KR20060114091A - An antimicrobial composition comprising lycopene having antimicrobial activity - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 스태필로코쿠스 아우레우스에 대한 라이코펜의 항생활성을 가시화하여 나타낸 도이며,1 is a diagram visualizing the antibiosis of lycopene to Staphylococcus aureus,
도 2는 캔디다 알비칸스에 대한 라이코펜의 항생활성을 가시화하여 나타낸 도이며,Figure 2 is a diagram showing the visualization of the lycopene antibiosis against Candida albicans,
도 3은 라이코펜의 스태필로코쿠스 아우레우스에 대한 살균활성을 나타낸 도로서 ○는 프로피온산을, ●은 라이코펜을 처리한 것을 나타내며,Figure 3 is a diagram showing the bactericidal activity of lycopene to Staphylococcus aureus, ○ is treated with propionic acid, and ● is treated with lycopene,
도 4는 라이코펜의 캔디다 알비칸스에 대한 살균활성을 나타낸 도로서 ○는 암포테리신 B를, ●는 라이코펜을 처리한 것을 나타내며,Figure 4 is a diagram showing the bactericidal activity of lycopene against Candida albicans, ○ indicates that treated with amphotericin B, ● indicates lycopene,
도 5는 캔디다 알비칸스의 동종이형에 대하여 라이코펜이 미치는 영향을 나타낸 도이며,5 is a diagram showing the effect of lycopene on the allotype of Candida albicans,
도 6a 및 도 6b는 캔디다 알비칸스의 세포주기에 라이코펜이 미치는 영향을 히스토그램(도 6a) 및 막대그래프(도 6b)로 나타낸 도이며,Figures 6a and 6b is a diagram showing the effect of lycopene on the cell cycle of Candida albicans in histogram (Fig. 6a) and bar graph (Fig. 6b),
도 7은 라이코펜이 세포막에 미치는 영햐을 나타낸 도이다.Figure 7 shows the effect of lycopene on the cell membrane.
본 발명은 항균 또는 항진균 활성을 갖는 라이코펜(lycopene)을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an antimicrobial composition containing lycopene having an antibacterial or antifungal activity as an active ingredient.
일반적으로 병원성 미생물에 의한 직접 혹은 간접적인 피해는 경제, 환경, 의학적으로 많은 문제를 야기 시키고 있다. 식품 산업에서의 식품 유통 과정중의 부패로 인한 손실, 농산업에서의 농작물에 대한 과량의 화학 살충제의 사용으로 인한 인체의 유해성 및 환경오염, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성 균주의 출연 등 사회 전반에서 많은 문제들을 야기 시키고 있다. 이런 현실에서 식물 등에서 분리된 천연 생리 활성 물질들은 병원성 세균, 진균 등의 넓은 범위에서 항생활성을 나타내지만, 환경 친화적으로 사용 할 수 있다는 점에서 새로운 대체 물질로서의 개발이 시급한 실정이다.In general, direct or indirect damage caused by pathogenic microorganisms causes many economic, environmental and medical problems. Loss due to corruption during the food distribution process in the food industry, the harmful effects of humans and environmental pollution from the use of excessive chemical pesticides on crops in the agricultural industry, and the appearance of antibiotic resistant strains due to the misuse of antibiotics. It is causing problems. In this reality, natural bioactive substances isolated from plants exhibit antimicrobial properties in a wide range of pathogenic bacteria, fungi, etc., but development of new alternatives is urgent in that they can be used environmentally.
라이코펜은 토마토 및 토마토로 만든 식품에서 대표적인 카로티노이드 물질로서 강력한 항산화제로 알려져 있으며(Di Mascio P. et al., Arch. Biochem. Biophys., 274, p532-538, 1989), 유방암, 전립선 암, 폐암 등의 질병을 억제한다고 보고 되어 졌다(Giovannucci E. et al., J. Natl. Canc. Inst., 91, p317-331, 1999). 또한 라이코펜의 섭취가 심근 경색의 위험을 줄여 주는 것으로 보고되어져 있다(Kohlmeier L. et al., Am. J. Epodemiol., 146, p618-626, 1997).Lycopene is a representative carotenoid substance in tomato and tomato foods (Di Mascio P. et al., Arch. Biochem. Biophys., 274 , p532-538, 1989), breast cancer, prostate cancer, lung cancer, etc. Has been reported to inhibit disease (Giovannucci E. et al., J. Natl. Canc. Inst., 91 , p317-331, 1999). It has also been reported that ingestion of lycopene reduces the risk of myocardial infarction (Kohlmeier L. et al., Am. J. Epodemiol., 146 , p618-626, 1997).
그러나 상기 문헌 어디에도 라이코펜의 항균 또는 항진균 활성에 대한 어떠한 교시나 개시가 없는 바, 이에 본 발명자들은 라이코펜의 인체에 감염되는 병원성 세균 및 진균에 대한 항균 및 항진균 활성을 확인함으로서 본 발명을 완성하였 다.However, there is no teaching or disclosure about the antimicrobial or antifungal activity of lycopene anywhere in the literature, and thus the present inventors have completed the present invention by confirming the antimicrobial and antifungal activity of lycopene against pathogenic bacteria and fungi infecting the human body.
본 발명의 목적은 항균 또는 항진균 활성을 갖는 라이코펜(lycopene)을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물에 관한 것이다.An object of the present invention relates to an antimicrobial composition containing lycopene having an antibacterial or antifungal activity as an active ingredient.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항균 또는 항진균 활성을 갖는 라이코펜(lycopene)을 유효성분으로 함유하여 병원성 세균 또는 진균에 대한 항균용 조성물을 제공하는 것이다.In order to achieve the above object, the present invention is to provide an antimicrobial composition against pathogenic bacteria or fungi containing lycopene having an antimicrobial or antifungal activity as an active ingredient.
상기 병원성 세균은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균 O-157(Escherichia coli O-157) 등을 포함하며, 상기 병원성 진균은 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포른 베이겔라이(Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 마라세지아 펄펄(Malassezia furfur) 등을 포함한다.The pathogenic bacteria include Staphylococcus aureus , Escherichia coli O-157 , etc., and the pathogenic fungi are Candida albicans , Tricospor Beigelai. ( Trichosporon beigelii ), Saccharomyces cerevisiae , Malassezia furfur , and the like.
또한 본 발명은 상기 항균 또는 항진균 활성을 갖는 라이코펜을 유효성분으로 함유하여 식품 보존용 첨가제 또는 화장품 첨가제 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention contains a lycopene having the antibacterial or antifungal activity as an active ingredient to provide an additive or cosmetic additive composition for food preservation.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 항균 또는 항진균 활성을 갖는 라이코펜(lycopene)을 유효성분으로 함유하여 병원성 세균 또는 진균에 대한 항균용 조성물을 제공하는 것이다.The present invention is to provide an antimicrobial composition against pathogenic bacteria or fungi by containing lycopene having an antibacterial or antifungal activity as an active ingredient.
본 발명의 하기 화학식 1의 구조를 갖는 라이코펜은 토마토 또는 토마토로 제조된 식품에서 분리되거나 당업계의 통상적인 방법에 의하여 합성하거나 일반 시 중에서 구입하여 사용할 수 있다.Lycopene having a structure of formula (1) of the present invention can be separated from a tomato or a food made of tomato, synthesized by a conventional method in the art, or can be purchased and used in a general city.
상기 화학식 1의 라이코펜은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균 O-157(Escherichia coli O-157) 등의 병원성 세균 또는 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포른 베이겔라이(Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 마라세지아 펄펄(Malassezia furfur) 등의 병원성 진균에 대하여 생육저해활성을 갖고, 균사체 형성을 저지하며, 세포막에 영향을 미쳐 세포막의 생체기능상실을 유도하며 또한 세포주기를 S기에서 정지시킴으로서 세포분열을 억제함으로서 살균작용을 나타낸다. 또한, 본 발명의 라이코펜은 세포독성이 적어 인체에 무해하기에 이를 이용하여 다양한 항균용 조성물을 제조할 수 있다.Lycopene of Formula 1 is a pathogenic bacterium such as Staphylococcus aureus , Escherichia coli O-157 or Candida albicans , Trichosporon beigelii ), Saccharomyces cerevisiae , Malassezia furfur , etc., have growth inhibitory activity against pathogenic fungi, inhibit mycelial formation, and affect cell membranes It exhibits bactericidal activity by inducing loss and by inhibiting cell division by stopping the cell cycle at S phase. In addition, lycopene of the present invention can be prepared for a variety of antimicrobial composition using less cytotoxicity to harm to the human body.
또한 본 발명은 상기 항균 또는 항진균 활성을 갖는 라이코펜을 유효성분으로 함유하여 식품 보존용 첨가제 또는 화장품 첨가제 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention contains a lycopene having the antibacterial or antifungal activity as an active ingredient to provide an additive or cosmetic additive composition for food preservation.
본 발명은 상기 항균 또는 항진균 활성을 갖는 라이코펜을 유효성분으로 함유하여 식품 보존용 첨가제로 이용하여 식품을 장기간 보존할 수 있으며, 또한 상기 항균 또는 항진균 활성을 갖는 라이코펜을 유효성분으로 함유하여 화장품 첨가제로 이용하여 손 또는 발의 청결유지를 위한 화장료 조성물 제조에 이용할 수 있 다.The present invention can contain the lycopene having an antimicrobial or antifungal activity as an active ingredient to preserve food for a long time by using as an additive for food preservation, and also contains a lycopene having the antibacterial or antifungal activity as an active ingredient as a cosmetic additive It can be used to prepare a cosmetic composition for keeping hands or feet clean.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 의하여 한정되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following Examples and Experimental Examples. However, the following Examples and Experimental Examples are only examples of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
실시예 1. 라이코펜과 실험용 균주의 준비Example 1 Preparation of Lycopene and Experimental Strains
라이코펜(ψ, ψ-carotene)의 항균 또는 항진균 활성을 입증하기 위하여 시그마 알드리치 코리아사로부터 구입하여 하기 실험에 이용하기 까지 -20 ℃에서 보관하고, 멸균된 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해하여 하기의 실험에 이용하였다. 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균 O-157(Escherichia coli O-157), 트리코스포른 베이겔라이(Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 마라세지아 펄펄(Malassezia furfur)는 한국생명공학연구원의 한국유전자원은행(KCTC)으로부터, 캔디다 알비칸스(Candida albicans)는 일본 오사카의 아카데믹 서사이어티즈(Academic Societies)로부터 분양받아 본 실험에 이용하였다.To demonstrate the antimicrobial or antifungal activity of lycopene (ψ, ψ-carotene), it was purchased from Sigma Aldrich Korea and stored at -20 ° C until used in the following experiment, dissolved in sterile DMSO (dimethyl sulfoxide) Used for. Staphylococcus aureus , Escherichia coli O-157 , Trichosporon beigelii , Saccharomyces cerevisiae , Marasegia Perl ( Malassezia furfur ) was purchased from the Korea Institute of Bioscience and Technology (KCTC) and Candida albicans from Academic Societies in Osaka, Japan.
실험예 1. 라이코펜의 병원성 미생물에 대한 생육저지활성실험Experimental Example 1. Growth inhibitory activity of lycopene against pathogenic microorganisms
라이코펜의 항균활성을 측정하기 위하여, 병원성 세균인 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157)을 LB 완전 배지(트립톤(Tryptone) 1 %, NaCl 1 %, 효모 추출액 0.5 %)로 1×106 세포/1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 라이코펜의 용액을 라이코펜의 용액을 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 ㎍의 양으로 처리했다. 상기 라이코펜을 처리한 후, 37 ℃ 배양기에서 6시간 동안 진탕배양을 하면서 ELISA 판독기(reader)를 이용하여 620 nm의 파장 하에서 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였다. In order to determine the antimicrobial activity of lycopene, pathogenic bacteria Staphylococcus aureus , Escherichia coli 0-157 were added to LB complete medium (Tryptone 1%, NaCl 1 %, Yeast extract 0.5%), and diluted to 1 × 10 6 cells / 1 mL of the number of cells, the aliquots of 100 μL in a 96-well plate, the solution of lycopene in 20, 10, 5, 2.5 , 1.25, 0.625 μg. After treatment with the lycopene, while shaking culture for 6 hours in a 37 ℃ incubator using an ELISA reader (reader) by measuring the absorbance at a wavelength of 620 nm to determine the minimum growth inhibition concentration (MIC).
또한, 라이코펜의 항진균 활성을 측정하기 위하여, 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이(Trichosporon beigel- ii), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 마라세지아 펄펄(Malassezia furfur)를 YPD 완전 배지(포도당 2%, 펩톤 1%, 효모 추출액 0.5%, pH 5,5)에 배양하여, YPD 액체 배지로 2×103 세포/1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 라이코펜의 용액을 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 ㎍의 양으로 처리했다. 상기 라이코펜을 처리한 후, 28 ℃ 배양기에서 24시간 동안 진탕 배양한 후, MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-dip- henyl-2H-tetrazolium bromide] 용액[5 mg of MTT/mL of PBS (pH 7.4)]을 각각의 웰에 넣고, 37 ℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. MTT에 의하여 생성된 포르마잔(Formazan)들을 용해하기 위해 0.02 N HCl이 포함된 20 % SDS를 20 ㎕를 넣은 후, 37 ℃에서 16시간 반응시켰다. ELISA 판독기(reader)로 570 nm의 파장 하에서의 각 웰의 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였다. 상기 실험의 대 조군으로 식품 보존용 첨가제로 사용되고 있는 프리피온산(Propionic acid)과 항진균제인 암포테리신 B(Amphotericin B)를 처리하여 실험하였다.In addition, to measure the antifungal activity of lycopene, pathogenic fungi Candida albicans , Trichosporon beigel-ii , Saccharomyces cerevisiae , Marasegia Perl ( Malassezia furfur ) was incubated in YPD complete medium (2% glucose, 1% peptone, 0.5% yeast extract, pH 5,5), diluted with 2 × 10 3 cells / 1 mL of bacteria in YPD liquid medium. Dispense 100 μl into a 96-well plate, and then lycopene solution. The amounts were 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 μg. After treatment with the lycopene, shaking culture for 24 hours in an incubator at 28 ℃, MTT [3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-dip-henyl-2H-tetrazolium bromide] solution [ 5 mg of MTT / mL of PBS (pH 7.4)] were added to each well and incubated for 4 hours in a 37 ° C. incubator. To dissolve Formazan produced by MTT, 20 μl of 20% SDS containing 0.02 N HCl was added and reacted at 37 ° C. for 16 hours. The minimum growth inhibition concentration (MIC) was determined by measuring the absorbance of each well under a wavelength of 570 nm with an ELISA reader. As a control of the experiment, the experiment was performed by treating propionic acid, which is used as an additive for food preservation, and amphotericin B, an antifungal agent.
상기 실험 수행의 결과, 하기 표 1에서 보는 바와 같이 라이코펜의 항균 활성은 그람 양성과 음성 균을 포함한 넓은 범위의 병원성 세균에서 항균 활성을 가지고 있으며, 최소 생육 저지 농도(MIC)는 대부분 5 - 10 ㎍으로, 식품 산업에서 식품 보존용 첨가제(방부제)로 사용되어지고 있는 프로피온산보다 뛰어난 항균 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한 라이코펜의 항진균 활성 측정의 결과, 병원성 진균에 대해서 2.5 - 5 ㎍의 최소 생육저지농도를 나타내었는 바, 이는 대조군인 임상에서 사용되어지고 있는 강력한 항진균제인 암포테리신 B와 유사한 항진균 활성으로 라이코펜이 강력한 항진균 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 하기 표 1의 a는 병원성 미생물의 생육이 전혀 안되는 라이코펜의 농도를 나타내며, b는 MIC 농도를 결정하지 않은 것을 의미한다.As a result of the experiment, as shown in Table 1, the antimicrobial activity of lycopene has antimicrobial activity in a wide range of pathogenic bacteria including Gram positive and negative bacteria, and the minimum growth inhibition concentration (MIC) is mostly 5-10 ㎍. As a result, it was confirmed that the food industry exhibited superior antimicrobial activity than propionic acid used as an additive (preservative) for food preservation. As a result of measuring the antifungal activity of lycopene, it showed a minimum growth inhibitory concentration of 2.5-5 ㎍ against pathogenic fungi, which was similar to that of amphotericin B, a potent antifungal agent used in the control clinic. It was found to exhibit potent antifungal activity. Table 1 a shows the concentration of lycopene in which no pathogenic microorganisms are grown, and b means that the MIC concentration is not determined.
실험예 2. 라이코펜의 항균활성의 가시적 관찰Experimental Example 2 Visual Observation of Antimicrobial Activity of Lycopene
항균 활성을 가시화하기 위해 스태필로코쿠스 아우레우스을 LB 액체 배지에서 배양한 후에 세포수를 1×106 세포/1 mL가 되도록 LB 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 100㎕씩 분주 한 후, 라이코펜 용액 10㎍을 처리하고, 37℃ 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 상기 배양을 한 후, LB 고체 배지 페트리 접시에 도말하여 37℃ 배양기에서 배양하여 페트리 접시 사진을 찍었다.To visualize the antimicrobial activity, Staphylococcus aureus was incubated in LB liquid medium, and then diluted with LB medium so that the cell number was 1 × 10 6 cells / 1 mL. After that, 10 μg of lycopene solution was treated and incubated for 6 hours in a 37 ° C. incubator. After the incubation, the plate was plated in an LB solid medium Petri dish and cultured in a 37 ° C. incubator to take a Petri dish photo.
또한, 항진균 활성을 가시화하기 위해 캔디다 알비칸스를 YPD 액체 배지에서 배양한 후에 세포수를 2×103 세포/ 1 mL가 되도록 YPD 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 100㎕씩 분주 한 후, 라이코펜 용액 5㎍을 처리하고, 28℃ 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 상기 배양을 한 후, YPD 고체 배지 페트리 접시에 도말하여 28℃ 배양기에서 배양하여 페트리 접시 사진을 찍었다. 상기 실험의 대조군으로 식품 보존용 첨가제로 사용되고 있는 프리피온산(Propionic acid) 20㎍과 항진균제인 암포테리신 B(Amphotericin B) 2.5㎍을 처리하여 실험하였다.In addition, in order to visualize antifungal activity, Candida albicans was cultured in YPD liquid medium, and then diluted with YPD medium so that the number of cells was 2 × 10 3 cells / 1 mL. Thereafter, 5 μg of lycopene solution was treated and incubated for 18 hours in a 28 ° C. incubator. After incubation, the plate was plated on a YPD solid medium Petri dish and cultured in a 28 ° C. incubator to take a Petri dish. As a control of the experiment, the experiment was performed by treating 20 µg of propionic acid, which is used as an additive for preserving food, and 2.5 µg of amphotericin B, an antifungal agent.
상기 실험 수행의 결과, 도 1 및 도 2 에서 보는 바와 같이 무처리군(도 1의 가)에 비하여 본 발명의 라이코펜 10㎍을 처리한 군(도 1의 나)에서는 20㎍의 프리피온산 처리군(도 1의 다)과 거의 유사한 항균 활성을 나타냄을 확인할 수 있었으며(도 1 참조), 또한 항진균 활성(도 2 참조) 역시 무처리군(도 2의 가)에 비하여 본 발명의 라이코펜 5㎍ 처리군(도 2의 나)에서는 2.5㎍ 암포테리신 B 처리군(도 2의 다)과 거의 유사한 항진균 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.As a result of the above experiment, as shown in Fig. 1 and Fig. 2, 20 μg of priponic acid treatment in the group treated with 10 μg of the lycopene of the present invention (b in Fig. 1) as compared to the untreated group (A in Fig. 1). It was confirmed that the antimicrobial activity was almost similar to the group (Fig. 1 C) (see Fig. 1), and also the antifungal activity (see Fig. 2) also 5 ㎍ of lycopene of the present invention compared to the untreated group (A of Fig. 2) In the treatment group (b of FIG. 2), it was confirmed that the antifungal activity was almost similar to that of the 2.5 μg amphotericin B treatment group (c in FIG. 2).
실험예 3. 시간별 라이코펜의 항생활성실험Experimental Example 3. Antibiotics test of lycopene over time
항균 활성의 시간에 따른 측정은 스태필로코쿠스 아우레우스을 LB 배지에서 배양한 후, 세포수를 1× 106 세포/1 mL가 되도록 LB 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 분주하였다. 그 후, 라이코펜의 용액 10㎍을 처리하고 37 ℃에서 배양하면서 일정 시간별로 LB 고체 배지 페트리 접시에 도말하여 37 ℃ 배양기에서 도말한 페트리 접시를 배양하여 형성된 콜로니의 숫자를 확인 하였다. The time-dependent measurement of antimicrobial activity was determined by culturing Staphylococcus aureus in LB medium, diluting the cells in 96-well plates by diluting the cell number to 1 × 10 6 cells / 1 mL. . Thereafter, 10 µg of a solution of lycopene was treated and incubated at 37 ° C., and then plated in a LB solid medium Petri dish at a predetermined time to determine the number of colonies formed by culturing the petri dish smeared at 37 ° C.
항진균 활성의 시간에 따른 측정은 캔디다 알비칸스를 YPD 배지에서 배양한 후, 세포수를 2× 103 세포/ 1 mL가 되도록 YPD 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 분주하였다. 그런 후, 라이코펜의 용액 5㎍을 처리하고 28 ℃에서 배양하면서 일정 시간별로 YPD 고체 배지 페트리 접시에 도말하여 28 ℃ 배양기에서 도말한 페트리 접시를 배양하여 형성된 콜로니의 숫자를 확인하였다. 상기 실험의 대조군으로 식품 보존용 첨가제로 사용되고 있는 프리피온산(Propionic acid) 20㎍과 항진균제인 암포테리신 B(Amphotericin B) 2.5㎍을 처리하여 실험하였다.The time-dependent measurement of antifungal activity was incubated in Candida albicans in YPD medium, and then diluted in a 96-well plate by diluting the cell number to 2 × 10 3 cells / 1 mL. Thereafter, 5 μg of a solution of lycopene was treated and incubated at 28 ° C., and then plated in a YPD solid medium Petri dish at predetermined times to determine the number of colonies formed by culturing the petri dish plated in a 28 ° C. incubator. As a control of the experiment, the experiment was performed by treating 20 µg of propionic acid, which is used as an additive for preserving food, and 2.5 µg of amphotericin B, an antifungal agent.
상기 실험 수행의 결과, 도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이 본 발명의 라이코펜을 처리한 경우 약 150분 경과 후 병원성 세균의 생존의 확인할 수 없었으며(도 3 참조), 또한 병원성 진균에 대하여도 약 9시간 경과 후에 그 생존을 확인할 수 없었는 바 이는 각각 프리피온산과 암포테리신 B와 거의 동일한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.As a result of the above experiment, when the lycopene of the present invention was treated as shown in Figure 3 and 4, the survival of pathogenic bacteria could not be confirmed after about 150 minutes (see Figure 3), and also about the pathogenic fungi After 9 hours, its survival could not be confirmed, which showed almost the same effect as pripionic acid and amphotericin B, respectively.
실험예 4. 동종 이형에 대해 라이코펜이 미치는 영향Experimental Example 4. Effect of lycopene on homomorphic heteromorphism
본 발명의 라이코펜이 캔디다 알비칸스가 체내에 감염되었을 때 병원성을 유발시키는 필수적인 동종 이형(Dimorphic transition)에 대해 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. 캔디다 알비칸스을 YPD 배지에서 배양한 후, 세포수가 2×103세포/1 mL가 되도록 YPD 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 분주하였다. 그 후, 라이코펜의 용액 10, 20㎍을 각각 처리하구 라이코펜 10㎍을 처리한 군에 생체 내 조건을 맞추어 주기 위해 20% 송아지 혈청액(Fetal bovine serum)을 넣어 주고, 체온과 같은 온도인 37 ℃ 배양기에서 배양하면서 균의 형태 변화를 관찰하였다.The following experiment was performed to determine the effect of lycopene of the present invention on essential dimorphic transitions that cause pathogenicity when Candida albicans is infected in the body. Candida albicans was incubated in YPD medium, then diluted with YPD medium so that the cell number was 2 × 10 3 cells / 1 mL and the dilutions were dispensed into 96-well plates. Subsequently, 10% and 20µg of lycopene solutions were treated respectively, and 20% calf serum (Fetal bovine serum) was added to the group treated with 10µg of lycopene to adjust the in vivo conditions. The morphological changes of the bacteria were observed while culturing in the incubator.
상기 실험 수행의 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 대조군인 송아지의 혈청액만을 넣은 경우에는 균사체를 형성하는데 비하여(도 5의 가 참조), 본 발명의 라이코펜10㎍과 송아지 혈청액 처리군(도 5의 나 참조) 및 라이코펜 20㎍ 처리군(도 5의 다 참조)에서는 균사체 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 라이코펜이 생체 내에서 캔디다 알비칸스에 의한 발병을 막을 수 있음이 판명되었다.As a result of performing the experiment, as shown in FIG. 5, when only the serum solution of the calf as a control group was added to form a mycelium (see FIG. 5), the lycopene 10μg and calf serum treatment group of the present invention (FIG. 5) ) And
실험예 5. 라이코펜이 세포주기에 미치는 영향Experimental Example 5. Effect of Lycopene on Cell Cycle
캔디다 알비칸스을 YPD 배지에서 배양한 후, 세포수가 2×105 세포/1 mL가 되도록 YPD 배지로 희석하여 에펜드로프 튜브에 분주한 후, 라이코펜의 용액 50㎍을 넣어주고 28 ℃ 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 상기 배양을 한 후, 세포를 고정시키기 위해 100% 에탄올 용액 1 ml을 첨가하고 4 ℃에서 24시간 배양하였다. 고정된 세포를 pH 7.4 의 인산-염화나트륨 완충액(PBS) 1㎖로 두 번 세척하고, 0.5 ml 인산-염화나트륨 완충액과 함께 RNA 분해 효소(RNAse, 100㎍/ml)를 넣고 1시간동안 37℃ 배양기에서 반응시켰다. 그 후 0.5ml 인산-염화나트륨 완충액과 함께 DNA를 염색하는 물질인 프로피디움 아이오다인(Propidium iodide, 50㎍/ml)를 첨가하고 4 ℃에서 1시간 동안 염색한 후, 프로피디움 아이오다인 염색 정도에 따라 세포 주기를 분석하였다.After cultivating Candida albicans in YPD medium, dilute with YPD medium so that the cell number becomes 2 × 10 5 cells / 1 mL and dispense into eppen rope tube, add 50 μg of lycopene solution and incubate at 28 ° C. Incubated for hours. After incubation, 1 ml of 100% ethanol solution was added to fix the cells and incubated at 4 ° C for 24 hours. The fixed cells were washed twice with 1 ml of pH 7.4 phosphate-sodium chloride buffer (PBS), added with RNA degrading enzyme (RNAse, 100 μg / ml) with 0.5 ml sodium phosphate-chloride buffer and incubator at 37 ° C. for 1 hour. Reacted. Then, Propidium iodide (50 µg / ml), a material for staining DNA with 0.5 ml phosphate-sodium chloride buffer, was added and stained at 4 ° C. for 1 hour, followed by propidium iodide staining. According to the cell cycle was analyzed.
상기 실험 수행의 결과, 도 6a 및 도 6b에서 보는 바와 같이 라이코펜에 의해 세포 주기가 G2/M 단계에서 주기가 멈춰짐을 확인하였는 바, 이로써 라이코펜의 항생 활성이 병원성 미생물의 세포 주기를 저해함으로써 항생 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 6a의 ㄱ 및 도 6b의 ■는 무처리군이며, 도 6a의 ㄴ 및 도 6b의 □는 50㎍의 라이코펜 처리군이다).As a result of the experiment, it was confirmed that the cell cycle is stopped at the G2 / M stage by lycopene, as shown in FIGS. 6a and 6b, whereby the antibiotic activity of lycopene inhibits the cell cycle of pathogenic microorganisms. (A in FIG. 6a and 6b in FIG. 6a is an untreated group, and □ in FIG. 6a and b in FIG. 6b is a 50 µg lycopene treatment group).
실험예 6. 라이코펜이 세포막에 미치는 영향Experimental Example 6. Effect of Lycopene on Cell Membrane
캔디다 알비칸스을 YPD 배지에서 배양한 후, 세포수가 2×105 세포/1 mL가 되도록 YPD 배지로 희석하여 에펜드로프 튜브에 분주한 후, 라이코펜의 용액 80㎍을 첨가하고 28℃ 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 그 후, pH 7.4의 인산-염화나트륨 완충액(PBS) 1㎖로 두 번 세척하고, 1 ml 인산-염화나트륨 완충액과 함께 세포막이 기능을 상실하고 탈분극 되었을 때, 세포막을 통과하여 세포 내부에 축적되는 물질인 bis-(1,3-Dibutylbarbituric acid)- Trimeyhine Oxonol (BOX, 50㎍/ml)을 첨가하고 1시간 동안 4 ℃에서 염색하였다. BOX의 염색 정도에 따라 세포막의 변화를 측정하였다.After cultivating Candida albicans in YPD medium, dilute with YPD medium so that the cell number becomes 2 × 10 5 cells / 1 mL and dispense into eppen rope tubes, add 80 μg of lycopene solution and incubate at 28 ° C. Incubated for hours. After washing twice with 1 ml of pH 7.4 phosphate-sodium chloride buffer (PBS) and with 1 ml phosphate-sodium chloride buffer, when the cell membrane loses function and is depolarized, it is a substance that accumulates inside the cell through the cell membrane. bis- (1,3-Dibutylbarbituric acid)-Trimeyhine Oxonol (BOX, 50µg / ml) was added and stained at 4 ° C for 1 hour. The change in cell membrane was measured according to the degree of staining of the BOX.
상기 실험 수행의 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 라이코펜에 의해 세포막의 생체 기능이 상실되었음을 확인 할 수 있었는 바, 이로써 라이코펜의 항생 활성이 병원성 미생물의 세포막에 피해를 줌으로써 항생 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.As a result of the experiment, as shown in Figure 7, it was confirmed that the biofilm function of the cell membrane was lost by lycopene, whereby it can be confirmed that the antibiotic activity of lycopene shows the antibiotic activity by damaging the cell membrane of pathogenic microorganisms. there was.
실험예 7. 세포독성실험Experimental Example 7. Cytotoxicity Test
라이코펜의 인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성을 하기의 방법으로 측정하였다. 적혈구 세포(Human erythrocytes)를 pH 7.4의 인산-염화나트륨 완충액(PBS)로 세 번 세척한 후, 인산-염화나트륨 완충액으로 희석하여, 8.0 %의 적혈구 세포 용액을 제조하였다. 그 후, 8.0 % 적혈구 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후에 라이코펜의 용액을 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 ㎍의 양으로 혼합하였다. 모든 웰 에 총액의 양이 200㎕가 되도록 생리 식염수(Saline 0.85 % NaCl)을 넣어주고, 37 ℃ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 원심 분리기에서 1000 rpm의 회전 속도로 10분간 원심 분리하여 상등액을 옆 웰로 옮겼다. 적혈구 세포에 대한 파괴능은 ELISA 판독기(reader)로 414 nm의 파장 하에서의 흡광도를 측정하여 파괴능을 분석하였다. 그리고 대조군으로 0.1 % 트리톤 X-100으로 처리하였을 경우의 값을 100 % 파괴능으로 계산하였으며, 적혈구 세포만을 넣은 경우를 0 % 파괴능으로 계산하였다. 라이코펜의 파괴능은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였다.Cytotoxicity of lycopene to human red blood cells was measured by the following method. Erythrocytes (Human erythrocytes) were washed three times with pH 7.4 phosphate-sodium chloride buffer (PBS) and then diluted with phosphate-sodium chloride buffer to prepare 8.0% erythrocyte cell solutions. Thereafter, 100 μl of the 8.0% erythrocyte cell solution was dispensed into 96-well plates, and then the solution of lycopene was mixed in amounts of 10, 5, 2.5, 1.25, and 0.625 μg. The saline solution (Saline 0.85% NaCl) was added to all the wells so that the total amount was 200 μl, and the cells were incubated for 1 hour in a 37 ° C. incubator. After incubation, the supernatant was transferred to the side wells by centrifugation for 10 minutes at a rotational speed of 1000 rpm in a centrifuge. Destructive capacity for erythrocytes was analyzed by measuring the absorbance under a wavelength of 414 nm with an ELISA reader. And when treated with 0.1% Triton X-100 as a control, the value was calculated as 100% destructive capacity, and only the red blood cells were counted as 0% destructive capacity. The breaking ability of lycopene was calculated by the following equation.
상기 실험 수행의 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 라이코펜은 고농도에서 약한 세포 독성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 그에 비해 임상에서 항진균제로 사용되어지는 암포테리신 B은 낮은 농도에서도 세포 독성이 매우 높게 나타났고, 식품 산업에서 사용되어지는 프로피온산은 세포 독성을 나타내지 않음을 확인 할 수 있었다. 따라서, 본 발명에서 발견된 라이코펜는 과다한 양을 사용하지 않은 범위 내에서 인간의 신체에 피해 없이 인간에 대해 사용이 가능하리라 판단되어졌다.As a result of the experiment, as shown in Table 2, the lycopene of the present invention was confirmed to exhibit weak cytotoxicity at high concentrations. In comparison, amphotericin B, which is used as an antifungal agent in the clinic, showed high cytotoxicity even at low concentrations, and propionic acid used in the food industry did not exhibit cytotoxicity. Therefore, it was determined that lycopene found in the present invention can be used in humans without damaging the human body within the range of not using excessive amounts.
상술한 바와 같이, 본 발명은 항균 또는 항진균 활성을 갖는 라이코펜 (lycopene)을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 라이코펜은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균 O-157(Escherichia coli O-157) 등의 병원성 세균 또는 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포른 베이겔라이(Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 마라세지아 펄펄(Malassezia furfur) 등의 병원성 진균에 대하여 생육저해활성을 가지며, 살균작용, 균사체 형성의 저해, 병원성 진균의 세포막의 생체기능을 상실시키는 활성을 가지며, 또한 현저히 감소된 세포독성으로 인하여 인체에 안전하게 사용할 수 있어 본 발명의 라이코펜을 함유하는 항생제, 식품 보존용 첨가제 또는 화장품 첨가제 조성물로 유용하게 이용가능하다.As described above, the present invention relates to an antimicrobial composition containing lycopene having an antibacterial or antifungal activity as an active ingredient, wherein the lycopene of the present invention is Staphylococcus aureus , E. coli O Pathogenic bacteria, such as Escherichia coli O-157 , or Candida albicans , Trichosporon beigelii , Saccharomyces cerevisiae , Marasegia pearl pearl Malassezia furfur ) has growth inhibitory activity against pathogenic fungi, bactericidal activity, inhibition of mycelial formation, loss of biological function of cell membranes of pathogenic fungi, and remarkably reduced cytotoxicity. Useful as an antibiotic, food preservative additive or cosmetic additive composition containing the lycopene of the present invention It is applicable.
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