KR20060107501A - Specific human antibodies - Google Patents

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티크바 보겔
다니엘 플라크신
투비아 페레츠
보아즈 아미트
레나 쿠퍼만
요체베드 하가이
에스테르 스잔톤
야리브 칸피
라첼 벤-레비
탈리 스즈라베르
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바이오-테크널러지 제너럴 (이스라엘) 리미티드
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Abstract

The present invention provides antibodies that bind an epitope of PSGL-1 comprising the motif D-X-Y-D, wherein X represents any amino acid or the covalent linkage between D and Y, and Y is sulfated, which antibody can be complexed with one or more copies of an agent. The antibodies of the invention can be used in a method of inducing antibody-dependent cell cytotoxicity and/or stimulating natural killer (NK) cells or T cells. In addition, by administering these antibodies to a patient in need thereof, a method of inducing cell death is provided. A method of preventing infection by a virus (e.g., HIV) by administering to a patient in need thereof an antibody of the present invention is also provided. The present invention also provides a method of introducing an agent into a cell that expresses sulfated PSGL-1 by coupling or complexing an agent to an antibody of the present invention and administering the complex to the cell. Finally, the present invention provides methods of diagnosis, prognosis and staging using the present antibodies.

Description

특이적인 인간 항체{SPECIFIC HUMAN ANTIBODIES}Specific human antibody {SPECIFIC HUMAN ANTIBODIES}

본 발명은 암 세포, 전이 세포, 백혈병 세포, 백혈구 및 혈소판 등의 세포 상에 존재하고, 세포 회전, 전이, 염증 및 자가면역 질환과 같은 다양한 생리학적 현상에서 중요한 역할을 하는 특정 에피토프에 결합하는 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이 항체는 항암 활성, 항전이 활성, 항백혈병 활성, 항바이러스 활성, 항감염 활성 및/또는 염증성 질환, 자가면역 질환, 바이러스 감염, 심혈관 질환(예, 심근경색), 망막병증 질환 및 황산화된 티로신 의존성 단백질-단백질 상호작용에 의해 유발되는 질환과 같은 기타 질환에 대한 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 체내의 특정 세포 또는 부위로 치료제를 유도하는 표적화 물질로서 사용될 수 있다.The present invention resides on cells such as cancer cells, metastatic cells, leukemia cells, leukocytes and platelets, and binds to specific epitopes that play an important role in various physiological phenomena such as cell turnover, metastasis, inflammation and autoimmune diseases. It is about. More specifically, the antibody has anti-cancer activity, anti-metastatic activity, anti-leukemia activity, antiviral activity, anti-infective activity and / or inflammatory disease, autoimmune disease, viral infection, cardiovascular disease (eg myocardial infarction), retinopathy disease And other diseases such as those caused by sulfated tyrosine dependent protein-protein interactions. In addition, the antibodies of the present invention can be used as targeting agents to induce therapeutic agents to specific cells or sites in the body.

백혈병, 림프종 및 흑색종은 골수 및 림프계 조직에서 유래되며 제어되지 않는 세포 성장과 관련이 있는 암이다. 급성 림프성 백혈병(ALL)은 특수한 임상적 및 면역학적 특성에 의해 정의되는 불균일한 질환이다. 다른 형태의 ALL과 마찬가지로, 대부분의 사례의 B 세포 ALL(B-ALL)의 명확한 원인은 알려져 있지 않으며, 다만, 많은 경우, 이 질환은 단일 세포의 DNA의 후천적인 유전적 변경으로부터 발생하여 비정상적이고 연속적인 증식을 유발한다. B-ALL에 걸린 환자에 대한 예후는 소아 및 성인 모두에서 다른 백혈병 환자보다 훨씬 더 나쁘다. 만성 림프성 백혈병(CLL) (이 중 한 예는 B 세포 CLL(B-CLL)임)은 진행이 서서히 일어나는 형태의 백혈병이며, 림프구의 수가 증가하는 것이 특징이다. 급성 골수성 백혈병(AML)은 정상적인 상태에서 골수 세포계(적혈구, 과립구, 단핵구 및 혈소판)의 최종 분화된 세포를 발생시키는 선조 세포를 갖는 불균질한 신생물의 집단이다. 다른 형태의 신생물에서와 마찬가지로, AML은 정상적으로 분화된 골수 세포를 비교적 미분화된 아세포로 치환시키는 결과를 초래하여 한 유형 이상의 조기 골수 세포 분화를 나타내는 후천적인 유전적 변경과 연관되어 있다. AML은 일반적으로 골수에서 진화하며, 2차 조혈 기관에서는 더 적은 정도로 진화한다. AML은 주로 성인에게 발병하며 15∼40세에 발병률이 최고조에 달하지만, 어린이와 노인에게도 발병하는 것으로 알려져 있다. 거의 모든 AML 환자는 임상적 완화를 얻기 위해 진단 후 바로 치료를 받아야 하며, 이 때, 순환하는 미분화 아세포의 비정상적 수준에 대한 증거는 없다.Leukemia, lymphoma and melanoma are cancers that are derived from bone marrow and lymphatic tissue and are associated with uncontrolled cell growth. Acute lymphocytic leukemia (ALL) is a heterogeneous disease defined by specific clinical and immunological characteristics. As with other forms of ALL, the clear cause of most cases of B cell ALL (B-ALL) is unknown, but in many cases, the disease results from acquired genetic alteration of single cell DNA and is abnormal. Causes continuous proliferation. The prognosis for patients with B-ALL is much worse than other leukemia patients in both children and adults. Chronic lymphocytic leukemia (CLL), one example of which is B-cell CLL (B-CLL), is a form of leukemia that progresses slowly and is characterized by an increased number of lymphocytes. Acute myeloid leukemia (AML) is a group of heterogeneous neoplasms with progenitor cells that give rise to the final differentiated cells of the bone marrow cell line (red blood cells, granulocytes, monocytes and platelets) under normal conditions. As with other forms of neoplasia, AML is associated with acquired genetic alterations that result in the replacement of normally differentiated bone marrow cells with relatively undifferentiated blast cells, indicating one or more types of early bone marrow cell differentiation. AML generally evolves in the bone marrow and to a lesser extent in secondary hematopoietic organs. AML occurs mainly in adults and peaks at 15 to 40 years of age, but is also known to occur in children and the elderly. Almost all AML patients should be treated immediately after diagnosis to obtain clinical remission, with no evidence of abnormal levels of circulating undifferentiated blast cells.

분리된 scFv 항체 분자에 대한 리간드Ligands for Isolated scFv Antibody Molecules

혈소판, 피브리노겐, GPIb, 셀렉틴 및 PSGL-1(P-셀렉틴 당단백질 리간드-1)은 각각 몇 가지 병원성 상태 또는 질환 상태, 예컨대 비정상적 또는 병원성 염증, 비정상적 또는 병원성 면역 반응, 자가면역 반응, 전이, 비정상적 또는 병원성 유착, 혈전증 및/또는 재발협착증 및 비정상적 또는 병원성 응집에 있어 중요한 역할을 한다. 따라서, 혈소판 및 상기한 분자에 결합하거나 이와 교차반응하는 항체는 그와 같은 병원성 상태와 관련된 질환 및 장애의 진단 및 치료에 유용할 것이다.Platelets, fibrinogen, GPIb, selectin, and PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1) each have several pathogenic conditions or disease states, such as abnormal or pathogenic inflammation, abnormal or pathogenic immune response, autoimmune response, metastasis, abnormal Or plays an important role in pathogenic adhesions, thrombosis and / or restenosis and abnormal or pathogenic aggregation. Thus, antibodies that bind to or cross-react with platelets and the aforementioned molecules will be useful in the diagnosis and treatment of diseases and disorders associated with such pathogenic conditions.

혈소판Platelets

혈소판은 혈액계의 잘 규명된 성분으로서, 지혈, 혈전증 및/또는 재발협착증에서 몇 가지 중요한 역할을 한다. 혈관에 대한 손상은, 일련의 순차적인 사건을 특징으로 하는 지혈이라고 알려진 과정이 작동되게 한다. 손상된 혈관에 대한 최초의 반응은 혈관 내면 상의 손상된 영역에 혈소판을 부착시키는 것이다. 다음 단계는 이미 부착된 혈소판에 다수의 혈소판 층을 응집시켜 지혈 플러그를 형성하고 혈관을 밀폐시키는 것이다. 지혈 플러그는 피브린 중합체의 침착에 의해 더욱 강화된다. 응혈 또는 플러그는 손상이 수복되는 경우에만 분해된다.Platelets are well-defined components of the blood system and play several important roles in hemostasis, thrombosis and / or restenosis. Damage to blood vessels causes a process known as hemostasis to be characterized, which is characterized by a series of sequential events. The first response to damaged blood vessels is to attach platelets to damaged areas on the inner surface of the blood vessels. The next step is to agglomerate multiple platelet layers onto already attached platelets to form hemostatic plugs and seal off blood vessels. Hemostatic plugs are further strengthened by the deposition of fibrin polymers. A clot or plug will disintegrate only if the damage is repaired.

순환하는 혈소판은 거핵구의 주변으로부터 방출되는 세포질 입자이다. 혈소판은 지혈에 있어서 중요한 역할을 한다. 혈관이 손상되면, 혈소판은 손상된 조직 표면에 들러 붙어 서로 부착한다(유착). 이러한 일련의 사건은 급속히 발생하여 혈관 손상 부위에 무정형의 덩어리(일반적으로 혈소판 플러그 또는 혈전이라 부름)를 형성한다. 응집이라고도 불리는 유착 현상은 다양한 물질 또는 작용제, 예컨대 콜라겐, 아데노신-디포스페이트(ADP), 에피네프린, 세로토닌 및 리스토세틴에 의해 시험관내에서 개시될 수 있다. 응집은 혈소판 기능의 한 척도로서 수행되는 다양한 시험관내 테스트 중 하나이다.Circulating platelets are cytoplasmic particles released from the periphery of megakaryocytes. Platelets play an important role in hemostasis. When blood vessels are damaged, platelets stick to the damaged tissue surface and adhere to each other (adhesion). This series of events occurs rapidly, forming amorphous masses (commonly called platelet plugs or thrombi) at the site of blood vessel damage. Adhesion, also called aggregation, can be initiated in vitro by various substances or agents, such as collagen, adenosine-diphosphate (ADP), epinephrine, serotonin and ristocetin. Aggregation is one of a variety of in vitro tests performed as a measure of platelet function.

전이에 있어서 혈소판의 중요성The Importance of Platelets in Metastasis

종양 전이는 아마도 암 환자의 생존을 제한하는 가장 중요한 인자일 것이다. 축적된 데이터에 의하면 종양 세포가 숙주 혈소판과 상호작용할 수 있는 능력은 전이의 필수불가결한 결정 인자 중 하나이다(Oleksowicz, Thrombosis Res. 79: 261-74 (1995)). 전이성 암 세포가 혈류에 진입할 경우, 종양 세포를 코팅하는 혈소판 및 백혈구로 이루어진 다세포 복합체가 형성된다. 이러한 복합체는 미소색전이라 칭하기도 하며, 이는 종양 세포가 면역계를 침입하는 것을 보조한다. 혈소판에 의한 종양 세포의 코팅은 혈소판에 의한 P-셀렉틴의 발현을 필요로 한다.Tumor metastasis is perhaps the most important factor limiting the survival of cancer patients. Accumulated data show that the ability of tumor cells to interact with host platelets is one of the indispensable determinants of metastasis (Oleksowicz, Thrombosis Res. 79: 261-74 (1995)). When metastatic cancer cells enter the bloodstream, a multicellular complex consisting of platelets and leukocytes that coat the tumor cells is formed. This complex is also called microembolism, which helps tumor cells invade the immune system. Coating of tumor cells by platelets requires expression of P-selectin by platelets.

종양 세포가 혈소판을 응집시키는 능력은 종양 세포의 전이 잠재력과 상관성이 있음이 입증되었으며, 종양 유도 혈소판 응집의 억제가 설치류 모델에서 전이의 억제와 상관성이 있는 것으로 나타났다. 혈소판과의 종양 세포 상호작용은 막 유착 분자 및 작용제 분비를 수반하는 것으로 입증되었다. 면역 관련 혈소판 당단백질의 발현은 종양 세포주에서 확인된 바 있다. 혈소판 면역 관련 당단백질인 GPIb, GPIIb/IIIa, GPIb/IX 및 인테그린 αv 서브유닛은 유방 종양 세포주의 표면에서 발현되는 것으로 입증되었다(Oleksowicz, (1995), supra; Kamiyama et al., J. Lab. Clin. Med. 117 (3): 209-17 (1991)).The ability of tumor cells to aggregate platelets has been demonstrated to correlate with the metastatic potential of tumor cells, and inhibition of tumor induced platelet aggregation has been shown to correlate with inhibition of metastasis in rodent models. Tumor cell interactions with platelets have been demonstrated to involve membrane adhesion molecules and agent secretion. Expression of immune related platelet glycoproteins has been identified in tumor cell lines. Platelet immune related glycoproteins GPIb, GPIIb / IIIa, GPIb / IX and integrin α v subunits have been demonstrated to be expressed on the surface of breast tumor cell lines (Oleksowicz, (1995), supra; Kamiyama et al., J. Lab. Clin.Med. 117 (3): 209-17 (1991)).

Gasic 등의 문헌[PNAS 61: 46-52 (1968)]은 항체 유도 혈소판 감소증이 CT26 결장 선암, 루이스 폐암 및 B16 흑색종에 의해 생산되는 전이의 수 및 용적을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다(Karpatkin et al., J. Clin. Invest. 81(4): 1012-19 (1988); Clezardin et al., Cancer Res. 53(19): 4695-700 (1993)). 뿐만 아니라, GPIb와 밀접한 관련이 있고 불완전하게 또는 비정상적으로 O-글리코실화된 GPIbα 서브유닛에 상응하는 단일 폴리펩티드 사슬(60 kd)이 HEL 세포의 표면 막 상에서 발현되는 것으로 확인되었다(Kieffer et al., J. Biol. Chem. 261 (34): 15854-62 (1986)). Gasic et al. (PNAS 61: 46-52 (1968)) have shown that antibody induced thrombocytopenia significantly reduces the number and volume of metastases produced by CT26 colon adenocarcinoma, Lewis lung cancer and B16 melanoma (Karpatkin et al. J. Clin. Invest. 81 (4): 1012-19 (1988); Clezardin et al., Cancer Res. 53 (19): 4695-700 (1993)). In addition, a single polypeptide chain (60 kd), which is closely related to GPIb and corresponding to incompletely or abnormally O-glycosylated GPIbα subunits, was found to be expressed on the surface membrane of HEL cells (Kieffer et al., J. Biol. Chem. 261 (34): 15854-62 (1986)).

GPIb 복합체GPIb Complex

지혈 과정의 각 단계는 혈소판 표면 상의 수용체의 존재를 요한다. 지혈에 있어서 중요한 한 수용체는 당단백질 Ib-IX 복합체(CD42로도 알려짐)이다. 이 수용체는 내피하층의 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 결합함으로써 손상 부위의 혈관벽에 대한 혈소판의 유착(최초 부착)을 매개한다. 이것은 또한 지혈에 있어 중요한 다른 두 가지 혈소판 기능에 있어서 중요한 역할을 한다: (a) 동맥 협착 부위의 고전단에 의해 유도되는 혈소판의 응집 및 (b) 저농도의 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 활성화.Each step of the hemostatic process requires the presence of receptors on the platelet surface. One important receptor for hemostasis is the glycoprotein Ib-IX complex (also known as CD42). This receptor mediates adhesion (first adhesion) of platelets to the vessel wall at the site of injury by binding to von Willebrand factor (vWF) in the subdermal layer. It also plays an important role in two other platelet functions important for hemostasis: (a) platelet aggregation induced by high shear at the arterial stenosis and (b) platelet activation induced by low levels of thrombin.

GPIb-IX 복합체는 혈소판 원형질막의 외면의 주요 성분 중 하나이다. 이 복합체는 막에 걸친 3개의 폴리펩티드 - GPIb의 이황화 결합된 130 kDa α-사슬 및 25 kDa β-사슬 및 비공유 결합된 GPIX(22 kDa)를 포함한다. 이들 서브유닛 모두는 혈소판 막 상에 CD42 복합체의 효율적인 세포 표면 발현 및 기능을 위해 등몰량으로 존재하는데, 이는 3개의 서브유닛의 복합체로의 적절한 조립이 원형질막 상에서의 완전한 발현에 필요하다는 것을 나타낸다. GPIb의 α-사슬은 3개의 상이한 구조적 도메인으로 구성된다: (1) 루신이 풍부한 반복 서열 및 Cys 결합의 측접 서열을 포함하는 구형의 N-말단 펩티드 도메인; (2) 고도로 글리코실화된 뮤신 유사 대형당펩티드 도메인; 및 (3) GPIbα에 대한 이황화 가교 및 경막 및 세포질 서열을 포함하는 막에 회합된 C-말단 영역.The GPIb-IX complex is one of the main components of the outer surface of the platelet plasma membrane. This complex comprises three polypeptides across the membrane—disulfide-linked 130 kDa α-chain and 25 kDa β-chain and non-covalently bound GPIX (22 kDa) of GPIb. All of these subunits are present in equimolar amounts for efficient cell surface expression and function of the CD42 complex on the platelet membrane, indicating that proper assembly of the three subunits into the complex is necessary for complete expression on the plasma membrane. The α-chain of GPIb consists of three different structural domains: (1) a spherical N-terminal peptide domain comprising a leucine-rich repeat sequence and a flanking sequence of Cys bonds; (2) highly glycosylated mucin-like large glycopeptide domains; And (3) a disulfide bridge to GPIbα and a C-terminal region associated with the membrane comprising the dura and cytoplasmic sequences.

몇 가지 증거는, vWF 및 GPIb-IX 복합체의 트롬빈 결합 도메인이 GPIbα의 아미노 말단에서 약 300 아미노산을 포함하는 구형 영역 내에 존재한다는 것을 나타낸다. 인간 혈소판 GPIb-IX 복합체는 혈소판 기능 및 반응성 둘 다를 매개하는 주요 막 수용체이기 때문에, GPIb에 의한 내피하층에 결합된 vWF의 인식은 혈소판이 손상된 혈관에 부착할 수 있게 한다. 게다가, GPIbα에 대한 vWF의 결합은 또한 혈소판 활성화를 유도하고, 이는 세포골격 또는 포스포리파제 A2와 GPIb-IX의 세포질 도메인의 상호작용을 연루시킬 수 있다. 게다가, GPIbα는 α-트롬빈에 대한 고친화성의 결합 부위를 포함하는데, 이는 아직 충분히 정의되지 않은 메카니즘에 의해 혈소판 활성화를 촉진한다.Some evidence indicates that the thrombin binding domains of the vWF and GPIb-IX complexes are in a spherical region comprising about 300 amino acids at the amino terminus of GPIbα. Since human platelet GPIb-IX complexes are the major membrane receptors that mediate both platelet function and reactivity, recognition of vWF bound to the endothelial layer by GPIb allows platelets to attach to damaged blood vessels. In addition, binding of vWF to GPIbα also induces platelet activation, which may implicate the cytoskeleton or the interaction of phospholipase A2 with the cytoplasmic domain of GPIb-IX. In addition, GPIbα contains a high affinity binding site for α-thrombin, which promotes platelet activation by a mechanism that is not yet fully defined.

GPIbα의 N-말단 구형 도메인은 음전하 아미노산의 클러스터를 포함한다. 몇 가지 증거는 GPIb-IX 복합체를 발현하는 형질감염된 CHO 세포 및 혈소판 GPIbα에서, 이 도메인에 포함된 3개의 티로신 잔기(Tyr-276, Tyr-278 및 Tyr-279)가 황산화된다는 것을 암시한다.The N-terminal spherical domain of GPIbα comprises a cluster of negatively charged amino acids. Some evidence suggests that in transfected CHO cells and platelet GPIbα expressing the GPIb-IX complex, the three tyrosine residues (Tyr-276, Tyr-278 and Tyr-279) included in this domain are sulfated.

단백질 황산화Protein Sulfation

단백질 황산화는 당 측쇄 또는 폴리펩티드 골격에 대한 설페이트의 효소적 공유 결합을 수반하는 일반적인 번역후 변형이다. 이 변형은 트랜스-골지 구획에서 발생한다. 황산화된 단백질은 분비성 단백질, 과립을 위해 표적화된 단백질 및 원형질막 단백질의 세포외 영역을 포함한다. 티로신은 현재 황산화되는 것으로 알려진 아미노산 잔기이다(Kehoe et al., Chem. Biol. 7: R57-61 (2000)). 다른 아미노산, 예를 들어 트레오닌 역시, 특히 질병 세포에서 황산화될 수 있다.Protein sulfate is a common post-translational modification involving the enzymatic covalent linkage of sulfate to sugar side chains or polypeptide backbone. This modification occurs in the trans-Golgi compartment. Sulfated proteins include extracellular regions of secretory proteins, proteins targeted for granules and plasma membrane proteins. Tyrosine is an amino acid residue currently known to be sulfated (Kehoe et al., Chem. Biol. 7: R57-61 (2000)). Other amino acids, such as threonine, can also be sulfated, particularly in diseased cells.

다수의 단백질이 티로신 황산화되는 것으로 확인되었으나, GPIb에서 발견되는 것과 같은 단일 폴리펩티드 내의 3개 이상의 황산화된 티로신의 존재는 일반적인 것이 아니다. GPIbα(CD42)는 혈소판 및 거핵구에 의해 발현되며, vWF와의 결합 을 통해 내피하층에 대한 혈소판의 부착 및 내피하층 상에서의 회전을 매개하며, 이는 또한 그 N-말단 도메인에 다수의 음전하를 포함한다. 그와 같은 높은 산성 및 친수성 환경은 황산화의 전제 조건인 것으로 생각되는데, 왜냐하면 티로실단백질 설포트랜스퍼라제는 산성 아미노산 잔기에 인접한 티로신을 특이적으로 인식하여 황산화시키기 때문이다(Bundgaard et al., J. Biol. Chem. 272: 21700-05 (1997)). GPIbα의 산성 부위의 완전한 황산화는 두드러진 음전하 밀도를 갖는 부위 - 19 아미노산 스트레치 내의 13 음전하 - 를 산출하며, 다른 단백질과의 정전기적 상호작용을 위한 후보 부위가 된다.While many proteins have been found to be tyrosine sulfated, the presence of three or more sulfated tyrosines in a single polypeptide as found in GPIb is not common. GPIbα (CD42) is expressed by platelets and megakaryocytes and mediates platelet adhesion to the endothelial layer and rotation on the subdermal layer through binding to vWF, which also includes a large number of negative charges in its N-terminal domain. Such high acidic and hydrophilic environments are thought to be preconditions for sulfated, because tyrosylprotein sulfotransferase specifically recognizes and sulfates tyrosine adjacent to acidic amino acid residues (Bundgaard et al., J. Biol. Chem. 272: 21700-05 (1997). Complete sulfation of the acidic sites of GPIbα yields sites with prominent negative charge densities-13 negative charges within 19 amino acid stretches-and are candidate sites for electrostatic interaction with other proteins.

또한, 황산화된 N-말단 티로신은, 인간 및 원숭이 면역결핍증 바이러스(HIV-1, HIV-2 및 SIV)의 표적 세포로의 진입을 위해 관련된 7개의 경막 세그먼트(7TMS) 수용체와의 공수용체(co-receptor)로서 작용하는 CC-케모카인 수용체, 예컨대 CCR5의 역할에 영향을 주는 것으로 생각된다. 예를 들어, 황산화된 N-말단 티로신은 CCR5의 MIP-1α, MIP-1β 및 HIV-1 gp120/CD4 복합체에 대한 결합에 기여하고, HIV-1이 CCR5 및 CD4를 발현하는 세포로 진입할 수 있는 능력에 기여하는 것으로 생각된다. 또 다른 중요한 HIV-1 공수용체인 CXCR4 역시 황산화된다(Farzan et al., Cell 96 (5): 667-76 (1999)). 티로신 황산화는 CCR-5 의존적 진입보다 CXCR4 의존적 HIV-1 진입에 있어서 덜 중요한 역할을 한다. 이로써, CXC-케모카인 패밀리 내의 티로신 황산화를 위한 가능한 역할을 입증하며, CCR5 및 CXCR4의 HIV-1 이용률에 있어서의 일반적인 차이를 분명히 보여준다(Farzan et al., J. Biol. Chem. 277 (33): 29,484-89 (2002)).In addition, sulfated N-terminal tyrosine is a co-receptor with seven transmembrane segment (7TMS) receptors involved for entry of human and monkey immunodeficiency virus (HIV-1, HIV-2 and SIV) into target cells. It is thought to influence the role of CC-chemokine receptors, such as CCR5, which act as co-receptors. For example, sulfated N-terminal tyrosine contributes to the binding of CCR5 to the MIP-1α, MIP-1β and HIV-1 gp120 / CD4 complexes, and HIV-1 enters cells expressing CCR5 and CD4. It is thought to contribute to the ability to do so. Another important HIV-1 co-receptor, CXCR4, is also sulfated (Farzan et al., Cell 96 (5): 667-76 (1999)). Tyrosine sulfate plays a less important role in CXCR4-dependent HIV-1 entry than CCR-5 dependent entry. This demonstrates a possible role for tyrosine sulfate in the CXC-chemokine family and clearly shows a general difference in HIV-1 utilization of CCR5 and CXCR4 (Farzan et al., J. Biol. Chem. 277 (33)). : 29,484-89 (2002)).

셀렉틴 및 PSGL-1Selectin and PSGL-1

P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴은 다른 기능 중에서도 특히 혈관 내피 상에서의 백혈구의 회전을 매개하는 유착 분자 패밀리의 구성원이다. P-셀렉틴은 혈소판 내에서 과립으로서 저장되며, 트롬빈, 히스타민, 포볼 에스테르, 또는 기타 자극성 분자에 의해 활성화된 후 표면으로 수송된다. P-셀렉틴은 활성화된 내피 세포상에서도 발현된다. E-셀렉틴은 내피 세포 상에서 발현되며, L-셀렉틴은 호중구, 단핵구, T 세포 및 B 세포 상에서 발현된다.P-selectin, E-selectin and L-selectin are members of a family of adhesion molecules that mediate the rotation of leukocytes on the vascular endothelium, among other functions. P-selectin is stored as granules in platelets and transported to the surface after being activated by thrombin, histamine, pobol esters, or other stimulatory molecules. P-selectin is also expressed on activated endothelial cells. E-selectin is expressed on endothelial cells and L-selectin is expressed on neutrophils, monocytes, T cells and B cells.

PSGL-1(CD162로도 불림)은 GPIb와 구조적 유사성을 공유하는 P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴에 대한 뮤신 당단백질 리간드이다(Afshar-Kharghan et al. (2001), supra). PSGL-1은 PACE(Paired Basic Amino Acid Converting Enzymes; 쌍을 이루는 염기성 아미노산 전환 효소) 절단 부위를 갖는 이황화 결합 동형이량체이다. PSGL-1은 또한 3개의 잠재적인 티로신 황산화 부위, 이에 이어 프롤린, 세린 및 트레오닌이 많은 10∼16개의 10량체 반복 서열을 보유한다. PSGL-1의 세포외 부분은 N-결합 글리코실화 부위를 포함하며, 다수의 살리실화, 푸코실화된 O-결합 올리고당 분지를 포함한다(Moore et al., J. Biol. Chem. 118: 445-56 (1992)). N-글리칸 부위의 대부분과 O-글리칸 부위의 다수를 점유한다. 인간 HL-60 세포로부터의 PSGL-1의 O-글리칸의 구조는 결정되었다. 이러한 O-글리칸의 부분집합은 셀렉틴에 대한 결합에 요구되는 살리실화 및 푸코실화된 구조인 코어-2이다. PSGL-1의 아미노 말단 영역의 티로신 황산화 역시 P-셀렉틴 및 L-셀렉틴에 대한 결합에 요구된다. 또한, 아마도 번역후에 절단되는 것으로 생각되는 N-말단 프로펩티드도 존재한 다.PSGL-1 (also called CD162) is a mucin glycoprotein ligand for P-selectin, E-selectin and L-selectin that share structural similarity with GPIb (Afshar-Kharghan et al. (2001), supra). PSGL-1 is a disulfide-linked homodimer with PACE (Paired Basic Amino Acid Converting Enzymes) pairing site. PSGL-1 also has 10 to 16 derivatized repeat sequences that are high in three potential tyrosine sulfated sites, followed by proline, serine and threonine. The extracellular portion of PSGL-1 contains an N-linked glycosylation site and includes a number of salicylated, fucosylated O-linked oligosaccharide branches (Moore et al., J. Biol. Chem. 118: 445- 56 (1992). Occupies most of the N-glycan site and many of the O-glycan sites. The structure of the O-glycans of PSGL-1 from human HL-60 cells was determined. This subset of O-glycans is Core-2, a salicylated and fucosylated structure required for binding to selectin. Tyrosine sulfate of the amino terminal region of PSGL-1 is also required for binding to P-selectin and L-selectin. In addition, there are also N-terminal propeptide that are thought to be cleaved post-translationally.

PSGL-1은 HL60 세포 내에 361개의 잔기를 보유하는데, 267개 잔기의 세포외 영역, 25개 잔기의 경막 영역 및 69개 잔기의 세포내 영역을 포함하며, 세포 표면 상에 이황화 결합된 동형이량체 또는 이형이량체를 형성한다(Afshar-Kharghan et al., Blood 97: 3306-12 (2001)). PSGL-1을 코딩하는 서열은 단일 엑손 내에 존재하여 선택적 스플라이싱이 불가능해야 한다. 그러나, HL60 세포 및 대부분의 세포주 내의 PSGL-1은 세포외 영역에 존재하는 10 잔기의 공통 서열로 이루어진 15개의 연속 반복 서열을 가지며, 다만, 다형핵 백혈구, 단핵구, 및 대부분의 천연 백혈구를 포함하는 기타 몇 종의 세포주에서는 이러한 서열의 14개 및 16개의 반복 서열이 존재한다.PSGL-1 has 361 residues in HL60 cells, including an extracellular region of 267 residues, a transmembrane region of 25 residues and an intracellular region of 69 residues, disulfide-linked homodimer on the cell surface Or to form heterodimers (Afshar-Kharghan et al., Blood 97: 3306-12 (2001)). The sequence encoding the PSGL-1 should be present in a single exon to prevent selective splicing. However, PSGL-1 in HL60 cells and most cell lines has 15 contiguous repeat sequences consisting of consensus sequences of 10 residues present in the extracellular region, including polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and most natural leukocytes. In some other cell lines there are 14 and 16 repeat sequences of this sequence.

PSGL-1은 호중구 상에서 겉보기 분자량이 250 kDa 및 160 kDa인 이량체로서 발현되는 반면, HL60 상에서는 이량체 형태가 약 220 kDa이다. 환원 조건 하에 분석하였을 때, 각 서브유닛은 반으로 감소된다. 분자량의 차이는 상이한 수의 10량체 반복 서열의 존재에 의해 유발되는 분자 내의 다형성에 의한 것일 수 있다(Leukocyte Typing VI. Edited by T. Kishimoto et al. (1997)).PSGL-1 is expressed as dimers with apparent molecular weights of 250 kDa and 160 kDa on neutrophils, while the dimeric form is about 220 kDa on HL60. When analyzed under reducing conditions, each subunit is reduced in half. The difference in molecular weight may be due to polymorphism in the molecule caused by the presence of a different number of 10-mer repeat sequences (Leukocyte Typing VI. Edited by T. Kishimoto et al. (1997)).

대부분의 혈액 백혈구, 예컨대 호중구, 단핵구, 백혈구, B 세포의 부분집단 및 모든 T 세포는 PSGL-1을 발현한다(Kishimoto et al. (1997), supra). PSGL-1은 활성화된 내피, 활성화된 혈소판, 기타 백혈구 및 염증성 부위에서 백혈구의 회전을 매개하며, P-셀렉틴 상에서의 호중구의 회전을 매개한다. PSGL-1은 또한 L-셀렉틴과의 결합에 의해 호중구-호중구 상호작용을 매개함으로써 염증을 매개할 수 있 다(Snapp et al., Blood 91(1): 154-64 (1998)).Most blood leukocytes such as neutrophils, monocytes, leukocytes, subsets of B cells and all T cells express PSGL-1 (Kishimoto et al. (1997), supra). PSGL-1 mediates the rotation of white blood cells in activated endothelial, activated platelets, other white blood cells and inflammatory sites, and mediates the rotation of neutrophils on P-selectin. PSGL-1 can also mediate inflammation by mediating neutrophil-neutrophil interactions by binding to L-selectin (Snapp et al., Blood 91 (1): 154-64 (1998)).

백혈구 회전은 염증에 있어서 중요하며, P-셀렉틴(활성화된 내피 및 혈소판 상에서 발현됨, 이는 손상 부위에서 고정화될 수 있음)과 PSGL-1 간의 상호작용은 혈관 벽 상에서의 백혈구의 고정 및 회전에 도움이 된다(Ramachandran et al., PNAS 98 (18): 10166-71 (2001); Afshar-Kharghan et al. (2001), supra). 세포 회전은 전이에 있어서도 중요하며, 내피 세포 상에서의 P-셀렉틴과 E-셀렉틴은 전이 세포에 결합함으로써 혈류로부터 주변 조직으로의 분출을 촉진하는 것으로 생각된다.Leukocyte rotation is important for inflammation, and the interaction between P-selectin (expressed on activated endothelial and platelets, which can be immobilized at the site of injury) and PSGL-1 aids in the fixation and rotation of leukocytes on the vessel wall (Ramachandran et al., PNAS 98 (18): 10166-71 (2001); Afshar-Kharghan et al. (2001), supra). Cell rotation is also important in metastasis, and P-selectin and E-selectin on endothelial cells are thought to promote release from the bloodstream into surrounding tissue by binding to metastatic cells.

따라서, PSGL-1은 모든 백혈구: 호중구, 단핵구, 림프구, 활성화된 말초 T 세포, 과립구, 호산구, 혈소판 상에서 발견되었으며, 몇몇 CD34 양성 줄기 세포 및 특정한 B 세포 부분집단 상에서도 확인되었다. P-셀렉틴은 활성화된 혈소판 및 내피 세포 상에서 선택적으로 발현된다. P-셀렉틴과 PSGL-1 간의 상호작용은 혈관 벽 상에서의 백혈구의 회전을 촉진하며, 혈관 부위에서의 비정상적인 백혈구의 축적은 각종 병원성 염증을 초래한다. PSGL-1 상의 개별 티로신 설페이트의 입체 특이적인 기여는 PSGL-1에 대한 P-셀렉틴의 결합에 있어 중요하다. 전하 역시 결합에 있어 중요한데, NaCl을 낮추면(150 mM에서 50 mM로) 결합을 증강시켰다(Kd ∼75 nM). PSGL-1 상의 티로신 황산화는 P-셀렉틴 상의 PSGL-1의 부착을 강화시키지만 이에 궁극적으로 요구되는 것은 아니다. PSGL-1 티로신 황산화는 모든 전단 속도에서 더 느린 회전 부착을 지지하며, 훨씬 더 빠른 전단 속도에서 회전 부착을 지지한다(Rodgers et al., Biophys. J. 81: 2001-09 (2001)). 뿐만 아니라, 혈소판 상에서 의 PSGL-1 발현은 백혈구의 발현보다 25∼100배 더 낮다는 것이 제안되었다(Frenette et al., J. Exp. Med. 191(8): 1413-22 (2000)). Thus, PSGL-1 was found on all leukocytes: neutrophils, monocytes, lymphocytes, activated peripheral T cells, granulocytes, eosinophils, platelets, and was also identified on several CD34 positive stem cells and certain B cell subsets. P-selectin is selectively expressed on activated platelets and endothelial cells. The interaction between P-selectin and PSGL-1 promotes the rotation of leukocytes on the vessel wall, and abnormal accumulation of leukocytes at the vessel site leads to various pathogenic inflammations. The stereospecific contribution of individual tyrosine sulfates on PSGL-1 is important for the binding of P-selectin to PSGL-1. Charge is also important for binding, lowering NaCl (from 150 mM to 50 mM) enhances binding (Kd-75 nM). Tyrosine sulfate on PSGL-1 enhances, but is not ultimately required for, adhesion of PSGL-1 on P-selectin. PSGL-1 tyrosine sulfates support slower rotational attachment at all shear rates and support rotational attachment at much higher shear rates (Rodgers et al., Biophys. J. 81: 2001-09 (2001)). In addition, it was suggested that PSGL-1 expression on platelets is 25-100 times lower than that of leukocytes (Frenette et al., J. Exp. Med. 191 (8): 1413-22 (2000)).

인간 PSGL-1에 대한 시판되는 모노클로날 항체인 KPL1은 PSGL-1과 P-셀렉틴 및 PSGL-1과 L-셀렉틴 간의 상호작용을 억제하는 것으로 나타났다. KPL1 에피토프는 PSGL-1의 티로신 황산화 영역(YEYLDYD) (서열 번호 1)에 맵핑되었다(Snapp et al., Blood 91(1): 154-64 (1998)). KPL1, a commercially available monoclonal antibody against human PSGL-1, has been shown to inhibit the interaction between PSGL-1 and P-selectin and PSGL-1 and L-selectin. KPL1 epitopes were mapped to the tyrosine sulfate region (YEYLDYD) (SEQ ID NO: 1) of PSGL-1 (Snapp et al., Blood 91 (1): 154-64 (1998)).

시알릴화, 푸코실화된 뮤신 리간드를 제거하는 O-시알로글리코프로테아제로 종양 세포를 전처리하는 것 역시 종양 세포-혈소판 복합체 형성을 억제하였다. 시험관내 실험에 의하면 이들 처리 중 어느 것이나 더 많은 단핵구가 순환하는 종양 세포와 회합하도록 하며, 이는 혈소판 결합을 감소시키는 것이 순환하는 종양 세포에 대한 면역 세포의 접근을 증가시킨다는 것을 시사한다(Varki and Varki, Braz. J. Biol. Res. 34(6): 711-17 (2001)).Pretreatment of tumor cells with O-sialglycoprotease to remove sialylated, fucosylated mucin ligands also inhibited tumor cell-platelet complex formation. In vitro experiments have shown that either of these treatments causes more monocytes to associate with circulating tumor cells, suggesting that reducing platelet binding increases immune cell access to circulating tumor cells (Varki and Varki). Braz. J. Biol. Res. 34 (6): 711-17 (2001)).

피브리노겐Fibrinogen

정상적인 인간 피브리노겐은 두 가지 형태 - 정상(γ) 및 γ 프라임이 있으며, 이들 각각은 정상적인 개체에서 발견된다. 보다 풍부한 형태(신체에서 발견되는 총 피브리노겐의 약 90%)인 정상 피브리노겐은 두 개의 동일한 55 kDa α 사슬, 두개의 동일한 95 kDa β 사슬 및 두 개의 동일한 49.5 kDa γ 사슬로 이루어진다. 정상적인 변형 피브리노겐은 보다 덜 풍부한 형태(신체에서 발견되는 피브리노겐의 약 10%)이며, 두 개의 동일한 55 kDa α 사슬, 두 개의 동일한 95 kDa β 사슬, 한 개의 49.5 kDa γ 사슬 및 한 개의 변형 50.5 kDa γ 프라임 사슬로 이루어진다. 감마 및 감마 프라임 사슬은 둘 다, 3' 말단에서 선택적 스플라이싱이 일어나는, 동일한 유전자에 의해 코딩된다. 정상적인 감마 사슬은 아미노산 1-411로 이루어지며, 정상적인 변형 감마 프라임 사슬은 427 아미노산으로 이루어지는데, 이 중에서 아미노산 1-407은 정상 감마 사슬의 것과 동일하고, 아미노산 408-427은 VRPEHPAETEYDSLYPEDDL(서열 번호 2)이다. 이 영역은 정상적으로는 트롬빈 분자에 의해 점유된다.Normal human fibrinogen comes in two forms-normal (γ) and γ prime, each of which is found in normal individuals. Normal fibrinogen, a richer form (about 90% of the total fibrinogen found in the body), consists of two identical 55 kDa α chains, two identical 95 kDa β chains, and two identical 49.5 kDa γ chains. Normally modified fibrinogen is a less abundant form (about 10% of the fibrinogen found in the body), two identical 55 kDa α chains, two identical 95 kDa β chains, one 49.5 kDa γ chain, and one modified 50.5 kDa γ It consists of a prime chain. Both gamma and gamma prime chains are encoded by the same gene, with selective splicing at the 3 'end. The normal gamma chain consists of amino acids 1-411, and the normal modified gamma prime chain consists of 427 amino acids, of which amino acids 1-407 are identical to those of the normal gamma chain, and amino acids 408-427 are VRPEHPAETEYDSLYPEDDL (SEQ ID NO: 2). to be. This region is normally occupied by thrombin molecules.

피브리노겐은 이온화된 칼슘 존재 하에 트롬빈의 작용에 의해 피브린으로 전환되어 혈액의 응고를 유발한다. 피브린은 또한 혈전 및 급성 염증성 삼출액의 한 성분이다.Fibrinogen is converted to fibrin by the action of thrombin in the presence of ionized calcium, causing blood coagulation. Fibrin is also a component of thrombus and acute inflammatory exudates.

따라서, 본 발명의 목적은 황산화된 PSGL-1에 결합하는 다양한 항체 또는 폴리펩티드 및 이의 사용 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide various antibodies or polypeptides that bind to sulfated PSGL-1 and methods of use thereof.

구체적으로, 본 발명의 목적은 본 발명의 항체를 투여함으로써 ADCC를 활성화시키거나 자연 킬러 세포(NK) 또는 T 세포를 자극하는 방법을 제공하는 것이다.Specifically, it is an object of the present invention to provide a method of activating ADCC or stimulating natural killer cells (NK) or T cells by administering an antibody of the invention.

본 발명의 또 다른 특정 목적은 세포사를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.Another specific object of the present invention is to provide a method of inducing cell death.

본 발명의 또 다른 특정 목적은 본원에서 정의되는 바와 같은 항체를, 바이러스 감염의 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, HIV와 같은 바이러스에 의한 감염을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.Another specific object of the present invention is to provide a method of preventing infection by a virus, such as HIV, comprising administering an antibody as defined herein to a patient in need thereof.

본 발명의 또 다른 특정 목적은 황산화된 PSGL-1을 발현하는 세포로 제제를 도입하는 방법으로서, 상기 제제를 본원에서 정의하는 바와 같은 항체에 커플링하거나 또는 이와 복합체를 형성하는 단계 및 항체-제제 쌍 또는 복합체를 제공된 세 포에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하는 것이다.Another specific object of the present invention is a method of introducing an agent into a cell expressing sulfated PSGL-1, coupling the agent to or forming a complex with the antibody as defined herein and antibody- It is to provide a method comprising administering a pair of agents or complexes to a given cell.

마지막으로, 본 발명의 특정 목적은 본 발명의 항체를 사용하는 진단, 예후 판정, 병기 결정 방법을 제공하는 것이다.Finally, it is a specific object of the present invention to provide a method for diagnosis, prognosis, and staging using the antibody of the present invention.

발명의 개요Summary of the Invention

본 발명은 모티프 D-X-Y-D(서열 번호 3)를 포함하는 PSGL-1의 에피토프에 결합하는 항체 또는 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서 X는 임의의 아미노산 또는 D와 Y 간의 공유 결합을 나타내고, Y는 황산화되며, 상기 항체는 항암제, 항백혈병제, 항전이제, 항신생물제, 항질병제, 항유착제, 항혈전제, 항재발협착제, 항자가면역제, 항응집제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택되는 제제의 복수 카피에 커플링되거나 이와 복합체를 형성할 수 있다.The present invention provides an antibody or polypeptide that binds to an epitope of PSGL-1 comprising the motif DXYD (SEQ ID NO: 3), wherein X represents a covalent bond between any amino acid or D and Y, Y is sulfated, The antibody is an anticancer agent, an anti-leukemia agent, an antimetastatic agent, an anti-neoplastic agent, an anti-inflammatory agent, an anti-adhesion agent, an antithrombotic agent, an anti-relapse constriction agent, an anti-immune agent, an anticoagulant, an antibacterial agent, an antiviral agent and an anti-inflammatory It may be coupled to or complexed with multiple copies of an agent selected from the group consisting of.

본 발명의 항체는 항체 의존적 세포독성을 유도하고/하거나 자연 킬러(NK) 세포 또는 T 세포를 자극하는 방법에 이용될 수 있다. 또한, 상기 항체들을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 세포사를 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체를 바이러스 감염의 예방을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 바이러스(예, HIV)에 의한 감염을 예방하는 방법 역시 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체에 제제를 커플링하거나 복합체를 형성하고 항체-제제 쌍 또는 복합체를 세포에 투여함으로써, 황산화된 PSGL-1을 발현하는 세포에 제제를 도입하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 종양 세포 마커를 동정, 분리 및 정제하는 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 본 발명 항체를 사용하는 진단, 예후 판정 및 병기 결정 방법을 제공한다.Antibodies of the invention can be used in methods of inducing antibody dependent cytotoxicity and / or stimulating natural killer (NK) cells or T cells. Also provided are methods of inducing cell death by administering the antibodies to a patient in need thereof. Also provided is a method of preventing infection by a virus (eg HIV) by administering the antibody of the invention to a patient in need thereof. The invention also provides a method of introducing an agent into a cell expressing sulfated PSGL-1 by coupling the agent to or forming a complex with the antibody of the invention and administering the antibody-agent pair or complex to the cell. The invention also provides methods for identifying, isolating and purifying tumor cell markers. Finally, the present invention provides methods for diagnosis, prognosis and staging using the antibodies of the invention.

본 발명은 하기의 첨부되는 도면을 참조하여 상세히 설명될 것이나, 이는 단지 예로서 제시된 것이고 제한하려는 의도는 아니다. The invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings which follow, which are presented by way of example only and are not intended to be limiting.

도 1은 Y1-IgG 친화도 컬럼을 통과하기 전후에 부분적으로 정제된 AML-R1 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 1 shows Western blots of partially purified AML-R1 cell lysates before and after passing through a Y1-IgG affinity column.

도 2는 정제된 단백질의 황산화-티로신 모티프 내의 3개 티로신 중, 티로신 2 및 3이 황산화된 것을 도시한다. FIG. 2 shows that of the three tyrosines in the sulfated-tyrosine motif of purified protein, tyrosine 2 and 3 were sulfated.

도 3은 1차 B-CLL 샘플에서 Y1-IgG(20 ㎍/㎖) 매개된 ADCC(세포독성률(%))를 도시한다.3 depicts Y1-IgG (20 μg / ml) mediated ADCC (% cytotoxicity) in primary B-CLL samples.

도 4는 AML 세포에 대항하는 PMBC에 의한 Y1-IgG-매개된 ADCC(세포독성률(%))를 도시한다.4 depicts Y1-IgG-mediated ADCC (% cytotoxicity) by PMBC against AML cells.

도 5는 Y1-IgG 농도의 함수로서 ML-2 세포 내 증가된 ADCC(세포독성률(%))를 도시한다.5 shows the increased ADCC (% cytotoxicity) in ML-2 cells as a function of Y1-IgG concentration.

도 6은 Y1-IgG와 KPL-1 간의 경쟁 함수로서 ML-2에 대항하는 PMBC에 의한 ADCC(세포독성률(%))를 도시한다. 6 shows ADCC (% cytotoxicity) by PMBC against ML-2 as a competition function between Y1-IgG and KPL-1.

도 7A는 ML2에 대항하는 B-CLL 환자 및 정상 공여체로부터 유래한 자연 킬러 세포에 의한 Y1-IgG-매개된 ADCC(세포독성률(%)) 분석 결과를 도시한다. 도 7B는 M12 표적에 대항하는 ADCC에서의 CD14+ 세포(단핵구)의 연관성을 도시한다. FIG. 7A shows the results of Y1-IgG-mediated ADCC (% cytotoxicity) assay by natural killer cells from B-CLL patients and normal donors against ML2. 7B shows the association of CD14 + cells (monocytes) in ADCC against the M12 target.

도 8은 Y1에 의해 매개되는 NK 세포 상에서의 CD69(조기 활성화 마커)의 발현을 도시한다.8 shows expression of CD69 (early activation marker) on NK cells mediated by Y1.

도 9는 FACS 분석에 의한 B-CLL 환자로부터 유래한 단핵 세포(CD19+, CD5+)에서의 Y1-IgG의 아폽토시스 효과를 도시한다. 9 shows the apoptosis effect of Y1-IgG on mononuclear cells (CD19 +, CD5 +) derived from B-CLL patients by FACS analysis.

도 10은 Y1-IgG 및 리툭시맵에 의해 매개되는 인간 B-CLL 환자로부터 얻은 단핵 세포, 즉 1차 인간 B-CLL 세포(KBC115 및 KBC116 세포)에 대항하는 ADCC 활성(세포독성률(%)) 분석 결과를 도시한다.10 shows ADCC activity (% cytotoxicity) against mononuclear cells, ie primary human B-CLL cells (KBC115 and KBC116 cells), obtained from human B-CLL patients mediated by Y1-IgG and rituximab. ) Shows the analysis results.

도 11은 환자 혈장의 존재 및 부재 하에 Y1-IgG, 리툭시맵 및 캄파스(Campath®)에 의해 매개되는 인간 B-CLL 환자로부터 유래한 단핵 세포 (KBC156, KBC159, KBC160, KBC166 및 RAJI 세포)에 대항하는 CDC 활성(세포용해율(%)) 분석 결과를 도시한다.FIG. 11 shows mononuclear cells derived from human B-CLL patients mediated by Y1-IgG, Rituximab and Campas ® (KBC156, KBC159, KBC160, KBC166 and RAJI cells) with and without patient plasma. The results of analysis of CDC activity (% cytolysis) against.

도 12는 모르폴리노-독소루비신에 결합된 항체의 제조를 위한 반응식을 도시한다.12 shows a scheme for the preparation of antibodies bound to morpholino-doxorubicin.

도 13은 제대혈 및 AML 세포에서의 항체-제제 복합체, 즉 Y1-모르폴리노다노루비신(Y1-M-DNR) 및 Y1-모르폴리노독소루비신(Y1-M-Dox) 복합체의 세포독성을 도시한다. FIG. 13 depicts cytotoxicity of antibody-agent complexes, ie, Y1-morpholinodanorrubicin (Y1-M-DNR) and Y1-morpholinodoxorubicin (Y1-M-Dox) complexes in cord blood and AML cells. .

도 14는 2개의 환자 AML 샘플(M4 및 M5 기) 및 CD34+ 세포에 대항하는 항체-제제 복합체 Y1-M-DNR의 세포독성을 도시한다.FIG. 14 depicts cytotoxicity of antibody-agent complex Y1-M-DNR against two patient AML samples (M4 and M5 phases) and CD34 + cells.

도 15는 B-ALL 세포에서 대조군의 백분율로서 각종 Y1 복합체의 세포독성을 도시한다.Figure 15 depicts cytotoxicity of various Y1 complexes as a percentage of control in B-ALL cells.

도 16A는 KU812 세포에의 Y1 scFv의 결합을 도시하고, 도 16B는 황산염 결핍형 KU812 세포에서의 GPIb의 표면 발현을 도시한다. FIG. 16A shows the binding of Y1 scFv to KU812 cells, and FIG. 16B shows surface expression of GPIb in sulfate deficient KU812 cells.

도 17A는 Y1-scFv의 혈소판에의 결합에 대한 황산화 펩티드 DLYDYYPE의 억제 효과를 도시한다. 도 17B는 Y1-scFv 혈소판 결합 분석에서 치환 돌연변이 펩티드의 효과를 도시한다.17A depicts the inhibitory effect of the sulfated peptide DLYDYYPE on binding of Y1-scFv to platelets. 17B depicts the effect of substitutional mutant peptides in Y1-scFv platelet binding assays.

도 18A는 Y1-scFv의 정제된 글리코칼신에의 결합 억제에 있어서 돌연변이 펩티드의 효과를 도시한다. 도 18B는 CovaLinkTM Plate에 공유 결합된 펩티드에 대한 Y1-scFv의 ELISA에 의한 결합 결과를 도시한다.18A depicts the effect of mutant peptides on inhibition of binding of Y1-scFv to purified glycocalcin. 18B shows the results of binding by ELISA of Y1-scFv to peptides covalently bound to CovaLink ™ Plate.

도 19는 PSGL-1으로부터 유도된 고정되고 황산화된 펩티드에 대한 Y1의 결합을 도시한다.19 shows binding of Y1 to immobilized and sulfated peptides derived from PSGL-1.

도 20은 제1, 제2 및 제3 위치에서 황산화된 PSGL-1 및 비황산화된 PSGL-1에 대한 Y1 결합의 활성률(%)을 도시한다. FIG. 20 shows the percent activity of Y1 binding to sulfated PSGL-1 and unsulphated PSGL-1 in the first, second and third positions.

도 21은 고도로 산성이고 황산화 티로신을 보유하는 잠재적인 Y1 결합 모니티프를 도시한다.FIG. 21 depicts a potential Y1 binding motif that is highly acidic and retains sulfated tyrosine.

도 22는 Y1에 의한 소세포 폐 암종(SCLC) 세포용해물의 인식을 도시한다.22 shows recognition of small cell lung carcinoma (SCLC) cell lysates by Y1.

도 23은 Y1의 1차 AML 세포로의 세포내이입작용(endocytosis)을 도시한다. Figure 23 depicts endocytosis of Y1 into primary AML cells.

도 24는 Y1의 1차 AML 세포로의 세포내이입작용을 도시한다. 24 depicts endocytosis of Y1 into primary AML cells.

도 25는 건강한 CD34+ 줄기 세포에 대한 Y1 결합의 분석 결과를 도시한다.25 depicts the assay results of Y1 binding to healthy CD34 + stem cells.

도 26은 건강한 CD34+ 줄기 세포에 대한 Y1 결합의 분석 결과를 도시한다.26 shows the results of analysis of Y1 binding to healthy CD34 + stem cells.

도 27은 37℃에서 Y1의 1차 AML 세포로의 내면화(internalization)를 도시한다.FIG. 27 depicts internalization of Y1 into primary AML cells at 37 ° C. FIG.

도 28은 산 처리로 막결합 단백질을 제거한 후에 1차 AML 세포에서의 Y1 염 색의 가시화 결과를 도시한다. FIG. 28 shows the results of visualization of Y1 staining in primary AML cells after removal of membrane bound proteins by acid treatment.

도 29는 프로나제 처리로 막결합 단백질을 제거한 후에 1차 AML 세포에서의 Y1 염색의 가시화 결과를 도시한다. 29 shows the results of visualization of Y1 staining in primary AML cells after removal of membrane bound proteins by Pronase treatment.

도 30은 4℃(도 30A) 및 37℃(도 30B)에서 산 처리 또는 수크로스 사전배양 후에 1차 AML 세포에서의 Y1 염색의 가시화 결과를 도시한다. FIG. 30 shows the results of visualization of Y1 staining in primary AML cells after acid treatment or sucrose preculture at 4 ° C. (FIG. 30A) and 37 ° C. (FIG. 30B).

도 31은 Y1-scFv가 활성화된 인간 혈소판의 ML2 세포에의 결합을 효과적으로 억제함을 도시한다. FIG. 31 shows that Y1-scFv effectively inhibits binding of activated human platelets to ML2 cells.

도 32는 저밀도(0.2 ㎍/㎖)로 고정된 rh-P-셀렉틴 상에서 회전하는 ML2 세포에 대한 Y1-scFv(10 ㎍/㎖)의 효과를 도시한다. 32 shows the effect of Y1-scFv (10 μg / ml) on ML2 cells spinning on low density (0.2 μg / ml) fixed rh-P-selectin.

도 33은 고밀도(1.0 ㎍/㎖)로 고정된 rh-P-셀렉틴 상에서 회전하는 ML2 세포에 대한 Y1-scFv(10 ㎍/㎖)의 효과를 도시한다. 33 shows the effect of Y1-scFv (10 μg / ml) on ML2 cells spinning on rh-P-selectin fixed at high density (1.0 μg / ml).

도 34는 각종 전단 응력에서 고정된 rh-P-셀렉틴(1.0 ㎍/㎖)에서 회전하는 ML2 세포에 대한 Y1-scFv(1 ㎍/㎖)의 효과를 도시한다. FIG. 34 shows the effect of Y1-scFv (1 μg / ml) on rotating ML2 cells in fixed rh-P-selectin (1.0 μg / ml) at various shear stresses.

도 35는 고밀도(1.0 ㎍/㎖)로 고정된 rh-P-셀렉틴 상에서 회전하는 인간 호중구에 대한 Y1-scFv의 농도 증가 효과를 도시한다. 35 shows the effect of increasing the concentration of Y1-scFv on human neutrophils rotating on rh-P-selectin fixed at high density (1.0 μg / ml).

도 36은 고밀도(1.0 ㎍/㎖)로 고정된 rh-P-셀렉틴 상에서 회전하는 인간 호중구에 대한 Y1-IgG 효과를 도시한다. 36 shows the effect of Y1-IgG on human neutrophils spinning on rh-P-selectin fixed at high density (1.0 μg / ml).

항체(Ab) 또는 면역글로불린(Ig)은 항원에 결합하는 단백질 분자이다. 자연 발생 항체의 각 기능성 결합 단위는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 4개의 폴리펩티드 사슬(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진다. 각 사슬은 불변 부위 및 가변 부위를 갖는다. 자연 발생 항체는 그 중쇄 성분에 기초하여 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 포함하는 몇 가지 부류로 분류될 수 있다. IgG 부류는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 비롯하여 몇 개의 하위 부류를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 면역글로불린은 B 림프구에 의해 생체내에서 생산되며, 그러한 각 분자는 특정 외부 항원성 결정 인자를 인식하고, 그 항원의 제거를 촉진한다.Antibodies (Ab) or immunoglobulins (Ig) are protein molecules that bind to an antigen. Each functional binding unit of a naturally occurring antibody consists of four polypeptide chains (two heavy chains and two light chains) linked together by disulfide bonds. Each chain has a constant region and a variable region. Naturally occurring antibodies can be classified into several classes, including IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE, based on their heavy chain components. The IgG class includes, but is not limited to, several subclasses, including IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , and IgG 4 . Immunoglobulins are produced in vivo by B lymphocytes, and each such molecule recognizes a specific external antigenic determinant and promotes its clearance.

항체는 항체 복합체를 비롯하여 여러 형태로 생성되어 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체 복합체" 또는 "항체 복합체들"이란 하나 이상의 항체와 다른 항체의 복합체, 또는 하나 이상의 항체와 항체 단편(들)의 복합체, 또는 2 이상의 항체 단편의 복합체를 의미하는 것으로 사용된다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, F(ab')2, Fc 및 Fd 단편을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 항체는 항체 또는 이의 단편의 복합체를 포함한다.Antibodies can be produced and used in many forms, including antibody complexes. As used herein, the term “antibody complex” or “antibody complexes” is used to mean a complex of one or more antibodies and other antibodies, or a complex of one or more antibodies and antibody fragment (s), or a complex of two or more antibody fragments. do. Examples of antibody fragments include Fv, Fab, F (ab ') 2 , Fc and Fd fragments. Thus, an antibody as used herein includes a complex of antibodies or fragments thereof.

본 명세서 및 청구의 범위에서 사용되는 Fv는 같거나 다를 수 있는, 인간 항체의 중쇄의 가변 부위 및 인간 항체의 경쇄의 가변 부위로 이루어진 분자로서, 이때, 중쇄의 가변 부위는 경쇄의 가변 부위에 연결되거나, 결합되거나, 융합되거나 또는 공유 결합되거나, 또는 이와 회합된다. Fv는 단일쇄 Fv(scFv) 또는 이황화 안정화된 Fv(dsFv)일 수 있다. scFv는 가요성 아미노산 폴리펩티드 스페이서 또는 링커에 의해 결합된, 항체의 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인으로 이루어진다. 링커는 분지될 수도 있고 비분지될 수도 있다. 바람직하게는, 링커는 0∼15 아미노산 잔기이며, 가장 바람직하게는 링커는 (Gly4Ser)3이다.As used herein and in the claims, the Fv is a molecule consisting of a variable region of a heavy chain of a human antibody and a variable region of a light chain of a human antibody, which may be the same or different, wherein the variable region of the heavy chain is linked to the variable region of the light chain Or are bonded, fused, fused or covalently associated with, or associated with. The Fv may be single chain Fv (scFv) or disulfide stabilized Fv (dsFv). The scFv consists of the variable domains of each of the heavy and light chains of the antibody, bound by a flexible amino acid polypeptide spacer or linker. The linker may be branched or unbranched. Preferably, the linker is 0-15 amino acid residues and most preferably the linker is (Gly 4 Ser) 3 .

Fv 분자 자체는 제1 사슬 및 제2 사슬로 이루어지며, 각 사슬은 제1, 제2 및 제3의 초가변 부위를 갖는다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 내의 초가변 루프는 상보성 결정 부위(CDR)라 칭한다. 중쇄 및 경쇄 각각에는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 부위가 존재한다. 이들 부위는 항원 결합 부위를 형성하는 것으로 생각되며, 강화된 결합 활성을 나타내도록 특이적으로 변형될 수 있다. 이들 부위 중 자연적으로 가장 가변성이 큰 부위는 중쇄의 CDR3 부위이다. CDR3 부위는 Ig 분자의 가장 노출된 부위인 것으로 이해되며, 본원에서 제시하는 바와 같이, 관찰되는 선택적 및/또는 특이적 결합 특성에 가장 많이 기여하는 부위이다.The Fv molecule itself consists of a first chain and a second chain, each chain having first, second and third hypervariable sites. The hypervariable loops in the variable domains of the light and heavy chains are called complementarity determining sites (CDRs). There are CDR1, CDR2, and CDR3 sites in each of the heavy and light chains. These sites are believed to form antigen binding sites and may be specifically modified to exhibit enhanced binding activity. The most naturally variable region of these sites is the CDR3 site of the heavy chain. The CDR3 site is understood to be the most exposed site of the Ig molecule, and as presented herein, is the site that most contributes to the selective and / or specific binding properties observed.

Fv 분자의 단편은 원형(original) Fv의 선택적 및/또는 특이적인 결합 특성을 여전히 보유하는 원형 Fv보다 작은 임의의 분자로서 정의된다. 그러한 단편의 예로는 비제한적으로 (1) Fv의 중쇄의 단편만을 포함하는 미니바디, (2) 항체 중쇄 가변 부위의 작은 부분 단위를 포함하는 마이크로바디(국제 출원 PCT/IL99/00581), (3) 경쇄의 단편을 갖는 더 작은 바디, 및 (4) 경쇄 가변 부위의 기능성 단위를 갖는 유사한 바디를 포함한다. Fv 분자의 단편은 실질적으로 원형 또는 루프형의 폴리펩티드일 수 있는 것으로 이해되어야 한다.Fragments of Fv molecules are defined as any molecule smaller than the circular Fv that still retains the selective and / or specific binding properties of the original Fv. Examples of such fragments include, but are not limited to, (1) minibodies comprising only fragments of the heavy chain of Fv, (2) microbodies comprising small partial units of antibody heavy chain variable regions (International Application PCT / IL99 / 00581), (3 ) A smaller body with fragments of the light chain, and (4) a similar body with functional units of the light chain variable region. It is to be understood that the fragment of the Fv molecule may be a substantially circular or looped polypeptide.

본원에서 사용되는 용어 "Fab 단편"은 면역글로불린의 1가 항원 결합 단편이다. Fab 단편은 경쇄와, 중쇄의 일부분으로 이루어진다.The term "Fab fragment" as used herein is a monovalent antigen binding fragment of an immunoglobulin. Fab fragments consist of a light chain and a portion of a heavy chain.

F(ab')2 단편은 펩신 분해에 의해 얻어지는 면역글로불린의 2가 항원 결합 단편이다. 이것은 양 경쇄와, 양 중쇄의 일부분을 포함한다.F (ab ') 2 fragments are bivalent antigen binding fragments of immunoglobulins obtained by pepsin digestion. This includes both light chains and portions of both heavy chains.

Fc 단편은 면역글로불린의 비-항원 결합 부분이다. 이것은 중쇄의 카르복시 말단 부분 및 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함한다.Fc fragments are non-antigen binding portions of immunoglobulins. This includes the carboxy terminal portion of the heavy chain and the binding site for the Fc receptor.

Fd 단편은 면역글로불린의 중쇄의 가변 부위 및 제1 불변 부위이다.The Fd fragment is the variable region and the first constant region of the heavy chain of immunoglobulin.

폴리클로널 항체는 면역 반응의 산물이며, 다수의 상이한 B 림프구에 의해 형성된다. 모노클로널 항체는 하나의 클론성 B 세포로부터 유래된다.Polyclonal antibodies are the product of an immune response and are formed by a number of different B lymphocytes. Monoclonal antibodies are derived from one clonal B cell.

폴리펩티드에 대해 적용되고 본 발명에서 정의되는 바와 같은 카세트는 프레임워크로서 작용하는 소정의 연속 아미노산 서열을 의미하며, 단일 단위로서 간주되고 단일 단위로서 조작된다. 아미노산은 한 쪽 말단 또는 양 말단에서 치환되거나, 삽입되거나, 제거되거나 또는 부착될 수 있다. 마찬가지로, 아미노산의 연신물은 한 쪽 말단 또는 양 말단에서 치환되거나, 삽입되거나, 제거되거나 또는 부착될 수 있다.Cassette as applied to a polypeptide and as defined in the present invention means any contiguous amino acid sequence that acts as a framework and is considered as a single unit and is manipulated as a single unit. Amino acids may be substituted, inserted, removed or attached at one or both ends. Likewise, stretches of amino acids can be substituted, inserted, removed or attached at one or both ends.

"에피토프"란 용어는 본원에서 항체, 항체 단편, 항체 복합체 또는 이의 결합 단편을 갖는 복합체 또는 T 세포 수용체와 상호작용하는 항원 결정 인자 또는 인식 부위 또는 항원 부위를 의미하는 것으로 사용된다. 에피토프란 용어는 본 명세서에서 리간드, 도메인 및 결합 부위와 혼용된다. The term “epitope” is used herein to mean an antigenic determinant or recognition site or antigenic site that interacts with an antibody, antibody fragment, antibody complex or complex having a binding fragment or T cell receptor. The term epitope is used interchangeably with the ligand, domain and binding site herein.

선택성이란, 실체 또는 실체 상태의 혼합물로부터 하나의 실체 또는 세포 상태를 선택하여 결합하는 표적화 분자의 능력으로서 정의되며, 상기의 모든 실체 또는 실체 상태는 표적화 분자에 대해 특이적일 수 있다.Selectivity is defined as the ability of a targeting molecule to select and bind one entity or cellular state from a mixture of entity or entity states, all of which entity or entity states may be specific for the targeting molecule.

본원에서 사용되는 "친화력(affinity)"이란 결합 분자(예, 항체 상의 한 결합 부위)와 리간드(예, 항원 결정 인자) 간의 결합 강도(결합 상수)의 척도이다. 항체 상의 단일 항원 결합 부위와 단일 에피토프 간의 비공유 상호작용의 총합의 강도는 그 에피토프에 대한 항체의 친화력이다. 저친화성 항체는 항원에 약하게 결합하여 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 항원에 보다 강하게 결합하여 더 오랫동안 결합된 상태로 유지된다. "결합력(avidity)"이란 항체-항원 상호작용의 수가(valence)를 반영하기 때문에 친화력과는 다르다.As used herein, “affinity” is a measure of the strength of binding (binding constant) between a binding molecule (eg, one binding site on an antibody) and a ligand (eg, an antigenic determinant). The strength of the sum total of noncovalent interactions between a single antigen binding site on an antibody and a single epitope is the affinity of the antibody for that epitope. Low affinity antibodies tend to weakly bind to the antigen and easily dissociate, while high affinity antibodies bind more strongly to the antigen and remain bound for longer. "Avidity" differs from affinity because it reflects the number of antibody-antigen interactions.

항체-항원 상호작용의 특이성: 항원-항체 반응은 특이적이지만, 어떤 경우에는 한 항원에 의해 유도된 항체가 다른 무관한 항원과 교차반응할 수 있다. 그러한 교차 반응은 두 개의 상이한 항원이 상동성 또는 유사한 구조, 에피토프, 또는 이의 고정 영역을 공유하는 경우나, 또는 한 에피토프에 특이적인 항체가 유사한 구조 배좌 또는 화학적 특성을 보유하는 무관한 에피토프에 결합하는 경우에 발생한다.Specificity of Antibody-Antigen Interactions: Antigen-antibody responses are specific, but in some cases antibodies induced by one antigen may cross react with an unrelated antigen. Such cross-reaction may occur when two different antigens share a homologous or similar structure, epitope, or a fixed region thereof, or when an antibody specific for one epitope binds to an irrelevant epitope that possesses similar structural coordinates or chemical properties. Occurs in the case.

혈소판은 골수강에 방출되어 그 후 말초 혈류에서 순환하는 거핵구의 원형 세포질 단편이다. 혈소판은 응혈 과정에서의 주요 역할을 비롯하여 몇 가지 생리학적인 기능을 보유한다. 혈소판은 중심부에 위치한 과립 및 말초의 투명한 원형질을 포함하지만, 뚜렷한 핵은 갖고 있지 않다.Platelets are circular cytoplasmic fragments of megakaryocytes that are released into the bone marrow and then circulate in the peripheral blood stream. Platelets have several physiological functions, including a major role in the clotting process. Platelets include granules located in the center and peripheral clear plasma, but do not have distinct nuclei.

본원에서 사용되는 유착은 현탁된 박테리아, 세포, 디스크 또는 기타 유사한 크기의 입자들이 부착되어 덩어리를 형성하는 과정을 의미한다. 이 과정은 침전과 유사하지만, 입자들은 더 크고 용액보다는 현탁액으로 존재한다.As used herein, adhesion refers to the process by which suspended bacteria, cells, disks or other particles of similar size attach to form agglomerates. This process is similar to precipitation, but the particles are larger and are in suspension than solution.

응집이란 용어는 시험관내에서 유도된 혈소판의 덩어리지는 현상을 의미하며, 트롬빈 및 콜라겐은 순차적 메카니즘의 일부로서 혈전 또는 지혈 플러그의 형성을 유도한다.The term aggregation refers to the phenomenon of agglutination of platelets induced in vitro, with thrombin and collagen inducing the formation of thrombus or hemostatic plugs as part of the sequential mechanism.

보존적 아미노산 치환은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 단편의 하나 또는 두 개의 아미노산을 변화시키는 것에 의한 아미노산 조성의 변화로서 정의된다. 치환은 대체로 유사한 성질(예, 산성, 염기성, 방향성, 크기, 양전하 또는 음전하, 극성, 비극성)을 갖는 아미노산에 대해 이루어지며, 이러한 치환은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 특성(예, 전하, 등전점, 친화력, 결합력, 배좌, 가용성) 또는 활성을 실질적으로 변화시키지 않도록 이루어진다. 그러한 보존적 아미노산 치환을 위해 수행될 수 있는 전형적인 치환은 다음과 같은 아미노산의 군 중에서 이루어질 수 있다.Conservative amino acid substitutions are defined as changes in amino acid composition by changing one or two amino acids of a peptide, polypeptide or protein or fragment thereof. Substitutions are generally made for amino acids having similar properties (eg, acidic, basic, aromatic, size, positive or negative, polar, nonpolar), and such substitutions may be made for peptide, polypeptide or protein properties (eg, charge, isoelectric point, affinity, Affinity, locus, solubility) or activity. Typical substitutions that can be made for such conservative amino acid substitutions can be made among the following groups of amino acids.

글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 루신(L) 및 이소루신(I)Glycine (G), Alanine (A), Valine (V), Leucine (L) and Isoleucine (I)

아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)Aspartic Acid (D) and Glutamic Acid (E)

알라닌(A), 세린(S) 및 트레오닌(T)Alanine (A), Serine (S) and Threonine (T)

히스티딘(H), 리신(K) 및 아르기닌(R)Histidine (H), lysine (K) and arginine (R)

아스파라긴(N) 및 글루타민(Q)Asparagine (N) and Glutamine (Q)

페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)Phenylalanine (F), Tyrosine (Y) and Tryptophan (W)

보존적 아미노산 치환은, 예를 들어 분자의 선택적 및/또는 특이적 결합 특성의 주된 원인이 되는 초가변 부위에 측접한 부위 뿐 아니라, 예를 들어 가변 중쇄 카세트와 같은 분자의 다른 부분에서 이루어질 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 변형은 전체 크기의 항체, 디아바디(이량체), 트리아바디(삼량체) 및/또는 테트라바디(사량체)를 형성하기 위해 또는 미니바디 또는 마이크로바디를 형성하기 위해 분자를 재구성함으로써 수행될 수 있다.Conservative amino acid substitutions may be made, for example, at sites flanking the hypervariable sites that are the major cause of selective and / or specific binding properties of the molecule, as well as at other parts of the molecule, such as, for example, variable heavy chain cassettes. . Additionally or alternatively, the modifications may be carried out to form molecules of full size antibodies, diabodies (dimers), triabodies (trimers) and / or tetrabodies (tetramers) or to form minibodies or microbodies. By reconstructing

파지미드는 플라스미드 DNA를 보유하는 파지 입자로서 정의된다. 파지미드는 필라멘트형 파지, 예컨대 fd의 m13으로부터의 복제 기점을 포함하도록 디자인된 플라스미드 벡터이다. 이것은 플라스미드 DNA를 보유하기 때문에 파지미드 입자는 파지 게놈의 완전한 보체를 포함하기 위한 충분한 공간을 보유하고 있지 않다. 파지 게놈으로부터 유실된 성분은 파지 입자를 패키징하는 데 필수적인 정보이다. 따라서 파지를 증폭시키기 위해서는, 유실된 패키징 정보를 보완하는 헬퍼 파지 종과 함께 원하는 파지 입자를 배양할 필요가 있다.Phagemids are defined as phage particles that carry plasmid DNA. Phagemids are plasmid vectors designed to contain the origin of replication from filamentous phage, such as fd, from m13. Because it contains plasmid DNA, phagemid particles do not have enough space to contain the complete complement of the phage genome. Components missing from the phage genome are essential information for packaging phage particles. Therefore, in order to amplify phage, it is necessary to incubate desired phage particles together with helper phage species that supplement lost packaging information.

프로모터는 RNA 폴리머라제가 결합하여 전사를 개시시키는 DNA 상의 영역이다.A promoter is a region on DNA where RNA polymerase binds to initiate transcription.

파지 디스플레이 라이브러리(파지 펩티드/항체 라이브러리, 파지 라이브러리, 또는 펩티드/항체 라이브러리라고도 함)는 대형 파지 집단(108 이상)을 포함하며, 각 파지 입자는 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 나타낸다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드 단편은 다양한 길이가 되도록 작제할 수 있다. 나타내어진 펩티드 또는 폴리펩티드는 인간 항체 중쇄 또는 경쇄로부터 유래될 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.Phage display libraries (also called phage peptide / antibody libraries, phage libraries, or peptide / antibody libraries) comprise large phage populations (10 8 or more), with each phage particle representing a different peptide or polypeptide sequence. Such peptide or polypeptide fragments can be constructed to vary in length. The peptides or polypeptides shown can be derived from, but are not limited to, human antibody heavy or light chains.

약학 조성물이란 본 발명의 항체 또는 펩티드 또는 폴리펩티드와 이의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제, 또는 항체-약제(항체-제제) 복합체와 이의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제형을 의미한다.A pharmaceutical composition is a formulation comprising an antibody or peptide or polypeptide of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent thereof, or an antibody-pharmaceutical (antibody-agent) complex and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent thereof. Means.

본 발명에서 제제란, 인간, 소, 말, 돼지, 쥐, 개, 고양이 또는 임의의 기타 온혈 동물을 비롯하여(이에 국한되는 것은 아님) 포유동물의 활성 질환의 치료, 예방적 치료 또는 진단에 유용한 것을 의미한다. 제제는 방사능 동위원소, 독소, 올리고뉴클레오티드, 재조합 단백질, 항체 단편, 항암제, 항백혈병제, 항전이제, 항신생물제, 항질환제, 항유착제, 항혈전제, 항재발협착제, 항자가면역제, 항응집제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택된다. 그러한 제제의 다른 예는 비제한적으로 아시클로비어, 간시클로비어 및 지도부딘을 포함하는 항바이러스제; 실로스타졸, 달테파린 나트륨, 레비파린 나트륨 및 아스피린을 포함하는 항혈전제/항재발협착제; 잘토프로펜, 프라노프로펜, 드록시캄, 아세틸 살리실릭 17, 디클로페낙, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 설린닥, 나프록센, 암톨메틴, 셀레콕시브, 인도메타신, 로페콕시브 및 니메술리드를 포함하는 항염증제; 레플루노마이드, 데닐루킨 디프티톡스, 수브레움, WinRho SDF, 데피브로타이드 및 시클로포스파마이드를 포함하는 항자가면역제; 리마프로스트, 클로크로멘 및 히알루론산을 포함하는 항유착제/항응집제를 포함한다. In the present invention, the agent is useful for the treatment, prophylactic treatment or diagnosis of an active disease in a mammal, including but not limited to humans, cattle, horses, pigs, mice, dogs, cats or any other warm-blooded animals. it means. Formulations include radioisotopes, toxins, oligonucleotides, recombinant proteins, antibody fragments, anticancer agents, anti-leukemic agents, antimetastatic agents, anti-neoplastic agents, anti-diseases, anti-adhesion agents, anti-thrombotic agents, anti-relapse constriction agents, anti-autoimmune Agent, anticoagulant, antibacterial agent, antiviral agent and anti-inflammatory agent. Other examples of such agents include, but are not limited to, antiviral agents including acyclovir, gancyclovir, and zidovudine; Anti-thrombotic / anti-relapse stenosis agents including cilostazol, dalteparin sodium, leviparin sodium and aspirin; Zaltoprofen, pranoprofen, doxycamp, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sullindac, naproxen, amtolmethin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide Anti-inflammatory agents, including; Anti-autoimmune agents including leflunomide, denilukine diftitox, subreum, WinRho SDF, depibrotide and cyclophosphamide; Antiadhesives / anticoagulants including limaprost, clochromen and hyaluronic acid.

항백혈병제는 항백혈병 활성을 가진 제제이다. 예를 들어, 항백혈병제는 백혈병 세포 또는 미성숙 예비 백혈병 세포의 성장을 억제 또는 중지시키는 제제, 백혈병 또는 예비 백혈병 세포를 사멸시키는 제제, 다른 항백혈병 제제에 대한 백혈병 또는 예비 백혈병 세포의 감수성을 증가시키는 제제 및 백혈병 세포의 전이를 억제하는 제제를 포함한다. 본 발명에서는, 항백혈병제는 또한 종양의 혈관형성을 예방, 억제, 지연 또는 중지시키는 항혈관신생 활성을 갖는 제제일 수 있다.Antileukemia agents are agents that have anti-leukemic activity. For example, anti-leukemia agents increase the susceptibility of leukemia or pre-leukemia cells to agents that inhibit or stop the growth of leukemia cells or immature pre-leukemia cells, agents that kill leukemia or pre-leukemia cells, or other leukemia agents. Agents and agents that inhibit the metastasis of leukemia cells. In the present invention, the anti-leukemic agent may also be an agent having antiangiogenic activity that prevents, inhibits, delays or stops angiogenesis of the tumor.

유전자의 발현 패턴은 특정한 시간에 다양한 조건 하에 다양한 조직에서 생성되는 유전자 생성물의 양을 분석함으로써 연구할 수 있다. 유전자는 유전자 생성물의 양이 정상 대조군, 예를 들어 비질환 대조군에서 발견되는 것보다 많은 경우에 "과발현"되는 것으로 간주된다.Expression patterns of genes can be studied by analyzing the amount of gene product produced in various tissues under various conditions at specific times. A gene is considered to be "overexpressed" when the amount of gene product is greater than that found in normal controls, such as non-disease controls.

소정의 세포는 소정의 항체에 대한 결합 부위(또는 에피토프)를 갖는 단백질을 그 표면에 발현할 수 있으나, 그 결합 부위는 제1기(I기)라 불리기도 하는 상태의 세포에서 잠재 형태(cryptic form)로 존재할 수 있다(예를 들어, 항체에 의해 공간적으로 방해 또는 차단되거나, 항체에 의한 결합에 필요한 특징이 결여됨). I기는, 예를 들어 정상적 상태, 건강한 상태, 비질환 상태일 수 있다. 에피토프가 잠재 형태로 존재하는 경우, 이것은 소정의 항체에 의해 인식되지 않는데, 즉, I기에서는 이 에피토프 또는 소정의 세포에 대한 항체의 결합이 존재하지 않는다. 그러나, 에피토프는, 예를 들어 스스로 변형을 겪거나 차단이 해제됨으로써 노출될 수 있는데, 왜냐하면 가까이 있거나 결합된 분자들이 변형되거나 또는 부위가 배좌 변화를 겪기 때문이다. 변형의 예로는 폴딩의 변화, 번역후 변형의 변화, 포스포리피데이션의 변화, 황산화의 변화, 글리코실화의 변화 등을 포함한다. 그러한 변형은 세포가 제2기(II기)라 불리는 다른 상태로 진입할 때 발생할 수 있다. 제2 상태 또는 제2기의 예는 활성화, 증식, 형질전환을 포함하거나 또는 악성 상태로 존재할 수 있다. 에피토프는 변형되면 노출될 수 있고 항체가 결합할 수 있다.Certain cells may express on their surface a protein having a binding site (or epitope) for a given antibody, but the binding site is a latent form in a cell in a state also referred to as phase I (phase I). form) (e.g., spatially obstructed or blocked by the antibody or lacking the features necessary for binding by the antibody). Group I can be, for example, a normal, healthy, or non-disease state. If the epitope is present in latent form, it is not recognized by a given antibody, ie there is no binding of the antibody to this epitope or a given cell at stage I. However, epitopes can be exposed, for example, by modifying or unblocking themselves, because nearby or bound molecules are deformed or sites undergo constitutional changes. Examples of modifications include changes in folding, changes in post-translational modifications, changes in phospholipidation, changes in sulfation, changes in glycosylation, and the like. Such modifications can occur when cells enter another state called stage II (phase II). Examples of the second state or stage 2 may include activation, proliferation, transformation, or exist in a malignant state. Epitopes can be exposed when modified and antibodies can bind.

펩티도-모의체(펩티드 모의체)는 아미노산 간에 임의의 펩티드 결합, 즉, 아미드 결합을 더 이상 포함하지 않는 분자(예, 항체)이다. 그러나, 본 발명에서, 펩티드 모의체란 용어는 자연적으로는 더 이상 완전한 펩티드가 아닌 분자, 예컨대 유사 펩티드, 반펩티드 및 펩토이드를 포함하는 것이다. 완전한 비-펩티드이든 부분적인 비-펩티드이든지 간에, 본 발명에 따른 펩티드 모의체는 펩티드 모의체의 기초를 이루는 펩티드 내의 활성 기의 3차원적 배열과 매우 유사한 반응성 화학적 부분의 공간적 배열을 제공한다. 이러한 분자들은 작은 분자, 지질, 다당류 또는 이들의 접합체를 포함한다.Peptido-mocks (peptide mimetics) are molecules (eg, antibodies) that no longer contain any peptide bonds, ie, amide bonds, between amino acids. However, in the present invention, the term peptide mimetic includes molecules that are no longer naturally complete peptides, such as analogous peptides, half-peptides and peptoids. Whether fully or partially non-peptide, the peptide mimetics according to the present invention provide a spatial arrangement of reactive chemical moieties that is very similar to the three-dimensional arrangement of active groups in the peptides underlying the peptide mimetics. Such molecules include small molecules, lipids, polysaccharides or conjugates thereof.

파지미드는 필라멘트형 파지, 예컨대 M13 또는 fd로부터의 복제 기점을 포함하도록 디자인된다.Phagemids are designed to include origins of replication from filamentous phage such as M13 or fd.

표면에서 세포-특이적 및/또는 질병-특이적 리간드를 발현하는 질병 세포, 변형 세포, 또는 기타 변환 세포를 포함하는 광범위한 질병이 존재한다. 이들 리간드는 각각의 개별 세포의 인식, 선별, 진단 및 치료를 통해 특정 질병을 인식, 선별, 진단 및 치료하는 데 이용될 수 있다. 본 발명은 Fv 분자, 이의 구성체, 이의 단편, 이의 단편의 구성체, 또는 구성체의 단편을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공하고, 이들 모두는 강화된 결합 특성을 가진다. 이들 결합 특성은 펩티드 또는 폴리펩티드 분자가 다른 세포보다 표적 세포에 선별적으로 및/또는 특이적으로 결합하게 하고, 결합 특이성 및/또는 선별성은 주로 제1 초가변 부위에 의해 결정된다. Fv는 scFv 또는 dsFv일 수 있다.A wide range of diseases exist, including disease cells, modified cells, or other converting cells that express cell-specific and / or disease-specific ligands on the surface. These ligands can be used to recognize, select, diagnose and treat specific diseases through the recognition, selection, diagnosis and treatment of each individual cell. The present invention provides peptides or polypeptides comprising Fv molecules, constructs thereof, fragments thereof, constructs of fragments thereof, or fragments of constructs, all of which have enhanced binding properties. These binding properties allow the peptide or polypeptide molecules to bind selectively and / or specifically to target cells rather than other cells, and binding specificity and / or selectivity is primarily determined by the first hypervariable site. Fv may be scFv or dsFv.

전술한 Fv 분자는 질병 세포를 표적하기 위해 사용될 수 있다. 질병 세포는, 예를 들어, 암 세포일 수 있다. 특정 표적화에 의해 진단 및/또는 치료될 수 있는 암 종류의 예로서는 암종, 육종, 백혈병, 샘종, 림프종, 골수종, 모세포종, 고환종, 및 흑색종을 들 수 있지만, 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니다. 백혈병, 림프종, 및 골수종은 골수 및 림프 조직으로부터 발생하는 암이고, 이들은 세포의 제어되지 않는 증식과 관련된다.The Fv molecules described above can be used to target diseased cells. The disease cell can be, for example, a cancer cell. Examples of cancer types that can be diagnosed and / or treated by specific targeting include, but are not limited to, carcinomas, sarcomas, leukemias, adenomas, lymphomas, myeloma, blastomas, testicular tumors, and melanoma. Leukemias, lymphomas, and myeloma are cancers that arise from bone marrow and lymphoid tissue, and they are associated with uncontrolled proliferation of cells.

PSGL-1 및/또는 GPIb에 결합하는 항체는 파지 라이브러리를 이용하여 확인하였고, 이는 미국 특허 출원 10/032,423; 10/032,037; 10/029,988; 10/029,926; 09/751,181; 10,189,032; 및 60/258,948 및 국제 특허 출원 PCT/US01/49442 및 PCT/US01/49440에 개시되어 있다. 이들 출원에 개시된 항체의 특정 예는 Y1, Y17 및 L32 항체를 포함한다. 이들 항체는 배선(germ line) (DP32)으로부터 분리되어, N-말단 티로신에서 황산화되고 세포 이동, 예컨대 종양 전이에 관련되는 것으로 생각되는 조혈성 세포의 단백질 상에서 발견되는 에피토프에 특히 결합하는 것으로 밝혀졌다.Antibodies that bind to PSGL-1 and / or GPIb have been identified using phage libraries, which are described in US Patent Application 10 / 032,423; 10 / 032,037; 10 / 029,988; 10 / 029,926; 09 / 751,181; 10,189,032; And 60 / 258,948 and international patent applications PCT / US01 / 49442 and PCT / US01 / 49440. Specific examples of the antibodies disclosed in these applications include Y1, Y17 and L32 antibodies. These antibodies are isolated from germ lines (DP32) and found to bind specifically to epitopes found on proteins of hematopoietic cells that are sulfated in N-terminal tyrosine and are thought to be involved in cell migration, such as tumor metastasis. lost.

Y1/Y17/L32에 결합하는 황산화 에피토프는 바람직하게는 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이, 부착 및/또는 혈전증, 재발협착, 세포 회전 및 응집과 같은 이러한 다양한 과정에서 중요한 역할을 하는 리간드 및 수용체 상에서 발견되는 2 이상의 산성 아미노산의 클러스터 내의 황산화 티로신 잔기 또는 황산화 카르보하이드레이트 또는 지질 부분과 같은 황산화 부분의 존재에 특징이 있다. 이러한 에피토프는 또한 병든 세포, 예컨대 T-ALL 세포, B-백혈병 세포, B-CLL 세포, AML 세포, 다발골수종 세포 및 전이 세포에서도 찾을 수 있다. 이들 에피토프는 그러한 과정의 치료 매개(표적화 제제 뿐만 아니라) 및 진단 방법을 위한 유용한 표적이다.Sulfated epitopes that bind Y1 / Y17 / L32 preferably play an important role in these various processes, such as inflammation, immune response, infection, autoimmune response, metastasis, adhesion and / or thrombosis, restenosis, cell rotation and aggregation Is characterized by the presence of sulfated tyrosine residues or sulfated moieties such as sulfated carbohydrates or lipid moieties in clusters of two or more acidic amino acids found on the ligand and the receptor. Such epitopes can also be found in diseased cells such as T-ALL cells, B-leukemia cells, B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells and metastatic cells. These epitopes are useful targets for the therapeutic mediation (as well as targeting agents) and diagnostic methods of such processes.

뿐만 아니라, 본 발명의 이러한 항체들은 세포의 발달 단계에 의존적임이 발견되었다(AML 아형은 통상적인 처리 및 세포화학적 염색에 의해 관찰된 형태를 이용하여 프렌치-아메리칸-브리티시 시스템에 기초하여 분류됨): 이 항체는 아형 M3 또는 이보다 높지만, M0 또는 M1 아형 세포는 아닌 AML 세포에 결합한다. 또한, 이 항체는 M2 아형 세포에 결합할 수도 하지 않을 수도 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 정상적이고 건강한 골수(예, CD34+ 세포)에는 결합하지 않는다. 그러한 차이는 PSGL-1 발현 및/또는 황산화에 있어서의 변경 뿐 아니라, 약간 다른 에피토프를 노출시키는 PSGL-1 내의 가능한 배좌적 변화에 기초한 것으로 생각된다.In addition, these antibodies of the invention have been found to be dependent on the stage of development of the cells (AML subtypes are classified based on the French-American-British system using forms observed by conventional treatment and cytochemical staining): The antibody binds to AML cells that are subtype M3 or higher but are not M0 or M1 subtype cells. In addition, the antibody may or may not bind to M2 subtype cells. Thus, the antibodies of the invention do not bind to normal and healthy bone marrow (eg, CD34 + cells). Such differences are believed to be based on alterations in PSGL-1 expression and / or sulfation, as well as possible collateral changes in PSGL-1 that expose slightly different epitopes.

특히, 낮은 수준의 GPIb를 발현하는 인간의 만성 골수 백혈병 세포주인 KU812 세포는 Y1 항체에 결합하는 것으로 발견되었다. GPIb 단백질의 황산화를 억제시키지만 이의 발현을 억제시키지는 않는 염소산나트륨 내에서 KU812 세포를 증식시킨 후, 세포에 대한 Y1의 결합은 50% 감소하였다. 또한, GPIb의 아미노산 273∼285에 기초한 티로신-황산화된 펩티드는 Y1 항체가 혈소판에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것으로 발견된 반면, 황산화되지 않은 펩티드는 Y1 항체의 혈소판에 대한 결합을 억제하지 않는다.In particular, KU812 cells, a human chronic myeloid leukemia cell line expressing low levels of GPIb, were found to bind to Y1 antibodies. After propagation of KU812 cells in sodium chlorate, which inhibits the sulfated of GPIb protein but does not inhibit its expression, the binding of Y1 to cells decreased by 50%. In addition, tyrosine-sulfated peptides based on amino acids 273-285 of GPIb have been found to competitively inhibit binding of Y1 antibodies to platelets, whereas unsulphated peptides do not inhibit binding of Y1 antibodies to platelets. Do not.

본 발명은 황산화된 티로신 모티프를 포함하는 에피토프를 인식하거나 이에 결합하는 항체 또는 이의 단편를 포함하거나 이용한다. 그러한 모티프는 산성 잔기(아스파테이트 및 글루타메이트)가 풍부한 펩티드 서열을 포함하고 하나 이상의 티로신을 함유한다. 인식 및 결합은 하나 이상의 황산화된 티로신에 적어도 부분적으로 의존한다. 하나의 그러한 항체는 Y1 또는 이의 단편이다. Y1은 본원에 기술된 구체예에서 언급된 항체이지만, 본 발명이 Y1을 이용하는 구체예에 국한되는 것으로 이해되어서는 안된다. 본 발명은 결합 특이성을 보유하는 Y1 및 이의 단편에 관련된 항체를 포함하지만 이에 국한되지 않는 황산화된 티로신 모티프를 포함하는 에피토프에 결합하는 기타 항체를 사용하는 구체예를 포함한다. The present invention includes or utilizes antibodies or fragments thereof that recognize or bind to epitopes comprising sulfated tyrosine motifs. Such motifs include peptide sequences rich in acidic residues (aspartate and glutamate) and contain one or more tyrosine. Recognition and binding depend at least in part on one or more sulfated tyrosine. One such antibody is Y1 or a fragment thereof. Y1 is the antibody mentioned in the embodiments described herein, but it should not be understood that the invention is limited to the embodiments using Y1. The present invention includes embodiments using other antibodies that bind to epitopes including sulfated tyrosine motifs, including but not limited to antibodies associated with Y1 and fragments thereof that retain binding specificity.

본 발명에 따라, 황산화된 티로신 모티프를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편이 제공되고, 여기서 결합은 하나 이상의 황산화된 모티프의 티로신에 의존한다. 하나의 구체예에서, 항체는 항체-의존적 세포 독성을 매개한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 Y1 또는 관련 항체이거나, 그의 단편이다.According to the present invention there is provided an antibody or fragment thereof that binds to an epitope comprising a sulfated tyrosine motif, wherein the binding is dependent on the tyrosine of one or more sulfated motifs. In one embodiment, the antibody mediates antibody-dependent cytotoxicity. In a preferred embodiment, the antibody is Y1 or a related antibody or fragment thereof.

본 발명은 상기 항체 또는 이의 단편과 복합체화(예를 들어, 회합된, 결합된, 융합된, 또는 연결된)된 제제를 추가로 제공한다. 1∼16개의 제제 분자, 또는 그 이상이 각각의 항체에 결합될 수 있다. 항체는 선택적으로 8개의 티올기로 환원될 수 있는 경첩 부위에 4개의 이황화 결합을 가진다. 티올기에 공유결합될 수 있고 하나의 제제 분자를 보유하는 링커를 사용함에 의해, 8 이하의 제제 분자가 항체에 부착될 수 있다. 유사하게 티올기와 반응하지만 n 제제 분자를 보유하는 링커를 사용함에 의해, 8n 제제 분자가 항체에 부착될 수 있다. 하나의 구체예에서, 오로지 중쇄만이 제제와 복합체를 형성하거나 오로지 경쇄만이 제제와 복합체를 형성하는 반면, 더 바람직한 구체예에서는, 각각의 중쇄는 약 2 카피의 제제와 복합체를 형성하고 각각의 경쇄는 약 2 카피의 제제와 복합체를 형성한다.The invention further provides an agent complexed with (eg, associated, bound, fused, or linked) with said antibody or fragment thereof. One to sixteen molecule molecules, or more, may be bound to each antibody. The antibody optionally has four disulfide bonds at the hinge site that can be reduced to eight thiol groups. By using a linker that can be covalently bound to a thiol group and that contains one agent molecule, up to 8 agent molecules can be attached to the antibody. Similarly, by using linkers that react with thiol groups but retain n agent molecules, 8n agent molecules can be attached to the antibody. In one embodiment, only the heavy chain forms the complex with the formulation or only the light chain forms the complex with the formulation, while in more preferred embodiments each heavy chain forms a complex with about 2 copies of the formulation and each The light chain forms a complex with about 2 copies of the formulation.

리포좀(예를 들어, 항체-링커-담체-제제) 뿐만 아니라 중간 약물 담체, 예컨대 자연(예를 들어, 덱스트란) 및 합성(예를 들어, HPMA) 중합체를 사용함에 의해 훨씬 더 많은 숫자의 제제 분자가 항체에 연결될 수 있다는 것이 당업자에게 공지되어 있다. 제제는 또한 항체의 자유 아미노기에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 제제는 링커를 통해 자유 ε- 또는 α-아미노기에 연결될 수 있다. 통상적으로 제제는 링커에 직접 결합되거나, 먼저 담체에 연결되고 이어서 링커에 결합된다. 링커-제제 또는 링커-담체-제제 복합체는 이어서 항체에 결합된다. 항체-제제 복합체는 종양 세포에 의해 흡수될 수 있고, 여기서 제제는 세포사를 야기한다. 하나의 구체예에서, 항체-제제 결합은 예를 들어 산 절단, 또는 효소 절단에 의해 세포 내부에서 끊어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 Y1 또는 관련 항체, 또는 이의 단편이다.A much larger number of agents by using liposomes (eg antibody-linker-carrier-formulations) as well as intermediate drug carriers such as natural (eg dextran) and synthetic (eg HPMA) polymers It is known to those skilled in the art that molecules can be linked to antibodies. The agent may also be linked directly or indirectly to the free amino group of the antibody. For example, the agent may be linked to a free ε- or α-amino group via a linker. Typically the agent is bound directly to the linker or first linked to a carrier and then bound to the linker. The linker-agent or linker-carrier-agent complex is then bound to the antibody. The antibody-agent complex can be taken up by tumor cells, where the agent causes cell death. In one embodiment, the antibody-agent binding may be broken inside the cell, for example by acid cleavage, or enzyme cleavage. In a preferred embodiment, the antibody is Y1 or a related antibody, or fragment thereof.

본 발명은 Y1 또는 Y1-제제 복합체를 포함하는 질병 치료를 위한 조성물을 추가로 제공한다. The present invention further provides compositions for treating diseases comprising Y1 or Y1-agent complexes.

한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 투여함에 의해 ADCC를 유도하거나 활성화시키는 방법을 제공한다. 따라서, 이들 항체는 ADCC를 활성화하고/하거나, 자연 킬러(NK) 세포(예, CD56+), γδ T 세포 및/또는 단핵구를 자극하여 세포 용해를 유도할 수 있다. 일반적으로, 항체의 Fc 영역 또는 부분을 포함하는 항체를 투여한 후, 상기 항체는 효과기 세포, 예를 들어 NK 세포 상에서 Fc 수용체(FcR)에 결합하여 퍼포린 및 그랜자임 B의 방출을 유발하고/하거나 Fas B 발현을 유도하며, 이는 후에 아폽토시스를 초래한다. 표적 세포 표면 상에서 Fas 수용체에 대해 효과기 세포 상에서 발현된 FasL의 결합은 Fas 수용체 신호 유발 경로의 활성화를 통해 표적 세포 아폽토시스를 유도할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 IgG 항체는 효과기 세포 상에서 FasL 발현을 유도한다. 관련된 효과기 세포의 형태, 사이토카인(예, IL-2 및 G-CSF), 항온 처리 시간, 세포 표면 상에 존재하는 수용체의 수 및 항체 친화도를 비롯한 다양한 인자가 ADCC에 영향을 줄 수 있다. In one embodiment, the invention provides a method of inducing or activating ADCC by administering an antibody of the invention. Thus, these antibodies can activate ADCC and / or stimulate natural killer (NK) cells (eg, CD56 +), γδ T cells, and / or monocytes to induce cell lysis. In general, after administration of an antibody comprising an Fc region or portion of an antibody, the antibody binds to an Fc receptor (FcR) on effector cells, eg, NK cells, to cause release of perforin and granzyme B / Or induces Fas B expression, which later leads to apoptosis. Binding of FasL expressed on effector cells to Fas receptors on target cell surface can induce target cell apoptosis through activation of Fas receptor signaling pathways. In one embodiment, IgG antibodies of the invention induce FasL expression on effector cells. Various factors can affect ADCC, including the type of effector cells involved, cytokines (eg, IL-2 and G-CSF), incubation time, number of receptors present on the cell surface, and antibody affinity.

또다른 구체예에서, 제제에 커플링되거나 복합체화된 본 발명의 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함에 의해 세포사를 유도하는 방법이 제공되고, 여기서 항체-제제 커플 또는 복합체는 흡수에 의해 세포에 진입하고, 항체-제제 접합체 또는 복합체가 절단되며, 제제가 방출된다. 흡수는 임의의 적절한 수단, 예를 들어 새포내 이입 또는 식작용에 의해 발생할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 환자의 질병 치료 방법을 제공한다(예를 들어, 치료는 질병의 영향을 개선하고, 질병을 방지하거나, 질병의 진행을 억제하는 것을 포함한다).In another embodiment, a method of inducing cell death by administering an antibody of the invention coupled or complexed to an agent to a patient in need thereof is provided wherein the antibody-agent couple or complex is incorporated into the cell by uptake. Enters, the antibody-formulation conjugate or complex is cleaved and the agent is released. Absorption can occur by any suitable means, such as by intrafollicle migration or phagocytosis. Accordingly, the present invention provides a method for treating a disease in a patient (eg, treatment includes improving the effects of the disease, preventing the disease, or inhibiting the progression of the disease).

구체적으로, 항체는 제제를 세포로 혼입하는 데 사용될 수 있다. 항체는 질병 세포의 표면에 우선적으로 발현된 단백질, 예컨대 황산화된 티로신 잔기를 가진 단백질에 결합한다. 바람직한 구체예에서, 제제는 독소, 예컨대 독소루비신, 모르폴리노-독소루비신, 또는 모르폴리노-다우노루비신이다. 더 바람직한 구체예에서, 독소는 아디프산 링커 또는 N-ε-말레이미도카프론산 하이드라지드 링커를 통해 항체에 연결된다. α 아미노기에 결합시키기 위해서는 아디프산 링커가 사용되었고, 반면 α 아미노기 및 또한 환원된 이황화 결합의 SH 기 모두에 결합시키기 위해서는 N-[말레이미도카프론산]하이드라지드 링커가 사용되었다(말레이미도 기를 통해 C-S 결합을 형성함). 또한, 약물과 N-[말레이미도카프론산]하이드라지드 링커 사이에 히드라존 결합이 형성된다. In particular, antibodies can be used to incorporate agents into cells. Antibodies bind to proteins preferentially expressed on the surface of diseased cells, such as proteins with sulfated tyrosine residues. In a preferred embodiment, the agent is a toxin such as doxorubicin, morpholino-doxorubicin, or morpholino-daunorubicin. In a more preferred embodiment, the toxin is linked to the antibody via an adipic acid linker or an N-ε-maleimidocapronic acid hydrazide linker. Adipic acid linker was used to bind the α amino group, while N- [maleimidocapronic acid] hydrazide linker was used to bind both the α amino group and also the SH group of the reduced disulfide bond (maleimido group To form a CS bond). Hydrazone bonds are also formed between the drug and the N- [maleimidocapronic acid] hydrazide linker.

항체-제제 복합체가 세포 표면 단백질에 결합한 후, 세포는 복합체를 흡수한다. 세포 내 효소는 그 후 항체-독소 결합을 절단하고, 독소는 세포에 작용하여 그의 사멸을 야기한다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 그러한 항체-독소 접합체를 포함하는, 질병 치료를 위한 조성물을 제공한다.After the antibody-agent complex binds to cell surface proteins, the cells take up the complex. Intracellular enzymes then cleave the antibody-toxin bond, and the toxin acts on the cell causing its death. In another embodiment, the present invention provides a composition for treating a disease comprising such an antibody-toxin conjugate.

본 발명의 또다른 구체예는 비-독성 제제를 세포로 혼입하는 유사한 방법을 제공한다. 비-독성 제제는 예를 들어, 특정 유전자의 활성을 직접 또는 간접적으로 촉진하거나 억제함에 의해 세포의 거동 또는 활성을 변화시키기 위해 사용될 수 있다.Another embodiment of the invention provides a similar method of incorporating a non-toxic agent into a cell. Non-toxic agents can be used to change the behavior or activity of a cell, for example, by promoting or inhibiting the activity of a particular gene directly or indirectly.

하나의 기타 구체예에서, 본 발명은 본원의 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 바이러스에 의한 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 따라서, 질병 치료 방법은 감염을 막는 항체를 투여함에 의해 달성된다. 세포는 항체에 의해 인지되고, 감염성 제제에 의한 감염에 필요하기도 한 황산화된-티로신 모티프 함유 에피토프를 함유하는 단백질을 그의 표면에서 발현한다. 항체는 단백질에 결합하여, 이에 따라 감염을 막는다. 바람직한 항체가 황산화된 티로신 모티프-함유 에피토프를 통해 결합하는 것으로 공지된 단백질은 피브리노겐 γ 사슬, GP1b-α 사슬, 보체 C4, 및 PSGL-1을 포함한다. 바람직한 항체가 황산화된 티로신 모티프 함유 에피토프를 통해 결합하는 것으로 생각되는 단백질은 CCR5 및 CXCR4를 포함한다. CCR5 및 CXCR4 모두는 HIV 감염에 필요한 공동 수용체로서 작용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 HIV 균주에 의한 감염을 막기 위해 사용될 수 있다. 항체는 Y1인 것이 바람직하다.In one other embodiment, the present invention provides a method of preventing infection by a virus comprising administering an antibody of the present application to a patient in need thereof. Thus, disease treatment methods are achieved by administering antibodies that prevent infection. The cell expresses on its surface a protein containing a sulfated-tyrosine motif containing epitope that is recognized by the antibody and is also required for infection by the infectious agent. Antibodies bind to proteins and thus prevent infection. Proteins in which preferred antibodies are known to bind through sulfated tyrosine motif-containing epitopes include fibrinogen γ chains, GP1b-α chains, complement C4, and PSGL-1. Proteins that are believed to bind preferred antibodies through sulfated tyrosine motif-containing epitopes include CCR5 and CXCR4. Both CCR5 and CXCR4 can act as co-receptors required for HIV infection. In a preferred embodiment, the antibody can be used to prevent infection by HIV strains. Preferably, the antibody is Y1.

마지막으로, 본원에서 기술된 바와 같이 제제를 항체에 커플링 또는 복합체화시키고 항체-제제 커플 또는 복합체를 세포에 투여하는 단계를 가지는, 황산화 된 PSGL-1을 발현하는 세포로 제제를 혼입하는 방법이 제공된다. Finally, a method of incorporating the agent into cells expressing sulfated PSGL-1, comprising coupling or complexing the agent to the antibody and administering the antibody-agent couple or complex to the cell as described herein. This is provided.

본 발명의 항체는 황산화된 PSGL-1에 결합한다. 염증에 관여하는 백색 세포, 예를 들어 단핵구, 호중구 및 림프구는 아테롬성 동맥경화증과 같은 질환의 염증 진행에 주로 4종의 유착 분자, PSGL-1, P-셀렉틴, VLA-4, 및 VCAM-1에 의해 참여하게 된다(Huo and Ley, Acta Physiol. Stand, 173: 35-43 (2001); Libby, Sci. Ans. May: 48-55 (2002); Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 38: 577-582 (2001)). 임의의 이러한 중심 분자에 의한 항체의 방해는 관련된 질환을 해결하는 데 있어서의 잠재적 역할을 시사할 수 있다. 구체적으로, P-셀렉틴은 세포 부착 및 회전을 제어한다. 또한, P-셀렉틴-PSGL-1 상호작용은 종양발생(악성 세포와 관련되었을 때) 및 염증성 반응(백혈구와 관련되었을 때)과 필수적으로 연관된 세포 표면 상의 다수의 다른 분자를 활성화시킨다(Shebuski and Kilgore, J. Pharmacol. Exp. Cher. 300: 729-735 (2002)). P-셀렉틴이 세포 과정을 조절할 수 있는 능력에 대한 이와 같은 이해에 기초하면, 황산화된 PSGL-1에 대한 항체의 강화된 scFv 선택성은 이 분자를 다양한 악성 및 염증성 질환을 치료하기 위한 우수한 분자로 만들 수 있음이 분명하다. 게다가, 악성 질환의 모델은, 악성 세포에 대한 P-셀렉틴의 결합은 PSGL-1의 황산화를 필요로 한다는 것을 보여주었다(Ma and Geng, J. Immunol. 168: 1690-1696 (2002)). 이러한 요건은 항체 결합에 대한 요건과 유사하다. 따라서, 항체가 진행성 악성 질환의 P-셀렉틴 촉진을 파괴할 수 있음을 예측할 수 있다.Antibodies of the invention bind to sulfated PSGL-1. White cells involved in inflammation, such as monocytes, neutrophils and lymphocytes, are primarily involved in the four adhesion molecules, PSGL-1, P-selectin, VLA-4, and VCAM-1, for inflammatory progression of diseases such as atherosclerosis. (Huo and Ley, Acta Physiol. Stand, 173: 35-43 (2001); Libby, Sci. Ans. May: 48-55 (2002); Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol 38: 577-582 (2001). Interference of antibodies by any of these central molecules may suggest a potential role in solving related diseases. Specifically, P-selectin controls cell attachment and rotation. In addition, P-selectin-PSGL-1 interaction activates a number of other molecules on the cell surface that are essentially associated with oncogenesis (when associated with malignant cells) and inflammatory responses (when associated with leukocytes) (Shebuski and Kilgore). , J. Pharmacol.Exp. Cher. 300: 729-735 (2002)). Based on this understanding of the ability of P-selectin to modulate cellular processes, the enhanced scFv selectivity of antibodies to sulfated PSGL-1 is an excellent molecule for treating a variety of malignant and inflammatory diseases. It is clear that it can be made. In addition, models of malignant disease have shown that binding of P-selectin to malignant cells requires sulfation of PSGL-1 (Ma and Geng, J. Immunol. 168: 1690-1696 (2002)). This requirement is similar to the requirement for antibody binding. Thus, it can be predicted that antibodies can disrupt P-selectin promotion of advanced malignant diseases.

바람직하게는, 본 발명의 항체는 T-ALL 세포, AML 세포, 프리-B-ALL 세포, B-백혈병 세포, B-CLL 세포, 다발성 골수종 세포 및 전이 세포를 포함하는, 염증 또는 종양발생에 관여하는 하나 이상의 세포 유형 상에 존재하는 에피토프에 결합한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 항체는 지질, 탄수화물, 펩티드, 당지질, 당단백질, 지단백질 및/또는 지다당류 분자 상의 에피토프에 결합한다. 이러한 에피토프는 바람직하게는 하나 이상의 황산화된 부분을 가진다. 대안으로, 그러나 역시 바람직하게는, 본 발명의 항체는 2 이상의 에피토프와 교차 결합하며, 각 에피토프는 하나 이상의 황산화된 티로신 잔기 및 2 이상의 산성 아미노산의 하나 이상의 클러스터를 보유하는데, 클러스터의 한 예가 PSGL-1이다. Preferably, the antibody of the invention is involved in inflammation or tumorigenesis, including T-ALL cells, AML cells, pre-B-ALL cells, B-leukemia cells, B-CLL cells, multiple myeloma cells and metastatic cells Bind to epitopes present on one or more cell types. More preferably, the antibodies of the invention bind to epitopes on lipids, carbohydrates, peptides, glycolipids, glycoproteins, lipoproteins and / or liposaccharide molecules. Such epitopes preferably have one or more sulfated moieties. Alternatively, but also preferably, the antibodies of the invention cross-link with two or more epitopes, each epitope having one or more sulfated tyrosine residues and one or more clusters of two or more acidic amino acids, an example of which is PSGL -1.

본 발명의 이들 항체, 항원-결합 단편 또는 이의 복합체는 세포 표면 상의 PSGL-1에 결합한 후 세포 내로 흡수될 수 있다. 그러한 흡수는 방식, 시간 및 온도 의존적인 능동 과정인 엔도사이토시스를 통해 일어날 수 있다. 예를 들어, Y1은 구체적으로는 PSGL-1을 통해 AML 환자로부터 세포 내로 흡수된다. These antibodies, antigen-binding fragments or complexes thereof of the invention can be taken up into cells after binding to PSGL-1 on the cell surface. Such absorption can occur through endocytosis, an active process that is time, time and temperature dependent. For example, Y1 is specifically taken up into cells from AML patients via PSGL-1.

본 발명의 항체는, 티로신 황산화 부위를 갖는 단백질에 결합한다. 이러한 단백질은 PSGL-1, GPIb, α-2-안티플라스민; 아미노펩티다제 B; CC 케모카인 수용체 예컨대 CCR2, CCR5, CCR3, CXCR3, CXCR4, CCR8, 및 CCR2b 및 CXCI; 7개의 경막 단편(7TMS) 수용체; 응집 인자 예컨대 인자 V, VIII, 및 IX; 피브리노겐 감마 사슬; 헤파린 보조 인자 II; 세크레토그라닌 예컨대 세크레토그라닌 I 및 II; 비트로넥틴, 아밀로이드 전구체, α-2-안티플라스민; 콜레시스토키닌; α-코리오고나도트로핀; 보체 C4; 더마탄 설파테프로테오글리칸; 피브로넥틴; 및 카스트린을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 황산화된 CC 케모카인 수용체 예컨대 CCR5, CXCR4, CXCI 및 CCR2b 에 결합한다. 앞서 언급한 바와 같이, 황산화된 티로신은 CCR5 의 MIP-1α, MIPβ, 및 HIV-1 gp120/CD4 에의 결합 및 CCR5 및 CD4 를 발현하는 세포로 진입하는 HIV-1 의 능력에 기여할 수 있다.The antibody of the present invention binds to a protein having a tyrosine sulfated site. Such proteins include PSGL-1, GPIb, α-2-antiplasmin; Aminopeptidase B; CC chemokine receptors such as CCR2, CCR5, CCR3, CXCR3, CXCR4, CCR8, and CCR2b and CXCI; Seven dural fragment (7TMS) receptors; Aggregation factors such as factors V, VIII, and IX; Fibrinogen gamma chains; Heparin cofactor II; Secretogranin such as secretogranin I and II; Vitronectin, Amyloid Precursor, α-2-Antiplasmin; Cholecystokinin; α-coriogonadotropin; Complement C4; Dermatan sulfateproteoglycans; Fibronectin; And castrin. In a preferred embodiment, the antibodies of the invention bind to sulfated CC chemokine receptors such as CCR5, CXCR4, CXCI and CCR2b. As mentioned above, sulfated tyrosine may contribute to the binding of CCR5 to MIP-1α, MIPβ, and HIV-1 gp120 / CD4 and the ability of HIV-1 to enter cells expressing CCR5 and CD4.

항체, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 및 이의 단편 및 구조체는 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 제조될 수 있다. 원핵 및 진핵 시스템에서의 항체 및 단편의 제조 방법은 당분야에서 공지되어 있다.Antibodies, peptides, polypeptides, proteins, and fragments and constructs thereof can be prepared in prokaryotic or eukaryotic expression systems. Methods of making antibodies and fragments in prokaryotic and eukaryotic systems are known in the art.

본원에 정의되어 있고 본원에서 기술하는 바와 같은 진핵 세포 시스템은 숙주 세포가 원핵 세포인, 유전 공학 방법에 의해 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 발현 시스템을 의미한다. 진핵 발현 시스템은 포유동물 시스템일 수 있으며, 포유동물 발현 시스템에서 생성된 펩티드 또는 폴리펩티드는 정제 후에 바람직하게는 실질적으로 포유동물 오염원이 없다. 유용한 진핵 발현 시스템의 다른 예로는 효모 발현 시스템을 포함한다.Eukaryotic cell systems as defined herein and described herein mean expression systems for preparing peptides or polypeptides by genetic engineering methods, wherein the host cell is a prokaryotic cell. The eukaryotic expression system can be a mammalian system, and peptides or polypeptides produced in the mammalian expression system are preferably substantially free of mammalian contaminants after purification. Other examples of useful eukaryotic expression systems include yeast expression systems.

본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 바람직한 원핵 시스템은 발현 벡터에 대한 숙주로서 이. 콜라이(E. coli)를 사용한다. 이. 콜라이 시스템에서 생성된 펩티드 또는 폴리펩티드는 정제 후에 실질적으로 이. 콜라이 오염 단백질이 없다. 원핵 발현 시스템을 사용하면 본 발명에서 제공되는 서열 중 일부 또는 전부의 N-말단에 메티오닌 잔기가 추가될 수 있다. N-말단 메티오닌 잔기를 제거하면, 펩티드 또는 폴리펩티드가 완전히 발현되도록 하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 제조는 당분야에 공지된 바와 같이 수행할 수 있으며, 그 한 예는 적절한 조건 하에 에어로모나스(Aeromonas) 아미노펩티다제를 사용하는 것이다(미국 특허 제5,763,215호).Preferred prokaryotic systems for preparing peptides or polypeptides of the invention are E. coli as a host for expression vectors. E. coli is used. this. Peptides or polypeptides produced in the E. coli system are substantially purified after purification. There is no coli contaminating protein. Prokaryotic expression systems can be used to add methionine residues to the N-terminus of some or all of the sequences provided herein. By removing the N-terminal methionine residues, the preparation of a peptide or polypeptide such that the peptide or polypeptide is fully expressed can be performed as is known in the art, an example being Aeromonas aminopeptide under appropriate conditions. Agent (US Pat. No. 5,763,215).

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 경우에 따라 약학적으로 유효한 담체와 함께 각종 약학 제제, 예컨대 약물, 독소, 및 방사능 동위원소와 복합체화, 예를 들어 결합, 융합, 또는 연결되어 항체/폴리펩티드를 포함하는 펩티드-약물 조성물 및 항질병 및/또는 항암 활성을 가지는 약학 제제를 형성한다. 그러한 조성물은 진단 목적으로도 사용될 수 있다. Antibodies and polypeptides of the invention optionally comprise an antibody / polypeptide complexed with, eg bound, fused, or linked with various pharmaceutical agents, such as drugs, toxins, and radioisotopes, together with pharmaceutically effective carriers. It forms a peptide-drug composition and a pharmaceutical agent having anti-disease and / or anticancer activity. Such compositions can also be used for diagnostic purposes.

예를 들어, 안트라사이클린의 항체에 대한 접합 또는 복합체화는 일반적으로 당분야에서 공지되어 있다(Dubowchik & Walker, Pharmacol. & Thera. 83: 67-123 (1999); Trail et al., Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337 (2003)). 그러한 접합은 직접적 접합이거나 링커, 예컨대 산 분해성 링커 또는 효소 분해성 링커를 통한 접합일 수 있고, 중간 담체, 예컨대 덱스트란 및 합성 중합체의 사용을 포함할 수 있다. 안트라사이클린은 (1) α 아미노기(약 pH 8)을 통해 본 발명의 항체에 복합체화되어 4:1의 약물:항체 비율을 형성하였고(여기서 2 약물 분자는 중쇄에 부착되고 2 약물 분자는 경쇄에 부착됨) (2) 이황화 결합을 통해 본 발명의 항체에 복합체화되어 사용되는 방법에 따라 4:1∼8:1의 비율인 약물 항체 비율을 형성하였다. 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이, 약물 항체 비율은 예를 들어 이중 분지, 삼중 분지, 사중 분지 등의 분지된 링커를 사용함에 의해 2배, 3배 또는 4배로 될 수 있다. 당업자는 접합체 제조를 위한 더 편리한 반응을 위하여 항체, 링커, 담체 및/또는 약물에 화학적 변형을 가할 수 있다.For example, conjugation or complexation of anthracyclines to antibodies is generally known in the art (Dubowchik & Walker, Pharmacol. & Thera. 83: 67-123 (1999); Trail et al., Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337 (2003). Such conjugation may be direct conjugation or conjugation via a linker such as an acid decomposable linker or an enzymatic decomposable linker, and may include the use of intermediate carriers such as dextran and synthetic polymers. Anthracyclines were (1) complexed to an antibody of the invention via an α amino group (about pH 8) to form a drug: antibody ratio of 4: 1 where 2 drug molecules were attached to the heavy chain and 2 drug molecules to the light chain. Attached) (2) A drug antibody ratio of 4: 1 to 8: 1 was formed according to the method used by complexing to the antibody of the present invention through disulfide bonds. As is known in the art, drug antibody ratios can be doubled, tripled or quadrupled, for example by using branched linkers such as double branches, triple branches, quadrants and the like. One skilled in the art can make chemical modifications to antibodies, linkers, carriers and / or drugs for a more convenient reaction for preparing conjugates.

본 발명의 하나의 구체예에서, Fc 부위의 2 이황화 결합은 메르캅토에틸아민으로 환원된 후 약 pH 7에서 약물 링커와 반응하여 4:1의 약물 항체 비율을 형성한다(이러한 경우 모든 4 약물은 중쇄에 부착됨). 또 다른 구체예에서, 경첩 부위의 4 이황화 결합은 DTT(약 pH 7)에 의해 환원된 후 약물 링커와 반응하여 7:1∼8:1의 약물 항체 비율을 형성한다(그러한 경우 5 또는 6의 약물 분자는 중쇄에 부착되고, 1 또는 2의 약물 분자는 경쇄에 부착됨).In one embodiment of the invention, the bidisulfide bonds of the Fc moiety are reduced to mercaptoethylamine and then react with the drug linker at about pH 7 to form a 4: 1 drug antibody ratio (in which case all 4 drugs are Attached to the heavy chain). In another embodiment, the four disulfide bonds at the hinge site are reduced by DTT (about pH 7) and then reacted with the drug linker to form a drug antibody ratio of 7: 1-8: 1, in which case 5 or 6 Drug molecules are attached to the heavy chain, and 1 or 2 drug molecules are attached to the light chain).

본 발명에 유용한 담체의 예로는 덱스트란, HPMA(친수성 중합체), 또는 임의의 기타 중합체, 예컨대 친수성 중합체 뿐 아니라 이의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다. 대안으로, scFv Y1 분자로 장식된 리포좀, 예컨대 Doxil과 같은, 면역 리포좀으로도 공지된 장식된 리포좀을 사용할 수 있다. 이러한 리포좀은 하나 이상의 원하는 제제를 포함하도록 제조될 수 있으며, 본 발명의 항체와 혼합하여 높은 약물 대 항체 비를 제공하도록 할 수 있다.Examples of carriers useful in the present invention include dextran, HPMA (hydrophilic polymer), or any other polymer such as hydrophilic polymers as well as derivatives, combinations and variants thereof. Alternatively, liposomes decorated with scFv Y1 molecules, such as decorated liposomes, also known as immune liposomes, such as Doxil, can be used. Such liposomes may be prepared to include one or more desired agents and may be mixed with the antibodies of the invention to provide a high drug to antibody ratio.

대안으로, 항체 또는 폴리펩티드와 제제 사이의 결합은 직접 결합일 수 있다. 2 이상의 이웃하는 분자 간의 직접 결합은 분자 내의 원소 또는 원소군 간의 화학 결합을 통해 생성될 수 있다. 화학 결합은, 예를 들어 이온 결합, 공유 결합, 소수성 결합, 친수성 결합, 정전기적 결합 또는 수소 결합일 수 있다. 결합은, 예를 들어 아미드, 탄소-설파이드, 펩티드 및/또는 이황화 결합일 수 있다. 항체를 제제 또는 링커에 부착시키기 위해서, 공유 결합을 형성하는 것으로 당분야에 공지되어 있는 아민, 카르복시, 히드록실, 티올 및 에스테르 작용기를 사용할 수 있다.Alternatively, the binding between the antibody or polypeptide and the agent may be a direct binding. Direct bonds between two or more neighboring molecules can be created through chemical bonds between elements or groups of elements in the molecule. The chemical bond may be, for example, an ionic bond, a covalent bond, a hydrophobic bond, a hydrophilic bond, an electrostatic bond or a hydrogen bond. The bond can be, for example, an amide, carbon-sulfide, peptide and / or disulfide bond. To attach the antibody to the agent or linker, amine, carboxy, hydroxyl, thiol and ester functional groups known in the art to form covalent bonds can be used.

펩티드와 제제 또는 펩티드와 담체, 또는 담체와 제제 간의 결합은 링커 화합물에 의한 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 링커 화합물은 2 이상의 부분을 연결시키는 화합물로서 정의된다. 링커는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 분지된 링커 화합물은 이중 분지, 삼중 분지 또는 사중 분지 또는 그 이상으로 분지된 화합물로 이루어질 수 있다. 본 발명에 유용한 링커 화합물은 디카르복실산, 말레미도 하이드라지드, PDPH, 카르복실산 하이드라지드 및 작은 펩티드를 포함한 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.The peptide and the agent or the bond between the peptide and the carrier or the carrier and the agent may be by a linker compound. As used herein, a linker compound is defined as a compound that connects two or more moieties. The linker may be straight or branched chain. Branched linker compounds may consist of compounds branched into a double branch, triple branch or quadruple branch or higher. Linker compounds useful in the present invention include those selected from the group comprising dicarboxylic acids, maleido hydrazides, PDPH, carboxylic acid hydrazides and small peptides.

본 발명에 따르면, 유용한 링커 화합물의 보다 구체적인 예로는 (a) 숙신산, 글루타르산 및 아디프산과 같은 디카르복실산; (b) N-[말레이미도카프론산] 하이드라지드, 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실하이드라지드 및 N-[말레이미도운데칸산] 하이드라지드와 같은 말레이미도 하이드라지드; (c) (3-[2-피리딜디티오]프로피오닐 하이드라지드)유도체, 조합체, 변형체 및 이의 유사체; 및 (d) 2∼5의 탄소 원자로부터 선택되는 카르복실산 하이드라지드를 포함한다.According to the present invention, more specific examples of useful linker compounds include (a) dicarboxylic acids such as succinic acid, glutaric acid and adipic acid; (b) Malays such as N- [maleimidocapronic acid] hydrazide, 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxyhydrazide and N- [maleimidodecanoic acid] hydrazide Mid hydrazide; (c) (3- [2-pyridyldithio] propionyl hydrazide) derivatives, combinations, variants and analogs thereof; And (d) carboxylic acid hydrazide selected from 2 to 5 carbon atoms.

작은 펩티드 링커를 사용하는 직접 커플링에 의한 결합 역시 유용하다. 예를 들어, 항암 약물 독소루비신의 유리 당과 scFv 사이의 직접 커플링은 작은 펩티드를 사용하여 수행할 수 있다. 작은 펩티드의 예로는 AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, 단백질 C, S-TAG®, T7, V5, VSV-G 및 KAK를 포함한다.Binding by direct coupling using small peptide linkers is also useful. For example, direct coupling between the free sugars of the anticancer drug doxorubicin and the scFv can be accomplished using small peptides. Examples of small peptides are AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, Protein C, S-TAG ® , T7, V5, VSV-G and KAK It includes.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 방사능 동위원소와 같은 영상화제(표식 마커라고도 함)에 결합되거나, 접합되거나, 이와 복합체를 형성하거나, 또는 다른 방식으로 회합될 수 있으며, 이러한 접합체는 진단 및 영상화 목적에 사용될 수 있다. 그러한 방사능 동위원소-항체(또는 단편) 접합체를 포함하는 키트가 제공된다.Antibodies and polypeptides of the invention may be linked to, conjugated to, complexed with, or otherwise associated with imaging agents (also known as marker markers) such as radioisotopes, and such conjugates may be used for diagnostic and imaging purposes. Can be used. Kits are provided that include such radioisotope-antibody (or fragment) conjugates.

진단에 유용한 방사능 동위원소의 예로는 111인듐, 113인듐, 99m레늄, 105레늄, 101레늄, 99m테크네튬, 121m텔루륨, 122m텔루륨, 125m텔루륨, 165툴륨, 167툴륨, 168툴륨, 123요오드, 126요오드, 131요오드, 133요오드, 81m크립톤, 33크세논, 90이트륨, 213비스무트, 77브롬, 18플루오르, 95루테늄, 97루테늄, 103루테늄, 105루테늄, 107수은, 203수은, 67갈륨 및 68갈륨을 포함한다. 바람직한 방사능 동위원소는 X-선 또는 임의의 적합한 상자성 이온에 불투명하다.Examples of radioactive isotopes useful for diagnosis include 111 indium, 113 indium, 99 m rhenium, 105 rhenium, 101 rhenium, 99 m technetium, 121 m tellurium, 122 m tellurium, 125 m tellurium, 165 thulium, 167 thulium, 168 thulium, 123 iodine , 126 iodine, 131 iodine, 133 iodine, 81m krypton, 33 xenon, 90 yttrium, 213 bismuth, 77 bromine, 18 fluorine, 95 ruthenium, 97 ruthenium, 103 ruthenium, 105 ruthenium, 107 mercury, 203 mercury, 67 gallium and 68 Contains gallium. Preferred radioactive isotopes are opaque to X-rays or any suitable paramagnetic ions.

표식 마커 분자는 형광 마커 분자일 수도 있다. 형광 마커 분자의 예로는 플루오레세인, 피코에리스린, 또는 로다민, 또는 이들의 변형체 또는 접합체를 포함한다.The marker marker molecule may be a fluorescent marker molecule. Examples of fluorescent marker molecules include fluorescein, phycoerythrin, or rhodamine, or variants or conjugates thereof.

표식 마커에 접합된 항체 또는 폴리펩티드는 질병 상태를 진단하거나, 예측하거나, 또는 모니터링 하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 그러한 방법은 환자 유래의 하나 이상의 샘플을 제공하고, 본 발명의 항체 또는 그의 단편이 환자의 세포에 결합하는지를 결정하여, 환자가 질병의 위험이 있는지 또는 질병을 가지고 있는지를 보여준다. 그러한 모니터링은 생체내, 시험관내 또는 체외에서 수행될 수 있다. 모니터링 또는 진단을 생체내 또는 체외에서 수행하는 경우, 영상화제는 환자에게 허용되지 않는 수준으로 유해하지 않는다는 점에서 생리학적으로 허용될 수 있는 것이 바람직하다. 허용 가능한 유해성 수준은 질환의 심각성 및 다른 선택의 유용성에 따라 의사가 그러한 기준을 이용하여 결정할 수 있다.Antibodies or polypeptides conjugated to marker markers can be used to diagnose, predict, or monitor disease states. In general, such methods provide one or more samples from the patient and determine whether the antibody or fragment thereof of the invention binds to the patient's cells to show whether the patient is at risk or has a disease. Such monitoring can be performed in vivo, in vitro or in vitro. When monitoring or diagnosis is performed in vivo or in vitro, it is desirable that the imaging agent be physiologically acceptable in that it is not harmful to the patient to an unacceptable level. Acceptable hazard levels can be determined by the physician using such criteria, depending on the severity of the disease and the usefulness of the other choice.

암의 경우, 환자의 병기를 결정하는 것은 일반적으로 종양의 크기, 유형, 위치 및 침입성에 기초하여 질환의 분류를 결정하는 것을 포함한다. 종양 특성에 의해 암을 분류하기 위한 한 가지 분류 시스템은 "TNM Classification of Malignant Tumours" (6판) (L. H. Sobin, Ed.) (본원에서 참고로 인용함)이며, 여기에서는 암의 단계를 T, N, 및 M 카테고리로 분류하는데, 여기서 T는 그 크기 및 위치에 따라 주요 종양을 나타내고, N은 국부 림프절을 나타내고, M은 원격 전이를 나타낸다. 또한, 숫자 I, II, III 및 IV는 단계를 나타내는데 사용되며, 각 수는 TNM 인자의 가능한 조합을 의미한다. 예를 들어, I기 유방암은 TMN 그룹: T1, NO, MO에 의해 정의된다: T1 - 종양의 직경이 2 cm 이하임, NO - 국부 림프절 전이가 없음, MO - 원격 전이가 없음. 또 다른 시스템은 AML의 병기를 결정하는 데 사용되는데, 분류된 아형은 통상적인 처리 및 세포화학적 염색 하에 관찰되는 형태를 이용하는 프렌치-아메리칸-브리티시 시스템에 기초한 것이다.In the case of cancer, determining the stage of a patient generally includes determining the classification of the disease based on the size, type, location and invasiveness of the tumor. One classification system for classifying cancer by tumor characteristics is "TNM Classification of Malignant Tumours" (6th edition) (LH Sobin, Ed.), Which is incorporated herein by reference, where the stages of cancer are referred to as T, N, and M categories, where T represents the major tumor, according to its size and location, N represents local lymph nodes, and M represents distant metastasis. In addition, the numbers I, II, III and IV are used to represent the steps, each number representing a possible combination of TNM factors. For example, stage I breast cancer is defined by the TMN group: T1, NO, MO: T1-tumor has a diameter of 2 cm or less, NO-no local lymph node metastasis, MO-no distant metastasis. Another system is used to determine the stage of AML, wherein the sorted subtypes are based on the French-American-British system using forms observed under conventional treatment and cytochemical staining.

또한, 최근에 제안된 세계 보건 기구(WHO)의 조혈 및 림프계 조직의 신생물 형성 질환의 병기 결정 또는 분류는 (특별히 AML에 대해서), 질병의 전통적인 FAB-형 카테고리 뿐 아니라, 특이적인 세포유전학적 발견 및 골수이형성증과 관련된 AML과 서로 관련이 있는 추가적인 질병 유형을 포함한다. 다른 연구자들 역시 병리학적 분류를 제안하였다. 예를 들어, AML에 특이적인 한 가지 제안은 세포유전학적 전위와 상관성이 있고, 형태학적 평가 및 면역형별에 의해 쉽게 파악될 수 있으며, 관련된 골수이형성적 변화의 중요성을 통합시키는 질병 유형을 포함한다. 이러한 시스템은 세포유전학 또는 분자유전학적 연구에 의해 지지되었으며, 새로운 인식할 수 있는 임상병리학적 실체가 소개됨에 따라 확장될 수 있었다(Arber, Am. J. Clin. Pathol. 115(4): 552-60 (2001)). In addition, the recently proposed World Health Organization (WHO) staging or classification of hematopoietic and lymphoid tissue neoplastic disease (particularly for AML), as well as specific cytogenetic as well as traditional FAB-type categories of disease And additional disease types that correlate with AML associated with myelodysplasia. Other researchers have also proposed pathological classification. For example, one suggestion specific to AML is a disease type that correlates with cytogenetic translocation, can be readily identified by morphological evaluation and immunotyping, and incorporates the importance of related myelodysplastic changes. . This system was supported by cytogenetic or molecular genetic studies and could be expanded with the introduction of new recognizable clinicopathological entities (Arber, Am. J. Clin. Pathol. 115 (4): 552-). 60 (2001)).

본 발명은 표식 마커 분자 또는 영상화제에 결합된 본 발명의 펩티드를 갖는 영상화제를 포함하는, 치료 전, 치료 중 또는 치료 후 치료 효능의 시험관내 분석을 위한 진단 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 세포와 조성물을 접촉시키는 단계; (b) 세포에 결합된 방사능 활성을 측정하는 단계; 및 이로써 (c) 종양을 가시화하는 단계를 포함하는, 암, 보다 구체적으로는 종양의 진단적 병소 위치 확인 및 영상화를 위해 영상화제를 사용하는 방법을 제공한다.The present invention provides diagnostic kits for in vitro analysis of treatment efficacy before, during or after treatment comprising an imaging agent having a peptide of the invention bound to a marker marker molecule or imaging agent. The present invention also provides a method of contacting a composition with (a) contacting a cell with a composition; (b) measuring the radioactivity bound to the cells; And thereby (c) visualizing the tumor, and more particularly, a method of using an imaging agent for the location and imaging of a diagnostic lesion of a cancer, more particularly a tumor.

적합한 영상화제의 예로는 형광 염료, 예컨대 FITC, PE 등, 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질을 들 수 있다. 다른 예로는 기질과 반응하여 색 변화와 같은 인식할 수 있는 변화를 생성하는 효소 및 방사능 분자를 포함한다.Examples of suitable imaging agents include fluorescent dyes such as FITC, PE and the like, fluorescent proteins such as green fluorescent proteins. Other examples include enzymes and radioactive molecules that react with the substrate to produce recognizable changes such as color changes.

한 예로서, 키트의 영상화제는 FITC와 같은 형광 염료이고, 키트는 암, 보다 구체적으로는 혈액 관렴 암, 예를 들어 백혈병, 림프종 및 골수종의 치료 효능을 분석하기 위한 키트를 제공한다. FACS 분석은, 예를 들어 진단시, 치료중, 완화중 및 재발중에 질병의 각 단계에서 영상화제에 의해 염색된 세포의 비율 및 염색 강도를 측정하기 위해 사용된다.As one example, the imaging agent of the kit is a fluorescent dye, such as FITC, and the kit provides a kit for analyzing the efficacy of treatment of cancer, more specifically hematopoietic cancers such as leukemia, lymphoma and myeloma. FACS analysis is used to measure the percentage and staining intensity of cells stained with an imaging agent at each stage of the disease, for example, at diagnosis, during treatment, during remission, and during relapse.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 항암제, 항신생물제, 항바이러스제, 항전이제, 항염증제, 항혈전제, 항재발협착제, 항응집제, 항자가면역제, 항유착제, 항심혈관질환제, 약제 또는 기타 항질병제에 결합되거나, 접합되거나, 또는 다른 방식으로 회합될 수 있다. 제제란 비제한적으로 인간, 소, 말, 돼지, 쥐, 개, 고양이 또는 기타 다른 온혈동물을 비롯하여 포유동물의 예방적 치료 또는 진단에 유용한 제제를 의미하다.Antibodies and polypeptides of the invention may be anti-cancer, anti-neoplastic, antiviral, anti-metastatic, anti-inflammatory, anti-thrombotic, anti-relapse confinement, anti-coagulant, anti-autoimmune, anti-adhesive, anti-cardiovascular disease, drug or other It can be linked to, conjugated to, or otherwise associated with an anti-disease. By agent is meant an agent useful for the prophylactic treatment or diagnosis of a mammal, including but not limited to humans, cattle, horses, pigs, mice, dogs, cats or other warm blooded animals.

그러한 제제의 예는 비제한적으로 아시클로비어, 간시클로비어 및 지도부딘을 포함하는 항바이러스제; 실로스타졸, 달테파린 나트륨, 레비파린 나트륨 및 아스피린을 포함하는 항혈전제/항재발협착제; 잘토프로펜, 프라노프로펜, 드록시캄, 아세틸 살리실릭 17, 디클로페낙, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 설린닥, 나프록센, 암톨메틴, 셀레콕시브, 인도메타신, 로페콕시브 및 니메술리드를 포함하는 항염증제; 레플루노마이드, 데닐루킨 디프티톡스, 수브레움, WinRho SDF, 데피브로타이드 및 시클로포스파마이드를 포함하는 항자가면역제; 및 리마프로스트, 클로크로멘 및 히알루론산을 포함하는 항유착제/항응집제를 포함한다. Examples of such agents include, but are not limited to, antiviral agents including acyclovir, gancyclovir and zidovudine; Anti-thrombotic / anti-relapse stenosis agents including cilostazol, dalteparin sodium, leviparin sodium and aspirin; Zaltoprofen, pranoprofen, doxycamp, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sullindac, naproxen, amtolmethin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide Anti-inflammatory agents, including; Anti-autoimmune agents including leflunomide, denilukine diftitox, subreum, WinRho SDF, depibrotide and cyclophosphamide; And antiadhesives / anticoagulants, including limaprost, clochromen and hyaluronic acid.

약제의 예로는 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신, 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신, 모르폴리노독소루비신, 모르폴리노다우노루비신, 메톡시모르폴리닐독소루비신, 메톡시모르폴리노다우노루비신 및 메톡시모르폴리닐독소루비신 및 이의 치환된 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다. 약제의 다른 예로는 시스-백금, 택솔, 칼리체아미신, 빈크리스틴, 시타라빈(Ara-C), 시클로포스파마이드, 프레드니손, 플루다라빈, 이다루비신, 클로람부실, 인터페론 알파, 히드록시우레아, 테모졸로마이드, 탈리도마이드 및 블레오마이신, 및 이들의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다. Examples of medicaments include anthracyclines such as doxorubicin (Adriamycin), daunorubicin, idarubicin, detorrubicin, caminomycin, epirubicin, esorubicin, morpholinodoxorubicin, morpholinodaunarubicin, metholine Methoxymorpholinyldoxorubicin, methoxymorpholinodaunorubicin and methoxymorpholinyldoxorubicin and substituted derivatives, combinations and variants thereof. Other examples of medicaments include cis-platinum, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, fludarabine, idarubicin, chlorambucil, interferon alpha, hydride Roxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and derivatives, combinations and variants thereof.

항암제는 항암 활성을 갖는 제제이다. 예를 들어, 항암제는 암 세포 또는 미성숙 예비 암 세포의 성장을 억제 또는 중지시키는 제제, 암 또는 예비 암 세포를 사멸시키는 제제, 다른 항암 제제에 대한 암 또는 예비 암 세포의 감수성을 증가시키는 제제 및 암 세포의 전이를 억제하는 제제를 포함한다. 본 발명에서, 항암제는 또한 종양의 혈관형성을 예방, 억제, 지연 또는 중지시키는 항혈관신생 활성을 갖는 제제일 수 있다.Anticancer agents are agents that have anticancer activity. For example, anticancer agents may be agents that inhibit or stop the growth of cancer cells or immature reserve cancer cells, agents that kill cancer or reserve cancer cells, agents that increase the sensitivity of cancer or reserve cancer cells to other anticancer agents and cancer Agents that inhibit metastasis of cells. In the present invention, the anticancer agent may also be an agent having antiangiogenic activity that prevents, inhibits, delays or stops angiogenesis of the tumor.

암 세포의 성장 억제는, 예를 들어 (i) 암 또는 전이 성장의 예방, (ii) 암 또는 전이 성장의 속도 저감, (iii) 세포를 무결하게 생존된 상태로 유지하면서 암 세포의 성장 진행 또는 전이 진행을 총체적으로 방지하는 것, (iv) 암 세포와 미소환경의 접촉을 방해하는 것, 또는 (v) 암 세포를 사멸시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 암 세포에 결합하여 이에 따라 T 세포 및 킬러 세포를 자극하여 항체 의존적 세포 세포독성에 의해 결합된 세포를 사멸시킴에 의해 암세포를 사멸시킨다.Inhibition of growth of cancer cells may include, for example, (i) preventing cancer or metastatic growth, (ii) slowing the rate of cancer or metastatic growth, (iii) progressing the growth of cancer cells while keeping the cells intact, or Totally preventing metastasis progression, (iv) interfering with the contact of the cancer cells with the microenvironment, or (v) killing the cancer cells. For example, antibodies kill cancer cells by binding to cancer cells and thus stimulating T cells and killer cells to kill bound cells by antibody dependent cellular cytotoxicity.

항백혈병제는 항백혈병 활성을 가진 제제이다. 예를 들어, 항백혈병제는 백혈병 세포 또는 미성숙 예비 백혈병 세포의 성장을 억제 또는 중지시키는 제제, 백혈병 또는 예비 백혈병 세포를 사멸시키는 제제, 다른 항백혈병 제제에 대한 백혈병 또는 예비 백혈병 세포의 감수성을 증가시키는 제제 및 백혈병 세포의 전이를 억제하는 제제를 포함한다. 본 발명에서는, 항백혈병제는 또한 종양의 혈관형성을 예방, 억제, 지연 또는 중지시키는 항혈관신생 활성을 갖는 제제일 수 있다.Antileukemia agents are agents that have anti-leukemic activity. For example, anti-leukemia agents increase the susceptibility of leukemia or pre-leukemia cells to agents that inhibit or stop the growth of leukemia cells or immature pre-leukemia cells, agents that kill leukemia or pre-leukemia cells, or other leukemia agents. Agents and agents that inhibit the metastasis of leukemia cells. In the present invention, the anti-leukemic agent may also be an agent having antiangiogenic activity that prevents, inhibits, delays or stops angiogenesis of the tumor.

백혈병 세포의 성장 억제는, 예를 들어 (i) 백혈병 또는 전이 성장의 예방, (ii) 백혈병 또는 전이 성장의 속도 저감, (iii) 세포를 무결하게 생존된 상태로 유지하면서 백혈병 세포의 성장 진행 또는 전이 진행을 총체적으로 방지하는 것, (iv) 백혈병 세포와 미소환경의 접촉을 방해하는 것, 또는 (v) 백혈병 세포를 사멸시키는 것을 포함한다.Inhibition of growth of leukemia cells may include, for example, (i) preventing leukemia or metastatic growth, (ii) slowing the rate of leukemia or metastatic growth, (iii) progressing the growth of leukemia cells while keeping the cells intact, or Totally preventing metastasis progression, (iv) interfering with contact of leukemia cells with microenvironments, or (v) killing leukemia cells.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드가 유용하게 연결될 수 있는 항질병, 항암 및 항백혈병제의 예는 독소, 방사능 동위원소 및 약학 조성물을 포함한다. Examples of anti-disease, anti-cancer and anti-leukemic agents to which the antibodies and polypeptides of the invention may be usefully linked include toxins, radioactive isotopes and pharmaceutical compositions.

독소의 예로는 겔로닌, 슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin) (PE), PE40, PE38, 디프테리아 독소, 리신, 또는 이의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다.Examples of toxins include gelonin, Pseudomonas Exotoxin (PE), PE40, PE38, diphtheria toxin, lysine, or derivatives, combinations and variants thereof.

방사능 동위원소의 예로는 병소 위치 확인 및/또는 치료에 사용될 수 있는 감마 방사체, 양전자 방사체 및 x-선 방사체, 및 치료에 사용될 수 있는 베타 방사체 및 알파 방사체를 포함한다. 진단에 유용한 전술한 방사능 동위원소 역시 치료에 유용하게 사용될 수 있다.Examples of radioactive isotopes include gamma emitters, positron emitters and x-ray emitters that can be used for lesion localization and / or treatment, and beta emitters and alpha emitters that can be used for treatment. The aforementioned radioisotopes useful for diagnosis may also be useful for treatment.

항암제 또는 항백혈병제의 비제한적인 예로는 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신, 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신, 모르폴리노독소루비신, 모르폴리노다우노루비신, 메톡시모르폴리닐독소루비신, 메톡시모르폴리노다우노루비신 및 메톡시모르폴리닐독소루비신 및 이의 치환된 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다. 약제의 다른 예로는 시스-백금, 택솔, 칼리체아미신, 빈크리스틴, 시타라빈(Ara-C), 시클로포스파마이드, 프레드니손, 다우노루비신, 이다루비신, 플루다라빈, 클로람부실, 인터페론 알파, 히드록시우레아, 테모졸로마이드, 탈리도마이드 및 블레오마이신, 및 이들의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다. Non-limiting examples of anticancer or anti-leukemia agents include anthracyclines such as doxorubicin (Adriamycin), daunorubicin, idarubicin, detorrubicin, caminomycin, epirubicin, esorubicin, morpholinodoxorubicin, morpho Polynodaunorubicin, methoxymorpholinyldoxorubicin, methoxymorpholinodaunorubicin and methoxymorpholinyldoxorubicin and substituted derivatives, combinations and variants thereof. Other examples of medicaments include cis-platinum, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, daunorubicin, idarubicin, fludarabine, chlorambucil, Interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and derivatives, combinations and variants thereof.

한 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 항체 또는 폴리펩티드는 세포 회전, 염증, 자가 면역 질환, 전이, 종양 세포 또는 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제, 또는 종양을 가진 환자의 종양 세포 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포수의 증가를 억제 또는 치료하기에 유효한 양으로 존재할 수 있다. 대안으로, 항체 또는 폴리펩티드는 종양 세포 또는 백혈병 세포의 사멸률을 증가시키는 데 유효한 양으로 존재할 수 있다. 또는, 항체 또는 폴리펩티드는 항질병제에 의한 손상에 대한 질병 세포의 감수성, 항암제에 의한 손상에 대한 종양 세포의 감수성, 또는 항백혈병제에 의한 손상에 대한 백혈병 세포의 감수성을 변화시키기에 유효한 양으로 존재할 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 폴리펩티드는 종양을 가진 환자의 종양 세포의 수 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포의 수를 감소시키는 데 유효한 양으로 존재할 수 있다. 또한 대안으로, 항체 또는 폴리펩티드는 재발협착을 억제하기에 유효한 양으로 존재할 수 있다. 항체 또는 폴리펩티드는 HIV 진입의 억제에 유효한 양으로 존재할 수도 있다. 대안으로, 항체 또는 폴리펩티드는 치료제를 특정 세포 또는 부위에 직접 전달하는 표적 제제로서 사용될 수 있다. In one embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention comprises an antibody or polypeptide of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier. The antibody or polypeptide may be used to inhibit or treat cell turnover, inflammation, autoimmune disease, metastasis, growth and / or replication of tumor cells or leukemia cells, or an increase in the number of tumor cells in patients with tumors or leukemia cells in leukemia patients. May be present in an effective amount. Alternatively, the antibody or polypeptide may be present in an amount effective to increase the death rate of tumor cells or leukemia cells. Alternatively, the antibody or polypeptide may be in an amount effective to alter the susceptibility of disease cells to damage by anti-pathological agents, the susceptibility of tumor cells to damage by anti-cancer agents, or the leukemia cells susceptibility to damage by anti-leukemic agents May exist. Alternatively, the antibody or polypeptide may be present in an amount effective to reduce the number of tumor cells of a patient with a tumor or the number of leukemia cells of a leukemia patient. Alternatively, the antibody or polypeptide may be present in an amount effective to inhibit restenosis. The antibody or polypeptide may be present in an amount effective to inhibit HIV entry. Alternatively, the antibody or polypeptide can be used as a target agent to deliver a therapeutic agent directly to a particular cell or site.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 적합한 방법에 의해 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 방법의 예로는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 기관지내, 포막내, 복강내, 림프선내, 비강, 설하, 경구, 직장, 질, 기도, 협측, 피내, 경피, 또는 늑막내 투여를 포함한다.Antibodies and polypeptides of the invention can be administered to a patient in need thereof by a suitable method. Examples of such methods include intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, bronchial, intravesical, intraperitoneal, lymphatic, nasal, sublingual, oral, rectal, vaginal, airway, buccal, intradermal, transdermal, or pleural administration. Include.

정맥내 투여의 경우, 제형은 바람직하게는, 환자에게 투여되는 양이 소정의 조성물 약 0.1 mg∼약 1000 mg의 유효량이 되도록 제조된다. 보다 바람직하게는, 투여되는 양은 소정의 조성물 약 1 mg∼약 500 mg이 될 것이다. 본 발명의 조성물은 광범위한 용량 범위에서 유효하며, 치료되는 질병의 구체적 특징, 환자 신체 내에서의 펩티드 또는 폴리펩티드계 약학 조성물의 반감기, 항체 또는 이의 단편과 복합체를 형성한 제제 및 약학 조성물의 물리 화학적 특성, 약학 조성물의 투여 방식, 치료 또는 진단 대상 환자의 구체적 특징 및 치료의가 중요하다고 판단하는 기타 파라미터에 좌우된다.For intravenous administration, the formulations are preferably prepared such that the amount administered to the patient is an effective amount of about 0.1 mg to about 1000 mg of the desired composition. More preferably, the amount administered will be about 1 mg to about 500 mg of the predetermined composition. The compositions of the present invention are effective over a wide range of dosages and include specific characteristics of the disease to be treated, half-life of peptide or polypeptide-based pharmaceutical compositions in the patient's body, formulations complexed with antibodies or fragments thereof, and physicochemical properties of the pharmaceutical compositions. The mode of administration of the pharmaceutical composition, the specific characteristics of the patient to be treated or diagnosed, and other parameters that the treatment physician deems important.

경구 투여용 약학 조성물은 임의의 안정한 형태로 존재할 수 있다. 이의 예에는 정제, 액상, 에멀션, 현탁액, 시럽, 환약, 캐플릿 및 캡슐이 포함된다. 약학 조성물의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다(예, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (pub) 참고). Pharmaceutical compositions for oral administration may be in any stable form. Examples thereof include tablets, liquids, emulsions, suspensions, syrups, pills, caplets and capsules. Methods of preparing pharmaceutical compositions are well known in the art (see, eg, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (pub)).

약학 조성물은 정기적인 방출, 지속적인 방출, 규칙적인 방출 또는 연속적인 방출을 용이하게 하도록 제제화될 수도 있다. 약학 조성물은 또한 정기적인 장치, 지속적인 장치, 규칙적인 장치 또는 연속적인 장치와 같은 장치로 투여될 수도 있다.The pharmaceutical composition may be formulated to facilitate regular release, sustained release, regular release or continuous release. The pharmaceutical composition may also be administered in a device such as a regular device, a continuous device, a regular device or a continuous device.

국부 투여용 약학 조성물은 임의의 적합한 형태, 예컨대, 크림, 연고, 로션, 패치, 용액, 현탁액, 동결건조물 및 겔의 형태일 수 있다. Pharmaceutical compositions for topical administration may be in any suitable form, such as creams, ointments, lotions, patches, solutions, suspensions, lyophilisates and gels.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드를 가지는 조성물은 종래의 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제, 담체 등을 포함할 수 있다. 정제, 환약, 캐플릿 및 캡슐은 락토즈, 전분 및 스테아르산마그네슘과 같은 종래의 부형제를 포함할 수 있다. 좌제는 왁스 및 글리세롤과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 주사액은 염수와 같은 멸균된 발열원이 없는 매질을 포함하며, 완충제, 안정화제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 종래의 장코팅제도 사용할 수 있다.Compositions having antibodies and polypeptides of the invention may include conventional pharmaceutically acceptable diluents, excipients, carriers and the like. Tablets, pills, caplets and capsules may include conventional excipients such as lactose, starch and magnesium stearate. Suppositories may include excipients such as waxes and glycerol. Injectable solutions include sterile pyrogen-free media, such as saline, and may include buffers, stabilizers or preservatives. Conventional enteric coating agents can also be used.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드, 및 이의 약학 조성물은 이를 필요로 하는 환자의 질병의 영향을 완화시키는 것, 질병의 예방하는 것, 또는 질병의 진행을 억제하는 방법에 사용될 수 있다. 그러한 방법으로는 세포 회전, 염증, 자가 면역 질환, 전이, 종양 세포 또는 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제, 또는 종양을 가진 환자의 종양 세포 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포수의 증가를 억제하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법은 종양 세포 또는 백혈병 세포의 치사율을 증가시키고, 항질병제에 의한 손상에 대한 질병 세포의 감수성, 항암제에 의한 손상에 대한 종양 세포의 감수성, 또는 항암제에 의한 손상에 대한 백혈병 세포의 감수성을 변화시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 또한 종양을 가진 환자의 종양 세포의 수 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포의 수를 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 또한 세포에 HIV 유입을 저해 또는 감소시키는 것, 이러한 저해의 결과로 HIV의 복제를 차단시키는 것을 포함한다. The antibodies and polypeptides of the present invention, and pharmaceutical compositions thereof, can be used in a method of alleviating the effects of a disease in a patient in need thereof, preventing the disease, or inhibiting the progression of the disease. Such methods include inhibiting cell turnover, inflammation, autoimmune disease, metastasis, growth and / or replication of tumor cells or leukemia cells, or increasing tumor cells in patients with tumors or leukemia cells in leukemia patients. . In addition, this method increases the mortality of tumor cells or leukemia cells, increases the susceptibility of disease cells to damage by anti-drug agents, susceptibility of tumor cells to damage by anti-cancer agents, or of leukemia cells to damage by anti-cancer agents. It involves changing the sensitivity. This method also includes reducing the number of tumor cells of a patient with a tumor or the number of leukemia cells of a leukemia patient. Such methods also include inhibiting or reducing HIV influx into cells, and blocking replication of HIV as a result of such inhibition.

또한, 본 발명은 예를 들어 AML, T-ALL, B-백혈병, B-CLL, Pre-B-ALL, 다발성 골수종, 전이, HIV 감염, 심장혈관 질환, 또는 세포 회전, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이와 같은 세포 기능 또는 작용이 중요한 역할을 하는 기타 질환과 같은 다양한 질병 상태의 치료를 위한 약제의 제조 방법을 제공한다. 이러한 약제는 본 발명의 항체 및 폴리펩티드를 포함한다.In addition, the present invention is for example AML, T-ALL, B-leukemia, B-CLL, Pre-B-ALL, multiple myeloma, metastasis, HIV infection, cardiovascular disease, or cell rotation, inflammation, immune response, infection It provides a method for the manufacture of a medicament for the treatment of various disease states, such as cellular diseases such as autoimmune reactions, metastasis, or other diseases in which the role is important. Such agents include the antibodies and polypeptides of the invention.

하나의 구체예에서, 본 발명은 조직 샘플에 특이적으로 결합하는 Y1의 능력을 분석하고 Y1 결합을 KPL-1과 같은 대조군 항체에 의한 결합과 비교함에 의해 개인별 암 진단 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 개인 유래의 혈액 또는 고형 조직으로부터 세포 샘플을 분리하고, 그 세포를 황산화된 모티프-함유 에피토프("실험 항체")를 인지하는 항체 또는 이의 단편과 함께 배양하며, 비 특이적으로 결합된 항체를 세정하여 제거하고, 그 결과를 공지된 결합 활성을 가지는 대조군 항체와 같은 표준품으로 수행된 상응하는 염색 방법에 의한 결과와 비교한다. 대조군 항체는 티로신 모티프의 비황산화 형태 또는 그를 함유하는 항원을 포함하는 에피토프를 인식하는 항체이다. 종양 세포의 존재는 염색 강도로 측정시, 실험 항체 결합이 대조군에 의한 결합보다 실질적으로 더 큰 경우 탐지된다. 염색 과정은 표준 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 제1 항체는 제1 항체를 인식하고 효소에 의해 작동시 착색 반응을 일으키는 효소 기질에 접합된 제2 항체를 사용함에 의해 가시화될 수 있다. 대안으로, 실험 항체 및 대조군 항체 모두가 세포에 결합하는 경우 종양 세포가 존재하는 것으로 지시되나, 세포는 Y1은 흡수하지만 대조군 항체는 흡수하지 않는다. 하나의 구체예에서, 암은 고형 종양이다. 또다른 구체예에서, 암은 혈인성 종양이다. 바람직한 구체예에서, 실험 항체는 Y1 또는 이의 단편이거나, 관련 항체 또는 이의 단편이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 대조군 항체는 KPL1이다.In one embodiment, the present invention provides a method for individual cancer diagnosis by analyzing the ability of Y1 to specifically bind a tissue sample and comparing Y1 binding to binding by a control antibody such as KPL-1. In one embodiment, a cell sample is isolated from blood or solid tissue from an individual, and the cell is incubated with an antibody or fragment thereof that recognizes a sulfated motif-containing epitope ("experimental antibody") and is non-specific The bound bound antibody is washed away and the results are compared with the results by the corresponding staining method performed with a standard such as a control antibody with known binding activity. Control antibodies are antibodies that recognize epitopes comprising non-sulfurized forms of tyrosine motifs or antigens containing them. The presence of tumor cells is detected when experimental antibody binding is substantially greater than binding by the control, as measured by staining intensity. The staining process can be carried out by standard methods. For example, a first antibody can be visualized by using a second antibody conjugated to an enzyme substrate that recognizes the first antibody and causes a coloring reaction when operated by the enzyme. Alternatively, tumor cells are indicated when both experimental and control antibodies bind to the cells, but the cells absorb Y1 but not the control antibody. In one embodiment, the cancer is a solid tumor. In another embodiment, the cancer is a hematologic tumor. In a preferred embodiment, the experimental antibody is Y1 or a fragment thereof, or a related antibody or fragment thereof. In another preferred embodiment, the control antibody is KPL1.

또다른 구체예에서, 본 발명은 종양 세포의 존재 여부에 대하여 혈액 또는 고형 조직 유래의 세포 샘플을 검색하는 것을 포함하는 암의 진단 방법을 제공한다. 웨스턴 블롯을 Y1 또는 이의 단편, 또는 관련 항체 또는 이의 단편을 사용하는 세포 샘플에 수행한다. Y1 결합은 Y1 자체를 탐지가능한 표지로 표식함에 의해, 또는 탐지가능한 항-인간 항체를 이용하는 표준 방법에 의해 관측될 수 있다. Y1 결합이 대조군에 의한 결합보다 실질적으로 더 큰 경우에 종양 세포의 존재가 지시되고, 여기서 대조군은 상기 정의된 바와 같다. Y1 결합이 대조군에 의한 결합보다 실질적으로 더 큰 경우에 종양 세포의 존재가 지시된다.In another embodiment, the present invention provides a method of diagnosing cancer comprising searching for a sample of cells from blood or solid tissue for the presence of tumor cells. Western blots are performed on cell samples using Y1 or fragments thereof, or related antibodies or fragments thereof. Y1 binding can be observed by labeling Y1 itself with a detectable label, or by standard methods using detectable anti-human antibodies. The presence of tumor cells is indicated when Y1 binding is substantially greater than binding by the control, where the control is as defined above. The presence of tumor cells is indicated when Y1 binding is substantially greater than binding by the control.

또다른 구체예에서, 본 발명은 세포 용해물을 제조하고 그 용해물을 친화성 칼럼을 통해 통과시킴에 의한 혈인성 종양 또는 고형 종양의 단백질 마커의 식별 방법을 제공한다. 친화성 칼럼은 Y1 또는 이의 단편, 또는 관련 항체 또는 이의 단편을 혼입한다. 하나의 구체예에서, 세포 용해물은 인간으로부터 얻어진 1차 조직 샘플 유래이다. 또다른 구체예에서, 세포 용해물은 종양 세포주 유래이다. 또다른 구체예에서, 세포주는 불후화된 세포주일 수 있다.In another embodiment, the present invention provides a method of identifying protein markers of hematologic or solid tumors by preparing cell lysates and passing the lysates through an affinity column. Affinity columns incorporate Y1 or fragments thereof, or related antibodies or fragments thereof. In one embodiment, the cell lysate is from a primary tissue sample obtained from a human. In another embodiment, the cell lysate is from a tumor cell line. In another embodiment, the cell line can be an immortalized cell line.

또다른 구체예에서, 본 발명은 혈인성 종양을 가진 환자로부터 백혈구를 분리하고, 세포를 Y1과 함께 배양하며, 참고 기준에 대한 Y1 결합의 정도를 측정하는 것을 포함하는 혈인성 종양의 단계를 모니터링하는 방법을 제공한다. In another embodiment, the present invention monitors the stages of hematologic tumors comprising isolating leukocytes from patients with hematologic tumors, culturing cells with Y1, and measuring the extent of Y1 binding to a reference criterion. Provide a way to.

단백질, 예컨대 GPIb 및 PSGL-1 상에 존재하는 황산화된 티로신 에피토프에 대한 치료적 표적에 대한 대안적 접근으로서, 작은 무기 화학 소재가 적절한 조합 라이브러리의 선별에 의해 식별된다. 그러한 화학적 소재는 scFv 또는 IgG에 기초한 치료제에 비해 수많은 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 무기 소재는 구강 투여될 수 있고, 감소된 면역-교차반응성을 포함하여 향상된 바이오안전성 프로파일을 가진다. 이는 특히 초기의 선도 화합물을 최적화하기 위한 합리적 약물 디자인에 따라, 표적에 대한 강화된 선별성을 제공할 수 있다. 다른 이점은 낮은 생산 비용, 긴 반감기 및 덜 복잡한 제어 접근 방법을 포함한다.As an alternative approach to therapeutic targets for sulfated tyrosine epitopes present on proteins such as GPIb and PSGL-1, small inorganic chemical materials are identified by selection of appropriate combinatorial libraries. Such chemical materials may have numerous advantages over therapeutic agents based on scFv or IgG. For example, the inorganic material can be administered orally and has an improved biosafety profile, including reduced immuno-cross-reactivity. This may provide enhanced selectivity for the target, particularly in accordance with rational drug design to optimize early lead compounds. Other advantages include low production costs, long half-lives and less complex control approaches.

본 발명의 에피토프의 수많은 구체예가 확인되었고, 예를 들어 GIPb 및 PSGL-1 상에서, 리간드 유도 접근(ligand-driven approach)에 의해 매우 좁은 특이성을 가지는 무기 화학 소재를 식별할 수 있거나, 대안으로, 각각 에피토프를 가지는 하나 이상의 개별 표적을 포함하는, 재-관류 손상과 같은 질병 상태에 대한 하나 이상의 황산화된 티로신 에피토프를 표적한다. 리간드 유도 접근은 치료 중재용 표적을 식별하는 선별 과정을 유의하게 단축시키며, 일련의 포커스 라이브러리(focused library)에 의해 수행될 수 있는 선도 최적화와 함께 표적 확인을 동시에 가능하게 한다.Numerous embodiments of epitopes of the present invention have been identified and, for example, on GIPb and PSGL-1, an inorganic chemical material with very narrow specificity can be identified by a ligand-driven approach, or alternatively, respectively It targets one or more sulfated tyrosine epitopes for disease states such as reperfusion injury, including one or more individual targets having epitopes. Ligand-induced approaches significantly shorten the screening process of identifying targets for therapeutic intervention and simultaneously enable target identification with leading optimization that can be performed by a series of focused libraries.

황산화된 티로신 에피토프를 표적하기 위한 무기 화학 소재의 라이브러리는 먼저 Y1과 같은 항체와 GPIb의 황산화된 Tyr-276 및 Asp-277 잔기와 같은 Y1의 공지된 표적 간의 3차원 상호작용을 분석함에 의해 디자인 및 개발된다. Y1 결합 부위를 모방하고 표적에 대한 증가된 친화성을 제공하는 소재로 이루어진 화학 라이브러리가 컴퓨터 보조의 조합 라이브러리 디자인에 의해 개발될 수 있다.A library of inorganic chemical materials for targeting sulfated tyrosine epitopes is first analyzed by three-dimensional interactions between antibodies such as Y1 and known targets of Y1 such as sulfated Tyr-276 and Asp-277 residues of GPIb. Are designed and developed. Chemical libraries of materials that mimic the Y1 binding site and provide increased affinity for the target can be developed by computer-assisted combinatorial library design.

본 출원을 통해, 각종 공보, 특허 및 특허 출원이 참고된다. 이들 공보, 특허 및 특허 출원의 교시 및 개시 내용은 본 명세서에 참조 인용되어 본 발명이 속해 있는 종래 기술을 더 완전하게 기술한다. Through this application, reference is made to various publications, patents, and patent applications. The teachings and disclosures of these publications, patents, and patent applications are incorporated herein by reference to more fully describe the prior art to which this invention pertains.

하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕고 본 발명을 추가로 예시하기 위해 기술된 것이나, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하려는 것은 아니다. 특정한 시약 및 반응 조건을 기재하였으나, 본 발명의 범위에 포함되는 변형이 이루어질 수 있다. 하기의 실시예는 따라서 본 발명을 추가로 예시하기 위하여 제공된다.The following examples are set forth to aid the understanding of the present invention and to further illustrate the invention, but are not intended to limit the scope of the invention in any way. Although specific reagents and reaction conditions have been described, modifications may be made that fall within the scope of the present invention. The following examples are therefore provided to further illustrate the invention.

실시예 1 : 1차 AML 세포(R1198-3)로부터 Y1 리간드의 식별Example 1 Identification of Y1 Ligands from Primary AML Cells (R1198-3)

1.1 1차 AML 세포(M4 단계)를 환자로부터 획득하고 용해시켰다. 그 용해물에 Y1-IgG 칼럼 상의 친화 크로마토그래피를 포함하는 정제를 실시하였다(도 1 참조). 분리된 단백질을 엔도프로테이나제 Asp-N으로 침지시키고, 생성되는 펩티드 서열을 질량 분석법을 사용하여 결정하였다. 그 서열은 인간 PSGL-1 N-말단 아미노산 서열로 밝혀진 것과 동일하였다. 이러한 결과는 단계 4의 1차 AML 세포가 Y1-IgG에 결합된 PSGL-1을 발현한다는 것을 보여준다. 정제된 단백질이 Y1 인식 모티프의 티로신 2 및 3에서 황산화되었다는 것이 추가로 측정되었다(도 2 참조). 내부 대조군을 사용하여 Y1의 면역제어 효과의 특이성을 증명하였으며, 예를 들어 마우스 인터루킨-6 세크레틴의 유도는 전혀 탐지되지 않았다. 1.1 Primary AML cells (Step M4) were obtained from patients and lysed. The lysate was purified with affinity chromatography on a Y1-IgG column (see FIG. 1). The isolated protein was immersed in endoproteinase Asp-N, and the resulting peptide sequence was determined using mass spectrometry. The sequence was identical to that found with the human PSGL-1 N-terminal amino acid sequence. These results show that the primary AML cells of step 4 express PSGL-1 bound to Y1-IgG. It was further determined that the purified protein was sulfated at tyrosine 2 and 3 of the Y1 recognition motif (see FIG. 2). Internal controls were used to demonstrate the specificity of the immunomodulatory effect of Y1, for example, no induction of mouse interleukin-6 secretin was detected.

실시예 2 :항체-의존성 세포 세포독성Example 2 Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity

2.1 Y1-IgG의 효과2.1 Effect of Y1-IgG

Y1-IgG가 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 매개할 수 있는지를 측정하는 시험은 이 항체가 환자 임상 샘플 유래의 ML2(모델 시스템의 표적으로서 작용하는 AML-유래 세포주) 및 B-CLL 세포를 포함하는 각종 표적 세포의 효과기 세포 세포독성을 매개한다는 것을 보여주었다. Y1-IgG는 건강한 B-세포 및 초기 단계의 AML이 실질적으로 존재하지 않는 CD162(PSGL-1)를 통해 이들 세포 유형에 결합한다.Tests to determine whether Y1-IgG can mediate antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) have shown that the antibody can detect ML2 (AML-derived cell lines serving as targets of model systems) and B-CLL cells from patient clinical samples. It has been shown to mediate effector cell cytotoxicity of various target cells, including. Y1-IgG binds to these cell types via CD162 (PSGL-1), which is substantially free of healthy B-cells and early stage AML.

Y1-IgG ADCC에 관련된 효과기 세포 모집단을 한정하였다. Y1-IgG가 ADCC를 매개하기 위하여, 자연 킬러(NK) 세포(예, CD56+), γδ T 세포 및/또는 단핵구(CD14+)가 필요하지만, T-보조 세포(CD4+) 및 세포독성 T 세포(CD8+)는 필요하지 않다.An effector cell population related to Y1-IgG ADCC was defined. In order for Y1-IgG to mediate ADCC, natural killer (NK) cells (eg, CD56 +), γδ T cells, and / or monocytes (CD14 +) are required, but T-helper cells (CD4 +) and cytotoxic T cells (CD8 +). ) Is not necessary.

또한, 초기 활성화 마커(CD69+)의 출현, 사이토카인, 예컨대 TNFα 및 IFNγ의 분비 및 FasL의 유도에 의해 측정되는 바와 같이, 표적 세포의 부재 하에서도 Y1-IgG는 상이한 유형의 효과기 세포를 매개한다. Y1-IgG의 2차 항-인간 Fc 항체와의 과다 가교(XL)는 아폽토시스 메커니즘이 세포사에도 기여한다는 것을 증명하였다.In addition, Y1-IgG mediates different types of effector cells in the absence of target cells, as measured by the appearance of early activation markers (CD69 +), secretion of cytokines such as TNFα and IFNγ and induction of FasL. Over-crosslinking (XL) of Y1-IgG with secondary anti-human Fc antibodies demonstrated that apoptosis mechanisms also contribute to cell death.

시험관내 1차 B-CLL 세포에 대한 Y1-IgG 활성을 각종 림프암의 치료를 위해 현재 광범위하게 사용되고 있는 2개의 상업적으로 시판하는 인간화 항체: 리툭시맵(CD20에 결합함) 및 캄파스(CD52에 결합함)의 활성과 비교하였다. 리툭시맵의 B-CLL에 대한 메커니즘은 분명한 반면, 이의 CD-20 포지티브 악성 B 세포에 대한 세포독성 효과는 보체-의존성 세포독성(CDC), ADCC 및 아폽토시스의 유도 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 캄파스의 CD52-포지티브 악성 B 세포, 뿐만 아니라 B 및 T 세포에 대한 세포독성 효과는 CDC, ADCC 및 아폽토시스의 유도를 포함한다. 캄파스 투여는 모든 성숙한 정상 B 및 T 세포를 완전 제거하여, 심각한 혈액 독성을 야기 한다.Two commercially available humanized antibodies currently used extensively for the treatment of various lymph cancers: Y1-IgG activity against primary B-CLL cells in vitro: Rituximab (which binds to CD20) and Campas (CD52). Bound to) activity. While the mechanism for rituximab for B-CLL is evident, its cytotoxic effects on CD-20 positive malignant B cells may include one or more of complement-dependent cytotoxicity (CDC), ADCC and induction of apoptosis. . Cytotoxic effects on Campas' CD52-positive malignant B cells, as well as B and T cells, include induction of CDC, ADCC and apoptosis. Campas administration completely eliminates all mature normal B and T cells, causing severe hematotoxicity.

ADCC 실험을 위해, 단핵 효과기 및 표적 세포를 FICOLL®상에서 분리하고, 표적 세포를 PKH26로 표지하고, 이를 세포막의 지질 부위 내에서 형광 염료를 안정하게 혼입하였다. 그 후, 세포를 세정하고, 다양한 농도의 S15 IgG 또는 대조 항체의 존재 또는 부재하에서 24시간 동안 다양한 효과기:표적(E:T) 비율로 효과기 세포와 함께 배양시킨다. 죽은 세포를 TOPRO® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)로 염색시키고, 게이팅된 표적 세포 상에서 FACS로 분석하였다.For ADCC experiments, mononuclear effector and target cells separated on FICOLL ® and labeled target cells with PKH26, and the mixture was mixed to this to stabilize the fluorescent dye within the lipid regions of the cell membrane. Cells are then washed and incubated with effector cells at various effector: target (E: T) ratios for 24 hours in the presence or absence of various concentrations of S15 IgG or control antibody. Dyeing the dead cells with TOPRO ® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) and analyzed by FACS on gated target cells.

CDC 실험을 위해, B-CLL 환자 유래의 단핵 세포를 FICOLL® 상에서 분리하였다. 세포를 환자 혈장의 존재 또는 부재 하에, Y1-IgG 또는 대조군 항체의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 배양하였다. 아폽토시스 세포를 Annexin-PI로 염색시켰고, FACS로 분석하였다.For CDC experiments, mononuclear cells from B-CLL patients were isolated on FICOLL ® . Cells were incubated for 24 hours with or without patient plasma and with or without Y1-IgG or control antibody. Apoptotic cells were stained with Annexin-PI and analyzed by FACS.

효과기 세포 활성을 분석하기 위하여, 건강한 공여체 유래의 단핵 세포를 FICOLL® 상에서 분리하였다. 세포를 Y1-IgG 또는 대조군의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 배양하였다. αCD69(초기 활성화 마커)항체에 의한 FACS 분석을 상이한 유형의 효과기 세포에 대하여 수행하였다. TNFα 및 IFNγ와 같은 사이토카인의 분비를 ELISA로 분석하였다. To analyze effector cell activity, mononuclear cells from healthy donors were isolated on FICOLL ® . Cells were incubated for 24 hours in the presence or absence of Y1-IgG or controls. FACS analysis with αCD69 (early activation marker) antibody was performed on different types of effector cells. Secretion of cytokines such as TNFα and IFNγ was analyzed by ELISA.

아폽토시스 실험을 위하여, B-CLL 환자 유래의 단핵 새포를 FICOLL® 상에서 분리하였다. 세포를 Y1-IgG 또는 대조군의 존재 또는 부재 하에 10분 동안 37℃에 서 배양하였다. 항-인간 Fc 항체를 그 후 첨가하였고 4∼24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 질병 세포(CD19+, CD5+)를 그 후 아폽토시스 마커, Annexin-TOPRO(등록상포)로 염색하였고 FACS로 분석하였다.For apoptosis experiments, monocytes from B-CLL patients were isolated on FICOLL ® . Cells were incubated at 37 ° C. for 10 minutes with or without Y1-IgG or controls. Anti-human Fc antibody was then added and incubated at 37 ° C. for 4-24 hours. Disease cells (CD19 +, CD5 +) were then stained with an apoptosis marker, Annexin-TOPRO (registered blast) and analyzed by FACS.

Y1-IgG 및 리툭시맵의 비교 연구는 ADCC의 매개 및 B-CLL 세포에 대한 아폽토시스의 유도에 있어서 Y1-IgG가 리툭시맵에 비해 우월하다는 것을 보여준다. 캄파스®에 반해, Y1-IgG는 1차 B-CLL 세포에 대하여 CDC를 매개할 수 없음이 발견되었다. 이들 시험관내 결과는 Y1-IgG이 그의 ADCC 활성에 기초한 B-CLL의 치료를 위한 치료 제제로서 유용할 수 있다는 것을 보여준다.Comparative studies of Y1-IgG and rituximab show that Y1-IgG is superior to rituximab in mediating ADCC and inducing apoptosis on B-CLL cells. In contrast to Campas ® , it was found that Y1-IgG was not able to mediate CDC against primary B-CLL cells. These in vitro results show that Y1-IgG may be useful as a therapeutic agent for the treatment of B-CLL based on its ADCC activity.

2.1.1 1차 B-만성 림프성 백혈병(B-CLL)에서의 ADCC2.1.1 ADCC in Primary B- Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL)

Y1-IgG가 1차 B-CLL에서 ADCC를 매개하는 지를 측정하기 위하여, 여러 환자 유래의 B-CLL 세포를 상이한 효과기-표적 세포 비율로 PBMC 효과기 세포와 함께 24시간 동안 공동 배양하였다. 13 개의 상이한 B-CLL 임상 샘플의 분석 결과, Y1-IgG가 약 21.4%의 평균 범위의 세포 용해로 모든 경우에서 효과기 세포 세포독성을 매개함을 보여주었다(도 3). 13 개의 샘플 중 4개(30%)는 30% 초과의 용해를 보여준 반면, 13개의 샘플 중 오로지 2개(15%)는 10% 미만의 용해를 보여주었다. 일부 경우에서, 높은 정도의 용해가 낮은 E:T 비율에서도 관측되었고, 예를 들어, KBC171은 약 62%의 용해를 나타낸 반면, 다른 경우에서는, 낮은 정도의 용해가 높은 E:T 비율에서도 관측되었고, 예를 들어 KBC104는 약 7%의 용해를 보여주었다. 이러한 차이는 효과기 세포 샘플이 상이한 건강한 공여체 유래이고, 뿐만 아니라 B-CLL 샘플 간에도 차이가 있기 때문이다. To determine if Y1-IgG mediates ADCC in primary B-CLL, B-CLL cells from different patients were co-cultured with PBMC effector cells for 24 hours at different effector-target cell ratios. Analysis of 13 different B-CLL clinical samples showed that Y1-IgG mediated effector cell cytotoxicity in all cases with cell lysis in the average range of about 21.4% (FIG. 3) . Four out of thirteen samples (30%) showed greater than 30% dissolution, whereas only two out of thirteen samples (15%) showed less than 10% dissolution. In some cases, high levels of dissolution were observed at low E: T ratios, for example, KBC171 exhibited about 62% dissolution, while in other cases, low levels of dissolution were also observed at high E: T ratios. KBC104, for example, showed about 7% dissolution. This difference is because effector cell samples are from different healthy donors, as well as differences between B-CLL samples.

2.1.2 급성 골수성 백혈병 세포에 대해 PBMC에 의한 Y1-IgG-매개된 ADCC: PBMC는 또한 다양한 PBMC:AML의 비(Y1-IgG 10 또는 20 ㎍/㎖의 존재 하에 10, 20 또는 40)를 사용하여 환자 유래의 1차 AML 세포에 대한 ADCC에 영향을 미친다. 예를 들어, 10:1의 세포비에서, AML 세포 7.9%는 항체의 부재 하에 사멸하고, 6%는 인간 IgG의 존재 하에 사멸한다. Y1-IgG 10 및 20 ㎍/㎖의 존재 하에, AML 세포 각각 14.2% 및 17.6%가 사멸한다(도 4). 세포 독성의 정도는 Y1-IgG 농도의 증가와 함께 증가하였다(10 또는 20 ㎍/㎖). 인간 IgG는 ADCC를 유도하지 않았다. 추가 1차 AML 샘플에 대해 유사한 결과를 얻었다(데이터는 도시하지 않음). 2.1.2 Y1-IgG- mediated ADCC by PBMCs for Acute Myeloid Leukemia Cells: PBMCs also use various PBMC: AML ratios (10, 20 or 40 in the presence of Y1-IgG 10 or 20 μg / ml) Thereby affecting ADCC on primary AML cells from the patient. For example, at a cell ratio of 10: 1, 7.9% of AML cells die in the absence of antibody and 6% die in the presence of human IgG. In the presence of Y1-IgG 10 and 20 μg / ml, AML cells die 14.2% and 17.6%, respectively (FIG. 4) . The degree of cytotoxicity increased with increasing Y1-IgG concentration (10 or 20 μg / ml). Human IgG did not induce ADCC. Similar results were obtained for additional primary AML samples (data not shown).

ML-2 세포는 ADCC에 대해 좋은 모델인데, 이는 Y1-IgG가 검출 가능한 내면화를 거치지 않고 결합하기 때문이다. ML-2 cells are a good model for ADCC because Y1-IgG binds without detectable internalization.

a. ML2 ADCC는 Y1-IgG 농도와 함께 증가한다: 24시간의 항온 처리 후, 세포 독성은 표적으로 하는 비(5:1, 10:1, 20:1, 40:1)에 대해 4개의 상이한 효과기(PBMC)에서 Y1-IgG의 부재 하에서보다 이의 존재 하에 더 컸다(도 5). 이 효과는 마우스 항-PSGL-1 항체 KPL1이 Y1-IgG에 대해 치환될 때 감소하거나 부재하고, 인간 IgG(효과기 세포 상의 Fc 수용체에 결합)가 Y1-IgG 대신 사용될 때에도 감소하였다. 5 ㎍/㎖ 정도로 낮은 Y1-IgG 농도는 효과기:표적 비가 40:1일 때 ADCC를 유도할 수 있다. a. ML2 ADCC increases with Y1-IgG concentrations: After 24 hours of incubation, cytotoxicity is determined by four different effectors (5: 1, 10: 1, 20: 1, 40: 1) for the targeting ratio (5: 1, 10: 1, 20: 1, 40: 1). PBMC) was larger in the presence thereof than in the absence of Y1-IgG (FIG. 5) . This effect was reduced or absent when the mouse anti-PSGL-1 antibody KPL1 was substituted for Y1-IgG and decreased when human IgG (binding to Fc receptors on effector cells) was used instead of Y1-IgG. Y1-IgG concentrations as low as 5 μg / ml can induce ADCC when the effector: target ratio is 40: 1.

b. Y1-IgG와 KPL-1간의 경쟁: Y1-IgG(20 및 50 ㎍/㎖)는 효과기:표적 비가 20:1 및 40:1일 때 ML2 세포에 대해 ADCC를 유도하였다. 마우스 항-PSGL-1 항체 KPL-1만이 ADCC를 유도하지 않았고, 따라서 Y1-결합으로 유도된 ADCC에 대한 경쟁 인자로 사용할 수 있었다. KPL-1은 부분적으로 Y1-IgG-유도된 ADCC를 억제하였는데(도 6), 예를 들어, 세포 독성 74.1%는 Y1-IgG의 존재 하에 항온 처리 48시간 후 관찰되었고(20 ㎍/㎖; 효과기/표적 비 20:1), KPL1(20 ㎍/㎖)의 추가 존재는 세포 독성 58.8%만을 초래하였다. 따라서, ML2의 Y1-IgG-유도된 ADCC는 Y1-IgG에 의한 PSGL-1의 결합과 관련이 있다. b. Competition between Y1-IgG and KPL-1: Y1-IgG (20 and 50 μg / ml) induced ADCC on ML2 cells at effector: target ratios of 20: 1 and 40: 1. Only mouse anti-PSGL-1 antibody KPL-1 did not induce ADCC and thus could be used as a competitive factor for ADCC induced by Y1-binding. KPL-1 partially inhibited Y1-IgG-induced ADCC (FIG. 6) , for example, cytotoxicity 74.1% was observed 48 hours after incubation in the presence of Y1-IgG (20 μg / ml; effector / Target ratio 20: 1), further presence of KPL1 (20 μg / ml) resulted in only 58.8% cytotoxicity. Thus, the Y1-IgG-derived ADCC of ML2 is related to the binding of PSGL-1 by Y1-IgG.

c. Y1-IgG로 매개된 ADCC 중 자연 킬러, γδT 세포 및 단핵구의 관련성: ML2 또는 B-CLL 표적 세포의 Y1-IgG로 매개된 ADCC에 영향을 줄 수 있는 양으로 선별된 효과기 세포 능력에 대해 양으로 선별된 효과기 세포를 분석하였다. 정상 공여체 및 B-CLL 환자 유래의 자연 킬러(NK) 세포(CD56+), γδT 세포 및 세포 독성 T-세포(CD8+)는 시판되는 자석 비드를 사용하여 분리하였다. 도 7A에 도시된 바와 같이, 정상 공여체 및 B-CLL 환자 유래의 NK 세포(도 7A의 KCS 샘플)는 ML2 및 B-CLL 표적 상에서 ADCC에 영향을 줄 수 있어(도 7A의 KCS 샘플), 대조군에 비해 13∼68%의 용해율이 초래될 수 있다. 또한, γδT 세포는 ML2 세포의 ADCC를 매개하는 것으로 드러났다. 대조적으로, 세포 독성 T-세포는 Y1-IgG로 매개된 세포 독성에는 관여하지 않는 것으로 드러났다. c. Relevance of Natural Killers, γδ T Cells, and Monocytes in Y1-IgG Mediated ADCCs: Amounts for Selector Effector Cell Capability in an amount that could affect Y1-IgG mediated ADCC of ML2 or B-CLL target cells Selected effector cells were analyzed. Natural killer (NK) cells (CD56 +), γδ T cells and cytotoxic T-cells (CD8 +) from normal donors and B-CLL patients were isolated using commercially available magnetic beads. As shown in FIG . 7A , NK cells from normal donors and B-CLL patients (KCS samples in FIG. 7A ) can affect ADCC on ML2 and B-CLL targets (KCS samples in FIG. 7A ), controls In comparison with this, dissolution rate of 13 to 68% may be caused. In addition, γδ T cells have been shown to mediate ADCC in ML2 cells. In contrast, cytotoxic T-cells have not been shown to be involved in Y1-IgG mediated cytotoxicity.

PBMC 유래의 특정 세포군의 음성 선별로, NK 세포(CD56+) 및 γδT 세포 외에 CD14+ 세포(단핵구) 또한 ML2 표적에 대한 ADCC에 관여함이 드러났다(도 7B). Y1-IgG로 매개된 독성에 관여하는 모든 효과기 세포는 Fc 수용체인 CD16을 발현한다. Negative selection of specific cell populations derived from PBMC revealed that in addition to NK cells (CD56 +) and γδ T cells, CD14 + cells (monocytes) were also involved in ADCC against ML2 targets (FIG. 7B) . All effector cells involved in Y1-IgG mediated toxicity express Fc receptor CD16.

d. Y1에 의한 NK-세포의 활성: CD69의 발현으로 측정한 바와 같이 Y1은 자연 킬러 세포에 의해 ADCC를 매개한다. 6개의 건강한 공여체 유래의 효과기 세포는 Y1-IgG 또는 인간 IgG 또는 뮤린 항-CD62 항체(KPL1, PL1 또는 PL2)의 존재 하에, 또는 임의의 항체의 부재 하에(대조군) 37℃에서 24시간 동안 항온 처리하였다. 이어서 FACS 분석을 수행하고, 자연 킬러(NK) 세포(CD56+) 상의 초기 활성화 마커 CD69의 발현을 측정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, Y1-IgG에 의한 NK 세포의 활성화는 6개의 공여체 세포 모두로 매개하였다. 대조적으로, 인간 IgG 또는 항-CD162 마우스 항체 KPL1, PL1 또는 PL2에 의한 효과는 검출할 수 없었다. 사전 연구에서는 또한 효과기 세포 상에서의 FasL 발현의 유도에 이어 Y1-IgG를 이용한 항온 처리를 보였다(데이터는 나타내지 않음). d. NK-cell activity by Y1: Y1 mediates ADCC by natural killer cells as measured by the expression of CD69. Effector cells from six healthy donors were incubated for 24 hours at 37 ° C. in the presence of Y1-IgG or human IgG or murine anti-CD62 antibody (KPL1, PL1 or PL2) or in the absence of any antibody (control). It was. FACS analysis was then performed and the expression of the early activation marker CD69 on natural killer (NK) cells (CD56 +) was measured. As shown in FIG . 8 , activation of NK cells by Y1-IgG was mediated by all six donor cells. In contrast, no effect by human IgG or anti-CD162 mouse antibody KPL1, PL1 or PL2 could be detected. Prior studies also showed induction treatment with Y1-IgG following induction of FasL expression on effector cells (data not shown).

e. Y1-IgG로 유도된 아폽토시스 e. Apoptosis Induced by Y1-IgG

Y1-IgG의 존재 하에 항온 처리된 B-CLL 환자 유래의 단핵 세포(CD19+, CD5+)는 FACS 분석으로 평가했을 때, 24시간 내에 약 5%의 아폽토시스를 나타내었다(도 9). Y1-IgG를 가교하는 2차 항체의 첨가로 24시간 내에 추가 50%의 아폽토시스를 유도하였다(도 9). Mononuclear cells (CD19 +, CD5 +) from B-CLL patients incubated in the presence of Y1-IgG showed about 5% apoptosis within 24 hours as assessed by FACS analysis (FIG. 9) . The addition of a secondary antibody cross-linking Y1-IgG induced an additional 50% apoptosis within 24 hours (FIG. 9) .

이 결과는, PSGL-1 상의 황산화된 에피토프에 대한 직접적인 항체의 가교가 1차 B-CLL 세포의 아폽토시스에 대한 신호를 유발한다는 것을 제시한다. 이는 PSGL-1이 B-CLL 환자 생체내에서 아폽토시스를 유도하기 위한 표적일 수 있음을 의미하는 것으로, 가교 효과는 Fc 수용체를 보유하는 세포, 예컨대, 단핵구, CD56+ NK 세포 및 γδ+T 세포에 의해 매개될 수 있다. This result suggests that crosslinking of antibodies directly against sulfated epitopes on PSGL-1 triggers a signal for apoptosis of primary B-CLL cells. This means that PSGL-1 may be a target for inducing apoptosis in B-CLL patients in vivo, the crosslinking effect being caused by cells bearing Fc receptors such as monocytes, CD56 + NK cells and γδ + T cells Can be mediated.

상술한 아폽토시스 및 가교 효과는 항-PSGL-1 항체 KPL1을 사용하여 억제할 수 있다(데이터는 나타내지 않음). 이 항체 그 자체는 아폽토시스를 유도하지 않는다. 이는 아폽토시스 신호가 PSGL-1 상의 에피토프를 통해 매개된다는 것을 확인해 준다. The apoptosis and crosslinking effects described above can be inhibited using anti-PSGL-1 antibody KPL1 (data not shown). This antibody itself does not induce apoptosis. This confirms that the apoptosis signal is mediated through the epitope on PSGL-1.

f. 리툭시맵에 대한 B-CLL 상의 Y1-IgG의 ADCC 효과f. ADCC Effect of Y1-IgG on B-CLL on Rituximab

2개의 1차 인간 B-CLL 환자 샘플 중 Y1-IgG 항체로 유도된 세포사의 비율은 리툭시맵에 의해 얻은 것보다 유의적으로 더 높았다. 도 10은 Y1이, 리툭시맵으로 유도된 세포 독성은 10∼13%만 유도하는 것에 비해 대조군에 대한 세포 독성은 25∼35%를 유도한다는 것을 보여준다. 표적 세포 상의 수용체 분자의 포화도는 Y1-IgG 항체 10 ㎍/㎖에서 얻을 수 있지만, 동일한 농도의 리툭시맵에서는 그러하지 않았다. The rate of cell death induced with Y1-IgG antibodies in two primary human B-CLL patient samples was significantly higher than that obtained by rituximab. 10 shows that Y1 induces 25-35% of cytotoxicity for the control group compared to only 10-13% of cytotoxicity induced by rituximab. Saturation of receptor molecules on target cells can be obtained at 10 μg / ml of Y1-IgG antibody, but not at the same concentration of rituximab.

이와 함께, Y1-IgG는 B-CLL의 치료에 대한 치료제로서 가능성이 있는 후보로, 세포 독성 및 아폽토시스 효과는 이들 질병에 걸린 세포 상에서 발현되는 PSGL-1 황산화된 에피토프의 특이적인 인식에 의해 매개된다는 것을 보여주는 결과를 제시한다. In addition, Y1-IgG is a potential candidate for the treatment of B-CLL, with cytotoxicity and apoptosis effects mediated by specific recognition of PSGL-1 sulfated epitopes expressed on these diseased cells. Present results that show that

g. B-CLL 상의 Y1-IgG, 리툭시맵 및 캄파스의 CDC 효과 분석g. Analysis of CDC Effects of Y1-IgG, Rituximab and Campas on B-CLL

B-CLL 환자 유래의 단핵 세포는 환자 혈장 25%의 존재 및 부재 하에 Y1-IgG, 리툭시맵 또는 캄파스®로 항온 처리하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 캄파스®만이 CDC를 통한 1차 B-CLL 세포의 세포 독성을 매개하였다. 리툭시맵이나 Y1-IgG 어느 것도 보체 결합을 통한 세포 독성을 유도하지 않았다. Mononuclear cells from B-CLL patients were incubated with Y1-IgG, Rituximab or Campas ® in the presence and absence of 25% of patient plasma. As shown in FIG . 11 , only Campas ® mediated cytotoxicity of primary B-CLL cells via CDC. Neither rituximab nor Y1-IgG induced cytotoxicity through complement binding.

이는 Y1-IgG가 ADCC 활성에 기초하는 B-CLL의 치료용 치료제로서 유용할 수 있음을 나타내는 시험관내 실험의 결과이다. This is the result of an in vitro experiment showing that Y1-IgG may be useful as a therapeutic agent for the treatment of B-CLL based on ADCC activity.

실시예 3: Y1-IgG-M-다우노루비신 유도체Example 3: Y1-IgG-M-Danorubicin Derivatives

3.1 Y1-IgG-M-다우노루비신 유도체의 제조: 모르폴리노-독소루비신-Y1-IgG(도 13) 및 항체-M-다우노루비신 접합체(하기 참조)와 같은 항체-독소 접합체를 제조하였다. 다우노루비신은 변형되어, 2개의 상이한 링커 중 하나에 결합한 뒤, 항체의 유리 아미노기 또는 항체의 감소된 이황화 결합을 통해 항체에 결합하였다. 용어 M-DNR-LINKER는 모르필리닐다우노루비신 아세테이트의 (6-말레이미도카프로일)히드라존 및 M-DNR-AES를 뜻한다. 3.1 Preparation of Y1-IgG-M-Daunorubicin Derivatives: Antibody-toxin conjugates such as morpholino-doxorubicin-Y1-IgG (FIG. 13) and antibody-M-daunorubicin conjugates (see below) were prepared. Daunorubicin was modified to bind to one of two different linkers and then to the antibody either through the free amino group of the antibody or through reduced disulfide bonds of the antibody. The term M-DNR-LINKER refers to (6-maleimidocaproyl) hydrazone and M-DNR-AES of morpholinyldaunorubicin acetate.

a. 3'-디아미노-3'-(4-모르폴리닐)다우노루비신 아세테이트(M-DNR-Ac)의 제조 a. Preparation of 3'-diamino-3 '-(4-morpholinyl) daunorubicin acetate (M-DNR-Ac)

무수 트리에틸아민을 아르곤 하에 무수 디메틸포름아미드 중 다우노루비신 히드로클로라이드 용액에 이어 비스(2-요오도에틸)에테르에 첨가하였다. 반응 혼합물은 빛으로부터 보호하여 실온에서 36시간 동안 교반하였다. Anhydrous triethylamine was added under argon to a solution of daunorubicin hydrochloride in anhydrous dimethylformamide followed by bis (2-iodoethyl) ether. The reaction mixture was protected from light and stirred for 36 hours at room temperature.

생성된 수성 혼합물은 염화메틸렌으로 추출하였다. 유기상은 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과시키고, 건조할 때까지 증발시켰다. 미정제 생성물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 관련된 단편은 함께 모아 증발시켜, 적색 오일로서 M-DNR 유리 염기를 얻었으며, 이는 (HPLC에 의해) 98%의 순도를 보였다. 수율은 55%였다. The resulting aqueous mixture was extracted with methylene chloride. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered through celite and evaporated to dryness. The crude product was purified by silica gel column chromatography and the associated fragments were collected together and evaporated to give M-DNR free base as a red oil, which showed a purity of 98% (by HPLC). The yield was 55%.

아세트산과의 반응 후, 생성된 유리 염기는 이의 고체 아세테이트 염으로서 분리한 뒤, 동결 건조시켰다. M-DNR-Ac는 -20℃에서 아르곤 하에 12개월 이상 안정 하였다. After reaction with acetic acid, the resulting free base was isolated as its solid acetate salt and then lyophilized. M-DNR-Ac was stable for more than 12 months under argon at -20 ° C.

b. 모르필리닐다우노루비신 아세테이트의 (6-말레이미도카프로일)히드라존의 제조b. Preparation of (6-maleimidocaproyl) hydrazone of morpholinyldaunorubicin acetate

6-말레이미도카프로일히드라지드는 아르곤 하에 무수 메탄올 중 M-DNR-Ac 용액에 이어 트리플루오로아세트산에 첨가하였다. 투명한 용액은 빛으로부터 보호하고, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 6-maleimidocaproylhydrazide was added to trifluoroacetic acid followed by a solution of M-DNR-Ac in anhydrous methanol under argon. The clear solution was protected from light and stirred at room temperature for 24 hours.

메탄올 용액은 감압 하에 25℃에서 건조할 때까지 증발시켜, 무수 메탄올 중에 용해된 적색의 오일성 잔류물을 얻었다. 이 용액에, 무수 에테르를 첨가하고, 침전된 적색 고체는 원심 분리로 분리하였다. 무수 에테르로 3회 분쇄한 뒤 순도 98% 및 수율 88%의 순수 결정질 생성물을 얻었고, 고진공 하에 건조시키고, -20℃에서 아르곤 하에 유지시켰다. 모르필리닐다우노루비신 아세테이트의 (6-말레이미도카프로일)히드라존은 -20℃에서 아르곤 하에 4개월 이상 안정하다. The methanol solution was evaporated to dryness at 25 ° C. under reduced pressure to give a red oily residue dissolved in anhydrous methanol. To this solution, anhydrous ether was added and the precipitated red solid was separated by centrifugation. After trituration with anhydrous ether three times, pure crystalline product of 98% purity and 88% yield was obtained, dried under high vacuum and kept under argon at -20 ° C. The (6-maleimidocaproyl) hydrazone of morpholinyldaunorubicin acetate is stable for at least 4 months under argon at -20 ° C.

c. 모르폴리노다우노루비신의 아디프산 모노히드라존의 N-히드록시숙신이미드 에스테르(M-DNR-AES)의 제조 c. Preparation of N-hydroxysuccinimide Ester (M-DNR-AES) of Adipic Acid Monohydrazone of Morpholinodaunorubicin

1. 모르폴리노다우노루비신의 아디프산 모노히드라존의 제조1. Preparation of Adipic Acid Monohydrazone of Morpholinodaunorubicin

모르폴리노다우노루비신 아세테이트 염, 무수 MeOH, 새로 제조한 메탄올계 용액(히드라지도아디프산 히드로클로라이드 및 Et3N 및 TFA 저장 용액)은, 1시간 동안 빛으로부터 보호하면서, Ar 하에 실온에서 합하고 교반하였다. Morpholinodaunorubicin acetate salt, anhydrous MeOH, freshly prepared methanol-based solution (hydrazidoadipic acid hydrochloride and Et3N and TFA stock solution) were combined and stirred at room temperature under Ar while protecting from light for 1 hour. .

용매는 감압 하에 제거하고, 생성된 잔류물은 NH4OAc:AN에 용해시키고, 세미프렙 HPLC 컬럼에 주입하였다. 혼합물은 등용매 조건 하에 세척하고 농축시켰다. 소정의 생성물은 약 4.5분 후에 수거하고, C-18 Sep Pak 카트리지로 농축시켰다. 생성물은 용출시키고, 동결 건조시키고, Ar 하에 -20℃에서 저장하였다. 생성물은 수율 80% 및 순도 95%의 적색 고체로 얻었다. The solvent was removed under reduced pressure and the resulting residue was dissolved in NH 4 OAc: AN and injected into a semiprep HPLC column. The mixture was washed under isocratic conditions and concentrated. The desired product was collected after about 4.5 minutes and concentrated on a C-18 Sep Pak cartridge. The product was eluted, lyophilized and stored at −20 ° C. under Ar. The product was obtained as a red solid with a yield of 80% and a purity of 95%.

2. 모르폴리노다우노루비신의 아디프산 모노히드라존의 N-히드록시숙신이미드 에스테르의 제조 2. Preparation of N-hydroxysuccinimide ester of adipic acid monohydrazone of morpholino-daunorubicin

무수 THF 중 히드록시숙신이미드 및 무수 THF 중 DCC를 무수 THF 중 모르폴리노다우노루비신의 아디프산 모노히드라존에 첨가하였다. 투명하고 적색인 용액은 Ar 하에 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응의 끝은 분석 HPLC로 결정하였고, 용매는 제거하였다. 이어서 빙 고체(glacial solid)를 완충액(N-메틸모르폴리늄 아세테이트/AN)에 용해시키고, 면(cotton)을 통해 여과시켰다. Hydroxysuccinimide in anhydrous THF and DCC in anhydrous THF were added to the adipic acid monohydrazone of morpholinodaudanorubicin in anhydrous THF. The clear and red solution was stirred for 24 h at room temperature under Ar. The end of the reaction was determined by analytical HPLC and the solvent was removed. The glacial solid was then dissolved in buffer (N-methylmorpholinium acetate / AN) and filtered through cotton.

생성물은 RP-HPLC로 분리하고, n-메틸모르폴리늄 아세테이트 용액 2 부피로 희석시키고, Sep-Pak 상에 로딩하였다(900 ㎎). 생성물은 용출시키고 동결 건조시켜, 수율 73% 및 순도 97.4%의 분말을 얻었다. The product was separated by RP-HPLC, diluted with 2 volumes of n-methylmorpholinium acetate solution and loaded on Sep-Pak (900 mg). The product was eluted and lyophilized to give a powder of 73% yield and 97.4% purity.

d. M-DNR-Y1-IgG 접합체의 제조d. Preparation of M-DNR-Y1-IgG Conjugates

무수 DMF 중 M-DNR-LINKER를 M-DMR-LINKER/Y1-IgG 몰비 23에서 MAb 용액에 첨가하였다. 혼합물은 아르곤 하에 실온에서 밤새 부드럽게 교반한 뒤, 원심 분리하였다. 상청액은 SPIN-X 튜브(Costar)를 통해 여과시키고, 1시간 동안 실온에서 Bio-Beads SM-2(Biorad)로 교반하였다. 혼합물은 10분간 그대로 두었다. 상청액은 PBS로 평형화한 PD-10 컬럼(Pharmacia)를 통해 통과시켰다. 접합체는 합한 단백질 함유 분획 및 PBS로 용출시켰다. 정제된 접합체는 SPIN-X 여과로 살균하였다. 접합 체 용액은 -70℃에서 동결시켜 저장하였다. 생성물 접합체는 수율 45∼50%로 얻었고, 다음의 특성을 가졌다: 응집체 5%; 흡수되고 비공유 결합으로 연결된 M-DNR 유도체 2∼5%; 항체에 대한 약물의 평균 분자비 4. M-DNR-LINKER in anhydrous DMF was added to the MAb solution at a M-DMR-LINKER / Y1-IgG molar ratio 23. The mixture was gently stirred overnight at room temperature under argon and then centrifuged. The supernatant was filtered through a SPIN-X tube (Costar) and stirred with Bio-Beads SM-2 (Biorad) at room temperature for 1 hour. The mixture was left for 10 minutes. Supernatants were passed through a PD-10 column (Pharmacia) equilibrated with PBS. The conjugate was eluted with the combined protein containing fractions and PBS. Purified conjugates were sterilized by SPIN-X filtration. The conjugate solution was stored frozen at -70 ° C. Product conjugates were obtained in yields 45-50% and had the following properties: 5% aggregates; 2-5% of M-DNR derivatives which are absorbed and linked by non-covalent bonds; Average molecular ratio of drug to antibody 4.

e. (Fc 영역 중 S-S 결합의 환원을 통한) M-DNR-Y1IgG 접합체의 제조 e. Preparation of M-DNR-Y1IgG Conjugates (via Reduction of S-S Bonds in the Fc Region)

NaCl, MES 및 EDTA로 이루어진 완충액 중 Y1-IgG를 동일한 완충액 중 시스테아민 히드로클로라이드 용액(Merck)에 첨가하였다. 반응 혼합물은 아르곤 하에 1.5시간 동안 37℃에서 항온 처리하였다. 반응 혼합물은 PBS/EDTA로 평형화한 PD-10 컬럼(Sephadex G-25, Pharmacia) 상에 로딩하였다. 환원된 단백질은 PBS/EDTA로 용출시켰다. 단백질 농도가 가장 높은 분획을 합하고, 4℃에서 저장하였다. 항체에 대한 유리 설프히드릴기의 분자 비는 적어도 3.5였다. 모르필리닐다우노루비신 아세테이트의 (6-말레이미도카프로일)히드라존은 DMF 중에 용해시키고, 환원된 단백질 용액에 첨가하고, 4℃에서 30분간 항온 처리하였다. 반응 혼합물은 PBS로 사전 평형화한 PD-10 컬럼을 통해 통과시킨 뒤, PBS로 용출시켰다. 단백질 분획을 합한 뒤, SPIN-X 여과(Coster)로 살균하였다. 정제된 접합체는 분취시켜, -70℃에서 저장하였다. 생성물 접합체는 ∼50%의 수율로 얻었고, 다음의 특징을 가졌다: 응집체 5% 이하; 유리 M-DNR 유도체 1∼2%; 항체에 대한 약물의 평균 분자비 4. Y1-IgG in a buffer consisting of NaCl, MES and EDTA was added to the cysteamine hydrochloride solution (Merck) in the same buffer. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 1.5 h under argon. The reaction mixture was loaded onto a PD-10 column (Sephadex G-25, Pharmacia) equilibrated with PBS / EDTA. The reduced protein was eluted with PBS / EDTA. Fractions with the highest protein concentrations were combined and stored at 4 ° C. The molecular ratio of free sulfhydryl group to antibody was at least 3.5. The (6-maleimidocaproyl) hydrazone of morpholinyldaunorubicin acetate was dissolved in DMF, added to the reduced protein solution and incubated at 4 ° C. for 30 minutes. The reaction mixture was passed through a PD-10 column pre-equilibrated with PBS and then eluted with PBS. Protein fractions were combined and then sterilized by SPIN-X filtration (Coster). Purified conjugates were aliquoted and stored at -70 ° C. The product conjugate was obtained in a yield of ˜50% and had the following characteristics: aggregate 5% or less; 1-2% free M-DNR derivative; Average molecular ratio of drug to antibody 4.

f. (S-S 결합의 환원을 통한) IgG-Y1-M-DNR 접합체의 제조f. Preparation of IgG-Y1-M-DNR Conjugates (via Reduction of S-S Binding)

IgG-Y1은 EDTA 중 PD-10 컬럼(Sephadex-25M, Pharmacia)를 통해 이를 통과시키고 PBS/EDTA 중에 용출시켜 환원시켰다. 단백질-함유 분획은 모았다. 항체에 대한 유리 설프히드릴기의 분자 비는 6 이상이었다. 무수 디메틸포름아미드 중 모르 필리닐다우노루비신 아세테이트의 (6-말레이미도카프로일)히드라존은 DMF 중에 용해시켰고, 환원된 단백질에 첨가하였다. 용액은 30분간 4℃에서 항온 처리하였다. 단백질 접합체는 PBS 중 PD-10 컬럼 상에서 정제하고, 단백질 분획은 SPIN-X 분획(Corning Life Sciences)로 살균시켰다. 접합체는 -70℃에서 동결시켜 저장하였다. 수율은 원 항체와 비교했을 때 약 50%였다. 최종 생성물은 응집체 5% 이하를 함유하였고, 유리 M-DNR은 0∼2%였으며, 항체에 대한 약물의 평균 분자 비는 7이었다.IgG-Y1 was reduced by passing it through a PD-10 column (Sephadex-25M, Pharmacia) in EDTA and eluting in PBS / EDTA. Protein-containing fractions were collected. The molecular ratio of free sulfhydryl group to antibody was 6 or more. (6-maleimidocaproyl) hydrazone of morpholinyldaunorubicin acetate in anhydrous dimethylformamide was dissolved in DMF and added to the reduced protein. The solution was incubated at 4 ° C. for 30 minutes. Protein conjugates were purified on PD-10 columns in PBS and protein fractions were sterilized with SPIN-X fractions (Corning Life Sciences). The conjugate was stored frozen at -70 ° C. The yield was about 50% compared to the original antibody. The final product contained 5% or less aggregates, the free M-DNR was 0-2%, and the average molecular ratio of drug to antibody was 7.

3.2 Y1-IgG-M-DNR 유도체에 대한 세포 독성(도 12∼14): Y1-약물 접합체의 특이적인 세포 독성 효과는 반고체(METHOCULTTM; StemCell Technologies Inc., Vancouver BC, Canada) 클론원성 분석으로 평가하였다. 세포(제대혈 또는 1차 AML 환자 샘플로부터의 CD34+ 줄기 세포)는 37℃에서 1시간 동안 최대 농도 10-6 M에서 유리 또는 접합된 약물과 함께 항온 처리하였다. 콜로니를 계수한 뒤, 세포는 세척하고, METHOCULTTM에 뿌리고, 10∼12일간 성장시켰다. 소과 (b)-IgG-M-DNR은 비특이적인 접합체 대조군으로 사용하였다. 3.2 Cytotoxicity to Y1-IgG-M-DNR Derivatives (FIGS. 12-14): The specific cytotoxic effects of Y1-drug conjugates were analyzed by clonality assays (METHOCULT ™ ; StemCell Technologies Inc., Vancouver BC, Canada). Evaluated. Cells (CD34 + stem cells from umbilical cord blood or primary AML patient samples) were incubated with free or conjugated drug at a maximum concentration of 10 −6 M for 1 hour at 37 ° C. After counting colonies, cells were washed, sprinkled with METHOCULT ™ and grown for 10-12 days. Bovine (b) -IgG-M-DNR was used as a nonspecific conjugate control.

결과(도 13)는 제대혈 샘플 상의 접합체 Y1-IgG-M-DNR의 한정된 효과를 나타냈다. 즉, 적어도 대조군 세포 뿐 아니라 생존한 Y1-IgG-M-DNR 1 μM의 존재 하에 비-표적 세포(건강한 CD34+ 줄기 세포)를 항온 처리하였고, 세포는 b-IgG-M-DNR 1 μM 또는 M-DNR 0.1 μM의 존재 하에 항온 처리하였다(즉, 유리 약물의 비치사 투여량). 따라서, 모든 제대혈 샘플에서 유의적인 효과를 볼 수 없었다. Results (FIG. 13) showed the limited effect of conjugate Y1-IgG-M-DNR on cord blood samples. That is, non-target cells (healthy CD34 + stem cells) were incubated at least in the presence of control cells as well as 1 μM of surviving Y1-IgG-M-DNR, and the cells were b-IgG-M-DNR 1 μM or M- Incubated in the presence of 0.1 μM of DNR (ie, non-fatal dose of free drug). Therefore, no significant effect was seen in all cord blood samples.

대조적으로, AML 샘플(M7 거대세포 백혈병)에서는, 동일한 농도에서의 비특 이적인 b-IgG-M-DNR 접합체와 비교했을 때, Y1-IgG-M-DNR이 콜로니 성장 억제를 3배 더 억제하였다(도 13). 즉, Y1-IgG-M-DNR 1 μM은 대조군(단독으로 항온 처리된 표적 세포)에 비해 1차 AML 세포의 생존도를 40% 감소시킨 반면, M-DNR 0.1 μM 및 b-IgG-M-DNR 1 μM 각각은 대조군에 비해 1차 AML 세포의 생존도를 80% 감소시켰다. In contrast, in AML samples (M7 giant cell leukemia), Y1-IgG-M-DNR inhibited colony growth inhibition three times as compared to nonspecific b-IgG-M-DNR conjugates at the same concentration. (FIG. 13) . That is, 1 μM of Y1-IgG-M-DNR reduced 40% survival of primary AML cells compared to the control (target cells alone incubated), while 0.1 μM of M-DNR and b-IgG-M- Each 1 μM of DNR reduced the viability of primary AML cells by 80% compared to the control.

Y1-IgG-M-DNR 접합체의 특이성은, Y1-IgG-M-DNR 1 μM으로 항온 처리한 뒤, 1차 AML-M4 및 AML-M5 세포(환자 유래임)로부터의 콜로니 형성이 대조군에 비해 각각 60% 및 35% 억제한다는 것을 나타내는 유사한 실험으로 추가 입증하였다(도 14). 대조적으로, 모든 AML-M4 세포 및 78%의 AML-M5 세포는 콜로니를 발생시킨 뒤 h-IgG-M-DNR 1 μM로 항온 처리하였다. M-DNR 1 μM로 항온 처리한 세포는 콜로니를 발생시키지 않았는데, 이는 세포가 약물에 대해 감수성이 있음을 확인시켜 주는 것이다. The specificity of the Y1-IgG-M-DNR conjugate was that incubation with 1 μM of Y1-IgG-M-DNR, followed by colony formation from primary AML-M4 and AML-M5 cells (patient derived) compared to the control. Further evidence was demonstrated by similar experiments showing 60% and 35% inhibition, respectively (FIG. 14) . In contrast, all AML-M4 cells and 78% of AML-M5 cells developed colonies and then incubated with 1 μM of h-IgG-M-DNR. Cells incubated with 1 μM of M-DNR did not generate colonies, confirming that the cells are drug sensitive.

Y1 에피토프를 발현하지 않는 B-ALL 세포(Y1을 결합하는 데 실패한 것으로 평가됨)는 Y1-IgG-M-DNR에 대해 감수성이 없으며, 따라서 콜로니를 발생시킨 뒤 대조군과 동일한 속도로 Y1-IgG-M-DNR로 항온 처리하였다(도 15). B-ALL cells that do not express Y1 epitopes (assessed that they failed to bind Y1) are not susceptible to Y1-IgG-M-DNR, and thus develop Y-IgG-M at the same rate as the control group after developing colonies. Incubated with -DNR (FIG. 15) .

실시예 4 : Y1 인식 모티프 및 황산화 Example 4 Y1 Recognition Motif and Sulfation

GPIb에 대한 Y1-scFv의 결합에 대한 티로신 황산화의 잠재 효과를 평가하기 위해, GPIb를 발현하는 인간 만성 골수종 백혈병 세포주 KU812를 소듐 클로레이트 100 mM의 존재 하에 황산화-유리 배지에서 성장시켜 황산화를 억제하였다. 사용된 조건 하에, 티로신 황산화는 단백질 합성 및 다른 번역후 변형에 영향을 미치지 않 고 최대 95% 억제되었다. 도 16A에 도시된 바와 같이, KU812 세포에 대한 Y1-scFv의 결합은, 소듐 클로레이트가 부족한 완전 배지에서 성장시킨 대조군 세포와 비교했을 때, 소듐 클로레이트가 있는 배지에서 성장시켰을 때 50% 감소하였다. 동일한 조건 하에서, 황산염이 결핍된 세포 상에서의 GPIb의 표면 발현은, 마우스 항-GPIb 모노클로날 항체 AK2-FITC를 사용하는 FACS 분석에서 나타난 바와 같이 불변하였다(도 16B). To assess the latent effect of tyrosine sulfate on the binding of Y1-scFv to GPIb, human chronic myeloma leukemia cell line KU812 expressing GPIb was grown in sulfated-glass medium in the presence of 100 mM sodium chlorate and sulfated. Was suppressed. Under the conditions used, tyrosine sulfate was inhibited by up to 95% without affecting protein synthesis and other posttranslational modifications. As shown in FIG . 16A , the binding of Y1-scFv to KU812 cells was reduced by 50% when grown in medium with sodium chlorate as compared to control cells grown in complete medium lacking sodium chlorate. . Under the same conditions, surface expression of GPIb on cells deficient in sulfate was unchanged as shown by FACS analysis using mouse anti-GPIb monoclonal antibody AK2-FITC (FIG. 16B) .

티로신 황산화 변형이 GPIb에 대한 Y1-scFv 결합에 중요한 역할을 하는지를 더 평가하기 위해, GPIb의 잔기 273∼285를 기준으로 다양한 합성 펩티드를 혈소판에 대한 Y1-scFv의 결합을 억제하는 능력에 대해 평가하였다. To further assess whether tyrosine sulfate modifications play an important role in Y1-scFv binding to GPIb, various synthetic peptides are evaluated for their ability to inhibit the binding of Y1-scFv to platelets based on residues 273-285 of the GPIb. It was.

요컨대, 펩티드는 ABIMED AMS-422 다중 펩티드 합성제를 사용하는 고상 방법론으로 합성하였으며, 필요할 경우, 티로신 황산화는 FMOC-Try 나트륨염을 사용하여 혼입시켰다. 합성 펩티드는 Lichrosorb RP-18 컬럼을 사용하여 정제하였다. Y1-scFv 혈소판 결합 분석을 위해, 합성 펩티드(2.5, 25 또는 200 μM) 및 Y1-scFv(10 ㎍)의 혼합물을 세척과 함께 항온 처리하였다. 세척 후, 혈소판은 R-피코에리스린으로 표지된 항-scFv로 항온 처리하고, 세척한 뒤, FACS로 분석하였다. In sum, peptides were synthesized by a solid phase methodology using ABIMED AMS-422 multipeptide synthesis, and if necessary tyrosine sulfate was incorporated using FMOC-Try sodium salt. Synthetic peptides were purified using Lichrosorb RP-18 column. For Y1-scFv platelet binding assays, a mixture of synthetic peptides (2.5, 25 or 200 μM) and Y1-scFv (10 μg) was incubated with washing. After washing, platelets were incubated with anti-scFv labeled R-phycoerythrin, washed and analyzed by FACS.

도 17A에 도시된 바와 같이, 25 μM에서의 펩티드 DLYSDYSYSPE(서열 번호 4) (3개의 황산화된 티로신 포함)는 혈소판에 대한 Y1-scFv의 결합을 효과적으로 억제하지만, 상응하는 황산화되지 않은 대조군 DLYDYYPE(서열 번호 5)는 200 μM에서도 효과를 보이지 않았다. 또한, 25 μM에서 각각의 펩티드 DLYSDYYPE(서열 번호 6), DLYSDYSYPE(서열 번호 7) 및 DLYSDYYSPE(서열 번호 8) (각각 첫 번째, 첫 번째 및 두 번째, 및 첫 번째 및 세 번째 티로신에서 황산화됨)는 Y1-scFv 결합을 효과적으로 억제하였다. 펩티드 DLYDYSYSPE(서열 번호 9) 및 DLYDYYSPE(서열 번호 10) (각각 두 번째 및 세 번째, 및 세 번째 티로신에서 황산화됨)은 200 μM에서도 Y1-scFv 결합에 대한 효과를 보이지 않았다(도 17A). 이들 결과는 GPIb 중 Tyr-276(즉, "첫 번째" 티로신 위치)에서의 황산화가 유의적인 경쟁을 위해 중요하며, 따라서 GPIb에 대한 Y1-scFv 결합에 대해서도 중요하다는 것을 명백하게 입증한다. As shown in FIG . 17A , peptide DLY S DY S Y S PE (SEQ ID NO: 4) (including three sulfated tyrosine) at 25 μM effectively inhibits the binding of Y1-scFv to platelets, but the corresponding The unsulfated control DLYDYYPE (SEQ ID NO: 5) showed no effect at 200 μM. Furthermore, at 25 μM each peptide DLY S DYYPE (SEQ ID NO: 6), DLY S DY S YPE (SEQ ID NO: 7) and DLY S DYY S PE (SEQ ID NO: 8) (first, first and second, respectively), and Sulfated in the first and third tyrosine) effectively inhibited Y1-scFv binding. Peptides DLYDY S Y S PE (SEQ ID NO: 9) and DLYDYY S PE (SEQ ID NO: 10) (sulfated at second and third, and third tyrosine, respectively) showed no effect on Y1-scFv binding even at 200 μM (FIG. 17A) . These results clearly demonstrate that sulfation at Tyr-276 (ie, the "first" tyrosine position) in GPIbs is important for significant competition and therefore also important for Y1-scFv binding to GPIb.

GPIb의 잔기 273∼285 영역 내에서 추가 아미노산이 Y1-scFv 결합에 기여하는 지를 평가하기 위해, 펩티드 DLYSDYYPE에 기초한 치환 돌연변이 펩티드를 Y1-scFv 혈소판 결합 분석에서 시험하였다(도 17B). 황산화된 Tyr-276이 음으로 전하된 Glu 잔기로 치환될 경우, DLYSDYYPE와는 대조적으로, 돌연변이 펩티드 DLEDYYPE(서열 번호 11)는 혈소판에 대한 Y1-scFv 결합을 실질적으로 억제하지 않는다. 유사하게, 각각 Glu, Asn 및 Ala로 치환된 Asp-277을 가지는 돌연변이 펩티드 DLYSEYYPE (서열 번호 12), DLYSNYYPE(서열 번호 13) 및 DLYSAYYPE(서열 번호 14)는 혈소판에 대한 Y1-scFv 결합을 실질적으로 억제할 수 없었다. 반면, Leu-275의 Ala(DAYSDYYPE) (서열 번호 15)로의 치환 및 아미노산 278∼280[DLYSDFYPE(서열 번호 16), DLYSDAYPE(서열 번호 17), DLYSDYYAE(서열 번호 18) 및 DLYSDYYPA(서열 번 호 19)]의 다양한 치환으로, DLYSDYYPE와 실질적으로 동일한 방식으로 혈소판에 대한 Y1-scFv 결합을 모두 억제하는 돌연변이 펩티드를 얻었다(도 17B). To assess whether additional amino acids contribute to Y1-scFv binding within the residues 273-285 region of GPIb, substitutional mutant peptides based on peptide DLY S DYYPE were tested in the Y1-scFv platelet binding assay (FIG. 17B) . When sulfated Tyr-276 is substituted with a negatively charged Glu residue, in contrast to DLY S DYYPE, the mutant peptide DLEDYYPE (SEQ ID NO: 11) does not substantially inhibit Y1-scFv binding to platelets. Similarly, the mutant peptides DLY S EYYPE (SEQ ID NO: 12), DLY S NYYPE (SEQ ID NO: 13), and DLY S AYYPE (SEQ ID NO: 14) with Asp-277 substituted with Glu, Asn, and Ala, respectively, yield Y1 for platelets. -scFv binding could not be substantially inhibited. In contrast, the substitution of Leu-275 with Ala (DAY S DYYPE) (SEQ ID NO: 15) and amino acids 278-280 [DLY S DFYPE (SEQ ID NO: 16), DLY S DAYPE (SEQ ID NO: 17), DLY S DYYAE (SEQ ID NO: 18) ) And DLY S DYYPA (SEQ ID NO: 19)] yielded mutant peptides that inhibit both Y1-scFv binding to platelets in substantially the same manner as DLY S DYYPE (FIG. 17B) .

혈소판 결합 억제 분석을 확인하기 위해, 정제된 글리코칼리신에 대한 Y1-scFv 결합의 억제에 대해 돌연변이 펩티드를 또한 시험하였다(도 18A). 요컨대, 미량적정 플레이트 상에 고정된 글리코칼리신을 Y1-scFv(5 ㎍/㎖) 및 펩티드(25 μM)와 함께 항온 처리하였다. 세척 후, 결합된 Y1-scFv는 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-래빗 IgG 항체 및 폴리클로날 항-scFv(scFv 혼합물과 래빗의 면역화에 의해 생성됨)를 사용하고, ELISA 리더기로 450 nm에서 흡광도를 읽어 검출하였다. To confirm platelet binding inhibition assays, mutant peptides were also tested for inhibition of Y1-scFv binding to purified glycocalycin (FIG. 18A) . In short, glycocalicin immobilized on microtiter plates was incubated with Y1-scFv (5 μg / ml) and peptide (25 μM). After washing, bound Y1-scFv uses anti-rabbit IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase and polyclonal anti-scFv (generated by immunization of the scFv mixture with the rabbit) and 450 nm with an ELISA reader. The absorbance was read and detected at.

글리코칼리신 결합 억제 분석에서 얻은 결과(도 18A)는 GPIb의 황산화된 Tyr-276 및 인접 잔기 Asp-277 둘 다 Y1-scFv 결합에 중요하다는 것을 나타내며, 따라서 혈소판 결합 억제 분석에서 얻은 결과를 확인하였다(도 17A 및 B). 추가 확인은 CovaLink Plates에 공유적으로 커플링된 펩티드에 대한 Y1-scFv의 직접 결합을 ELISA에 의해 평가하여 얻었다(도 18B). 이 연구는, 실질적으로 모두 Y1-scFv에 의해 직접 결합할 수 있는, 275, 278, 279 또는 280 위치에서의 치환을 갖거나 또는 황산화되지 않은 Tyr-278 또는 Tyr-279를 갖는 돌연변이 펩티드와는 대조적으로, 황산화된 Tyr-276 또는 Asp-277의 치환을 갖는 GPIb-유래된 돌연변이 펩티드가 실질적으로 Y1-scFv에 의해 직접 결합할 수 없음을 나타냈다. The results obtained in the glycocalycin binding inhibition assay (FIG. 18A) indicate that both sulfated Tyr-276 and the adjacent residue Asp-277 of GPIb are important for Y1-scFv binding, thus confirming the results obtained in platelet binding inhibition assay. (FIGS. 17A and B) . Further confirmation was obtained by assessing by ELISA the direct binding of Y1-scFv to the peptide covalently coupled to CovaLink Plates (FIG. 18B) . This study differs from mutant peptides with substitutions at positions 275, 278, 279 or 280 or with unsulfated Tyr-278 or Tyr-279, all of which can be directly bound by Y1-scFv. In contrast, it was shown that GPIb-derived mutant peptides with substitutions of sulfated Tyr-276 or Asp-277 are substantially incapable of direct binding by Y1-scFv.

PSGL-1의 잔기 42∼58을 기초로 한 합성 펩티드를 사용하는 유사한 직접 결합 실험으로, PSGL-1 티로신 황산화가 Y1-scFv 결합에 중요하다는 것을 확인하였다(도 19 참조). 구체적으로, PSGL-1 서열 QATEYEYLDYDFLPETE(서열 번호 20) 중 세 번째 티로신 위치의 황산화로 인해 상응하는 황산화되지 않은 대조군 펩티드에 비해 Y1-scFv 결합 활성이 약 100%가 되었다(도 20 참조). 대조적으로, 두 번째 티로신 위치에서 동일한 직선형 펩티드에 대한 황산화는 대조군에 비해 약 40%의 결합만 주고, 세 번째 티로신 위치에서의 황산화는 대조군과 실질적으로 구별할 수 없는 결합 활성을 준다. Similar direct binding experiments using synthetic peptides based on residues 42-58 of PSGL-1 confirmed that PSGL-1 tyrosine sulfate was important for Y1-scFv binding (see FIG. 19 ). Specifically, the sulfation of the third tyrosine position in the PSGL-1 sequence QATEYEYLDYDFLPETE (SEQ ID NO: 20) resulted in about 100% Y1-scFv binding activity compared to the corresponding unsulphated control peptide (see FIG. 20 ). In contrast, the sulfation of the same linear peptide at the second tyrosine position only gives about 40% binding compared to the control, and the sulfation at the third tyrosine position results in substantially indistinguishable binding activity from the control.

이와 함께, GPIb 및 PSGL-1를 기초로 한 합성 펩티드를 사용하여 얻은 결과는, X가 임의의 아미노산을 나타내고, YS는 황산화된 티로신을 나타내는 모티프 DXYSD(서열 번호 21) 내에서 발견된 서열 YSD가 이의 에피토프에 대한 Y1 결합을 위해 중요하다는 것을 나타냈다. In addition, the results obtained using synthetic peptides based on GPIb and PSGL-1 were found in the motif DXY S D (SEQ ID NO: 21), wherein X represents any amino acid and Y S represents sulfated tyrosine. Shown that the sequence Y S D is important for Y1 binding to its epitope.

여러 단백질이 모티프 DXYSD 및/또는 고도로 산성인 환경 내에서 발견된 서열 YSD를 함유함은 알려져 있다(도 21). 이러한 산성 환경은 생체내 티로신 황산화에 대해 중요하다고 간주된다. GPIb 및 PSGL-1에서 나타낸 바와 같이, Y1은 상기 황산화된 서열에서 상기 단백질에 결합할 수 있음이 예측된다. It is known that several proteins contain the motif DXY S D and / or the sequence Y S D found in a highly acidic environment (FIG. 21) . This acidic environment is considered important for tyrosine sulfate in vivo. As shown in GPIb and PSGL-1, it is predicted that Y1 can bind to the protein in the sulfated sequence.

4.2 Y1은 고형 암종 항원에 결합하지만 KPL-1은 결합하지 않음: 소세포 폐 암종(SCLC) 세포주 용해물에 대한 웨스턴 블로팅을 수행하여, Y1 및 시판되는 마우스 항-PSGL-1 항체 KPL1에 대한 결합을 비교하였다(도 22). 단일 광역 밴드가 Y1 블로팅에 대해 관찰되었지만, KPL1 블로팅에서는 어떠한 밴드도 관찰되지 않았다. 이는 SCLC 환자에서 Y1을 사용하는 면역요법에 대한 표적으로서 PSGL-1을 적용할 수 있음을 나타내는 것이다. 4.2 Y1 binds to solid carcinoma antigen but no KPL-1: Western blotting on small cell lung carcinoma (SCLC) cell line lysates was performed to bind to Y1 and commercial mouse anti-PSGL-1 antibody KPL1 Were compared (FIG. 22) . A single wide band was observed for Y1 blotting, but no band was observed for KPL1 blotting. This indicates that PSGL-1 can be applied as a target for immunotherapy using Y1 in SCLC patients.

실시예 5 : PSGL-1를 통한 Y1-IgG-매개된 세포내이입작용Example 5 Y1-IgG-Mediated Endocytosis Via PSGL-1

PSGL-1은 AML 환자의 혈액 세포 상에 고도로 발현된다. 하기 결과는, Y1이 특이적으로 인식되고, PSGL-1을 발현하는 종양 세포에 의해 내면화됨을 나타낸다. 시판되는 KPL-1(항-PSGL-1)은 종양 세포에 결합하지만, 내면화되지는 않는다. 이는, PSGL-1을 AML 환자에서 Y1을 사용하는 면역요법에 대한 표적으로 적용할 수 있음을 나타낸다. PSGL-1 is highly expressed on blood cells of AML patients. The following results indicate that Y1 is specifically recognized and internalized by tumor cells expressing PSGL-1. Commercially available KPL-1 (anti-PSGL-1) binds to tumor cells but is not internalized. This indicates that PSGL-1 can be applied as a target for immunotherapy using Y1 in AML patients.

5.1 공초점 현미경 연구: 환자의 백혈구 세포는 FICOLL® 구배로 분리하였다. 세포는 상이한 시간 간격으로 37℃에서 형광 항-PSGL-1 항체(Y1 또는 시판되는 항체 KPL1 및 PL1)의 존재 하에 항온 처리하였다. 형관 항체 국재화는 공초점 현미경에 의한 세포의 가시화에 의해 생세포에서 측정하였다. 5.1 Confocal Microscopy Study: Patient white blood cells were isolated by FICOLL ® gradient. Cells were incubated in the presence of fluorescent anti-PSGL-1 antibodies (Y1 or commercially available antibodies KPL1 and PL1) at 37 ° C. at different time intervals. Coronary antibody localization was measured in live cells by visualization of cells by confocal microscopy.

도 23 및 24는 공초점 현미경으로 가시화한 뒤 37℃에서 2시간 동안 Y1-PE(왼쪽), KPL1-PE(중간) 및 Y1-IgG-FITC(오른쪽)와 함께 세포를 항온 처리한 환자의 AML 생세포를 도시한다. 세포는 3차원 방식(X, Y 및 X 평면)으로 스캐닝하였고, 본원에 제시된 사진은 Z 평면에 대해 구의 중심으로부터 찍었다. 도시된 바와 같이, 하기 항온 처리 Y1-IgG는 세포의 내부 부분에 존재하는 반면(핵은 아님), KPL1은 세포막에 존재하며 내면화되지는 않았다. 23 and 24 show AML of patients incubated with Y1-PE (left), KPL1-PE (middle) and Y1-IgG-FITC (right) for 2 hours at 37 ° C. after visualization with confocal microscopy. Live cells are shown. Cells were scanned in three-dimensional fashion (X, Y and X planes) and the photos presented here were taken from the center of the sphere with respect to the Z plane. As shown, the following incubated Y1-IgG is present in the inner part of the cell (not the nucleus), while KPL1 is present in the cell membrane and not internalized.

5.1 형광 현미경 연구: 환자의 백혈구 세포는 FICOLL 구배로 분리하였다. 세포는 상이한 시간 간격으로 37℃에서 Y1-IgG의 존재 하에 항온 처리하였다. Y1-IgG의 검출을 위해, 세포를 고정시키고, 투과시킨 뒤, 로다민으로 표지된 항-인간(Fc) 항체로 염색하였다. 이 세포는 형광 현미경으로 가시화하였다. 5.1 Fluorescence Microscopy Study: Patient leukocyte cells were isolated by FICOLL gradient. Cells were incubated in the presence of Y1-IgG at 37 ° C. at different time intervals. For detection of Y1-IgG, cells were fixed, permeated and stained with anti-human (Fc) antibody labeled with rhodamine. These cells were visualized by fluorescence microscopy.

도 25 및 26은 공초점 현미경으로 가시화한 뒤 37℃에서 2시간 동안 Y1-IgG-FITC(왼쪽) 및 KPL1-PE(오른쪽)로, 및 항-CD34-PE 또는 FITC로 세포를 항온 처리한 CD34+ 생세포(각각 건강한 골수 및 건강한 제대혈로부터 얻음)를 보여준다. 도시한 바와 같이, Y1-IgG는 정상 CD34+ 줄기 세포에 결합하지 않았다. 대조적으로, 하측 오른쪽 패널 중 몇몇 세포가 이중 염색된 것으로 입증되듯이, KPL-1-PE는 CD34+ 세포를 비롯하여 정상 세포를 표지하였다. 25 and 26 show CD34 + incubated with Y1-IgG-FITC (left) and KPL1-PE (right) and anti-CD34-PE or FITC for 2 hours at 37 ° C. after visualization with confocal microscopy. Live cells (obtained from healthy bone marrow and healthy cord blood, respectively) are shown. As shown, Y1-IgG did not bind to normal CD34 + stem cells. In contrast, KPL-1-PE labeled normal cells, including CD34 + cells, as some cells in the lower right panel demonstrated double staining.

5.3 세포내이입작용의 모니터링: Y1-IgG의 세포 표면 결합은 항체의 존재 하에 4℃에서 (내면화의 활성 과정을 억제하는) NaN3 0.1%로 세포를 항온 처리한 뒤 검출하였다. 37℃에서 10분∼2시간(NaN3 없음) 동안의 항온 처리로, 캡핑(capping)과 패칭(patching) 및 내면화된 염색이 초래되었다. 공초점 현미경 또는 형광 현미경을 사용하여 상이한 AML 샘플로 유사한 사진을 얻었다. 5.3 Monitoring of Endocytosis: Cell surface binding of Y1-IgG was detected after incubation of cells with 0.1% NaN 3 (which inhibits the active process of internalization) at 4 ° C. in the presence of antibody. Incubation at 37 ° C. for 10 minutes to 2 hours (without NaN 3 ) resulted in capping, patching and internalized staining. Similar pictures were obtained with different AML samples using confocal microscopy or fluorescence microscopy.

도 27은 상이한 시간 동안 37℃ 또는 4℃에서 비표지된 Y1-IgG로 항온 처리한 AML 환자 샘플 유래의 4개의 개별 세포를 보여준다. 도시한 바와 같이, Y1-IgG의 세포 표면 결합은 항체의 존재 하에 4℃에서 NaN3 0.1%로 세포를 항온 처리한 뒤 검출하였다. 37℃에서 10분∼2시간(NaN3 없음) 동안 Y1-IgG의 항온 처리로, 캡핑과 패칭 및 내면화된 염색이 초래되었다. 내면화는 시간에 따라 증가하였다. 4℃에서 유지된 세포에서는 내면화가 관찰되지 않았다. Y1-IgG는 로다민으로 표지된 항-인간(Fc) 항체로 검출하였다. 세포의 가시화는 형광 현미경으로 수행하였다. 27 shows four individual cells from AML patient samples incubated with unlabeled Y 1 -IgG at 37 ° C. or 4 ° C. for different times. As shown, cell surface binding of Y1-IgG was detected after incubation of cells with 0.1% NaN 3 at 4 ° C. in the presence of antibody. Incubation of Y1-IgG at 37 ° C. for 10 minutes to 2 hours (without NaN 3 ) resulted in capping, patching, and internalized staining. Internalization increased with time. Internalization was not observed in cells maintained at 4 ° C. Y1-IgG was detected with anti-human (Fc) antibodies labeled with rhodamine. Visualization of cells was performed by fluorescence microscopy.

5.4 산성 스트리핑(stripping): 글리신 50 mM(pH 2.5)을 이용한 세포 처리로 Y1-IgG의 세포 표면 결합을 제거하고, 내면화된 Y1-IgG의 검출이 가능하였다. 5.4 Acidic Stripping: Cell treatment with glycine 50 mM (pH 2.5) removed the cell surface binding of Y1-IgG and allowed for detection of internalized Y1-IgG.

도 28은 37℃에서 1시간 동안 비표지된 Y1-IgG로 항온 처리한 AML 환자의 세포를 보여준다. 이어서 하측 열에 도시된 세포는 글리신 50 mM, pH 2.5로 5분간 실온에서 항온 처리하여, 표면에 결합된 Y1-IgG를 제거하였다. 도시한 바와 같이, 상측 패널은 세포 표면 캡핑 및 패칭을 나타내며, 내면화된 Y1-IgG를 나타낸다. 하측 패널에서는, 단지 내면화된 Y1-IgG가 검출되었다. FIG. 28 shows cells of AML patients incubated with unlabeled Y1-IgG for 1 hour at 37 ° C. FIG. Cells shown in the lower row were then incubated with glycine 50 mM, pH 2.5 at room temperature for 5 minutes to remove Y1-IgG bound to the surface. As shown, the top panel shows cell surface capping and patching and shows internalized Y1-IgG. In the lower panel, only internalized Y1-IgG was detected.

5.5 프로나제: 단백질 가수분해 효소인 프로나제로 세포 표면 단백질을 제거하여, Y1-IgG의 세포 표면 결합을 제거하고, 내면화된 Y1-IgG를 검출할 수도 있었다. 5.5 Pronase: Pronase, a proteolytic enzyme, was used to remove cell surface proteins, eliminate cell surface binding of Y1-IgG, and detect internalized Y1-IgG.

도 29는 37℃에서 1시간 동안 비표지된 Y1-IgG로 항온 처리한 AML 환자의 세포를 도시한다. 그 뒤 하측 열에 도시된 세포를 1 ㎎/㎖로 실온에서 60분간 항온 처리하여, 표면에 결합된 Y1-IgG를 제거하였다. 도시된 바와 같이, 상측 패널에는, 세포 표면 캡핑과 패칭 및 내면화된 Y1-IgG가 나타나 있다. 하측 패널에서는, 내면화된 Y1-IgG만이 검출되었다. 유로포드(uropod)는 프로나제에 의해 제거되는데, 이는 CD162의 Y1-IgG 가교로 형성된 유로포드가 세포 표면의 외측 표면 상에 형성되었음을 의미하는 것임에 유념해야 한다. FIG. 29 depicts cells of AML patients incubated with unlabeled Y1-IgG for 1 hour at 37 ° C. FIG. The cells shown in the lower row were then incubated at 1 mg / ml for 60 minutes at room temperature to remove Y1-IgG bound to the surface. As shown, the top panel shows cell surface capping and patching and internalized Y1-IgG. In the lower panel, only internalized Y1-IgG was detected. Europods are removed by pronase, which is to be noted that the europods formed by the Y1-IgG crosslinking of CD162 were formed on the outer surface of the cell surface.

5.6 코팅된 구덩이(Coated-pit)로 매개된 세포내이입작용: 수용체로 매개되는 세포내이입작용는 코팅된 구덩이를 통해 일어날 수 있다. 코팅된 구덩이-매개된 세포내이입작용는 Y1-IgG로 항온 처리하기 전 37℃에서 15분간 수크로스 0.45 M로 세포를 항온 처리하여 차단할 수 있다. 이 방법으로, 세포 표면에 대한 Y1-IgG의 결합에 영향을 주지 않고 Y1-IgG의 세포내이입작용를 억제하였다. 5.6 Coated-pit Mediated Endocytosis : Receptor-mediated endocytosis can occur through coated pits. Coated pit-mediated endocytosis can be blocked by incubating the cells with sucrose 0.45 M at 37 ° C. for 15 minutes prior to incubation with Y1-IgG. In this way, the endocytosis of Y1-IgG was inhibited without affecting the binding of Y1-IgG to the cell surface.

도 30은 4℃(도 30A) 또는 37℃(도 30B)에서 1시간 동안 비표지된 Y1-IgG로 항온 처리한 AML 환자의 세포를 도시한다. 이어서 가운데 열에 도시되어 있는 세포를 실온에서 5분간 글리신 50 mM pH 2.5로 항온 처리하여, 표면에 결합된 Y1-IgG를 제거하였다. 도시한 바와 같이(도 30A), 상측 패널은 Y1-IgG의 세포 표면 염색을 나타낸다. 표면에 결합된 Y1-IgG는 산으로 세척하여 제거하였다(가운데 패널). 37℃(도 30B)에서, 캡핑과 패칭 및 Y1-IgG의 내면화를 관찰하였다(상측 패널). 산 세척으로 세포 표면에 결합된 Y1-IgG를 제거하였으며, 내면화된 항체만을 검출할 수 있었다(가운데 패널). 30 depicts cells of AML patients incubated with unlabeled Y 1 -IgG for 1 hour at 4 ° C. (FIG. 30A) or 37 ° C. (FIG. 30B) . The cells shown in the middle column were then incubated with glycine 50 mM pH 2.5 at room temperature for 5 minutes to remove Y1-IgG bound to the surface. As shown (FIG. 30A) , the top panel shows cell surface staining of Y1-IgG. Y1-IgG bound to the surface was removed by washing with acid (center panel). At 37 ° C. (FIG. 30B) capping and patching and internalization of Y 1 -IgG were observed (top panel). Acid washing removed Y1-IgG bound to the cell surface and only internalized antibodies could be detected (center panel).

코팅된 구덩이로 매개되는 세포내이입작용의 차단(하단 열)은 Y1-IgG로 항온 처리하기 전 37℃에서 15분간 수크로스 0.45 M로 세포를 항온 처리하여 얻었다. 하측 패널에 도시된 바와 같이, 수크로스 0.45 M를 이용한 세포의 처리는 4℃에서 세포에 대한 Y1-IgG의 결합에는 영향을 주지 않았으나(도 30A), 37℃에서의 내면화는 억제하였다(도 30B). Blocking of endocytosis mediated by coated pits (bottom row) was obtained by incubating the cells with 0.45 M sucrose for 15 minutes at 37 ° C. before incubating with Y1-IgG. As shown in the lower panel, treatment of cells with sucrose 0.45 M did not affect the binding of Y1-IgG to cells at 4 ° C. (FIG. 30A) , but inhibited internalization at 37 ° C. (FIG. 30B ).

실시예 6: 백혈구-혈소판 상호작용의 Y1-IgG-억제Example 6: Y1-IgG-inhibition of leukocyte-platelet interaction

혈관 표면에 대한 백혈구의 접착으로, 재관류 손상, 발작, 장간막 및 말초 혈관 질환을 비롯한 다양한 질환; 장기 이식 및 순환성 쇼크로 인한 장기 손상이 초래된다. 재관류 손상은 아마도 트롬빈 및 사이토카인에 의한 혈소판 및 내피의 활성으로 인해 부분적으로 뇌허혈 부분 중 혈관 내피에 대한 백혈구의 접착과 관련 이 있는데, 이는 백혈구에 대한 표면 접착성을 부여한다. 재관류 손상의 주요 개시제는 폰 빌레브란트 인자(vWF)와 혈소판 GPIb 수용체 간의 상호작용이다. 관상 동맥 폐색을 완화시키기 위한 혈전 용해제, 예컨대, 조직 플라스미노겐 활성인자 및 스트렙토키나제로 치료 중인 심장병 환자는 재관류 손상으로 인한 심근 괴사를 앓을 수도 있다. 따라서, 혈관 표면에 대한 백혈구 접착을 줄일 수 있고 심장혈관 질환의 결과를 개선시키기 위해 혈전 용해제와 함께 투여할 수 있는 약물에 대한 요구가 존재한다. Adhesion of leukocytes to the surface of blood vessels, resulting in various diseases including reperfusion injury, seizures, mesentery and peripheral vascular disease; Organ damage from organ transplantation and cyclic shock is caused. Reperfusion injury is probably related to the adhesion of leukocytes to the vascular endothelium in the cerebral ischemic area, in part due to the activity of platelets and endothelial by thrombin and cytokines, which confer surface adhesion to leukocytes. The main initiator of reperfusion injury is the interaction between von Willebrand factor (vWF) and platelet GPIb receptors. Heart disease patients being treated with thrombolytic agents such as tissue plasminogen activators and streptokinase to alleviate coronary artery occlusion may suffer from myocardial necrosis due to reperfusion injury. Thus, there is a need for drugs that can be administered with thrombolytic agents to reduce leukocyte adhesion to the blood vessel surface and improve the outcome of cardiovascular disease.

Y1(scFv 및 전체 IgG)는 혈소판(즉, GPIb) 및 백혈구(예, PSGL-1) 상에서 뚜렷한 황산화된 분자에 결합하기 때문에, 이 항체는 다양한 세포-세포 상호 작용을 억제하기 위한 치료제로서의 잠재성을 가진다. Because Y1 (scFv and total IgG) binds distinct sulfated molecules on platelets (ie GPIb) and leukocytes (eg PSGL-1), this antibody is a potential therapeutic agent for inhibiting various cell-cell interactions. Have a last name

도 31은 Y1-scFv가 ML2 세포(PSGL-1을 발현하는 세포주에서 유래한 인간 AML)에 대한 활성화된 인간 혈소판의 결합을 효과적으로 억제한다는 것을 도시한다. 최적의 억제는 항체를 혈소판과 ML2 세포와 함께 동시에 항온 처리할 때 얻어지지만, 부분 억제는 항체를 처음에는 혈소판 또는 ML2 세포로 항온 처리한 뒤, 결합되지 않은 항체를 제거하고, 이어서 잔여 세포 형태를 첨가하여 얻어진다(도 31). 31 shows that Y1-scFv effectively inhibits the binding of activated human platelets to ML2 cells (human AML derived from cell lines expressing PSGL-1). Optimal inhibition is obtained when the antibody is incubated simultaneously with platelets and ML2 cells, while partial inhibition is initially incubated with platelets or ML2 cells, then the unbound antibody is removed, and then the remaining cell morphology is removed. It is obtained by addition (FIG. 31) .

도 31은, 뮤린 항체 KPL1(인간 PSGL-1 N-말단 도메인에 대해 유도되지만, 티로신 황산화 의존적이지는 않음) 또한 ML2에 대해 활성화된 혈소판의 결합은 효과적으로 억제하지만, Y1-scFv에 의한 것보다는 그 억제가 더 적다는 것을 보여준다. 이는 Y1-scFv가 그러했듯이, KPL1이 두 세포 형태 상에 존재하는 에피토프를 인식 하지 않는다는 사실 때문일 수 있다. 뮤린 항체, 즉 인간 PSGL-1에 대해 또한 유도되는 PL2 항체를 이용한 억제는 관찰되지 않았다(도시하지 않음). Figure 31 shows that murine antibody KPL1 (induced for human PSGL-1 N-terminal domain, but not tyrosine sulfation dependent) also effectively inhibits binding of activated platelets to ML2, but rather than with Y1-scFv Shows that the inhibition is less. This may be due to the fact that KPL1 does not recognize epitopes present on both cell types, as Y1-scFv did. Inhibition with murine antibodies, ie PL2 antibodies, also induced against human PSGL-1 was not observed (not shown).

실시예 7: 유출(flow) 조건 하에 고정된 P-셀렉틴 상에서 세포 회전의 Y1-IgG-억제 Example 7: Y1-IgG-inhibition of cell rotation on fixed P-selectin under flow conditions

리간드로 코팅된 기질을 제조하기 위해, 재조합 인간 (rh)-P-셀렉틴(R & D Systems, Minneapolis, MN)을 코팅 배지(비카르보네이트 20 mM로 보충된 PBS, pH 8.5) 중 0.2∼1.0 ㎍/㎖으로 희석시키고, 4℃에서 밤새 폴리스티렌 플레이트 상으로 즉시 흡수시킨 뒤, 인간 혈청 알부민(Calbiochem) 2 ㎍/㎖를 함유하는 PBS를 4℃에서 1시간 동안 세척하였다. To prepare a substrate coated with a ligand, recombinant human (rh) -P-selectin (R & D Systems, Minneapolis, MN) was added with 0.2 to 0.2 in coating medium (PBS supplemented with 20 mM bicarbonate, pH 8.5). After diluting to 1.0 μg / ml and immediately absorbing onto polystyrene plates overnight at 4 ° C., PBS containing 2 μg / ml of human serum albumin (Calbiochem) were washed at 4 ° C. for 1 hour.

층류 분석을 위해, 정제된 리간드가 고정된 폴리스티렌 플레이트를 전술한 바와 같이 평행한 플레이트 층류 챔버에서 모았다(Lawrence & Springer, Cell 65, 859-873 (1991)). 인간 호중구(덱스트란 침강 및 FICOLL에 대한 밀도 분리에 의한 항응고된 혈액에서 분리함) 또는 ML-2 세포는 H/H 배지(행크 균형 염 용액, HEPES 10 mM) 중에서 세척하고, 2 x 106 세포/㎖에서 세포 결합 배지(CaCl2 2 mM로 보충된 H/H 배지)에 재현탁시키며, 자동화된 주사기 펌프를 이용하여 발생된, 소정의 유속에서 벽 전단 응력을 발생시키는 속도로 흐름 챔버(flow chamber)를 통해 실온에서 관류시켰다(Harvard Apparatus, Natick, MA). 시험 접착성 기질의 상류측에 도달했을 때, 유속이 증가하여 전단 응력은 1 dyn/cm2이 되었으며, 모든 세포 상호작용은 역 주기 명암 현미경의 10배 대물렌즈를 사용하여(Diaphot 300, Nikon Inc., Tokyo, Japan), 2개의 상이한 관찰 범위(각 면적 중 0.17 mm2)에서 가시화하였다. 백혈구의 순간 속도를 분석하기 위해 전술한 바와 같이 영상화 시스템 WSCAN-Array-3(Galai, Migdal-Ha'emek, Israel)을 사용하였다(Dwir et al., J. Biol. Chem. 275, 18682-18691 (2000)). For laminar flow analysis, the purified ligand-immobilized polystyrene plates were collected in parallel plate laminar flow chambers as described above (Lawrence & Springer, Cell 65, 859-873 (1991)). Human neutrophils (isolated from anticoagulated blood by dextran sedimentation and density separation for FICOLL) or ML-2 cells are washed in H / H medium (Hank Balanced Salt Solution, HEPES 10 mM), 2 x 10 6 Resuspend in cell / ml cell binding medium (H / H medium supplemented with CaCl 2 2 mM) and flow chamber (at a rate to generate wall shear stress at a predetermined flow rate, generated using an automated syringe pump). perfusion at room temperature through a flow chamber (Harvard Apparatus, Natick, MA). Upon reaching the upstream side of the test adhesive substrate, the flow rate increased to a shear stress of 1 dyn / cm 2 , and all cell interactions were performed using a 10-fold objective of a reverse cycle contrast microscope (Diaphot 300, Nikon Inc.). , Tokyo, Japan), visualized in two different observation ranges (0.17 mm 2 in each area). The imaging system WSCAN-Array-3 (Galai, Migdal-Ha'emek, Israel) was used to analyze the instantaneous velocity of white blood cells (Dwir et al., J. Biol. Chem. 275, 18682-18691). (2000)).

시험 범위에서의 회전 백혈구의 축적은 컴퓨터화된 세포 움직임 추적으로 측정하였다. 회전 세포의 빈도는 초기 구속 후 3초 이상 지속되는 접착성 기질 상에서 지속적으로 회전을 개시하는 세포 유출로부터의 세포 수로 정의하였다. 세포는 상이한 농도에서 항체와 함께 항온 처리하였고, 동일한 농도의 항체를 함유하는 결합 배지와 함께 흐름 챔버로 재관류시켰다. 세포 회전은 제제의 후속 세척("세척된") 또는 제제의 존재 하에 분석하였다. Accumulation of rotatory white blood cells in the test range was measured by computerized cell movement tracking. The frequency of rotating cells was defined as the number of cells from cell efflux that consistently initiated rotation on the adhesive substrate lasting at least 3 seconds after initial confinement. Cells were incubated with the antibodies at different concentrations and reperfused into the flow chamber with binding medium containing the same concentration of antibody. Cell rotation was analyzed in the subsequent washing of the formulation (“washed”) or in the presence of the formulation.

영상화 분석을 위해, 상이한 접착성 기질 상에서의 세포 회전의 동시 속도의 정량적 분석을 위한 영상화 시스템을 개발하였다. 768 x 574 픽셀(10배 대물렌즈를 사용한 1.15 ㎛의 픽셀 크기)로 구성된 비디오 프레임 영상은 Matrox Pulsar frame grabber(Matrox Graphics Inc., Dorval, Quebec, Canada)를 사용하여 디지털화하였고, 영상은 Atlas pentium MMX-200 work station에서 운영하여 WSCAN-Array-3 영상화 소프트웨어(Galai, Migdal-Ha'emek, Israel)로 스캐닝하고 처리하였다. 세포 움직임은 0.02초 간격으로 추적하면서 영상으로부터 확인하였다. 프로그램 출력물은 0.02초 간격의 연속적인 비월주사(interlace) 범위에서 각 세포의 중심점의 좌표를 제공하였다. For imaging analysis, an imaging system was developed for quantitative analysis of the simultaneous rate of cell rotation on different adhesive substrates. Video frame images consisting of 768 x 574 pixels (1.15 μm pixel size using a 10x objective) were digitized using Matrox Pulsar frame grabber (Matrox Graphics Inc., Dorval, Quebec, Canada), and the images were Atlas pentium MMX It was run at -200 work station and scanned and processed with WSCAN-Array-3 imaging software (Galai, Migdal-Ha'emek, Israel). Cell movements were confirmed from the images with tracking at 0.02 second intervals. The program output provided the coordinates of the center point of each cell in the continuous interlace range at 0.02 second intervals.

세포 움직임 분석용 컴퓨터 프로그램은 David Malah 교수의 실험실(Electric Engineering Faculty, Technion, Haifa, Israel)에서 정교하게 개발되었다. 이 소프트웨어는 Matlab 5.2 하에 운영하여, 최대 5초간 연속 비디오 이미지로 개별 세포의 순간 위치를 비교한다. 리간드로 코팅된 범위에서 꾸준하게 회전하고 급격한 움직임으로 이 범위를 통해 움직이는 개별 세포의 한계는 흐름 방향에서 동시 세포 속도의 변화에 따라 결정하였다. 회전 중지는 전단 응력 1∼1.75 dyn/cm2에서 29 ㎛/초 이하로 떨어진 동시 속도로 정의하였다. 이 역치 속도 값은 컴퓨터화 시스템에 의해 및 비디오 모니터로부터 직접 수동으로 대표적인 세포 상에서 수행된 중지 분석 간의 최적 관련성으로 얻었다. 개별 회전 세포의 연속 중지 사이의 단계 간격을 평균하여, 소정의 회전 세포의 평균 단계 간격을 산출하였다. The computer program for cell motion analysis was elaborated in David Malah's laboratory (Electric Engineering Faculty, Technion, Haifa, Israel). The software runs under Matlab 5.2, comparing the instantaneous position of individual cells with a continuous video image for up to 5 seconds. The limits of the individual cells that steadily rotate in the ligand-coated range and move through this range with rapid movement were determined by changes in the simultaneous cell velocity in the flow direction. Rotational stop was defined as the simultaneous velocity falling below 29 μm / sec at shear stress 1-1.75 dyn / cm 2 . This threshold rate value was obtained with the optimal relationship between stop assays performed on representative cells manually by computerized system and directly from the video monitor. The step intervals between successive stops of individual rotating cells were averaged to yield the average step intervals of a given rotating cell.

도 32는 저밀도(0.2 ㎍/㎖)에서 고정된 rh-P-셀렉틴 상에서 ML2 세포 회전에 대한 Y1-scFv(10 ㎍/㎖)의 효과를 도시한다. 전단력 1 dyn/cm2에서, 필드 당 회전 세포의 수는 Y1-scFv의 존재 하에 전체적으로 근절된다는 것이 분석에서 드러났다. 동일한 양의 scFv-N06(음성 대조군)를 사용할 경우, 어떠한 효과도 얻지 못하였다. 32 depicts the effect of Y1-scFv (10 μg / ml) on ML2 cell rotation on immobilized rh-P-selectin at low density (0.2 μg / ml). At shear force of 1 dyn / cm 2 , the analysis revealed that the number of rotatory cells per field is eradicated entirely in the presence of Y1-scFv. When the same amount of scFv-N06 (negative control) was used, no effect was obtained.

도 33은 다양한 전단력에서 고밀도(1.0 ㎍/㎖)에서 고정된 rh-P-셀렉틴 상에서 ML2 세포 회전에 대한 Y1-scFv(10 ㎍/㎖)의 효과를 도시한다. 전단력 1, 5 및 10 dyn/cm2에서, 필드 당 회전 세포의 수는 Y1-scFv의 존재 하에 각각 83%, 98% 및 100% 억제하였음이 분석에서 드러났다. 세포를 세척한 뒤 Y1-scFv로 항온 처리하고, 이어서 시험할 경우(Y1 세척), 어떠한 효과도 음성 대조군, N06로 얻지 못하였다. 33 shows the effect of Y1-scFv (10 μg / ml) on ML2 cell rotation on immobilized rh-P-selectin at high density (1.0 μg / ml) at various shear forces. At shear forces of 1, 5 and 10 dyn / cm 2 , the analysis revealed that the number of rotatory cells per field inhibited 83%, 98% and 100% in the presence of Y1-scFv, respectively. Cells were washed and then incubated with Y1-scFv and subsequently tested (Y1 wash), no effect was obtained with the negative control, N06.

도 34는 다양한 전단 응력에서 고정된 rh-P-셀렉틴(1 ㎍/㎖) 상에서 회전하는 ML2 세포 상의 Y1-IgG(1 ㎍/㎖)의 효과를 도시한다. 전단력 1 dyn/cm2에서 세포 회전은 89%로 억제되고, 전단력 5 및 10 dyn/cm2에서의 세포 회전은 100%로 억제된다는 것이 분석에서 드러났다. 세포를 세척한 뒤 Y1-IGG로 항온 처리하고, 이어서 시험할 경우(Y1-IgG 세척), 전단력 1, 5 및 10 dyn/cm2에서 각각 세포 회전을 46%, 48% 및 54% 억제하였다. 뮤린 항-PSGL-1 항체 KPL1은 또한 모든 전단력에서 세포 회전을 100% 억제할 수 있었다. 34 depicts the effect of Y1-IgG (1 μg / ml) on ML2 cells spinning on immobilized rh-P-selectin (1 μg / ml) at various shear stresses. The analysis revealed that cell turnover at shear force 1 dyn / cm 2 is suppressed to 89% and cell turnover at shear forces 5 and 10 dyn / cm 2 to 100%. Cells were washed and then incubated with Y1-IGG and then tested (Y1-IgG wash), inhibiting 46%, 48% and 54% cell rotation at shear forces 1, 5 and 10 dyn / cm 2 , respectively. The murine anti-PSGL-1 antibody KPL1 was also able to inhibit cell rotation 100% at all shear forces.

도 35는 고밀도(1.0 ㎍/㎖)에서 고정된 rh-P-셀렉틴 상에서의 인간 호중구 회전에 대한 Y1-scFv의 증가하는 농도의 효과를 보여준다. 전단력 1 dyn/cm2에서, 1, 5 및 10 ㎍/㎖의 Y1-scFv는 각각 회전 호중구의 수를 20%, 81% 및 100% 억제하였음이 분석에서 나타났다. 35 shows the effect of increasing concentrations of Y1-scFv on human neutrophil rotation on immobilized rh-P-selectin at high density (1.0 μg / ml). At shear force of 1 dyn / cm 2 , 1, 5 and 10 μg / ml of Y1-scFv inhibited 20%, 81% and 100% of neutrophils, respectively.

도 36은 고밀도(1.0 ㎍/㎖)에서 고정된 rh-P-셀렉틴 상에서의 인간 호중구 회전에 대한 Y1-IgG의 효과를 보여준다. 전단력 1 dyn/cm2에서의 필드 당 회전 호중구의 수는 Y1-IgG(1 ㎍/㎖)의 존재 하에 전체적으로 근절(100% 억제)된다는 것이 분석에서 나타났다. KPL-1에서도 유사한 결과를 얻었다. 36 shows the effect of Y1-IgG on human neutrophil rotation on immobilized rh-P-selectin at high density (1.0 μg / ml). The analysis showed that the number of rotative neutrophils per field at shear force 1 dyn / cm 2 is totally eradicated (100% inhibition) in the presence of Y1-IgG (1 μg / ml). Similar results were obtained with KPL-1.

실시예 8 : 무기 화합물 라이브러리의 스크리닝Example 8 Screening of Inorganic Compound Libraries

특이적 수용체(단백질)로부터 유래된 합성 황산화 펩티드(공지된 펩티드의 아미노산 서열 내 소정의 특이적인 티로신 잔기 상에 황산화됨)는 카프론산과 같은 짧은 링커를 통해 합성 펩티드에 커플링되는 비오틴 태그(비오티닐화)로 제조할 수 있다. 동일한 합성 펩티드를 사용하는 대조군 펩티드는 황산화 및 비오틴 태그("B") 없이 제조할 수 있다. 또한, 다른 관련이 없는 단백질로부터 유래된 합성 황산화 펩티드는 추가 대조군으로서 비오틴 태그("C")를 갖지 않고서 제조할 수 있다. Synthetic sulfated peptides derived from specific receptors (proteins) (sulfated on certain specific tyrosine residues in the amino acid sequences of known peptides) are biotin tags that are coupled to the synthetic peptides via short linkers such as capronic acid ( Biotinylation). Control peptides using the same synthetic peptide can be prepared without sulfated and biotin tags (“B”). In addition, synthetic sulfated peptides derived from other unrelated proteins can be prepared without the biotin tag (“C”) as an additional control.

상기 비오티닐화 펩티드("A")는 스트렙타비딘으로 코팅된 자석 비드에 커플링시킨 뒤, 과량의 비결합된 비오티닐화 펩티드는 세척해 내었다. 비오틴-스트렙타비딘 펩티드 접합체("D")는 "A"에 결합하는 분자에 대한 생리적 조건(37℃, pH 7.0∼7.4, 염 농도, 전도성 등) 하에 과량의 비황산화된 대조군 펩티드("B")의 존재 하에 작은 화학 실체 라이브러리에 대해 스크리닝할 수 있다. 그 뒤, 커플링된 자석 비드는 완충액으로 2회 세척하고, 매번 원심 분리하여 과량의 비결합된 분자를 제거하였다. 자석 비드("E")에 결합된 분자는 용출하고, 화학적으로 동정하고, 추가 스크리닝을 위해 더 많은 양으로 제조할 수 있다. The biotinylated peptide (“A”) was coupled to magnetic beads coated with streptavidin and the excess unbound biotinylated peptide was washed off. The biotin-streptavidin peptide conjugate (“D”) is an excess of non-sulfated control peptide (“B”) under physiological conditions (37 ° C., pH 7.0-7.4, salt concentration, conductivity, etc.) for molecules that bind to “A”. Can be screened for small chemical entity libraries in the presence of "). The coupled magnetic beads were then washed twice with buffer and centrifuged each time to remove excess unbound molecules. Molecules bound to magnetic beads (“E”) can be eluted, chemically identified, and prepared in higher amounts for further screening.

선택된 화학 화합물("E")에 의한 비오티닐화 황산화된 펩티드에 대한 결합의 확인은 추가 스크리닝 방법으로 수행할 수 있다. 이 방법은 비오티닐화된 관련 없는 황산화된 펩티드와의 경쟁(방법 1) 또는 비오티닐화 펩티드 "A"에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편(예, scFv)과의 경쟁(방법 2)을 포함한다. Confirmation of the binding to the biotinylated sulfated peptide by the selected chemical compound (“E”) can be performed by additional screening methods. This method involves competition with biotinylated unrelated sulfated peptides (method 1) or competition with antibodies or fragments thereof (eg scFv) that specifically bind to biotinylated peptide “A” (method 2). It includes.

8.1 관련 없는 비오티닐화 황산화화된 펩티드와의 경쟁에 의한 재-스크리닝(방법 1)8.1 Re-screening by Competition with Unrelated Biotinylated Sulfated Peptides (Method 1)

화합물이 "A"에 대해 특이적으로 결합한다는 것을 확실히 하기 위해, 2번째 스크리닝을 수행할 수 있다. 비오틴-스트렙타비딘 펩티드 접합체("D")는 과량의 관련 없는 비오티닐화 황산화된 펩티드 "C"의 존재 하에 선택된 화합물 "E"를 이용하여 재-스크리닝할 수 있다. 이어서 튜브를 원심 분리하고, 자석 비드에 커플링된 비오틴-스트렙타비딘 펩티드 접합체는 완충액으로 2회 세척하고, 매번 원심 분리하여 과량의 비결합된 분자를 제거하였다. 자석 비드에 결합된 화합물은 화학 동정을 위해 용출시킬 수 있다. 과량의 화학 화합물은 "A"에 대한 선택적인 결합의 확인 및 시험관내 및 생체내 효능 시험과 같은 추가 연구를 위해 제조할 수 있다. To ensure that the compound specifically binds to "A", a second screening can be performed. The biotin-streptavidin peptide conjugate (“D”) can be re-screened using compound “E” selected in the presence of excess irrelevant biotinylated sulfated peptide “C”. The tube was then centrifuged and the biotin-streptavidin peptide conjugate coupled to the magnetic beads washed twice with buffer and centrifuged each time to remove excess unbound molecules. Compounds bound to the magnetic beads can be eluted for chemical identification. Excess chemical compounds can be prepared for further studies, such as identification of selective binding to "A" and in vitro and in vivo efficacy testing.

8.2 특정 scFv 항-황산화된 항체와의 경쟁에 의한 재-스크리닝(방법 2)8.2 Re-screening by Competition with Specific scFv Anti-Sulfated Antibodies (Method 2)

"A"에 대해 바람직한 결합 친화도를 가진 화합물은 "A"를 특이적으로 인식하고 결합하는 과량의 특정 scFv 항체의 존재 하에 선택된 각각의 화합물 "E"에 대해 비오틴-스트렙타비딘 펩티드 접합체("D")의 결합을 경쟁시켜 재스크리닝할 수 있다. scFv 항체에 의한 "A"에 대한 결합을 특이적으로 억제하는 화학 화합물은 "A"에 대한 선택적인 결합의 확인 및 시험관내 및 생체내 효능 시험과 같은 추가 연구를 위해 제조할 수 있다. Compounds with a preferred binding affinity for "A" are biotin-streptavidin peptide conjugates ("") for each compound "E" selected in the presence of excess specific scFv antibodies that specifically recognize and bind "A". D ") can be competition to rescreen. Chemical compounds that specifically inhibit binding to "A" by scFv antibodies can be prepared for further studies, such as identification of selective binding to "A" and in vitro and in vivo efficacy testing.

본 발명은 특정 구체예, 물질 및 데이터를 참조하여 설명하였다. 당업자가 이해하듯이, 본 발명의 다양한 측면을 사용하거나 제조하기 위해 다른 수단을 사용할 수 있다. 이러한 다른 수단은 하기 청구의 범위로 한정되는 본 발명의 의미 및 발명 사상 내에 포함되는 것으로 이해된다. The present invention has been described with reference to specific embodiments, materials and data. As will be appreciated by those skilled in the art, other means may be used to make or use the various aspects of the invention. Such other means are understood to be included within the meaning and spirit of the invention as defined by the following claims.

[서열목록][Sequence list]

서열 번호 1SEQ ID NO: 1

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서열 번호 2SEQ ID NO: 2

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서열 번호 3SEQ ID NO: 3

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서열 번호 4SEQ ID NO: 4

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서열 번호 5SEQ ID NO: 5

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서열 번호 6SEQ ID NO: 6

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서열 번호 7SEQ ID NO: 7

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서열 번호 8SEQ ID NO: 8

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서열 번호 9SEQ ID NO: 9

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서열 번호 10SEQ ID NO: 10

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서열 번호 11SEQ ID NO: 11

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서열 번호 12SEQ ID NO: 12

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서열 번호 13SEQ ID NO: 13

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서열 번호 14SEQ ID NO: 14

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서열 번호 15SEQ ID NO: 15

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서열 번호 16SEQ ID NO: 16

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서열 번호 17SEQ ID NO: 17

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서열 번호 18SEQ ID NO: 18

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서열 번호 19SEQ ID NO: 19

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서열 번호 20SEQ ID NO: 20

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서열 번호 21SEQ ID NO: 21

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서열 번호 22SEQ ID NO: 22

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서열 번호 23SEQ ID NO: 23

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서열 번호 24SEQ ID NO: 24

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서열 번호 25SEQ ID NO: 25

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Claims (85)

모티프 D-X-Y-D(여기서 X는 임의의 아미노산 또는 D와 Y 간의 공유 결합을 나타내고, Y는 황산화됨)를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편.An antibody or fragment thereof that binds to an epitope comprising the motif D-X-Y-D, wherein X represents a covalent bond between any amino acid or D and Y, and Y is sulfated. 제1항에 있어서, 항암제, 항백혈병제, 항전이제, 항신생물제, 항질병제, 항유착제, 항혈전제, 항재발협착제, 항자가면역제, 항응집제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택되는 제제와 복합체를 형성하는 것인 항체 또는 이의 단편.The method of claim 1, wherein the anticancer agent, anti-leukemia agent, anti-metastatic agent, anti-neoplastic agent, anti-disease agent, anti-adhesion agent, anti-thrombotic agent, anti-relapse constriction agent, anti autoimmune agent, anti-coagulant agent, antibacterial agent, antiviral agent And an antibody or fragment thereof that forms a complex with an agent selected from the group consisting of anti-inflammatory agents. 제2항에 있어서, 유리 아미노기를 통해 제제와 복합체를 형성하는 것인 항체 또는 이의 단편. The antibody or fragment thereof of claim 2, which forms a complex with the agent via a free amino group. 제2항에 있어서, 1∼16 카피의 제제와 복합체를 형성하는 것인 항체 또는 이의 단편. The antibody or fragment thereof of claim 2, which forms a complex with 1 to 16 copies of the formulation. 제4항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 IgG이고, 항체 또는 이의 단편 각각의 중쇄는 약 3 카피의 제제와 복합체를 형성하며, 각각의 경쇄는 약 1 카피의 제제와 복합체를 형성하는 것인 항체 또는 이의 단편. The antibody of claim 4, wherein the antibody or fragment thereof is an IgG, each heavy chain of the antibody or fragment thereof complexes with about 3 copies of the agent, and each light chain complexes with about 1 copy of the agent. Or a fragment thereof. 제2항에 있어서, 제제는 아시클로비어, 간시클로비어 및 지도부딘으로 이루어진 군에서 선택되는 항바이러스제인 항체 또는 이의 단편.The antibody or fragment thereof of claim 2, wherein the agent is an antiviral agent selected from the group consisting of acyclovir, gancyclovir, and zidovudine. 제2항에 있어서, 제제는 실로스타졸, 달테파린 나트륨, 레비파린 나트륨 및 아스피린으로 이루어진 군에서 선택되는 항혈전제/항재발협착제인 항체 또는 이의 단편.The antibody or fragment thereof of claim 2, wherein the agent is an antithrombotic / anti-reocytic confinement agent selected from the group consisting of cilostazol, dalteparin sodium, leviparin sodium and aspirin. 제2항에 있어서, 제제는 잘토프로펜, 프라노프로펜, 드록시캄, 아세틸 살리실릭 17, 디클로페낙, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 설린닥, 나프록센, 암톨메틴, 셀레콕시브, 인도메타신, 로페콕시브 및 니메설리드로 이루어진 군에서 선택되는 항염증제인 항체 또는 이의 단편.The formulation according to claim 2, wherein the formulation is zaltoprofen, pranoprofen, doxycamp, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtolmethin, celecoxib, indomethacin, An antibody or fragment thereof, which is an anti-inflammatory agent selected from the group consisting of rofecoxib and nimesulide. 제2항에 있어서, 제제는 레플루노마이드, 데닐루킨 디프티톡스, 수브레움, WinRho SDF, 데피브로타이드 및 시클로포스파마이드로 이루어진 군에서 선택되는 항자가면역제인 항체 또는 이의 단편.The antibody or fragment thereof of claim 2, wherein the agent is an anti-autoimmune agent selected from the group consisting of leflunomide, denilukine diftitox, subreum, WinRho SDF, depibrotide, and cyclophosphamide. 제2항에 있어서, 제제는 리마프로스트, 클로크로멘 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 항유착제/항응집제인 항체 또는 이의 단편.The antibody or fragment thereof of claim 2, wherein the agent is an antiadhesive / anticoagulant selected from the group consisting of limaprost, clochromen and hyaluronic acid. 제2항에 있어서, 제제는 독소, 방사능 동위원소, 영상화제 및 약제로 이루어 진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.The antibody or fragment thereof of claim 2, wherein the agent is selected from the group consisting of toxins, radioisotopes, imaging agents, and agents. 제11항에 있어서, 독소는 겔로닌, 슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin) (PE), PE40, PE38, 리신, 및 이의 변형체 및 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.The antibody or fragment thereof of claim 11, wherein the toxin is selected from the group consisting of gelonin, Pseudomonas Exotoxin (PE), PE40, PE38, lysine, and variants and derivatives thereof. 제11항에 있어서, 방사능 동위원소는 감마-방사체, 양전자 방사체, x-선 방사체, 베타-방사체 및 알파-방사체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편. The antibody or fragment thereof of claim 11, wherein the radioisotope is selected from the group consisting of gamma-radiators, positron emitters, x-ray emitters, beta-emitters, and alpha-emitters. 제11항에 있어서, 방사능 동위원소는 111인듐, 113인듐, 99m레늄, 105레늄, 101레늄, 99m테크네튬, 121m텔루륨, 122m텔루륨, 125m텔루륨, 165툴륨, 167툴륨, 168툴륨, 123요오드, 126요오드, 131요오드, 133요오드, 81m크립톤, 33크세논, 90이트륨, 213비스무트, 77브롬, 18플루오르, 95루테늄, 97루테늄, 103루테늄, 105루테늄, 107수은, 203수은, 67갈륨 및 68갈륨으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.The radioactive isotope of claim 11 is 111 indium, 113 indium, 99m rhenium, 105 rhenium, 101 rhenium, 99m technetium, 121m tellurium, 122m tellurium, 125m tellurium, 165 thulium, 167 thulium, 168 thulium, 123 Iodine, 126 Iodine, 131 Iodine, 133 Iodine, 81m Krypton, 33 Xenon, 90 Yttrium, 213 Bismuth, 77 Bromine, 18 Fluorine, 95 Ruthenium, 97 Ruthenium, 103 Ruthenium, 105 Ruthenium, 107 Mercury, 203 Mercury, 67 Gallium and 68 Gallium antibody or fragment thereof selected from the group consisting of. 제11항에 있어서, 약제는 안트라사이클린인 항체 또는 이의 단편.The antibody or fragment thereof of claim 11, wherein the medicament is anthracycline. 제15항에 있어서, 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신, 모르폴리노독소루비신, 모르폴리노다우노루비신 및 메톡시모르폴리닐독소루비신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.The method of claim 15, wherein the anthracycline is doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, detorrubicin, caminomycin, epirubicin, esorubicin, morpholino doxorubicin, morpholino-daunorubicin and methoxymorpholi. An antibody or fragment thereof that is selected from the group consisting of nyldoxorubicin. 제11항에 있어서, 약제는 시스-백금, 택솔, 칼리체아미신, 빈크리스틴, 시타라빈(Ara-C), 시클로포스파마이드, 프레드니손, 플루다라빈, 클로람부실, 인터페론 알파, 히드록시우레아, 테모졸로마이드, 탈리도마이드 및 블레오마이신과, 이의 유도체 및 조합체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.The pharmaceutical composition of claim 11, wherein the medicament is cis-platinum, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, fludarabine, chlorambucil, interferon alpha, hydroxy An antibody or fragment thereof selected from the group consisting of urea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and derivatives and combinations thereof. 제2항에 있어서, 하나 이상의 제제와 복합체를 형성할 수 있는 비히클 또는 담체와 복합체를 형성하는 것인 항체 또는 이의 단편.The antibody or fragment thereof of claim 2, wherein the antibody or fragment thereof forms a complex with a vehicle or carrier capable of complexing with one or more agents. 제18항에 있어서, 비히클 또는 담체는 덱스트란, 친지성 중합체, HPMA 및 리포좀과, 이들의 유도체 및 변형체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.The antibody or fragment thereof of claim 18, wherein the vehicle or carrier is selected from the group consisting of dextran, lipophilic polymers, HPMA and liposomes, and derivatives and variants thereof. 제1항의 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the antibody of claim 1 or a fragment thereof and a pharmaceutically acceptable carrier. 제1항의 항체 또는 이의 단편 및 영상화제를 포함하는 진단, 예후 판정 또는 병기 결정 키트.A diagnostic, prognostic or staging kit comprising the antibody of claim 1 or a fragment thereof and an imaging agent. 제21항에 있어서, 영상화제는 방사능 동위원소인 진단, 예후 판정 또는 병기 결정 키트.The diagnostic, prognostic or staging kit of claim 21, wherein the imaging agent is a radioisotope. 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)의 유도를 필요로 하는 환자에게 제20항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유도하는 방법.A method of inducing antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) comprising administering the pharmaceutical composition of claim 20 to a patient in need thereof. 자연 킬러(NK) 세포 또는 T 세포의 자극을 필요로 하는 환자에게 제20항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 자연 킬러(NK) 세포 또는 T 세포를 자극하는 방법.A method of stimulating natural killer (NK) cells or T cells, comprising administering the pharmaceutical composition of claim 20 to a patient in need of stimulation of natural killer (NK) cells or T cells. 세포사의 유도를 필요로 하는 환자에게 제2항의 항체 또는 이의 단편을 투여하는 것을 포함하는 세포사를 유도하는 방법으로서, 제제와 복합체를 형성한 항체 또는 이의 단편이 세포로 진입하고, 항체 또는 이의 단편이 제제로부터 절단되어 제제를 방출하는 것인 방법. A method of inducing cell death comprising administering the antibody or fragment thereof of claim 2 to a patient in need of induction of cell death, wherein the antibody or fragment thereof complexed with the agent enters the cell, and the antibody or fragment thereof And cleaved from the formulation to release the formulation. HIV의 치료를 필요로 하는 환자에게 제20항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 HIV를 치료하는 방법. A method of treating HIV comprising administering the pharmaceutical composition of claim 20 to a patient in need thereof. 제26항에 있어서, 투여는 HIV의 진입을 방지하는 것인 방법. The method of claim 26, wherein the administration prevents entry of HIV. 모티프 D-X-Y-D(여기서 X는 임의의 아미노산 또는 D와 Y 간의 공유 결합을 나타내고, Y는 황산화됨)를 포함하는 에피토프를 발현하는 세포로 제제를 도입하는 방법으로서, A method of introducing an agent into a cell expressing an epitope comprising the motif D-X-Y-D, wherein X represents a covalent bond between any amino acid or D and Y, and Y is sulfated, 제1항의 항체 또는 이의 단편과 제제의 복합체를 형성하는 단계; 및 Forming a complex of the agent of claim 1 with a fragment thereof; And 제제와 복합체를 형성한 항체 또는 이의 단편을 세포로 투여하는 단계Administering to the cell an antibody or fragment thereof complexed with the agent 를 포함하는 방법. How to include. 제28항에 있어서, 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 질환을 치료하는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the disease is treated in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 세포 회전의 치료를 필요로 하는 환자에서 세포 회전을 치료하는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the cell rotation is treated in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 염증의 치료를 필요로 하는 환자에서 염증을 치료하는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the inflammation is treated in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 자가면역 질환을 것인 치료하는 방법. 29. The method of claim 28, wherein the autoimmune disease is in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 전이 치료를 필요로 하는 환자에서 전이를 치료하는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the metastasis is treated in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 종양 세포의 성장 및/또는 복제의 치료를 필요로 하는 환자에서 종양 세포의 성장 및/또는 복제를 치료하는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the growth and / or replication of tumor cells is treated in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 종양 세포의 사멸률 증가를 필요로 하는 환자에서 종양 세포의 사멸률을 증가시키는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the mortality rate of tumor cells is increased in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제의 억제를 필요로 하는 환자에서 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제를 억제하는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the method inhibits the growth and / or replication of leukemia cells in a patient in need of inhibition of the growth and / or replication of leukemia cells. 제28항에 있어서, 백혈병 세포의 사멸률 증가를 필요로 하는 환자에서 백혈병 세포의 사멸률을 증가시키는 것인 방법. 29. The method of claim 28, wherein the mortality rate of leukemia cells is increased in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 항질병제에 의한 손상에 대한 질병 세포의 감수성 변화를 필요로 하는 환자에서 항질병제에 의한 손상에 대한 질병 세포의 감수성을 변화시 키는 것인 방법. 29. The method of claim 28, wherein the method alters the susceptibility of disease cells to damage by anti-pathogens in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 항암제에 의한 손상에 대한 종양 세포의 감수성 증가를 필요로 하는 환자에서 항암제에 의한 손상에 대한 종양 세포의 감수성을 증가시키는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the method increases the susceptibility of tumor cells to injury by an anticancer agent in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 항백혈병제에 의한 손상에 대한 백혈병 세포의 감수성 증가를 필요로 하는 환자에서 항백혈병제에 의한 손상에 대한 백혈병 세포의 감수성을 증가시키는 것인 방법. 29. The method of claim 28, wherein the leukemia cells are susceptible to damage by anti-leukemic agents in a patient in need of increased susceptibility of leukemia cells to damage by anti-leukemic agents. 제28항에 있어서, 종양이 있는 환자에서 종양 세포수 증가를 억제하는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the method inhibits tumor cell number increase in patients with tumors. 제28항에 있어서, 종양이 있는 환자에서 종양 세포수를 감소시키는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the tumor cell number is reduced in a patient having a tumor. 제28항에 있어서, 백혈병이 있는 환자에서 백혈병 세포수의 증가를 억제하는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the method inhibits an increase in leukemia cell numbers in a patient with leukemia. 제28항에 있어서, 백혈병이 있는 환자에서 백혈병 세포수를 감소시키는 것인 방법. The method of claim 28, wherein the leukemia cell number is reduced in a patient with leukemia. 제28항에 있어서, 혈소판 응집의 억제를 필요로 하는 환자에서 혈소판 응집을 억제하는 것인 방법. 29. The method of claim 28, wherein the platelet aggregation is inhibited in a patient in need thereof. 제28항에 있어서, 재발협착의 억제를 필요로 하는 환자에서 재발협착을 억제하는 것인 방법. 29. The method of claim 28, wherein the restenosis is suppressed in a patient in need thereof. 환자의 종양 세포를 모니터링하는 방법으로서, A method of monitoring tumor cells of a patient, 환자 유래의 종양 세포를 제공하는 단계; 및 Providing tumor cells from the patient; And 종양 세포를 제1항의 항체 또는 이의 단편과 함께 항온 처리하여 종양 세포의 병기를 결정하는 단계Incubating the tumor cells with the antibody of claim 1 or a fragment thereof to determine the stage of the tumor cells 를 포함하는 방법. How to include. 제47항에 있어서, 참고 기준에 대한 항체 또는 이의 단편의 특이적 결합을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법. 48. The method of claim 47, further comprising determining specific binding of the antibody or fragment thereof to the reference criteria. 제47항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 Y1인 방법. The method of claim 47, wherein the antibody or fragment thereof is Y1. 종양-특이적 항원을 분리하는 방법으로서, As a method of separating tumor-specific antigens, 세포 샘플을 얻는 단계; Obtaining a cell sample; 세포를 용해시키는 단계; Lysing the cells; 제1항의 항체 또는 이의 단편의 단백질 리간드를 동정하는 단계; 및 Identifying a protein ligand of the antibody of claim 1 or a fragment thereof; And 항체 또는 이의 단편을 포함하는 친화도 컬럼을 통해 세포 용해물을 통과시켜 단백질 리간드를 정제하는 단계Purifying the protein ligand by passing the cell lysate through an affinity column containing the antibody or fragment thereof 를 포함하는 방법. How to include. 제50항에 있어서, 단백질 리간드를 서열화하여 종양-특이적 항원을 동정하는 단계를 더 포함하는 방법. 51. The method of claim 50, further comprising sequencing protein ligands to identify tumor-specific antigens. 제50항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 Y1인 방법. The method of claim 50, wherein the antibody or fragment thereof is Y1. 제50항에 있어서, 세포는 인간 종양으로부터 얻는 것인 방법. 51. The method of claim 50, wherein the cells are obtained from a human tumor. 제53항에 있어서, 종양은 고형 종양인 방법. The method of claim 53, wherein the tumor is a solid tumor. 제54항에 있어서, 종양은 소세포 폐 암종인 방법. 55. The method of claim 54, wherein the tumor is small cell lung carcinoma. 제53항에 있어서, 종양은 혈인성 종양인 방법. The method of claim 53, wherein the tumor is a hematologic tumor. 제56항에 있어서, 종양은 백혈병인 방법. The method of claim 56, wherein the tumor is leukemia. 환자 질병의 진단, 예후 판정 또는 병기 결정 방법으로서, As a method of diagnosis, prognosis or staging of a patient's disease, 환자 유래의 세포를 포함하는 샘플을 제공하는 단계 및 Providing a sample comprising cells of a patient, and 제1항의 항체 또는 이의 단편이 환자 세포에 결합하는지를 결정하여, 그 환자가 질병 위험이 있는지 또는 질병을 보유하고 있는지를 확인하는 단계Determining whether the antibody of claim 1 or a fragment thereof binds to a patient cell to determine whether the patient is at risk or has a disease 를 포함하는 방법. How to include. 제58항에 있어서, The method of claim 58, 항체 또는 이의 단편의 특이적 결합을 결정하는 단계 및 Determining the specific binding of the antibody or fragment thereof and 참고 기준에 대하여 세포에 항체 또는 이의 단편의 특이적 결합을 비교하는 단계Comparing the specific binding of the antibody or fragment thereof to the cell against a reference criterion 를 더 포함하는 방법. How to include more. 제58항에 있어서, 제1항의 항체 또는 이의 단편이 환자 세포에 결합하는지를 결정하기 위해 웨스턴 블로팅을 사용하는 것인 방법. The method of claim 58, wherein western blotting is used to determine whether the antibody of claim 1 or a fragment thereof binds to the patient cell. 제58항에 있어서, 질환은 암인 방법. The method of claim 58, wherein the disease is cancer. 제61항에 있어서, 암은 고형 암종인 방법. 62. The method of claim 61, wherein the cancer is a solid carcinoma. 제62항에 있어서, 암은 소세포 폐 암종인 방법. The method of claim 62, wherein the cancer is small cell lung carcinoma. 제61항에 있어서, 암은 혈인성 종양인 방법. The method of claim 61, wherein the cancer is a hematologic tumor. 제64항에 있어서, 암은 백혈병인 방법. The method of claim 64, wherein the cancer is leukemia. 제58항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 Y1인 방법. The method of claim 58, wherein the antibody or fragment thereof is Y1. 환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계 및 Providing a sample containing cells from a patient, and 환자 유래의 세포와 제1항의 항체 또는 이의 단편을 항온 처리하는 단계를 포함하는, 환자로부터 종양 세포를 제거(purging)하는 방법.A method of purging tumor cells from a patient, comprising incubating the cells of the patient with the antibody of claim 1 or a fragment thereof. 제67항에 있어서, 제거는 체외에서 이루어지는 것인 방법.The method of claim 67, wherein the removal is in vitro. 안트라사이클린-제제 복합체의 형성 방법으로서, As a method of forming an anthracycline-formulation complex, 안트라사이클린을 제공하는 단계; Providing an anthracycline; 안트라사이클린과 아디프산을 반응시키는 단계; Reacting anthracycline with adipic acid; 안트라사이클린-아디프산의 활성 에스테르를 생성하는 단계; 및 Producing an active ester of anthracycline-adipic acid; And 폴리펩티드와 아디프산-안트라사이클린을 반응시켜 안트라사이클린-제제 복 합체를 형성하는 단계Reacting the polypeptide with adipic acid-anthracycline to form an anthracycline-agent complex 를 포함하는 방법. How to include. 제69항에 있어서, 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신, 모르폴리노독소루비신, 모르폴리노다우노루비신 및 메톡시모르폴리닐독소루비신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.70. The method of claim 69, wherein the anthracycline is doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, detorrubicin, caminomycin, epirubicin, esorubicin, morpholino doxorubicin, morpholino-daunorubicin and methoxymorpholi. The method is selected from the group consisting of nildoxorubicin. 제69항에 있어서, 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편인 방법. The method of claim 69, wherein the polypeptide is an antibody or fragment thereof. 제69항의 방법에 따라 생산된 복합체. A complex produced according to the method of claim 69. 제72항에 있어서, 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신, 모르폴리노독소루비신, 모르폴리노다우노루비신 및 메톡시모르폴리닐독소루비신인 복합체. 74. The method of claim 72, wherein the anthracycline is doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, detorrubicin, caminomycin, epirubicin, esorubicin, morpholinodoxorubicin, morpholino-daunorubicin and methoxymorpholi. Nildoxorubicin complex. 제72항에 있어서, 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편인 복합체. The complex of claim 72, wherein the polypeptide is an antibody or fragment thereof. 서열 YD(여기서 YD는 모티프 DXYD 내 또는 산성 환경 내에 위치하고, 여기서 X는 임의의 아미노산 또는 D와 Y 간의 공유 결합이며, Y는 황산화됨)를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편. An antibody or fragment thereof that binds to an epitope comprising the sequence YD, wherein YD is located in the motif DXYD or in an acidic environment, where X is any amino acid or a covalent bond between D and Y, and Y is sulfated. 제75항의 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the antibody of claim 75 or a fragment thereof and a pharmaceutically acceptable carrier. 제75항의 항체 또는 이의 단편 및 영상화제를 포함하는 진단, 예후 판정 또는 병기 결정 키트.A diagnostic, prognostic or staging kit comprising the antibody of claim 75 or a fragment thereof and an imaging agent. 제77항에 있어서, 영상화제는 방사능 동위원소인 진단, 예후 판정 또는 병기 결정 키트.78. The diagnostic, prognostic or staging kit of claim 77, wherein the imaging agent is a radioisotope. 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)의 유도를 필요로 하는 환자에게 제76항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유도하는 방법.77. A method of inducing antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) comprising administering the pharmaceutical composition of claim 76 to a patient in need of induction of antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC). 자연 킬러(NK) 세포 또는 T 세포의 자극을 필요로 하는 환자에게 제76항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 자연 킬러(NK) 세포 또는 T 세포를 자극하는 방법.A method of stimulating natural killer (NK) cells or T cells, comprising administering the pharmaceutical composition of claim 76 to a patient in need of stimulation of natural killer (NK) cells or T cells. 세포사의 유도를 필요로 하는 환자에게 제75항의 항체 또는 이의 단편을 투 여하는 것을 포함하는 세포사를 유도하는 방법으로서, 제제와 복합체를 형성한 항체 또는 이의 단편이 세포로 진입하고, 항체 또는 이의 단편이 제제로부터 절단되어 제제를 방출하는 것인 방법. A method of inducing cell death comprising administering the antibody of claim 75 or a fragment thereof to a patient in need of induction of cell death, wherein the antibody or fragment thereof complexed with the agent enters the cell and the antibody or fragment thereof Which is cleaved from this formulation to release the formulation. HIV의 치료를 필요로 하는 환자에게 제76항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 HIV를 치료하는 방법. 77. A method of treating HIV comprising administering the pharmaceutical composition of claim 76 to a patient in need thereof. 제82항에 있어서, 투여는 HIV의 진입을 방지하는 것인 방법. The method of claim 82, wherein the administration prevents entry of HIV. 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 제1항 또는 제76항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질환을 치료하는 방법. 77. A method of treating a disease comprising administering the pharmaceutical composition of claim 1 or 76 to a patient in need thereof. 제84항에 있어서, 세포 회전의 치료를 필요로 환자에서 세포 회전을 치료하는 것인 방법. The method of claim 84, wherein the cell rotation is treated in a patient in need thereof.
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