分極させることにより誘起されるＡＰ。静止膜電位（Ｖｍ）−５９ｍＶ（ｆｉ）及び７０ｍＶ（ｆｉｉ）。（Ｇ）４２ＤＩＶに関して維持されるニューロンにおける自発的ＡＰ。Ｖｍ−５０ｍＶ。（Ｈ）対照条件下でＫ−グルコネートベースのピペット溶液を用いた−４０ｍＶでの自発的内向き及び外向きシナプス電流（Ｈｉ）。ビククリン（２０μＭ）及びストリキニーネ（５μＭ）の両方の適用は、外向き電流を阻止した（ＩＰＳＣ、Ｈｉｉ）。ＡＰ−５（４０μＭ）及びＣＮＱＸ（２０μＭ）の続く適用は、残存する内向き電流を阻止した（ＥＰＳＣ、Ｈｉｉｉ）。（ｉ）パネルＨで示される細胞からの平均ｓＩＰＳＣ及びｓＥＰＳＣ。（Ｊ）ビオチン（記録用電極から）及びＣｈＡＴに関する二重免疫染色。青色は、ヘキスト染色した核を示す。バー＝５０μｍ。Motor neuron maturation in culture. ChAT-expressing cells were mostly localized in the cluster (A) and were large multipolar cells (B). Confocal images showed co-localization of ChAT in neuronal cell bodies and processes and HB9 in the nucleus in 3 weeks of culture (C). Most cells in the cluster expressed VChAT (D). Many ChAT ⁺ cells were also positive for synapsin in neuronal cell bodies and processes after 5 weeks in culture (E). (F) AP induced by depolarizing the current stage (0.15 nA) in neurons maintained for 42 DIV. Resting membrane potential (Vm) -59 mV (fi) and 70 mV (fii). (G) Spontaneous AP in neurons maintained for 42DIV. Vm-50 mV. (H) Spontaneous inward and outward synaptic currents (Hi) at −40 mV using a K-gluconate based pipette solution under control conditions. Application of both bicuculline (20 μM) and strychnine (5 μM) blocked outward current (IPSC, Hii). Subsequent application of AP-5 (40 μM) and CNQX (20 μM) blocked the remaining inward current (EPSC, Hiii). (I) Mean sIPSC and sEPSC from cells shown in panel H. (J) Double immunostaining for biotin (from recording electrode) and ChAT. Blue indicates a Hoechst stained nucleus. Bar = 50 μm. ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された運動ニューロンの電気生理学的特性化。（Ａ）４２ＤＩＶに関して維持されるニューロンにおける電流段階（０．１５ｎＡ）を脱分極させることにより誘起されるＡＰ。静止膜電位（Ｖｍ）−５９ｍＶ（ａｉ）及び７０ｍＶ（ａｉｉ）。（Ｂ）４２ＤＩＶに関して維持されるニューロンにおける自発的ＡＰ。Ｖｍ−５０ｍＶ。（Ｃ）対照条件下でＫ−グルコネートベースのピペット溶液を用いた−４０ｍＶでの自発的内向き及び外向きシナプス電流（ｃｉ）。ビククリン（２０μＭ）及びストリキニーネ（５μＭ）の両方の適用は、外向き電流を阻止した（ＩＰＳＣ、ｃｉｉ）。ＡＰ−５（４０μＭ）及びＣＮＱＸ（２０μＭ）の続く適用は、残存する内向き電流を阻止した（ＥＰＳＣ、ｃｉｉｉ）。（Ｄ）パネルｃで示される細胞からの平均ｓＩＰＳＣ及びｓＥＰＳＣ。（Ｅ及びＦ）記録後に、カバーガラスクラスターをＣｈＡＴで免疫染色し、ビオチン充填したニューロンはＣｈＡＴに対して陽性であることを示した。バー＝５０μｍ。Electrophysiological characterization of motor neurons generated in vitro. (A) AP induced by depolarizing the current stage (0.15 nA) in neurons maintained for 42 DIV. Resting membrane potential (Vm) -59 mV (ai) and 70 mV (aii). (B) Spontaneous AP in neurons maintained for 42DIV. Vm-50 mV. (C) Spontaneous inward and outward synaptic currents (ci) at −40 mV using a K-gluconate based pipette solution under control conditions. Application of both bicuculline (20 μM) and strychnine (5 μM) blocked outward current (IPSC, cii). Subsequent application of AP-5 (40 μM) and CNQX (20 μM) blocked the remaining inward current (EPSC, ciii). (D) Mean sIPSC and sEPSC from cells shown in panel c. (E and F) After recording, cover glass clusters were immunostained with ChAT, indicating that biotin-filled neurons were positive for ChAT. Bar = 50 μm.

Claims (24)

胚幹細胞から培養され、初期ロゼット形態を特徴とし、且つＳｏｘ１^-，Ｐａｘ６⁺である細胞の同調性集団を含む細胞の集団を創出する方法であって、以下の：
（ａ）胚幹細胞を胚様体へと増殖させる工程、及び
（ｂ）胚様体を初期ロゼットの形態の神経幹細胞の同調集団へと増殖させる工程（ここで、この増殖は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９又はＦＧＦ４の存在下である）
を含むところの、該細胞の集団を創出する方法。 Cultured from embryonic stem cells, characterized by initial rosette form, and Sox1 ^-, a method of creating a population of cells comprising a tuning population of cells that are Pax6 ^+, the following:
(A) expanding embryonic stem cells into embryoid bodies, and (b) expanding embryoid bodies into a synchronized population of neural stem cells in the form of early rosettes, where the proliferation is FGF2, FGF8, In the presence of FGF9 or FGF4)
A method for creating a population of cells, comprising: 工程（ａ）と初期ロゼットの発生との間の期間が８〜１０日間である、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, wherein the period between step (a) and the occurrence of the initial rosette is 8-10 days. Ｐａｘ６⁺／Ｓｏｘ１^-細胞の前記集団は、総細胞集団の少なくとも７０％である、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the population of Pax6 ⁺ / Sox1 ⁻ cells is at least 70% of the total cell population. 胚様体が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９又はＦＧＦ４の存在下で、４〜６日間培養される、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the embryoid body is cultured for 4 to 6 days in the presence of FGF2, FGF8, FGF9 or FGF4. 前記成長因子がＦＧＦ−２である、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, wherein the growth factor is FGF-2. 請求項１に記載の方法により産生される細胞の集団。   A population of cells produced by the method of claim 1. 神経管様ロゼット形態を特徴とし、且つＰａｘ６⁺／Ｓｏｘ１⁺である同調神経幹細胞の集団を創出する方法であって、初期ロゼット形態を特徴とし、且つＳｏｘ１^-，Ｐａｘ６⁺である細胞を、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８又はＲＡの存在下で４〜６日間培養する工程を含むところの、該細胞の集団を創出する方法。 A method of creating a population of synchronized neural stem cells characterized by a neural tube-like rosette morphology and being Pax6 ⁺ / Sox1 ⁺ , characterized by an initial rosette morphology and characterized by Sox1 ⁻ , Pax6 ⁺ FGF2, A method of creating a population of cells comprising the step of culturing for 4-6 days in the presence of FGF4, FGF8 or RA. 前記接触が４〜６日間である請求項７に記載の方法。   The method according to claim 7, wherein the contact is for 4 to 6 days. 請求項８に記載の方法により創出される細胞の集団。   A population of cells created by the method of claim 8. 前記細胞は、ＦＧＦ８を用いて培養され、ＥＮ１⁺である、請求項９に記載の細胞。 10. The cell of claim 9, wherein the cell is cultured with FGF8 and is EN1 ⁺ . 前記細胞は、ＦＧＦ２を用いて培養され、Ｂｆ１⁺である、請求項９に記載の細胞。 10. The cell of claim 9, wherein the cell is cultured with FGF2 and is Bf1 ⁺ . 前記細胞は、ＲＡを用いて培養され、Ｈｏｘ⁺である、請求項９に記載の細胞。 10. The cell according to claim 9, wherein the cell is cultured with RA and is Hox ⁺ . 請求項１０に記載の細胞をＦＧＦ８の存在中にＳＨＨへ培養する工程を含む、中脳ドーパミンニューロンの集団を創出する方法であって、得られた細胞は、ＴＨ、ＡＡＤＣ、ＥＮ−１、ＶＭＡＴ２及びＤＡＴを発現するが、ＤｂＨ及びＰＮＭＴを発現せず、前記細胞は、ドーパミンを生産するところの、該ニューロンの集団を創出する方法。   A method for creating a population of midbrain dopamine neurons comprising the step of culturing the cells of claim 10 into SHH in the presence of FGF8, wherein the resulting cells are TH, AADC, EN-1, VMAT2 And DAT, but not DbH and PNMT, wherein the cells produce dopamine, creating a population of the neurons. ＳＨＨへの前記接触が６〜７日間である、請求項１３に記載の方法。   14. The method of claim 13, wherein the contact with SHH is 6-7 days. 請求項１３に記載の方法により創出される細胞の集団。   A population of cells created by the method of claim 13. ＳＨＨを用いて請求項１２に記載の細胞を培養する工程を含む、脊髄運動ニューロンの集団を単離する方法であって、得られた細胞は、ＨＢ９、ＨｏｘＢ１、ＨｏｘＢ６、ＨｏｘＣ５、ＨｏｘＣ８、ＣｈＡＴ及びＶＡＣｈＴを発現し、且つアセチルコリンを生産するところの、該ニューロンの集団を単離する方法。   A method for isolating a population of spinal motor neurons, comprising culturing the cells of claim 12 with SHH, wherein the obtained cells are HB9, HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8, ChAT and A method of isolating a population of neurons that expresses VAChT and produces acetylcholine. 前記細胞は、６〜７日間、ＳＨＨへ接触させる、請求項１６に記載の方法。   17. The method of claim 16, wherein the cells are contacted with SHH for 6-7 days. 請求項１６に記載の方法により創出される細胞の集団。   A population of cells created by the method of claim 16. ＳＨＨを用いて請求項１１に記載の細胞を培養する工程を含む、前脳ドーパミンニューロンの集団を創出する方法であって、得られた細胞は、ＴＨ、ＡＡＤＣ、Ｂｆ１、Ｏｔｘ２を発現するが、ＤＢＨ及びＰＮＭＴを発現せず、前記細胞は、ドーパミンを生産するところの、該ニューロンの集団を創出する方法。   A method for creating a population of forebrain dopamine neurons comprising the step of culturing the cell of claim 11 using SHH, wherein the resulting cell expresses TH, AADC, Bf1, Otx2, A method of creating a population of neurons that do not express DBH and PNMT, and wherein the cells produce dopamine. 前記細胞は、６〜７日間、ＳＨＨへ接触させる、請求項１９に記載の方法。   20. The method of claim 19, wherein the cells are contacted with SHH for 6-7 days. 請求項１９に記載の方法により創出される細胞の集団。   A population of cells created by the method of claim 19. 神経細胞発生を攪乱させる能力に関して試験化合物を検査する方法であって、前記試験化合物を請求項１５に記載の細胞へ接触させる工程と前記試験化合物に接触していない細胞の対照集団を比較して接触の結果を検査する工程を含むところの、該試験化合物を検査する方法。   A method for testing a test compound for its ability to disrupt neuronal development, comprising contacting the test compound with a cell according to claim 15 and a control population of cells not in contact with the test compound. A method for inspecting the test compound, comprising the step of inspecting the result of contact. 神経細胞発達を攪乱させる能力に関して試験化合物を検査する方法であって、前記試験化合物を請求項１８に記載の細胞へ接触させる工程と前記試験化合物に接触していない細胞の対照集団を比較して接触の結果を検査する工程を含むところの、該試験化合物を検査する方法。   A method for testing a test compound for its ability to perturb neuronal cell development, comprising contacting the test compound with a cell according to claim 18 and a control population of cells not in contact with the test compound. A method for inspecting the test compound, comprising the step of inspecting the result of contact. 神経細胞発達を攪乱させる能力に関して試験化合物を検査する方法であって、前記試験化合物を請求項２１に記載の細胞へ接触させる工程と前記試験化合物に接触していない細胞の対照集団を比較して接触の結果を検査する工程を含むところの、該試験化合物を検査する方法。
22. A method of testing a test compound for its ability to disrupt neuronal development, comprising contacting the test compound with a cell according to claim 21 and a control population of cells not in contact with the test compound. A method for inspecting the test compound, comprising the step of inspecting the result of contact.

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