KR20060100894A - Low molecular weight chondroitin sulfates from cartilage of chondrichthyes and process for preparing thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 연골어류의 연골로부터 얻은 저분자 콘드로이틴 황산 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 연골어류인 상어 및 홍어의 연골로부터 경제적이고 효과적인 공정을 통해 얻을 수 있는 저분자 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate, CS) 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to low-molecular chondroitin sulfate obtained from cartilage of cartilage fish and a method for producing the same. More specifically, low-molecular chondroitin sulfate (CS) obtainable through economical and effective processes from cartilage of cartilage sharks and skates And it relates to a manufacturing method thereof.
본 발명은 연골어류의 연골로부터 얻을 수 있으며, 저분자량, 보다 바람직하게는 평균분자량이 3,000∼12,000 Da인 콘드로이틴 황산의 제공을 목적으로 한다.The present invention can be obtained from cartilage of cartilage fish, and an object of the present invention is to provide chondroitin sulfate having a low molecular weight, more preferably an average molecular weight of 3,000 to 12,000 Da.
본 발명은 연골어류의 연골로부터 효소가수분해, 산가수분해, 여과 및 정제공정을 통해 저분자량의 콘드로이틴 황산 제조방법 제공을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a method for producing low molecular weight chondroitin sulfate through enzymatic hydrolysis, acid hydrolysis, filtration and purification from cartilage of cartilage fish.
본 발명은 연골어류의 연골을 재료로 하는 콘드로이틴 황산의 제조에 있어서,The present invention in the production of chondroitin sulfate using cartilage of cartilage fish as a material,
연골어류의 연골을 분쇄하는 단계, Grinding the cartilage of the cartilage fish,
분쇄된 연골에 물과 효소를 첨가하여 연골을 효소가수분해하는 단계,Enzymatic hydrolysis of cartilage by adding water and enzyme to the ground cartilage,
연골 효소가수분해물에 약산을 첨가하여 산가수분해하는 단계,Acid hydrolysis by adding weak acid to cartilage enzyme hydrolyzate,
산가수분해물을 여과하고, 정제하는 단계를 포함한다.Filtering and purifying the acid hydrolyzate.
Description
도 1은 본 발명의 연골어류의 연골 유래 저분자 콘드로이틴 황산의 제조공정도이다.1 is a manufacturing process chart of cartilage-derived low molecular chondroitin sulfate of cartilage fish of the present invention.
도 2a는 상어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산의 아가로스 겔 전기영동.Figure 2a is agarose gel electrophoresis of chondroitin sulfate prepared from shark cartilage.
도 2b는 홍어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산의 아가로스 겔 전기영동.Figure 2b is agarose gel electrophoresis of chondroitin sulfate prepared from skate cartilage.
도 3a는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 평균분자량을 나타낸 그래프이고, 도 3b는 홍어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 평균분자량을 나타낸 그래프이다.Figure 3a is a graph showing the average molecular weight of chondroitin sulfate prepared from shark cartilage according to the malic acid concentration and treatment time, Figure 3b is a graph showing the average molecular weight of chondroitin sulfate prepared from skate horse cartilage according to the concentration and treatment time.
도 3c는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 황산화도를 나타낸 그래프이고, 도 3d는 홍어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 황산화도를 나타낸 그래프이다.Figure 3c is a graph showing the sulfated degree of chondroitin sulfate prepared from shark cartilage according to the malic acid concentration and treatment time, Figure 3d is a graph showing the sulfated degree of chondroitin sulfate prepared from the skater cartilage according to the malic acid concentration and treatment time.
도 3e는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 수율 변화를 나타낸 그래프이고, 도 3f는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 수율 변화를 나타낸 그래프이다.Figure 3e is a graph showing the change in yield of chondroitin sulfate prepared from shark cartilage according to the malic acid concentration and treatment time, Figure 3f is a graph showing the change in yield of chondroitin sulfate prepared from shark cartilage according to the malic acid concentration and treatment time.
도 4a는 상어 연골로부터 제조한 고분자 콘드로이틴 황산, 저분자 콘드로이틴 황산 및 표품 콘드로이틴 황산의 구조를 분석한 H1 핵자기공명법(NMR) 그래프이다.FIG. 4A is a H1 nuclear magnetic resonance (NMR) graph analyzing the structures of high molecular weight chondroitin sulfate, low molecular weight chondroitin sulfate, and standard chondroitin sulfate from shark cartilage.
도 4b는 홍어 연골로부터 제조한 고분자 콘드로이틴 황산, 저분자 콘드로이틴 황산 및 표품 콘드로이틴 황산의 구조를 분석한 H1 핵자기공명법(NMR) 그래프이다.FIG. 4B is a H1 nuclear magnetic resonance (NMR) graph of the structures of high molecular weight chondroitin sulfate, low molecular weight chondroitin sulfate and standard chondroitin sulfate prepared from skate cartilage.
본 발명은 연골어류의 연골로부터 얻은 저분자 콘드로이틴 황산 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 연골어류인 상어 및 홍어의 연골로부터 경제적이고 효과적인 공정을 통해 얻을 수 있는 저분자 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate, CS) 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to low-molecular chondroitin sulfate obtained from cartilage of cartilage fish and a method for producing the same. More specifically, low-molecular chondroitin sulfate (CS) obtainable through economical and effective processes from cartilage of cartilage sharks and skates And it relates to a manufacturing method thereof.
콘드로이틴 황산은 연골, 혈관 및 뼈를 비롯한 동물의 조직에 널리 분포하고 있는 점질성 다당류로서 황산기의 위치에 따라 크게 콘드로이틴 황산 A(chondroitin sulfate A), 콘드로이틴 황산 B(chondroitin sulfate B) 및 콘드로이틴 황산 C(chondroitin sulfate C)의 세 가지로 구분된다. Chondroitin sulfate is a viscous polysaccharide widely distributed in animal tissues including cartilage, blood vessels, and bones. Chondroitin sulfate A, chondroitin sulfate B, and chondroitin sulfate C chondroitin sulfate C).
콘드로이틴 황산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-갈락토사민 β(1→3) 결합에 의해 이루어진 이당류를 단위로 하여 반복되어지는 다당류이다. Chondroitin sulfate is a polysaccharide that is repeated on the basis of disaccharides formed by D-glucuronic acid and N-acetyl-D-galactosamine β (1 → 3) bond.
이러한 이당류 단위는 황산기가 존재하는 위치에 따라 △Di-6S, △Di-4S 및 △Di-2,6diS 등으로 나눌 수 있으며 황산기가 없는 △Di-0S도 있다. Such disaccharide units can be divided into ΔDi-6S, ΔDi-4S and ΔDi-2,6diS according to the position of the sulfate group, and there are also ΔDi-0S without sulfate group.
일반적으로 육상동물 유래 콘드로이틴 황산의 경우는 대부분 △Di-0S, △Di-6S 및 △Di-4S로 이루어져 있으며, 어류의 연골에서 유래한 콘드로이틴 황산은 △Di-2,6diS도 존재한다. In general, in the case of land animal-derived chondroitin sulfate, mostly composed of ΔDi-0S, ΔDi-6S and ΔDi-4S, and chondroitin sulfate derived from fish cartilage also has ΔDi-2,6diS.
콘드로이틴 황산을 구성하고 있는 황산화 이당류들은 생체활성과 같은 특성에 크게 관여하고 있다. Sulfated disaccharides that make up chondroitin sulfate are highly involved in properties such as bioactivity.
콘드로이틴 황산은 분자량이 5,000∼20,000 Da 정도의 저분자 영역에 가까울수록 흡수율 및 생리활성이 뛰어나다. 특히, 관절염 관련 약품 및 건강기능식품은 구강으로 섭취하기 때문에 저분자일수록 인체에 흡수가 많이 되어 생체이용률 측면에서 바람직하다(Kelly G.S., Alternative Medicine Review, 1998, 3: 37-44).Chondroitin sulfate has a higher absorption rate and physiological activity as the molecular weight is closer to the low molecular region of 5,000 to 20,000 Da. In particular, arthritis-related drugs and health functional foods are consumed by the oral cavity, so the lower molecules are more absorbed by the human body, which is desirable in terms of bioavailability (Kelly G.S., Alternative Medicine Review, 1998, 3: 37-44).
콘드로이틴 황산은 현재 관절염의 예방 및 치료를 목적으로 약품 및 건강기능식품의 소재와 화장품의 원료로 널리 이용되고 있다.Chondroitin sulfate is widely used as a raw material for medicines and health functional foods and cosmetics for the purpose of preventing and treating arthritis.
전 세계적으로 노령 인구가 증가함에 따라 실버산업의 성장 또한 증가하고 있으며, 이러한 추세의 일예로서 노령자에게 필요한 약품, 건강식품의 시장 역시 확대되고, 이처럼 노령자에게 필요한 약품, 건강식품의 재료의 하나인 콘드로이틴 황산 시장 규모는 매우 커질 것이다. As the world's elderly population grows, the growth of the silver industry is also increasing. For example, the market for drugs and health foods for the elderly is expanding, and so is the chondroitin, which is one of the ingredients for the elderly and health foods. The sulfuric acid market will grow very large.
관절염 관련의 약품 및 건강기능식품에 사용되는 콘드로이틴 황산은 대부분 육상동물 유래의 소재를 사용하고 있으나, 특히 소의 골분을 이용한 제품은 광우병의 우려를 내포하고 있다. Chondroitin sulfate, which is used in arthritis-related medicines and health functional foods, is mostly made of terrestrial animal-derived materials, but in particular, products using bovine bone meal have concerns about mad cow disease.
현재, 소의 골분을 대체하는 소재로 상어연골이 각광을 받고 있으나 아무런 처리가 되지 않은 연골분말의 형태, 즉 고분자 콘드로이틴 황산을 함유하고 있는 상태로 소비되고 있어 흡수율이 높지 못하다. Currently, shark cartilage has been spotlighted as a substitute material for bovine bone meal, but it is consumed in the form of untreated cartilage powder, that is, containing polymer chondroitin sulfate, and the absorption rate is not high.
콘드로이틴 황산의 주요 원료로는 소 기관지(bovine trachea) 및 상어 연골(shark cartilage)이 주로 이용되고 있다. Bovine trachea and shark cartilage are mainly used as the main raw materials of chondroitin sulfate.
일반적으로 소 기관지 유래 콘드로이틴 황산은 분자량이 20,000 Da 이하로 저분자이지만, 상어연골 유래 콘드로이틴 황산은 50,000 Da에서 100,000 Da 정도로 고분자이다(Adebowale A.O. et al., J. Am. Nutraceutical Assoc., 2000, 3: 27-39). 특히, 상어 연골 관련 제품은 단순추출물 또는 원료 상태 그대로 분말화만 되어 출시되고 있어 소화흡수율이 매우 낮다. In general, bovine bronchial-derived chondroitin sulfate has a low molecular weight of 20,000 Da or less, while shark cartilage-derived chondroitin sulfate is polymerized from 50,000 Da to 100,000 Da (Adebowale AO et al., J. Am. Nutraceutical Assoc., 2000, 3: 27-39). In particular, shark cartilage-related products are released as a simple extract or powdered as it is raw material is very low digestive absorption rate.
일반적인 콘드로이틴 황산의 저분자화 방법은 강산 및 강알칼리 가수분해, 중금속 촉매의 과산화수소를 이용한 가수분해 등이 있다(Vopli et al., Analytical Bi℃hemistry, 1992, 200:100-107; Cho et al., Biol. Pharm. Bull., 2004, 27:47-51; Vopli et al., Carbohydrate Research, 1999, 315:345-349). 하지만, 이러한 방법들은 공정이 복잡하고, 비용이 많이 소요되기 때문에 실제 경제적으로 생산하는 공정보다는 학문적인 공정에 가까운 문제가 있다.Typical methods for low molecular weight of chondroitin sulfate include strong acid and strong alkali hydrolysis and hydrolysis using heavy metal catalyst hydrogen peroxide (Vopli et al., Analytical Bi ° Chemistry, 1992, 200: 100-107; Cho et al., Biol) Pharm Bull, 2004, 27: 47-51; Vopli et al., Carbohydrate Research, 1999, 315: 345-349). However, these methods are complicated and expensive, and thus have a problem that is more of an academic process than an actual economic process.
본 발명에서는 흡수율 및 생체 이용률 측면에서 연골어류인 상어 연골을 원료로 하거나 또는 홍어 연골을 원료로 하는 저분자 콘드로이틴 황산 및 저분자 콘드로이틴 황산을 제조하였다.In the present invention, low-molecular chondroitin sulfate and low-molecular chondroitin sulfate were prepared using shark cartilage, which is cartilaginous fish, or skate cartilage, in terms of absorption and bioavailability.
한편 본 발명과 관련된 종래 기술로서 한국공개특허공보 제2002-0078053호에 (1)동물 연골 조직을 엔도프로타제로 가수분해하고, (2)상기 (1)에서 얻은 가수분해물을 엔도프로타제와 엑소펩티다제로 가수분해하고, (3)상기 (2)에서 얻은 가수분해물에 염을 가하고 알콜로 분별침전시키고, (4)상기 (3)단계에서 얻은 침전물을 탈염하는 단계로 이루어진 콘드로이틴 황산의 정제방법이 있다.On the other hand, in the prior art related to the present invention, Korean Unexamined Patent Publication No. 2002-0078053 discloses (1) hydrolysis of animal cartilage tissue with endoprotase, and (2) hydrolyzate obtained in (1) above. Hydrolysis with peptidase, (3) adding salt to the hydrolyzate obtained in (2), fractionating and precipitating with alcohol, and (4) desalting the precipitate obtained in step (3). There is this.
또한 한국공개특허 제2004-0098738호에 (1)균질화한 닭식도에 닭식도의 10배에 해당하는 양의 증류수를 첨가하고 120℃의 온도로 1시간 동안 가열한 후, 4℃로 방냉하여 탈지하는 단계, (2)탈지 후 수산화나트륨을 가하여 pH를 9.0으로 조정하고, 엔도펩티다아제를 닭식도 건물 중량 대비 2％ 첨가하여 55℃에서 24시간 동안 쉐이킹 인큐규베이션(incubation)하는 단계, (3)300rpm으로 30분간 원심분리한 후 상등액을 수집하는 단계를 포함하는 닭식도로부터 콘드로이틴 황산을 추출하는 방법이 있다.In addition, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2004-0098738 (1) To the homogenized chicken esophagus, 10 times the amount of distilled water corresponding to chicken esophagus is added and heated at a temperature of 120 ° C. for 1 hour, and then cooled to 4 ° C. to degrease (2) after degreasing, sodium hydroxide is added to adjust the pH to 9.0, and 2% of the endopeptidase is added to the chicken esophageal dry weight to incubate shaking at 55 ° C. for 24 hours, (3) After centrifugation at 300 rpm for 30 minutes, there is a method of extracting chondroitin sulfate from chicken esophagus, which includes collecting the supernatant.
그러나 상기 선행기술들은 본 발명의 연골어류의 연골을 분쇄하는 단계, 분쇄된 연골에 물과 효소를 첨가하여 연골을 효소가수분해하는 단계, 연골 효소가수분해물에 약산을 첨가하여 산가수분해하는 단계, 산가수분해물을 여과하고, 정제하는 단계를 포함하는 저분자 콘드로이틴 황산의 제조방법과는 기술적 구성을 달리한다.However, the prior art is a step of grinding the cartilage of the cartilage fish of the present invention, the step of enzymatic hydrolysis of cartilage by adding water and enzyme to the crushed cartilage, the step of acid hydrolysis by adding a weak acid to the cartilage enzyme hydrolyzate, The technical configuration is different from the method for producing low molecular weight chondroitin sulfate, which comprises filtering and purifying the acid hydrolyzate.
본 발명은 연골어류의 연골로부터 얻을 수 있으며, 저분자, 보다 바람직하게는 평균분자량이 3,000∼12,000 Da인 콘드로이틴 황산의 제공을 목적으로 한다.The present invention can be obtained from cartilage of cartilage fish, and aims to provide a low molecular weight, more preferably chondroitin sulfate having an average molecular weight of 3,000 to 12,000 Da.
본 발명은 연골어류의 연골로부터 효소가수분해, 산가수분해, 여과 및 정제공정을 통해 저분자 콘드로이틴 황산 제조방법 제공을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a method for producing low molecular weight chondroitin sulfate through enzymatic hydrolysis, acid hydrolysis, filtration and purification from cartilage of cartilage fish.
본 발명에 의해 제조한 저분자 콘드로이틴 황산은 의약품, 화장품 또는 건강기능성 식품 소재로 활용 할 수 있다.The low molecular weight chondroitin sulfate produced by the present invention can be utilized as a pharmaceutical, cosmetic or health functional food material.
상기에서 언급한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 연골어류의 연골을 재료로 하는 콘드로이틴 황산의 제조에 있어서,The present invention for achieving the above-mentioned object in the production of chondroitin sulfate using cartilage of cartilage fish as a material,
연골어류의 연골을 분쇄하는 단계, Grinding the cartilage of the cartilage fish,
분쇄된 연골에 물과 효소를 첨가하여 연골을 효소가수분해하는 단계,Enzymatic hydrolysis of cartilage by adding water and enzyme to the ground cartilage,
연골 효소가수분해물에 약산을 첨가하여 산가수분해하는 단계,Acid hydrolysis by adding weak acid to cartilage enzyme hydrolyzate,
산가수분해물을 여과하고, 정제하는 단계를 포함한다.Filtering and purifying the acid hydrolyzate.
이하 본 발명의 연골어류의 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조방법을 각각의 단계에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. Hereinafter, the method for producing chondroitin sulfate from cartilage of cartilage fish of the present invention will be described in more detail by each step.
(1) 연골어류의 연골 분쇄(1) Cartilage grinding of cartilage fish
본 발명에서 연골어류는 종래 콘드로이틴 황산 제조시 사용하는 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 연골어류의 일예로서 상어 또는 홍어의 연골을 콘드로이틴 황산 제조시 원료로 사용할 수 있다.Cartilage fish in the present invention can be used as long as it is used in the conventional production of chondroitin sulfate. As one example of such cartilage fish in the present invention, cartilage of shark or skate can be used as a raw material in the production of chondroitin sulfate.
본 발명에서 연골어류의 연골은 추후 공정인 효소가수분해 및 산가수분해시 각각의 가수분해가 잘 이루어 질 정도로 분쇄하는 것이 좋다. 본 발명에서 이러한 연골 분쇄의 일예로서 연골을 5∼20mm로 파쇄할 수 있다. In the present invention, the cartilage of cartilage fish may be crushed to the extent that each hydrolysis is well performed during the enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis, which are the subsequent processes. As an example of such cartilage grinding in the present invention, cartilage can be broken into 5 to 20 mm.
(2) 분쇄된 연골에 물과 효소를 첨가하여 연골을 효소가수분해하는 단계,(2) hydrolyzing the cartilage by adding water and enzyme to the ground cartilage,
콘드로이틴 황산은 연골의 주요 구성성분으로 핵단백질(core protein)과 결합된 상태로 존재하고 있다. 따라서 프로테아제와 같은 단백질 분해효소를 이용하여 건조된 연골 조직을 와해시키면서 가수분해시켜 고분자 콘드로이틴 황산을 얻는 단계가 필요하다. Chondroitin sulfate is a major component of cartilage and is present in association with the core protein. Therefore, it is necessary to obtain polymer chondroitin sulfate by hydrolyzing while decomposing dried cartilage tissue using a protease such as protease.
따라서 연골 조직을 와해시키면서 가수분해시켜 고분자 콘드로이틴 황산을 얻기 위해 상기 (1)단계를 이용하여 파쇄한 연골에 연골 중량 대비 5∼15배의 물을 가하고 효소를 연골 중량 대비 1.0∼2.0％ 첨가하고 1∼5시간 동안 10∼100rpm으로 교반하여 연골의 효소가수분해를 실시한다. 교반시 온도는 효소의 최적활성을 나타내는 온도에서 실시할 수 있다. 이러한 온도조건은 효소에 따라 최적활성을 나타내는 온도가 서로 상이하므로 사용하는 효소에 따라 온도조건을 적의 선택할 수 있다. Therefore, to disintegrate cartilage tissue and hydrolyze to obtain polymer chondroitin sulfate, 5-15 times water by weight of cartilage is added to the cartilage crushed using step (1), and enzyme is added 1.0-2.0% by weight of cartilage. Enzymatic hydrolysis of cartilage is carried out by stirring at 10-100 rpm for ˜5 hours. The temperature at the time of stirring may be carried out at a temperature exhibiting the optimum activity of the enzyme. These temperature conditions may be appropriately selected according to the enzyme used because the temperature showing the optimum activity is different from each other.
연골을 분해하는 효소는 연골어류의 연골을 핵단백질을 분해랄 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 연골을 분해하는 효소의 일예로서 프로테아제(protease)의 일종인 맥사자임 NNP(Maxazyme NNP), 알칼라제(Alcalase), 플라보자임(Flavourzyme), 나투자임(Natoozyme) 중에서 선택된 어느 하나의 효소를 사용하거나 또는 둘 이상의 효소를 사용할 수 있다. 이때 두 개의 효소를 사용하는 경우 각각 1:9∼9:1의 비로 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게 는 가격이 저렴한 맥사자임 NNP를 사용하는 것이 좋다. The enzyme that breaks down cartilage can be used as long as it can break down the protein of cartilage of cartilage fish. As an example of an enzyme that breaks down cartilage in the present invention, any one selected from Maxazyme NNP, Alcalase, Flavozyme, Natoozyme, which is a kind of protease One enzyme may be used or two or more enzymes may be used. In this case, two enzymes may be used by mixing in a ratio of 1: 9 to 9: 1. It is preferable to use the inexpensive Maxazyme NNP.
본 발명에서 상기의 효소를 이용하여 다양한 조건에 의해 연골어류의 연골을 효소가수분해를 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 연골어류의 연골 효소가수분해는 전술한 수치범위로 연골을 효소가수분해하는 것이 좋다. Enzymatic hydrolysis of cartilage of cartilage fish under various conditions using the above enzyme in the present invention, the cartilage enzyme hydrolysis of cartilage fish to achieve the object of the present invention is enzymatic hydrolysis of cartilage in the above-described numerical range It is good to disassemble.
(3) 연골 효소가수분해물에 약산을 첨가하여 산가수분해하는 단계,(3) acid hydrolysis by adding a weak acid to the cartilage enzyme hydrolyzate,
상기 (2)단계로부터 얻은 고분자 콘드로이틴 황산은 저분자화 처리 공정과 정제공정을 거쳐야 한다.The high molecular chondroitin sulfate obtained in step (2) must go through a low molecular weight treatment step and a purification step.
일반적으로 저분자화 처리공정으로 강산 및 강알칼리를 분해시키거나 또는 중금속을 촉매로 하는 과산화수소를 이용해 고분자의 콘드로이틴 황산을 분해시켜 저분자 콘드로이틴 황산을 얻을 수 있다. 그러나 이러한 방법들은 콘드로이틴 황산의 생체 활성에 주요 인자인 황산기(sulfate group, SO3)의 제거, 수율 및 경제성의 저하를 가져오는 문제가 있다. 그래서 본 발명에서는 약산 보다 바람직하게는 식품첨가물로 사용되고 있는 안정한 유기산과 비교적 열에 안정한 콘드로이틴 황산의 특성을 고려해 유기산과 고온고압의 조건에서 효소가수분해물의 가수분해를 실시할 수 있다. In general, a low molecular weight treatment process may decompose strong acids and strong alkalis, or may decompose high molecular weight chondroitin sulfate using hydrogen peroxide as a catalyst of heavy metals to obtain low molecular weight chondroitin sulfate. However, these methods have a problem in that the removal of sulfate group (SO 3 ), which is a major factor in the bioactivity of chondroitin sulfate, and the yield and economic efficiency are deteriorated. Therefore, in the present invention, the hydrolysis of the enzymatic hydrolyzate can be performed under conditions of high temperature and high pressure in consideration of the properties of the stable organic acid and the relatively thermally stable chondroitin sulfate which are preferably used as food additives.
따라서 고분자의 콘드로이틴 황산의 저분자화 처리공정으로 본 발명에서는 상기 (2)단계로부터 얻은 효소가수분해물에 약산을 연골 중량 대비 1％∼2.5％ 첨가하고 120∼130℃, 1.0∼1.5 kg/cm2에서 30분∼100분 동안 산가수분해를 실시한다.Therefore, in the present invention, low molecular weight treatment of chondroitin sulfate of the polymer is carried out by adding 1% to 2.5% of the weak acid to the enzyme hydrolyzate obtained in the above step (2) at 120 to 130 ° C and 1.0 to 1.5 kg / cm 2 . Acid hydrolysis is carried out for 30 to 100 minutes.
본 발명에서 약산은 농도가 0.1∼2.4M인 유기산 또는 무기산을 사용할 수 있 다. 보다 바람직하게는 식품첨가물로 사용할 수 있는 유기산을 사용하는 것이 좋다.In the present invention, the weak acid may be an organic or inorganic acid having a concentration of 0.1 to 2.4 M. More preferably, it is preferable to use an organic acid which can be used as a food additive.
상기에서 약산은 말산(malic acid), 구연산(citric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 아세트산(acetic acid) 중에서 선택된 어느 하나의 유기산을 사용하거나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다. 이때 두 개의 유기산을 사용하는 경우 각각 1:9∼9:1의 비로 혼합된 유기산을 사용할 수 있다.The weak acid may be any one organic acid selected from malic acid, citric acid, citric acid, ascorbic acid, acetic acid, or two or more thereof. In this case, when two organic acids are used, organic acids mixed in a ratio of 1: 9 to 9: 1 may be used.
상기에서 약산은 염산과 같은 무기산을 사용할 수 있다. The weak acid may be an inorganic acid such as hydrochloric acid.
본 발명에서 상기의 약산을 이용하여 다양한 조건에 의해 연골어류의 연골 효소가수분해물의 산가수분해를 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서 연골어류의 연골효소가수분해물의 산가수분해는 전술한 수치의 조건으로 산가수분해하는 것이 좋다. Acid hydrolysis of cartilage enzyme hydrolyzate of cartilage fish under various conditions using the weak acid in the present invention, in order to achieve the object of the present invention, the acid hydrolysis of cartilage enzyme hydrolyzate of cartilage fish is described above. Acid hydrolysis is recommended under numerical conditions.
(4) 산가수분해물을 여과하고, 정제하는 단계(4) filtering and purifying the acid hydrolyzate
상기 (3)단계의 산가수분해가 끝나면 가수분해물을 여과하고 정제하여 목적하는 저분자 콘드로이틴 황산을 얻을 수 있다.After the acid hydrolysis in step (3), the hydrolyzate is filtered and purified to obtain the desired low molecular weight chondroitin sulfate.
이때 가수분해물의 여과는 통상적으로 사용하는 여과종이, 여과포와 같은 여과재 또는 여과장치를 이용하여 여과를 실시할 수 있으면 족하므로 이하 자세한 내용은 생략하기로 한다.At this time, the filtration of the hydrolyzate is sufficient if the filtration species commonly used can be filtered using a filter medium or a filtration device such as a filter cloth will be omitted below.
또한 여과된 가수분해물은 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 정제를 실시할 수 있다. 본 발명에서 이러한 이온교환 크로마토그래피의 일예로서 DEAE- Sephacel 칼럼을 사용하며, 50mM 인산완충액을 사용하여 샘플을 로딩(loading)한 후 염화나트륨(NaCl) 용액을 0에서 1M 까지 직선적으로 증가시키면서 저분자 콘드로이틴 황산을 용출시켜 얻을 수 있다.In addition, the filtered hydrolyzate can be purified using ion exchange chromatography. In the present invention, a DEAE-Sephacel column is used as an example of such an ion exchange chromatography. After loading a sample using a 50 mM phosphate buffer, sodium chloride (NaCl) solution is linearly increased from 0 to 1 M and low molecular weight chondroitin sulfate is used. It can be obtained by eluting.
상기에서 여과, 정제된 저분자 콘드로이틴 황산은 탈염, 건조 및 재차 분쇄하여 제품화할 수 있다.The low molecular chondroitin sulfate filtered and purified in the above can be commercialized by desalting, drying and regrinding.
한편 본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 평균분자량이 3,000∼12,000 Da 이고, 비황산화 이당류(△Di-0S) 3.6∼12.8％, C6 위치 황산화 이당류(△Di-6S) 41.1∼54.8％, C4 위치 황산화 이당류(△Di-4S) 28.4∼38.3％ 및 C2, C6 위치 이황산화 이당류(△Di-2,6diS) 4.7∼16.4％를 구성하고 있으며 이러한 이당류들이 임의로 배열된 구조의 상어 연골 유래의 콘드로이틴 황산을 얻을 수 있다.Meanwhile, the present invention has an average molecular weight of 3,000 to 12,000 Da by the above-mentioned method, 3.6 to 12.8% of non-sulfurated disaccharide (ΔDi-0S), 41.1 to 54.8% of C6 position sulfated disaccharide (ΔDi-6S), It consists of 28.4-38.3% of C4 position sulfated disaccharide (ΔDi-4S) and 4.7-16.4% of C2, C6 position disulfide disaccharide (ΔDi-2,6diS), and these disaccharides are derived from shark cartilage of randomly arranged structure. Chondroitin sulfate can be obtained.
그리고, 본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 평균분자량이 3,000∼1,2000 Da 이고, 비황산화 이당류(△Di-0S) 5.8∼11.8％, C6 위치 황산화 이당류(△Di-6S) 67.4∼72.8％, C4 위치 황산화 이당류(△Di-4S) 13.8∼19.6％ 및 C2, C6 위치 이황산화 이당류(△Di-2,6diS) 2.7∼6.1％를 구성하고 있으며 이러한 이당류들이 임의로 배열된 구조의 홍어 연골 유래 콘드로이틴 황산을 얻을 수 있다.In addition, the present invention has an average molecular weight of 3,000 to 1,2000 Da by the above-mentioned method, 5.8 to 11.8% of non-sulfurated disaccharide (ΔDi-0S), and 67.4 to C6 position sulfated disaccharide (ΔDi-6S). 72.8%, C4-positioned sulfated disaccharide (ΔDi-4S) 13.8-19.6%, and C2, C6-positioned disulfide disaccharide (ΔDi-2,6diS) 2.7-6.1%. Skate cartilage derived chondroitin sulfate can be obtained.
또한 본 발명은 상기에서 언급한 평균분자량이 3,000∼1,2000 Da 이고, 상어 연골 유래의 콘드로이틴 황산 또는 평균분자량이 3,000∼1,2000 Da 이고, 홍어 연골 유래의 콘드로이틴 황산을 약품, 건강보조식품, 화장품 중에서 선택된 어느 하 나에 사용할 수 있다.In addition, the present invention is the above-mentioned average molecular weight of 3,000 to 1,2000 Da, chondroitin sulfate derived from shark cartilage or average molecular weight of 3,000 to 1,2000 Da, chondroitin sulfate derived from skate cartilage, pharmaceuticals, health supplements, It can be used for any one selected from cosmetics.
상기에서 콘드로이틴 황산을 함유하는 약품은 약학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하여 관절염 관련 약품에 사용할 수 있다.Drugs containing chondroitin sulfate may be used in arthritis-related drugs, including pharmaceutically acceptable excipients or additives.
상기에서 콘드로이틴 황산을 함유하는 건강보조식품은 식품학적으로 허용하는 고상의 부형제를 포함하여 분말, 환(丸), 정제(tablet), 산제, 캡슐(capsule)과 같은 고상 형태로 제형화 될 수 있다. 또한 콘드로이틴 황산을 함유하는 건강보조식품은 식품학적으로 허용하는 액상의 부형제를 포함하여 음료, 드링크제, 페이스트(paste)와 같은 액상 형태로 제형화 될 수 있다. The dietary supplement containing chondroitin sulfate may be formulated in solid form such as powder, pill, tablet, powder, capsule, etc. . In addition, dietary supplements containing chondroitin sulfate may be formulated in liquid forms, such as beverages, drinks, and pastes, including food-acceptable liquid excipients.
상기에서 콘드로이틴 황산을 함유하는 화장품은 통상적으로 사용하는 화장품 재료에 첨가되어 액상, 고상 또는 페이스트 제형의 화장품으로 제공될 수 있다. Cosmetics containing chondroitin sulfate in the above can be added to the commonly used cosmetic materials can be provided as a cosmetic in liquid, solid or paste formulations.
이하, 본 발명은 하기의 실시예 및 시험예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명에 의한 하나의 일실시예일 뿐 이들에 의해 본 발명의 권리범위하 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples and test examples. However, these are only one embodiment of the present invention and are not limited thereto by the scope of the present invention.
<실시예 1> 상어 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조Example 1 Preparation of Chondroitin Sulfate from Shark Cartilage
도 1과 같은 제조공정을 이용하여 상어 연골로부터 콘드로이틴 황산을 제조하였다.Chondroitin sulfate was prepared from shark cartilage using the manufacturing process as shown in FIG. 1.
5mm로 파쇄하고 건조한 상어 연골에 연골 중량 대비 10배의 물을 가하고, 상어 연골 중량 대비 1.65％의 맥사자임 NNP를 첨가하였다. 그런 다음 맥사자임 NNP 의 최적 활성 온도인 50℃에서 3시간 동안 50rpm으로 교반하면서 효소가수분해를 실시하였다. 이후 여과를 통해 가수분해되지 않은 연골성분을 제거하였다.10 times of water relative to cartilage weight was added to the shark cartilage, which was crushed to 5 mm and dried, and 1.65% of Maxazyme NNP was added to the weight of shark cartilage. Thereafter, enzyme hydrolysis was performed while stirring at 50 rpm for 3 hours at 50 ° C., which is the optimum activity temperature of Maxosaim NNP. The cartilage component that was not hydrolyzed was then removed by filtration.
상기에서 얻은 효소가수분해물에 유기산으로 말산을 상어 연골 중량 대비 1.18％ 첨가하고 121℃, 1.5 kg/cm2에서 48분 동안 산가수분해를 실시하였다.To the enzyme hydrolyzate obtained above, 1.18% of malic acid was added as an organic acid to the weight of shark cartilage, and acid hydrolysis was performed at 121 ° C. for 1.5 minutes at 1.5 kg / cm 2 .
산가수분해가 끝난 후 여과재를 이용하여 여과한 후 이온교환 크로마토그래피를 정제하여 저분자 콘드로이틴 황산을 정제하였다. 이때 이온교환 크로마토그래피는 DEAE-Sephacel 칼럼을 사용하며, 50mM 인산완충액을 사용하여 샘플을 로딩(loading)한 후 염화나트륨(NaCl) 용액을 0에서 1M 까지 직선적으로 증가시키면서 저분자 콘드로이틴 황산을 용출시켜 정제하였다.After the acid hydrolysis was completed, the resultant was filtered using a filter medium, followed by purification of ion exchange chromatography to purify low molecular weight chondroitin sulfate. At this time, ion-exchange chromatography uses a DEAE-Sephacel column and is purified by eluting low molecular weight chondroitin sulfate while linearly increasing the sodium chloride (NaCl) solution from 0 to 1M after loading the sample using 50 mM phosphate buffer. .
정제한 저분자 콘드로이틴 황산은 탈염을 거친 후 -7℃에서 동결건조 시킨 다음 100메쉬로 분쇄하여 저분자 콘드로이틴 황산을 제조하였다.Purified low molecular weight chondroitin sulfate was desalted and lyophilized at -7 ° C. and then pulverized to 100 mesh to prepare low molecular weight chondroitin sulfate.
<실시예 2> 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조Example 2 Preparation of Chondroitin Sulfate from Skate Cartilage
5mm로 파쇄하고 건조한 홍어 연골을 사용하고, 산가수분해시 말산을 홍어 연골 중량 대비 1.64％ 첨가하고 121℃, 1.5 kg/cm2에서 46분 동안 산가수분해를 실시하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 저분자 콘드로이틴 황산을 제조하였다.The above example was used, except that the dried skates cartilage and dried at 5 mm were added with 1.64% of malic acid to the weight of skates cartilage and acid hydrolysis was performed at 121 ° C. and 1.5 kg / cm 2 for 46 minutes. In the same manner as in 1, a low molecular weight chondroitin sulfate was prepared.
<시험예 1> 가수분해제의 종류에 따른 콘드로이틴 황산의 물리화학적 특성Test Example 1 Physical and Chemical Properties of Chondroitin Sulfate According to the Type of Hydrolysing Agent
본 발명에서는 경제적이고 효율적인 저분자화 공정을 개발하기 위하여 알칼리, 유기산 및 무기산을 가수분해제로 검토하였다. In the present invention, in order to develop an economical and efficient low molecular weight process, alkali, organic acid and inorganic acid were examined as hydrolysing agents.
상기 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법으로 상어 연골 및/또는 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조시 하기 표 1에 언급된 알칼리, 유기산 및 무기산의 산가수분해제를 이용하여 제조한 콘드로이틴 황산의 분자량, 황산화도 및 수율을 비롯한 주요 물리화학적 특성을 측정하고 그 결과를 아래의 표 1에 나타내었다. Molecular weight, sulfuric acid of chondroitin sulfate prepared by using the acid hydrolytic agents of alkali, organic and inorganic acids mentioned in Table 1 when preparing chondroitin sulfate from shark cartilage and / or skate cartilage by the method described in Examples 1 and 2 above Major physicochemical properties including the degree of purity and yield were measured and the results are shown in Table 1 below.
상기에서 콘드로이틴 황산의 분자량은 HPSEC(High-Performance Size-Exclusion Chromatography) 장치를 이용하여 측정되었으며, 분자량 3,000에서 1,000,000 사이의 콘드로이틴 황산 표준품들이 검량선 작성을 위해 사용되었다.The molecular weight of chondroitin sulfate was measured using a High-Performance Size-Exclusion Chromatography (HPSEC) apparatus, and chondroitin sulfate standards with molecular weights of 3,000 to 1,000,000 were used for the calibration curve.
상기에서 콘드로이틴 황산의 황산화도는 총이당류 함량에서 황산화된 이당류가 차지하는 비율을 백분율로 나타낸 것이며, 수율은 사용된 연골 무게 대비 최종 제품의 무게의 비율로 계산되었다. The sulfated degree of chondroitin sulfate is expressed as a percentage of the sulfated disaccharide in the total disaccharide content, and the yield was calculated as the ratio of the weight of the final product to the used cartilage weight.
산가수분해제를 사용한 저분자 콘드로이틴 황산의 평균분자량의 경향을 보면, 알칼리보다는 산을 이용한 콘드로이틴 황산의 경우가 저분자화 효과가 큰 것으로 나타났다. 특히, 구연산을 가수분해제로 이용한 경우 무기산인 염산 보다 저분자화 효과가 더 크게 나타났으며 다른 유기산인 말산 및 아스코르브산의 경우도 비슷한 수준을 보여주고 있다. 또한, 콘드로이틴 황산은 일반적으로 가수분해되어 저분자화 될 때 황산기가 떨어져 나가는 탈황산화(desulfation)가 동반된다. 본 발명에서도 분자량이 작아질수록 황산화도가 낮아지는 것으로 나타났다. 반면에, 유기산 처리구 중에는 말산 처리구가 황산화도가 높으면서 저분자화 효과가 큰 것으로 나타났다. 저분자처리를 하지 않은 미처리구의 경우 높은 수율을 보이고 있으나 저분자화가 많이 될수록 수율이 2∼4％ 정도 감소하였다. 말산 및 아스코르브산 처리구의 경우 알칼리 처리구에 비해 큰 수율 차이를 보이지 않으면서 저분자화 효과가 큰 것으로 나타났다.The trend of the average molecular weight of the low molecular weight chondroitin sulfate using an acid hydrolyzate showed that the chondroitin sulfate using an acid rather than an alkali had a large low molecular weight effect. In particular, when citric acid is used as a hydrolytic agent, the effect of lowering the molecular weight was greater than that of hydrochloric acid, which is an inorganic acid, and similar levels of other organic acids, malic acid and ascorbic acid. In addition, chondroitin sulfate is generally accompanied by desulfurization, in which sulfuric acid groups fall off when hydrolyzed and low molecular weighted. Also in the present invention, the lower the molecular weight, the lower the degree of sulfation. On the other hand, in the organic acid treatment group, the malic acid treatment group was shown to have a high low molecular weight effect while having a high degree of sulfate. In the low molecular weight treatments, the untreated plots showed high yields, but as the molecular weight increased, the yield decreased by 2-4%. In the case of malic acid and ascorbic acid treatment, the low molecular weight effect was shown to be higher than the alkali treatment.
<표 1> 가수분해제의 종류에 따른 콘드로이틴 황산의 특성Table 1 Characteristics of Chondroitin Sulfate According to the Type of Hydrolysing Agent
<시험예 2> 아가로스 겔 전기영동(Agarose gel electrophoresis)Test Example 2 Agarose gel electrophoresis
시험예 1에서 HPSEC 장치를 이용한 콘드로이틴 황산의 분자량 측정방법은 고가의 장치 구입비 및 칼럼 구매 경비가 들어가기 때문에 간단하고 경제적으로 대략적인 분자량을 검증할 수 있는 아가로스 겔 전기영동을 이용하였다.In Test Example 1, the method for measuring molecular weight of chondroitin sulfate using the HPSEC apparatus used agarose gel electrophoresis, which can verify the approximate molecular weight simply and economically, because the expensive apparatus purchase cost and the column purchase cost are included.
상기 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법으로 상어 연골 및/또는 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조시 상기 표 1에 언급된 알칼리, 유기산 및 무기산의 산가수분해제를 이용하여 제조한 콘드로이틴 황산의 아가로스 겔 전기영동을 시행하고 그 결과를 도 2a,2b에 나타내었다.Agarose gels of chondroitin sulfate prepared by using the acid hydrolysing agents of alkali, organic and inorganic acids mentioned in Table 1 when preparing chondroitin sulfate from shark cartilage and / or skate cartilage by the method described in Examples 1 and 2 above. Electrophoresis was performed and the results are shown in FIGS. 2a and 2b.
도 2a는 상어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산의 아가로스 겔 전기영동이고, 도 2b는 홍어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산의 아가로스 겔 전기영동이 다.Figure 2a is agarose gel electrophoresis of chondroitin sulfate prepared from shark cartilage, Figure 2b is agarose gel electrophoresis of chondroitin sulfate prepared from skate cartilage.
도 2a,2b에서 1은 분자량이 15,000 Da인 표품 콘드로이틴 황산, 2는 분자량이 40,000 Da인 표품 콘드로이틴 황산, 3은 미처리구, 4는 수산화나트륨 처리구, 5는 탄산나트륨 처리구, 6은 인산나트륨 처리구, 7은 구연산 처리구, 8은 말산 처리구, 10은 아스코르브산 처리구, 10은 염산 처리구를 나타낸다. In Figures 2a,
도 2a,2b를 보면 미처리구인 고분자의 상어 및 홍어 콘드로이틴 황산의 경우 1.5％ 아가로스 겔(agarose gel)을 제대로 통과하지 못해 위쪽에 진한 밴드를 나타내고 있으며, 알칼리(수산화나트륨, 탄산나트륨, 인산나트륨) 처리구들은 분자량 40,000 Da 표품과 거의 비슷한 이동도를 나타내고 있다. 유기산(말산, 구연산, 아스코르브산) 및 무기산(염산) 처리구들은 분자량 15,000 Da 표품 보다 밴드가 낮은 위치에서 나타나 HPSEC 결과와 비슷한 경향을 보였다.2A and 2B, the shark and the skate of chondroitin sulfate, which are untreated, do not pass the 1.5% agarose gel properly and show a dark band on the upper side. Have similar mobility to molecular weight 40,000 Da. Organic acid (malic acid, citric acid, ascorbic acid) and inorganic acid (hydrochloric acid) treatments showed lower tendency than the 15,000 Da molecular weight and showed similar tendency with HPSEC results.
<시험예 3> 이당류 조성 분석Test Example 3 Disaccharide Composition Analysis
상기 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법으로 상어 연골 및/또는 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조시 하기 표 2, 표 3에 언급된 알칼리, 유기산 및 무기산의 산가수분해제를 이용하여 제조한 콘드로이틴 황산에 대하여 강음이온교환 칼럼(strong-anonion exchange column)을 이용하여 이당류 조성을 분석하였으며 시그마(Sigma Co.)사의 이당류 표품을 통해 동정하고 그 결과를 아래의 표 2, 표 3에 나타내었다. Chondroitin sulfate prepared by using the acid hydrolytic agents of alkali, organic and inorganic acids mentioned in Tables 2 and 3 when preparing chondroitin sulfate from shark cartilage and / or skate cartilage by the method described in Examples 1 and 2. The disaccharide composition was analyzed using a strong-anonion exchange column and identified through the disaccharide standard of Sigma Co., and the results are shown in Tables 2 and 3 below.
상어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산은 이미 알려진 조성과 유사하였으 며, 홍어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산은 그동안 연구가 되지 않았던 것으로 상어에 비해 △Di-0S 및 △Di-6S의 함량은 높았으며, △Di-4S 및 △Di-2,6diS는 낮게 나타났다. Chondroitin sulfate produced from shark cartilage was similar to the known composition, and chondroitin sulfate produced from skate cartilage was not studied until now, and the content of ΔDi-0S and ΔDi-6S was higher than that of shark, -4S and ΔDi-2,6diS were low.
그러나, 상어 연골 및 홍어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산 모두 저분자화가 일어나면서 이당류 조성의 변화는 유사하게 나타났다. △Di-6S의 경우는 모두 변화가 거의 없어 안정적으로 나타났지만, △Di-4S 및 △Di-2,6diS는 저분자화 되면서 탈황산화(desulfation) 되어 그 함량이 낮게 나타났다. 반면에 △Di-0S는 절대적인 양의 변화는 크게 없었으나 황산화 이당류의 탈황산화가 일어나면 상대적인 함량이 증가한 것으로 나타났다. However, as the molecular weight of both chondroitin sulfates prepared from shark cartilage and skate cartilage occurred, changes in disaccharide composition were similar. In the case of ΔDi-6S, almost no change was found to be stable, but ΔDi-4S and ΔDi-2,6diS were desulfurized while being low molecular weight, and their contents were low. On the other hand, ΔDi-0S showed no significant change in absolute amount, but the relative content increased when desulfurization of sulfated disaccharides occurred.
<표 2> 상어 연골 콘드로이틴 황산의 이당류 조성 분석<Table 2> Disaccharide Composition Analysis of Shark Cartilage Chondroitin Sulfate
<표 3> 홍어 연골 콘드로이틴 황산의 이당류 조성 분석<Table 3> Disaccharide Composition Analysis of Skate Cartilage Chondroitin Sulfate
<시험예 4> 저분자 콘드로이틴 황산 제조를 위한 조건의 설정Test Example 4 Setting of Conditions for the Preparation of Low-Molecular Chondroitin Sulfate
본 발명에서는 유기산이 다른 알칼리 및 산에 비해 안전하고 저분자화 효과도 뛰어나 유기산인 말산을 이용한 최적 저분자화 조건을 구명하였다. 특히, 말산은 원료 1kg당 단가가 280원으로 가장 저렴하여, 본 발명의 가수분해제로 선택되었다. 저분자 콘드로이틴 황산 제조 조건의 설정은 반응표면분석법을 이용하였으며, 평균분자량, 황산화도 및 수율을 종속변수로 말산의 농도 및 처리시간을 독립변수로 설정하였다.In the present invention, the organic acid is safer than other alkalis and acids, and has an excellent low molecular weighting effect. Therefore, the optimum low molecular weight condition using the organic acid malic acid was investigated. In particular, malic acid was selected as the hydrolysing agent of the present invention because the unit price per 1 kg of raw material is the cheapest at 280 won. The reaction conditions for the preparation of low molecular weight chondroitin sulfate were determined using reaction surface analysis, and the concentration and treatment time of malic acid were used as independent variables, with average molecular weight, degree of sulfation, and yield.
SAS 통계프로그램의 반응표면회귀 처리(response surface regression procedure)를 사용하였으며 말산의 농도 (X1)를 1％에서 2.4％까지, 처리시간 (X2)을 32분에서 88분까지 변화시켜 이에 따른 저분자 콘드로이틴 황산의 특성을 분석하였다. The response surface regression procedure of the SAS statistical program was used to change the concentration of malic acid (X1) from 1% to 2.4% and the treatment time (X2) from 32 to 88 minutes. Was analyzed.
종속변수인 평균분자량(Y1), 황산화도(Y2) 및 수율(Y3) 모두 모델식의 결정계수 (R2) 값이 0.95 이상으로 높게 나타났으며, 또한 유의수준(P-value)이 0.001∼0.003으로 95％ 수준에서 유의성을 보였다. 따라서 본 실험계획의 모델이 통계적 으로 적합한 것으로 판단된다. The average molecular weight (Y1), the degree of sulfation (Y2), and the yield (Y3), which are dependent variables, showed a high coefficient of determination (R2) of 0.95 or higher, and a significance level (P-value) of 0.001 to 0.003. Significant at the 95% level. Therefore, it is judged that the model of this design is statistically appropriate.
말산의 농도 (X1)와 처리시간 (X2)에 대한 영향을 분석해보면, 모든 종속변수에서 말산의 농도보다는 처리시간에 대한 영향을 크게 받는 것으로 나타났다. 같은 처리시간에서 농도의 변화에 따른 종속변수의 차이는 크게 나타나지 않으나 같은 농도에서 처리시간이 길어지면서 급격하게 종속변수의 차이가 보였다(도 3 참조).Analysis of the effects on the concentration of malic acid (X1) and treatment time (X2) showed that all dependent variables were more affected by the treatment time than the concentration of malic acid. The difference in the dependent variable according to the change of concentration at the same treatment time does not appear much, but the difference in the dependent variable is rapidly seen as the treatment time increases at the same concentration (see FIG. 3).
도 3a는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 평균분자량을 나타낸 그래프이고, 도 3b는 홍어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 평균분자량을 나타낸 그래프이다.Figure 3a is a graph showing the average molecular weight of chondroitin sulfate prepared from shark cartilage according to the malic acid concentration and treatment time, Figure 3b is a graph showing the average molecular weight of chondroitin sulfate prepared from skate horse cartilage according to the concentration and treatment time.
도 3c는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 황산화도를 나타낸 그래프이고, 도 3d는 홍어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 황산화도를 나타낸 그래프이다.Figure 3c is a graph showing the sulfated degree of chondroitin sulfate prepared from shark cartilage according to the malic acid concentration and treatment time, Figure 3d is a graph showing the sulfated degree of chondroitin sulfate prepared from the skater cartilage according to the malic acid concentration and treatment time.
도 3e는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 수율 변화를 나타낸 그래프이고, 도 3f는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 수율 변화를 나타낸 그래프이다.Figure 3e is a graph showing the change in yield of chondroitin sulfate prepared from shark cartilage according to the malic acid concentration and treatment time, Figure 3f is a graph showing the change in yield of chondroitin sulfate prepared from shark cartilage according to the malic acid concentration and treatment time.
본 발명의 제조 조건에서 제조된 상어 및 홍어 연골 유래 저분자 콘드로이틴 황산의 특성은 하기의 표 4와 같다. The characteristics of the shark and skate cartilage-derived low molecular chondroitin sulfate prepared under the preparation conditions of the present invention are shown in Table 4 below.
<표 4> 최적조건에서 제조된 상어 및 홍어 연골 유래 저분자 콘드로이틴 황산의 특성<Table 4> Characteristics of Low-Molecular Chondroitin Sulfate from Shark and Skate Cartilage Prepared Under Optimum Conditions
<시험예 5> 저분자 콘드로이틴 황산의 구조 분석Test Example 5 Structural Analysis of Low Molecular Chondroitin Sulfate
상기 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법으로 상어 연골 및/또는 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산의 구조를 핵자기공명법(NMR)으로 측정하고 분석하여 저분자화에 따른 구조 변화를 살펴보았다.The structure of chondroitin sulfate from shark cartilage and / or skate cartilage by the method described in Examples 1 and 2 was measured and analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR) to examine the structural change caused by low molecular weight.
상어 연골 및/또는 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산의 구조를 핵자기공명법으로 나타낸 그래프를 도 4에 나타내었다. A graph showing the structure of chondroitin sulfate from shark cartilage and / or skate cartilage by nuclear magnetic resonance method is shown in FIG. 4.
도 4a는 상어 연골로부터 제조한 고분자 콘드로이틴 황산, 저분자 콘드로이틴 황산 및 표품 콘드로이틴 황산의 구조를 분석한 H1 핵자기공명법(NMR) 그래프이다.FIG. 4A is a H1 nuclear magnetic resonance (NMR) graph analyzing the structures of high molecular weight chondroitin sulfate, low molecular weight chondroitin sulfate, and standard chondroitin sulfate from shark cartilage.
도 4b는 홍어 연골로부터 제조한 고분자 콘드로이틴 황산, 저분자 콘드로이틴 황산 및 표품 콘드로이틴 황산의 구조를 분석한 H1 핵자기공명법(NMR) 그래프이다.FIG. 4B is a H1 nuclear magnetic resonance (NMR) graph of the structures of high molecular weight chondroitin sulfate, low molecular weight chondroitin sulfate and standard chondroitin sulfate prepared from skate cartilage.
도 4에서 (A)로 나타낸 표품(시그마사의 콘드로이틴 황산 C)과, (B)로 나타 낸 고분자 콘드로이틴 황산의 경우 표품과 유사하였으며, 특히 홍어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산은 거의 표품에 가까웠다. 이러한 상어 및 홍어 연골 유래 콘드로이틴 황산의 결과의 차이는 서로 다른 이당류 조성을 가지고 있기 때문인 것으로 보인다. In Figure 4 (S) chondroitin sulfate C from Sigma, and the polymeric chondroitin sulfate shown in (B) was similar to the standard, especially chondroitin sulfate prepared from skate cartilage was almost close to the standard. The difference in the results of these shark and skate cartilage-derived chondroitin sulfate appears to be due to the different disaccharide composition.
도 4에서 (C)로 나타낸 저분자 콘드로이틴 황산은 폴리머 구조의 파괴 및 탈황산화에 의해 고분자보다 많은 피크들을 보이고 있으나 구조상으로 큰 변화를 나타내지는 않았다. 3.5ppm 영역에서 새로운 피크의 생성은 폴리머 구조 파괴에 의한 D-글루콘산의 잔기가 노출되어 나타나는 것이며, 4.2ppm 영역의 피크의 생성은 탈황산화된 N-아세틸-D-갈락토사민으로 인한 것으로 판단된다.The low molecular chondroitin sulfuric acid represented by (C) in FIG. 4 shows more peaks than the polymer due to the breakdown and desulfurization of the polymer structure, but does not show a significant change in structure. The generation of new peaks in the 3.5 ppm region is due to the exposure of residues of D-gluconic acid due to the breakdown of the polymer structure, and the generation of the peaks in the 4.2 ppm region is due to desulfurized N-acetyl-D-galactosamine. do.
상기의 시험예의 결과에서처럼 흡수율 및 생체 이용률 측면에서 매우 효과적인 저분자 곤드로이틴 황산을 연골어류 특히, 상어 연골 및/또는 홍어 연골을 재료로 하여 효소가수분해, 산가수분해를 이용하여 제조할 수 있다.As a result of the above test example, low molecular weight gondrotin sulfate, which is very effective in terms of water absorption and bioavailability, may be prepared by using enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis using cartilage fish, in particular shark cartilage and / or skate cartilage.
본 발명에 의해 그 동안 미이용 자원이었던 홍어연골을 사용함으로 고부가가치 효과를 볼 수 있다. By using the present invention can be seen a high value-added effect by using the skate cartilage that has been unused resources.
또한 본 발명에 의해 얻을 수 있는 저분자 콘드로이틴 황산은 건강에 대한 관심의 증가와 노령화 사회로의 구조 이동과 같은 현 상황에서 관절염 관련 약품, 건강보조식품과 화장품 제품의 시장에 수출을 통한 국익 및 국민 건강에 이바지할 것으로 기대된다.In addition, the low molecular weight chondroitin sulfate obtainable by the present invention is a national interest and national health through the export to the market of arthritis-related drugs, dietary supplements and cosmetic products in the current situation, such as increased interest in health and restructuring into an aging society. It is expected to contribute to.
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