KR20060062832A - Recombinant protein, vaccine and prevention method for pmws using the same - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 써코바이러스2 감염 예방용 재조합 단백질, 이를 포함하는 백신 및 돼지 서코바이러스2의 감염을 예방하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 도 1b의 아미노산 서열(서열번호 2)을 가지며, 수탁번호 KFCC-11341인 돼지 써코바이러스2의 ORF2 단백질 단편과 돼지 인터류킨2 단백질 단편이 융합된 재조합 단백질, 이를 포함하는 백신 및 돼지 서코바이러스2의 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant protein for preventing swine circovirus 2 infection, a vaccine comprising the same, and a method for preventing infection of swine circovirus 2, more specifically, having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of FIG. The present invention relates to a recombinant protein in which ORF2 protein fragment of porcine circovirus 2 and porcine interleukin 2 protein fragment fused with KFCC-11341, a vaccine comprising the same, and a method for preventing infection with porcine circovirus 2.

돼지 서코바이러스2, 이유후 전신소모성 증후군, ORF2, IL-2Porcine circovirus 2, post-weaning systemic wasting syndrome, ORF2, IL-2

Description

재조합 단백질, 이를 포함하는 백신 및 이를 이용한 ＰＭＷＳ 예방방법{RECOMBINANT PROTEIN, VACCINE AND PREVENTION METHOD FOR PMWS USING THE SAME}Recombinant protein, VACCINE AND PREVENTION METHOD FOR PMWS USING THE SAME

도 1은 돼지 써코바이러스2 ORF2 DNA 단편과 돼지 인터류킨2 DNA 단편이 연결된 재조합 DNA의 염기 서열(도 1a)(하선표시는 상기 양 DNA를 연결한 부분을 나타냄), 및 돼지 써코바이러스2 ORF2 단백질과 돼지 인터류킨2 단백질이 융합된 재조합 단백질의 아미노산 서열(도 1b)을 나타낸다. Figure 1 shows the nucleotide sequence of the recombinant DNA (Fig. 1a) is connected to the pig circovirus 2 ORF2 DNA fragment and pig interleukin 2 DNA fragment (underline shows the portion connecting the both DNA), and the pig circovirus 2 ORF2 protein The amino acid sequence of the recombinant protein to which the porcine interleukin2 protein is fused is shown (FIG. 1B).

도 2는 BacHLT-PCIL2에 의해 발현되는 재조합 단백질중 PCV2의 ORF2 단백질을 항-PCV2 ORF2 단일클론 항체를 사용, 형광항체법으로 확인한 사진이다.Figure 2 is a photograph confirming the ORF2 protein of PCV2 of the recombinant protein expressed by BacHLT-PCIL2 by using an anti-PCV2 ORF2 monoclonal antibody by fluorescent antibody method.

도 3은 BacHLT-PCIL2에 의해 발현되는 재조합 단백질중 돼지 인터류킨2를 항-인터류킨2 단일클론 항체를 사용, 형광항체법으로 확인한 사진이다.Figure 3 is a photograph confirming the porcine interleukin 2 of the recombinant protein expressed by BacHLT-PCIL2 by the fluorescent antibody method using an anti-interleukin 2 monoclonal antibody.

도 4는 BacHLT-PCIL2에 의해 형질도입된 Sf9 세포 용해액을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅한 후, 항-PCV2 ORF2 단일클론 항체를 사용, 재조합 단백질의 발현을 면역염색법으로 확인한 사진이다. 이때, A레인은 PCV2 ORF2 단일 단백질(30kDa)을, B레인은 본 발명의 재조합 단백질(45kDa)을 나타낸다.Figure 4 is a photograph confirmed by immunostaining the expression of recombinant protein using SDS-PAGE and Western blotting Sf9 cell lysate transduced with BacHLT-PCIL2, using an anti-PCV2 ORF2 monoclonal antibody. In this case, lane A represents a PCV2 ORF2 single protein (30 kDa) and lane B represents a recombinant protein (45 kDa) of the present invention.

본 발명은 양돈농가의 경제적 피해를 유발하는 돼지 써코바이러스2의 감염 예방을 위한 재조합 단백질, 이를 포함하는 백신 및 이를 이용한 PMWS 예방방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지 써코바이러스2의 ORF2 단백질의 항원성을 가지는 동시에 돼지 인터류킨2의 활성을 유지한 재조합 단백질, 이를 포함하는 백신 및 이를 이용한 PMWS 예방방법에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant protein for preventing the infection of swine circovirus 2 that causes economic damage to pig farms, a vaccine comprising the same, and a method for preventing PMWS using the same. More specifically, the antigen of the ORF2 protein of swine circovirus 2 The present invention relates to a recombinant protein having sex and maintaining the activity of porcine interleukin 2, a vaccine comprising the same, and a method for preventing PMWS using the same.

돼지 써코바이러스(Porcine circovirus: PCV)는 써코비리데(Circoviridae)과에 속하는 바이러스로서, 돼지 신장세포인 Porcine kidney(PK)15 세포에 오염되어 있는 것이 Tischer 등에 의해 1974년 처음으로 보고되었다. PK15 세포에서 분리된 PCV는 타입 1으로서 동물접종 실험에서 비병원성인 것이 Tischer 등(1986)에 의해 확인되었다.Pig sseoko virus (Porcine circovirus: PCV) is sseoko corruption to a virus belonging to the (Circoviridae), is contaminated with pig kidney cells, Porcine kidney (PK) 15 cells have been reported for the first time in 1974 by Tischer is located. PCV isolated from PK15 cells was type 1 and confirmed by Tischer et al. (1986) as non-pathogenic in animal vaccination experiments.

최근에 이유자돈의 전신성 소모성 증후군(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome:PMWS)과 관련이 있는 병인체 중의 하나로 PCV가 보고되고 있다. Hamel 및 Meehan 등(1998)은 PCV에 대한 유전자 분석 결과, PCV에는 2가지 타입, 즉 병원성이 없는 PCV 타입 1(PCV1) 및 병원성이 있는 PCV 타입 2(PCV2)가 존재함을 확인하였다.Recently, PCV has been reported as one of the pathogens associated with post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Hamel and Meehan et al. (1998) found that there are two types of PCV, namely PCV type 1 (PCV1) and pathogenic PCV type 2 (PCV2).

PCV2는 엔벨롭이 없는(non-enveloped) 바이러스로서, 유전자는 단일가닥의 환형 DNA로 1759개의 염기로 구성되어 있으며, 산성 환경, 클로로포름 및 고온(56℃~70℃)에 저항하는 것으로 알려져 있다. PCV2 is a non-enveloped virus whose gene consists of 1759 bases in single stranded circular DNA and is known to resist acidic environments, chloroform and high temperatures (56 ° C to 70 ° C).

이유자돈 전신성 소모성 증후군을 일으키는 원인체로서의 PCV2가 1996년 캐나다의 Clark에 의해서 최초 보고되었다. 이후 미국과 아일랜드, 프랑스, 독일, 스 페인, 중국, 일본, 대만 등지에서 발병에 대한 보고가 있어 왔으며, 국내에는 1998년에 최초로 보고되어, 1999년에는 전국에 산재한 것이 확인되었다. 국내 감염형인 경우 6~12주령의 돼지에서 발생하였으며, 폐사율은 극히 낮아 평균 1~5%에 달한다. 하지만, 위생관리가 열악한 농장의 경우 20%이상의 폐사율을 보이기도 하였으며, 80% 이상의 발증돈은 타 질병의 원인체와 혼합감염양상을 보였다. 혼합감염되는 경우 체중감소, 위축, 호흡곤란, 기침, 폐렴, 설사, 청색증, 신경증상 등의 임상증상을 보이면서 20%이상 폐사가 나타난다.PCV2 as the causative agent of weaning systemic wasting syndrome was first reported by Clark in Canada in 1996. Since then, there have been reports of outbreaks in the United States, Ireland, France, Germany, Spain, China, Japan, and Taiwan. It was first reported in 1998 in Korea and scattered throughout the country in 1999. Domestic infections occurred in pigs aged 6-12 weeks, and mortality was extremely low, reaching an average of 1-5%. However, in farms with poor hygiene management, mortality was more than 20%, and more than 80% of pigs showed mixed infection with other causative agents. Mixed infections cause more than 20% mortality, with clinical symptoms such as weight loss, atrophy, dyspnea, cough, pneumonia, diarrhea, cyanosis, and neurological symptoms.

PMWS의 주요 임상증상으로는 성장지연, 피부의 창백화, 매우 드물게 황달 등이 관찰되며, 간혹 설사나 호흡곤란 등이 관찰되기도 한다. 주로 4주에서 15주령의 자돈에서 임상증상이 관찰되고 있으며, 치사율과 이환율은 농장 상황에 따라 매우 다양하지만 이환율은 70~80% 정도이며 치사율은 4~10% 정도이다. 육안 병변으로는 림프절 장애, 간염, 신염, 폐렴 등이 관찰되며, 부검시 폐가 허탈되지 않으며 주로 서혜림프절, 악하림프절, 장간막림프절, 종격동림프절의 종대가 관찰된다. 그러나 이런 육안 병변은 항상 관찰되는 것은 아니므로 육안병변만을 가지고 PMWS를 진단해서는 안된다. 병리조직학적 소견으로는 임파장기 내에서 거대 다핵세포가 관찰되는 육아종성 염증이 관찰되며, 임파장기에 침윤한 조직구나 대식구계 세포에서 호염성의 세포질내 봉입체가 관찰되기도 한다.The main clinical manifestations of PMWS include growth retardation, pale skin, and very rarely jaundice, and sometimes diarrhea and dyspnea. Clinical signs are observed in piglets between 4 and 15 weeks of age. Mortality and morbidity vary widely depending on farm conditions, but morbidity is 70-80% and mortality is 4-10%. Gross lesions include lymph node disorders, hepatitis, nephritis, and pneumonia. Lungs are not collapsed at necropsy and mainly swollen lymph nodes, submandibular lymph nodes, mesenteric lymph nodes, and mediastinal lymph nodes. However, these gross lesions are not always observed, so PMWS should not be diagnosed with gross lesions alone. Histopathologic findings include granulomatous inflammation, in which giant multinucleated cells are observed in lymphatic organs, and basophilic intracellular inclusion bodies are observed in tissue or macrophage cells infiltrating lymph node.

PCV2는 일반적인 세정제나 소독제에 대해 매우 저항성이 강하여 감염된 건물 전체를 비감염 상태로 만드는 것은 매우 어렵다. PCV2에 의한 PMWS에 대하여, ORF2의 유핵세포 발현체를 진단키트에 이용하려는 시도가 행해지고 있으며, 유전자의 변이면(Mutation)에서 대륙간 상동성(Homology)이 높고, 변이체(Mutant)발생률이 낮아, 재조합 단백질의 중요한 인자로서 선발되어 백신개발연구 중에 있다. 그러나, 현재까지 PCV2에 대한 어떠한 효과적인 백신도 개발된 바가 없으며, Allan 등이 개발한 백신의 경우에도 실험감염에서 감염까지는 아니지만 단지 7주까지 임상증상의 발현만을 막을 수 있었다.PCV2 is highly resistant to common cleaning and disinfectants, making it very difficult to make an entire infected building uninfected. Attempts have been made to utilize the nucleated cell expression of ORF2 in diagnostic kits for PMWS by PCV2. It is selected as an important factor of protein and is under study for vaccine development. However, no effective vaccine against PCV2 has been developed to date, and the vaccine developed by Allan et al. Was able to prevent the onset of clinical symptoms up to 7 weeks, but not from experimental infection to infection.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로, 돼지 써코바이러스2의 ORF2 단백질의 항원성을 가지는 동시에 돼지 인터류킨2의 활성을 유지한 재조합 단백질을 제조하여, 돼지 써코바이러스에 대한 항체 생성을 유도하는 동시에 인터류킨2에 의한 면역증강 효과를 발휘할 수 있는 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention is to solve the above problems, by producing a recombinant protein having the antigenicity of the ORF2 protein of porcine circovirus 2 and maintaining the activity of porcine interleukin 2, to induce the production of antibodies to porcine circovirus At the same time, an object of the present invention is to provide a recombinant protein capable of exerting an immune enhancing effect by interleukin 2 and a vaccine comprising the same.

또한, 본 발명은 본 발명의 백신을 이유자돈에게 투여하여 전신성 소모성 증후군에 대한 면역성을 증진시키므로써 돼지 써코바이러스2 감염을 예방하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preventing swine circovirus 2 infection by administering the vaccine of the present invention to weaning pigs to enhance immunity to systemic wasting syndrome.

본 발명의 재조합 단백질은, 도 1b의 아미노산 서열(서열번호 2)을 가지며, 돼지 써코바이러스2의 ORF2 단백질과 돼지 인터류킨2 단백질이 융합된 것(수탁번호 KFCC-11341)인 것을 특징으로 한다. The recombinant protein of the present invention has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of Fig. 1B, and is characterized in that the ORF2 protein of porcine circovirus 2 and the porcine interleukin 2 protein are fused (Accession No. KFCC-11341).

PCV2의 주요 구조단백질은 ORF2 유전자로부터 번역되는 약 30kDa의 단백질로서, 바이러스의 캡시드(capsid)를 구성한다. 이 단백질은 재조합 단백질로 발현될 때, 바이러스 유사 입자(virus-like particle:VLP)를 형성하며, 바이러스 중화항체 생산에 관여하는 것으로 알려져 있다.The major structural protein of PCV2 is a protein of about 30 kDa, which is translated from the ORF2 gene, making up the capsid of the virus. When expressed as a recombinant protein, the protein forms virus-like particles (VLPs) and is known to be involved in viral neutralizing antibodies.

한편, 돼지 인터류킨2(IL-2)는 T-임파구에서 생성되어 면역 세포의 조절 및 성장에 중요한 역할을 하는데, 특히 골수유래 T세포의 성장 및 분화 조절 뿐만 아니라, B 임파구 및 NK 세포(natural killer cell) 등을 활성화시킨다고 알려져 있다. 본 발명에서는 재조합 바이러스 벡터내에 상기 ORF2 유전자 이외에 IL-2 유전자를 삽입하는 것에 의해, 이로부터 발현된 재조합 단백질을 백신으로 사용할 때 IL-2가 돼지의 면역계를 자극하므로써, 면역증강의 상승 효과를 나타낼 수 있는 것이다.On the other hand, porcine interleukin 2 (IL-2) is produced in T-lymphocytes and plays an important role in the regulation and growth of immune cells, especially B lymphocytes and NK cells (natural killer), as well as regulating the growth and differentiation of bone marrow-derived T cells. cell) and the like. In the present invention, by inserting the IL-2 gene in addition to the ORF2 gene in the recombinant viral vector, IL-2 stimulates the pig's immune system when using the recombinant protein expressed therein as a vaccine, thereby exhibiting a synergistic effect of immunostimulation. It can be.

본 발명의 재조합 단백질은, PCV2의 ORF2 전체 단백질중 면역원성이 우수한 구조부위로 이루어진 단백질 단편과, 돼지 IL-2 전체 단백질중 면역증강 효과가 우수한 기능부위로 이루어진 단백질 단편이 융합된 재조합 단백질이다.The recombinant protein of the present invention is a recombinant protein in which a protein fragment composed of a structural region having excellent immunogenicity among all the ORF2 proteins of PCV2 and a protein fragment composed of a functional region having excellent immunopotentiating effect among the whole protein of pig IL-2.

본 발명의 백신은, 본 발명의 재조합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 이유자돈의 전신성 소모성 증후군의 예방용 재조합 백신이다.The vaccine of the present invention is a recombinant vaccine for the prevention of systemic wasting syndrome of weaning pigs comprising the recombinant protein of the present invention.

본 발명의 돼지 써코바이러스2 감염을 예방하는 방법은, 상기와 같은 본 발명의 재조합 단백질 백신을 이유자돈에게 투여하여 전신성 소모성 증후군에 대한 면역성을 증진시키므로써 돼지 써코바이러스2 감염을 예방하는 것을 특징으로 한다.The method for preventing swine circovirus 2 infection of the present invention is characterized by preventing swine circovirus 2 infection by increasing the immunity to systemic wasting syndrome by administering the recombinant protein vaccine of the present invention to weaning pigs as described above. .

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.                     

[실시예]EXAMPLE

단계 1: PCV2의 분리 및 동정Step 1: Isolation and Identification of PCV2

전형적인 PMWS 증상을 나타내는 돼지에서 림프절을 수집하고, 페니실린과 스트렙토마이신을 함유한 동량의 MEM배지(2X, Gibco BRL)를 혼합한 후 유발과 균질기(homogenizer)를 이용하여 조직을 파쇄하였다. 균질화한 조직을 -70℃로 동결시키고 다시 파쇄하는 과정을 3회 반복하였다. 균질화한 조직을 4℃, 1,500rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 재원심분리(4℃, 5,000rpm, 20분)하여 상층액을 회수하고, 이 회수액을 바이러스(PCV2) 시액으로 사용하였다. Lymph nodes were collected from pigs with typical PMWS symptoms, and the same amount of MEM medium (2X, Gibco BRL) containing penicillin and streptomycin was mixed and tissues were disrupted using an induction and homogenizer. The homogenized tissue was frozen at −70 ° C. and shredded three times. The homogenized tissue was centrifuged at 1,500 rpm for 30 minutes at 4 ° C to recover the supernatant. The recovered supernatant was recentrifuged (4 ° C., 5,000 rpm, 20 minutes) to recover the supernatant, which was used as a virus (PCV2) reagent.

단계 2: PCV2 ORF2 유전자 및 돼지 인터류킨 2 유전자의 연결 및 클로닝 Step 2: Linking and Cloning of PCV2 ORF2 Gene and Porcine Interleukin 2 Gene

상기 바이러스 시액에 SDS(sodium dodecyl sulfate, Sigma사제) 및 프로테아제 K(protease K, Sigma사제)를 각각 최종농도가 1%(v/v) 및 20㎍(w/v)이 되도록 첨가한 다음, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25:24:1)을 동량 첨가하여 단백질을 제거하고, 추출된 상층액을 취하여 에탄올을 동량첨가, DNA를 침전, 건조시킨 후 멸균 증류수에 적당농도로 용해시켜 PCV2 게놈 DNA를 준비하였다. SDS (sodium dodecyl sulfate, manufactured by Sigma) and protease K (protease K, manufactured by Sigma) were added to the virus solution so that their final concentrations were 1% (v / v) and 20 µg (w / v), respectively. It was made to react at 1 degreeC. The same amount of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) is added to remove the protein, and the extracted supernatant is taken to the same amount, ethanol is added, DNA is precipitated and dried, and then dissolved in a suitable concentration in sterile distilled water. Genomic DNA was prepared.

상기 PCV2 게놈 DNA 5㎕를 폴리머라제 연쇄반응법(Polymerase chain reaction:PCR)에 의한 ORF2 유전자 증폭용 주형(template)으로 사용하였다. 반응조건은 센스 프라이머(Sense primer)로서 5'-atgacgtatccaaggaggcg-3'를, 안티센스 프라이머로서 5'-gaattcagggttaagtggggggtct-3'를 사용하였으며, TAKARA LA Taq 폴 리머라제(TAKARA사제) 0.5㎕를 혼합하여 프로토콜에 따라 92℃에서 5분 반응후, 92℃ 30초, 46℃ 30초 및 72℃ 2분간 35사이클 반응시키고, -72℃에서 30분 반응시키므로써 반응을 종결시켰다. 증폭된 전장 DNA는 제한효소 EcoRI으로 부분절단한 다음, 705bp 길이의 DNA 단편을 정제하므로써 PCV2의 ORF2 DNA 단편을 얻었다.5 μl of the PCV2 genomic DNA was used as a template for amplification of the ORF2 gene by polymerase chain reaction (PCR). Reaction conditions were 5'-atgacgtatccaaggaggcg-3 'as a sense primer and 5'-gaattcagggttaagtggggggtct-3' as an antisense primer, and 0.5 µl of TAKARA LA Taq polymerase (manufactured by TAKARA) was mixed. The reaction was terminated by reacting for 5 minutes at 92 ° C for 35 cycles of 92 ° C, 30 seconds, 46 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes, and for 30 minutes at -72 ° C. The amplified full-length DNA was partially cleaved with the restriction enzyme EcoRI, and the 705 bp long DNA fragment was purified to obtain an ORF2 DNA fragment of PCV2.

또한, 돼지 인터류킨 2 DNA 단편은 다음과 같이 준비하였다. 돼지 임파구를 분리, DMEM 배지에서 1일간 배양한 후, 7.5㎍/㎖의 ConA(Sigma사제)를 첨가하여 37℃에서 4~8시간 배양하고 세포를 수확하여 PBS로 3회 세척한 후, 이를 RNA 추출 재료로 하였다. RNAaid 키트(BIO 101사제)를 사용하여 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출한 후, 이를 주형으로 하고 한쌍의 돼지 인터류킨 2 유전자 증폭용 프라이머(센스 프라이머; 5'-gaattcatgtataagatgcagctcttgtgtt-3', 안티센스 프라이머; 5'-ttatcaagtcagtgttgagtgtagc-3')를 사용하여 RT-PCR 방법으로 인터류킨2 cDNA를 합성하였다. 이를 증폭하여 얻어진 전장 인터류킨2 cDNA를 제한효소 EcoRI으로 부분절단한 다음, 469bp 길이의 DNA 단편을 정제하므로써 돼지 인터류킨 2 DNA 단편을 얻었다.In addition, porcine interleukin 2 DNA fragments were prepared as follows. Porcine lymphocytes were isolated and cultured in DMEM medium for 1 day, followed by incubation at 37 ° C. for 4-8 hours with 7.5 μg / ml ConA (manufactured by Sigma), harvesting cells, washing with PBS three times, and then RNA Extraction material was used. Using RNAaid kit (manufactured by BIO 101), the whole RNA was extracted according to the protocol, which was then used as a template, and a pair of porcine interleukin 2 gene amplification primers (sense primer; 5'-gaattcatgtataagatgcagctcttgtgtt-3 ', antisense primer; 5'- Interleukin2 cDNA was synthesized by RT-PCR method using ttatcaagtcagtgttgagtgtagc-3 '). The full length interleukin 2 cDNA obtained by amplifying the fragment was partially digested with restriction enzyme EcoRI, and then purified by a 469 bp long DNA fragment to obtain a porcine interleukin 2 DNA fragment.

상기의 PCV2 ORF2 DNA 단편과 돼지 인터류킨 2 DNA 단편을 DNA 연결효소(ligase)로 연결(이하, PCVIL2라 함)하였으며, 그 연결된 DNA의 전체 서열을 도 1a에 나타내었으며, 이때 하선표시된 부분은 연결부위를 나타낸다. 상기 연결된 DNA를 플라스미드 PCR-TA 클로닝 벡터(Invitrogen사제)에 삽입하여 얻어진 산물을 pPCVIL2라 명명하였다.The PCV2 ORF2 DNA fragment and the porcine interleukin 2 DNA fragment were linked with DNA ligase (hereinafter referred to as PCVIL2), and the entire sequence of the linked DNA is shown in FIG. 1A, where the underlined portion is a linking site. Indicates. The product obtained by inserting the linked DNA into the plasmid PCR-TA cloning vector (Invitrogen) was named pPCVIL2.

단계 3: 발현벡터 및 재조합 바이러스 작성Step 3: Create Expression Vectors and Recombinant Virus

상기의 pPCVIL2에 클로닝된 PCVIL2 유전자를 베큘로바이러스 발현벡터인 pVL1393(Pharmingen사제)에 클로닝하여 pBacPCV2IL2로 명명된 재조합 발현벡터를 얻었다. 이를 Maxi-prep한 다음, 1㎍의 상기 발현벡터, 1㎍의 베큘로바이러스의 게놈 DNA 및 10㎕의 리포펙틴(lipofectin, GibcoBRL사제)(1㎍/㎖)을 혼합하고 무혈청배지 800㎕를 첨가하여 공동형질도입(cotransfection) 혼합물을 제조한 후, 숙주로서 Hi-five 곤충세포(Invitrogen사제)에 공동형질도입시켰다. 형질도입 조건은 리포펙틴 제조사의 프로토콜에 따라서 실시하였다. The PCVIL2 gene cloned into pPCVIL2 was cloned into pVL1393 (manufactured by Pharmingen), a baculovirus expression vector, to obtain a recombinant expression vector named pBacPCV2IL2. After Maxi-prep, 1 μg of the expression vector, 1 μg of the baculovirus genomic DNA and 10 μl of lipofectin (manufactured by GibcoBRL) (1 μg / ml) were mixed and 800 μl of serum-free medium was mixed. After addition, a cotransfection mixture was prepared, and then co-transformed into Hi-five insect cells (Invitrogen) as a host. Transduction conditions were performed according to the protocol of the lipofectin manufacturer.

형질도입후 6~7일간 배양, 재조합 바이러스를 수확하여 BacHLT-PCIL2로 명명하였다. Six to seven days after transduction, the recombinant virus was harvested and named BacHLT-PCIL2.

단계 4: 재조합 단백질의 발현 확인Step 4: Confirm expression of the recombinant protein

상기의 BacHLT-PCIL2 재조합 바이러스를 Hi-five 곤충세포(Invitrogen사제)에 감염시켜 5~6일간 37℃에서 배양하고, 상층액을 제거한 후 냉각보관된 80% 아세톤으로 고정하였다. 이는, 항-PCV2 ORF2 단일클론 항체 및 항-IL2 단일클론 항체(Pharmingen사제)를 사용하여 형광항체법으로 재조합 단백질의 발현 여부를 확인하는 데에 사용되었으며, 그 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다. 이로부터, 본 발명의 재조합 단백질은 PCV2 ORF2의 활성과 IL2의 활성을 모두 가짐을 알 수 있었다.The BacHLT-PCIL2 recombinant virus was infected with Hi-five insect cells (manufactured by Invitrogen), incubated at 37 ° C. for 5-6 days, and the supernatant was removed and fixed with 80% acetone. This was used to confirm the expression of recombinant protein by fluorescent antibody method using anti-PCV2 ORF2 monoclonal antibody and anti-IL2 monoclonal antibody (manufactured by Pharmingen), and the results are shown in FIGS. 2 and 3, respectively. Indicated. From this, the recombinant protein of the present invention was found to have both the activity of PCV2 ORF2 and IL2 activity.

상기의 BacHLT-PCIL2가 감염된 곤충세포를 수확하여 초음파 파쇄한 다음 2,000rpm에서 10분간 원심후 상층액을 SDS-PAGE, 웨스턴 블랏 분석용으로 사용하였다. 표지된 항-PCV2 단일클론 항체를 이용하여 면역염색(immunostaining)한 결과( 도 4 참조), 약 45kDa에서 특이적으로 반응하는 단백질 밴드(B레인)를 확인하였으며, 이는 약 30kDa에서 특이적으로 반응하는 단백질 밴드(A레인)와 구분되는 것으로, 곤충세포에서 PCV2의 ORF2 단백질(약 30kDa)과 돼지 인터류킨2 단백질(약 15kDa)이 융합되어 발현되었음을 의미하는 것이다.The insect cells infected with the BacHLT-PCIL2 were harvested and sonicated, and then the supernatant was centrifuged at 2,000 rpm for 10 minutes and used for SDS-PAGE and Western blot analysis. Immunostaining using a labeled anti-PCV2 monoclonal antibody (see FIG. 4) confirmed a protein band (Blane) that specifically reacts at about 45 kDa, which specifically reacts at about 30 kDa. It is distinguished from the protein band (lane A), which means that the ORF2 protein (about 30kDa) and porcine interleukin 2 protein (about 15kDa) of PCV2 are fused and expressed in insect cells.

단계 5: 재조합 단백질의 생산Step 5: Production of Recombinant Protein

150㎠ 플레이트에 Hi-five 곤충세포를 80% 정도의 밀도로 부착시킨 다음 BacHLT-PCIL2를 감염시켰다. 37℃에서 5~6일간 배양하여 세포병원성 작용(cytopathic effect:CPE)이 90% 정도 나타났을 때 상층액과 세포를 각각 수확하였다. 세포는 1ml의 PBS 완충액에 현탁한 다음 초음파 파쇄를 실시하였다. 초음파 파쇄는 얼음위에서 30초간 3회 실시하였으며, 얻어진 초음파 파쇄액을 3,000rpm으로 20분간 원심 후 상층액을 수확하여 재조합 단백질을 정제하였다.Hi-five insect cells were attached to a 150 cm 2 plate at a density of about 80% and then infected with BacHLT-PCIL2. Supernatants and cells were harvested when the cells were incubated at 37 ° C. for 5 to 6 days when the cytopathic effect (CPE) was about 90%. The cells were suspended in 1 ml PBS buffer and subjected to ultrasonic disruption. Ultrasonic crushing was performed three times for 30 seconds on ice. Centrifugation of the obtained ultrasonic crushing solution at 3,000 rpm for 20 minutes was followed by harvesting the supernatant to obtain recombinant protein. Purified.

상기 정제된 단백질은 정확한 아미노산 서열을 확인하기 위하여, 공지의 방법으로 서열분석하였으며, 그 결과를 도 1b에 나타내었다.
The purified protein was sequenced by a known method to confirm the exact amino acid sequence, the results are shown in Figure 1b.

동물 접종 시험에 의한 항체 형성 확인Antibody formation confirmation by animal inoculation test

공시동물로서 체중 300~350g의 건강한 기니피그 25마리를 공시하여 10두를 항원 접종군으로 하고, 10두를 대조군으로 사용하였다. 체중 2.0kg의 건강한 토끼 12마리를 공시하여 8마리를 항원 접종군으로 하고, 4마리를 대조군으로 하였다. 체중 5~6kg의 PCV2에 대한 항체가 없는 건강한 자돈을 9마리 공시한 후, 6마리를 항원 접종군으로 하고, 3마리를 대조군으로 하였다. As a test animal, 25 healthy guinea pigs with a weight of 300-350 g were published and 10 heads were used as the inoculation group, and 10 heads were used as a control group. Twelve healthy rabbits weighing 2.0 kg were reported, and eight were used as the antigen inoculation group, and four were used as the control group. Nine healthy piglets without antibodies to PCV2 with a body weight of 5 to 6 kg were disclosed, and six were taken as the inoculation group and three were used as the control group.                     

항원 접종은, 항원 접종군의 경우 실시예에 의해 제조된 재조합 단백질을 이용하여 공지의 방법으로 제조된 백신(이하, 시험백신)을 공시 동물에 따라 이하의 접종 농도 및 부위에 접종하고, 대조군의 경우 PBS를 공시 동물에 따라 이하 접종 농도 및 부위에 접종하였다. 기니피그는 2ml씩 3주 간격으로 2회 근육에 접종하였고, 토끼는 2ml씩 3주 간격으로 2회 근육에 접종하였으며, 돼지는 1.5ml씩 3주 간격으로 2회 근육에 접종하였다. 항체 검사용 시료 채취는 모두 2차 접종 3주 후에 채혈하여 혈청을 분리하여 간접형광항체법을 이용하여 항체 유무를 확인하였다.In the case of antigen inoculation, a vaccine (hereinafter referred to as a test vaccine) prepared by a known method using the recombinant protein prepared according to the example in the case of the antigen inoculation group was inoculated at the following inoculation concentrations and sites according to the animals. PBS was inoculated at the following inoculation concentrations and sites according to the published animals. Guinea pigs were inoculated into the muscles twice at 3 week intervals of 2ml, rabbits were inoculated into muscles twice at the 3 week intervals of 2ml, and pigs were inoculated into muscles twice every 3 weeks at 1.5ml. All samples for antibody testing were collected 3 weeks after the second inoculation, and serum was separated to confirm the presence of antibodies using indirect fluorescent antibody method.

간접형광항체법은 다음과 같은 방법으로 하였다. 즉 PCV2를 PCV2가 없는 PK15 세포주에 접종하여 맹목 계대하고, 바이러스 감염세포가 50% 정도 되는 세포를 계대하여 2×10⁶개의 세포를 96웰 세포배양 플레이트에 100㎕씩 접종하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양한 후, 배양액을 제거, PBS로 세척한 후 건조하여 냉장 80% 아세톤 100㎕를 첨가하고, -20℃에서 10분간 고정하여 제거하고 호일로 싼후, -20℃에 뒤집어 보관하면서 필요시 마다 꺼내어 사용하였다.Indirect fluorescent antibody method was performed as follows. In other words, PCV2 was inoculated into a PK15 cell line without PCV2 and blindly passaged, and cells infected with 50% of virus-infected cells were passaged, and 100 μl of 2 × 10 ⁶ cells were inoculated into a 96-well cell culture plate at 37 ° C. and 5%. After 24 hours of incubation under CO ₂ condition, the culture solution was removed, washed with PBS and dried to add 100 μl of refrigerated 80% acetone, fixed at −20 ° C. for 10 minutes, wrapped with foil, and then inverted to −20 ° C. It was taken out and used whenever needed.

시험에 사용된 동물의 혈청을 U형 플레이트를 사용하여 PBS로 20배부터 2진희석한 후, 상기의 플레이트를 실온화한 후, 여기에 100㎕씩 접종하여 37℃에서 1시간 반응한 후, PBS 200㎕로 3~5회 세척하였다. 항-돼지 IgG FITC 컨쥬게이트(conjugate)를 50㎕씩 첨가, 37℃에서 30분 반응한 후, PBS 200㎕로 3~5회 세척하여 킴타올에 털어낸 후 형광현미경으로 검경하여 특이형광이 보이는 희석배수를 항체 역가로 정하였다. After diluting the serum of the animals used for the test from 20 times with PBS using a U-type plate, the plate was allowed to warm to room temperature, and then inoculated with 100 μl and reacted at 37 ° C. for 1 hour, followed by PBS. Wash 3 to 5 times with 200 μl. 50 μl of anti-pig IgG FITC conjugate was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After washing 3 ~ 5 times with 200 μl of PBS, they were shaken off with kimtool and examined under a fluorescent microscope. Dilution multiples were determined by antibody titers.                     

각 시험동물에 접종하여 형성된 항체 분석 결과를 표 1에 나타내었다. Table 1 shows the results of antibody analysis obtained by inoculating each test animal.

표 1 : 재조합 단백질로 면역유도된 기니피그, 토끼 및 돼지에서 형성된 항체에 대한 결과.Table 1: Results for antibodies formed in guinea pigs, rabbits, and pigs immunized with recombinant protein.

동물animal 실험군Experimental group 공시두수Public announcement 항체 역가 분포(두)Antibody titer distribution (two) ＜20<20 2020 4040 8080 160160 320320 640640 12801280 ＞1280＞ 1280 기니 피그Guinea pig 접종군Inoculation group 1010 1One 22 44 22 1One 대조군Control 1010 99 1One 토끼rabbit 접종군Inoculation group 88 1One 1One 44 22 대조군Control 44 44 돼지pig 접종군Inoculation group 66 1One 22 22 1One 대조군Control 33 22 1One

상기의 표 1에 나타난 바와 같이, 각 시험동물에서 접종전에는 PCV2에 대한 항체가 존재하지 않았으나, 실시예에 의해 제조된 백신을 접종한 후에는 접종전에 비하여 20~640배의 항체가 형성되었음을 확인하였다.
As shown in Table 1 above, the antibody against PCV2 was not present in each test animal before inoculation, but after inoculation of the vaccine prepared in Example, it was confirmed that 20-640 times as much antibody was formed as before the inoculation. .

양돈장 사육 모돈 및 자돈 접종시험에 의한 항체 형성 확인Confirmation of antibody formation by pig breeding sows and piglet vaccination test

시험 농장에 상관없이 PCV2 항체 음성인 분만 7주전 모돈 40두를 공시하여, 20두에게는 시험백신을 접종하고, 나머지 20두에게는 대조군으로서 PBS를 접종하였다. 임신 모돈의 백신 접종은 1차 접종의 경우 분만 5주전, 2차 접종의 경우 분만 2주전에 실시하였으며, 시험백신을 2ml씩 이근부에 접종하고 대조군은 백신 접종군과 동일 시기에 PBS를 2ml씩 이근부에 접종하였다. 이에 의해 형성된 항체 분석 결과를 표 2에 나타내었다.Regardless of the test farm, 40 sows were published 7 weeks before delivery, negative for PCV2 antibody, and 20 were inoculated with the test vaccine and 20 were inoculated with PBS as a control. Vaccinations of pregnant sows were given 5 weeks before delivery for the first dose and 2 weeks before delivery for the second dose. Was inoculated. The antibody analysis results thus formed are shown in Table 2.

표 2 : 야외 시험 모돈 및 자돈에서 재조합 단백질로 면역유도되어 형성된 항체에 대한 결과.Table 2: Results for antibodies formed by immunization with recombinant proteins in sows and piglets in field trials.

가. 모돈end. Sows

나. 자돈I. Piglets

상기의 표 2에 나타난 바와 같이, 모돈에서의 항체 역가는 접종전에 비하여 대조군에서는 20~640배였으며, 항원 접종군에서는 대략 80~1280배로서, 시험백신 접종으로 항체 형성이 급격히 증가되었음을 확인하였다. 또한, 자돈에서의 항체 역 가는 대조군에서는 40배 이하가 대부분이었으며, 항원 접종군에서는 40~1280배로서, 접종군에서 항체 형성이 급격히 증가되었음을 확인하였다.As shown in Table 2, the antibody titers in sows were 20 to 640 times in the control group compared to before inoculation, approximately 80 to 1280 times in the antigen inoculation group, it was confirmed that the antibody formation sharply increased by the test vaccine inoculation. In addition, the antibody titers in piglets were 40-fold or less in the control group, 40-1280-fold in the inoculation group, and it was confirmed that the antibody formation was rapidly increased in the inoculation group.

이러한 결과는, 본 발명의 재조합 단백질이 돼지에서 PCV2에 대한 면역원성및 면역증강의 이중 효과가 발휘되어, 이러한 상승 효과로 인해 PCV2에 대한 항체가 매우 많이 형성됨을 의미한다. 따라서, 본 발명의 재조합 단백질을 이용한 우수한 백신의 제공이 가능하다.These results indicate that the recombinant protein of the present invention exerts a dual effect of immunogenicity and immunopotentiation on PCV2 in pigs, and this synergistic effect results in the formation of very many antibodies against PCV2. Therefore, it is possible to provide an excellent vaccine using the recombinant protein of the present invention.

본 발명은 돼지 써코바이러스의 ORF2 단백질의 면역원성을 가지고 있으면서 돼지 인터류킨2의 활성을 유지한 재조합 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 단백질은 돼지 써코바이러스에 대한 항체 생성을 유도할 수 있으며, 돼지 인터류킨2의 활성을 유지하고 있어 돼지 써코바이러스 감염의 예방을 위한 다기능 백신으로 사용할 수 있는 장점이 있다. The present invention relates to a recombinant protein that retains the activity of porcine interleukin 2 while having immunogenicity of the ORF2 protein of porcine circovirus. The recombinant protein of the present invention can induce the production of antibodies against porcine circovirus, and porcine interleukin. It maintains the activity of 2 has the advantage that can be used as a multifunctional vaccine for the prevention of swine circovirus infection.

Claims (3)

도 1b의 아미노산 서열(서열번호 2)을 가지며, 수탁번호 KFCC-11341인 돼지 써코바이러스2의 ORF2 단백질 단편과 돼지 인터류킨2 단백질 단편이 융합된 재조합 단백질.Recombinant protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 2), wherein the ORF2 protein fragment of porcine circovirus 2 and porcine interleukin 2 protein fragment are fused with accession number KFCC-11341. 제 1항의 재조합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 이유자돈의 전신성 소모성 증후군의 예방용 백신.A vaccine for preventing systemic wasting syndrome of weaning pigs, comprising the recombinant protein of claim 1. 제 2항의 백신을 이유자돈에게 투여하여 전신성 소모성 증후군에 대한 면역성을 증진시키므로써 돼지 써코바이러스2 감염을 예방하는 방법.A method of preventing swine circovirus 2 infection by administering the vaccine of claim 2 to weaning piglets to enhance immunity to systemic wasting syndrome.

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