JP2007527393A - Specific human antibodies - Google Patents

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クーパーマン，レナ
ハガイ，ヨヘベット
スザントン，エスザー
カンフィ，ヤリブ
ベン−レビー，レイチェル
スズラジベール，タリ
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Abstract

本発明は、モチーフD-X-Y-D(SEQ ID NO:3)を含むPSGL-1のエピトープに結合する抗体又はポリペプチドであって、Xは任意のアミノ酸、又はDとYとの共有結合を表し、そしてYは硫酸化されており、抗体は、薬剤の複数のコピーとカップリング又は複合することができる、抗体又はポリペプチドを提供する。本発明の抗体は、抗体依存性細胞の細胞毒性を誘発し、且つ/又はナチュラルキラー(NK)細胞又はT細胞を刺激する方法において使用することができる。加えて、これらの抗体をこれを必要とする患者に投与することにより、細胞死を誘発する方法が提供される。当該感染の予防を必要とする患者に本発明の抗体を投与することにより、ウィルス(例えばHIV)による感染を予防する方法も提供される。本発明はまた、本発明の抗体に薬剤をカップリング又は複合し、そして細胞に抗体-薬剤カップリング体又は複合体を細胞に投与することにより、硫酸化型PSGL-1を発現させる細胞中に薬剤を導入する方法を提供する。最後に、本発明は、本発明の抗体を使用して診断、予後又は病期診断の方法を提供する。  The present invention is an antibody or polypeptide that binds to an epitope of PSGL-1 comprising the motif DXYD (SEQ ID NO: 3), wherein X represents any amino acid, or a covalent bond between D and Y, and Y Are sulfated, and antibodies provide antibodies or polypeptides that can be coupled or complexed with multiple copies of the drug. The antibodies of the present invention can be used in methods of inducing cytotoxicity of antibody-dependent cells and / or stimulating natural killer (NK) cells or T cells. In addition, methods are provided for inducing cell death by administering these antibodies to a patient in need thereof. Also provided is a method for preventing infection by a virus (eg, HIV) by administering the antibody of the present invention to a patient in need of prevention of the infection. The present invention also provides a method for coupling sulfated PSGL-1 into a cell by coupling or conjugating a drug to the antibody of the present invention and administering the antibody-drug coupling agent or complex to the cell. A method of introducing a drug is provided. Finally, the present invention provides methods for diagnosis, prognosis or staging using the antibodies of the present invention.

Description

発明の分野
本発明は、細胞、癌細胞、転移細胞、白血病細胞、白血球及び血小板上に存在し、そして、細胞転動、転移、炎症及び自己免疫疾患のような多種多様な生理学的現象において重要な特定のエピトープに結合する抗体に関する。より具体的には、これらの抗体は、抗癌活性、抗転移活性、抗白血病活性、抗ウィルス活性、抗感染活性、及び/又はその他の疾患、例えば炎症性疾患、自己免疫疾患、ウィルス感染、心臓血管疾患、例えば心筋梗塞、網膜症疾患、及び硫酸化型チロシン依存性タンパク質間相互作用によって引き起こされる疾患に対する活性を有することができる。加えて、本発明の抗体は、ターゲッティング薬として使用することにより、治療薬を体内の特異的な細胞又は部位に向けることができる。 The present invention is present on cells, cancer cells, metastatic cells, leukemia cells, leukocytes and platelets and is important in a wide variety of physiological phenomena such as cell mobilization, metastasis, inflammation and autoimmune diseases. Relates to antibodies that bind to specific epitopes. More specifically, these antibodies have anti-cancer activity, anti-metastatic activity, anti-leukemic activity, anti-viral activity, anti-infective activity, and / or other diseases such as inflammatory diseases, autoimmune diseases, viral infections, It can have activity against cardiovascular diseases such as myocardial infarction, retinopathy diseases, and diseases caused by sulfated tyrosine-dependent protein-protein interactions. In addition, the antibodies of the present invention can be used as targeting agents to direct therapeutic agents to specific cells or sites in the body.

発明の背景
白血病、リンパ腫及び骨髄腫は、骨髄及びリンパ組織を起源とし、コントロールされない細胞成長に関与する癌である。急性リンパ芽球性白血病(ALL)は、特異的な臨床的及び免疫学的特性によって定義された異種疾患である。ALLの他の形態と同様に、B細胞ALL(B-ALL)のほとんどの事例の明確な原因は知られていないが、多くの事例において、この疾患は、単一の細胞のDNAにおける後天性遺伝子変化から生じ、異常及び連続的な増殖を引き起こす。B-ALL患者の予後は、小児及び成人の双方において、他の白血病患者よりも悪い。B細胞CLL(B-CLL)が一例となる慢性リンパ性白血病(CLL)は、リンパ球の数の増大によって特徴付けられる、白血病の緩徐進行性形態である。急性骨髄性白血病(AML)は、前駆細胞を有する新生物の異種群であり、前駆細胞は、正常な条件下では、骨髄系の最終分化細胞(赤血球、顆粒球、単球及び血小板)を生じさせる。新生物形成の他の形態のように、AMLは、後天性遺伝子変化と連携する。後天性遺伝子変化は、結果として、正常に分化された骨髄性細胞を比較的未分化の芽細胞と置換させ、1つ又は2つ以上の初期骨髄分化タイプを示す。AMLは一般に骨髄内で進化し、また、より低い程度で二次造血器内で進化する。主として、AMLは成人が罹り、その罹患ピークは15〜40歳であるが、しかし小児やより高齢の成人が罹患することも知られている。ほとんど全てのAML患者は、異常な循環未分化芽細胞レベルの痕跡がない臨床的緩解を得るために、診断直後に治療を必要とする。 BACKGROUND OF THE INVENTION Leukemia, lymphoma and myeloma are cancers that originate in bone marrow and lymphoid tissue and are involved in uncontrolled cell growth. Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous disease defined by specific clinical and immunological characteristics. Like other forms of ALL, the clear cause of most cases of B-cell ALL (B-ALL) is unknown, but in many cases the disease is acquired in the DNA of a single cell It arises from genetic changes and causes abnormalities and continuous growth. The prognosis for B-ALL patients is worse than for other leukemia patients, both in children and adults. Chronic lymphocytic leukemia (CLL), exemplified by B cell CLL (B-CLL), is a slowly progressive form of leukemia characterized by an increase in the number of lymphocytes. Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous group of neoplasms with progenitor cells that, under normal conditions, give rise to myeloid terminally differentiated cells (erythrocytes, granulocytes, monocytes and platelets) Let Like other forms of neoplasia, AML is associated with acquired genetic changes. Acquired genetic changes result in the replacement of normally differentiated myeloid cells with relatively undifferentiated blasts, indicating one or more early myeloid differentiation types. AML generally evolves in the bone marrow and to a lesser extent in secondary hematopoietic organs. Mainly, AML affects adults, with peak morbidity between 15 and 40 years old, but it is also known to affect children and older adults. Almost all AML patients require treatment immediately after diagnosis to obtain clinical remission with no evidence of abnormal circulating undifferentiated blast levels.

分離されたscFv抗体分子のリガンド
血小板、フィブリノゲン、GPIb、セレクチン及びPSGL-1(P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1)はそれぞれ、いくつかの病原性条件又は疾患状態、例えば異常又は病原性炎症、異常又は病原性免疫反応、自己免疫反応、転移、異常又は病原性癒着、血栓及び/又は再狭窄、及び異常又は病原性凝集において重要な役割を演じる。こうして、血小板及びこれらの分子と結合又は交差反応する抗体は、これらの又は他の病原性条件に関与する疾患及び障害の診断及び治療に有用となる。 The isolated scFv antibody molecule ligand platelets, fibrinogen, GPIb, selectin and PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1) each have several pathogenic conditions or disease states, such as abnormal or pathogenic inflammation, abnormal Or play an important role in pathogenic immune reactions, autoimmune reactions, metastasis, abnormal or pathogenic adhesions, thrombus and / or restenosis, and abnormal or pathogenic aggregation. Thus, antibodies that bind or cross-react with platelets and these molecules are useful in the diagnosis and treatment of diseases and disorders associated with these or other pathogenic conditions.

血小板
血小板は、血液系の十分に特徴付けられた成分であり、止血、血栓及び/又は再狭窄においていくつかの重要な役割を演じる。血管に対する損傷は、止血として知られるプロセスを始動する。止血は一連の順次事象によって特徴付けられる。損傷された血管に対する初期反応は、血管の内面上の罹患領域への血小板の癒着である。次のステップは、前に癒着された血小板上への多くの血小板層の凝集であり、止血血栓を形成して血管壁をシールする。止血血栓はフィブリン・ポリマーの沈積によってさらに強化される。塊又は栓は、損傷が修復されたときにのみ分解される。 Platelet platelets are well-characterized components of the blood system and play several important roles in hemostasis, thrombus and / or restenosis. Damage to the blood vessels initiates a process known as hemostasis. Hemostasis is characterized by a series of sequential events. The initial response to damaged blood vessels is the adhesion of platelets to the affected area on the inner surface of the blood vessel. The next step is the aggregation of a number of platelet layers onto previously adhered platelets, forming a hemostatic thrombus and sealing the vessel wall. The hemostatic thrombus is further strengthened by fibrin polymer deposition. The mass or plug is only broken down when the damage is repaired.

循環血小板は、巨核球の周囲から放出された細胞質粒子である。血小板は止血において重要な役割を演じる。血管外傷時に、血小板は損傷組織表面に癒着し、そして互いに結合する(粘着)。この事象シーケンスは急速に発生し、血管外傷部位に無構造塊(一般には血小板血栓又は血栓と呼ばれる)を形成する。凝集としても知られる粘着現象は、種々の物質又はアゴニスト、例えばコラーゲン、アデノシン-ジホスフェート(ADP)、エピネフリン、セロトニン及びリストセチンによってin vitroで開始することができる。凝集は、血小板機能の尺度として実施される数多くのin vitro試験のうちの1つである。   Circulating platelets are cytoplasmic particles released from around megakaryocytes. Platelets play an important role in hemostasis. During vascular trauma, platelets adhere to the damaged tissue surface and bind to each other (adhesion). This sequence of events occurs rapidly and forms an unstructured mass (commonly called platelet thrombus or thrombus) at the site of vascular trauma. The adhesion phenomenon, also known as aggregation, can be initiated in vitro by various substances or agonists such as collagen, adenosine-diphosphate (ADP), epinephrine, serotonin and ristocetin. Aggregation is one of many in vitro tests performed as a measure of platelet function.

転移における血小板の重要性
腫瘍転移はおそらく、癌患者の生存を制限する最も重要な要因である。蓄積されたデータが示すところによれば、宿主血小板と相互作用する腫瘍細胞の能力が、転移の必須決定因子の1つである(Oleksowicz, Thrombosis Res. 79:261-74(1995))。転移癌細胞が血流に侵入すると、腫瘍細胞をコーティングする血小板と白血球とから成る多細胞複合体が形成される。ミクロ塞栓と呼ぶことができるこれらの複合体は、腫瘍細胞が免疫系から逃れるのを助ける。血小板による腫瘍細胞のコーティングは、血小板によるP-セレクチンの発現を必要とする。 The importance of platelets in metastasis Tumor metastasis is probably the most important factor limiting the survival of cancer patients. The accumulated data indicate that the ability of tumor cells to interact with host platelets is one of the essential determinants of metastasis (Oleksowicz, Thrombosis Res. 79: 261-74 (1995)). When metastatic cancer cells enter the bloodstream, a multicellular complex consisting of platelets and white blood cells that coat the tumor cells is formed. These complexes, which can be called microembolism, help the tumor cells escape the immune system. Coating of tumor cells with platelets requires the expression of P-selectin by platelets.

血小板を凝集させる腫瘍細胞の能力は、腫瘍細胞の転移可能性と相関することが実証されており、そして、腫瘍誘発型の血小板凝集は齧歯類モデルにおいて転移の抑制と相関することが示されている。腫瘍細胞と血小板との相互作用は、膜癒着分子及びアゴニストの分泌に関与することが実証されている。免疫関連血小板糖タンパク質の発現が、腫瘍細胞系上で同定されている。血小板免疫関連糖タンパク質GPIb、GPIIb/IIIa、GPIb/IX及びインテグリンαvサブユニットが、乳癌細胞系の表面上に発現されることが実証された(Oleksowicz(1995)、前出；Kamiyama他、J. Lab. Clin. Med. 117(3):209-17(1991))。 The ability of tumor cells to aggregate platelets has been demonstrated to correlate with tumor cell metastatic potential, and tumor-induced platelet aggregation has been shown to correlate with inhibition of metastasis in rodent models. ing. Tumor cell-platelet interactions have been demonstrated to be involved in the secretion of membrane adhesion molecules and agonists. Immune-related platelet glycoprotein expression has been identified on tumor cell lines. Platelet immune related glycoproteins GPIb, GPIIb / IIIa, GPIb / IX and integrin α v subunit have been demonstrated to be expressed on the surface of breast cancer cell lines (Oleksowicz (1995), supra; Kamiyama et al., J Lab. Clin. Med. 117 (3): 209-17 (1991)).

Gasic他(PNAS 61:46-52(1968))は、抗体誘発型血小板減少が、CT26結腸腺癌、ルイス肺癌、及びB16メラノーマによって生成された転移体の数及び体積を著しく低減することを示した(Karpatkin他、J. Clin. Invest. 81(4): 1012-19(1988); Clezardin他、Cancer Res. 53(19):4695-700(1993))。さらに、単一のポリペプチド鎖(60kd)が、HEL細胞の表面膜上に発現させられ、この表面膜はGPIbに密接に関連し、そして不完全又は異常にO-グリコシル化されたGPIbαサブユニットに相当することが見いだされた(Kieffer他、J. Biol. Chem. 261(34):15854-62(1986))。   Gasic et al. (PNAS 61: 46-52 (1968)) show that antibody-induced thrombocytopenia significantly reduces the number and volume of metastases produced by CT26 colon adenocarcinoma, Lewis lung cancer, and B16 melanoma. (Karpatkin et al., J. Clin. Invest. 81 (4): 1012-19 (1988); Clezardin et al., Cancer Res. 53 (19): 4695-700 (1993)). In addition, a single polypeptide chain (60 kd) is expressed on the surface membrane of HEL cells, which surface membrane is closely related to GPIb and is an incomplete or abnormally O-glycosylated GPIbα subunit. (Kieffer et al., J. Biol. Chem. 261 (34): 15854-62 (1986)).

GPIb複合体
止血プロセスにおける各ステップは、血小板表面上の受容体の存在を必要とする。止血において重要な1つの受容体は、糖タンパク質Ib-IX複合体(CD42としても知られる)である。この受容体は、内皮細胞下においてフォン・ビレブラント因子(vWF)と結合することにより、血管壁損傷部位に血小板が癒着する(初期結合)のを媒介する。この受容体はまた、止血において重要な2つの他の血小板機能：(a)動脈狭窄領域における高剪断力によって誘発される血小板の凝集、及び(b)低濃度のトロンビンによって誘発される血小板活性、において重大な役割を有している。 Each step in the GPIb complex hemostasis process requires the presence of a receptor on the platelet surface. One receptor important in hemostasis is the glycoprotein Ib-IX complex (also known as CD42). This receptor mediates platelet adhesion (initial binding) to the site of vascular wall injury by binding to von Willebrand factor (vWF) under endothelial cells. This receptor also has two other platelet functions important in hemostasis: (a) platelet aggregation induced by high shear forces in the arterial stenosis region, and (b) platelet activity induced by low concentrations of thrombin, Has a critical role.

GPIb-IX複合体は、血小板原形質膜の外面の主要成分の1つである。この複合体は、膜に及ぶ3つのポリペプチド、すなわちGPIbのジスルフィドリンクされた130 kDa α-鎖及び25 kDa β鎖、及び非共有会合されたGPIX(22 kDa)を含む。サブユニットの全ては、CD42複合体の効率的な細胞表面発現及び機能のために、血小板膜上に等モル量で提供される。このことは、原形質膜上の完全発現のために、3つのサブユニットの適正な集成により複合体が形成されることが必要とされることを示唆する。GPIbのα-鎖は、3つの区別可能な構造ドメイン：(1)ロイシンに富んだ反復配列及びCys結合型フランキング配列を含有する球形N末端ペプチド・ドメイン；(2)高グリコシル化されたムチン様マクログリコペプチド・ドメイン；及び(3)膜と会合するC末端領域であって、GPIbαとのジスルフィド架橋及び膜貫通型の細胞質配列を含有する領域から成る。   The GPIb-IX complex is one of the major components of the outer surface of the platelet plasma membrane. This complex contains three polypeptides spanning the membrane: GPIb disulfide-linked 130 kDa α-chain and 25 kDa β-chain, and non-covalently associated GPIX (22 kDa). All of the subunits are provided in equimolar amounts on the platelet membrane for efficient cell surface expression and function of the CD42 complex. This suggests that a complex must be formed by proper assembly of the three subunits for full expression on the plasma membrane. The α-chain of GPIb consists of three distinct structural domains: (1) a spherical N-terminal peptide domain containing a leucine-rich repeat and a Cys-linked flanking sequence; (2) a highly glycosylated mucin A macroglycopeptide domain; and (3) a C-terminal region associated with the membrane, containing a disulfide bridge with GPIbα and a transmembrane cytoplasmic sequence.

証拠となるいくつかの系が示唆するところによれば、GPIb-IX複合体のvWF及びトロンビン結合ドメインは、GPIbαのアミノ末端にほぼ300個のアミノ酸を含む球形領域内に存在する。ヒト血小板GPIb-IX複合体が、血小板及び反応性の両方を媒介する主要膜受容体であるのに伴って、内皮細胞下で結合されたvWFがGPIbによって認識されることにより、血小板の損傷血管への癒着が可能になる。さらに、vWFとGPIbαとの結合はまた血小板活性化を誘発する。この活性化は、GPIb-IXの細胞質ドメインと細胞骨格又はホスホリパーゼA2との相互作用に関与することができる。さらに、GPIbαは、α-トロンビンの高アフィニティ結合部位を含有し、この結合部位は、まだ十分には定義されていないメカニズムによって血小板活性化を容易にする。   Several lines of evidence suggest that the vWF and thrombin binding domain of the GPIb-IX complex resides within a spherical region containing approximately 300 amino acids at the amino terminus of GPIbα. As the human platelet GPIb-IX complex is a major membrane receptor that mediates both platelets and reactivity, vWF bound under endothelial cells is recognized by GPIb, thereby causing damaged blood vessels in platelets. Adhesion to is possible. Furthermore, the binding of vWF and GPIbα also induces platelet activation. This activation can be involved in the interaction of the cytoplasmic domain of GPIb-IX with the cytoskeleton or phospholipase A2. Furthermore, GPIbα contains a high affinity binding site for α-thrombin, which facilitates platelet activation by a mechanism that is not yet well defined.

GPIbαのN末端球形ドメインは、負荷電アミノ酸のクラスターを含有する。証拠となるいくつかの系が示唆するところによれば、GPIb-IX複合体を発現させるトランスフェクトされたCHO細胞、及び血小板GPIbαにおいて、このドメイン(Tyr-276、Tyr-278、及びTyr-279)内に含有された3つのチロシン残基は、硫酸化される。   The N-terminal globular domain of GPIbα contains a cluster of negatively charged amino acids. Several lines of evidence suggest that this domain (Tyr-276, Tyr-278, and Tyr-279) in transfected CHO cells that express the GPIb-IX complex and platelet GPIbα. The three tyrosine residues contained within) are sulfated.

タンパク質硫酸化
タンパク質硫酸化は、硫酸塩と、糖側鎖又はポリペプチド主鎖との酵素的共有結合に関与する広範囲な翻訳後修飾である。この修飾はトランス-ゴルジ区画内で発生する。硫酸化型タンパク質は分泌タンパク質、顆粒をターゲットにするタンパク質、及び原形質膜タンパク質の細胞外領域を含む。チロシンは、硫酸化されることが現在知られているアミノ酸残基である。Kehoe他、Chem. Biol. 7:R57-61(2000)。他のアミノ酸、例えばトレオニンも、特に疾患細胞中で硫酸化され得る。 Protein sulfation Protein sulfation is a wide range of post-translational modifications involved in the enzymatic covalent bonding of sulfate with sugar side chains or polypeptide backbones. This modification occurs within the trans-Golgi compartment. Sulfated proteins include secreted proteins, proteins that target granules, and the extracellular region of plasma membrane proteins. Tyrosine is an amino acid residue currently known to be sulfated. Kehoe et al., Chem. Biol. 7: R57-61 (2000). Other amino acids such as threonine can also be sulfated, especially in diseased cells.

多数のタンパク質が、チロシン硫酸化型であることが見いだされているが、しかし、GPIb上に見いだされるような、単一のポリペプチド内の3つ又は4つ以上の硫酸化型チロシンの存在は、一般的でない。血小板及び巨核球によって発現させられ、vWFとの結合を介して内皮細胞下に血小板が結合して内皮細胞上を転動するのを媒介するGPIbα(CD42)はまた、そのN末端ドメインに多数の負電荷を含有する。このような高い酸性及び親水性の環境は、硫酸化にとって必須条件であると考えられる。なぜならば、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼは酸性アミノ残基に隣接するチロシンを特異的に認識し、そしてこれらを硫酸化するからである(Bundgaard他、J.Biol.Chem. 272:21700-05(1997))。GPIbαの酸性領域の完全硫酸化は、顕著な負電荷密度(19個のアミノ酸の延在内部に13個の負電荷)を有する領域を産出し、また、他のタンパク質との静電相互作用のための候補部位となる。   Many proteins have been found to be tyrosine sulfated, but the presence of three or more sulfated tyrosine within a single polypeptide as found on GPIb is , Not general. GPIbα (CD42), which is expressed by platelets and megakaryocytes and mediates platelets binding and rolling on endothelial cells via binding to vWF, also has numerous N-terminal domains. Contains a negative charge. Such highly acidic and hydrophilic environments are considered essential for sulfation. This is because tyrosyl protein sulfotransferase specifically recognizes tyrosine adjacent to acidic amino residues and sulphates them (Bundgaard et al., J. Biol. Chem. 272: 21700-05 (1997). )). The complete sulfation of the acidic region of GPIbα yields a region with a pronounced negative charge density (13 negative charges within the 19 amino acid extension) and is also responsible for electrostatic interactions with other proteins. Candidate sites for

硫酸化型N末端チロシンは、CC-ケモカイン受容体、例えばCCR5の役割に影響を与えるとも考えられる。CC-ケモカイン受容体は、ヒト及びサルの免疫不全ウィルス(HIV-1、HIV-2及びSIV)がターゲット細胞内に侵入するための、関連7膜貫通型セグメント(7TMS)受容体を有する共受容体として役立つ。例えば、硫酸化型N末端チロシンが、CCR5とMIP-1α、MIP-1β、及びHIV-1 gp120/CD4複合体との結合、及びCCR及びCD4を発現させる細胞に侵入するHIV-1の能力に関与することが考えられる。別の重要なHIV-1共受容体であるCXCR4も、硫酸化される(Farzan他、Cell 96(5):667-76(1999))。チロシン硫酸化は、CCR-5依存性侵入ほど、CXCR4-依存性HIV-1侵入において有意な役割を演じることはなく、従って、CXC-ケモカイン群におけるチロシン硫酸化のための考えられ得る役割を実証し、そしてHIV-1の、CCR5とCXCR4との利用率の全般的な差を強調する(Farzan他、J. Biol. Chem. 277(33):29, 484-89(2002))。   Sulfated N-terminal tyrosine may also affect the role of CC-chemokine receptors, such as CCR5. CC-chemokine receptors are co-receptors with associated 7 transmembrane segment (7TMS) receptors for entry of human and monkey immunodeficiency viruses (HIV-1, HIV-2 and SIV) into target cells Useful as a body. For example, sulfated N-terminal tyrosine binds CCR5 to MIP-1α, MIP-1β, and HIV-1 gp120 / CD4 complex, and the ability of HIV-1 to enter cells that express CCR and CD4. It is possible to be involved. Another important HIV-1 co-receptor, CXCR4, is also sulfated (Farzan et al., Cell 96 (5): 667-76 (1999)). Tyrosine sulfation does not play as significant a role in CXCR4-dependent HIV-1 invasion as CCR-5-dependent entry, thus demonstrating a possible role for tyrosine sulfation in CXC-chemokines And highlights the general differences in HIV-1 utilization between CCR5 and CXCR4 (Farzan et al., J. Biol. Chem. 277 (33): 29, 484-89 (2002)).

セレクチン及びPSGL-1
P-、E-、及びL-セレクチンは、数ある機能の中で、血管内皮上の白血球の転動を媒介する癒着部分群の員である。P-セレクチンは、血小板内の顆粒として貯蔵され、トロンビン、ヒスタミン、ホルボール・エステル、又はその他の刺激分子による活性化後に表面へ輸送される。P-セレクチンはまた、活性化された内皮細胞上に発現される。E-セレクチンは、内皮細胞上に発現され、そしてL-セレクチンは好中球、単球、T細胞及びC細胞上に発現される。 Selectin and PSGL-1
P-, E-, and L-selectin are members of the adhesion subgroup that mediates leukocyte rolling on the vascular endothelium, among other functions. P-selectin is stored as granules in platelets and is transported to the surface after activation by thrombin, histamine, phorbol esters, or other stimulatory molecules. P-selectin is also expressed on activated endothelial cells. E-selectin is expressed on endothelial cells and L-selectin is expressed on neutrophils, monocytes, T cells and C cells.

PSGL-1(CD162とも呼ばれる)は、P-セレクチン、E-セレクチン及びL-セレクチンのムチン糖タンパク質リガンドであり、このリガンドは、GPIbと構造類似性を共有する(Afshar-Kharghan他(2001)、前出)。PSGL-1はPACE(対合塩基性アミノ酸変換酵素:Paired Basic Amino Acid Converting Enzymes)切断部位を有するジスルフィド・リンク型ホモダイマーである。PSGL-1はまた、3つの潜在的チロシン硫酸化部位、及びこれに続く、プロリン、セリン及びトレオニンが多い10-16デカマー反復を有する。PSGL-1の細胞外部分は3つのNリンク型グリコシル化部位を含有し、シアリル化型、フコシル化型の多数のOリンク型オリゴ糖分枝を有する(Moore他、Biol. Chem. 118:445-56(1992))。N-グリカン部位のほとんど及びO-グリカン部位の多くが占有される。ヒトHL-60細胞に由来するPSGL-1のO-グリカンの構造が決定されている。これらのO-グリカンのサブセットは、セレクチンとの結合に必要となるコア-2、シアリル化型及びフコシル化型構造である。PSGL-1のアミノ末端領域のチロシン硫酸化は、P-セレクチン及びL-セレクチンとの結合にも必要である。さらに、翻訳後におそらく切断されるN末端プロペプチドがある。   PSGL-1 (also called CD162) is a mucin glycoprotein ligand for P-selectin, E-selectin and L-selectin, which shares structural similarity with GPIb (Afshar-Kharghan et al. (2001), The above). PSGL-1 is a disulfide-linked homodimer having a PACE (Paired Basic Amino Acid Converting Enzymes) cleavage site. PSGL-1 also has three potential tyrosine sulfation sites followed by 10-16 decamer repeats rich in proline, serine and threonine. The extracellular portion of PSGL-1 contains three N-linked glycosylation sites and has a number of O-linked oligosaccharide branches, sialylated and fucosylated (Moore et al., Biol. Chem. 118: 445- 56 (1992)). Most of the N-glycan sites and many of the O-glycan sites are occupied. The structure of O-glycan of PSGL-1 derived from human HL-60 cells has been determined. A subset of these O-glycans are core-2, sialylated and fucosylated structures that are required for binding to selectins. Tyrosine sulfation of the amino terminal region of PSGL-1 is also required for binding to P-selectin and L-selectin. In addition, there is an N-terminal propeptide that is probably cleaved after translation.

PSGL-1は、267残基細胞外領域、25残基膜貫通型領域、及び69残基細胞内領域とともに、HL60細胞内に361残基を有し、そして、ジスルフィド結合型ホモダイマー又はヘテロダイマーを細胞表面上に形成する(Afshar-Kharghan他、Blood 97;3306-12(2001))。PSGL-1コード配列は、単一のエクソン内にあるので、代わりのスプライシングが可能であるべきではない。しかしHL60細胞内及びほとんどの細胞系におけるPSGL-1は、細胞外領域内に存在する10残基コンセンサス配列の15の連続反復を有するものの、ほとんどの天然型白血球を含む多形核白血球、単球、及び幾つかの他の細胞系において、この配列には14反復及び16反復がある。   PSGL-1 has 361 residues in HL60 cells, together with a 267-residue extracellular region, a 25-residue transmembrane region, and a 69-residue intracellular region, and a disulfide-linked homodimer or heterodimer It forms on the cell surface (Afshar-Kharghan et al., Blood 97; 3306-12 (2001)). Since the PSGL-1 coding sequence is within a single exon, alternative splicing should not be possible. However, PSGL-1 in HL60 cells and most cell lines has 15 consecutive repeats of the 10-residue consensus sequence present in the extracellular region, but polymorphonuclear leukocytes, including most natural leukocytes, monocytes In some cell lines, and in some other cell lines, this sequence has 14 and 16 repeats.

PSGL-1は、ダイマーとして好中球上に発現され、見かけ分子量は250 kDa及び160 kDaの両方であるのに対して、HL60上ではダイマー形態はほぼ220 kDaである。低減条件下で分析すると、各サブユニットは半分に低減される。分子質量の差は、異なる数のデカマー反復の存在によって引き起こされる分子内の多形に起因し得る(Leukocyte Typing VI. T. Kishimoto他編(1997))。   PSGL-1 is expressed as a dimer on neutrophils with apparent molecular weights of both 250 kDa and 160 kDa, whereas on HL60 the dimer form is approximately 220 kDa. When analyzed under reduced conditions, each subunit is reduced in half. The difference in molecular mass can be attributed to intramolecular polymorphism caused by the presence of different numbers of decamer repeats (Leukocyte Typing VI. T. Kishimoto et al. (1997)).

ほとんどの血液白血球、例えば好中球、単球、白血球、B細胞のサブセット、及び全てのT細胞はPSGL-1を発現させる(Kishimoto他(1997)前出)。PSGL-1は、活性化された内皮、活性化された血小板、他の白血球及び炎症部位上で白血球の転動を媒介し、そしてP-セレクチン上での好中球の転動を媒介する。PSGL-1はL-セレクチンとの結合を介して好中球-好中球相互作用を媒介し、これにより炎症を媒介することもできる(Snapp他、Blood 91(1):154-64(1998))。   Most blood leukocytes such as neutrophils, monocytes, leukocytes, a subset of B cells, and all T cells express PSGL-1 (Kishimoto et al. (1997) supra). PSGL-1 mediates leukocyte rolling on activated endothelium, activated platelets, other leukocytes and sites of inflammation, and mediates neutrophil rolling on P-selectin. PSGL-1 mediates neutrophil-neutrophil interactions through binding to L-selectin, which can also mediate inflammation (Snapp et al., Blood 91 (1): 154-64 (1998 )).

白血球転動は炎症において重要であり、そしてP-セレクチン(活性化された内皮によって血小板上に発現される。血小板は損傷部位に固定化することができる)とPSGL-1との相互作用は、血管壁上での白血球の束縛及び転動のために役立つ(Ramachandran他、PNAS 98(18):10166-71(2001);Afshar-Kharghan他(2001)、前出)。細胞転動はまた転移において重要であり、内皮細胞上のP-及びE-セレクチンは、転移細胞と結合し、これにより血流から周囲組織内に溢出するのを容易にすると考えられる。   Leukocyte rolling is important in inflammation, and the interaction between P-selectin (expressed on platelets by activated endothelium. Platelets can be immobilized at the site of injury) and PSGL-1 Useful for leukocyte binding and rolling on the vessel wall (Ramachandran et al., PNAS 98 (18): 10166-71 (2001); Afshar-Kharghan et al. (2001), supra). Cell rolling is also important in metastasis, and P- and E-selectin on endothelial cells are thought to bind to metastatic cells, thereby facilitating overflow from the bloodstream into the surrounding tissue.

こうして、PSGL-1は、全ての白血球：好中球、単球、リンパ球、活性化された周囲T細胞、顆粒球、好酸球、血小板上で、また、いくつかのCD34ポジティブ幹細胞及びB細胞の或る特定のサブセット上で見いだされた。P-セレクチンとPSGL-1との相互作用は、血管壁上での白血球の転動を促進し、血管部位の白血球の異常蓄積は、種々の病的炎症をもたらす。PSGL-1上の個々のチロシン硫酸塩の立体特異的な関与は、P-セレクチンとPSGL-1との結合にとって重要である。電荷はまた結合：すなわちNaCLの(150から50mMへの)低減によって増強される結合(Kd〜75nM)にとって重要である。PSGL-1上のチロシン硫酸化は高まるが、しかしこのことはP-セレクチン上でのPSGL-1癒着に究極的に必要とされるわけではない。PSGL-1チロシン硫酸化は、全ての剪断速度でより低速の転動癒着を支援し、そしてより著しく高い剪断速度で転動癒着を支援する(Rodgers他、Biophys. J. 81:2001-09(2001))。さらに、血小板上のPSGL-1発現は、白血球の25-100分の1である(Frenette他、J. Exp. Med. 191(8): 1413-22(2000))。   Thus, PSGL-1 is on all leukocytes: neutrophils, monocytes, lymphocytes, activated surrounding T cells, granulocytes, eosinophils, platelets, and some CD34 positive stem cells and B Found on a certain subset of cells. The interaction between P-selectin and PSGL-1 promotes leukocyte rolling on the vessel wall, and abnormal accumulation of leukocytes at the vascular site results in various pathological inflammations. The stereospecific involvement of individual tyrosine sulfates on PSGL-1 is important for the binding of P-selectin and PSGL-1. Charge is also important for binding: that is, binding (Kd-75 nM) enhanced by reduction of NaCL (from 150 to 50 mM). Tyrosine sulfation on PSGL-1 is increased, but this is not ultimately required for PSGL-1 adhesion on P-selectin. PSGL-1 tyrosine sulfation supports slower rolling adhesions at all shear rates and supports rolling adhesions at significantly higher shear rates (Rodgers et al., Biophys. J. 81: 2001-09) 2001)). Furthermore, PSGL-1 expression on platelets is 25-100 times lower than leukocytes (Frenette et al., J. Exp. Med. 191 (8): 1413-22 (2000)).

ヒトPSGL-1に対する商業的に入手可能なモノクローナル抗体KPL1は、PSGL-1とP-セレクチンとの相互作用、及びPSGL-1とL-セレクチンとの相互作用を阻害することが判っている。KPL1エピトープは、PSGL-1のチロシン硫酸化領域(YEYLDYD)(SEQ ID NO:1)にマッピングされた(Snapp他、Blood 91(1):154-64(1998))。   A commercially available monoclonal antibody KPL1 against human PSGL-1 has been shown to inhibit the interaction between PSGL-1 and P-selectin and the interaction between PSGL-1 and L-selectin. The KPL1 epitope was mapped to the tyrosine sulfated region (YEYLDYD) (SEQ ID NO: 1) of PSGL-1 (Snapp et al., Blood 91 (1): 154-64 (1998)).

シアリル化型、フコシル化型のムチン・リガンドを除去する、0-シアログリコプロテアーゼによる腫瘍細胞の前処理はまた、腫瘍細胞-血小板複合体の形成を阻害した。in vivo試験が示すところによれば、これらの処理のいずれの結果としても、単球が循環腫瘍細胞とより大きく会合するようになり、このことは血小板結合の低減が、循環腫瘍細胞への免疫細胞によるアクセスを増大させることを示唆する(Varki及びVarki, Braz. J. Biol. Res. 34(6):711-17(2001))。   Pretreatment of tumor cells with 0-sialoglycoprotease, which removes sialylated and fucosylated mucin ligands, also inhibited the formation of tumor cell-platelet complexes. In vivo studies show that, as a result of either of these treatments, monocytes become more associated with circulating tumor cells, indicating that the reduction in platelet binding is responsible for immunity to circulating tumor cells. It suggests increasing access by cells (Varki and Varki, Braz. J. Biol. Res. 34 (6): 711-17 (2001)).

フィブリノゲン
正常なヒト・フィブリノゲンには2つの形態、すなわち正常(γ)及びγプライムがある。これらの形態のそれぞれは正常な個体において見いだされる。より豊富な形態(体内に見いだされる総フィブリノゲンのほぼ90%)である正常フィブリノゲンは、2つの同一の55 kDa α鎖、2つの同一の95 kDa β鎖、及び2つの同一の49.5 kDa γ鎖から成る。より豊富でない形態である正常変異形フィブリノゲン(体内に見いだされる総フィブリノゲンのほぼ10%)は、2つの同一の55 kDa α鎖、2つの同一の95 kDa β鎖、1つの49.5 kDa γ鎖、及び1つの変異体50.5 kDa γプライム鎖から成る。ガンマ及びガンマ・プライム鎖は両方とも、同じ遺伝子によってコードされ、代わりのスプライシングが3'末端に発生する。正常ガンマ鎖は、アミノ酸1-411から成り、そして正常変異形ガンマ・プライム鎖は427個のアミノ酸から成り、これらのアミノ酸のうちアミノ酸1-407は正常ガンマ鎖におけるアミノ酸と同じであり、アミノ酸408-427はVRPEHPAETEYDSLYPEDDL(SEQ ID NO:2)である。この領域は通常、トロンビン分子によって占有される。 Fibrinogen Normal human fibrinogen has two forms: normal (γ) and γ prime. Each of these forms is found in normal individuals. Normal fibrinogen, a more abundant form (nearly 90% of the total fibrinogen found in the body), consists of two identical 55 kDa alpha chains, two identical 95 kDa beta chains, and two identical 49.5 kDa gamma chains. Become. The less abundant form of normal mutant fibrinogen (almost 10% of the total fibrinogen found in the body) consists of two identical 55 kDa alpha chains, two identical 95 kDa beta chains, one 49.5 kDa gamma chain, and One variant consists of a 50.5 kDa gamma prime chain. Both gamma and gamma prime strands are encoded by the same gene, with alternative splicing occurring at the 3 ′ end. The normal gamma chain consists of amino acids 1-411 and the normal variant gamma prime chain consists of 427 amino acids, of which amino acids 1-407 are the same as the amino acids in the normal gamma chain and amino acids 408 -427 is VRPEHPAETEYDSLYPEDDL (SEQ ID NO: 2). This region is usually occupied by thrombin molecules.

フィブリノゲンは、イオン化されたカルシウムの存在においてトロンビンの作用によってフィブリンに変換されることにより血液の凝固が生成される。フィビリンはまた血栓及び急性炎症性滲出液の1成分である。   Fibrinogen is converted to fibrin by the action of thrombin in the presence of ionized calcium to produce blood clots. Fivirin is also a component of thrombus and acute inflammatory exudate.

従って、本発明の目的は、硫酸化PSGL-1と結合する種々の抗体又はポリペプチド、及びその使用方法を提供することである。   Accordingly, it is an object of the present invention to provide various antibodies or polypeptides that bind to sulfated PSGL-1 and methods of use thereof.

具体的には、本発明の目的は、本発明の抗体を投与することによって、ADCCを活性化するか又はナチュラルキラー(NK)又はT細胞を刺激する方法を提供することである。   Specifically, an object of the present invention is to provide a method of activating ADCC or stimulating natural killer (NK) or T cells by administering the antibody of the present invention.

本発明の別の特定の目的は、細胞死を誘発する方法を提供することである。   Another particular object of the present invention is to provide a method for inducing cell death.

本発明のさらに別の特定の目的は、本明細書中に記載された抗体を、当該感染の防止を必要とする患者に投与することを含む、ウィルス、例えばHIVによる感染を防止する方法を提供することである。   Yet another specific object of the present invention provides a method for preventing infection by a virus, eg, HIV, comprising administering an antibody described herein to a patient in need of prevention of said infection. It is to be.

本発明のさらに別の特定の目的は、硫酸化型PSGL-1を発現させる細胞内に薬剤を導入する方法であって、下記ステップ：本明細書中に記載された抗体に薬剤をカップリング又は複合し、そして、抗体-薬剤カップリング体又は複合体を細胞に投与するステップを有する方法を提供することである。   Yet another specific object of the invention is a method for introducing a drug into a cell that expresses sulfated PSGL-1, comprising the following steps: coupling the drug to the antibody described herein or It is intended to provide a method comprising the steps of conjugating and administering an antibody-drug coupling agent or conjugate to a cell.

最後に、本発明の特定の目的は、本発明の抗体を使用して診断、予後又は病期診断の方法を提供することである。   Finally, a particular object of the present invention is to provide a method for diagnosis, prognosis or staging using the antibodies of the present invention.

発明の概要
本発明は、モチーフD-X-Y-D(SEQ ID NO:3)を含むPSGL-1のエピトープに結合する抗体又はポリペプチドであって、Xは任意のアミノ酸、又はDとYとの共有結合を表し、そしてYは硫酸化されており、抗体は、抗癌薬、抗白血病薬、抗転移薬、抗新生物薬、抗疾患薬、抗癒着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウィルス薬、及び抗炎症薬から成る群から選択された薬剤の複数のコピーとカップリング又は複合することができる、抗体又はポリペプチドを提供する。 SUMMARY OF THE INVENTIONThe present invention is an antibody or polypeptide that binds to an epitope of PSGL-1 comprising the motif DXYD (SEQ ID NO: 3), wherein X represents any amino acid or a covalent bond between D and Y. , And Y is sulfated, and antibodies are anti-cancer drugs, anti-leukemia drugs, anti-metastatic drugs, anti-neoplastic drugs, anti-disease drugs, anti-adhesion drugs, anti-thrombotic drugs, anti-restenosis drugs, anti-autoimmunity Provided is an antibody or polypeptide that can be coupled or complexed with multiple copies of a drug selected from the group consisting of drugs, anti-aggregating drugs, antibacterial drugs, antiviral drugs, and anti-inflammatory drugs.

本発明の抗体は、抗体依存性細胞の細胞毒性を誘発し、且つ/又はナチュラルキラー(NK)細胞又はT細胞を刺激する方法において使用することができる。加えて、これらの抗体をこれを必要とする患者に投与することにより、細胞死を誘発する方法が提供される。当該感染の予防を必要とする患者に本発明の抗体を投与することにより、ウィルス(例えばHIV)による感染を予防する方法も提供される。本発明はまた、本発明の抗体に薬剤をカップリング又は複合し、そして細胞に抗体-薬剤カップリング体又は複合体を細胞に投与することにより、硫酸化型PSGL-1を発現させる細胞中に薬剤を導入する方法を提供する。本発明はさらに、腫瘍細胞マーカーを同定し、分離し、そして精製する方法を提供する。最後に、本発明は、本発明の抗体を使用して診断、予後又は病期診断の方法を提供する。   The antibodies of the present invention can be used in methods of inducing cytotoxicity of antibody-dependent cells and / or stimulating natural killer (NK) cells or T cells. In addition, methods are provided for inducing cell death by administering these antibodies to a patient in need thereof. Also provided is a method for preventing infection by a virus (eg, HIV) by administering the antibody of the present invention to a patient in need of prevention of the infection. The present invention also provides a method for coupling sulfated PSGL-1 into a cell by coupling or conjugating a drug to the antibody of the present invention and administering the antibody-drug coupling agent or complex to the cell. A method of introducing a drug is provided. The invention further provides methods for identifying, isolating and purifying tumor cell markers. Finally, the present invention provides methods for diagnosis, prognosis or staging using the antibodies of the present invention.

発明の詳細な説明
抗体(Abs)又は免疫グロブリン(Igs)は、抗原に結合するタンパク質分子である。自然発生型抗体の各機能結合ユニットは、ジスルフィド結合によって一緒にリンクされた4つのポリペプチド鎖(2つは重鎖であり2つは軽鎖である)のユニットから成る。鎖のそれぞれは定常領域及び可変領域を有する。自然発生型抗体は、これらの重鎖成分を基準として、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEを含むいくつかのクラスに分類することができる。IgGクラスは、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含むいくつかのサブクラスを含む。Bリンパ球によって免疫グロブリンをin vivoで生成し、そしてそれぞれのこのような分子は特定の外来抗原決定基を認識し、そしてその抗原のクリヤリングを容易にする。 Detailed Description of the Invention Antibodies (Abs) or immunoglobulins (Igs) are protein molecules that bind to an antigen. Each functional binding unit of a naturally occurring antibody consists of units of four polypeptide chains (two are heavy chains and two are light chains) linked together by disulfide bonds. Each chain has a constant region and a variable region. Naturally occurring antibodies can be classified into several classes including IgG, IgM, IgA, IgD and IgE based on these heavy chain components. The IgG class includes several subclasses including, for example, IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 and IgG 4 . Immunoglobulins are generated in vivo by B lymphocytes, and each such molecule recognizes a particular foreign antigenic determinant and facilitates the clearing of that antigen.

抗体は、抗体複合体を含む数多くの形態で生成して使用することができる。本明細書中に使用される「抗体複合体」は、1つ又は2つ以上の抗体と別の抗体、又は抗体断片との複合体、又は2つ又は3つ以上の抗体断片の複合体を意味するために使用される。抗体断片の例は、Fv、Fab、F(ab')2、Fc及びFd断片を含む。従って、本発明による抗体は、抗体又は抗体断片の複合体を含む。 Antibodies can be generated and used in a number of forms, including antibody conjugates. As used herein, an “antibody complex” is a complex of one or more antibodies and another antibody or antibody fragment, or a complex of two or more antibody fragments. Used to mean. Examples of antibody fragments include Fv, Fab, F (ab ′) 2 , Fc and Fd fragments. Thus, an antibody according to the present invention comprises a complex of antibodies or antibody fragments.

本明細書及び特許請求の範囲において使用するFvは、ヒト抗体の重鎖の可変領域と、同じもの又は異なるものであってよいヒト抗体の軽鎖の可変領域とから形成された分子として定義される。ヒト抗体において、重鎖の可変領域は、軽鎖の可変領域と結合、リンク、融合又は共有結合、又は会合されている。Fvは単鎖Fv(scFv)又はジスルフィド安定化型Fv(dsFv)であってよい。scFvは、フレキシブルなアミノ酸ポリペプチド・スペーサー又はリンカーによってリンクされた、抗体の重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域から成る。リンカーは分枝型又は非分枝型であってよい。好ましくはリンカーは0-15アミノ酸残基であり、そして最も好ましくはリンカーは(Cly4Ser)3である。 As used herein and in the claims, Fv is defined as a molecule formed from the variable region of a human antibody heavy chain and the variable region of a human antibody light chain, which may be the same or different. The In human antibodies, the variable region of the heavy chain is bound, linked, fused or covalently bound or associated with the variable region of the light chain. Fv may be single chain Fv (scFv) or disulfide stabilized Fv (dsFv). The scFv consists of the variable regions of each antibody heavy and light chain linked by a flexible amino acid polypeptide spacer or linker. The linker may be branched or unbranched. Preferably the linker is 0-15 amino acid residues, and most preferably the linker is (Cly 4 Ser) 3 .

Fv分子自体は、第1鎖と第2鎖とから成っている。各鎖は第1、第2及び第3の超可変領域を有している。軽鎖及び重鎖の可変領域内部の超可変ループは、相補性決定領域(CDR)と呼ばれている。重鎖及び軽鎖のそれぞれには、CDR1、CDR2及びCDR3領域がある。これらの領域は、抗原結合部位を形成すると考えられ、そして具体的には修飾することにより、結合活性を高めることができる。性質上これらの領域のうちで最も可変なのは重鎖のCDR3領域である。CDR3領域は、Ig分子の最も暴露された領域であると理解され、そして本明細書中に示すように、観察される選択的且つ/又は特異的結合特性に主に関与する部位である。   The Fv molecule itself consists of a first strand and a second strand. Each chain has a first, second and third hypervariable region. The hypervariable loops within the light and heavy chain variable regions are called complementarity determining regions (CDRs). In each of the heavy and light chains there is a CDR1, CDR2 and CDR3 region. These regions are thought to form antigen binding sites and can be specifically modified to enhance binding activity. By nature, the most variable of these regions is the CDR3 region of the heavy chain. The CDR3 region is understood to be the most exposed region of the Ig molecule and is the site primarily responsible for the observed selective and / or specific binding properties as shown herein.

Fv分子の断片は、元のFvの選択的且つ/又は特異的結合特性を依然として維持する、元のFvよりも小さな任意の分子として定義される。このような断片の例の一例としては、(1)Fvの重鎖だけの断片を含むミニ・ボディ、(2)抗体重鎖可変領域の小さな部分ユニットを含むミクロ・ボディ(国際出願第PCT/IL99/00581号明細書)、(3)軽鎖の断片を有する同様のボディ、及び(4)軽鎖可変領域の機能ユニットを有する同様のボディが挙げられる。いうまでもなく、FV分子の断片は実質的に環状又はループ状のポリペプチドであってよい。   A fragment of an Fv molecule is defined as any molecule smaller than the original Fv that still maintains the selective and / or specific binding properties of the original Fv. Examples of such fragments include (1) a mini-body containing only the heavy chain of Fv, (2) a micro-body containing a small partial unit of the antibody heavy chain variable region (International Application No.PCT / IL99 / 00581), (3) a similar body having a light chain fragment, and (4) a similar body having a light chain variable region functional unit. Needless to say, the fragment of the FV molecule may be a substantially circular or looped polypeptide.

本明細書に使用される用語「Fab断片」は、免疫グロブリンの一価抗原結合断片である。Fab断片は軽鎖と重鎖部分とから成っている。   The term “Fab fragment” as used herein is a monovalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin. The Fab fragment consists of a light chain and a heavy chain part.

F(ab')2断片は、ペプシン消化によって得られる免疫グロブリンの二価抗原結合断片である。これは両軽鎖と両重鎖の部分を含有する。 The F (ab ′) 2 fragment is an immunoglobulin bivalent antigen-binding fragment obtained by pepsin digestion. This contains both light and heavy chain parts.

Fc断片は免疫グロブリンの非抗原結合部分である。これは重鎖のカルボキシ末端部分と、Fc受容体の結合部位とを含有する。   Fc fragments are non-antigen binding portions of immunoglobulins. This contains the carboxy-terminal portion of the heavy chain and the Fc receptor binding site.

Fd断片は、免疫グロブリンの重鎖の可変領域、及び第1定常領域である。   The Fd fragment is the variable region of the immunoglobulin heavy chain and the first constant region.

ポリクローナル抗体は、免疫応答の生成物であり、多数の種々異なるリンパ球によって形成される。モノクローナル抗体は、1つのクローナルB細胞に由来する。   Polyclonal antibodies are the product of an immune response and are formed by a number of different lymphocytes. Monoclonal antibodies are derived from one clonal B cell.

ポリペプチドに適用され、また本発明において定義されるカセットは、所与の連続アミノ酸配列を意味する。この配列はフレームワークとして役立ち、単一のユニットと考えられ、そしてそのようなものとして操作される。アミノ酸を一方又は両方の末端で置換、挿入、除去又は結合することができる。同様にアミノ酸の延在部分を一方又は両方の末端で置換、挿入、除去又は結合することができる。   A cassette as applied to a polypeptide and as defined in the present invention means a given contiguous amino acid sequence. This array serves as a framework, is considered a single unit, and is manipulated as such. Amino acids can be substituted, inserted, removed or joined at one or both termini. Similarly, extended portions of amino acids can be substituted, inserted, removed or joined at one or both ends.

「エピトープ」という用語は、本明細書中では、抗原決定基又は認識部位、又は抗体、抗体断片、抗体複合体、又はその結合断片又はT細胞受容体を有する複合体と相互作用する抗原部位を意味するのに使用される。エピトープという用語は、リガンド、ドメイン及び結合領域という用語と本明細書中において相互置き換え可能に使用される。   The term “epitope” as used herein refers to an antigenic determinant or recognition site, or an antigenic site that interacts with an antibody, antibody fragment, antibody complex, or binding fragment thereof or complex with a T cell receptor. Used to mean. The term epitope is used interchangeably herein with the terms ligand, domain and binding region.

選択性は本明細書中において、エンティティ又はエンティティ状態の混合物から1つのエンティティ又は細胞状態を選んでこれに結合するターゲッティング分子の能力として定義される。このエンティティ又はエンティティ状態は全て、ターゲッティング分子に対して特異的であってよい。   Selectivity is defined herein as the ability of a targeting molecule to select and bind to an entity or cell state from an entity or mixture of entity states. All of this entity or entity state may be specific for the targeting molecule.

本明細書中に使用される「アフィニティ」という用語は、結合分子(例えば抗体上の1結合部位)と、リガンド(例えば抗原決定基)との間の結合強度の尺度(会合定数)である。抗体上の単一の抗原結合部位と単一のエピトープとの非共有相互作用の合計の強度は、そのエピトープに対する抗体のアフィニティである。低アフィニティ抗体は抗原と弱く結合し、容易に解離する傾向があるのに対し、高アフィニティ抗体はより密に抗原に結合し、より長く結合され続ける。「アビディティ」という用語はアフィニティとは異なる。なぜならば、前者は抗原-抗体相互作用の原子価を反映するからである。   As used herein, the term “affinity” is a measure of binding strength (association constant) between a binding molecule (eg, one binding site on an antibody) and a ligand (eg, an antigenic determinant). The total strength of the non-covalent interaction between a single antigen binding site on an antibody and a single epitope is the affinity of the antibody for that epitope. Low affinity antibodies bind weakly to antigens and tend to dissociate easily, whereas high affinity antibodies bind to antigens more tightly and continue to bind longer. The term “avidity” is different from affinity. This is because the former reflects the valence of the antigen-antibody interaction.

抗体-抗原相互作用の特異性：抗体-抗原反応は特異的ではあるものの、いくつかの事例では、1抗原によって誘発される抗体が別の無関係の抗原と交差反応することができる。2つの異なる抗原が相同又は同様の構造、エピトープ、又はそのアンカー領域を共有する場合、或いは、1エピトープに対して特異的な抗体が同様の構造配座又は化学特性をプロセッシングする無関係のエピトープに結合する場合に、このような交差反応が発生する。   Specificity of antibody-antigen interaction: Although the antibody-antigen reaction is specific, in some cases, an antibody elicited by one antigen can cross-react with another unrelated antigen. When two different antigens share a homologous or similar structure, epitope, or anchor region thereof, or an antibody specific for one epitope binds to an irrelevant epitope that processes similar structural conformations or chemical properties In such a case, such a cross reaction occurs.

血小板は骨髄内で発生し、続いて末梢血流内で循環する巨核球のディスク状細胞質断片である。血小板は、凝固における主要な役割を含むいくつかの生理学的機能を有する。血小板は中心に配置された顆粒及び周囲のクリアな原形質を含有するが、しかし、明確な核は有していない。   Platelets are discoid cytoplasmic fragments of megakaryocytes that develop in the bone marrow and subsequently circulate in the peripheral blood stream. Platelets have several physiological functions, including a major role in clotting. Platelets contain centrally located granules and surrounding clear protoplasts, but do not have a clear nucleus.

本明細書中に使用される「アグルチネーション」は、懸濁された同様のサイズの細菌、細胞、ディスク又はその他の粒子を癒着させ、塊を形成させるプロセスを意味する。このプロセスは沈澱に似ているが、粒子はより大きく、溶液中にあるのではなく懸濁液中にある。   “Agglutination” as used herein refers to the process of causing suspended, similarly sized bacteria, cells, discs or other particles to coalesce and form a mass. This process is similar to precipitation, but the particles are larger and are in suspension rather than in solution.

「凝集」という用語は、血栓又は止血血栓の形成に通じる順次的なメカニズムの一部として、in vitroで誘発される血小板、及びトロンビン及びコラーゲンの塊形成を意味する。   The term “aggregation” means in vitro induced platelet and thrombin and collagen mass formation as part of the sequential mechanism leading to the formation of thrombus or hemostatic thrombus.

同類アミノ酸置換は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、又はその断片の1つ又は2つのアミノ酸を変化させることによる、アミノ酸組成の変化として定義される。置換は、概ね類似の特性(例えば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正又は負の電荷、極性、非極性)を有するアミノ酸によって行われるので、置換はペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の特性(電荷、等電点、アフィニティ、アビディティ、配座、溶解度)又は活性をほとんど変えない。このような同類アミノ酸置換のために行うことができる典型的な置換は、下記アミノ酸群：
グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)及びイソロイシン(I)
アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)
アラニン(A)、セリン(S)及びトレオニン(T)
ヒスチジン(H)、リシン(K)及びアルギニン(R)
アスパラギン(N)及びグルタミン(Q)
フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)及びトリプトファン(W)
の中から行われてよい。 A conservative amino acid substitution is defined as a change in amino acid composition by changing one or two amino acids of a peptide, polypeptide or protein, or fragment thereof. Substitutions are made by amino acids with generally similar properties (e.g., acidic, basic, aromatic, size, positive or negative charge, polar, nonpolar), so substitution is a property of a peptide, polypeptide or protein (charge , Isoelectric point, affinity, avidity, conformation, solubility) or activity. Exemplary substitutions that can be made for such conservative amino acid substitutions include the following amino acid groups:
Glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L) and isoleucine (I)
Aspartic acid (D) and glutamic acid (E)
Alanine (A), serine (S) and threonine (T)
Histidine (H), lysine (K) and arginine (R)
Asparagine (N) and glutamine (Q)
Phenylalanine (F), tyrosine (Y) and tryptophan (W)
May be done from within.

同類アミノ酸置換は、例えば分子の選択的且つ/又は特異的結合特性に主に関与する超可変領域をフランキングする領域、並びに分子の他の部分、例えば可変重鎖カセットにおいて形成することができる。これに加えて、又はこれとは別に、分子を再構成してフルサイズの抗体、ダイアボディ(ダイマー)、トリアボディ(トリマー)及び/又はテトラボディ(テトラマー)を形成するか、或いは、ミニボディ又はミクロボディを形成することにより、修飾を達成することもできる。   Conservative amino acid substitutions can be made, for example, in regions flanking hypervariable regions that are primarily responsible for the selective and / or specific binding properties of the molecule, as well as in other parts of the molecule, such as variable heavy chain cassettes. In addition or alternatively, the molecule may be reconstituted to form full size antibodies, diabodies (dimers), triabodies (trimers) and / or tetrabodies (tetramers), or minibodies Alternatively, modifications can be achieved by forming microbodies.

ファージミドは、プラスミドDNAを担持するファージ粒子として定義される。ファージミドは、繊維状ファージ、例えばfd又はm13からの複製の起源を含有するように設計されたプラスミド・ベクターである。ファージミドはプラスミドDNAを担持するので、ファージミド粒子は、ファージ・ゲノムの完全補体を含有するのに十分なスペースを有さない。ファージ・ゲノムから欠落した成分は、ファージ粒子をパッケージングするのに必須の情報である。従ってファージを増殖するために、欠落パッケージング情報を補完するヘルパー・ファージ株と一緒に、所望のファージ粒子を培養することが必要である。   A phagemid is defined as a phage particle carrying plasmid DNA. A phagemid is a plasmid vector designed to contain an origin of replication from a filamentous phage, such as fd or m13. Because the phagemid carries plasmid DNA, the phagemid particles do not have enough space to contain the complete complement of the phage genome. Components missing from the phage genome are essential information for packaging phage particles. Therefore, in order to propagate the phage, it is necessary to culture the desired phage particles together with a helper phage strain that complements the missing packaging information.

プロモーターは、RNAポリメラーゼが結合して転写を開始するDNA上の領域である。   A promoter is a region on DNA where RNA polymerase binds and initiates transcription.

ファージ提示ライブラリー(ファージ・ペプチド/抗体ライブラリー、ファージ・ライブラリー、又はペプチド/抗体ライブラリーと呼ばれる)は、ファージの大きな個体群(108以上)を含み、各ファージ粒子は異なるペプチド又はポリペプチド配列を提示する。これらのペプチド又はポリペプチド断片は、可変の長さを有するように構成することができる。提示されたペプチド又はポリペプチドは、例えばヒト抗体重鎖又は軽鎖に由来することが可能である。 A phage display library (referred to as a phage peptide / antibody library, phage library, or peptide / antibody library) comprises a large population of phage (over 10 8 ), each phage particle having a different peptide or poly The peptide sequence is presented. These peptides or polypeptide fragments can be constructed to have variable lengths. The presented peptide or polypeptide can be derived, for example, from a human antibody heavy or light chain.

医薬組成物は、本発明の抗体又はペプチド又はポリペプチド、及び製薬上許容可能なキャリヤ、賦形剤又はその希釈剤、又は抗体-医薬剤(抗体-薬剤)複合体、及び製薬上許容可能なキャリヤ、賦形剤又はその希釈剤を含む配合物を意味する。   A pharmaceutical composition comprises an antibody or peptide or polypeptide of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent thereof, or an antibody-pharmaceutical agent (antibody-drug) complex, and a pharmaceutically acceptable It means a formulation comprising a carrier, excipient or diluent thereof.

本発明との関連における薬剤は、例えばヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ、又は任意のその他の温血動物を含む哺乳動物の活性疾患の治療、予防的治療、又は診断に有用である。薬剤は、放射性同位体、毒素、オリゴヌクレオチド、組換えタンパク質、抗体断片、抗癌薬、抗白血病薬、抗転移薬、抗新生物薬、抗疾患薬、抗癒着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウィルス薬、及び抗炎症薬から成る群から選択される。このような薬剤の他の例は、例えばアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンを含む抗ウィルス薬；シロスタゾル、ダルテパリン・ナトリウム、レビパリン・ナトリウム、及びアスピリンを含む抗血栓/抗再狭窄薬；ザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、アセチルサリチル酸17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドを含む抗炎症薬；レフルノミド、デニロイキン・ジフチトックス、スブレウム、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミドを含む抗自己免疫薬；及びリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸を含む抗癒着/抗凝集薬、を含む。   Agents in the context of the present invention are useful in the treatment, prophylactic treatment, or diagnosis of active diseases in mammals including, for example, humans, cows, horses, pigs, mice, dogs, cats, or any other warm-blooded animal It is. Drugs are radioisotopes, toxins, oligonucleotides, recombinant proteins, antibody fragments, anticancer drugs, anti-leukemia drugs, anti-metastatic drugs, anti-neoplastic drugs, anti-disease drugs, anti-adhesion drugs, anti-thrombotic drugs, anti-recurrent drugs Selected from the group consisting of stenosis, anti-autoimmune, anti-aggregating, antibacterial, antiviral, and anti-inflammatory agents. Other examples of such agents include antiviral drugs including, for example, acyclovir, ganciclovir and zidovudine; antithrombotic / anti-restenotic drugs including cilostazol, dalteparin sodium, leviparin sodium, and aspirin; zaltoprofen, pranoprofen, Anti-inflammatory drugs including droxicam, acetylsalicylic acid 17, diclofenac, ibuprofen, dexbuprofen, sulindac, naproxen, amtormethine, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide; leflunomide, denileukin diftitox, subureum, WinRho SDF and phosbrochido defibrotide And anti-adhesion / anti-aggregation drugs including limaprost, chlorchromene and hyaluronic acid.

抗白血病薬は、抗白血病活性を有する薬剤である。例えば抗白血病薬は、白血病細胞又は未熟な前白血病細胞の成長を阻害又は中止する薬剤、白血病細胞又は前白血病細胞を殺す薬剤、他の抗白血病薬に対する白血病細胞又は前白血病細胞の感受性を高める薬剤、及び白血病細胞の転移を阻害する薬剤を含む。本発明において、抗白血病薬は、腫瘍の脈管化を防止、阻害、遅延又は中止する抗血管形成薬を有する薬剤であってもよい。   An anti-leukemic drug is a drug having anti-leukemic activity. For example, an anti-leukemic drug is an agent that inhibits or stops the growth of leukemia cells or immature pre-leukemic cells, an agent that kills leukemia cells or pre-leukemic cells, an agent that increases the sensitivity of leukemia cells or pro-leukemic cells to other anti-leukemic cells And agents that inhibit leukemia cell metastasis. In the present invention, the anti-leukemic agent may be an agent having an anti-angiogenic agent that prevents, inhibits, delays or stops tumor vascularization.

遺伝子の発現パターンは、種々の条件下で、特定の時間に、種々の組織内などで生成された遺伝子生成物の量を分析することにより研究することができる。遺伝子は、遺伝子生成物の量が、正常な対照、例えば非疾患対照において見いだされるよりも高いときに「過剰発現」されたと考えられる。   Gene expression patterns can be studied by analyzing the amount of gene product produced in various tissues, etc., at various times under various conditions. A gene is considered "overexpressed" when the amount of gene product is higher than found in normal controls, such as non-disease controls.

所与の細胞は、その表面上に、所与の抗体のための結合部位(又はエピトープ)を有するタンパク質を発現させることができるが、しかしその結合部位は、第1期(段階I)と呼ぶことができる状態において、細胞中に曖昧な形態で(例えば立体障害又はブロックされた形態、又は抗体による結合に必要な特徴の欠如)存在することがある。段階Iは、例えば正常で健常な非疾患状態であることが可能である。エピトープが曖昧な形態で存在する場合、このエピトープは所与の抗体によって認識されない。すなわち、抗体とこのエピトープとの結合、又は抗体と段階Iにおける所与の細胞との結合はない。しかし、エピトープは、例えばそれ自体に修飾を施すか、又はブロック解除することにより暴露することができる。なぜならば、隣接する又は会合された分子が修飾されるか、又は或る領域が配座変化させられるからである。修飾の例は、折り畳みの変化、翻訳後修飾の変化、リン脂質化の変化、硫酸化の変化、グリコシル化の変化などを含む。細胞が第2期(段階II)と呼ぶことができる異なる状態に侵入すると、このようは修飾が発生し得る。第2の状態又は第2期の例は、活性化、増殖、トランスフォーメーション又は悪性状態を含む。修飾されると、次いでエピトープを暴露することができ、そして抗体が結合することができる。   A given cell can express a protein on its surface that has a binding site (or epitope) for a given antibody, but that binding site is referred to as the first phase (stage I) In situations where it is possible, it may be present in the cell in an ambiguous form (eg, steric hindrance or blocked form, or lack of features necessary for antibody binding). Stage I can be, for example, a normal and healthy non-disease state. If an epitope is present in an ambiguous form, this epitope is not recognized by a given antibody. That is, there is no binding of the antibody to this epitope, or binding of the antibody to a given cell in stage I. However, an epitope can be exposed, for example, by modifying itself or unblocking. This is because adjacent or associated molecules are modified or certain regions are conformed. Examples of modifications include changes in folding, changes in post-translational modifications, changes in phospholipidation, changes in sulfation, changes in glycosylation, and the like. This modification can occur when cells enter a different state, which can be called the second phase (stage II). Examples of the second condition or stage 2 include activation, proliferation, transformation or malignant conditions. Once modified, the epitope can then be exposed and the antibody can bind.

ペプチド類似体は、アミノ酸の間に任意のペプチド結合、すなわちアミド結合をもはや含有しない分子(例えば抗体)であるが、本発明との関連において、ペプチド類似体という用語は、性質上もはや完全にはペプチド性ではない分子、例えばシュード・ペプチド、半ペプチド及びペプトイドを含むものとする。完全に非ペプチドであろうと部分的に非ペプチドであろうと、本発明によるペプチド類似体は、ペプチド類似体の基準となるペプチド内の活性基の三次元配列に酷似する反応性化学部分の空間的配列を提供する。これらの分子は小分子、脂質、多糖、又はこれらの複合体を含む。   Peptide analogs are molecules that no longer contain any peptide bonds, i.e. amide bonds, between amino acids (e.g. antibodies), but in the context of the present invention, the term peptide analog is no longer completely in nature. It is intended to include molecules that are not peptidic, such as pseudo-peptides, half-peptides and peptoids. Whether completely non-peptide or partially non-peptide, the peptide analog according to the present invention is a spatially reactive chemical moiety that closely resembles the three-dimensional arrangement of active groups within the peptide that is the basis for the peptide analog. Provide an array. These molecules include small molecules, lipids, polysaccharides, or complexes thereof.

ファージミドは、繊維状ファージ、例えばM13又はfdからの複製の起源を含有するように設計されたプラスミド・ベクターである。   A phagemid is a plasmid vector designed to contain a source of replication from a filamentous phage, such as M13 or fd.

細胞特異的且つ/又は疾患特異的リガンドをこれらの表面上に発現させる、疾患細胞、変化細胞又はその他の修飾細胞を伴う広範囲の疾患が存在する。これらのリガンドを利用することにより、各個別の細胞を認識、選択、診断及び治療することにより、特異的疾患の認識、選択、診断及び治療をもたらすことができる。本発明は、全て結合特性が高められたFv分子、その構造、その断片、その断片の構造、又は構造の断片を含むペプチド又はポリペプチドを提供する。これらの結合特性は、ペプチド又はポリペプチド分子が、他の細胞に優先してターゲット細胞に選択的且つ/又は特異的に結合することを可能にし、その結合特異性及び/又は選択性は主として第1の超可変領域によって決定される。FvはscFv又はdsFvであってよい。   There is a wide range of diseases with disease cells, altered cells or other modified cells that express cell-specific and / or disease-specific ligands on these surfaces. By utilizing these ligands, recognition, selection, diagnosis and treatment of specific diseases can be provided by recognizing, selecting, diagnosing and treating each individual cell. The present invention provides Fv molecules, structures, fragments thereof, fragment structures, or fragments of structures, all of which have enhanced binding properties. These binding properties allow a peptide or polypeptide molecule to selectively and / or specifically bind to a target cell in preference to other cells, whose binding specificity and / or selectivity is primarily Determined by one hypervariable region. Fv may be scFv or dsFv.

上記Fv分子を使用することにより、疾患細胞をターゲットすることができる。疾患細胞は例えば癌細胞であってよい。特異的ターゲッティングによって診断及び/又は治療されやすい癌のタイプの例は、例えば癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽細胞腫、セミノーマ及びメラノーマを含む。白血病、リンパ腫及び骨髄腫は、骨髄及びリンパ組織を起源とし、コントロールされない細胞成長に関与する癌である。   By using the Fv molecule, disease cells can be targeted. The disease cell can be, for example, a cancer cell. Examples of types of cancer that are amenable to diagnosis and / or treatment by specific targeting include, for example, carcinoma, sarcoma, leukemia, adenoma, lymphoma, myeloma, blastoma, seminoma and melanoma. Leukemia, lymphoma, and myeloma are cancers that originate in bone marrow and lymphoid tissue and are involved in uncontrolled cell growth.

PSGL-1及び/又はGPIbに結合する抗体は、ファージ提示ライブラリーを使用して同定され、米国特許出願第10/032,423号；同第10/032,037号；同第10/029,988号；同第10/029,926号；同第09/751,181号；同第10/189,032号；及び同第60/258,948号の各明細書及び国際出願第PCT/US01/49442号明細書及び同第PCT/US01/49440号明細書に開示された。これらの出願明細書に開示された抗体の具体例は、Y1、Y17及びL32抗体を含む。これらの抗体は、生殖細胞系(DP32)から分離され、そして、造血性細胞のタンパク質上に見いだされたエピトープに特異的に結合することが発見された。このエピトープはN末端チロシンで硫酸化され、そして細胞移動、例えば腫瘍転移に関与すると考えられる。   Antibodies that bind to PSGL-1 and / or GPIb have been identified using phage display libraries and are described in US Patent Application Nos. 10 / 032,423; 10 / 032,037; 10 / 029,988; / 029,926; 09 / 751,181; 10 / 189,032; and 60 / 258,948 and International PCT / US01 / 49442 and PCT / US01 / 49440 It was disclosed in the specification. Specific examples of antibodies disclosed in these application specifications include Y1, Y17 and L32 antibodies. These antibodies were isolated from germline (DP32) and were found to bind specifically to epitopes found on hematopoietic cell proteins. This epitope is sulfated at the N-terminal tyrosine and is thought to be involved in cell migration such as tumor metastasis.

Y1/Y17/L32に結合する硫酸化型エピトープは、硫酸化部分、例えば硫酸化型チロシン残基又は硫酸化型炭水化物又は脂質部分が、好ましくは2つ又は3つ以上の酸性アミノ酸のクラスター内部に存在することによって特徴付けられる。これらの硫酸化部分は、炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、癒着、血栓及び/又は再狭窄、細胞転動、及び凝集のような種々様々なプロセスにおいて重要な役割を演じるリガンド及び受容体上に見いだされる。このようなエピトープは、疾患細胞、例えばT-ALL細胞、B-白血病細胞、B-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞、及び転移細胞上にも見いだされる。これらのエピトープは、これらのプロセスの治療媒介(並びにターゲッティング薬)及び診断処置のための有用なターゲットである。   Sulfated epitopes that bind to Y1 / Y17 / L32 have sulfated moieties, such as sulfated tyrosine residues or sulfated carbohydrate or lipid moieties, preferably within the cluster of two or more acidic amino acids. Characterized by the presence. These sulfated moieties are ligands that play an important role in a wide variety of processes such as inflammation, immune response, infection, autoimmune response, metastasis, adhesion, thrombus and / or restenosis, cell mobilization, and aggregation. Found on the receptor. Such epitopes are also found on diseased cells such as T-ALL cells, B-leukemia cells, B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells, and metastatic cells. These epitopes are useful targets for therapeutic mediation (and targeting agents) and diagnostic treatment of these processes.

さらに、本発明のこれらの抗体に関して、結合が細胞の発育段階に依存することが判った(AMLサブタイプは、日常的なプロセッシング及び細胞化学的染色下で観察される形態学を用いて、French-American-Britishシステムに基づいて分類される)。すなわち、抗体はサブタイプM3以上のAML細胞と結合し、M0又はM1サブタイプ細胞とは結合しない。加えて、抗体はM2サブタイプ細胞に結合する場合もしない場合もある。従って、本発明の抗体は、正常な健常骨髄(例えばCD34 + 細胞)には結合しない。このような差は、PSGL-1発現及び/又は硫酸化の変化、並びに、僅かに異なるエピトープを暴露するPSGL-1の可能な配座変化に基づくと考えられる。   Furthermore, for these antibodies of the present invention, binding was found to be dependent on the stage of cell development (AML subtypes were found in French using morphologies observed under routine processing and cytochemical staining. -Classified based on American-British system). That is, the antibody binds to subtype M3 or higher AML cells and does not bind to M0 or M1 subtype cells. In addition, the antibody may or may not bind to M2 subtype cells. Therefore, the antibody of the present invention does not bind to normal healthy bone marrow (eg, CD34 + cells). Such differences are believed to be based on changes in PSGL-1 expression and / or sulfation, as well as possible conformational changes in PSGL-1 exposing slightly different epitopes.

具体的には、低レベルのGPIbを発現させるヒト慢性骨髄性白血病細胞系であるKU812細胞は、Y1抗体と結合することが判っている。GPIbタンパク質の硫酸化を阻害するが発現は阻害しない、塩素酸ナトリウム中のKU812細胞の成長に続いて、Y1と細胞との結合は50%低減された。加えて、GPIbのアミノ酸273〜285に基づいたチロシン硫酸化型ペプチドは、Y1抗体と血小板との結合を競合的に阻害するのに対して、非硫酸化型ペプチドは、Y1抗体と血小板との結合を阻害しないことが判っている。   Specifically, KU812 cells, a human chronic myeloid leukemia cell line that expresses low levels of GPIb, have been found to bind to the Y1 antibody. Following growth of KU812 cells in sodium chlorate, which inhibits GPIb protein sulfation but not expression, the binding of Y1 to cells was reduced by 50%. In addition, tyrosine sulfated peptides based on amino acids 273 to 285 of GPIb competitively inhibit the binding of Y1 antibody to platelets, whereas non-sulfated peptides do not interact with Y1 antibody and platelets. It has been found that it does not inhibit binding.

本発明は、硫酸化型チロシン・モチーフを含むエピトープを認識してこれに結合する抗体又はその断片を含むか又は採用する。このようなモチーフは、酸性残基(アスパルテート及びグルタメート)が豊富なペプチド配列を含み、そして1つ以上のチロシンを含有する。認識及び結合は、硫酸化されているチロシンのうちの1つ以上に、少なくとも部分的に依存する。このような1つの抗体はY1又はその断片である。Y1は、本明細書中に記載された実施態様において言及された抗体であるが、本発明を、Y1を採用する実施態様に限定するものとして理解されるべきではない。本発明は、硫酸化型チロシン・モチーフを含むエピトープに結合する他の抗体、例えば、結合特異性を維持する、Y1及びその断片に関連する抗体を使用する実施態様を含む。   The present invention includes or employs an antibody or fragment thereof that recognizes and binds to an epitope comprising a sulfated tyrosine motif. Such motifs contain peptide sequences rich in acidic residues (aspartate and glutamate) and contain one or more tyrosines. Recognition and binding depends at least in part on one or more of the tyrosine being sulfated. One such antibody is Y1 or a fragment thereof. Y1 is the antibody mentioned in the embodiments described herein, but should not be understood as limiting the invention to embodiments employing Y1. The invention includes embodiments that use other antibodies that bind to an epitope comprising a sulfated tyrosine motif, such as antibodies related to Y1 and fragments thereof that maintain binding specificity.

本発明によれば、硫酸化型チロシン・モチーフを含むエピトープに結合する抗体又はその断片が提供され、結合が、硫酸化されているモチーフの1つ以上のチロシンに依存する。1実施態様の場合、抗体は、抗体依存性細胞の細胞毒性を媒介する。好ましい実施態様の場合、抗体はY1又は関連抗体、又はその断片である。   According to the present invention, an antibody or fragment thereof that binds to an epitope comprising a sulfated tyrosine motif is provided, wherein binding depends on one or more tyrosine of the motif being sulfated. In one embodiment, the antibody mediates cytotoxicity of antibody-dependent cells. In a preferred embodiment, the antibody is Y1 or a related antibody, or fragment thereof.

本発明はさらに、このような抗体又はその断片と複合(例えば会合、組合わせ、融合又はリンク)された薬剤を提供する。1〜16個又はそれ以上の薬剤分子を各抗体に結合することができる。抗体は、ヒンジ領域に4つのジスルフィド結合を有している。これらのジスルフィド結合は選択的に8つのチオール基に還元することができる。チオール官能基に共有結合することができ、そして1つの薬剤分子を担持するリンカーを使用することにより、最大8n個の薬剤分子を抗体に結合することができる。1実施態様の場合、重鎖だけが薬剤と複合されるか、又は軽鎖だけが薬剤と複合されるのに対して、より好ましい実施態様の場合、各重鎖は薬剤の約2つのコピーと複合され、そして各軽鎖は薬剤の約2つのコピーと複合される。   The invention further provides agents conjugated (eg, associated, combined, fused or linked) with such antibodies or fragments thereof. From 1 to 16 or more drug molecules can be attached to each antibody. The antibody has four disulfide bonds in the hinge region. These disulfide bonds can be selectively reduced to eight thiol groups. By using a linker that can be covalently linked to the thiol functional group and carry one drug molecule, up to 8n drug molecules can be attached to the antibody. In one embodiment, only the heavy chain is conjugated to the drug, or only the light chain is conjugated to the drug, whereas in a more preferred embodiment, each heavy chain comprises about 2 copies of And each light chain is conjugated with about two copies of the drug.

当業者に知られているように、中間薬物キャリヤ、例えば天然型(例えばデキストラン)及び合成型(例えばHPMA)ポリマー並びにリポソーム(例えば抗体-リンカー-キャリヤ-薬剤)を使用することにより、さらに多数の薬剤分子を抗体にリンクすることができる。抗体の遊離アミノ基に薬剤を直接的又は間接的にリンクすることもできる。例えば、薬剤はリンカーを介して、遊離ε-又はα-アミノ基にリンクすることができる。典型的には薬剤はリンカーに直接的に接合され、又は先ずキャリヤに接合され、次いでこれがリンカーに接合される。リンカー-薬剤又はリンカー-キャリヤ-薬剤複合体は、次いで抗体に接合される。抗体-薬剤複合体は、腫瘍細胞によって内部化することができ、薬剤は細胞の死をもたらす。1実施態様の場合、抗体-薬剤のリンクは、例えば酸切断又は酵素切断によって、細胞内部で断絶することができる。好ましい実施態様の場合、抗体はY1又は関連抗体、又はその断片である。   As known to those skilled in the art, by using intermediate drug carriers such as natural (e.g. dextran) and synthetic (e.g. HPMA) polymers and liposomes (e.g. antibody-linker-carrier-drug) Drug molecules can be linked to antibodies. The drug can also be linked directly or indirectly to the free amino group of the antibody. For example, the drug can be linked to a free ε- or α-amino group via a linker. Typically, the drug is joined directly to the linker, or first joined to the carrier, which is then joined to the linker. The linker-drug or linker-carrier-drug complex is then conjugated to the antibody. Antibody-drug conjugates can be internalized by tumor cells, and the drug results in cell death. In one embodiment, the antibody-drug link can be broken inside the cell, for example by acid cleavage or enzymatic cleavage. In a preferred embodiment, the antibody is Y1 or a related antibody, or fragment thereof.

本発明はさらに、Y1又はY1-薬剤複合体を含む、疾患治療用組成物を提供する。   The present invention further provides a composition for treating a disease comprising Y1 or Y1-drug conjugate.

1実施態様の場合、本発明は、本発明の抗体を投与することにより、ADCCを誘発又は活性化する方法を提供する。従って、これらの抗体は、ADCCを活性化し、且つ/又はナチュラルキラー(NK)細胞(例えばCD56+)、γδ T-細胞、及び/又は単球を刺激することができ、その結果、細胞溶解をもたらすことができる。一般に、Fc領域又は抗体の一部を含む抗体を投与することに続いて、前記抗体は、エフェクター細胞、例えばNK細胞上のFc受容体(FcR)に結合し、パーフォリン及びグランザイムBの放出をトリガし、且つ/又はFas B発現を誘発する。次いでこのことはアポトーシスを招く。エフェクター細胞上に発現されたFasLと、ターゲット細胞表面上のFas受容体との結合は、Fas受容体シグナル伝達経路の活性化を介して、ターゲット細胞アポトーシスを誘発することができる。1実施態様の場合、本発明の抗体は、エフェクター細胞上のFasL発現を誘発する。関与するエフェクター細胞のタイプ、サイトカイン(例えばIL-2及びG-CSF)、インキュベーション時間、細胞表面上に存在する受容体の数、及び抗体アフィニティを含む種々の因子が、ADCCに影響を与えることができる。   In one embodiment, the present invention provides a method of inducing or activating ADCC by administering an antibody of the present invention. Thus, these antibodies can activate ADCC and / or stimulate natural killer (NK) cells (eg, CD56 +), γδ T-cells, and / or monocytes, resulting in cell lysis. be able to. In general, following administration of an antibody comprising an Fc region or part of an antibody, the antibody binds to an Fc receptor (FcR) on effector cells, such as NK cells, and triggers the release of perforin and granzyme B. And / or induce Fas B expression. This in turn leads to apoptosis. Binding of FasL expressed on effector cells to Fas receptors on the target cell surface can induce target cell apoptosis via activation of the Fas receptor signaling pathway. In one embodiment, the antibodies of the invention induce FasL expression on effector cells. Various factors can affect ADCC, including the type of effector cells involved, cytokines (e.g. IL-2 and G-CSF), incubation time, number of receptors present on the cell surface, and antibody affinity. it can.

さらに別の実施態様の場合、細胞死の誘発を必要とする患者に、薬剤とカップリング又は複合された本発明の抗体を投与することにより、細胞死を誘発する方法であって、抗体-薬剤カップリング体又は複合体が、内部化によって細胞に侵入し、そして抗体-薬剤接合体又は複合体が切断され、薬剤を放出する、方法が提供される。内部化は、エンドサイトーシス又はファゴサイトーシスによって、任意の好適な手段によって行うことができる。本発明はこうして、患者における疾患を治療する(例えば、治療は疾患の効果の改善、疾患の予防、又は疾患の進行の阻害を含むことができる)手段を提供する。   In yet another embodiment, a method of inducing cell death by administering to a patient in need of induction of cell death an antibody of the invention coupled or conjugated to the agent comprising the antibody-drug A method is provided wherein a coupling body or complex enters cells by internalization and the antibody-drug conjugate or complex is cleaved to release the drug. Internalization can be done by any suitable means by endocytosis or phagocytosis. The present invention thus provides a means of treating a disease in a patient (eg, treatment may include improving the effect of the disease, preventing the disease, or inhibiting the progression of the disease).

具体的には、抗体を使用することにより、細胞内に薬剤を導入する。抗体は、疾患細胞の表面上に優先的に発現されたタンパク質、例えば硫酸化型チロシン残基を有するタンパク質に結合する。好ましい実施態様の場合、薬剤は、毒素、例えばドキソルビシン、モルホリノ-ドキソルビシン、又はモルホリノ-ダウノルビシンである。より好ましい実施態様の場合、毒素は、アジピン酸リンカー又はN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド・リンカーを介して、抗体にリンクされる。アジピン酸リンカーは、αアミノ酸基に結合するために使用されているのに対して、N-[マレイミドカプロン酸]ヒドラジド・リンカーは、αアミノ酸基及び還元されたジスルフィド・リンケージのSH基(マレイミド基を介してC-S結合を形成する)の双方に結合するために使用されている。加えて、薬物と、N-[マレイミドカプロン酸]ヒドラジド・リンカーとの間にヒドラゾン結合が形成される。   Specifically, a drug is introduced into cells by using an antibody. The antibody binds to a protein that is preferentially expressed on the surface of the diseased cell, such as a protein having a sulfated tyrosine residue. In a preferred embodiment, the agent is a toxin, such as doxorubicin, morpholino-doxorubicin, or morpholino-daunorubicin. In a more preferred embodiment, the toxin is linked to the antibody via an adipic acid linker or an N-ε-maleimidocaproic acid hydrazide linker. Adipic acid linkers have been used to attach to α-amino acid groups, whereas N- [maleimidocaproic acid] hydrazide linkers have α-amino acid groups and SH groups of reduced disulfide linkages (maleimide groups). To form both CS bonds). In addition, a hydrazone bond is formed between the drug and the N- [maleimidocaproic acid] hydrazide linker.

抗体-薬剤複合体が細胞表面タンパク質に結合した後、細胞は複合体を内部化する。次いで細胞内部の酵素は、抗体-毒素リンケージを切断し、毒素は細胞に作用してその死をもたらす。別の実施態様の場合、本発明は、このような抗体-毒素接合体を含む、疾患治療用の組成物を提供する。   After the antibody-drug complex binds to the cell surface protein, the cell internalizes the complex. The enzyme inside the cell then cleaves the antibody-toxin linkage, which acts on the cell and causes its death. In another embodiment, the invention provides a composition for treating a disease comprising such an antibody-toxin conjugate.

別の実施態様は、細胞内に非毒性薬剤を導入する同様の方法を提供する。非毒性薬剤を使用することにより、例えば特異的遺伝子の活性を直接的又は間接的に活性化又は抑圧することにより、細胞の挙動又は活性を変化させることができる。   Another embodiment provides a similar method for introducing non-toxic drugs into cells. By using non-toxic drugs, cell behavior or activity can be altered, for example, by directly or indirectly activating or suppressing the activity of specific genes.

1つの別の実施態様の場合、本発明はウィルス感染を防止する方法であって、このことを必要とする患者に、本明細書中に記載された抗体を投与することを含む、方法を提供する。従って、疾患治療手段は、感染をブロックする抗体を投与することにより達成される。細胞はその表面上に、抗体によって認識され感染性物質の感染にも必要な硫酸化型チロシン・モチーフ含有エピトープを含有するタンパク質を発現させる。抗体はこのタンパク質に結合し、これにより感染をブロックする。好ましい抗体が硫酸化型チロシン・モチーフ含有エピトープを介して結合することが知られているタンパク質は、フィブリノゲンγ鎖、GPIb-α鎖、補体C4、及びPSGL-1を含む。好ましい抗体が硫酸化型チロシン・モチーフ含有エピトープを介して結合すると考えられているタンパク質が、CCR5及びCXCR4を含む。CCR5及びCXCR4のいずれもが、HIV感染に必要な共受容体として機能することができる。好ましい実施態様の場合、抗体を使用することにより、HIV株の感染をブロックすることができた。好ましくは、抗体はY1である。   In one alternative embodiment, the present invention provides a method of preventing viral infection, comprising administering to a patient in need thereof an antibody described herein. To do. Thus, disease treatment means are achieved by administering an antibody that blocks infection. The cell expresses on its surface a protein containing a sulfated tyrosine motif-containing epitope that is recognized by the antibody and is also required for infectious agent infection. The antibody binds to this protein, thereby blocking infection. Proteins that are known to bind preferred antibodies via a sulfated tyrosine motif-containing epitope include fibrinogen γ chain, GPIb-α chain, complement C4, and PSGL-1. Proteins for which preferred antibodies are thought to bind via sulfated tyrosine motif-containing epitopes include CCR5 and CXCR4. Both CCR5 and CXCR4 can function as co-receptors required for HIV infection. In a preferred embodiment, the use of antibodies could block infection of HIV strains. Preferably the antibody is Y1.

最後に、硫酸化型PSGL-1を発現させる細胞内に薬剤を導入する方法であって：本明細書中に記載された抗体に薬剤をカップリング又は複合し、そして抗体-薬剤カップリング体又は複合体を細胞に投与することを含むステップを有する、方法が提供される。   Finally, a method of introducing a drug into a cell that expresses sulfated PSGL-1 comprising: coupling or conjugating a drug to the antibody described herein; and an antibody-drug coupling body or A method is provided having a step comprising administering the complex to a cell.

本発明の抗体は、硫酸化型PSGL-1に結合する。炎症に関与する白血球、例えば単球、好中球及びリンパ球は、第1に、アテローム性動脈硬化のような疾患の炎症プロセス中に、4つの癒着分子、PSGL-1、P-セレクチン、VLA-4及びVCAM-1によって補充される(Huo及びLey, Acta Physiol. Scand., 173: 35-43(2001)；Libby, Sci. Am. May:48-55(2002)；Wang他、J. Am. Coll. Cardiol. 38:577-582(2001))。抗体がこれらの中心分子のいずれかを妨害することは、関連疾患を無効にする上での抗体の潜在的な役割を示唆する。具体的にはP-セレクチンは細胞の結合及び転動を制御する。加えて、P-セレクチン-PSGL-1の相互作用は、腫瘍形成(悪性細胞と関係する場合)及び炎症応答(白血球と関係する場合)と一体的に関連する細胞上の多数の他の分子を活性化する(Shebuski及びKilgore, J. Pharmacol. Exp. Ther. 300: 729-735(2002))。細胞プロセスを調節するP-セレクチンの能力をこのように理解した上で、硫酸化型PSGL-1に対する、抗体の高められたscFv選択性は、この抗体を、種々の悪性疾患及び炎症性疾患を治療するための優れた分子にすることができることが明らかである。さらに、悪性疾患のモデルは、P-セレクチンと悪性細胞との結合が、PSGL-1の硫酸化を必要とすることを示している(Ma及びGeng, J. Immunol. 168:1690-1696(2002))。この要件は、抗体の結合に対する要件と類似する。従って、抗体は、進行中の悪性疾患のP-セレクチンによる促進を無効にできることが期待できる。   The antibody of the present invention binds to sulfated PSGL-1. The leukocytes involved in inflammation, such as monocytes, neutrophils and lymphocytes, are primarily involved in the four inflammatory molecules, PSGL-1, P-selectin, VLA, during the inflammatory process of diseases such as atherosclerosis -4 and VCAM-1 (Huo and Ley, Acta Physiol. Scand., 173: 35-43 (2001); Liby, Sci. Am. May: 48-55 (2002); Wang et al., J. MoI. Am. Coll. Cardiol. 38: 577-582 (2001)). Interfering with any of these central molecules by the antibody suggests a potential role for the antibody in negating the associated disease. Specifically, P-selectin controls cell binding and mobilization. In addition, the interaction of P-selectin-PSGL-1 involves numerous other molecules on the cell that are integrally associated with tumorigenesis (when associated with malignant cells) and inflammatory responses (when associated with leukocytes). It is activated (Shebuski and Kilgore, J. Pharmacol. Exp. Ther. 300: 729-735 (2002)). With this understanding of P-selectin's ability to regulate cellular processes, the increased scFv selectivity of the antibody against sulfated PSGL-1 has made it possible to treat this antibody against a variety of malignancies and inflammatory diseases. Clearly it can be an excellent molecule to treat. In addition, models of malignancy have shown that the binding of P-selectin to malignant cells requires the sulfation of PSGL-1 (Ma and Geng, J. Immunol. 168: 1690-1696 (2002 )). This requirement is similar to the requirement for antibody binding. Therefore, it can be expected that the antibody can abolish the promotion of ongoing malignant disease by P-selectin.

好ましくは、本発明の抗体は、T-ALL細胞、AML細胞、Pre-B-ALL細胞、B-白血病細胞、B-CLL細胞、多発性骨髄腫細胞、及び転移細胞を含む、炎症又は腫瘍形成に関与する1つ以上の細胞タイプ上に存在するエピトープに結合する。さらに好ましくは、本発明の抗体は、脂質、炭水化物、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び/又はリポ多糖分子上のエピトープに結合することができる。このようなエピトープは好ましくは1つ以上の硫酸化型部分を有する。或いは、しかし好ましくは、本発明の抗体は2つ又は3つ以上のエピトープと交差反応し、各エピトープは1つ又は2つ以上の硫酸化型チロシン残基、及び2つ又は3つ以上の酸性アミノ酸から成る1つ以上のクラスターを有し、その一例がPSGL-1である。   Preferably, the antibody of the present invention comprises T-ALL cells, AML cells, Pre-B-ALL cells, B-leukemia cells, B-CLL cells, multiple myeloma cells, and metastatic cells, inflammation or tumor formation Binds to an epitope present on one or more cell types involved in More preferably, the antibodies of the invention are capable of binding to an epitope on a lipid, carbohydrate, peptide, glycolipid, glycoprotein, lipoprotein and / or lipopolysaccharide molecule. Such epitopes preferably have one or more sulfated portions. Alternatively, but preferably, the antibodies of the invention cross-react with two or more epitopes, each epitope having one or more sulfated tyrosine residues and two or more acidic It has one or more clusters of amino acids, an example of which is PSGL-1.

本発明の、これらの抗体、抗原結合断片、又はその複合体は、細胞表面上でPSGL-1と結合するのに続いて、細胞内に内部化することができる。このような内部化は、活性プロセスとしてエンドサイトーシスを介して生じることができる。活性プロセスは、様式、時間及び温度に依存する。例えばY1は、PSGL-1を介してAML患者から細胞内に特異的に内部化される。   These antibodies, antigen-binding fragments, or complexes thereof of the present invention can be internalized intracellularly following binding to PSGL-1 on the cell surface. Such internalization can occur via endocytosis as an active process. The activation process depends on the mode, time and temperature. For example, Y1 is specifically internalized into cells from AML patients via PSGL-1.

本発明の抗体は、チロシン硫酸化部位を有するタンパク質に結合する。このようなタンパク質は、PSGL-1、GP1b、α-2抗プラスミン；アミノペプチダーゼB；CCケモカイン受容体、例えばCCR2、CCR5、CCR3、CXCR3、CXCR4、CCR8、CCR2b及びCXCI；7膜貫通型セグメント(7TMS)受容体；凝固因子、例えば因子V、VIII及びIX；フィブリノゲン・ガンマ鎖；ヘパリン補因子II；セクレトグラニン、例えばセクレトグラニンI及びII；ビトロネクチン、アミロイド前駆体、α-2抗プラスミン；コレシストキニン；α-絨毛膜ゴナドトロピン；補体C4；デルマタン・スファイエプロテオグリカン;フィブリネクチン；及びカストリンを含む。好ましい実施態様の場合、本発明の抗体は、硫酸化型CCケモカイン受容体、CCR5、CXCR4、CXCI及びCCR2bに結合する。前述のように、硫酸化型チロシンは、CCR5と、MIP-1α、MIPβ及びHIV-1 gp120/CD4との結合、及びCCR5及びCD4を発現させる細胞に侵入するHIV-1の能力に関与し得る。   The antibody of the present invention binds to a protein having a tyrosine sulfation site. Such proteins include PSGL-1, GP1b, α-2 antiplasmin; aminopeptidase B; CC chemokine receptors such as CCR2, CCR5, CCR3, CXCR3, CXCR4, CCR8, CCR2b and CXCI; 7 transmembrane segments ( 7TMS) receptors; coagulation factors such as factors V, VIII and IX; fibrinogen gamma chain; heparin cofactor II; secretogranins such as secretogranins I and II; vitronectin, amyloid precursor, α-2 antiplasmin; Cholecystokinin; α-chorionic gonadotropin; complement C4; dermatan sphaie proteoglycan; fibrinectin; and castrin. In a preferred embodiment, the antibodies of the invention bind to the sulfated CC chemokine receptor, CCR5, CXCR4, CXCI and CCR2b. As mentioned above, sulfated tyrosine can be involved in the binding of CCR5 to MIP-1α, MIPβ and HIV-1 gp120 / CD4, and the ability of HIV-1 to enter cells expressing CCR5 and CD4. .

原核細胞発現系又は真核細胞発現系において、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及びその断片及び構造を生成することができる。原核細胞系又は真核細胞系において抗体及び断片を生成する方法は当業者によく知られている。   Peptides, polypeptides, proteins, and fragments and structures thereof can be generated in prokaryotic or eukaryotic expression systems. Methods of producing antibodies and fragments in prokaryotic or eukaryotic cell systems are well known to those skilled in the art.

本発明において定義され論じられた真核細胞系とは、遺伝子工学法によりペプチド又はポリペプチドを生成する発現系を意味し、宿主細胞は真核細胞である。真核細胞発現系は、哺乳動物系であってよく、そして、哺乳動物発現系において生成されたペプチド又はポリペプチドには、精製後には、哺乳動物汚染物質が実質的にないのが好ましい。有用な真核細胞発現系の他の例は、酵母発現系を含む。   A eukaryotic cell system as defined and discussed in the present invention means an expression system that produces a peptide or polypeptide by genetic engineering, and the host cell is a eukaryotic cell. The eukaryotic expression system may be a mammalian system, and the peptide or polypeptide produced in the mammalian expression system is preferably substantially free of mammalian contaminants after purification. Other examples of useful eukaryotic expression systems include yeast expression systems.

本発明のペプチド又はポリペプチドを生成するための好ましい原核細胞系は、発現ベクターのための宿主としてE.coliを使用する。E.coli系において生成されたペプチド又はポリペプチドは、精製後には、E.coli汚染タンパク質が実質的にないのが好ましい。原核細胞発現系を使用する結果、本発明において提供される配列のうちのいくつか又は全てのN末端に、メチオニン残基が添加される。ペプチド又はポリペプチドの完全な発現を可能にするために、ペプチド又はポリペプチド精製後にN末端メチオニン残基を除去することは、当業者に知られているように実施することができ、その一例は、好適な条件下でAeromonas aminopeptidaseを使用することにより実施される(米国特許第5,763,215号明細書)。   A preferred prokaryotic system for producing the peptides or polypeptides of the invention uses E. coli as a host for expression vectors. The peptide or polypeptide produced in the E. coli system is preferably substantially free of E. coli contaminating proteins after purification. As a result of using a prokaryotic expression system, a methionine residue is added to the N-terminus of some or all of the sequences provided in the present invention. Removal of the N-terminal methionine residue after peptide or polypeptide purification to allow for complete expression of the peptide or polypeptide can be performed as known to those skilled in the art, an example of which is Carried out by using Aeromonas aminopeptidase under suitable conditions (US Pat. No. 5,763,215).

本発明の抗体及びポリペプチドは、種々の医薬剤、例えば薬物、毒素及び放射性同位体、及び任意には製薬上効果的なキャリヤと複合、例えば会合、組み合わせ、融合又はリンクすることにより、抗体/ポリペプチドと、抗疾患活性及び/又は抗癌活性を有する医薬剤とを含むペプチド-薬物組成物を形成することができる。このような組成物は診断を目的として使用することもできる。   The antibodies and polypeptides of the present invention can be obtained by conjugating, eg, associating, combining, fusing or linking various pharmaceutical agents, such as drugs, toxins and radioisotopes, and optionally pharmaceutically effective carriers. A peptide-drug composition comprising a polypeptide and a pharmaceutical agent having anti-disease activity and / or anti-cancer activity can be formed. Such compositions can also be used for diagnostic purposes.

例えば、アントラサイクリンと抗体との接合又は複合は当業者に広く知られている(Dubowchik & Walker, Pharmacol. & Thera. 83: 67-123 (1999); Trail他、Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337 (2003))。このような接合は直接的な接合によって、又はリンカー、例えば酸切断可能なリンカー又は酵素切断可能なリンカーを介して行うことができ、また、中間キャリヤ、例えばデキストラン及び合成ポリマーの使用を伴うことができる。アントラサイクリンは、(1)薬物:抗体の比4:1を生成するためのαアミノ基(約pH 8)(この場合2つの薬物分子が重鎖に結合され、そして2つの薬物分子が軽鎖に結合される)；及び(2)使用される方法に応じて4:1〜8:1の薬物・抗体比を生成するためのジスルフィド・リンケージを介して、本発明の抗体に複合されている。当業者に知られているように、薬物・抗体比は例えば、2つ、3つ、4つなどの分枝リンカーを使用することにより、二倍化、三倍化又は四倍化することができる。当業者ならば、抗体、リンカー、キャリヤ及び/又は薬物に対して化学的修飾を施すことにより、接合体を調製するためにより好都合な反応を形成することができる。   For example, conjugation or conjugation of anthracyclines and antibodies is well known to those skilled in the art (Dubowchik & Walker, Pharmacol. & Thera. 83: 67-123 (1999); Trail et al., Cancer Immunol. Immunother. 52: 328 -337 (2003)). Such conjugation can be done by direct conjugation or via a linker, such as an acid cleavable linker or an enzyme cleavable linker, and may involve the use of an intermediate carrier such as dextran and a synthetic polymer. it can. Anthracyclines are (1) alpha-amino groups (about pH 8) to produce a drug: antibody ratio of 4: 1 (in this case two drug molecules are attached to the heavy chain and two drug molecules are And (2) conjugated to the antibody of the present invention via a disulfide linkage to generate a 4: 1 to 8: 1 drug-antibody ratio depending on the method used. . As known to those skilled in the art, the drug-antibody ratio can be doubled, tripled or quadrupled, for example, by using two, three, four, etc. branched linkers. it can. One skilled in the art can form more favorable reactions to prepare conjugates by chemically modifying the antibody, linker, carrier and / or drug.

本発明の1実施態様の場合、Fc領域内の2つのジスルフィド・リンケージを、メルカプトエチルアミンで還元し、次いで約pH7で薬物リンカーと反応させ、これにより薬物・抗体比を4:1にする(この場合4つ全ての薬物は重鎖に結合される)。別の実施態様の場合、ヒンジ領域における4つのジスルフィド結合を、DTT(約pH7)で還元し、次いで薬物リンカーと反応させ、これにより薬物・抗体比を約7:1〜8:1にする(この場合、薬物分子の5つ又は6つは重鎖に結合され、そして薬物分子の1つ又は2つは軽鎖に結合される)。   In one embodiment of the invention, the two disulfide linkages in the Fc region are reduced with mercaptoethylamine and then reacted with a drug linker at about pH 7 to give a drug to antibody ratio of 4: 1 (this In all cases, all four drugs are bound to the heavy chain). In another embodiment, the four disulfide bonds in the hinge region are reduced with DTT (about pH 7) and then reacted with a drug linker, resulting in a drug to antibody ratio of about 7: 1 to 8: 1 ( In this case, five or six of the drug molecules are bound to the heavy chain and one or two of the drug molecules are bound to the light chain).

本発明において有用なキャリヤの例は、デキストラン、HPMA(親水性ポリマー)、又は任意の他のポリマー、例えば親水性ポリマー、並びにこれらの誘導体、組み合わせ及び修飾形を含む。或いは、免疫リポソームとしても知られる装飾型リポソーム、例えばscFv Y1分子で装飾されたリポソーム、例えば多量のドキソルビシンを含有する商業的に入手可能なリポソームであるドキシルを使用することもできる。このようなリポソームは、1つ又は2つ以上の所望の薬剤を含有するように調製し、本発明の抗体と混和することにより、抗体に対して高い比率の薬物を提供することができる。   Examples of carriers useful in the present invention include dextran, HPMA (hydrophilic polymer), or any other polymer, such as hydrophilic polymers, and derivatives, combinations and modified forms thereof. Alternatively, decorative liposomes, also known as immunoliposomes, such as liposomes decorated with scFv Y1 molecules, such as doxil, a commercially available liposome containing a large amount of doxorubicin, can be used. Such liposomes can be prepared to contain one or more desired drugs and admixed with the antibodies of the invention to provide a high ratio of drug to antibody.

或いは、抗体又はポリペプチドと薬剤とのリンクが、直接リンクであってもよい。2つ又は3つ以上の隣接する分子間の直接リンクは、分子内の元素間又は元素群間の化学結合を介して生成することができる。化学結合は、例えばイオン結合、共有結合、疎水性結合、親水性結合、静電結合、又は水素結合であってよい。結合は例えば、アミド、炭素-スルフィド、ペプチド、及び/又はジスルフィド結合であってよい。薬剤又はリンカーに抗体を結合するために、当業者に知られているように、アミン、カルボキシ、ヒドロキシ、チオール及びエステル官能基を使用することにより、共有結合を形成することができる。   Alternatively, the link between the antibody or polypeptide and the drug may be a direct link. Direct links between two or more adjacent molecules can be generated through chemical bonds between elements or groups of elements within the molecule. The chemical bond may be, for example, an ionic bond, a covalent bond, a hydrophobic bond, a hydrophilic bond, an electrostatic bond, or a hydrogen bond. The bond may be, for example, an amide, carbon-sulfide, peptide, and / or disulfide bond. Covalent bonds can be formed by using amine, carboxy, hydroxy, thiol and ester functional groups as known to those skilled in the art to attach antibodies to drugs or linkers.

ペプチドと薬剤との間、又はペプチドとキャリヤとの間、又はキャリヤと薬剤との間のリンクは、リンカー化合物を介して形成することができる。本発明中に使用されるように、リンカー化合物は、2つ又は3つ以上の部分を接合する化合物として定義される。リンカーは直鎖状又は分枝状であってよい。分枝状リンカー化合物は、二重分枝、三重分枝、又は四重以上の分枝化合物から成っていてよい。本発明において有用なリンカー化合物は、ジカルボン酸、マレイミドヒドラジド、PDPH、カルボン酸ヒドラジド、及び小ペプチドを有する群から選択された化合物を含む。   The link between the peptide and the drug, or between the peptide and the carrier, or between the carrier and the drug can be formed via a linker compound. As used in the present invention, a linker compound is defined as a compound that joins two or more moieties. The linker may be linear or branched. Branched linker compounds may consist of double-branched, triple-branched, or quadruple or more branched compounds. Linker compounds useful in the present invention include compounds selected from the group having dicarboxylic acids, maleimide hydrazides, PDPH, carboxylic acid hydrazides, and small peptides.

本発明に基づいて有用なリンカー化合物のより具体的な例は：(a)ジカルボン酸、例えば琥珀酸、グルタル酸、及びアジピン酸；(b)マレイミドヒドラジド、例えばN-[マレイミドカプロン酸]ヒドラジド、4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシルヒドラジド、及びN-[マレイミドウンデカン酸] ヒドラジド；(3)(3-[2-ピリジルジチオ]プロピオニルヒドラジド)誘導体、これらの組み合わせ、修飾形、及び類似体；及び(d)炭素原子数2〜5のカルボン酸ヒドラジド、を含む。   More specific examples of linker compounds useful in accordance with the present invention are: (a) dicarboxylic acids such as succinic acid, glutaric acid, and adipic acid; (b) maleimide hydrazide such as N- [maleimidocaproic acid] hydrazide, 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxyl hydrazide, and N- [maleimidoundecanoic acid] hydrazide; (3) (3- [2-pyridyldithio] propionyl hydrazide) derivatives, combinations, modifications, and And (d) carboxylic acid hydrazides having 2 to 5 carbon atoms.

小ペプチド・リンカーを使用した直接カップリングを介したリンクも有用である。例えば抗癌薬ドキソルビシンの遊離糖とscFvとの間の直接カップリングを、小ペプチドを使用して達成することができる。小ペプチドの例は、AU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、タンパク質C、S-TAG（登録商標）、T7、V5、VSV-G、及びKAKを含む。   Linking via direct coupling using a small peptide linker is also useful. For example, direct coupling between the free sugar of the anticancer drug doxorubicin and scFv can be achieved using small peptides. Examples of small peptides are AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, Protein C, S-TAG®, T7, V5, VSV -Includes G and KAK.

本発明の抗体及びポリペプチドは、画像形成剤(指示マーカーとも呼ばれる)、例えば放射性同位体と結合、接合、複合又はその他の形式で会合することができ、そしてこれらの接合体は、診断及び画像形成目的で使用することができる。このような放射性同位体-抗体(又は断片)複合体を有するキットが提供される。   The antibodies and polypeptides of the invention can be associated, imaged, conjugated, or otherwise associated with imaging agents (also called indicator markers), eg, radioisotopes, and these conjugates are diagnostic and imaging Can be used for forming purposes. Kits having such radioisotope-antibody (or fragment) complexes are provided.

診断に有用な放射性同位体の例は、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルリウム、122mテルリウム、125mテルリウム、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123ヨウ素、126ヨウ素、131ヨウ素、133ヨウ素、81mクリプトン、33キセノン、90イットリウム、213ビスマス、77臭素、18フッ素、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウム及び68ガリウムを含む。好ましい放射性同位体は、X線又は任意の好適な常磁性イオンを通さない。 Examples of useful radioisotopes in diagnosis, 111 Indium, 113 Indium, 99m rhenium, 105 rhenium, 101 rhenium, 99m technetium, 121m tellurium, 122m tellurium, 125m tellurium, 165 thulium, 167 Thulium, 168 Thulium, 123 Iodine, 126 iodine, 131 iodine, 133 iodine, 81 m krypton, 33 xenon, 90 yttrium, 213 bismuth, 77 bromine, 18 fluorine, 95 ruthenium, 97 ruthenium, 103 ruthenium, 105 ruthenium, 107 mercury, 203 mercury, 67 gallium and 68 gallium including. Preferred radioisotopes do not pass x-rays or any suitable paramagnetic ions.

指示マーカー分子は蛍光マーカー分子であってもよい。蛍光マーカー分子の例は、フルオレセイン、フィコエリトリン、又はローダミン、又はこれらの修飾形又は接合体を含む。   The indicator marker molecule may be a fluorescent marker molecule. Examples of fluorescent marker molecules include fluorescein, phycoerythrin, or rhodamine, or modified forms or conjugates thereof.

指示マーカーに接合された抗体及びポリペプチドを使用して、疾患状態を診断、予後又はモニタリングすることができる。一般に、このような方法は、患者から1つ以上の細胞の試料を提供し、そして本発明の抗体又はその断片は患者の細胞に結合するかどうかを見極め、これにより、患者が疾患のリスクを有するか、又は疾患にかかっていることを示すことを含む。モニタリング又は診断がin vivo又はex vivoで実施される場合には、画像形成剤は好ましくは、許容できないレベルまで患者に害を与えないという点で生理学的に許容可能である。許容可能な害のレベルは、疾患の重症度及び他の選択肢の利用可能性のような基準を用いて、医師によって決定することができる。   Antibodies and polypeptides conjugated to indicator markers can be used to diagnose, prognose or monitor disease states. In general, such methods provide a sample of one or more cells from a patient and determine whether an antibody or fragment thereof of the invention binds to the patient's cells, thereby allowing the patient to risk disease. Including having or having a disease. Where monitoring or diagnosis is performed in vivo or ex vivo, the imaging agent is preferably physiologically acceptable in that it does not harm the patient to an unacceptable level. The level of harm that can be tolerated can be determined by a physician using criteria such as the severity of the disease and the availability of other options.

癌に関して、患者における疾患を病期診断することは、一般に、腫瘍のサイズ、タイプ、位置、及び侵襲性に基づいた疾患の分類を見極めることを伴う。腫瘍特性によって癌を分類するための1分類システムは、「TNM Classification of Malignant Tumours」(第6版)(L.H. Sobin編)であり、これを参考のため本明細書中に引用する。このシステムは、癌の病期をT、N及びMのカテゴリーに分類し、この場合Tは一次腫瘍をそのサイズ及び位置に基づいて表し、Nは局所的リンパ節を表し、そしてMは遠隔転移を表す。加えて、数字I, II, III及びIVを使用して、病期を示し、そして各数字は、TNM因子の可能な組み合わせを意味する。例えば段階I乳癌は、TMN群：T1、N0、M0によって定義され、T1は腫瘍が直径2 cm以下であること、N0は、局所的リンパ節転移がないこと、M0は、遠隔転移がないことを意味する。AMLを病期診断するために別のシステムが使用され、この場合、日常的なプロセッシング及び細胞化学的染色下で観察される形態学を用いて、French-American-Britishシステムに基づいてサブタイプが分類される。
加えて、世界保健機関(WHO)により最近提案された、造血組織及びリンパ系組織の腫瘍性疾患の病期診断又は分類は、(AMLに対して特異的に)伝統的なFABタイプの疾患カテゴリ、並びに、特異的な細胞遺伝学的発見と相関する付加的な疾患タイプ、及び骨髄異形成と関連するAMLを含む。他には、病理学的分類も提案されている。AMLに対して特異的な1つの提案は、特異的な細胞遺伝学的転座と相関し、そして形態学的評価及び免疫表現型特定によって信頼性よく認識することができる疾患タイプ、及び関連する骨髄異形成変化の重要性を内蔵する疾患タイプを含む。このシステムは、細胞遺伝学的又は分子遺伝学的研究によって支援され、そして新しい理解可能な臨床病理学的なものが記載されるのに伴って規模を大きくすることができる(Arber, Am. J. Clin. Pathol. 115(4): 552-60(2001))。 With respect to cancer, staging a disease in a patient generally involves determining the classification of the disease based on tumor size, type, location, and invasiveness. One classification system for classifying cancers by tumor characteristics is “TNM Classification of Malignant Tumours” (6th edition) (LH Sobin), which is incorporated herein by reference. This system classifies cancer stages into T, N, and M categories, where T represents the primary tumor based on its size and location, N represents the local lymph node, and M represents distant metastasis Represents. In addition, the numbers I, II, III and IV are used to indicate the stage and each number represents a possible combination of TNM factors. For example, stage I breast cancer is defined by the TMN group: T1, N0, M0, where T1 is less than 2 cm in diameter, N0 is no regional lymph node metastasis, M0 is no distant metastasis Means. Another system is used to stage AML, where subtypes are based on the French-American-British system, using morphology observed under routine processing and cytochemical staining. being classified.
In addition, the staging or classification of neoplastic diseases of hematopoietic and lymphoid tissues, recently proposed by the World Health Organization (WHO), is a traditional FAB-type disease category (specific to AML). As well as additional disease types that correlate with specific cytogenetic findings and AML associated with myelodysplasia. Other pathological classifications have also been proposed. One proposal specific for AML correlates with specific cytogenetic translocations and is associated with disease types that can be reliably recognized by morphological evaluation and immunophenotyping Includes disease types that incorporate the importance of myelodysplastic changes. This system is supported by cytogenetic or molecular genetic studies and can be scaled up as new and understandable clinicopathological ones are described (Arber, Am. J. Clin. Pathol. 115 (4): 552-60 (2001)).

本発明は、治療前、治療中又は治療後に治療効果をin vitroで分析するための診断キットであって、指示マーカー分子にリンクされた本発明のペプチドを有する画像形成剤を有するキット、又は画像形成剤を有するキットを提供する。本発明はさらに、癌、より具体的には腫瘍を診断的に位置特定して画像形成するための画像形成剤を使用する方法であって、下記ステップ：(a)細胞を組成物と接触させ；(b)細胞に結合された放射能を測定し；そして、従って(c)腫瘍を視覚化するステップを有する、方法を提供する。   The present invention is a diagnostic kit for analyzing the therapeutic effect in vitro before, during or after treatment, comprising an imaging agent having the peptide of the present invention linked to an indicator marker molecule, or an image A kit having a forming agent is provided. The present invention further comprises a method of using an imaging agent for diagnostically locating and imaging a cancer, more specifically a tumor, comprising the following step: (a) contacting the cell with the composition Providing a method comprising: (b) measuring the radioactivity bound to the cells; and thus (c) visualizing the tumor.

好適な画像形成剤の例は、蛍光色素、例えばFITC及びPEなど、及び蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質を含む。他の例は放射性分子、及び基質と反応することにより認識可能な変化、例えば色の変化をもたらす酵素を含む。   Examples of suitable imaging agents include fluorescent dyes such as FITC and PE, and fluorescent proteins such as green fluorescent protein. Other examples include radioactive molecules and enzymes that produce a recognizable change, such as a color change, by reacting with a substrate.

1つの例において、キットの画像形成剤は蛍光色素、例えばFITCであり、そしてキットは、癌、より具体的には血液関連癌、例えば白血病、リンパ腫及び骨髄腫の治療効果の分析を可能にする。FACS分析を用いることにより、画像形成剤によって染色された細胞のパーセンテージ、及び疾患の各段階、例えば診断時、治療中、緩解中及び再発中における染色強度を見極める。   In one example, the imaging agent of the kit is a fluorescent dye, such as FITC, and the kit allows analysis of the therapeutic effect of cancer, more specifically blood related cancers such as leukemia, lymphoma and myeloma . By using FACS analysis, the percentage of cells stained by the imaging agent and the intensity of staining at each stage of the disease, eg at diagnosis, during treatment, during remission and during recurrence are determined.

本発明の抗体及びポリペプチドは、抗癌薬、抗新生物薬、抗ウィルス薬、抗転移薬、抗炎症薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗凝集薬、抗自己免疫薬、抗癒着薬、抗心臓血管薬、医薬剤、又はその他の抗疾患薬と結合、接合、又はその他の形式で会合することができる。薬剤は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ、又は任意のその他の温血動物を含む哺乳動物の予防的治療又は診断において有用な薬剤を意味する。   The antibodies and polypeptides of the present invention are anti-cancer drugs, anti-neoplastic drugs, anti-viral drugs, anti-metastatic drugs, anti-inflammatory drugs, anti-thrombotic drugs, anti-restenosis drugs, anti-aggregating drugs, anti-autoimmune drugs, anti-cancer drugs, It can be combined, conjugated, or otherwise associated with an adhesion agent, anti-cardiovascular agent, pharmaceutical agent, or other anti-disease agent. Agent refers to an agent useful in the prophylactic treatment or diagnosis of mammals including humans, cows, horses, pigs, mice, dogs, cats, or any other warm-blooded animal.

このような薬剤の例は、例えばアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンを含む抗ウィルス薬；シロスタゾル、ダルテパリン・ナトリウム、レビパリン・ナトリウム、及びアスピリンを含む抗血栓/抗再狭窄薬；ザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、アセチルサリチル酸17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドを含む抗炎症薬；レフルノミド、デニロイキン・ジフチトックス、スブレウム、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミドを含む抗自己免疫薬；及びリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸を含む抗癒着/抗凝集薬、を含む。   Examples of such agents include antiviral drugs including, for example, acyclovir, ganciclovir and zidovudine; antithrombotic / anti-restenotic drugs including cilostazol, dalteparin sodium, leviparin sodium, and aspirin; zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, Anti-inflammatory drugs including acetylsalicylic acid 17, diclofenac, ibuprofen, dexbuprofen, sulindac, naproxen, amtormetine, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide; Anti-autoimmune agents including; and anti-adhesion / anti-aggregating agents including limaprost, chlorchromene and hyaluronic acid.

医薬剤の例は、アントラサイクリン、例えばドキソルビシン(アドリアミシン)、ダウノルビシン、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、及びメトキシモルホリニルドキソルビシン、メトキシモルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、及びこれらの置換型誘導体、組み合わせ及び修飾形を含む。医薬剤の更なる例は、cis-白金、タクソール、カリーチアミシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、フルダラビン、イダルビシン、クロラムブシル、インターフェロン・アルファ、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びこれらの誘導体、組み合わせ及び修飾形を含む。   Examples of pharmaceutical agents are anthracyclines such as doxorubicin (adriamycin), daunorubicin, idarubicin, detorubicin, carminomycin, epirubicin, esorubicin, morpholinodoxorubicin, morpholinodaunorubicin, and methoxymorpholinyl doxorubicin, methoxymorpholino nodolin birubinol Includes doxorubicin, and substituted derivatives, combinations and modified forms thereof. Further examples of pharmaceutical agents are cis-platinum, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, fludarabine, idarubicin, chlorambucil, interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide And bleomycin, and derivatives, combinations and modified forms thereof.

抗癌薬は、抗癌活性を有する薬剤である。例えば抗癌活性は、癌細胞又は未熟な前癌細胞の成長を阻害又は中止する薬剤、癌細胞又は前癌細胞を殺す薬剤、他の抗癌薬に対する癌細胞又は前癌細胞の感受性を高める薬剤、及び癌細胞の転移を阻害する薬剤を含む。本発明において、抗癌薬は、腫瘍の脈管化を防止、阻害、遅延又は中止する抗血管形成薬を有する薬剤であってもよい。   An anticancer drug is a drug having anticancer activity. For example, anticancer activity is an agent that inhibits or stops the growth of cancer cells or immature precancerous cells, an agent that kills cancer cells or precancerous cells, an agent that increases the sensitivity of cancer cells or precancerous cells to other anticancer agents And agents that inhibit cancer cell metastasis. In the present invention, the anticancer drug may be a drug having an antiangiogenic drug that prevents, inhibits, delays or stops tumor vascularization.

癌細胞の成長の阻害は、例えば(i)癌又は転移の成長の予防、(ii)癌又は転移の成長の低速化、(iii)細胞を無傷で生きたままにしながら、癌細胞の成長プロセス又は転移プロセスを総合的に予防すること、(iv)癌細胞とミクロ環境との接触の妨害、又は(v)癌細胞の死滅を含む。例えば抗体は癌細胞に結合して、そしてT細胞又はナチュラルキラー細胞を刺激して、抗体依存性の細胞毒性によって結合済細胞を死滅させることにより、癌細胞を死滅させることができる。   Inhibition of cancer cell growth may include, for example, (i) prevention of cancer or metastasis growth, (ii) slowing of cancer or metastasis growth, and (iii) the process of cancer cell growth while leaving the cells intact and alive Or comprehensively preventing the metastatic process, (iv) preventing contact between cancer cells and the microenvironment, or (v) killing cancer cells. For example, antibodies can kill cancer cells by binding to cancer cells and stimulating T cells or natural killer cells to kill the bound cells by antibody-dependent cytotoxicity.

抗白血病薬は、抗白血病活性を有する薬剤である。例えば抗白血病薬は、白血病細胞又は未熟な前白血病細胞の成長を阻害又は中止する薬剤、白血病細胞又は前白血病細胞を殺す薬剤、他の抗白血病薬に対する白血病細胞又は前白血病細胞の感受性を高める薬剤、及び白血病細胞の転移を阻害する薬剤を含む。本発明において、抗白血病薬は、腫瘍の脈管化を防止、阻害、遅延又は中止する抗血管形成薬を有する薬剤であってもよい。   An anti-leukemic drug is a drug having anti-leukemic activity. For example, an anti-leukemic drug is an agent that inhibits or stops the growth of leukemia cells or immature pre-leukemic cells, an agent that kills leukemia cells or pre-leukemic cells, an agent that increases the sensitivity of leukemia cells or pro-leukemic cells to other anti-leukemic cells And agents that inhibit leukemia cell metastasis. In the present invention, the anti-leukemic agent may be an agent having an anti-angiogenic agent that prevents, inhibits, delays or stops tumor vascularization.

白血病細胞の成長の阻害は、例えば(i)白血病又は転移の成長の予防、(ii)白血病又は転移の成長の低速化、(iii)細胞を無傷で生きたままにしながら、白血病細胞の成長プロセス又は転移プロセスを総合的に予防すること、(iv)白血病細胞とミクロ環境との接触の妨害、又は(v)白血病細胞の死滅を含む。   Inhibiting leukemia cell growth may include, for example, (i) prevention of leukemia or metastasis growth, (ii) slowing leukemia or metastasis growth, and (iii) leukemia cell growth process while leaving the cells intact and alive. Or comprehensively preventing the metastatic process, (iv) preventing contact between the leukemic cells and the microenvironment, or (v) killing the leukemia cells.

本発明の抗体及び断片を通常リンクすることができる抗疾患薬、抗癌薬、及び抗白血病薬の例は、毒素、放射性同位体、及び医薬剤を含む。   Examples of anti-disease, anti-cancer, and anti-leukemia drugs that can normally be linked to the antibodies and fragments of the present invention include toxins, radioisotopes, and pharmaceutical agents.

毒素の例は、ゲロニン、Pseudomonasエクソトキシン(PE)、PE40、PE38、ジフテリア毒素、リシン、及びこれらの誘導体、組み合わせ及び修飾形を含む。   Examples of toxins include gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE), PE40, PE38, diphtheria toxin, ricin, and derivatives, combinations and modified forms thereof.

放射性同位体の例は、位置特定及び/又は治療のために使用することができるガンマ放射体、ポジトロン放射体、x線放射体、及び治療のために使用することができるベータ放射体、及びアルファ放射体を含む。診断のために有用な前述の放射性同位体は、治療のためにも有用である。   Examples of radioisotopes include gamma emitters, positron emitters, x-ray emitters that can be used for localization and / or therapy, and beta emitters that can be used for therapy, and alpha Includes radiators. The aforementioned radioisotopes useful for diagnosis are also useful for therapy.

抗癌薬又は抗白血病薬の一例は、アントラサイクリン、例えばドキソルビシン(アドリアミシン)、ダウノルビシン、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、メトキシモルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、及びこれらの置換型誘導体、組み合わせ及び修飾形を含む。医薬剤の例は、cis-白金、タクソール、カリーチアミシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロン・アルファ、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びこれらの誘導体、組み合わせ及び修飾形を含む。   Examples of anti-cancer or anti-leukemia drugs include anthracyclines such as doxorubicin (adriamycin), daunorubicin, idarubicin, detorubicin, carminomycin, epirubicin, esorubicin, morpholinodoxorubicin, morpholino daunorubicin, methoxymorpholinyl doxorubicin, methoxynorpholinoda, Including methoxymorpholinyl doxorubicin, and substituted derivatives, combinations and modified forms thereof. Examples of pharmaceutical agents are cis-platinum, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, daunorubicin, idarubicin, fludarabine, chlorambucil, interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide And bleomycin, and derivatives, combinations and modified forms thereof.

1実施態様の場合、本発明の製薬組成物は、本発明の抗体又はポリペプチドと、製薬上許容可能なキャリヤとを有する。抗体又はポリペプチドは、細胞転動、炎症、自己免疫疾患、転移、腫瘍細胞又は白血病細胞の成長及び/又は複製、又は白血病患者における腫瘍細胞又は白血病細胞を有する患者内の腫瘍細胞数の増大を阻害するのに効果的な量で存在することができる。或いは、抗体又はポリペプチドは、腫瘍細胞又は白血病細胞の死亡率を高めるのに効果的な量で存在することもできる。また或いは、抗体又はポリペプチドは、抗疾患薬による疾患細胞の損傷され易さ、抗癌薬による腫瘍細胞の損傷され易さ、又は抗白血病薬による白血病細胞の損傷され易さを変化させるのに効果的な量で存在することもできる。或いは、抗体又はポリペプチドは、白血病患者における腫瘍細胞又は白血病細胞を有する患者内の腫瘍細胞数を減少させるのに効果的な量で存在することもできる。また或いは、抗体又はポリペプチドは、再狭窄を阻害するのに効果的な量で存在することもできる。抗体又はポリペプチドは、HIV侵入を阻害するのに効果的な量で存在することもできる。また或いは、抗体又はポリペプチドは、特異的な細胞又は部位に治療薬を導くためのターゲッティング薬として使用することもできる。   In one embodiment, the pharmaceutical composition of the invention comprises the antibody or polypeptide of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier. The antibody or polypeptide may increase cell motility, inflammation, autoimmune disease, metastasis, growth and / or replication of tumor cells or leukemia cells, or increase the number of tumor cells in a patient with tumor cells or leukemia cells in a leukemia patient. It can be present in an amount effective to inhibit. Alternatively, the antibody or polypeptide can be present in an amount effective to increase mortality of tumor cells or leukemia cells. Alternatively, the antibody or polypeptide may alter the susceptibility of disease cells to damage by anti-disease drugs, the susceptibility of tumor cells to damage by anti-cancer drugs, or the susceptibility of leukemia cells to damage by anti-leukemia drugs. It can also be present in an effective amount. Alternatively, the antibody or polypeptide can be present in an amount effective to reduce the number of tumor cells in a leukemia patient or in a patient having leukemia cells. Alternatively, the antibody or polypeptide can be present in an amount effective to inhibit restenosis. The antibody or polypeptide can also be present in an amount effective to inhibit HIV entry. Alternatively, the antibody or polypeptide can be used as a targeting agent to direct the therapeutic agent to a specific cell or site.

本発明の抗体又はポリペプチドは、これを必要とする患者に、任意の好適な方法を介して投与することができる。投与法の例は、静脈内、筋内、皮下、局所、気管内、くも膜下、腹腔内、リンパ管内、鼻腔、舌下、経口、直腸、膣、呼吸器、口腔、皮内、経皮又は胸腔内投与を含む。   The antibody or polypeptide of the present invention can be administered to a patient in need thereof via any suitable method. Examples of administration methods are intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intratracheal, intrathecal, intraperitoneal, intralymphatic, nasal, sublingual, oral, rectal, vagina, respiratory, buccal, intradermal, transdermal or Includes intrathoracic administration.

静脈内投与の場合、配合物は好ましくは、患者への投与量が約0.1 mg〜約1000 mgの有効量の所望の組成物となるように調製される。より好ましくは、投与量は、約1 mg〜約500 mgの範囲の所望の組成物となる。本発明の組成物は、広い投与量範囲にわたって効果的であり、治療されるべき疾患の詳細、ペプチド又はポリペプチドを基剤とする製薬組成物の患者体内の半減期、抗体又はその断片と複合された任意の薬剤、及び製薬組成物の物理的及び化学的特性、治療又は診断されるべき患者の詳細、並びに、治療する医師が重要とみなす他のパラメータのようなファクターに依存する。   For intravenous administration, the formulation is preferably prepared so that the dosage to the patient is an effective amount of the desired composition from about 0.1 mg to about 1000 mg. More preferably, the dosage will be the desired composition in the range of about 1 mg to about 500 mg. The compositions of the present invention are effective over a wide dosage range, details of the disease to be treated, the half-life in the patient's body of the pharmaceutical composition based on the peptide or polypeptide, complexed with the antibody or fragment thereof It depends on factors such as the physical and chemical properties of any given drug, and the pharmaceutical composition, the details of the patient to be treated or diagnosed, and other parameters deemed important by the treating physician.

経口投与のための製薬組成物は、任意の好適な形態であってよい。例は、錠剤、液体、エマルジョン、懸濁液、シロップ剤、丸剤、カプレット剤及びカプセル剤を含む。製薬組成物の形成方法は当業者によく知られている(例えばRemington, The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro編、Lippincott, Williams & Wilkins(発行)参照)。   The pharmaceutical composition for oral administration may be in any suitable form. Examples include tablets, liquids, emulsions, suspensions, syrups, pills, caplets and capsules. Methods of forming pharmaceutical compositions are well known to those skilled in the art (see, eg, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, edited by Alfonso R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, published).

製薬組成物は、徐放、持続放出、パルス放出又は連続放出を容易にするように調製することもできる。製薬組成物は、装置、例えば徐放、持続放出、パルス放出又は連続放出装置内で投与することもできる。   The pharmaceutical composition can also be prepared to facilitate sustained release, sustained release, pulsed release or continuous release. The pharmaceutical composition can also be administered in a device, such as a sustained release, sustained release, pulsed release or continuous release device.

局所投与のための製薬組成物は、任意の好適な形態、例えばクリーム、軟膏、ローション、パッチ、溶液、懸濁液、凍結乾燥物、及びゲルであってよい。   Pharmaceutical compositions for topical administration can be in any suitable form, such as creams, ointments, lotions, patches, solutions, suspensions, lyophilizates, and gels.

本発明の抗体、構造、接合体及び断片を有する組成物は、製薬上許容可能なコンベンショナルな希釈剤、賦形剤、及びキャリヤなどを含むことができる。錠剤、丸剤、カプレット剤及びカプセル剤は、コンベンショナルな賦形剤、ラクトース、澱粉及びステアリン酸マグネシウムを含むことができる。坐剤は、賦形剤、例えばワックス及びグリセロールを含むことができる。注射溶液は、発熱物質なしの滅菌媒質、例えば生理食塩水を含み、そして緩衝剤、安定剤又は保存剤を含んでよい。コンベンショナルな腸溶性コーティングを使用することもできる。   Compositions having antibodies, structures, conjugates and fragments of the invention can include pharmaceutically acceptable conventional diluents, excipients, carriers, and the like. Tablets, pills, caplets and capsules can contain conventional excipients, lactose, starch and magnesium stearate. Suppositories can contain excipients such as waxes and glycerol. Injection solutions include a pyrogen-free sterile medium, such as saline, and may include buffers, stabilizers, or preservatives. Conventional enteric coatings can also be used.

本発明の抗体及びポリペプチド、及びその製薬組成物は、疾患の影響を改善し、疾患を予防し、疾患を治療し、又はこれを必要とする患者の疾患の進行を阻害する方法において使用することができる。このような方法は、細胞転動、炎症、自己免疫疾患、転移、腫瘍細胞又は白血病細胞の成長及び/又は複製、又は白血病患者における腫瘍細胞又は白血病細胞を有する患者内の腫瘍細胞数の増大を阻害することを含む。加えて、このような方法は、腫瘍細胞又は白血病細胞の死亡率を高めることを含み、抗疾患薬による疾患細胞の損傷され易さ、抗癌薬による腫瘍細胞の損傷され易さ、又は抗白血病薬による白血病細胞の損傷され易さを変化させる。このような方法はまた、白血病患者における腫瘍細胞又は白血病細胞を有する患者内の腫瘍細胞数を減少させることを含む。このような方法はまた、細胞へのHIV侵入を阻害し又は減少させることを含む。このような方法はさらに、心臓血管疾患、例えば再狭窄を予防又は阻害することを含む。   The antibodies and polypeptides of the present invention, and pharmaceutical compositions thereof, are used in methods of improving the effects of disease, preventing disease, treating disease, or inhibiting disease progression in patients in need thereof. be able to. Such methods may include cell mobilization, inflammation, autoimmune disease, metastasis, growth and / or replication of tumor cells or leukemia cells, or an increase in the number of tumor cells in patients with tumor cells or leukemia cells in leukemia patients. Including inhibiting. In addition, such methods include increasing the mortality of tumor cells or leukemia cells and are susceptible to damage of disease cells by anti-disease agents, susceptibility of tumor cells to anti-cancer agents, or anti-leukemia It changes the susceptibility of leukemia cells to damage by drugs. Such methods also include reducing the number of tumor cells in a leukemia patient or a patient having leukemia cells. Such methods also include inhibiting or reducing HIV entry into the cell. Such methods further include preventing or inhibiting cardiovascular diseases such as restenosis.

本発明はさらに、種々の疾患状態、例えばAML、T-ALL、B-白血病、B-CLL、Pre-B-ALL、多発性骨髄腫、転移細胞、HIV感染、心臓血管疾患、又は細胞転動、炎症、免疫疾患、感染、自己免疫反応、転移のような細胞機能又は作用が有意な役割を演じる他の疾患を治療するための薬物の製造方法を提供する。このような薬物は、本発明の抗体及びポリペプチドを含む。   The invention further provides for various disease states such as AML, T-ALL, B-leukemia, B-CLL, Pre-B-ALL, multiple myeloma, metastatic cells, HIV infection, cardiovascular disease, or cell motility. Provided is a method for the manufacture of a medicament for treating other diseases in which cellular function or action such as inflammation, immune disease, infection, autoimmune response, metastasis plays a significant role. Such drugs include the antibodies and polypeptides of the present invention.

1実施態様の場合、本発明は、組織試料と特異的に結合するY1の能力をアッセイし、そしてY1結合と、対照抗体、例えばKPL-1による結合とを比較することにより、或る人物の癌を診断する方法を提供する。1実施態様の場合、この方法は、その人物の血液又は固形組織から細胞試料を分離し、細胞を、硫酸化型チロシン・モチーフ含有エピトープ(「試験エピトープ」)を認識する抗体又はその断片と一緒にインキュベートし、非特異的に結合された抗体を洗い流し、そしてその結果と、基準標準、例えば既知の結合活性を有する対照抗体で実施された対応染色処置の結果とを比較することを含む。対照抗体は、チロシン・モチーフの硫酸化されていない形態を含有するエピトープ、又はこのような形態を含有する抗原を認識する抗体である。試験抗体結合が染色強度によって測定して、対照による結合よりも著しく大きいと、腫瘍細胞の存在が示される。染色処置は標準的な方法によって実施することができる。例えば、二次抗体を使用して、第1抗体を視覚化することができる。二次抗体は第1抗体を認識し、そして酵素基質に接合される。酵素基質は、酵素による作用を受けると色反応を生じさせる。或いは、試験抗体及び対照抗体の双方が細胞に結合するが、しかし細胞はY1を内部化し、そして対照抗体を内部化しない場合に、腫瘍細胞の存在が示される。1実施態様において、癌は充実性腫瘍である。別の実施態様において、癌は血液担持型腫瘍である。好ましい実施態様において、試験抗体はY1又はその断片、又は関連抗体又はその断片である。別の好ましい実施態様の場合、対照抗体はKPL1である。   In one embodiment, the present invention can assay a person's ability to assay the ability of Y1 to specifically bind to a tissue sample and compare Y1 binding to binding by a control antibody, such as KPL-1. A method of diagnosing cancer is provided. In one embodiment, the method separates a cell sample from the person's blood or solid tissue and combines the cells with an antibody or fragment thereof that recognizes a sulfated tyrosine motif-containing epitope ("test epitope"). And washing away the non-specifically bound antibody and comparing the results with the results of a corresponding staining procedure performed with a reference standard, eg, a control antibody with known binding activity. A control antibody is an antibody that recognizes an epitope containing a non-sulfated form of the tyrosine motif, or an antigen containing such a form. A test antibody binding, as measured by staining intensity, is significantly greater than the binding by the control, indicating the presence of tumor cells. The staining procedure can be performed by standard methods. For example, a secondary antibody can be used to visualize the first antibody. The secondary antibody recognizes the first antibody and is conjugated to the enzyme substrate. Enzyme substrates cause a color reaction when acted upon by the enzyme. Alternatively, both the test antibody and the control antibody bind to the cell but the cells internalize Y1 and do not internalize the control antibody, indicating the presence of tumor cells. In one embodiment, the cancer is a solid tumor. In another embodiment, the cancer is a blood-borne tumor. In a preferred embodiment, the test antibody is Y1 or a fragment thereof, or a related antibody or fragment thereof. In another preferred embodiment, the control antibody is KPL1.

別の実施態様の場合、本発明は、癌を診断する方法であって、血液又は固形組織から細胞試料を、腫瘍細胞の存在に関してスクリーニングすることを含む方法を提供する。Y1又はその断片、又は関連抗体又はその断片を使用して、細胞試料溶解物上でウェスタン・ブロットを実施する。Y1自体に検出可能な標識を付けるか、又は検出可能な抗ヒト抗体を採用する標準的な方法を用いることにより、Y1結合を観察することができる。Y1結合が、上記のように定義された対照による結合よりも著しく大きい場合に、腫瘍細胞の存在が示される。Y1結合が、対照による結合よりも著しく大きい場合に、腫瘍細胞の存在が示される。   In another embodiment, the present invention provides a method of diagnosing cancer comprising screening a cell sample from blood or solid tissue for the presence of tumor cells. Western blots are performed on cell sample lysates using Y1 or fragments thereof, or related antibodies or fragments thereof. Y1 binding can be observed by attaching a detectable label to Y1 itself, or by using standard methods that employ detectable anti-human antibodies. The presence of tumor cells is indicated when Y1 binding is significantly greater than binding by the control defined above. The presence of tumor cells is indicated when Y1 binding is significantly greater than binding by the control.

別の実施態様の場合、本発明は、細胞溶解物を調製し、そしてアフィニティ・カラムに細胞溶解物を通すことにより溶解物を精製することによって、血液担持型腫瘍又は固形腫瘍のタンパク質マーカーを同定する方法を提供する。アフィニティ・カラムは、Y1又はその断片、又は関連抗体又はその断片を内蔵する。1実施態様の場合、細胞溶解物は、ヒトから捕集された一次組織試料に由来する。別の実施態様の場合、細胞溶解物は、腫瘍細胞系に由来する。更なる実施態様の場合、腫瘍細胞系は不死化細胞系であってよい。   In another embodiment, the invention identifies protein markers for blood-borne tumors or solid tumors by preparing cell lysates and purifying the lysate by passing the cell lysate through an affinity column. Provide a way to do it. The affinity column contains Y1 or a fragment thereof, or a related antibody or fragment thereof. In one embodiment, the cell lysate is derived from a primary tissue sample collected from a human. In another embodiment, the cell lysate is derived from a tumor cell line. In a further embodiment, the tumor cell line may be an immortalized cell line.

別の実施態様の場合、本発明は、血液担持型癌の段階をモニタリングする方法であって、血液担持型癌患者から白血球を分離し、細胞をY1と一緒にインキュベートし、基準標準に対するY1結合規模を見極めることを含む方法を提供する。   In another embodiment, the present invention is a method for monitoring the stage of a blood-borne cancer, wherein leukocytes are separated from a blood-borne cancer patient, the cells are incubated with Y1, and Y1 binding to a reference standard is achieved. Provide a method that includes determining the scale.

タンパク質、例えばGPIb及びPSGL-1上に存在する硫酸化型チロシン・エピトープの治療ターゲッティングの別のアプローチとして、適切な組み合わせライブラリーのスクリーニングによって、小さな無機化学物質を同定することができる。このような化学物質は、scFv又はIgGを基剤とする治療薬を上回る多数の利点を有することができる。例えば、無機化学物質は経口投与することができ、免疫反応の低減を含む高められたバイオセイフティ・プロフィールを有することができる。無機化学物質は、特に、最初に選択されたリード化合物を最適化するための合理的な薬物設計に従って、ターゲットに向けられる選択性を高めることができる。他の利点は製造コストの低下、貯蔵寿命の長期化、及び規制認可プロセスの単純化を含む。   As another approach for therapeutic targeting of sulfated tyrosine epitopes present on proteins such as GPIb and PSGL-1, small inorganic chemicals can be identified by screening appropriate combinatorial libraries. Such chemicals can have a number of advantages over therapeutic agents based on scFv or IgG. For example, inorganic chemicals can be administered orally and have an enhanced biosafety profile that includes a reduction in immune response. Inorganic chemicals can increase the selectivity directed to the target, particularly according to a rational drug design to optimize the lead compound initially selected. Other benefits include reduced manufacturing costs, extended shelf life, and simplified regulatory approval process.

本発明のエピトープの多数の実施態様が例えばGPIb及びPSGL-1上で同定されているので、リガンド駆動型アプローチを採用することにより、無機化学物質を同定することができる。無機化学物質は極めて狭い特異性を有しているか、或いは、再潅流傷害のような疾患状態に対する2つ以上の硫酸化型チロシン・エピトープをターゲットする。再潅流傷害は、それぞれこのようなエピトープを担持する2つ以上の明確なターゲットを伴う。リガンド駆動型アプローチは、治療的介入のためにターゲットを同定するスクリーニング・プロセスを有意に短縮し、そしてリード最適化と同時的なターゲット立証を可能にし、このことは一連の集中ライブラリーを用いて実施することができる。   Since numerous embodiments of the epitope of the present invention have been identified, for example on GPIb and PSGL-1, inorganic chemicals can be identified by employing a ligand-driven approach. Inorganic chemicals have very narrow specificity or target two or more sulfated tyrosine epitopes for disease states such as reperfusion injury. Reperfusion injury involves two or more distinct targets, each carrying such an epitope. The ligand-driven approach significantly shortens the screening process for identifying targets for therapeutic intervention and allows for target verification simultaneously with lead optimization, which uses a series of centralized libraries Can be implemented.

硫酸化型チロシン・エピトープをターゲットするために特殊化された無機化学物質のライブラリーは、先ず抗体、例えばY1と、その既知のターゲット、例えばGPIbの残基硫酸化型Tyr-276及びAsp-277との三次元相互作用を分析することにより設計して開発することができる。Y1結合部位を模倣して、ターゲットに対するアフィニティを高める物質から成る化学ライブラリーは、コンピューター支援型組み合わせライブラリー設計によって開発することができる。   A library of inorganic chemicals specialized to target sulfated tyrosine epitopes is first an antibody, eg Y1, and its known target, eg GPIb residues sulfated Tyr-276 and Asp-277. It can be designed and developed by analyzing the three-dimensional interaction with. Chemical libraries consisting of substances that mimic the Y1 binding site and increase affinity for the target can be developed by computer-aided combinatorial library design.

本出願明細書全体にわたって、種々の刊行物、特許明細書、及び特許出願明細書を参照している。これらの刊行物、特許明細書、及び特許出願明細書の教示内容及び開示内容全体を、参考のため本出願明細書に引用し、本発明が関連する従来技術をより十分に説明する。   Throughout this application reference is made to various publications, patent specifications, and patent application specifications. The entire teachings and disclosures of these publications, patent specifications and patent application specifications are cited in this application for reference to more fully describe the prior art to which this invention pertains.

実施例
本発明を理解する助けとなるように、以下に実施例を示すが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するように意図されたものではなく、またそのように解釈されるべきでない。特定の試薬や反応条件を記載するが、本発明の範囲に含まれるような変更を加えることができる。従って下記実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。 EXAMPLES The following examples are presented to aid the understanding of the present invention, but these examples are not intended and should be construed as not limiting the scope of the invention. Not. Although specific reagents and reaction conditions are described, modifications can be made that fall within the scope of the present invention. Accordingly, the following examples are provided to further illustrate the present invention.

実施例1：一次AML細胞(R1198-3)からのY1リガンドの同定
1.1 一次AML細胞(段階M4)を患者から捕集して溶解した。溶解物に、Y1-IgGカラム上のアフィニティ・クロマトグラフィを含む精製を施した(図1参照)。分離されたタンパク質を、エンドプレテイナーゼAsp-Nで消化し、そしてその結果として生じるペプチド配列を、質量分析を用いて決定した。配列は、発表済のヒトPSGL-1 N末端アミノ酸配列と同一であった。これらの結果は、段階4の一次AML細胞が、Y1-IgGによって結合することができるPSGL-1を発現させることを示す。精製されたタンパク質が、Y1認識モチーフのチロシン2及び3で硫酸化されることが、さらに見極められた(図2参照)。内部対照を使用して、Y1の免疫調節効果の特異性を検証し、例えばマウス・インターロイキン-6分泌の誘発は検出されなかった。 Example 1: Identification of Y1 ligand from primary AML cells (R1198-3)
1.1 Primary AML cells (stage M4) were collected from the patient and lysed. The lysate was subjected to purification including affinity chromatography on a Y1-IgG column (see FIG. 1). The separated protein was digested with endoproteinase Asp-N and the resulting peptide sequence was determined using mass spectrometry. The sequence was identical to the published human PSGL-1 N-terminal amino acid sequence. These results indicate that stage 4 primary AML cells express PSGL-1, which can be bound by Y1-IgG. It was further determined that the purified protein was sulfated with the tyrosine 2 and 3 of the Y1 recognition motif (see FIG. 2). An internal control was used to verify the specificity of the immunomodulatory effect of Y1, for example, no induction of mouse interleukin-6 secretion was detected.

実施例2：抗体依存性細胞の細胞毒性
2.1 Y1-IgGの効果：
Y1-IgGが抗体依存性細胞の細胞毒性(ADCC)を媒介することができるかどうかを見極めるための研究が示したところでは、この抗体は、種々のターゲット細胞のエフェクター細胞の細胞毒性を媒介する。ターゲット細胞は、ML2(我々のモデル系におけるターゲットとして働くAML由来細胞系)、及び患者臨床試料から得られたB-CLL細胞を含む。Y1-IgGはこれらの細胞タイプと、CD162(PSGL-1)を介して結合する。CD162は、健常B-細胞及び初期段階AML上には実質的に存在しない分子である。 Example 2: Cytotoxicity of antibody-dependent cells
2.1 Effect of Y1-IgG:
Studies have shown that Y1-IgG can mediate antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC), and this antibody mediates effector cell cytotoxicity of various target cells . Target cells include ML2 (an AML-derived cell line that serves as a target in our model system) and B-CLL cells obtained from patient clinical samples. Y1-IgG binds to these cell types via CD162 (PSGL-1). CD162 is a molecule that is substantially absent on healthy B-cells and early stage AML.

Y1-IgG ADCCに関与するエフェクター細胞個体群が定義されている。Y1-IgGがADCCを媒介するためには、ナチュラルキラー(NK)細胞(D56+)、γδ T-細胞、及び単球(CD14+)が必要となるが、しかしT-ヘルパー細胞(CD4+)及び細胞毒性T細胞(CD8+)は必要とならない。このことは、健常被験者及びB-CLL患者の両方から得られたドナー細胞で確認された。   An effector cell population involved in Y1-IgG ADCC has been defined. For Y1-IgG to mediate ADCC, natural killer (NK) cells (D56 +), γδ T-cells, and monocytes (CD14 +) are required, but T-helper cells (CD4 +) and cytotoxicity T cells (CD8 +) are not required. This was confirmed with donor cells obtained from both healthy subjects and B-CLL patients.

さらに、ターゲット細胞が存在しない場合でさえ、Y1-IgGは、初期活性化マーカー(CD69+)、サイトカイン、例えばTNFα及びIFNγの分泌、及びFasLの誘発の出現によって測定して、種々異なるタイプのエフェクター細胞の活性化を媒介する。Y1-IgGと二次抗ヒトFc抗体とのハイパー架橋(XL)が実証したところによれば、アポトーシス・メカニズムが細胞死滅にも関与する。   Furthermore, even in the absence of target cells, Y1-IgG is a different type of effector cell as measured by the appearance of early activation markers (CD69 +), secretion of cytokines such as TNFα and IFNγ, and induction of FasL. Mediates activation. Hyper-crosslinking (XL) between Y1-IgG and secondary anti-human Fc antibody has been demonstrated, and the apoptosis mechanism is also involved in cell death.

in vitroの一次B-CLL細胞に向けられたY1-IgG活性を、種々のリンパ性悪性疾患の治療のために現在幅広く使用されている、商業的に入手可能な2種のヒト化抗体、すなわちリツキシマブ(CD20と結合)及びキャンパス(CD52と結合)の活性と比較した。B-CLLに対するリツキシマブの作用メカニズムは明らかではないが、CD-20ポジティブ悪性B細胞に対するその細胞毒性効果は、補体依存性細胞毒性(CDC)、ADCC及びアポトーシス誘発のうちの1つ又は2つ以上を伴うことができる。CD52ポジティブ悪性B細胞、並びに正常B及びT細胞に対するキャンパスの細胞毒性効果は、CDC、ADCC及びアポトーシス誘発を伴う。キャンパス投与は、全ての成熟正常B及びT細胞の完全なアブレーションと関連し、重大な血液毒性を招く。   Y1-IgG activity directed against primary B-CLL cells in vitro is converted into two commercially available humanized antibodies, currently widely used for the treatment of various lymphoid malignancies, namely The activities of rituximab (binding to CD20) and campus (binding to CD52) were compared. Although the mechanism of action of rituximab on B-CLL is unclear, its cytotoxic effect on CD-20 positive malignant B cells is one or two of complement-dependent cytotoxicity (CDC), ADCC, and apoptosis induction. The above can be accompanied. Campus cytotoxic effects on CD52 positive malignant B cells and normal B and T cells are associated with CDC, ADCC and apoptosis induction. Campus administration is associated with complete ablation of all mature normal B and T cells, resulting in significant hematologic toxicity.

ADCC試験に際して、単核エフェクター及びターゲット細胞をFICOLL（登録商標）上で分離した。次いでターゲット細胞にはPKH26を標識付けした。PKH26は、細胞膜の脂質領域内部に蛍光色素を安定的に内蔵する。次いで細胞を洗浄し、そして、種々異なる濃度のY1-IgG又は対照抗体の不存在又は存在において、24時間にわたって、種々のエフェクター：ターゲット(E:T)比で、エフェクター細胞と一緒にインキュベートした。死細胞をTOPRO（登録商標）(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)によって染色し、そしてゲート・ターゲット細胞上のFACSによって分析した。   For ADCC testing, mononuclear effector and target cells were separated on FICOLL®. The target cells were then labeled with PKH26. PKH26 stably incorporates a fluorescent dye inside the lipid region of the cell membrane. Cells were then washed and incubated with effector cells at various effector: target (E: T) ratios for 24 hours in the absence or presence of different concentrations of Y1-IgG or control antibody. Dead cells were stained with TOPRO® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) and analyzed by FACS on gated target cells.

CDC試験に際して、B-CLL患者の単核細胞をFICOLL（登録商標）上で分離した。患者の血漿の存在又は不存在において、24時間にわたって、Y1-IgG又は対照抗体を伴って又はこれを伴わずに、細胞をインキュベートした。次いでアポトーシス細胞をAnnexin-PIで染色し、そしてFACSによって分析した。   During the CDC study, mononuclear cells from B-CLL patients were separated on FICOLL®. Cells were incubated with or without Y1-IgG or control antibodies in the presence or absence of patient plasma for 24 hours. Apoptotic cells were then stained with Annexin-PI and analyzed by FACS.

エフェクター細胞活性化を評価するために、健常ドナーの単核細胞をFICOLL（登録商標）上で分離した。24時間にわたって、Y1-IgG又は対照抗体を伴って又はこれを伴わずに、細胞をインキュベートした。αCD69(初期活性化マーカー)抗体によるFACS分析を、種々異なるタイプのエフェクター細胞に関して実施した。サイトカイン、例えばTNFα及びIFNγの分泌をELISAによって測定した。   To assess effector cell activation, healthy donor mononuclear cells were separated on FICOLL®. Cells were incubated for 24 hours with or without Y1-IgG or control antibody. FACS analysis with αCD69 (early activation marker) antibody was performed on different types of effector cells. The secretion of cytokines such as TNFα and IFNγ was measured by ELISA.

アポトーシス試験に際して、B-CLL患者の単核細胞をFICOLL（登録商標）上で分離した。10分間にわたって37℃で、Y1-IgG又は対照抗体の存在又は不存在において、細胞をインキュベートした。次いで非ヒトFc抗体を添加し、4-24時間にわたって37℃でインキュベートした。次いで、疾患細胞(CD19+、CD5+)をアポトーシス・マーカーAnnexin-TOPRO（登録商標）で染色し、そしてFACSによって分析した。   During the apoptosis test, mononuclear cells from B-CLL patients were separated on FICOLL®. Cells were incubated in the presence or absence of Y1-IgG or control antibody at 37 ° C. for 10 minutes. Non-human Fc antibody was then added and incubated at 37 ° C. for 4-24 hours. Disease cells (CD19 +, CD5 +) were then stained with the apoptosis marker Annexin-TOPRO® and analyzed by FACS.

Y1-IgG及びリツキシマブの比較研究は、Y1-IgGが、ADCCの媒介、及びB-CLL細胞に対するアポトーシス誘発に関して、リツキシマブよりも優れていることを示す。キャンパス｛Campath（登録商標）｝とは対照的に、Y1-IgGは、一次B-CLL細胞に対してCDCを媒介することができないことが見いだされた。これらのin vitroの結果は、Y1-IgGが、そのADCC活性に基づいてB-CLLの治療のための治療薬として有用であることを示す。   A comparative study of Y1-IgG and rituximab shows that Y1-IgG is superior to rituximab in mediating ADCC and inducing apoptosis on B-CLL cells. In contrast to the campus {Campath®}, Y1-IgG was found to be unable to mediate CDC on primary B-CLL cells. These in vitro results indicate that Y1-IgG is useful as a therapeutic for the treatment of B-CLL based on its ADCC activity.

2.1.1 一次B-慢性リンパ球性白血病(B-CLL)におけるADCC：
Y1-IgGが一次B-CLLにおいてADCCを媒介するかどうかを見極めるために、種々異なる患者のB-CLL細胞を、種々異なるエフェクター/ターゲット細胞比で、PBMCエフェクター細胞とともに、24時間にわたって同時インキュベートした。13個の異なるB-CLL臨床試料の分析が示したところによれば、Y1-IgGは、細胞溶解の平均規模約21.4%で、全ての事例(図3)において、エフェクター細胞の細胞毒性を媒介する。13個の試料のうちの4つ(30%)が、30%を上回る溶解度を示し、これに対して13個の試料のうちの2つ(15%)だけが、10%未満の溶解度を示した。いくつかの事例において、低いE:T比でさえ、高い溶解度が見られた。例えばKBC171は約62%の溶解度を示した。これに対して他の事例の場合、高いE:T比でさえ、低い溶解度が見られた。例えばKBC104は約7%の溶解度しか示さなかった。変動は、種々異なる健常ドナーから得られたエフェクター細胞試料、並びにB-CLL試料間の差異に帰属し得る。 2.1.1 ADCC in primary B-chronic lymphocytic leukemia (B-CLL):
To determine whether Y1-IgG mediates ADCC in primary B-CLL, B-CLL cells from different patients were co-incubated with PBMC effector cells at different effector / target cell ratios for 24 hours. . Analysis of 13 different B-CLL clinical samples showed that Y1-IgG mediates effector cell cytotoxicity in all cases (Figure 3) with an average magnitude of cell lysis of approximately 21.4%. To do. Four of the 13 samples (30%) show a solubility greater than 30%, whereas only two of the 13 samples (15%) show a solubility of less than 10%. It was. In some cases, high solubility was seen even at low E: T ratios. For example, KBC171 showed a solubility of about 62%. In contrast, other cases showed low solubility even at high E: T ratios. For example, KBC104 showed only about 7% solubility. Variations can be attributed to differences between effector cell samples obtained from different healthy donors, as well as B-CLL samples.

2.1.2 急性骨髄性白血病細胞に対する、PBMCによるY1-IgG媒介型ADCC：
PBMCはまた、種々のPBMC:AML比(10, 20又は40：10又は20μg/mlのY1-IgGの存在において)を用いて、患者の一次AML細胞に対してADCCをもたらした。例えば、細胞比10:1において、AML細胞の7.9%が、抗体の不存在において死亡し、そしてヒトIgGの存在において6%が死亡した。10及び20μg/mlのY1-IgGの存在において、AML細胞のそれぞれ14.2%及び17.6%が死亡した(図4)。細胞毒性の度合いは、Y1-IgGの増大(10又は20μg/ml)に伴って高くなった。ヒトIgGはADCCを誘発しなかった。1つの付加的な一次AML試料に関して同様の結果が得られた(データは示さず)。 2.1.2 Y1-IgG-mediated ADCC by PBMC for acute myeloid leukemia cells:
PBMC also produced ADCC against the patient's primary AML cells using various PBMC: AML ratios (in the presence of 10, 20 or 40:10 or 20 μg / ml Y1-IgG). For example, at a cell ratio of 10: 1, 7.9% of AML cells died in the absence of antibody and 6% died in the presence of human IgG. In the presence of 10 and 20 μg / ml Y1-IgG, 14.2% and 17.6% of AML cells died, respectively (FIG. 4). The degree of cytotoxicity increased with increasing Y1-IgG (10 or 20 μg / ml). Human IgG did not induce ADCC. Similar results were obtained for one additional primary AML sample (data not shown).

ML-2細胞はADCCの良好なモデルを提供する。それというのもY1-IgGが、検出可能な内部化を被ることなしに結合するからである。   ML-2 cells provide a good model for ADCC. This is because Y1-IgG binds without undergoing detectable internalization.

a. ML2 ADCCはY1-IgG濃度とともに増大する：
24時間のインキュベーション後には、細胞毒性は、エフェクター(PBMC)とターゲットとの4つの異なる比(5:1、10:1、20:1、40:1)で、Y1-IgGの存在において、その不存在におけるよりも高かった(図5)。この効果は、マウス抗PSGL-1抗体KPL1をY1-IgGの代わりに使用すると減少するか又は存在せず、そしてヒトIgG(エフェクター細胞上のFc受容体に結合する)がY1-IgGの代わりに使用されても減少した。エフェクター：ターゲット比が40:1である場合には、5μg/mlもの低さのY1-IgG濃度が、ADCCを誘発することができた。 a. ML2 ADCC increases with Y1-IgG concentration:
After 24 hours of incubation, cytotoxicity is observed in the presence of Y1-IgG in four different ratios of effector (PBMC) and target (5: 1, 10: 1, 20: 1, 40: 1). It was higher than in the absence (Figure 5). This effect is diminished or absent when the mouse anti-PSGL-1 antibody KPL1 is used instead of Y1-IgG and human IgG (which binds to the Fc receptor on effector cells) replaces Y1-IgG Reduced even when used. When the effector: target ratio was 40: 1, Y1-IgG concentrations as low as 5 μg / ml were able to induce ADCC.

b. Y1-IgGとKPL-1との競合：
Y1-IgG(20又は50μg/ml)が、エフェクター：ターゲット比20:1〜40:1で、ML2細胞に対してADCCを誘発した。マウス抗PSGL-1抗体KPL-1は単独ではADCCを誘発せず、従って、Y1結合誘発型ADCCの競合体として使用することができた。KPL-1はY1-IgG誘発型ADCCを部分的に阻害し(図6)、そして例えば、Y1-IgG(20μg/ml；エフェクター/ターゲット比20:1)の存在における48時間のインキュベーション後に、74.1%の細胞毒性が観察されるのに対して、KPL1(20μg/ml)の付加的な存在の結果、細胞毒性を58.8%しかもたらさなかった。従って、ML2のY1-IgG誘発型ADCCは、Y1-IgGによるPSGL-1の結合を伴う。 b. Competition between Y1-IgG and KPL-1:
Y1-IgG (20 or 50 μg / ml) induced ADCC on ML2 cells at an effector: target ratio of 20: 1 to 40: 1. The mouse anti-PSGL-1 antibody KPL-1 alone did not induce ADCC and could therefore be used as a competitor for Y1 binding induced ADCC. KPL-1 partially inhibits Y1-IgG-induced ADCC (FIG. 6) and, for example, after 48 hours incubation in the presence of Y1-IgG (20 μg / ml; effector / target ratio 20: 1), 74.1 % Cytotoxicity was observed, whereas the additional presence of KPL1 (20 μg / ml) resulted in only 58.8% cytotoxicity. Therefore, Y1-IgG-induced ADCC of ML2 is accompanied by PSGL-1 binding by Y1-IgG.

c. Y1-IgG媒介型ADCCにおけるナチュラルキラー、γδ T細胞及び単球の関与：
ML2又はB-CLLターゲット細胞のY1-IgG媒介型ADCCをもたらすことができる能力に関して、ポジティブに選択されたエフェクター細胞を分析した。商業的に入手可能な磁気ビードを使用して、正常ドナー及びB-CLL患者から、ナチュラルキラー(NK)細胞(CD56+)、γδ T-細胞及び細胞毒性T-細胞(CD8+)を分離した。図7Aに示すように、正常ドナー及びB-CLL患者双方のNK細胞(図7AのKCS試料)は、ML2及びB-CLLターゲットにADCCをもたらすことができ(図7AのKCS試料)、その結果、対照を上回る13〜68%の溶解が生じた。また、γδ T細胞は、ML2細胞のADCCを媒介することが示された。対照的に、細胞毒性T-細胞は、Y1-IgG媒介型細胞毒性に関与するようには見えない。 c. Involvement of natural killer, γδ T cells and monocytes in Y1-IgG mediated ADCC:
Positively selected effector cells were analyzed for the ability of ML2 or B-CLL target cells to produce Y1-IgG mediated ADCC. Natural killer (NK) cells (CD56 +), γδ T-cells and cytotoxic T-cells (CD8 +) were isolated from normal donors and B-CLL patients using commercially available magnetic beads. As shown in FIG. 7A, NK cells from both normal donors and B-CLL patients (KCS sample in FIG. 7A) can bring ADCC to ML2 and B-CLL targets (KCS sample in FIG. 7A), resulting in , 13-68% dissolution occurred over the control. In addition, γδ T cells have been shown to mediate ADCC of ML2 cells. In contrast, cytotoxic T-cells do not appear to be involved in Y1-IgG mediated cytotoxicity.

PBMCから特異的細胞個体群をネガティブに選択することから示されたところでは、NK細胞(CD56+)及びγδ T細胞に加えて、CD14+細胞(単球)もまた、ML2ターゲットに対するADCCに関与する(図7B)。Y1-IgG媒介型毒性に関与するエフェクター細胞の全てが、Fc受容体、CD16を発現させる。   In addition to NK cells (CD56 +) and γδ T cells, CD14 + cells (monocytes) are also involved in ADCC against ML2 targets, as shown by negative selection of specific cell populations from PBMC ( FIG. 7B). All effector cells involved in Y1-IgG mediated toxicity express the Fc receptor, CD16.

d. Y1によるNK細胞の活性化：
CD69の発現によって測定して、Y1は、ナチュラルキラー細胞によってADCCを媒介する。6人の健常ドナーのエフェクター細胞を、Y1-IgG又はヒトIgG又はマウス抗CD62抗体(KPL1、PL1又はPL2)の存在において、又はあらゆる抗体の不存在において(対照)、37℃で24時間にわたってインキュベートした。次いで、FACS分析を実施し、そして、ナチュラルキラー(NK)細胞(CD56+)上の初期活性化マーカーCD69の発現を見極めた。図8に示すように、Y1-IgGによるNK細胞の活性化は、6種のドナー細胞全てで媒介された。対照的に、ヒトIgGによって、又は抗CD162マウス抗体KPL1、PL1又はPL2によって、効果を検出することができた。予備研究はまた、Y1-IgGとのインキュベーションに続いて、エフェクター細胞上でのFasL発現の誘発をも示した(データは示さず)。 d. Activation of NK cells by Y1:
Y1 mediates ADCC by natural killer cells as measured by CD69 expression. Effector cells of 6 healthy donors are incubated for 24 hours at 37 ° C. in the presence of Y1-IgG or human IgG or mouse anti-CD62 antibody (KPL1, PL1 or PL2) or in the absence of any antibody (control) did. FACS analysis was then performed and the expression of the early activation marker CD69 on natural killer (NK) cells (CD56 +) was determined. As shown in FIG. 8, the activation of NK cells by Y1-IgG was mediated by all six donor cells. In contrast, the effects could be detected by human IgG or by anti-CD162 mouse antibodies KPL1, PL1 or PL2. Preliminary studies also showed induction of FasL expression on effector cells following incubation with Y1-IgG (data not shown).

e. Y1-IgG誘発型アポトーシス
Y1-IgGの存在においてインキュベートされたB-CLL患者の単核細胞(CD19+、CD5+)は、FACS分析によって評価して、24時間以内に約5%のアポトーシスを示した(図9)。Y1-IgGを架橋する二次抗体の添加は、24時間以内に付加的な50%のアポトーシスを誘発した(図9)。 e. Y1-IgG-induced apoptosis
Mononuclear cells (CD19 +, CD5 +) from B-CLL patients incubated in the presence of Y1-IgG showed approximately 5% apoptosis within 24 hours as assessed by FACS analysis (FIG. 9). Addition of a secondary antibody that crosslinks Y1-IgG induced an additional 50% apoptosis within 24 hours (FIG. 9).

これらの結果は、PSGL-1上の硫酸化型エピトープに導かれた抗体の架橋が、一次B-CLL細胞のアポトーシスのためのシグナルをトリガーすることを示唆する。このことは、PSGL-1がB-CLL患者においてin vivoでアポトーシスを誘発するためのターゲットである得ることを暗示する。架橋効果は、Fc受容体担持細胞、例えば単球、CD56+ NK細胞及びγδ T-細胞によって媒介することができる。   These results suggest that antibody cross-linking directed to sulfated epitopes on PSGL-1 triggers signals for apoptosis of primary B-CLL cells. This implies that PSGL-1 may be a target for inducing apoptosis in B-CLL patients in vivo. The cross-linking effect can be mediated by Fc receptor-bearing cells such as monocytes, CD56 + NK cells and γδ T-cells.

上記のアポトーシス効果及び架橋効果は、抗PSGL-1抗体KPL1を使用して阻害することができる(データは示さず)。この抗体だけではアポトーシスを誘発することはない。このことは、アポトーシス・シグナルがPSGL-1上のエピトープによって媒介される確証を提供する。   The apoptotic and crosslinking effects described above can be inhibited using the anti-PSGL-1 antibody KPL1 (data not shown). This antibody alone does not induce apoptosis. This provides confirmation that the apoptotic signal is mediated by an epitope on PSGL-1.

f. リツキシマブと比較した、B-CLLに対するY1-IgGのADCC効果
2つの一次ヒトB-CLL患者試料におけるY1-IgG抗体によって誘発された細胞死のパーセンテージは、リツキシマブによって得られるものよりも有意に高かった。図10は、Y1が対照を上回って25%〜35%の細胞毒性を誘発し、これと比較してリツキシマブによって誘発された細胞毒性は10%〜13%にすぎないことを示す。ターゲット細胞上における受容体分子の飽和は、10μg/mlのY1-IgG抗体で達成されたが、しかし同じ濃度のリツキシマブによっては達成されなかった。 f. ADCC effect of Y1-IgG on B-CLL compared to rituximab
The percentage of cell death induced by Y1-IgG antibody in the two primary human B-CLL patient samples was significantly higher than that obtained with rituximab. FIG. 10 shows that Y1 induces 25% -35% cytotoxicity over the control, compared to only 10% -13% cytotoxicity induced by rituximab. Receptor molecule saturation on target cells was achieved with 10 μg / ml Y1-IgG antibody, but not with the same concentration of rituximab.

これらをまとめると、これらの結果は、Y1-IgGが、B-CLLの治療における治療薬として有望な候補であることを示唆する。それというのも、細胞毒性効果及びアポトーシス効果が、これらの疾患細胞上に発現されるPSGL-1硫酸化型エピトープの特異的認識によって媒介されるように見えるからである。   Taken together, these results suggest that Y1-IgG is a promising candidate as a therapeutic agent in the treatment of B-CLL. This is because cytotoxic and apoptotic effects appear to be mediated by specific recognition of PSGL-1 sulfated epitopes expressed on these disease cells.

g. B-CLLに対するY1-IgG、リツキシマブ及びキャンパスのCDC効果の分析
B-CLL患者の単各細胞を、患者の血漿の存在及び不存在において、Y1-IgG、リツキシマブ又はキャンパス(Campath（登録商標）)と一緒にインキュベートした。図11に示すように、キャンパス（登録商標）だけが、CDCによって一次B-CLL細胞の細胞毒性を媒介した。リツキシマブもY1-IgGも補体結合によって細胞毒性を誘発することはなかった。 g. Analysis of CDC effect of Y1-IgG, rituximab and campus on B-CLL
Individual B-CLL patient cells were incubated with Y1-IgG, rituximab or campus (Campath®) in the presence and absence of patient plasma. As shown in FIG. 11, only Campus® mediated the cytotoxicity of primary B-CLL cells by CDC. Neither rituximab nor Y1-IgG induced cytotoxicity by complement binding.

in vitroのこれらの結果は、Y1-IgGがそのADCC活性に基づいて、B-CLLの治療のための治療薬として有用であることを示す。   These in vitro results indicate that Y1-IgG is useful as a therapeutic agent for the treatment of B-CLL based on its ADCC activity.

実施例3：Y1-IgG-M-ダウノルビシン誘導体
3.1 Y1-IgG-M-ダウノルビシン誘導体の調製：
抗体-毒素接合体、例えばモルホリノ-ドキソルビシン-Y1-IgG(図13)、及び酵素-M-ダウノルビシン接合体(下記参照)を調製した。ダウノルビシンを修飾して、2つの異なるリンカーのうちの一方に接合し、次いで抗体の遊離アミノ基を介して、又は抗体の還元ジスルフィド結合を介して、抗体に接合した。M-DNR-リンカーという用語は、モルホリニルダウノルビシンアセテートの(6-マレイミドカプロイル)ヒドラゾン及びM-DNR-AESの両方を意味する。 Example 3: Y1-IgG-M-daunorubicin derivative
3.1 Preparation of Y1-IgG-M-daunorubicin derivative:
Antibody-toxin conjugates, such as morpholino-doxorubicin-Y1-IgG (FIG. 13), and enzyme-M-daunorubicin conjugate (see below) were prepared. Daunorubicin was modified and conjugated to one of two different linkers and then conjugated to the antibody through the free amino group of the antibody or through the reduced disulfide bond of the antibody. The term M-DNR-linker means both (6-maleimidocaproyl) hydrazone and M-DNR-AES of morpholinyl daunorubicin acetate.

a. 3'-デアミノ-3'-(4-モルホリニル)ダウノルビシンアセテート(M-DNR-Ac)の調製
乾燥ジメチルホルムアミド中の塩酸ダウノルビシンの溶液に、アルゴン下で乾燥トリエチルアミンを添加し、続いてビス(2-ヨードエチル)エーテルを添加した。反応混合物を光から保護し、そして36時間にわたって室温で撹拌した。 a. Preparation of 3'-deamino-3 '-(4-morpholinyl) daunorubicin acetate (M-DNR-Ac) To a solution of daunorubicin hydrochloride in dry dimethylformamide was added dry triethylamine under argon followed by bis ( 2-Iodoethyl) ether was added. The reaction mixture was protected from light and stirred at room temperature for 36 hours.

結果として生じた水性混合物を塩化メチレンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、セライトを介して濾過し、乾燥するまで蒸発させた。粗生成物をシリカゲル・カラム・クロマトグラフィによって調製し、そして当該画分を一緒にプールして蒸発させることにより、M-DNR遊離塩基を赤い油として産出した。この純度は98%であることが見いだされた(HPLCにより)。収率は55%であった。   The resulting aqueous mixture was extracted with methylene chloride. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered through celite and evaporated to dryness. The crude product was prepared by silica gel column chromatography and the fractions were pooled together and evaporated to yield M-DNR free base as a red oil. This purity was found to be 98% (by HPLC). The yield was 55%.

酢酸との反応後、結果として生じる遊離塩基を、その固形酢酸塩として分離し、続いて凍結乾燥させた。M-DNR-Acは12ヶ月以上にわたって-20℃のアルゴン下で安定である。   After reaction with acetic acid, the resulting free base was separated as its solid acetate and subsequently lyophilized. M-DNR-Ac is stable under -20 ° C argon for over 12 months.

b. モルホリニルダウノルビシンアセテートの(6-マレイミドカプロイル)ヒドラゾンの調製
乾燥メタノール中のM-DNR-Acの溶液に、アルゴン下で6-マレイミドカプロイルヒドラジドを添加し、続いてトリフルオロ酢酸を添加した。透明溶液を光から保護し、そして24時間にわたって室温で撹拌した。 b. Preparation of (6-maleimidocaproyl) hydrazone of morpholinyl daunorubicin acetate To a solution of M-DNR-Ac in dry methanol, 6-maleimidocaproyl hydrazide was added under argon followed by trifluoroacetic acid. Added. The clear solution was protected from light and stirred at room temperature for 24 hours.

メタノール溶液を減圧下において25℃で、乾燥するまで蒸発させ、その結果赤い油残留物が生じた。これを乾燥メタノール中に溶解させた。この溶液に、乾燥エーテルを添加し、そして遠心分離により、沈澱した赤い固形物を分離した。乾燥エーテルと一緒に3回粉砕した後、純度98%及び収率88%を有する純粋な結晶性生成物を得、高真空下で乾燥させ、そして-20℃のアルゴン下で維持した。モルホリニルダウノルビシンアセテートの(6-マレイミドカプロイル)ヒドラゾンは、4ヶ月以上にわたって-20℃のアルゴン下で安定である。   The methanol solution was evaporated to dryness at 25 ° C. under reduced pressure, resulting in a red oil residue. This was dissolved in dry methanol. To this solution was added dry ether and the precipitated red solid separated by centrifugation. After triturating three times with dry ether, a pure crystalline product having a purity of 98% and a yield of 88% was obtained, dried under high vacuum and maintained at −20 ° C. under argon. Morpholinyl daunorubicin acetate (6-maleimidocaproyl) hydrazone is stable under -20 ° C. argon for over 4 months.

c. モルホリノダウノルビシンのアジピン酸モノヒドラゾンのN-ヒドロキシスクシニミド・エステル(M-DNR-AES)の調製
1. モルホリノダウノルビシンのアジピン酸モノヒドラゾンの調製
下記のものを、1時間にわたって光から保護しながら、Ar下で室温において合体させ撹拌した：モルホリノダウノルビシン酢酸塩、乾燥MeOH、調製されたばかりのメタノール溶液(ヒドラジドアジピン酸ヒドロクロリド及びEt3N及びTFA原液)。 c. Preparation of N-hydroxysuccinimide ester (M-DNR-AES) of monohydrazone adipate of morpholinodaunorubicin
1. Preparation of morpholinodaunorubicin adipate monohydrazone The following were combined and stirred at room temperature under Ar for 1 hour, protected from light: morpholinodaunorubicin acetate, dry MeOH, freshly prepared methanol solution ( Hydrazidodipic acid hydrochloride and Et3N and TFA stock solution).

溶剤を減圧下で除去し、そして結果として生じる残留物をNH4OAc:AN中に溶解し、そして半調製HPLCカラム内へ注入した。混合物を洗浄し、そして定組成条件下で濃縮した。約4.5分後に所望の生成物を捕集し、そしてC-18 Sep Pakカートリッジによって濃縮した。生成物を溶離し、凍結乾燥させ、そしてAr下で-20℃で貯蔵した。生成物を赤い固形物として、収率80%及び純度95%で得た。 The solvent was removed under reduced pressure and the resulting residue was dissolved in NH 4 OAc: AN and injected into a semi-preparative HPLC column. The mixture was washed and concentrated under isocratic conditions. The desired product was collected after about 4.5 minutes and concentrated by a C-18 Sep Pak cartridge. The product was eluted, lyophilized and stored at −20 ° C. under Ar. The product was obtained as a red solid in 80% yield and 95% purity.

2. モルホリノダウノルビシンのアジピン酸モノヒドラゾンのN-ヒドロキシスクシニミド・エステルの調製
乾燥THF中のモルホリノダウノルビシンのアジピン酸モノヒドラゾンに、乾燥TFH中のヒドロキシスクシニミド及び乾燥THF中のDCCを添加した。透明な赤い溶液をAr下で24時間にわたって室温で撹拌した。反応の終了を分析HPLCによって決定し、そして溶剤を除去した。次いで氷固形物を緩衝溶液(N-メチルモルホリニウムアセテート/AN)中に溶解し、そして綿を通して濾過した。 2. Preparation of N-hydroxysuccinimide ester of morpholinodaunorubicin adipate monohydrazone To morpholinodaunorubicin adipate monohydrazone in dry THF was added hydroxysuccinimide in dry TFH and DCC in dry THF . The clear red solution was stirred at room temperature under Ar for 24 hours. The end of the reaction was determined by analytical HPLC and the solvent was removed. The ice solid was then dissolved in a buffer solution (N-methylmorpholinium acetate / AN) and filtered through cotton.

生成物をRP-HPLCによって分離し、2容積のn-メチルモルホリニウムアセテート溶液で希釈し、そしてSep-Pak(900mg)上にローディングした。生成物を溶離して凍結乾燥させることにより、収率73%及び純度97.4%の粉末を得た。   The product was separated by RP-HPLC, diluted with 2 volumes of n-methylmorpholinium acetate solution and loaded onto Sep-Pak (900 mg). The product was eluted and lyophilized to obtain a powder with a yield of 73% and a purity of 97.4%.

d. M-DNR-Y1-IgG接合体の調製
DNR-リンカー/Y1-IgGのモル比23で、MAb溶液に、乾燥DMF中のM-DNR-リンカーを添加した。混合物をアルゴン下で一晩にわたって室温で静かに震盪し、次いで遠心分離した。上澄みをSPIN-X管(Costar)を通して濾過し、そしてBio-Beads SM-2(Biorad)で、1時間にわたって室温で震盪した。混合物を10分間にわたって静止させておいた。上澄みを、PBSで平衡化させたPD-10カラム(Pharmacia)に通した。接合体をPBSで溶離し、そしてタンパク質含有画分を合体した。精製された接合体を、SPIN-X濾過によって滅菌した。接合体溶液を-70℃で凍結させて貯蔵した。生成物接合体は45〜50%の収率で得られ、そして下記の特性を有した：5%の凝集体；2%〜5%の吸収された非共有結合型M-DNR誘導体；抗体に対する薬物の平均分子比4。 d. Preparation of M-DNR-Y1-IgG conjugate
M-DNR-linker in dry DMF was added to the MAb solution at a DNR-linker / Y1-IgG molar ratio of 23. The mixture was gently shaken at room temperature overnight under argon and then centrifuged. The supernatant was filtered through a SPIN-X tube (Costar) and shaken with a Bio-Beads SM-2 (Biorad) for 1 hour at room temperature. The mixture was allowed to rest for 10 minutes. The supernatant was passed through a PD-10 column (Pharmacia) equilibrated with PBS. The conjugate was eluted with PBS and the protein containing fractions combined. The purified conjugate was sterilized by SPIN-X filtration. The conjugate solution was stored frozen at -70 ° C. The product conjugate was obtained in 45-50% yield and had the following properties: 5% aggregate; 2% to 5% absorbed non-covalent M-DNR derivative; Average molecular ratio of drugs 4.

e. (Fc領域中のS-S結合の還元を介した)M-DNR-Y1IgG接合体の調製
NaCl、MES及びEDTAから成る緩衝液中のY1-IgGを、同じ緩衝液中の塩酸システアミン溶液(Merck)に添加した。混合物をアルゴン下で1.5時間にわたって37℃でインキュベートした。反応混合物を、PBS/EDTAで平衡化させたPD-10カラム(Sephadex G-25, Pharmacia)上にローディングした。還元されたタンパク質をPBS/EDTAで溶離した。最高タンパク質濃度を有する画分を合体させ、そして4℃で貯蔵した。抗体に対する遊離スルフヒドリル基のモル比は3.5以上であった。モルホリニルダウノルビシンアセテートの(6-マレイミドカプロイル)ヒドラゾンをDMF中に希釈し、そして還元タンパク質の溶液に添加し、そして4℃で30分間にわたってインキュベートした。反応混合物を、PBSで前平衡化させたPD-10カラムに通し、次いでPBSで溶離した。タンパク質画分を合体し、次いでSPIN-X濾過(Costar)によって滅菌した。精製された接合体をアリコートし、次いで-70℃で貯蔵した。生成物接合体は、〜50%収率で得られ、そして下記の特性を有した：5%未満の凝集体；1%〜2%の遊離M-DNR誘導体；抗体に対する薬物の平均分子比4。 e. Preparation of M-DNR-Y1 IgG conjugate (via reduction of SS binding in the Fc region)
Y1-IgG in a buffer consisting of NaCl, MES and EDTA was added to a cysteamine hydrochloride solution (Merck) in the same buffer. The mixture was incubated at 37 ° C. for 1.5 hours under argon. The reaction mixture was loaded onto a PD-10 column (Sephadex G-25, Pharmacia) equilibrated with PBS / EDTA. Reduced protein was eluted with PBS / EDTA. Fractions with the highest protein concentration were combined and stored at 4 ° C. The molar ratio of free sulfhydryl groups to antibody was 3.5 or more. Morpholinyl daunorubicin acetate (6-maleimidocaproyl) hydrazone was diluted in DMF and added to the reduced protein solution and incubated at 4 ° C. for 30 minutes. The reaction mixture was passed through a PD-10 column pre-equilibrated with PBS and then eluted with PBS. The protein fractions were combined and then sterilized by SPIN-X filtration (Costar). The purified conjugate was aliquoted and then stored at -70 ° C. Product conjugates were obtained in ~ 50% yield and had the following properties: <5% aggregates; 1% -2% free M-DNR derivatives; average molecular ratio of drug to antibody 4 .

f. (S-S結合の還元を介した)IgG-Y1-M-DNR接合体の調製
IgG-Y1をEDTA中でPD-10カラム(Sephadex 25M, Pharmacia)に通し、PBS/EDTA中で溶離することにより、IgG-Y1を還元した。タンパク質含有画分をプールした。抗体に対する遊離スルフヒドリル基のモル比は6以上であった。乾燥ジメチルホルムアミド中のモルホリニルダウノルビシンアセテートの(6-マレイミドカプロイル)ヒドラゾンをDMF中に希釈し、そして還元タンパク質に添加した。溶液を、4℃で30分間にわたってインキュベートした。反応混合物を、PBS中でPD-10カラム上で精製し、そしてタンパク質画分をSPIN-X濾過(Corning Life Sciences)によって滅菌した。接合体を凍結させ、そして-70℃で貯蔵した。収率は元の抗体に対して約50%であった。最終生成物は、5%未満の凝集体；0%〜2%の遊離M-DNR；抗体に対する薬物の平均分子比7。 f. Preparation of IgG-Y1-M-DNR conjugate (via reduction of SS bond)
IgG-Y1 was reduced by passing IgG-Y1 through a PD-10 column (Sephadex 25M, Pharmacia) in EDTA and eluting in PBS / EDTA. Protein containing fractions were pooled. The molar ratio of free sulfhydryl groups to antibody was 6 or more. Morpholinyl daunorubicin acetate (6-maleimidocaproyl) hydrazone in dry dimethylformamide was diluted in DMF and added to the reduced protein. The solution was incubated at 4 ° C. for 30 minutes. The reaction mixture was purified on a PD-10 column in PBS and the protein fraction was sterilized by SPIN-X filtration (Corning Life Sciences). The conjugate was frozen and stored at -70 ° C. The yield was about 50% with respect to the original antibody. The final product is less than 5% aggregate; 0% to 2% free M-DNR; average molecular ratio of drug to antibody7.

3.2 Y1-IgG-M-DNR誘導体の細胞毒性(図12〜14):
Y1-薬物接合体の特異的細胞毒性効果を、半固形(METHOCULT（登録商標）;StemCell Technologies Inc., Vancouver BC, Canada)クローン原性アッセイにおいて評価した。細胞(臍帯血又は一次AML患者試料のCD34+幹細胞)を、37℃で1時間にわたって最大10-6Mの濃度の遊離薬物又は接合薬物と一緒にインキュベートした。細胞を洗浄し、METHOCULT（登録商標）内で播種し、そして10-12日間にわたって成長させ、その後コロニーをカウントしたウシ(b)-IgG-M-DNRを非特異的接合体対照として使用した。 3.2 Cytotoxicity of Y1-IgG-M-DNR derivatives (Figures 12-14):
The specific cytotoxic effect of Y1-drug conjugates was evaluated in a semi-solid (METHOCULT®; StemCell Technologies Inc., Vancouver BC, Canada) clonogenic assay. Cells (umbilical cord blood or primary AML patient sample CD34 + stem cells) were incubated with free or conjugated drugs at a concentration of up to 10 −6 M for 1 hour at 37 ° C. Cells were washed, seeded in METHOCULT®, and grown for 10-12 days, after which colony counted bovine (b) -IgG-M-DNR was used as a non-specific conjugate control.

結果(図13)は、臍帯血試料上の接合体Y1-IgG-M-DNRの制限された効果を示した。すなわち、1μMのY1-IgG-M-DNRの存在においてインキュベートされた非ターゲット細胞(健常CD34+幹細胞)、並びに対照細胞、及び1μMのb-IgG-M-DNR又は1μMのM-DNR(すなわち非致死量の遊離薬物)の存在においてインキュベートされた細胞が少なくとも生き残った。従って、全ての臍帯血試料中において有意な効果は見られなかった。   The results (FIG. 13) showed a limited effect of the conjugate Y1-IgG-M-DNR on cord blood samples. Non-target cells incubated in the presence of 1 μM Y1-IgG-M-DNR (healthy CD34 + stem cells) and control cells, and 1 μM b-IgG-M-DNR or 1 μM M-DNR (ie non-lethal) At least the cells incubated in the presence of the amount of free drug) survived. Therefore, no significant effect was seen in all cord blood samples.

対照的に、AML試料(M7 巨核球性白血病)において、Y1-IgG-M-DNRはコロニー成長の阻害において、同じ濃度の非特異的b-IgG-M-DNR接合体と比較して3倍多くの阻害作用を有した(図13)。すなわち1μMのY1-IgG-M-DNRは、一次AML細胞の生存可能性を、対照(単独でインキュベートされたターゲット細胞)に対して40%まで低減するのに対して、1μMのM-DNR及び1μMのb-IgG-M-DNRはそれぞれ、一次AML細胞の生存可能性を、対照に対して80%まで低減する。   In contrast, in AML samples (M7 megakaryocytic leukemia), Y1-IgG-M-DNR was three times more effective in inhibiting colony growth compared to non-specific b-IgG-M-DNR conjugates at the same concentration. It had many inhibitory effects (Figure 13). That is, 1 μM Y1-IgG-M-DNR reduces the viability of primary AML cells to 40% relative to control (target cells incubated alone), whereas 1 μM M-DNR and Each 1 μM b-IgG-M-DNR reduces the viability of primary AML cells to 80% relative to controls.

Y1-IgG-M-DNR接合体の特異性は、同様の試験でさらに実証された。この試験が示したところでは、1μMのY1-IgG-M-DNRと共にインキュベートしたあとで、一次AML-M4及びAML-M5細胞(患者から得られた)からのコロニー形成が、対照と比較してそれぞれ60%及び35%まで阻害された(図14)。対照的に、全てのAML-M4細胞及びAML-M5細胞の78%は、1μMのh-IgG-M-DNRと共にインキュベートしたあとで、コロニーを生じさせた。1μMのM-DNRと共にインキュベートされた細胞は、コロニーを生じさせ、細胞が薬物に対して感受性を有することを確認した。   The specificity of the Y1-IgG-M-DNR conjugate was further demonstrated in similar tests. This study showed that after incubation with 1 μM Y1-IgG-M-DNR, colony formation from primary AML-M4 and AML-M5 cells (obtained from patients) was compared to controls. It was inhibited by 60% and 35%, respectively (FIG. 14). In contrast, 78% of all AML-M4 and AML-M5 cells gave rise to colonies after incubation with 1 μM h-IgG-M-DNR. Cells incubated with 1 μM M-DNR gave rise to colonies and confirmed that the cells were sensitive to the drug.

(Y1と結合されないことにより評価して)Y1エピトープを発現させないB-ALL細胞は、Y1-IgG-M-DNRに対して感受性を有さず、ひいては、対照と同じ率で1μMのY1-IgG-M-DNRと共にインキュベートされた後、コロニーを生じさせた(図15)。   B-ALL cells that do not express the Y1 epitope (assessed by not binding to Y1) are not sensitive to Y1-IgG-M-DNR and thus 1 μM Y1-IgG at the same rate as the control Colonies were generated after incubation with -M-DNR (Figure 15).

実施例4： Y1認識モチーフ及び硫酸化
Y1-scFvとGPIbとの結合に対するチロシン硫酸化の潜在的な効果を評価するために、GPIbを発現させるヒト慢性骨髄性白血病細胞系KU812を、100 mM塩素酸ナトリウムの存在において硫酸塩無しの培地中で成長させることにより、硫酸化を阻害した。採用される条件下で、タンパク質合成又はその他の翻訳後修飾に影響を与えることなしに、チロシン硫酸化を最大95%だけ阻害する。図16Aに示すように、塩素酸ナトリウムを欠いた完全培地中で成長した対照細胞と比較して、塩素酸ナトリウムを用いた成長に続いて、Y1-scFvとKU812との結合は、50%だけ低減された。マウス抗GPIbモノクローナル抗体AK2-FITCを使用したFACS分析によって示されるように、同じ条件下では、硫酸塩不足細胞上でのGPIbの表面発現は変わらないままであった(図16B)。 Example 4: Y1 recognition motif and sulfation
To evaluate the potential effect of tyrosine sulfation on the binding of Y1-scFv to GPIb, human chronic myeloid leukemia cell line KU812 expressing GPIb was cultured in sulfate-free medium in the presence of 100 mM sodium chlorate. Sulfation was inhibited by growing in. Under the conditions employed, it inhibits tyrosine sulfation by up to 95% without affecting protein synthesis or other post-translational modifications. As shown in FIG. 16A, compared to control cells grown in complete medium lacking sodium chlorate, Y1-scFv and KU812 binding was only 50% following growth with sodium chlorate. Reduced. Under the same conditions, surface expression of GPIb on sulfate-deficient cells remained unchanged as shown by FACS analysis using the mouse anti-GPIb monoclonal antibody AK2-FITC (FIG. 16B).

チロシン・スルフェート修飾がY1-scFvとGPIbとの結合において役割を演じるかどうかをさらに評価するために、GPIbの残基273-285に基づく種々の合成ペプチドを、Y1-scFvと血小板との結合を阻害する能力に関して評価した。   To further evaluate whether tyrosine sulfate modification plays a role in the binding of Y1-scFv to GPIb, various synthetic peptides based on residues 273-285 of GPIb were used to bind Y1-scFv to platelets. The ability to inhibit was evaluated.

手短に言えば、ABIMED AMS-422多ペプチド・シンセサイザーを使用して、固相法によってペプチドを合成し、そして必要な場合には、FMOC-Tryナトリウム塩を使用してチロシン・スルフェートを組み込んだ。Lichrosorb RP-18カラムを使用して、合成ペプチドを精製した。Y1-scFv血小板結合アッセイの場合、合成ペプチド(2.5, 25又は200 μM)及びY1-scFv(10μg)との混合物をインキュベートして洗浄した。洗浄に続いて、血小板をR-フィコエリトリン標識付け抗scFvと一緒にインキュベートし、洗浄し、そしてFACSによって分析した。   Briefly, peptides were synthesized by the solid phase method using an ABIMED AMS-422 multipeptide synthesizer and, if necessary, tyrosine sulfate was incorporated using FMOC-Try sodium salt. The synthetic peptide was purified using a Lichrosorb RP-18 column. For the Y1-scFv platelet binding assay, a mixture of synthetic peptide (2.5, 25 or 200 μM) and Y1-scFv (10 μg) was incubated and washed. Following washing, platelets were incubated with R-phycoerythrin labeled anti-scFv, washed and analyzed by FACS.

図17に示すように、25μMのペプチドDLYSDYSYSPE(SEQ ID NO:4)(3つの硫酸化型チロシンを含む)が、Y1-scFvと血小板との結合を効果的に阻害するのに対して、対応する非硫酸化型対照DLYDYYPE(SEQ ID NO:5)は、200μMでも効果を有さなかった。さらに、25μMのペプチドDLYSDYYPE(SEQ ID NO:6)、DLYSDYSYPE(SEQ ID NO:7)、及びDLYSDYYSPE(SEQ ID NO:8)(それぞれ第1チロシン、第1及び第2チロシン、及び第1及び第3チロシンで硫酸化)は、Y1-scFv結合を効果的に阻害した。ペプチドDLYDYSYSPE(SEQ ID NO:9)及びDLYDYYSPE(SEQ ID NO:10)(それぞれ第2及び第3チロシン、及び第3チロシンで硫酸化)は200μMでも、Y1-scFv結合に対する効果を有さなかった(図17A)。これらの結果は明らかに、GPIb内のTyr-276、すなわち「第1」チロシン位置における硫酸化は、有意な競合、ひいてはY1-scFvとGPIbにとって重要であることを明らかに実証する。 As shown in FIG. 17, 25 μM peptide DLY S DY S Y S PE (SEQ ID NO: 4) (containing 3 sulfated tyrosine) effectively inhibits the binding of Y1-scFv to platelets In contrast, the corresponding non-sulfated control DLYDYYPE (SEQ ID NO: 5) had no effect even at 200 μM. In addition, 25 μM peptides DLY S DYYPE (SEQ ID NO: 6), DLY S DY S YPE (SEQ ID NO: 7), and DLY S DYY S PE (SEQ ID NO: 8) (first tyrosine, first And sulfated at the second and second tyrosines, and the first and third tyrosines) effectively inhibited Y1-scFv binding. The peptides DLYDY S Y S PE (SEQ ID NO: 9) and DLYDYY S PE (SEQ ID NO: 10) (sulfated at the second and third tyrosines and third tyrosines, respectively) are 200 μM, even for Y1-scFv binding. There was no effect (Figure 17A). These results clearly demonstrate that Tyr-276 within GPIb, ie sulfation at the “first” tyrosine position, is important for significant competition and thus for Y1-scFv and GPIb.

GPIbの残基273-285の領域内部の付加的なアミノ酸がY1-scFv結合に関与するかどうかを評価するために、ペプチドDLYSDYYPEに基づく置換突然変異ペプチドをY1-scFv血小板結合アッセイにおいて試験した(図17B)。硫酸化型Tyr-276が負荷電型Glu残基と置換されると、突然変異ペプチドDLEYDYYPE(SEQ ID NO:11)は、DLYSDYYPEとは異なり、Y1-scFvと血小板との結合に対して実質的な阻害作用を発揮しなかった。同様に、Asp-277がそれぞれGlu、Asn及びAlaによって置換された突然変異ペプチドDLYSEYYPE(SEQ ID NO:12)、DLYSNYYPE(SEQ ID NO:13)及びDLYSAYYPE(SEQ ID NO:14)も、Y1-scFvと血小板との結合を阻害することはほとんどできない。他方において、Leu-275をAla(DAYSDYYPE)(SEQ ID NO:15)及びアミノ酸278-280の種々の置換[DLYSDFYPE(SEQ ID NO:16)、DLYSDAYPE(SEQ ID NO:17)、DLYSDYYAE(SEQ ID NO:18)及びDLYSDYYPA(SEQ ID NO:19)]も突然変異ペプチドを産出し、これらのペプチドは全て、DLYSDYYPE(図17B)と実質的に同一に、Y1-scFvと血小板との結合を阻害した。 To evaluate whether additional amino acids within the region of residues 273-285 of GPIb are involved in Y1-scFv binding, substitution mutant peptides based on the peptide DLY S DYYPE were tested in the Y1-scFv platelet binding assay (FIG. 17B). When sulfated Tyr-276 is replaced with a negatively charged Glu residue, the mutant peptide DLEYDYYPE (SEQ ID NO: 11) differs from DLY S DYYPE in binding to Y1-scFv and platelets. It did not exhibit a substantial inhibitory effect. Similarly, the mutant peptides DLY S EYYPE (SEQ ID NO: 12), DLY S NYYPE (SEQ ID NO: 13) and DLY S AYYPE (SEQ ID NO: :) in which Asp-277 is replaced by Glu, Asn and Ala, respectively. 14) can hardly inhibit the binding between Y1-scFv and platelets. On the other hand, Leu-275 is replaced with Ala (DAY S DYYPE) (SEQ ID NO: 15) and various substitutions of amino acids 278-280 (DLY S DFYPE (SEQ ID NO: 16), DLY S DAYPE (SEQ ID NO: 17 ), DLY S DYYAE (SEQ ID NO: 18) and DLY S DYYPA (SEQ ID NO: 19)] also yielded mutant peptides, all of which are substantially identical to DLY S DYYPE (FIG. 17B). Furthermore, the binding between Y1-scFv and platelets was inhibited.

血小板結合阻害アッセイの正当性を立証するために、突然変異ペプチドを、Y1-scFvと精製済グリコカリシンとの結合の阻害に関しても試験した(図18A)。手短にいえば、マイクロタイター・プレート上に固定化されたグリコカリシンを、Y1-scFv(5μg/ml)及びペプチド(25μM)と一緒にインキュベートした。洗浄に続いて、ポリクローナル抗scFv(scFv混合物でウサギを免疫化することにより生成)及びホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに接合された抗ウサギIgG抗体を使用して、そしてELISAリーダーで450 nmの吸収度を読み取ることにより、結合されたY1-scFvを検出した。   To validate the platelet binding inhibition assay, the mutant peptide was also tested for inhibition of binding of Y1-scFv to purified glycocalycin (FIG. 18A). Briefly, glycocalicin immobilized on a microtiter plate was incubated with Y1-scFv (5 μg / ml) and peptide (25 μM). Following washing, read the absorbance at 450 nm using polyclonal anti-scFv (generated by immunizing rabbits with scFv mixture) and anti-rabbit IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase and with an ELISA reader As a result, bound Y1-scFv was detected.

グリコカリシン結合阻害アッセイで得られた結果(図18A)は、硫酸化型Tyr-276及びGPIbの隣接残基Asp-277の双方が、Y1-scFv結合にとって重要なことを示し、ひいては血小板結合阻害アッセイで得られた結果(図17A及びB)を確認した。ELISAによって、CovaLink Plateに共有結合されたペプチドにY1-scFvが直接的に結合することを評価することによって、付加的な確認が得られた(図18B)。この研究が示したところによれば、位置275, 278, 279又は280に置換を有するか、又は非硫酸化型Tyr-278又はTyr-279を有する突然変異型ペプチドが全て、Y1-scFvと直接的に結合することが実質的に可能であるのに対して、硫酸化型Tyr-276又はAsp-277の置換を有するGPIb誘導型突然変異型ペプチドは、Y1-scFvと直接的に結合することが実質的にできない。   The results obtained in the glycocalycin binding inhibition assay (FIG. 18A) show that both sulfated Tyr-276 and the adjacent residue Asp-277 of GPIb are important for Y1-scFv binding, and thus the platelet binding inhibition assay (FIGS. 17A and 17B) were confirmed. Additional confirmation was obtained by evaluating the direct binding of Y1-scFv to peptides covalently bound to the CovaLink Plate by ELISA (FIG. 18B). This study shows that all mutant peptides with a substitution at position 275, 278, 279 or 280 or with non-sulfated Tyr-278 or Tyr-279 are all directly linked to Y1-scFv. GPIb-induced mutant peptides with sulfated Tyr-276 or Asp-277 substitutions bind directly to Y1-scFv, whereas Is virtually impossible.

PSGL-1の残基42-58に基づいた合成ペプチドを使用して、類似の直接結合試験を行うことにより、PSGL-1チロシン硫酸化がY1-scFv結合にとって重要であることを確認した(図19参照)。具体的には、PSGL-1配列QATEYEYLDYDFLPETE(SEQ ID NO:20)における第3のチロシン位置が硫酸化される結果、硫酸化されない対応対照ペプチドに対して、約100%のY1-scFv結合活性がもたらされる(図20参照)。対照的に、第2のチロシン位置における同じ線状ペプチドの硫酸化は、対照に対して約40%の結合活性しかもたらさず、また第1のチロシン位置における硫酸化がもたらす結合活性は、対照とはほとんど区別できない。   Similar direct binding studies were performed using a synthetic peptide based on residues 42-58 of PSGL-1, confirming that PSGL-1 tyrosine sulfation is important for Y1-scFv binding (Fig. 19). Specifically, the third tyrosine position in the PSGL-1 sequence QATEYEYLDYDFLPETE (SEQ ID NO: 20) is sulfated, resulting in approximately 100% Y1-scFv binding activity relative to the unsulfated counterpart control peptide. (See FIG. 20). In contrast, sulfation of the same linear peptide at the second tyrosine position results in only about 40% binding activity relative to the control, and the binding activity resulting from sulfation at the first tyrosine position is Are almost indistinguishable.

これらをまとめると、GPIb及びPSGL-1に基づく合成ペプチドを使用して得られる結果は、モチーフDXYSD(SEQ ID NO:21)(Xは任意のアミノ酸を表し、そしてYSは硫酸化型チロシンを表す)内部に見いだされる配列YSDは、Y1とそのエピトープとの結合にとって重要であることを示す。 Taken together, the results obtained using synthetic peptides based on GPIb and PSGL-1 is the motif DXY S D (SEQ ID NO: 21) (X represents any amino acid, and Y S is sulfated type sequence Y S D found therein representing the tyrosine) indicates that it is important for the binding of Y1 and its epitope.

いくつかのタンパク質が、モチーフDXYSD内部及び/又は高酸性環境内部で見いだされた配列YSDを含有することで知られている(図21)。このような酸性環境はin vivoにおけるチロシン硫酸化にとって有意であると考えられる。Y1は、GPIb及びPSGL-1に関して示されているように、この硫酸化型配列でこのようなタンパク質に結合できると予測される。 Several proteins are known to contain the sequence Y S D found within the motif DXY S D and / or within a highly acidic environment (FIG. 21). Such an acidic environment is thought to be significant for tyrosine sulfation in vivo. Y1 is predicted to be able to bind to such proteins with this sulfated sequence, as shown for GPIb and PSGL-1.

4.2 Y1は充実性腫瘍抗原に結合するのに対して、KPL-1は結合しない：
小細胞肺癌(SCLC)細胞系溶解物をウェスタン・ブロットすることにより、Y1、及び商業的に入手可能なマウス抗PSGL-1抗体KPL1の結合を比較した(図22)。Y1ブロットにおいて単一の広帯域が観察されたのに対して、KPL1ブロットには帯域は観察されなかった。このことは、PSGL-1が、Y1を使用したSCLC患者における免疫治療のためのターゲットとして役立ち得ることを示す。 4.2 Y1 binds to solid tumor antigens, whereas KPL-1 does not:
Western blotting of small cell lung cancer (SCLC) cell line lysates compared the binding of Y1 and the commercially available mouse anti-PSGL-1 antibody KPL1 (FIG. 22). A single broad band was observed in the Y1 blot, whereas no band was observed in the KPL1 blot. This indicates that PSGL-1 can serve as a target for immunotherapy in SCLC patients using Y1.

実施例5：PSGL-1を介したY1-IgG媒介型エンドサイトーシス
PSGL-1は、AML患者の血液細胞上に高発現される。下記結果は、Y1が、PSGL-1を発現させる腫瘍細胞を特異的に認識し、そしてこれらの腫瘍細胞によって内部化されることを示す。商業的に入手可能なKPL-1(抗PSGL-1)は、腫瘍細胞に結合するが、しかし内部化はされない。このことは、PSGL-1が、Y1を使用したAML患者における免疫治療のためのターゲットとして役立ち得ることを示す。 Example 5: Y1-IgG-mediated endocytosis via PSGL-1
PSGL-1 is highly expressed on blood cells of AML patients. The results below show that Y1 specifically recognizes tumor cells that express PSGL-1 and is internalized by these tumor cells. Commercially available KPL-1 (anti-PSGL-1) binds to tumor cells but is not internalized. This indicates that PSGL-1 may serve as a target for immunotherapy in AML patients using Y1.

5.1 共焦点顕微鏡研究：
患者の白血球をFICOLL（登録商標）勾配上で分離した。蛍光抗PSGL-1抗体(Y1又は商業的抗体KPL1及びPL1)の存在において、37℃で、種々異なる時間にわたって細胞をインキュベートした。共焦点顕微鏡によって細胞を視覚化することにより、生きている細胞内で蛍光抗体の位置を見極めた。 5.1 Confocal microscopy study:
Patient leukocytes were separated on a FICOLL® gradient. Cells were incubated for various times at 37 ° C. in the presence of fluorescent anti-PSGL-1 antibodies (Y1 or commercial antibodies KPL1 and PL1). By visualizing the cells with a confocal microscope, the location of the fluorescent antibody was determined in living cells.

図23及び24は、Y1-PE(左)、KPL1-PE(中央)及びY1-IgG-FITC(右)と一緒に、2時間にわたって37℃で細胞をインキュベートした後、共焦点顕微鏡研究によって視覚化されたAML患者の細胞を示す。細胞を三次元(X, Y及びZ平面)で走査し、ここで示された写真は、Z平面に対して球体中心から撮られたものである。図示のように、インキュベーション後、Y1-IgGは細胞の内部に存在した(しかし核内ではない)のに対して、KPL1は細胞膜上に存在し、そして内部化はしなかった。   Figures 23 and 24 are shown by confocal microscopy studies after incubating the cells for 2 hours at 37 ° C with Y1-PE (left), KPL1-PE (middle) and Y1-IgG-FITC (right). Shows cells from AML patients. The cells were scanned in three dimensions (X, Y and Z planes) and the picture shown here was taken from the center of the sphere with respect to the Z plane. As shown, after incubation, Y1-IgG was present inside the cell (but not in the nucleus), whereas KPL1 was present on the cell membrane and was not internalized.

5.1 蛍光顕微鏡研究：
患者の白血球をFICOLL（登録商標）勾配上で分離した。Y1-IgGの存在において、37℃で、種々異なる時間にわたって細胞をインキュベートした。Y1-IgGの検出のために、細胞を固定し、透過性化し、次いでローダミン標識付け抗ヒト(Fc)抗体で染色した。蛍光顕微鏡により細胞を視覚化した。 5.1 Fluorescence microscopy study:
Patient leukocytes were separated on a FICOLL® gradient. Cells were incubated for various times at 37 ° C. in the presence of Y1-IgG. For detection of Y1-IgG, cells were fixed, permeabilized, and then stained with rhodamine labeled anti-human (Fc) antibody. Cells were visualized by fluorescence microscopy.

図25及び26は、Y1-IgG-FITC(左)及びKPL1-PE(右)、及び抗CD34-PE又はFITCと一緒に、2時間にわたって37℃で細胞をインキュベートした後、共焦点顕微鏡研究によって視覚化された生きたCD34+細胞(それぞれ健常骨髄及び健常臍帯血に由来する)を示す。図示のようにY1-IgGは、正常なCD34+幹細胞に結合しなかった。対照的に、右下パネル内のいくつかの細胞の二重染色によって証明されるように、KPL-1-PEは、CD34+細胞を含む正常細胞を標識付けした。   Figures 25 and 26 show that by incubating cells at 37 ° C for 2 hours with Y1-IgG-FITC (left) and KPL1-PE (right), and anti-CD34-PE or FITC, followed by confocal microscopy studies. Visualized live CD34 + cells (derived from healthy bone marrow and healthy umbilical cord blood, respectively) are shown. As shown, Y1-IgG did not bind to normal CD34 + stem cells. In contrast, KPL-1-PE labeled normal cells, including CD34 + cells, as evidenced by double staining of some cells in the lower right panel.

5.3 エンドサイトーシスのモニタリング：
0.1%のNaN3(内部化の活性プロセスを阻害する)と一緒に4℃で、抗体の存在において細胞をインキュベートした後、Y1-IgGの細胞表面結合が検出された。10分間〜2時間にわたる37℃でのインキュベーション(NaN3なし)の結果、キャッピング及びパッチング、並びに内部化染色が生じた。共焦点顕微鏡研究又は蛍光顕微鏡研究によって、種々異なるAML試料を用いて、同様の写真が得られた。 5.3 Endocytosis monitoring:
After incubating cells in the presence of antibody at 4 ° C. with 0.1% NaN 3 (which inhibits the internalization activity process), cell surface binding of Y1-IgG was detected. Incubation at 37 ° C. for 10 minutes to 2 hours (without NaN 3 ) resulted in capping and patching, and internalized staining. Similar photos were obtained with different AML samples by confocal or fluorescence microscopy studies.

図27は、37℃又は4℃で、種々異なる時間にわたって非標識付けY1-IgGと一緒にインキュベートされるAML患者試料の4種の個々の細胞を示す。図示のように、0.1% NaN3と一緒に4℃で、抗体の存在において細胞をインキュベートした後で、Y1-IgGの細胞表面結合を検出した。10分間〜2時間にわたる37℃でのY1-IgGのインキュベーション(NaN3なし)の結果、キャッピング及びパッチング、並びに内部化染色が生じた。内部化は時間とともに増大した。4℃で維持された細胞内には内部化は観察されなかった。ローダミン標識付け抗ヒト(Fc)抗体を用いて、Y1-IgGを検出した。細胞の視覚化は蛍光顕微鏡研究によって実施した。 FIG. 27 shows four individual cells of an AML patient sample incubated with unlabeled Y1-IgG at 37 ° C. or 4 ° C. for different times. As shown, Y1-IgG cell surface binding was detected after incubating cells in the presence of antibody at 4 ° C. with 0.1% NaN3. Incubation of Y1-IgG at 37 ° C. for 10 minutes to 2 hours (without NaN 3 ) resulted in capping and patching, and internalized staining. Internalization increased with time. No internalization was observed in cells maintained at 4 ° C. Y1-IgG was detected using a rhodamine-labeled anti-human (Fc) antibody. Cell visualization was performed by fluorescence microscopy studies.

5.4 酸ストリッピング：
50 mMグリシン(pH 2.5)で細胞を処理する結果、Y1-IgGの細胞表面結合を除去し、内部化されたY1-IgGの検出を可能にした。 5.4 Acid stripping:
As a result of treating the cells with 50 mM glycine (pH 2.5), the cell surface binding of Y1-IgG was removed, and internalized Y1-IgG could be detected.

図28は、37℃で1時間にわたって、非標識付けY1-IgGと一緒にインキュベートしたAML患者細胞を示す。次いで、下の列に示された細胞を、50mMグリシン、pH2.5と一緒に5分間にわたって室温でインキュベートすることにより、表面結合されたY1-IgGを取り出した。図示のように、上側のパネルは、細胞表面のキャッピング及びパッチング、並びに内部化Y1-IgGを表す。下側のパネルにおいては内部化されたY1-IgGだけが検出された。   FIG. 28 shows AML patient cells incubated with unlabeled Y1-IgG for 1 hour at 37 ° C. The surface-bound Y1-IgG was then removed by incubating the cells shown in the bottom row with 50 mM glycine, pH 2.5 for 5 minutes at room temperature. As shown, the upper panel represents cell surface capping and patching, and internalized Y1-IgG. Only the internalized Y1-IgG was detected in the lower panel.

5.5 プロナーゼ：
タンパク質分解酵素プロナーゼによって細胞表面タンパク質を除去する結果、Y1-IgGの細胞表面結合が除去され、そして内部化Y1-IgGの検出が可能になった。 5.5 Pronase:
Removal of the cell surface protein by proteolytic enzyme pronase resulted in the removal of the cell surface binding of Y1-IgG and the detection of internalized Y1-IgG.

図29は、37℃で1時間にわたって非標識付けY1-IgGと一緒にインキュベートされたAML患者の細胞を示す。次いで、下の列に示された細胞を1mg/mlのプロナーゼと一緒に60分間にわたって、室温でインキュベートすることにより、表面結合Y1-IgGを除去した。図示のように、上側のパネルは、細胞表面のキャッピング及びパッチング、並びに内部化Y1-IgGを表す。下側のパネルにおいては内部化されたY1-IgGだけが検出された。なお、腹肢がプロナーゼによって除去された。このことは、CD162のY1-IgG架橋によって形成された腹肢が、細胞表面の外面上に形成されることを暗示する。   FIG. 29 shows AML patient cells incubated with unlabeled Y1-IgG for 1 hour at 37 ° C. The surface-bound Y1-IgG was then removed by incubating the cells shown in the bottom row with 1 mg / ml pronase for 60 minutes at room temperature. As shown, the upper panel represents cell surface capping and patching, and internalized Y1-IgG. Only the internalized Y1-IgG was detected in the lower panel. The abdominal limb was removed by pronase. This implies that the abdominal limb formed by the Y1-IgG cross-linking of CD162 is formed on the outer surface of the cell surface.

5.6 被覆小胞媒介型エンドサイトーシス：
受容体媒介型エンドサイトーシスは、被覆小胞を介して発生することができる。被覆小胞媒介型エンドサイトーシスは、Y1-IgGと一緒にインキュベートする前に、37℃で15分間にわたって0.45M スクロースと一緒に細胞をインキュベートすることによってブロックすることができる。この方法は、Y1-IgGと細胞表面との結合に影響を与えることなしに、Y1-IgGのエンドサイトーシスを阻害した。 5.6 Encapsulated vesicle-mediated endocytosis:
Receptor-mediated endocytosis can occur through coated vesicles. Coated vesicle-mediated endocytosis can be blocked by incubating cells with 0.45 M sucrose for 15 minutes at 37 ° C. prior to incubation with Y1-IgG. This method inhibited Y1-IgG endocytosis without affecting the binding of Y1-IgG to the cell surface.

図30は、4℃(図30A)又は37℃(図30B)で、1時間にわたって非標識付けY1-IgGと一緒にインキュベートされたAML患者の細胞を示す。次いで、中央の列に示された細胞を50 mMグリシン pH2.5と一緒に5分間にわたって、室温でインキュベートすることにより、表面結合Y1-IgGを除去した。図示のように(図30A)、上側のパネルは、Y1-IgGの細胞表面染色を表す。表面結合されたY1-IgGは、酸洗浄によって除去された(中央パネル)。37℃(図30B)で、キャッピング及びパッチング及びY1-IgGの内部化が観察された(上側パネル)。酸洗浄は、細胞表面結合Y1-IgGを除去し、そして内部化された抗体だけを検出することができた(中央パネル)。   FIG. 30 shows AML patient cells incubated with unlabeled Y1-IgG for 1 hour at 4 ° C. (FIG. 30A) or 37 ° C. (FIG. 30B). Then the surface bound Y1-IgG was removed by incubating the cells shown in the middle row with 50 mM glycine pH 2.5 for 5 minutes at room temperature. As shown (FIG. 30A), the upper panel represents cell surface staining for Y1-IgG. Surface bound Y1-IgG was removed by acid washing (middle panel). At 37 ° C. (FIG. 30B) capping and patching and Y1-IgG internalization were observed (upper panel). Acid wash removed cell surface bound Y1-IgG and was able to detect only the internalized antibody (middle panel).

被覆小胞媒介型エンドサイトーシスのブロック(下の列)は、Y1-IgGと一緒にインキュベートする前に、37℃で15分間にわたって0.45M スクロースと一緒に細胞をインキュベートすることによって達成することができる。下側パネルに示すように、0.45Mスクロースで細胞を処理することは、4℃ではY1-IgGと細胞表面との結合に影響を与えることはなかった(図30A)が、しかし37℃で内部化を阻害した(図30B)。   Coated vesicle-mediated endocytosis block (bottom row) can be achieved by incubating cells with 0.45M sucrose for 15 minutes at 37 ° C before incubating with Y1-IgG. it can. As shown in the lower panel, treatment of cells with 0.45M sucrose did not affect the binding of Y1-IgG to the cell surface at 4 ° C (Figure 30A), but internal at 37 ° C. Inhibition was observed (Figure 30B).

実施例6：白血球-血小板相互作用のY1-IgG阻害
血管表面への白血球の癒着は、結果として種々の障害において器官傷害をもたらす。この傷害は例えば再潅流傷害、発作、腸間膜血管疾患及び末梢血管疾患；臓器移植及び循環器ショックを含む。再潅流傷害は、虚血性ゾーンにおける血管内皮に対する白血球の癒着と関連する。このような癒着は、おそらく一部は、トロンビン及びサイトカインによる血小板及び内皮の活性化に起因する。このことは、血管表面を白血球に対して接着性にする。再潅流傷害の主なイニシエーターは、フォン・ビレブラント因子(vWF)と血小板GPIb受容体との相互作用である。冠状動脈狭窄を軽減するために、血栓溶解剤、例えば組織プラスミノゲン・アクチベーター及びストレプトキナーゼで治療されている心臓病患者は、依然として再潅流傷害に起因する心筋壊死に罹るおそれがある。従って、血管表面に対する白血球の癒着を低減することができ、しかも、血栓溶解剤とともに投与することにより、心臓血管障害の結果を改善することができる薬物が必要である。 Example 6: Y1-IgG inhibition of leukocyte-platelet interaction The adhesion of leukocytes to the vascular surface results in organ injury in various disorders. This injury includes, for example, reperfusion injury, stroke, mesenteric vascular disease and peripheral vascular disease; organ transplantation and cardiovascular shock. Reperfusion injury is associated with the adhesion of leukocytes to the vascular endothelium in the ischemic zone. Such adhesions are probably due in part to platelet and endothelial activation by thrombin and cytokines. This makes the blood vessel surface adherent to leukocytes. The main initiator of reperfusion injury is the interaction of von Willebrand factor (vWF) with platelet GPIb receptors. Cardiac patients treated with thrombolytic agents such as tissue plasminogen activator and streptokinase to alleviate coronary artery stenosis may still suffer from myocardial necrosis due to reperfusion injury. Therefore, there is a need for a drug that can reduce the adhesion of leukocytes to the vascular surface and that can improve the outcome of cardiovascular disorders when administered with a thrombolytic agent.

Y1(scFv及び完全IgGの両方)は血小板(すなわちGPIb)及び白血球(すなわちPSGL-1)上の明確な硫酸化型分子に結合するので、この抗体は、種々の細胞間相互作用を阻害する治療薬として潜在力を有している。   Since Y1 (both scFv and complete IgG) binds to distinct sulfated molecules on platelets (ie GPIb) and leukocytes (ie PSGL-1), this antibody is a therapeutic that inhibits various cell-cell interactions Has potential as a medicine.

図31は、Y1-scFvが、活性化型ヒト血小板とML2細胞(PSGL-1を発現させるヒトAML由来の細胞系)との結合を効果的に阻害することを示す。抗体を血小板及びML2細胞の両方と同時にインキュベートすると、最適な阻害が得られたのに対して、抗体をまず血小板又はML2細胞と一緒にインキュベートし、続いて非結合抗体を除去し、続いて残りの細胞タイプを添加すると、部分阻害が得られた(図31)。   FIG. 31 shows that Y1-scFv effectively inhibits the binding between activated human platelets and ML2 cells (a human AML-derived cell line that expresses PSGL-1). Incubating the antibody simultaneously with both platelets and ML2 cells resulted in optimal inhibition, whereas the antibody was first incubated with platelets or ML2 cells followed by removal of unbound antibody followed by the rest. Partial inhibition was obtained when the cell types were added (FIG. 31).

図31はまた、マウス抗体KPL1(ヒトPSGL-1 N末端ドメインに対して指向されるが、しかしチロシン硫酸化依存性ではない)が、活性化型血小板とML2との結合を阻害する上でも効果的であるが、しかし阻害作用は、Y1-scFvによる作用よりも小さかった。このことは、Y1-scFvが両細胞タイプ上に存在するエピトープを認識するようには、KPL1はこのようなエピトープを認識しないという事実に起因すると考えられる。やはりヒトPSGL-1に対して指向されるPL2抗体であるマウス抗体では、阻害は観察されなかった(図示せず)。   FIG. 31 also shows that the mouse antibody KPL1, directed against the human PSGL-1 N-terminal domain but not tyrosine sulfation-dependent, is also effective in inhibiting the binding of activated platelets to ML2. However, the inhibitory effect was smaller than that due to Y1-scFv. This may be due to the fact that KPL1 does not recognize such epitopes as Y1-scFv recognizes epitopes present on both cell types. No inhibition was observed with mouse antibodies, which are also PL2 antibodies directed against human PSGL-1 (not shown).

実施例7：流動状態下の固定化P-セレクチン上での細胞転動のY1-IgG阻害
リガンドをコーティングされた基板を調製するために、組換えヒト(rh)-P-セレクチン(R&D Systems, Minneapolis, MN)を、コーティング媒質(20mM重炭酸塩を補充されたPBS、pH8.5)中に0.2-1.0 μg/mlまで希釈し、そしてただちに4℃で一晩にわたってポリスチレン・プレート上に吸着させ、続いて1時間にわたって4℃で2μg/mlヒト血清アルブミン(Calbiochem)を含有するPBSで洗浄した。 Example 7: To prepare a substrate coated with a Y1-IgG inhibitory ligand for cell rolling on immobilized P-selectin under flow conditions , recombinant human (rh) -P-selectin (R & D Systems, Minneapolis, MN) is diluted to 0.2-1.0 μg / ml in coating medium (PBS supplemented with 20 mM bicarbonate, pH 8.5) and immediately adsorbed onto polystyrene plates overnight at 4 ° C. This was followed by washing with PBS containing 2 μg / ml human serum albumin (Calbiochem) at 4 ° C. for 1 hour.

精製されたリガンドが固定化されたポリスチレン・プレートを、前記のような並列プレート層流チャンバ内で組み立てた(Lawrence & Springer, Cell 65, 859-873(1991))。ヒト好中球(デキストラン沈降及びFICOLL上の密度分離によって抗凝固処理血液から分離)、又はML-2細胞をH/H培地(Hanks平衡塩類溶液、10mM HEPES)中で洗浄し、細胞結合培地(2 mM CaCl2を補充されたH/H培地)中に2 x 106細胞/mlで再懸濁し、そして自動シリンジ・ポンプ(Harvard Apparatus, Natick, MA)で生成された所望の流量で、壁剪断応力を生成する速度で流動チャンバ中を室温で潅流させた。試験接着性基板の上流側に達したら、逆位相差顕微鏡の10 x 対物レンズ(Diaphot 300, Nikon Inc., 日本国東京)を使用して、流量を高めることにより1 dyn/cm2の剪断応力を生成し、全ての細胞相互作用を2つの異なる視野(それぞれ0.17 mm2の面積)で視覚化した。前述のように(Dwir他、J. Biol. Chem. 275, 18682-18691(2000))、白血球の瞬間速度を分析するために、画像形成システムWSCAN-Array-3(Galai, Migdal-Ha'emek, Israel)を使用した。 Polystyrene plates on which purified ligands were immobilized were assembled in a parallel plate laminar flow chamber as described above (Lawrence & Springer, Cell 65, 859-873 (1991)). Human neutrophils (separated from anticoagulated blood by dextran sedimentation and density separation on FICOLL), or ML-2 cells were washed in H / H medium (Hanks balanced salt solution, 10 mM HEPES) and cell-bound medium ( Resuspend at 2 x 10 6 cells / ml in H / H medium supplemented with 2 mM CaCl 2 and at the desired flow rate generated with an automatic syringe pump (Harvard Apparatus, Natick, Mass.) The flow chamber was perfused at room temperature at a rate that generated shear stress. When reaching the upstream side of the test adhesive substrate, use a 10x objective lens (Diaphot 300, Nikon Inc., Tokyo, Japan) with an anti-phase microscope to increase the flow rate and increase the shear stress to 1 dyn / cm 2 And all cell interactions were visualized in two different fields of view (each with an area of 0.17 mm 2 ). As previously described (Dwir et al., J. Biol. Chem. 275, 18682-18691 (2000)), the imaging system WSCAN-Array-3 (Galai, Migdal-Ha'emek) was used to analyze the instantaneous velocity of leukocytes. , Israel).

試験フィールド上の転動中の白血球の蓄積を、コンピューターによる細胞動作トラッキングによって見極めた。転動細胞の出現頻度を、最初の束縛後3秒以上継続する接着性基板上の持続性転動を開始する、細胞フラックスから出た細胞の数として定義された。細胞を異なる濃度の抗体と一緒にインキュベートし、同じ濃度の抗体を含有する結合培地を有する流動チャンバーに潅流させた。試薬の洗浄に続いて(「washed」)、又は試薬の存在において、細胞転動を分析した。   Accumulation of leukocytes during rolling on the test field was determined by computer cell tracking. The frequency of rolling cells was defined as the number of cells emanating from the cell flux that initiated sustained rolling on the adherent substrate that lasted for more than 3 seconds after the initial binding. Cells were incubated with different concentrations of antibody and perfused into a flow chamber with binding medium containing the same concentration of antibody. Following reagent wash ("washed") or in the presence of reagent, cell motility was analyzed.

画像分析に際しては、種々異なる接着性基板上の細胞転動の瞬間速度の定量分析のための画像システムを開発した。Matrox Pulsar フレーム取込み器(Matrox Graphics Inc., Dorval, Quebec, Canada)を使用して、768 x 574画素(10x対物レンズを使用して1.15μmの画素サイズを有する)から成るビデオ・フレーム画像をデジタル化し、そして画像を走査し、そして、Atlas ペンティアム（登録商標）MMX-200ワークステーション上を走行するWSCAN-Array-3画像形成ソフトウェア(Galai, Migdal-Ha'emek, Israel)によって処理した。細胞動作を0.02秒インターバルでトラックされた画像から識別した。プログラムの出力は、0.02秒隔てて、連続インターレース・フィールド内の各細胞の中心点の座標を提供した。   In the image analysis, we developed an image system for quantitative analysis of the instantaneous velocity of cell rolling on different adhesive substrates. Use a Matrox Pulsar frame grabber (Matrox Graphics Inc., Dorval, Quebec, Canada) to digitally convert a video frame image consisting of 768 x 574 pixels (with a pixel size of 1.15 μm using a 10x objective). And scanned the images and processed by WSCAN-Array-3 imaging software (Galai, Migdal-Ha'emek, Israel) running on an Atlas Pentium® MMX-200 workstation. Cell movement was identified from images tracked at 0.02 second intervals. The output of the program provided the coordinates of the center point of each cell in the continuous interlaced field, separated by 0.02 seconds.

細胞動作分析のためのコンピューター・プログラムは、David Malah教授(Electric Engineering Faculty, Technion, Haifa, Israel)の研究所との共同で開発した。ソフトウェアは、Matlab 5.2下で走行し、最大5秒間にわたる連続ビデオ画像で個々の細胞の瞬間位置を比較する。リガンドをコーティングされたフィールド上で持続的に転動する個々の細胞の束縛、又はこのフィールドをぎくしゃくした動きで進むことが、流動方向における瞬間細胞速度の変化に従って見極められた。転動の中断は、剪断応力1-1.75 dyn/cm2で29μm/秒未満までの瞬間速度低下として定義された。この速度閾値は、コンピューター・システムによってそしてビデオ・モニターからマニュアルで直接的に、代表細胞上で行われる中断分析間の最適な相関を与えた。個々の転動細胞の連続した中断間のステップ距離を平均することにより、所与の転動細胞の平均ステップ距離をもたらした。 A computer program for cell behavior analysis was developed in collaboration with the laboratory of Professor David Malah (Electric Engineering Faculty, Technion, Haifa, Israel). The software runs under Matlab 5.2 and compares the instantaneous position of individual cells with continuous video images over a maximum of 5 seconds. It was determined according to changes in the instantaneous cell velocity in the direction of flow that the binding of individual cells that continually roll over the ligand-coated field, or the jerky movement of this field. Rolling interruption was defined as an instantaneous speed reduction to less than 29 μm / sec at a shear stress of 1-1.75 dyn / cm 2 . This speed threshold gave an optimal correlation between the break analysis performed on the representative cells by the computer system and manually directly from the video monitor. Averaging the step distance between successive breaks of individual rolling cells resulted in the average step distance for a given rolling cell.

図32は、低密度(0.2μg/ml)の固定化rh-P-セレクチン上で転動するML2細胞に対するY1-scFv(10μg/ml)の効果を示す。分析は、剪断力1 dyn/cm2で、1フィールド当たりの転動細胞の数を、Y1-scFvの存在において完全に無くすることを示した。このような効果は、等しい量のscFv-N06(ネガティブ対照)を使用した場合には得られなかった。 FIG. 32 shows the effect of Y1-scFv (10 μg / ml) on ML2 cells rolling on low density (0.2 μg / ml) immobilized rh-P-selectin. Analysis showed that at a shear force of 1 dyn / cm 2 , the number of rolling cells per field was completely eliminated in the presence of Y1-scFv. Such an effect was not obtained when an equal amount of scFv-N06 (negative control) was used.

図33は、種々の剪断力で、高密度(1.0μg/ml)の固定化rh-P-セレクチン上で転動するML2細胞に対する、Y1-scFv(10μg/ml)の効果を示す。分析は、剪断力1、5及び10 dyn/cm2で、1フィールド当たりの転動細胞の数を、Y1-scFvの存在においてそれぞれ83%、98%及び100%だけ阻害されることを示した。このような効果は、ネガティブ対照N06では、又はY1-scFvと一緒にインキュベートした後で細胞を洗浄し、次いで試験した(Y1 wash)ときには得られなかった。 FIG. 33 shows the effect of Y1-scFv (10 μg / ml) on ML2 cells that roll on high density (1.0 μg / ml) immobilized rh-P-selectin at various shear forces. Analysis showed that at shear forces 1, 5 and 10 dyn / cm 2 , the number of rolling cells per field was inhibited by 83%, 98% and 100% in the presence of Y1-scFv, respectively. . Such an effect was not obtained with the negative control N06 or when the cells were washed and then tested (Y1 wash) after incubation with Y1-scFv.

図34は、種々の剪断応力で固定化rh-P-セレクチン(1μg/ml)上で転動するML2細胞に対する、Y1-IgG(1μg/ml)の効果を示す。分析は、剪断力1 dyn/cm2で、細胞転動は89%だけ阻害され、そして剪断力5及び10 dyn/cm2で、細胞転動は100%だけ阻害されることを示した。Y1-IgGと一緒にインキュベートした後で細胞を洗浄し、次いで試験した(Y1-IgG wash)ときには、細胞転動は、剪断力1、5及び10 dyn/cm2で、それぞれ46%、48%及び54%だけ阻害された。マウス抗PSGL-1抗体KPL1も、全ての剪断力で細胞転動を100%阻害することができた。 FIG. 34 shows the effect of Y1-IgG (1 μg / ml) on ML2 cells rolling on immobilized rh-P-selectin (1 μg / ml) at various shear stresses. Analysis showed that at a shear force of 1 dyn / cm 2 , cell rolling was inhibited by 89%, and at shear forces of 5 and 10 dyn / cm 2 , cell rolling was inhibited by 100%. When cells were washed after incubation with Y1-IgG and then tested (Y1-IgG wash), cell rolling was 46% and 48% with shear forces of 1, 5 and 10 dyn / cm 2 respectively. And was inhibited by 54%. Mouse anti-PSGL-1 antibody KPL1 was also able to inhibit cell rolling 100% with all shear forces.

図35は、高密度(1.0 μg/ml)の固定化rh-P-セレクチン上で転動するヒト好中球に対する、Y1-scFvの濃度増大の効果を示す。分析が示したところによれば、剪断力1 dyn/cm2で、1、5及び10 μg/mlのY1-scFvは、転動する好中球の数をそれぞれ20%、81%及び100%だけ阻害する。 FIG. 35 shows the effect of increasing Y1-scFv concentration on human neutrophils that roll on high density (1.0 μg / ml) immobilized rh-P-selectin. Analysis showed that at a shear force of 1 dyn / cm 2 , 1, 5 and 10 μg / ml Y1-scFv reduced the number of rolling neutrophils by 20%, 81% and 100%, respectively. Only inhibit.

図36は、高密度(1.0 μg/ml)の固定化rh-P-セレクチン上で転動するヒト好中球に対する、Y1-IgGの効果を示す。分析は、剪断力1 dyn/cm2で、1フィールド当たりの転動好中球の数を、Y1-IgG(1.0 μg/ml)の存在において完全に無くする(100%の阻害)ことを示した。KPL-1で同様の結果が得られた。 FIG. 36 shows the effect of Y1-IgG on human neutrophils that roll on high density (1.0 μg / ml) immobilized rh-P-selectin. Analysis, at a shear force 1 dyn / cm 2, shows a number of rolling neutrophils per field, Y1-IgG (1.0 μg / ml) ( inhibition of 100%) that completely without the presence of a possible It was. Similar results were obtained with KPL-1.

実施例8：無機化合物ライブラリーのスクリーニング
特異的受容体(タンパク質)に由来する合成硫酸化型ペプチド(ペプチドの既知のアミノ酸配列内部の所与の特異的チロシン残基上で硫酸化される)を、短いリンカー、例えばカプロン酸を介して合成ペプチドにカップリングされたビオチン標識(ビオチニル化)を有するように調製することができる。同じ合成ペプチドを使用した対照ペプチドを、硫酸化なしでしかもビオチン標識(「B」)なしで調製することができる。加えて、他の非関連タンパク質に由来する合成硫酸化型ペプチドを、ビオチン標識(「C」)を有することなしに、付加的な対照として調製することができる。 Example 8: Screening of inorganic compound libraries Synthetic sulfated peptides derived from specific receptors (proteins) that are sulfated on a given specific tyrosine residue within the known amino acid sequence of the peptide Can be prepared to have a biotin label (biotinylated) coupled to a synthetic peptide via a short linker, such as caproic acid. A control peptide using the same synthetic peptide can be prepared without sulfation and without biotin labeling (“B”). In addition, synthetic sulfated peptides from other unrelated proteins can be prepared as an additional control without having a biotin label (“C”).

上記ビオチニル化型ペプチド(「A」)は、ストレプトアビジンをコーティングされた磁気ビードにカップリングし、次いで過剰の未結合ビオチニル化型ペプチドを洗い流すことができる。ビオチン-ストレプトアビジン・ペプチド接合体(「D」)を、生理学的条件(37℃、pH 7.0-7.4、塩濃度、導電性など)下で、「A」と結合する分子に関して、大幅に過剰の非硫酸化型対照ペプチド(「B」)の存在において、小化学物質ライブラリーに対してスクリーニングすることができる。次いで、カップリングされた磁気ビードを緩衝剤で2回洗浄し、その都度遠心分離して過剰の未結合分子を除去する。磁気ビードに結合された分子(「E」)を溶離し、化学的に同定し、そして更なるスクリーニングのために大量に調製することができる。   The biotinylated peptide ("A") can be coupled to a magnetic bead coated with streptavidin and then excess unbound biotinylated peptide washed away. Biotin-Streptavidin / Peptide Conjugate (“D”) is significantly excess for molecules that bind to “A” under physiological conditions (37 ° C., pH 7.0-7.4, salt concentration, conductivity, etc.). A small chemical library can be screened in the presence of a non-sulfated control peptide ("B"). The coupled magnetic beads are then washed twice with buffer and centrifuged each time to remove excess unbound molecules. Molecules bound to magnetic beads ("E") can be eluted, chemically identified, and prepared in large quantities for further screening.

選択された化合物(「E」)によってビオチニル化硫酸化型ペプチドに結合することは、更なるスクリーニング・プロセスによって確認することができる。このプロセスは、ビオチニル化された無関係の硫酸化型ペプチドとの競合(プロセス1)、又はビオチニル化型ペプチド「A」に特異結合する抗体又はその断片(例えばscFv)との競合(プロセス2)を含む。   Binding to the biotinylated sulfated peptide by the selected compound ("E") can be confirmed by a further screening process. This process involves competition with a biotinylated unrelated sulfated peptide (Process 1) or competition with an antibody or fragment thereof (e.g. scFv) that specifically binds to biotinylated peptide `` A '' (Process 2). Including.

8.1 無関係のビオチニル化硫酸化型ペプチドとの競合による再スクリーニング(プロセス1)
化合物が「A」に特異結合することを保証するために、スクリーニングの第2ラウンドを実施することができる。ビオチン-ストレプトアビジン・ペプチド接合体(「D」)を、大幅に過剰の無関係のビオチニル化硫酸化型ペプチド「C」の存在において、選択された化合物「E」で再スクリーニングすることができる。次いで管を遠心分離し、ビオチン-ストレプトアビジン・ペプチド接合体にカップリングされた磁気ビードを、緩衝剤で2回洗浄し、そしてその都度遠心分離して過剰の未結合分子を除去する。磁気ビードに結合された化合物は、化学的な同定のために溶離することができる。そして更なる研究、例えば「A」との選択的な結合の立証、及びin vitro及びin vivoでの効果試験のために、大量の化合物を調製することができる。 8.1 Rescreening by competition with unrelated biotinylated sulfated peptides (Process 1)
A second round of screening can be performed to ensure that the compound specifically binds to “A”. The biotin-streptavidin peptide conjugate (“D”) can be rescreened with the selected compound “E” in the presence of a significant excess of an irrelevant biotinylated sulfated peptide “C”. The tube is then centrifuged and the magnetic bead coupled to the biotin-streptavidin peptide conjugate is washed twice with buffer and centrifuged each time to remove excess unbound molecules. Compounds bound to magnetic beads can be eluted for chemical identification. Large quantities of compounds can then be prepared for further studies, eg, demonstration of selective binding with “A”, and in vitro and in vivo efficacy studies.

8.2 特異的なscFv抗硫酸化型抗体との競合による再スクリーニング(プロセス2)
「A」を特異的に認識してこれと結合する大幅に過剰の特異的scFv抗体の存在において、選択された化合物「E」のそれぞれに、ビオチン-ストレプトアビジン・ペプチド接合体(「D」)が結合するのを競合させることにより、「A」との好ましい結合アフィニティを有する化合物を再スクリーニングすることができる。scFv抗体によって「A」との結合を特異的に阻害された化合物を、更なる研究、例えば「A」との選択的な結合の立証、及びin vitro及びin vivoでの効果試験のために調製することができる。 8.2 Re-screening by competition with specific scFv anti-sulfated antibodies (Process 2)
In the presence of a significant excess of specific scFv antibody that specifically recognizes and binds to “A”, each selected compound “E” is labeled with a biotin-streptavidin peptide conjugate (“D”). By competing for binding, compounds having favorable binding affinity with “A” can be rescreened. Compounds specifically inhibited from binding to “A” by scFv antibodies are prepared for further studies, eg, demonstration of selective binding to “A”, and in vitro and in vivo efficacy studies can do.

本発明を具体的な実施例、材料及びデータを参照しながら説明してきた。当業者に明らかなように、本発明の種々の構成要件を使用又は調製する代わりの手段を利用することができる。このような代わりの手段は、添付の特許請求の範囲によって定義された本発明の意図及び思想の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Figure 2007527393
Figure 2007527393
 The invention has been described with reference to specific embodiments, materials and data. As will be apparent to those skilled in the art, alternative means of using or preparing the various components of the present invention can be utilized. Such alternative means should be construed as being included within the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.
Figure 2007527393
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以下に説明する添付の図面に関連して、一例として、そして非限定的に本発明をより詳細に説明する。   The invention will now be described in more detail, by way of example and not limitation, with reference to the accompanying drawings described below.

図1は、部分精製されたAML-R1細胞溶解物のウェスタン・ブロットを、Y1-IgGアフィニティ・カラムに通す前及び後の状態で示す図である。FIG. 1 shows a Western blot of partially purified AML-R1 cell lysate before and after passing through a Y1-IgG affinity column. 図2は、精製されたタンパク質の硫酸化型チロシン・モチーフにおける3つのチロシンのうち、チロシン2及び3が硫酸化されていることを示す図である。FIG. 2 is a diagram showing that tyrosine 2 and 3 are sulfated among the three tyrosines in the sulfated tyrosine motif of the purified protein. 図3は、一次B-CLL試料中の、Y1-IgG(20 μg/ml)媒介型ADCC(パーセント細胞毒性)を示す。FIG. 3 shows Y1-IgG (20 μg / ml) mediated ADCC (percent cytotoxicity) in primary B-CLL samples. 図4は、AML細胞に対する、PBMCによるY1-IgG媒介型ADCC(パーセント細胞毒性)を示す。FIG. 4 shows Y1-IgG mediated ADCC (percent cytotoxicity) by PBMC against AML cells. 図5は、Y1-IgG濃度の関数として、ML-2細胞中で増大するADCC(パーセント細胞毒性)を示す。FIG. 5 shows ADCC (percent cytotoxicity) increasing in ML-2 cells as a function of Y1-IgG concentration. 図6は、Y1-IgGとKPL-1との競合の関数として、ML-2に対するPBMCによるADCC(パーセント細胞毒性)を示す。FIG. 6 shows ADCC (percent cytotoxicity) by PBMC against ML-2 as a function of competition between Y1-IgG and KPL-1. 図7Aは、ML2細胞に対する、正常ドナー及びB-CLL患者に由来するナチュラルキラー細胞によるY1-IgG媒介性ADCC(パーセント細胞毒性)の分析を示す図である。FIG. 7A shows an analysis of Y1-IgG mediated ADCC (percent cytotoxicity) by natural killer cells from normal donors and B-CLL patients against ML2 cells. 図7Bは、M12ターゲットに対する、ADCCにおけるCD14+ 細胞(単球)の関与を示す図である。FIG. 7B shows the involvement of CD14 + cells (monocytes) in ADCC with respect to the M12 target. 図8は、Y1によって媒介される、NK細胞上におけるCD69(初期活性化マーカー)の発現を示す図である。FIG. 8 shows the expression of CD69 (early activation marker) on NK cells mediated by Y1. 図9は、FACS分析による、B-CLL患者に由来する単核細胞(CD19+、CD5+)に対するY1-IgGのアポトーシス効果を示す。FIG. 9 shows the apoptotic effect of Y1-IgG on mononuclear cells (CD19 +, CD5 +) from B-CLL patients by FACS analysis. 図10は、Y1-IgG及びリツキシマブ(Rituximab)によって媒介される、ヒトB-CLL患者に由来する単核細胞、すなわち一次ヒトB-CLL細胞に対するADCC活性(パーセント細胞毒性)の分析を示す。FIG. 10 shows an analysis of ADCC activity (percent cytotoxicity) on mononuclear cells from human B-CLL patients, ie primary human B-CLL cells, mediated by Y1-IgG and Rituximab. 図11は、患者の血漿の存在及び不存在においてY1-IgG、リツキシマブ及びキャンパス｛Campath（登録商標）｝によって媒介された、ヒトB-CLL患者に由来する単核細胞(KBC156、KBC159、KBC160、KBC166、及びRAJI細胞)に対するCDC活性(パーセント溶解)の分析を示す。FIG. 11 shows mononuclear cells from human B-CLL patients (KBC156, KBC159, KBC160, mediated by Y1-IgG, rituximab and campus {Campath®) in the presence and absence of patient plasma. Analysis of CDC activity (percent lysis) against KBC166 and RAJI cells). 図12は、ホルホリノ-ドキソルビシンにリンクされた抗体を調製するための反応スキームを示す図である。FIG. 12 shows a reaction scheme for preparing antibodies linked to morpholino-doxorubicin. 図13は、臍帯血及びAML細胞中の抗体-薬剤複合体、つまりY1-モルホリノダウノルビシン(Y1-M-DNR)及びY1-モルホリノドキソルビシン(Y1-M-Dox)複合体の細胞毒性を示す図である。FIG. 13 shows the cytotoxicity of antibody-drug conjugates in cord blood and AML cells, namely Y1-morpholinodaunorubicin (Y1-M-DNR) and Y1-morpholinodoxorubicin (Y1-M-Dox) conjugates. is there. 図14は、2患者AML試料(M4及びM5期)及びCD34+細胞に対する、抗体-薬剤複合体Y1-M-DNRの細胞毒性を示す図である。FIG. 14 shows the cytotoxicity of antibody-drug conjugate Y1-M-DNR against 2 patient AML samples (M4 and M5 stage) and CD34 + cells. 図15は、種々のY1複合体の細胞毒性を、B-ALL細胞中の対照のパーセントとして示す図である。FIG. 15 shows the cytotoxicity of various Y1 complexes as a percent of control in B-ALL cells. 図16Aは、Y1 scFvとKU812細胞との結合を示し、そして図16Bは、硫酸塩が不足したKU812細胞上でのGPIbの表面発現を示す図である。FIG. 16A shows the binding of Y1 scFv to KU812 cells, and FIG. 16B shows the surface expression of GPIb on KU812 cells deficient in sulfate. 図17Aは、Y1-scFvと血小板との結合に対する、硫酸化型ペプチドDLYDYYPEの阻害効果を示す図である。図17Bは、Y1-scFv血小板結合アッセイにおいて、置換突然変異ペプチドの効果を示す図である。FIG. 17A shows the inhibitory effect of sulfated peptide DLYDYYPE on the binding of Y1-scFv and platelets. FIG. 17B shows the effect of substitution mutant peptides in the Y1-scFv platelet binding assay. 図18Aは、Y1-scFvと精製済グリコカリシンとの結合の阻害における突然変異ペプチドの効果を示す。図18Bは、ELISAによる、CovaLink（登録商標）プレートに共有結合されたペプチドにY1scFvが結合することを示す。FIG. 18A shows the effect of the mutant peptide in inhibiting the binding of Y1-scFv to purified glycocalycin. FIG. 18B shows that Y1scFv binds to peptides covalently linked to CovaLink® plates by ELISA. 図19は、固定化された、PSGL-1に由来する硫酸化型ペプチドとY1との結合を示す図である。FIG. 19 is a diagram showing the binding of immobilized sulfated peptide derived from PSGL-1 to Y1. 図20は、非硫酸化型PSGL-1、及び第1、第2及び第3の位置において硫酸化されたPSGL-1に結合するY1のパーセント活性を示す図である。FIG. 20 shows the percent activity of Y1 binding to non-sulfated PSGL-1 and PSGL-1 sulfated at the first, second and third positions. 図21は、高酸性であり硫酸化型チロシンを有するいくつかの潜在的なY1結合モチーフを示す図である。FIG. 21 shows several potential Y1 binding motifs that are highly acidic and have sulfated tyrosine. 図22は、Y1による小細胞肺癌(SCLC)溶解物の認識を示す図である。FIG. 22 is a diagram showing recognition of small cell lung cancer (SCLC) lysate by Y1. 図23は、一次AML細胞中へのY1のエンドサイトーシスを示す図である。FIG. 23 shows Y1 endocytosis into primary AML cells. 図24は、一次AML細胞中へのY1のエンドサイトーシスを示す図である。FIG. 24 shows endocytosis of Y1 into primary AML cells. 図25は、Y1と、健常CD34+幹細胞との結合の分析を示す図である。FIG. 25 is a diagram showing an analysis of the binding between Y1 and healthy CD34 + stem cells. 図26は、Y1と、健常CD34+幹細胞との結合の分析を示す図である。FIG. 26 is a diagram showing an analysis of the binding between Y1 and healthy CD34 + stem cells. 図27は、37℃における、一次AML細胞内へのY1の内部化を示す図である。FIG. 27 is a diagram showing internalization of Y1 into primary AML cells at 37 ° C. 図28は、酸処理によって膜結合型タンパク質をストリップした後の、一次AML細胞におけるY1染色の視覚化を示す図である。FIG. 28 shows visualization of Y1 staining in primary AML cells after stripping membrane-bound protein by acid treatment. 図29は、プロナーゼによって膜結合型タンパク質をストリップした後の、一次AML細胞におけるY1染色の視覚化を示す図である。FIG. 29 shows visualization of Y1 staining in primary AML cells after stripping membrane-bound protein with pronase. 4℃(図30A)及び37℃(図30B)における酸処理又はスクロース前インキュベーション後の、一次AML細胞におけるY1染色の視覚化を示す図である。FIG. 30 shows visualization of Y1 staining in primary AML cells after acid treatment or pre-sucrose incubation at 4 ° C. (FIG. 30A) and 37 ° C. (FIG. 30B). 4℃(図30A)及び37℃(図30B)における酸処理又はスクロース前インキュベーション後の、一次AML細胞におけるY1染色の視覚化を示す図である。FIG. 30 shows visualization of Y1 staining in primary AML cells after acid treatment or pre-sucrose incubation at 4 ° C. (FIG. 30A) and 37 ° C. (FIG. 30B). 図31は、Y1-scFvが活性化済ヒト血小板とML2細胞との結合を効果的に阻害することを示す図である。FIG. 31 shows that Y1-scFv effectively inhibits the binding between activated human platelets and ML2 cells. 図32は、低密度(0.2 μg/ml)の固定化rh-P-セレクチン上で転動するML2細胞に対する、Y1-scFv(10 μg/ml)の効果を示す。FIG. 32 shows the effect of Y1-scFv (10 μg / ml) on ML2 cells rolling on low density (0.2 μg / ml) immobilized rh-P-selectin. 図33は、高密度(1.0 μg/ml)の固定化rh-P-セレクチン上で転動するML2細胞に対する、Y1-scFv(10 μg/ml)の効果を示す。FIG. 33 shows the effect of Y1-scFv (10 μg / ml) on ML2 cells that roll on high density (1.0 μg / ml) immobilized rh-P-selectin. 図34は、種々の剪断応力で固定化rh-P-セレクチン(1.0 μg/ml)上で転動するML2細胞に対する、Y1-IgG(1 μg/ml)の効果を示す。FIG. 34 shows the effect of Y1-IgG (1 μg / ml) on ML2 cells rolling on immobilized rh-P-selectin (1.0 μg / ml) at various shear stresses. 図35は、高密度(1.0 μg/ml)の固定化rh-P-セレクチン上で転動するヒト好中球に対する、Y1-scFvの濃度増大の効果を示す。FIG. 35 shows the effect of increasing Y1-scFv concentration on human neutrophils that roll on high density (1.0 μg / ml) immobilized rh-P-selectin. 図36は、高密度(1.0 μg/ml)で固定化rh-P-セレクチン上で転動するヒト好中球に対する、Y1-IgGの効果を示す。FIG. 36 shows the effect of Y1-IgG on human neutrophils that roll on immobilized rh-P-selectin at high density (1.0 μg / ml).

Claims (85)

モチーフD-X-Y-Dを含むエピトープに結合する抗体又はその断片であって、Xは任意のアミノ酸、又はDとYとの共有結合を表し、そしてYは硫酸化されている、抗体又はその断片。   An antibody or fragment thereof that binds to an epitope comprising the motif D-X-Y-D, wherein X represents any amino acid, or a covalent bond between D and Y, and Y is sulfated. 該抗体又はその断片は、抗癌薬、抗白血病薬、抗転移薬、抗新生物薬、抗疾患薬、抗癒着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウィルス薬、及び抗炎症薬から成る群から選択された薬剤と複合されている、請求項1に記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof is anticancer drug, anti-leukemia drug, anti-metastasis drug, anti-neoplastic drug, anti-disease drug, anti-adhesion drug, anti-thrombotic drug, anti-restenosis drug, anti-autoimmune drug, anti-aggregating drug 2. The antibody or fragment thereof of claim 1 conjugated with a drug selected from the group consisting of: an antibacterial drug, an antiviral drug, and an anti-inflammatory drug. 該抗体又はその断片は、遊離アミノ基を介して該薬剤と複合されている、請求項2に記載の抗体又はその断片。   3. The antibody or fragment thereof according to claim 2, wherein the antibody or fragment thereof is conjugated to the drug via a free amino group. 該抗体又はその断片は、該薬剤の1〜16個のコピーと複合されている、請求項2に記載の抗体又はその断片。   3. The antibody or fragment thereof of claim 2, wherein the antibody or fragment thereof is conjugated with 1 to 16 copies of the agent. 該抗体又はその断片はIgGであり、該抗体又はその断片の各重鎖は該薬剤の約3つのコピーと複合されており、そして各軽鎖は該薬剤の約1つのコピーと複合されている、請求項4に記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof is IgG, each heavy chain of the antibody or fragment thereof is complexed with about 3 copies of the drug, and each light chain is complexed with about 1 copy of the drug 5. The antibody or fragment thereof according to claim 4. 該薬剤が、アシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンから成る群から選択された抗ウィルス薬である、請求項2に記載の抗体又はその断片。   3. The antibody or fragment thereof according to claim 2, wherein the drug is an antiviral drug selected from the group consisting of acyclovir, ganciclovir and zidovudine. 該薬剤が、シロスタゾル、ダルテパリン・ナトリウム、レビパリン・ナトリウム、及びアスピリンから成る群から選択された抗血栓/抗再狭窄薬である、請求項2に記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to claim 2, wherein the drug is an antithrombotic / anti-restenotic drug selected from the group consisting of cilostazol, dalteparin sodium, leviparin sodium, and aspirin. 該薬剤が、ザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、アセチルサリチル酸17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドから成る群から選択された抗炎症薬である、請求項2に記載の抗体又はその断片。   The drug is an anti-inflammatory drug selected from the group consisting of zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetylsalicylic acid 17, diclofenac, ibuprofen, dexibprofen, sulindac, naproxen, amtormetine, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide 3. The antibody or fragment thereof according to claim 2. 該薬剤が、レフルノミド、デニロイキン・ジフチトックス、スブレウム、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミドから成る群から選択された抗自己免疫薬である、請求項2に記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to claim 2, wherein the drug is an anti-autoimmune drug selected from the group consisting of leflunomide, denileukin diftitox, subureum, WinRho SDF, defibrotide and cyclophosphamide. 該薬剤が、リマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸から成る群から選択された抗癒着/抗凝集薬である、請求項2に記載の抗体又はその断片。   3. The antibody or fragment thereof according to claim 2, wherein the drug is an anti-adhesion / anti-aggregation drug selected from the group consisting of limaprost, chlorochromene and hyaluronic acid. 該薬剤が、毒素、放射性同位体、画像形成剤及び医薬剤から成る群から選択される、請求項2に記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to claim 2, wherein the agent is selected from the group consisting of toxins, radioisotopes, imaging agents and pharmaceutical agents. 該毒素が、ゲロニン、Pseudomonasエクソトキシン(PE)、PE40、PE38、リシン、及びこれらの修飾形及び誘導体から成る群から選択される、請求項11に記載の抗体又はその断片。   12. The antibody or fragment thereof of claim 11, wherein the toxin is selected from the group consisting of gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE), PE40, PE38, ricin, and modified forms and derivatives thereof. 該放射性同位体が、ガンマ放射体、ポジトロン放射体、x線放射体、ベータ放射体、及びアルファ放射体から成る群から選択される、請求項11に記載の抗体又はその断片。   12. The antibody or fragment thereof of claim 11, wherein the radioisotope is selected from the group consisting of a gamma emitter, a positron emitter, an x-ray emitter, a beta emitter, and an alpha emitter. 該放射性同位体が、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルリウム、122mテルリウム、125mテルリウム、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123ヨウ素、126ヨウ素、131ヨウ素、133ヨウ素、81mクリプトン、33キセノン、90イットリウム、213ビスマス、77臭素、18フッ素、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウム及び68ガリウムから成る群から選択される、請求項11に記載の抗体又はその断片。 The radioisotope is 111 indium, 113 indium, 99 m rhenium, 105 rhenium, 101 rhenium, 99 m technetium, 121 m tellurium, 122 m tellurium, 125 m tellurium, 165 thulium, 167 thulium, 168 thulium, 123 iodine, 126 iodine, 131 iodine 133 iodine, 81m krypton, 33 xenon, 90 yttrium, 213 bismuth, 77 bromine, 18 fluorine, 95 ruthenium, 97 ruthenium, 103 ruthenium, 105 ruthenium, 107 mercury, 203 mercury, 67 gallium and 68 gallium 12. The antibody or fragment thereof according to claim 11, wherein 該医薬剤がアントラサイクリンである、請求項11に記載の抗体又はその断片。   12. The antibody or fragment thereof according to claim 11, wherein the pharmaceutical agent is an anthracycline. 該アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、及びメトキシモルホリニルドキソルビシンから成る群から選択される、請求項15に記載の抗体又はその断片。   16. The antibody or fragment thereof of claim 15, wherein the anthracycline is selected from the group consisting of doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, detorubicin, carminomycin, epirubicin, esorubicin, morpholinodoxorubicin, morpholinodaunorubicin, and methoxymorpholinyl doxorubicin. . 該医薬剤が、cis-白金、タクソール、カリーチアミシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロン・アルファ、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びこれらの誘導体及び組み合わせから成る群から選択される、請求項11に記載の抗体又はその断片。   The pharmaceutical agent is cis-platinum, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, fludarabine, chlorambucil, interferon alfa, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and these 12. The antibody or fragment thereof of claim 11 selected from the group consisting of derivatives and combinations of: 該抗体又はその断片が、2種以上の薬剤と複合することができるビヒクル又はキャリヤと複合されている、請求項2に記載の抗体又はその断片。   3. The antibody or fragment thereof according to claim 2, wherein the antibody or fragment thereof is conjugated with a vehicle or carrier capable of being conjugated with two or more drugs. 該ビヒクル又はキャリヤは、デキストラン、親油性ポリマー、HPMA、及びリポソーム、及びこれらの誘導体及び修飾形から成る群から選択される、請求項18に記載の抗体又はその断片。   19. The antibody or fragment thereof according to claim 18, wherein the vehicle or carrier is selected from the group consisting of dextran, lipophilic polymers, HPMA, and liposomes, and derivatives and modified forms thereof. 請求項1に記載の抗体又はその断片、及び製薬上許容可能なキャリヤを含む製薬組成物。   A pharmaceutical composition comprising the antibody or fragment thereof according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項1に記載の抗体又はその断片、及び画像形成剤を含む、診断、予後又は病期診断キット。   A diagnostic, prognostic or staging kit comprising the antibody or fragment thereof according to claim 1 and an image forming agent. 該画像形成剤が放射性同位体である、請求項21に記載の診断、予後又は病期診断キット。   The diagnostic, prognostic, or staging kit according to claim 21, wherein the imaging agent is a radioisotope. 抗体依存性細胞の細胞毒性(ADCC)を誘発する方法であって、これを必要とする患者に、請求項20に記載の製薬組成物を投与することを含む、方法。   21. A method of inducing antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) comprising administering to a patient in need thereof a pharmaceutical composition according to claim 20. ナチュラルキラー(NK)細胞又はT細胞を刺激する方法であって、これを必要とする患者に、請求項20に記載の製薬組成物を投与することを含む、方法。   21. A method of stimulating natural killer (NK) cells or T cells, comprising administering the pharmaceutical composition of claim 20 to a patient in need thereof. 細胞死を誘発する方法であって、これを必要とする患者に、請求項2に記載の抗体又はその断片を投与することを含み、該薬剤に複合された該抗体又はその断片が該細胞に侵入し、そして該抗体又はその断片が該薬剤から切断され、これにより該薬剤を放出する、方法。   A method of inducing cell death, comprising administering the antibody or fragment thereof according to claim 2 to a patient in need thereof, wherein the antibody or fragment thereof conjugated to the agent is administered to the cell. Invading and the antibody or fragment thereof is cleaved from the drug, thereby releasing the drug. HIVを治療する方法であって、これを必要とする患者に、請求項20に記載の製薬組成物を投与することを含む、方法。   21. A method of treating HIV comprising administering to a patient in need thereof a pharmaceutical composition according to claim 20. 該投与がHIVの侵入を防止する、請求項26に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the administration prevents HIV entry. モチーフD-X-Y-Dを含むエピトープを発現させる細胞内に薬剤を導入する方法であって、Xは任意のアミノ酸、又はDとYとの共有結合を表し、そしてYは硫酸化されており、該方法が下記ステップ：
請求項1に記載の抗体又はその断片に該薬剤を複合し、そして
該薬剤に複合された該抗体又はその断片を、該細胞に投与する
ことを含む、方法。 A method of introducing a drug into a cell that expresses an epitope containing the motif DXYD, wherein X represents any amino acid, or a covalent bond between D and Y, and Y is sulfated. Step:
2. A method comprising: conjugating the agent or fragment thereof according to claim 1 to the agent, and administering the antibody or fragment thereof conjugated to the agent to the cell. 該方法は、これを必要とする患者における疾患を治療する、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method treats a disease in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における細胞転動を治療する、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method treats cell tumbling in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における炎症を治療する、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method treats inflammation in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における自己免疫疾患を治療する、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method treats an autoimmune disease in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における転移を治療する、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method treats metastasis in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における腫瘍細胞の成長及び/又は複製を治療する、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method treats tumor cell growth and / or replication in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における腫瘍細胞の死亡率を高める、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method increases tumor cell mortality in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における白血病細胞の成長及び/又は複製を阻害する、請求項28に記載の方法。   29. The method of claim 28, wherein the method inhibits leukemia cell growth and / or replication in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における白血病細胞の死亡率を高める、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method increases leukemia cell mortality in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における抗疾患薬による疾患細胞の損傷され易さを変化させる、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method alters the susceptibility of diseased cells to damage by anti-disease drugs in patients in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における抗癌薬による腫瘍細胞の損傷され易さを高める、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method increases the susceptibility of the tumor cells to damage by an anticancer drug in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における抗白血病薬による白血病細胞の損傷され易さを高める、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method increases the susceptibility of leukemic cells to damage by an anti-leukemic agent in a patient in need thereof. 該方法は、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数の増大を阻害する、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method inhibits an increase in the number of tumor cells in a patient having a tumor. 該方法は、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数を減少させる、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method reduces the number of tumor cells in a patient having a tumor. 該方法は、白血病患者における白血病細胞の数の増大を阻害する、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method inhibits an increase in the number of leukemic cells in a leukemia patient. 該方法は、白血病患者における白血病細胞の数を減少させる、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method reduces the number of leukemic cells in a leukemia patient. 該方法は、これを必要とする患者における血小板凝集を阻害する、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method inhibits platelet aggregation in a patient in need thereof. 該方法は、これを必要とする患者における再狭窄を阻害する、請求項28に記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the method inhibits restenosis in a patient in need thereof. 患者における腫瘍細胞をモニタリングする方法であって：
該患者から腫瘍細胞を準備し、そして
該腫瘍細胞を、請求項1に記載の抗体又はその断片と一緒にインキュベートし、
これにより該腫瘍細胞を病期診断する、方法。 A method for monitoring tumor cells in a patient comprising:
Providing tumor cells from the patient, and incubating the tumor cells with the antibody or fragment thereof of claim 1;
A method of staging the tumor cells thereby. 該方法はさらに、
基準標準に対する該抗体又はその断片の特異的結合を見極めることを含む、請求項47に記載の方法。 The method further includes:
48. The method of claim 47, comprising determining specific binding of the antibody or fragment thereof to a reference standard. 該抗体又はその断片がY1である、請求項47に記載の方法。   48. The method of claim 47, wherein the antibody or fragment thereof is Y1. 腫瘍特異的抗原を分離する方法であって：
細胞の試料を獲得し、
細胞を溶解し、
請求項1に記載の抗体又はその断片のタンパク質リガンドを同定し、そして
該抗体又はその断片を含むアフィニティ・カラムに該細胞溶解物を通すことにより、該タンパク質リガンドを精製する
ことを含む方法。 A method for separating tumor-specific antigens comprising:
Obtain a sample of cells,
Lysed cells,
A method comprising identifying a protein ligand of the antibody or fragment thereof according to claim 1 and purifying the protein ligand by passing the cell lysate through an affinity column comprising the antibody or fragment thereof. 該方法はさらに、該タンパク質リガンドを配列決定し、これにより該腫瘍特異的抗原を同定することを含む、請求項50に記載の方法。   51. The method of claim 50, wherein the method further comprises sequencing the protein ligand, thereby identifying the tumor specific antigen. 該抗体又はその断片がY1である、請求項50に記載の方法。   51. The method of claim 50, wherein the antibody or fragment thereof is Y1. 該細胞がヒトの腫瘍から得られる、請求項50に記載の方法。   51. The method of claim 50, wherein the cell is obtained from a human tumor. 該腫瘍が充実性腫瘍である、請求項53に記載の方法。   54. The method of claim 53, wherein the tumor is a solid tumor. 該腫瘍が小細胞肺癌である、請求項54に記載の方法。   55. The method of claim 54, wherein the tumor is small cell lung cancer. 該腫瘍が、血液担持型腫瘍である、請求項53に記載の方法。   54. The method of claim 53, wherein the tumor is a blood-borne tumor. 該腫瘍が白血病である、請求項56に記載の方法。   57. The method of claim 56, wherein the tumor is leukemia. 患者における疾患の診断、予後又は病期診断の方法であって、
該患者から、細胞を含む試料を準備し、そして
請求項1に記載の抗体又はその断片が該患者の該細胞に結合するかどうかを見極め
ことを含み、
これにより、該患者が該疾患のリスクを有するか、又は該疾患にかかっていることを示す、方法。 A method for diagnosis, prognosis or staging of a disease in a patient,
Preparing a sample containing cells from the patient, and determining whether the antibody or fragment thereof of claim 1 binds to the cell of the patient;
Thereby indicating that the patient is at risk for or suffers from the disease. 該方法がさらに、
該抗体又はその断片の特異的結合を見極め、そして
基準標準に対して、該抗体又はその断片と該細胞との特異的結合を比較する、
請求項58に記載の方法。 The method further includes:
Determining the specific binding of the antibody or fragment thereof and comparing the specific binding of the antibody or fragment thereof to the cell against a reference standard;
59. The method of claim 58. ウェスタン・ブロッティングを用いて、請求項1に記載の抗体又はその断片が該患者の該細胞に結合するかどうかを見極める、請求項58に記載の方法。   59. The method of claim 58, wherein Western blotting is used to determine whether the antibody or fragment thereof of claim 1 binds to the cell of the patient. 該疾患が癌である、請求項58に記載の方法。   59. The method of claim 58, wherein the disease is cancer. 該癌が充実性腫瘍である、請求項61に記載の方法。   62. The method of claim 61, wherein the cancer is a solid tumor. 該癌が小細胞肺癌である、請求項62に記載の方法。   64. The method of claim 62, wherein the cancer is small cell lung cancer. 該癌が血液担持型腫瘍である、請求項61に記載の方法。   62. The method of claim 61, wherein the cancer is a blood-borne tumor. 該癌が白血病である、請求項64に記載の方法。   65. The method of claim 64, wherein the cancer is leukemia. 該抗体又はその断片がY1である、請求項58に記載の方法。   59. The method of claim 58, wherein the antibody or fragment thereof is Y1. 患者から腫瘍細胞をパージする方法であって、
該患者から、細胞を含有する試料を準備し、そして
患者に由来する細胞を、請求項1に記載の抗体又はその断片と一緒にインキュベートする
ことを含む、方法。 A method for purging tumor cells from a patient comprising:
A method comprising preparing a sample containing cells from the patient and incubating the cells from the patient with the antibody or fragment thereof of claim 1. 該パージがex vivoで発生する、請求項67に記載の方法。   68. The method of claim 67, wherein the purge occurs ex vivo. アントラサイクリン-薬剤複合体を形成する方法であって、
アントラサイクリンを準備し；
アジピン酸を該アントラサイクリンと反応させ；
該アジピン酸-アントラサイクリンの活性エステルを生成し；そして
該アジピン酸-アントラサイクリンをポリペプチドと反応させることにより、アントラサイクリン-薬剤複合体を形成する
ことを含む、方法。 A method of forming an anthracycline-drug complex comprising:
Prepare an anthracycline;
Reacting adipic acid with the anthracycline;
Producing an active ester of the adipic acid-anthracycline; and reacting the adipic acid-anthracycline with a polypeptide to form an anthracycline-drug complex. 該アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、及びメトキシモルホリニルドキソルビシンから成る群から選択される、請求項69に記載の方法。   70. The method of claim 69, wherein the anthracycline is selected from the group consisting of doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, detorubicin, carminomycin, epirubicin, esorubicin, morpholinodoxorubicin, morpholinodaunorubicin, and methoxymorpholinyl doxorubicin. 該ポリペプチドが抗体又はその断片である、請求項69に記載の方法。   70. The method of claim 69, wherein the polypeptide is an antibody or fragment thereof. 請求項69に記載の方法に従って製造された複合体。   70. A composite produced according to the method of claim 69. 該アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、及びメトキシモルホリニルドキソルビシンである、請求項72に記載の方法。   73. The method of claim 72, wherein the anthracycline is doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, detorubicin, carminomycin, epirubicin, esorubicin, morpholinodoxorubicin, morpholinodaunorubicin, and methoxymorpholinyl doxorubicin. 該ポリペプチドが抗体又はその断片である、請求項72に記載の方法。   73. The method of claim 72, wherein the polypeptide is an antibody or fragment thereof. 配列YDを含むエピトープに結合する抗体又はその断片であって、YDはモチーフDXYD内部又は酸性環境内部に配置され、Xは任意のアミノ酸、又はDとYとの共有結合であり、そしてYは硫酸化されている、抗体又はその断片。   An antibody or fragment thereof that binds to an epitope comprising the sequence YD, wherein YD is located within the motif DXYD or within an acidic environment, X is any amino acid, or a covalent bond between D and Y, and Y is sulfate An antibody or fragment thereof. 請求項75に記載の抗体又はその断片、及び製薬上許容可能なキャリヤとを含む医薬組成物。   76. A pharmaceutical composition comprising the antibody or fragment thereof of claim 75 and a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項75に記載の抗体又はその断片、及び画像形成剤を含む、診断、予後又は病期診断キット。   76. A diagnostic, prognostic, or staging kit comprising the antibody or fragment thereof according to claim 75 and an image forming agent. 該画像形成剤が放射性同位体である、請求項77に記載の診断、予後又は病期診断キット。   78. The diagnostic, prognostic, or staging kit of claim 77, wherein the imaging agent is a radioisotope. 抗体依存性細胞の細胞毒性(ADCC)を誘発する方法であって、これを必要とする患者に、請求項76に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。   78. A method of inducing antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) comprising administering to a patient in need thereof a pharmaceutical composition of claim 76. ナチュラルキラー(NK)細胞又はT細胞を刺激する方法であって、これを必要とする患者に、請求項76に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。   77. A method of stimulating natural killer (NK) cells or T cells, comprising administering to a patient in need thereof a pharmaceutical composition according to claim 76. 細胞死を誘発する方法であって、これを必要とする患者に、請求項75に記載の抗体又はその断片を投与することを含み、該薬剤に複合された該抗体又はその断片が該細胞に侵入し、そして該抗体又はその断片が該薬剤から切断され、これにより該薬剤を放出する、方法。   76. A method of inducing cell death comprising administering to a patient in need thereof an antibody or fragment thereof according to claim 75, wherein said antibody or fragment thereof conjugated to said agent is administered to said cell. Invading and the antibody or fragment thereof is cleaved from the drug, thereby releasing the drug. HIVを治療する方法であって、これを必要とする患者に、請求項76に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。   77. A method of treating HIV, comprising administering to a patient in need thereof a pharmaceutical composition according to claim 76. 該投与がHIVの侵入を防止する、請求項82に記載の方法。   84. The method of claim 82, wherein the administration prevents HIV entry. 疾患を治療する方法であって、これを必要とする患者に、請求項1又は76に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。   77. A method of treating a disease comprising administering to a patient in need thereof a pharmaceutical composition according to claim 1 or 76. 該方法は、これを必要とする患者における細胞転動を治療する、請求項84に記載の方法。   85. The method of claim 84, wherein the method treats cell tumbling in a patient in need thereof.
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