RU2779423C2 - RECOMBINANT EXPRESSION OF PROTEIN ORF2 PCV2b IN INSECT CELLS - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology; veterinary medicine.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology and veterinary medicine, in particular to an insect cell providing optimized expression of mutant protein ORF2 PCV2b; to a virus-like particle (VLP) of mutant protein ORF2 PCV2b; to a method for expression and production of mutant protein ORF2 PCV2b in insect cells; to a vaccine for pigs for suppression of PCV2 infection or disease signs related to it, containing mutant protein ORF2 PCV2b, and to its production method; to a method for suppression of PCV2 infection or disease signs related to it in a pig, using the above-mentioned vaccine, as well as to mutant protein ORF2 PCV2b, and its use.

EFFECT: mutation in protein ORF2 PCV2b allows for prevention of its accumulation in a nucleus and, thereby, optimization of its expression in insect cells.

14 cl, 4 dwg, 4 tbl, 3 ex

Description

Настоящее изобретение относится к области вакцин для домашнего скота, в частности к вакцинам против PCV2 для свиней. В частности, настоящее изобретение относится к клеткам насекомых, содержащим гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, экспрессирующую мутантный белок ORF2 PCV2b, к вирусоподобным частицам из мутантного белка ORF2 PCV2b, к способам получения или использования клеток насекомых или мутантного белка ORF2 PCV2b и к вакцинам для свиней.The present invention relates to the field of vaccines for livestock, in particular vaccines against PCV2 for pigs. In particular, the present invention relates to insect cells containing a heterologous nucleic acid sequence expressing a PCV2b ORF2 mutant protein, to virus-like particles from a PCV2b ORF2 mutant protein, to methods for making or using insect cells or a PCV2b ORF2 mutant protein, and to vaccines for pigs.

Цирковирус 2 свиней (PCV2) является патогеном для свиней, который встречается во всем мире и причиняет много страданий животным и приводит к серьезным экономическим потерям в сельскохозяйственном секторе. В отношении обзора см. Gillespie et al. (2009, J. Vet. Intern. Med., vol. 23, p. 1151-1163). Porcine circovirus 2 (PCV2) is a porcine pathogen that occurs worldwide and causes a lot of suffering to animals and leads to serious economic losses in the agricultural sector. For a review, see Gillespie et al. (2009, J. Vet. Intern. Med., vol. 23, pp. 1151-1163).

PCV2 принадлежит к семейству Circoviridae и имеет небольшой (17 нм), икосаэдрический, не покрытый оболочкой вирион, содержащий геном в виде кольцевой одноцепочечный ДНК размером, составляющим приблизительно 1,76 т.п.н. Геном содержит только несколько открытых рамок считывания, из которых ORF2 кодирует белок вирусного капсида, который содержит основные вируснейтрализующие эпитопы.PCV2 belongs to the Circoviridae family and is a small (17 nm), icosahedral, non-enveloped virion containing a circular single-stranded DNA genome of approximately 1.76 kbp. The genome contains only a few open reading frames, of which ORF2 encodes a viral capsid protein that contains the major virus-neutralizing epitopes.

PCV2 является относительно стойким и очень инфекционным. Он распространяется через различные виды секреций организма и может распространяться как горизонтально, так и вертикально в стаде свиней. Основными поражениями, вызванными PCV2 инфекцией, являются истощение лимфоидной ткани; результирующая иммуносупрессия также делает инфицированное животное чувствительным к вторичным или сопутствующим инфекциям. Следовательно, PCV2 участвует в ряде синдромов заболевания у свиней, которые в совокупности называются связанным с цирковирусом свиней заболеванием (PCVAD). Наиболее выраженным PCVAD является «синдром послеотъемного мультисистемного истощения» (PMWS), наблюдаемый у молодых свиней. Клинические признаки и патология PMWS включают прогрессирующее истощение, одышку, тахипноэ, и иногда желтуху и желтуху. Другими PCVAD являются комплекс респираторных заболеваний свиней, синдром дерматита и нефропатии у свиней, нарушение репродуктивной функции, гранулематозный энтерит, врожденное дрожание и экссудативный эпидермит. Ради обзора см. Merck Veterinary Manual, 11^th ed., 2016, ISBN: 9780911910933; и “Diseases of Swine”, 10^th ed., 2012, ISBN: 9780813822679.PCV2 is relatively persistent and highly infectious. It spreads through various types of bodily secretions and can spread both horizontally and vertically in a herd of pigs. The main lesions caused by PCV2 infection are depletion of lymphoid tissue; the resulting immunosuppression also renders the infected animal susceptible to secondary or co-infections. Therefore, PCV2 is involved in a number of disease syndromes in pigs, which are collectively referred to as porcine circovirus-associated disease (PCVAD). The most pronounced PCVAD is "post-weaning multi-systemic wasting syndrome" (PMWS) seen in young pigs. The clinical signs and pathology of PMWS include progressive emaciation, dyspnea, tachypnea, and sometimes jaundice and icterus. Other PCVADs are porcine respiratory disease complex, porcine dermatitis and nephropathy syndrome, reproductive dysfunction, granulomatous enteritis, congenital tremor, and exudative epidermitis. For an overview, see Merck Veterinary Manual, 11th ed., 2016, ISBN: ^{9780911910933} ; and Diseases of Swine, ^10th ed., 2012, ISBN: 9780813822679.

Однако без вторичной инфекции у большинства свиней, инфицированных PCV2, могут отсутствовать четкие клинические симптомы заболевания, за исключением слабого роста и продуктивности у явно здоровых свиней. (Суб-)Клинические симптомы PCVAD, вызванные PCV2, могут наблюдаться у свиней, как правило, начиная с 3 или 4-недельного возраста, т.е. времени, когда поросят отнимают от груди, и защитные антитела материнского происхождения начинают снижаться.However, without secondary infection, most pigs infected with PCV2 may have no clear clinical symptoms of the disease, except for poor growth and production in apparently healthy pigs. (Sub-)Clinical symptoms of PCVAD caused by PCV2 can be observed in pigs, usually starting at 3 or 4 weeks of age, i.e. the time when piglets are weaned and maternal protective antibodies begin to decline.

Для защиты от PCV2 инфекции и связанных с ней признаков заболевания в распоряжении имеется несколько коммерческих вакцин, которые используются во всем мире в очень больших количествах. К различным типам вакцин против PCV2 относятся, например: вакцина на основе инактивированного целого вируса PCV2 (Circovac™, Merial) или на основе инактивированного химерного PCV1/PCV2 вируса (Suvaxyn™ PCV, Fostera™ PCV, Zoetis). Однако наиболее распространенной является субъединичная вакцина на основе рекомбинантного экспрессированного капсидного белка PCV2, обычно называемого белком ORF2 (Ingelvac™ CircoFLEX, Boehringer Ingelheim; и: Circumvent™ PCV, Porcilis™ PCV, MSD AH). Субъединичную вакцину на основе белка ORF2 обычно получают путем экспрессии гена ORF2 PCV2 в рекомбинантной экспрессионной системе; самой используемой является бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых. Экспрессированный белок ORF2 подвергается самосборке в вирусоподобные частицы (VLP), которые напоминают нативный PCV2 вирион, за исключением того, что в нем отсутствует содержимое в виде вирусного генома, и, следовательно, он не способен к репликации. Вакцины на основе таких VLP из ORF2 PCV2 являются очень стабильными, высокоиммуногенными при приготовлении вместе с адъювантом и, как было продемонстрировано, являются безопасными для свиней всех возрастов, независимо от того, являются ли они серопозитивными по антителам против PCV2 или нет. Типичная полная доза вакцины на основе белка ORF2 PCV2 содержит приблизительно 80 мкг белка ORF2 в объеме дозы, составляющем 2 мл на животное. Однако эти субъединичные вакцины являются эффективными уже в дозе, составляющей приблизительно 20 мкг ORF2 на животное, см. EP 1926496. Также их можно вводить в качестве вакцины для однократного введения, и их можно вводить с использованием различных путей введения, таких как внутримышечный (IM), подкожный (SC) или внутрикожный (ID).Several commercial vaccines are available to protect against PCV2 infection and associated disease symptoms and are used worldwide in very large quantities. Various types of PCV2 vaccines include, for example: an inactivated whole PCV2 virus vaccine (Circovac™, Merial) or an inactivated chimeric PCV1/PCV2 virus vaccine (Suvaxyn™ PCV, Fostera™ PCV, Zoetis). However, the most commonly used subunit vaccine is based on the recombinant expressed PCV2 capsid protein, commonly referred to as the ORF2 protein (Ingelvac™ CircoFLEX, Boehringer Ingelheim; and: Circumvent™ PCV, Porcilis™ PCV, MSD AH). A subunit vaccine based on the ORF2 protein is usually prepared by expressing the PCV2 ORF2 gene in a recombinant expression system; the most used is the baculovirus expression system in insect cells. The expressed ORF2 protein self-assembles into virus-like particles (VLPs) that resemble the native PCV2 virion, except that it lacks the contents of a viral genome and is therefore incapable of replication. Vaccines based on such PCV2 ORF2 VLPs are very stable, highly immunogenic when formulated with an adjuvant, and have been shown to be safe in pigs of all ages, whether they are PCV2 antibody seropositive or not. A typical full dose PCV2 ORF2 protein vaccine contains approximately 80 μg ORF2 protein in a dose volume of 2 ml per animal. However, these subunit vaccines are effective already at a dose of approximately 20 μg of ORF2 per animal, see EP 1926496. They can also be administered as a single dose vaccine and can be administered using various routes of administration such as intramuscular (IM) , subcutaneous (SC) or intradermal (ID).

Внутри вида PCV2 существуют различные генотипы вируса. Их можно различить по генетическому расстоянию между их генами ORF2, и в прошлом использовались различные соглашения о наименовании. Однако Segales et al. (2008, Vet. Rec, vol. 162, p. 867-868) опубликовал метод, который стал стандартом, которого в настоящее время придерживаются для определения и наименования генотипов PCV2. Из 5 различных генотипов PCV2, которые распознаны в настоящее время, только три в настоящее время имеют ветеринарную значимость в данной области техники: PCV2a, PCV2b и PCV2d.Within the PCV2 species, there are different genotypes of the virus. They can be distinguished by the genetic distance between their ORF2 genes and various naming conventions have been used in the past. However, Segales et al. (2008, Vet. Rec, vol. 162, p. 867-868) published a method that has become the standard currently followed for defining and naming PCV2 genotypes. Of the 5 different PCV2 genotypes that are currently recognized, only three currently have veterinary relevance in the art: PCV2a, PCV2b and PCV2d.

Хотя все коммерческие вакцины против PCV2 в настоящее время основаны на PCV2a, генотипы PCV2b и 2d, по-видимому, увеличиваются по распространенности в этой области. В отношении обзора см.: Karuppannan & Opriessnig, 2017, Viruses, vol. 9, p. 9, doi: 10.3390/v9050099. Хотя эти авторы пришли к выводу, что между этими генотипами существует достаточный уровень перекрестного иммунитета, предпочитают, как правило, применять типологически гомологичные вакцины. Следовательно, в этой области существует потребность в производстве безопасных, дешевых и эффективных вакцин также для генотипов PCV2, отличных от PCV2a.Although all commercial PCV2 vaccines are currently based on PCV2a, the PCV2b and 2d genotypes appear to be increasing in prevalence in this area. For a review, see: Karuppannan & Opriessnig, 2017, Viruses, vol. 9, p. 9, doi: 10.3390/v9050099. Although these authors concluded that there is sufficient cross-immunity between these genotypes, typologically homologous vaccines are generally preferred. Therefore, there is a need in this field to produce safe, cheap and effective vaccines also for PCV2 genotypes other than PCV2a.

В WO 2009/000459 (University Gent) описана диагностика для идентификации антигенных или патогенных вариантов PCV2 на основе белка ORF2; в частности, способы и антитела, применимые для этой цели. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот описаны для ORF2 из двух штаммов PCV2b. Предложено несколько мутаций белка ORF2 для изменения профиля распознавания моноклональными антителами. Среди множества предложенных мутаций одна представляет собой замену треонина в аминокислотном положении 131 на пролин. Однако в WO 2009/000459 раскрыто в достаточной степени только серологическое тестирование немутированных (дикого типа) штаммов PCV2a (Stoon 1010, 1121) и PCV2b (48285), и раскрыта только экспрессия немутированного ORF2 одного из штаммов PCV2a дикого типа (Stoon 1010) в клетках насекомых.WO 2009/000459 (University Gent) describes a diagnostic for identifying antigenic or pathogenic PCV2 variants based on the ORF2 protein; in particular, methods and antibodies applicable for this purpose. The nucleic acid and amino acid sequences are described for ORF2 from two strains of PCV2b. Several mutations of the ORF2 protein have been proposed to change the recognition profile of monoclonal antibodies. Among the many proposed mutations, one is the replacement of threonine at amino acid position 131 with proline. However, WO 2009/000459 only sufficiently discloses serological testing of wild-type (wild-type) strains of PCV2a (Stoon 1010, 1121) and PCV2b (48285), and only discloses the expression of wild-type ORF2 of one of the wild-type strains of PCV2a (Stoon 1010) in cells insects.

Впоследствии Saha et al., 2012 (J. of Gen. Virol., vol. 93, p. 1548-1555) описывают, среди прочего, экспрессию белка ORF2 PCV2a с мутацией T131P в клетках PK-15 путем трансфекции инфекционными клонами мутированного PCV2 генома.Subsequently, Saha et al., 2012 (J. of Gen. Virol., vol. 93, p. 1548-1555) describe, inter alia, the expression of the T131P mutated PCV2a ORF2 protein in PK-15 cells by transfection with infectious clones of the mutated PCV2 genome .

В WO 2010/068969 (Vectogen) описаны способы противо-PCV2 вакцинации путем доставки ORF2 с помощью вирусного вектора, в соответствии с которыми белок ORF2 был мутирован путем замены или удаления «сигнала ядерной локализации», т.е. N-концевой 41 аминокислоты ORF2. В результате ORF2 затем становится экспрессируемым в цитоплазме или секретируется клетками, инфицированными вектором. Предпочтительным вирусным вектором является аденовирус свиньи.WO 2010/068969 (Vectogen) describes anti-PCV2 vaccination methods by delivering ORF2 with a viral vector, whereby the ORF2 protein has been mutated by replacing or removing the "nuclear localization signal", i. N-terminal 41 amino acids of ORF2. As a result, ORF2 then becomes expressed in the cytoplasm or secreted by cells infected with the vector. A preferred viral vector is porcine adenovirus.

В WO 2015/051099 (Boehringer-lngelheim) описаны способы увеличения уровня экспрессии белка ORF2 PCV2b и вирусоподобных частиц из него в бакуловирусной системе экспрессии в клетках насекомых путем введения мутации в кодирующую ORF2 последовательность PCV2b: раскрытая мутация представляет собой замену аргинина в аминокислотном положении 63, предпочтительно, на треонин. Нет никаких упоминаний о какой-либо мутации в аминокислотном положении 131 ORF2 PCV2b, и нет информации о каких-либо проблемах с экспрессией этого белка в клетках насекомых.WO 2015/051099 (Boehringer-lngelheim) describes methods for increasing the level of expression of the PCV2b ORF2 protein and virus-like particles from it in a baculovirus expression system in insect cells by introducing a mutation in the PCV2b ORF2 coding sequence: the disclosed mutation is a substitution of arginine at amino acid position 63, preferably threonine. There is no mention of any mutation at amino acid position 131 of PCV2b ORF2, and there is no information about any problems with the expression of this protein in insect cells.

В EP 17184630 (Intervet Int. BV) раскрыто, что в случае вакцины против PCV2, как было обнаружено, белок ORF2 генотипа PCV2b обеспечивает не только гомологичный иммунитет, но также хороший перекрестный иммунитет к гетерологичным генотипам PCV2a и PCV2d. Также этот эффект неожиданно был получен даже в случае очень низких количеств, составляющих менее 20 мкг белка ORF2 PCV2b в каждой дозе для животного. Следовательно, будет достаточно вакцинировать свиней низкой дозой белка ORF2 PCV2b для обеспечения эффективной иммунной защиты от всех существующих штаммов PCV2.EP 17184630 (Intervet Int. BV) discloses that in the case of a PCV2 vaccine, the ORF2 protein of the PCV2b genotype was found to provide not only homologous immunity, but also good cross-immunity to the heterologous PCV2a and PCV2d genotypes. Also, this effect was unexpectedly obtained even at very low amounts of less than 20 μg of PCV2b ORF2 protein per animal dose. Therefore, it will be sufficient to vaccinate pigs with a low dose of PCV2b ORF2 protein to provide effective immune protection against all existing strains of PCV2.

Использование клеток насекомых для рекомбинантной экспрессии белка хорошо известно и применяется по-разному: экспрессии у живых насекомых, в первичных клетках насекомых или в линиях иммортализованных клеток насекомых в культуре. Наиболее используемые клетки насекомых происходят от отряда Lepidopteran (чешуекрылых), например, от родов Spodoptera или Trichoplusia. Использование этих клеток часто происходит в связи с популярной бакуловирусной системой экспрессии в клетках насекомых, причем рекомбинантный бакуловирус используется для инфицирования клеток чешуекрылых в культуре. Бакуловирус содержит ряд сильных промоторов, которые не требуются, когда вирус реплицируется в культуре клеток; а значит, они могут быть использованы для управления экспрессией гетерологичного гена.The use of insect cells for recombinant protein expression is well known and has been used in a variety of ways: expression in live insects, in primary insect cells, or in cultured immortalized insect cell lines. The most used insect cells come from the order Lepidopteran (Lepidoptera), for example from the genera Spodoptera or Trichoplusia. The use of these cells is often in connection with the popular baculovirus expression system in insect cells, with recombinant baculovirus being used to infect Lepidoptera cells in culture. Baculovirus contains a number of strong promoters that are not required when the virus replicates in cell culture; hence, they can be used to direct the expression of a heterologous gene.

Задачей настоящего изобретения является преодоление недостатка предшествующего уровня техники и удовлетворение потребности в данной области путем обеспечения способа оптимизации рекомбинантной экспрессии белка ORF2 PCV2 в клетках насекомых.It is an object of the present invention to overcome the disadvantage of the prior art and satisfy the need in the art by providing a method for optimizing recombinant PCV2 ORF2 protein expression in insect cells.

При исследовании приготовления вакцин против PCV2 на основе белковых субъединиц ORF2 авторы настоящего изобретения обнаружили, что рекомбинантная экспрессия белка ORF2 вирусных штаммов с генотипом PCV2b в клетках насекомых не была такой простой, как в случае белка ORF2 генотипа PCV2a. Было обнаружено, что экспрессированный белок ORF2 PCV2b по своей природе склонен к накапливанию в ядре клеток насекомых, в которых он экспрессировался. В этой форме общие уровни экспрессии белка ORF2 PCV2b были значительно снижены, и оказалось, что белок очень трудно собирать и очищать с помощью последующей обработки; даже при использовании агрессивной диссоциации могли быть выделены лишь очень небольшие количества белка ORF2. К тому же, в небольших количествах белка, которые могли быть выделены, количество VLP было очень низким; ядерная локализация, по-видимому, не позволяла белку ORF2 подвергаться в значительной степени самосборке в VLP. В результате иммуногенность этого экспрессированного белка была значительно уменьшенной.In studying the preparation of PCV2 vaccines based on ORF2 protein subunits, the present inventors found that recombinant expression of the PCV2b genotype ORF2 protein in insect cells was not as easy as the PCV2a genotype ORF2 protein. It has been found that the expressed PCV2b ORF2 protein is inherently prone to accumulating in the nucleus of the insect cells in which it is expressed. In this form, the overall expression levels of the PCV2b ORF2 protein were significantly reduced, and the protein proved to be very difficult to assemble and purify by post-processing; even using aggressive dissociation, only very small amounts of the ORF2 protein could be isolated. Also, in the small amounts of protein that could be isolated, the amount of VLP was very low; nuclear localization appears to have prevented the ORF2 protein from being largely self-assembled into the VLP. As a result, the immunogenicity of this expressed protein was significantly reduced.

Неожиданно было обнаружено, что когда в белок ORF2 PCV2b вводится очень специфическая аминокислотная замена, накопление в ядре при экспрессии в клетках насекомых может быть в значительной степени предотвращено.Surprisingly, it has been found that when a very specific amino acid substitution is introduced into the PCV2b ORF2 protein, accumulation in the nucleus when expressed in insect cells can be largely prevented.

Специфическая аминокислотная замена включала замену аминокислоты, встречающейся в природе в положении 131 полноразмерного белка ORF2 PCV2b, на аминокислоту пролин. В случае пролина в положении 131 большая часть экспрессированного мутантного белка ORF2 PCV2b («ORF2b-131P») впоследствии находилась в цитоплазме клетки насекомого, а не накапливалась в ядре. Было обнаружено, что это увеличивает общие уровни экспрессии, а также значительно облегчает сбор мутантного белка ORF2 PCV2b из этих клеток насекомых; в этом цитоплазматическом состоянии можно использовать стандартные щадящие способы выделения, чтобы можно было бы легко выделить большие количества белка. К тому же было обнаружено, что большая часть ORF2b-131P эффективно собирается в VLP, которые являются очень эффективными в вакцине против PCV2 для животных в виде свиней.The specific amino acid substitution involved replacing the naturally occurring amino acid at position 131 of the full length PCV2b ORF2 protein with the amino acid proline. In the case of the proline at position 131, most of the expressed PCV2b ORF2 mutant protein ("ORF2b-131P") subsequently resided in the cytoplasm of the insect cell rather than accumulating in the nucleus. This was found to increase overall expression levels as well as greatly facilitate the collection of the PCV2b ORF2 mutant protein from these insect cells; in this cytoplasmic state, standard gentle isolation techniques can be used so that large amounts of protein can be easily isolated. In addition, most of the ORF2b-131P was found to efficiently assemble into VLPs, which are very effective in the PCV2 vaccine for porcine animals.

Это было неожиданно, особенно по сравнению с ситуацией с белком ORF2 PCV2a: в то время как в белке ORF2 вируса PCV2b встречающейся в природе аминокислотой в положении 131, как правило, является треонин; в вирусах PCV2a у некоторых в положении 131 находится треонин, и у некоторых - пролин. Однако при экспрессии в клетках насекомых ни один из двух вариантов ORF2 PCV2a не накапливается в ядре. Следовательно, не было никаких оснований предполагать, что именно это положение аминокислоты будет причиной накопления в ядре, наблюдаемого в случае белка ORF2 PCV2b при экспрессии в клетках насекомых.This was unexpected, especially when compared to the situation with the PCV2a ORF2 protein: while in the PCV2b ORF2 protein, the naturally occurring amino acid at position 131 is typically threonine; in PCV2a viruses, some have threonine at position 131, and some have proline. However, when expressed in insect cells, neither of the two PCV2a ORF2 variants accumulates in the nucleus. Therefore, there was no evidence to suggest that this particular amino acid position would be responsible for the nuclear accumulation observed in the PCV2b ORF2 protein when expressed in insect cells.

Еще более примечательным было то, что белок ORF2 PCV2d, который также демонстрирует накопление в ядре при экспрессии в клетках насекомых, не мог быть изменен на цитоплазматический профиль экспрессии после замены его природного треонина в положении 131 на пролин.Even more remarkable was that the PCV2d ORF2 protein, which also shows nuclear accumulation when expressed in insect cells, could not be changed to a cytoplasmic expression profile after replacing its natural threonine at position 131 with proline.

По-видимому, ситуация вокруг экспрессии белка ORF2 PCV2 в клетках насекомых является уникальной для каждого из генотипов.Apparently, the situation around PCV2 ORF2 protein expression in insect cells is unique for each of the genotypes.

Неизвестно, каким образом замена аминокислоты на 131P предотвращает накопление белка ORF2 PCV2b в ядре при экспрессии в клетках насекомых. Хотя авторы настоящего изобретения не хотят ограничиваться какой-либо теорией или моделью, которая могла бы объяснить эти данные, они предполагают, что наличие аминокислоты пролина в этом конкретном положении в белке ORF2 генотипа PCV2b вызывает изменение свойств этого белка ORF2. Изменение может, например, повлиять на трехмерное свертывание или профиль гидрофобности белка ORF2, что может повлиять на его маршрут внутри клетки насекомого.It is not known how the amino acid change to 131P prevents PCV2b ORF2 from accumulating in the nucleus when expressed in insect cells. Although the present inventors do not wish to be bound by any theory or model that could explain these data, they suggest that the presence of the amino acid proline at this particular position in the PCV2b genotype ORF2 protein causes a change in the properties of this ORF2 protein. The change may, for example, affect the three-dimensional folding or hydrophobicity profile of the ORF2 protein, which may affect its route within the insect cell.

Это открытие открывает путь для ряда выгодных применений в результате улучшения возможности получения и антигенного качества рекомбинантно экспрессируемого белка ORF2 PCV2b. Это, в свою очередь, позволяет удобно производить в больших масштабах эффективные субъединичные вакцины против PCV2 для свиней; поскольку для его выделения не требуются агрессивные диссоциирующие соединения или сложные методы, экспрессируемый белок может быть получен дешевым, безопасным и эффективным способом.This discovery paves the way for a number of beneficial applications by improving the availability and antigenic quality of the recombinantly expressed PCV2b ORF2 protein. This, in turn, allows convenient large-scale production of effective PCV2 subunit vaccines for pigs; since it does not require aggressive dissociating compounds or complicated methods to isolate it, the expressed protein can be obtained in a cheap, safe and efficient manner.

Таким образом, одна или более целей настоящего изобретения могут быть достигнуты, и, следовательно, может быть преодолен один или более недостатков предшествующего уровня техники.In this way, one or more of the objectives of the present invention can be achieved and, therefore, one or more of the disadvantages of the prior art can be overcome.

Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к клеткам насекомых, содержащим гетерологичную нуклеиновую кислоту, включающую:Therefore, in one aspect, the present invention relates to insect cells containing a heterologous nucleic acid, including:

a. нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 цирковируса 2 свиней с генотипом 2b (PCV2b), иa. a nucleotide sequence encoding the ORF2 protein of porcine circovirus 2 genotype 2b (PCV2b), and

b. контролирующую транскрипцию последовательность, которая функционально связана с указанной нуклеотидной последовательностью, отличающимся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует мутантный белок ORF2 PCV2b, имеющий пролин в аминокислотном положении 131.b. a transcription control sequence that is operably linked to said nucleotide sequence, characterized in that the nucleotide sequence encodes a mutant PCV2b ORF2 protein having a proline at amino acid position 131.

В случае настоящего изобретения «клетки насекомых» представляют собой клетки, происходящие из организма класса Insecta. Клетки являются жизнеспособными (т.е. способными к репликации) и достаточно интактны, чтобы быть способными к экспрессии белка. Клетки могут быть покоящимися или активными и могут находиться на любой стадии клеточного цикла. Клетки насекомых могут использоваться для настоящего изобретения различными путями: либо путем использования целого насекомого; путем использования экстракта или части насекомого; путем использования первичных клеток, происходящих от насекомого; путем использования ткани или органа насекомого; или путем использования линии иммортализованных клеток насекомых.In the case of the present invention, "insect cells" are cells derived from an organism of the class Insecta. The cells are viable (ie capable of replication) and intact enough to be capable of expressing the protein. Cells may be quiescent or active and may be at any stage of the cell cycle. Insect cells can be used for the present invention in various ways: either by using the whole insect; by using an extract or part of an insect; by using primary cells derived from the insect; by using the tissue or organ of an insect; or by using an immortalized insect cell line.

Клетки насекомых по настоящему изобретению обычно будут содержаться в подходящем носителе. Такой носитель представляет собой композицию, которая поддерживает жизнеспособность клеток насекомых, и представляет собой, например, жидкость, такую как забуференный раствор или культуральная среда. В связи с использованием целых насекомых организм самого насекомого функционирует в качестве носителя.The insect cells of the present invention will usually be contained in a suitable carrier. Such a carrier is a composition that maintains the viability of insect cells, and is, for example, a liquid such as a buffered solution or a culture medium. In connection with the use of whole insects, the body of the insect itself functions as a carrier.

Используемый здесь термин «содержащий (включающий)» (а также такие варианты, как «содержат», «содержит» и «содержащийся») обозначает все элементы и в любой вероятной комбинации, возможной в случае настоящего изобретения, которые охватываются или включены в раздел текста, абзац текста, пункт формулы и т. д., в котором этот термин используется, даже если такие элементы или комбинации не указаны явно; а не к исключению любого из таких элементов или комбинаций.As used herein, the term "comprising (including)" (as well as variants such as "comprise", "comprises" and "contained") means all elements and in any possible combination possible in the case of the present invention, which are covered or included in a section of the text , paragraph of text, claim, etc., in which this term is used, even if such elements or combinations are not explicitly indicated; and not to the exclusion of any of such elements or combinations.

Таким образом, любой такой раздел текста, абзац текста, пункт формулы изобретения и т.д. может также относиться к одному или более вариантов осуществления, в которых термин «содержащий» (или его варианты) заменен такими терминами, как «состоят из», «состоящие из» или «по существу состоят из».Thus, any such section of text, paragraph of text, claim, etc. may also refer to one or more embodiments in which the term "comprising" (or variations thereof) is replaced by terms such as "consist of", "consisting of", or "essentially consist of".

В случае настоящего изобретения нуклеиновая кислота является« гетерологичной» по отношению к клеткам насекомых, которые ее содержат, если нуклеиновая кислота не присутствовала в нуклеиновых кислотах исходных клеток насекомых, от которых происходят эти клетки. Нуклеиновая кислота может быть любого типа, например ДНК или РНК.In the case of the present invention, a nucleic acid is "heterologous" with respect to the insect cells that contain it, if the nucleic acid was not present in the nucleic acids of the original insect cells from which these cells are derived. The nucleic acid can be of any type, such as DNA or RNA.

Гетерологичная нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением может быть введена в клетки насекомых по настоящему изобретению различными путями, такими как трансфекция или электропорация нуклеиновой кислоты, возможно на носителе; альтернативно, путем инфицирования рекомбинантным микроорганизмом, например вирусом.The heterologous nucleic acid of the present invention may be introduced into the insect cells of the present invention by various routes, such as transfection or electroporation of the nucleic acid, optionally on a carrier; alternatively, by infection with a recombinant microorganism, such as a virus.

Нуклеотидная последовательность «кодирует», или что-то подобное «кодирует» белок, когда транскрипция и/или трансляция с нее приводит к тому, что этот белок экспрессируется. Как правило, такая нуклеотидная последовательность, способная кодировать белок, называется открытой рамкой считывания (ORF), что указывает на отсутствие нежелательных стоп-кодонов, которые преждевременно прекращали бы трансляцию белка. Такая нуклеотидная последовательность может представлять собой ген, кодирующий полный белок, или может представлять собой фрагмент гена, кодирующий часть белка, например, кодирующий только зрелую или секретируемую форму белка, т.е. без «лидерной», «якорной» или «сигнальной последовательности». Нуклеотидная последовательность может быть природного или синтетического происхождения.A nucleotide sequence "encodes" or the like "encodes" a protein when transcription and/or translation from it results in that protein being expressed. Typically, such a nucleotide sequence capable of encoding a protein is referred to as an open reading frame (ORF), indicating the absence of unwanted stop codons that would prematurely stop translation of the protein. Such a nucleotide sequence may be a gene encoding a complete protein, or may be a gene fragment encoding a portion of a protein, such as encoding only the mature or secreted form of the protein, i. without "leader", "anchor" or "signal sequence". The nucleotide sequence may be of natural or synthetic origin.

В случае настоящего изобретения «белок» представляет собой молекулярную цепь аминокислот. Белок может быть нативным или зрелым белком, пре- или про-белком или частью белка. Среди прочего: пептиды, олигопептиды и полипептиды включены в определение белка.In the case of the present invention, a "protein" is a molecular chain of amino acids. The protein may be a native or mature protein, a pre- or pro-protein, or a portion of a protein. Among others: peptides, oligopeptides and polypeptides are included in the definition of protein.

Белок «ORF2» по настоящему изобретению относится к белку, кодируемому открытой рамкой считывания 2 (ORF2) в геноме PCV или частью ORF2. Полноразмерный белок ORF2 PCV2 обычно имеет длину в 233 аминокислоты и при исследовании с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (SDS-ПААГ) проявляет относительную молекулярную массу, составляющую приблизительно 26 кДа. Однако хорошо известны и могут преимущественно использоваться для настоящего изобретения усеченные формы белка ORF2, например усеченная форма белка ORF2 PCV2, в которой отсутствует 30 аминокислот с его N-конца. Белок ORF2 также называется капсидом, а кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты называется геном ORF2 или геном капсида.The "ORF2" protein of the present invention refers to a protein encoded by open reading frame 2 (ORF2) in the PCV genome or part of ORF2. The full-length PCV2 ORF2 protein is typically 233 amino acids long and, when examined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), exhibits a relative molecular weight of approximately 26 kDa. However, truncated forms of the ORF2 protein are well known and can advantageously be used for the present invention, such as a truncated form of the PCV2 ORF2 protein that lacks 30 amino acids from its N-terminus. The ORF2 protein is also called the capsid, and the nucleic acid coding sequence is called the ORF2 gene or capsid gene.

Компьютерные программы, которые могут помочь в анализе кодирующих областей и удобно представляют такую информацию, коммерчески доступны от различных поставщиков.Computer programs that can assist in the analysis of coding regions and conveniently present such information are commercially available from various vendors.

«Цирковирус 2 свиней» или PCV2 относится к цирковирусу этого вида, имеющему характерные признаки членов его таксономической группы, такие как морфологические, геномные и биохимические характеристики, а также биологические характеристики, например физиологические, иммунологические, или патологическое поведение."Porcine circovirus 2" or PCV2 refers to a circovirus of this species that has characteristic features of members of its taxonomic group, such as morphological, genomic, and biochemical characteristics, as well as biological characteristics, such as physiological, immunological, or pathological behavior.

Как известно в данной области, классификация микроорганизма как отдельного вида основана на комбинации таких признаков. Следовательно, настоящее изобретение также включает PCV2, которые подклассифицируются от него любым образом, например, как подвид, штамм, изолят, генотип, вариант, подтип или подгруппа и т.п.As is known in the art, the classification of a microorganism as a distinct species is based on a combination of such features. Therefore, the present invention also includes PCV2 that are subclassified from it in any manner, such as subspecies, strain, isolate, genotype, variant, subtype, or subgroup, and the like.

Специалисту в области техники настоящего изобретения будет очевидно, что, хотя конкретный PCV2 по настоящему изобретению может в настоящее время быть отнесен к этому виду, однако это таксономическая классификация, которая может измениться со временем, поскольку новые идеи могут привести к переклассификации в новую или отличную таксономическую группу. Однако, поскольку это не меняет сам микроорганизм или его антигенный спектр, а только его научное название или классификацию, такие переклассифицированные микроорганизмы остаются в пределах объема настоящего изобретения.It will be apparent to one skilled in the art of the present invention that while the particular PCV2 of the present invention may currently be assigned to this species, this is a taxonomic classification that may change over time as new ideas may lead to reclassification to a new or different taxonomic group. However, since this does not change the microorganism itself or its antigenic spectrum, but only its scientific name or classification, such reclassified microorganisms remain within the scope of the present invention.

PCV2 для применения в настоящем изобретении может быть получен из ряда источников, например, в виде полевого изолята от свиньи в дикой природе или на ферме, или из различных лабораторий, (депозитарных) учреждений или (ветеринарных) университетов. В качестве альтернативы, PCV2 может быть воссоздан исходя из цифровой информации о последовательности, путем синтеза его геномной нуклеиновой кислоты и ее трансфекции в соответствующие клетки.PCV2 for use in the present invention can be obtained from a number of sources, for example, as a field isolate from a pig in the wild or on a farm, or from various laboratories, (depository) institutions or (veterinary) universities. Alternatively, PCV2 can be reconstructed from the digital sequence information by synthesizing its genomic nucleic acid and transfecting it into appropriate cells.

Генотипирование PCV2 осуществляется путем сравнения нуклеотидных последовательностей. В случае настоящего изобретения «PCV2 с генотипом 2b» или «PCV2b» представляет собой вирус PCV2, который относится к группе b генотипа, используя метод Segales et al. (2008, Vet. rec. vol. 162, p. 867-868). В этом методе используется генотипирование PCV2 на основе P-расстояния между генами ORF2 PCV2, т.е. отношения нуклеотидов, которые различаются между двумя генами ORF2 PCV2, к общему числу нуклеотидов их гена ORF2 PCV2. Отсечка для различных генотипов PCV2, идентифицированных по Segales et al., находится на равном 0,035 значении Р-расстояния для ORF2; поэтому, когда Р-разница меньше, две последовательности относятся к одному и тому же генотипу.PCV2 genotyping is carried out by comparing nucleotide sequences. In the case of the present invention, "PCV2 genotype 2b" or "PCV2b" is a PCV2 virus that belongs to genotype group b using the method of Segales et al. (2008, Vet. rec. vol. 162, p. 867-868). This method uses PCV2 genotyping based on the P-distance between PCV2 ORF2 genes, i.e. the ratio of nucleotides that differ between two PCV2 ORF2 genes to the total number of nucleotides of their PCV2 ORF2 gene. The cut-off for the various PCV2 genotypes identified by Segales et al. is at the 0.035 P-distance value for ORF2; therefore, when the P-difference is smaller, the two sequences belong to the same genotype.

В случае настоящего изобретения эталонным вирусом PCV2 с генотипом 2b является изолят «Imp.1011», также известный как штамм 48285, последовательность генома которого опубликована в GenBank™ под номером доступа: AF055394.In the case of the present invention, the reference genotype 2b PCV2 virus is the "Imp.1011" isolate, also known as strain 48285, whose genome sequence is published in GenBank™ under accession number: AF055394.

Следовательно, любой вирус PCV2, характеризующийся составляющим менее 0,035 Р-расстоянием между его геном ORF2 и геном ORF2 штамма 48285, рассчитанным с использованием метода Segales et al. (выше), является вирусом PCV2b по настоящему изобретению.Therefore, any PCV2 virus with less than 0.035 P-distance between its ORF2 gene and the ORF2 gene of strain 48285 calculated using the method of Segales et al. (above) is the PCV2b virus of the present invention.

Однако, и это будет понятно специалисту, поскольку геном PCV является одноцепочечным и кольцевым, кодирующая область гена ORF2 может сразу не быть очевидной из конкретной линейной нуклеотидной последовательности, и может потребовать подвергание нуклеотидной последовательности инвертированию, комплементации и/или повороту. Например: в геномной последовательности штамма 48285 PCV2b под номером доступа в GenBank: AF055394, ген ORF2 простирается в опубликованной линейной цепи от нуклеотида под номером 314 до нуклеотида 1 и продолжается от нуклеотида 1767 вплоть до и включительно нуклеотида 1383; вместе это представляет 699 нуклеотидов гена ORF2 (не включая стоп-кодон) и кодируется цепью, комплементарной этой области опубликованной цепи. Опять же, такой анализ и представление кодирующих областей может быть удобно выполнен с использованием коммерчески доступной компьютерной программы.However, and it will be appreciated by those skilled in the art, since the PCV genome is single stranded and circular, the coding region of the ORF2 gene may not be immediately apparent from a particular linear nucleotide sequence, and may require the nucleotide sequence to be subjected to inversion, complementation, and/or rotation. For example: in the genomic sequence of strain 48285 PCV2b GenBank accession number: AF055394, the ORF2 gene extends in the published linear chain from nucleotide number 314 to nucleotide 1 and extends from nucleotide 1767 up to and including nucleotide 1383; together this represents 699 nucleotides of the ORF2 gene (not including the stop codon) and is encoded by a strand complementary to this region of the published strand. Again, such analysis and presentation of coding regions can be conveniently performed using a commercially available computer program.

Аналогичный подход используется для «генотипа 2a PCV2» (PCV2a) и «генотипа 2d PCV2» (PCV2d), как здесь используется; эталонным вирусом для PCV2a является изолят «Imp.1010», он же «Stoon 1010», с номером доступа: AF055392; а эталонным вирусом для PCV2d является изолят «S99-1542/3a», с номером доступа JX512856.A similar approach is used for "PCV2 genotype 2a" (PCV2a) and "PCV2 genotype 2d" (PCV2d), as used here; the reference virus for PCV2a is the isolate "Imp.1010", aka "Stoon 1010", with accession number: AF055392; and the reference virus for PCV2d is isolate "S99-1542/3a", accession number JX512856.

Способы идентификации вируса как вируса PCV2, определения нуклеотидной последовательности его гена ORF2 и вычисления P-расстояния по сравнению с геном ORF2 штамма 48285 хорошо известны и легкодоступны специалисту в области техники настоящего изобретения.Methods for identifying a virus as a PCV2 virus, determining the nucleotide sequence of its ORF2 gene, and calculating the P-distance compared to the 48285 strain ORF2 gene are well known and readily available to one skilled in the art of the present invention.

«Контролирующая транскрипцию последовательность» представляет собой функциональную область нуклеиновой кислоты, обычно в ДНК, которая посредством связывания контролирующих факторов индуцирует механизм экспрессии белка в клетке, чтобы инициировать и осуществлять транскрипцию ДНК в РНК расположенной ниже (3’) кодирующей области. Такая контролирующая транскрипцию область (TCR) также может называться промотором и обычно содержит ряд регуляторных областей, таких как «сайт инициации транскрипции», расположенный 5’ на расстоянии приблизительно 30-40 нуклеотидов от первого инициирующего кодона. Другими хорошо известными консервативными элементами являются TATA-блок, CAAT-блок и GC-блок. TCR также может включать так называемый энхансер, который участвует в связывании регуляторных факторов, которые могут влиять на время, продолжительность, условия и уровень транскрипции.A "transcriptional control sequence" is a functional region of a nucleic acid, usually in DNA, which, through the binding of control factors, induces a protein expression mechanism in a cell to initiate and effect transcription of the DNA into an RNA downstream (3') coding region. Such a transcription control region (TCR) may also be referred to as a promoter and typically contains a number of regulatory regions such as a "transcriptional initiation site" located 5' approximately 30-40 nucleotides from the first initiation codon. Other well-known conservative elements are the TATA block, the CAAT block, and the GC block. The TCR may also include a so-called enhancer that is involved in the binding of regulatory factors that can influence the timing, duration, conditions, and level of transcription.

Следовательно, транскрипция (и последующая трансляция) может иметь временную или постоянную природу, т.е. быть транзиторной или постоянной экспрессией, в зависимости от особенностей используемой TCR и генетической конструкции в целом.Therefore, transcription (and subsequent translation) can be either temporary or permanent, i.e. be transient or permanent expression, depending on the characteristics of the TCR used and the genetic construct in general.

TCR для экспрессии (гетерологичного) гена должна быть способна к эффективному управлению транскрипцией находящейся 3’ кодирующей области. Это обычно называют TCR, «функционально связанной» с геном, так что ген находится «под контролем» или «управляется» TCR. Это обычно означает, что TCR и кодирующая область соединены в одной и той же молекуле в эффективной близости и без сигналов или последовательностей между ними, которые могли бы быть помехой для эффективной транскрипции.A TCR for expression of a (heterologous) gene must be capable of efficiently directing the transcription of the 3' coding region. This is commonly referred to as the TCR being "operably linked" to the gene such that the gene is "under the control" or "driven" by the TCR. This usually means that the TCR and the coding region are connected in the same molecule in effective proximity and without signals or sequences between them that could interfere with efficient transcription.

Термины «мутантный белок ORF2 PCV2b» служат для указания на то, что экспрессированный белок ORF2 PCV2b не идентичен варианту этого белка дикого типа, но содержит мутацию. Такая мутация может быть введена различными способами, используя методы in vivo или in vitro. Однако самым эффективным является использование технологии рекомбинантных ДНК для субклонирование гена ORF2 PCV2b в бактериальную плазмиду и использования, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и синтетических праймеров для введения желаемой мутации в желаемом месте. Подробности представлены в примерах ниже. При таком подходе, например, манипулировали последовательностью ДНК исходного гена ORF2 PCV2b, с номером доступа в GenBank: AF055394, в результате чего триплет нуклеотидов дикого типа, кодирующий треонин в аминокислотном положении 131: 5'-ака-3', был мутирован в триплет: 5'-ccc-3', кодирующий пролин.The terms "mutant PCV2b ORF2 protein" are used to indicate that the expressed PCV2b ORF2 protein is not identical to the wild-type variant of this protein, but contains a mutation. Such a mutation can be introduced in various ways using in vivo or in vitro methods. However, it is most efficient to use recombinant DNA technology to subclone the PCV2b ORF2 gene into a bacterial plasmid and use, for example, polymerase chain reaction (PCR) and synthetic primers to introduce the desired mutation at the desired location. Details are provided in the examples below. With this approach, for example, the DNA sequence of the original PCV2b ORF2 gene, with GenBank accession number: AF055394, was manipulated, as a result of which the wild-type nucleotide triplet encoding threonine at amino acid position 131: 5'-aka-3' was mutated into the triplet: 5'-ccc-3' encoding proline.

Дальнейшие манипуляции могут быть применены при оптимизации частоты использования кодонов в гене ORF2, чтобы он больше соответствовал предпочтениям кодонов в клетках насекомых и/или бакуловируса. Например, используя предпочтение кодонов в гене полиэдрина бакуловируса AcMNPV, как опубликовано в: Hooft van Iddekinge et al., 1983, Virology, vol. 131, p. 561-565. Концепция оптимизации частоты использования кодонов в гене для гетерологичной экспрессии хорошо известна; как правило, все такие мутации являются молчащими, что означает, что, хотя кодирующая нуклеотидная последовательность изменяется, не меняется аминокислотная последовательность кодируемого белка. Подробности приведены в примерах.Further manipulations can be applied in optimizing the codon frequency in the ORF2 gene to better match codon preferences in insect and/or baculovirus cells. For example, using codon preference in the AcMNPV baculovirus polyhedrin gene, as published in: Hooft van Iddekinge et al., 1983, Virology, vol. 131, p. 561-565. The concept of optimizing the frequency of codon usage in a gene for heterologous expression is well known; as a rule, all such mutations are silent, which means that although the coding nucleotide sequence is changed, the amino acid sequence of the encoded protein does not change. See examples for details.

Было установлено, что оптимизация частоты использования кодонов повышает уровень экспрессии белка ORF2 в клетках насекомых. В минимальной степени также изменялась ядерная локализацию белка ORF2 PCV2b дикого типа при экспрессии в клетках насекомых. Однако существенное предотвращение накопления в ядре клеток насекомых могло быть достигнуто только в случае белка ORF2 из PCV2b при замене аминокислоты в положении 131 на пролин.It was found that the optimization of the frequency of use of codons increases the level of expression of the ORF2 protein in insect cells. The nuclear localization of wild-type PCV2b ORF2 protein was also minimally altered when expressed in insect cells. However, a significant prevention of accumulation in the nucleus of insect cells could only be achieved in the case of the ORF2 protein from PCV2b by replacing the amino acid at position 131 with proline.

В случае настоящего изобретения «дикий тип» относится к форме (микро)организма, в которой он встречается в дикой природе, например: форме исходного организма до того, как он был изменен в результате вмешательства человека.In the case of the present invention, "wild type" refers to the form of the (micro)organism in which it occurs in the wild, for example: the form of the original organism before it was altered by human intervention.

Создание, конструирование и сборка гетерологичной нуклеиновой кислоты, экспрессирующей мутантный белок ORF2 PCV2b по настоящему изобретению, может быть осуществлено с помощью хорошо известных молекулярно-биологических методов, включающих клонирование, трансфекцию, рекомбинацию, отбор и амплификацию. Эти и другие методы подробно объясняются в стандартных учебниках, таких как Sambrook & Russell: “Molecular cloning: a laboratory manual” (2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN: 0879695773); Ausubel et al., in: Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley and Sons Inc., NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach & G. Dveksler: “PCR primers: a laboratory manual” (CSHL Press, ISBN 0879696540); и “PCR protocols”, by: J. Bartlett and D. Stirling (Humana press, ISBN: 0896036421).The creation, construction and assembly of a heterologous nucleic acid expressing a mutant PCV2b ORF2 protein of the present invention can be carried out using well-known molecular biological techniques, including cloning, transfection, recombination, selection and amplification. These and other methods are explained in detail in standard textbooks such as Sambrook & Russell: “Molecular cloning: a laboratory manual” (2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN: 0879695773); Ausubel et al., in: Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley and Sons Inc., NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach & G. Dveksler: “PCR primers: a laboratory manual” (CSHL Press, ISBN 0879696540); and “PCR protocols”, by: J. Bartlett and D. Stirling (Humana press, ISBN: 0896036421).

В случае настоящего изобретения конкретное «положение аминокислоты» пронумеровано на основе нумерации аминокислот в аминокислотной последовательности полноразмерного белка ORF2 эталонного штамма для этого генотипа PCV2. Для PCV2b эталонным штаммом является 48285, а полноразмерная аминокислотная последовательность его белка ORF2 опубликована в GenBank под номером доступа AAC35331.In the case of the present invention, a particular "amino acid position" is numbered based on the amino acid numbering in the amino acid sequence of the full-length ORF2 protein of the reference strain for that PCV2 genotype. For PCV2b, the reference strain is 48285, and the full amino acid sequence of its ORF2 protein is published in GenBank under accession number AAC35331.

Клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением могут экспрессировать ORF2b-131P; мутантный белок ORF2 PCV2b (почти всегда) больше не накапливается в ядре, а рассредоточивается по всей цитоплазме клетки насекомого. Это различие в клеточной локализации мутантного белка ORF2 PCV2b по сравнению с его немутированным аналогом может быть без труда обнаружено, среди прочего, с помощью (световой) микроскопии и визуализации с использованием иммунофлуоресцентной технологии. Подробности представлены в разделе «Примеры».Insect cells according to the present invention can express ORF2b-131P; the mutant PCV2b ORF2 protein (almost always) no longer accumulates in the nucleus, but is dispersed throughout the cytoplasm of the insect cell. This difference in cellular localization of the mutant PCV2b ORF2 protein compared to its non-mutated counterpart can be easily detected by (light) microscopy and imaging using immunofluorescence technology, among other things. Details are provided in the Examples section.

Было обнаружено, что остаточный уровень накопления белка ORF2b-131P в ядре несколько различается в зависимости от генетической конструкции, используемой для экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых: при экспрессии с помощью рекомбинантного бакуловируса, полученного с использованием системы Bac-to-Bac, все еще демонстрировалось некоторое накопление в ядре, например, приблизительно 10% от уровня, наблюдаемого для белка ORF2 PCV2b дикого типа. Однако когда мутантный белок получали из рекомбинантного бакуловируса, сконструированного с помощью системы ProEasy, больше не наблюдалось выявляемого накопления в ядре. К тому же, уровень экспрессии белка был выше, чем уровень, получаемый с помощью рекомбинантного бакуловируса Bac-Bac.It was found that the residual level of accumulation of the ORF2b-131P protein in the nucleus differs somewhat depending on the genetic construct used to express the mutant PCV2b ORF2 protein in insect cells: when expressed with a recombinant baculovirus obtained using the Bac-to-Bac system, all still showed some accumulation in the nucleus, for example, approximately 10% of the level observed for the PCV2b ORF2 protein of the wild type. However, when the mutant protein was obtained from a recombinant baculovirus constructed using the ProEasy system, no detectable accumulation in the nucleus was observed anymore. In addition, the protein expression level was higher than that obtained with recombinant Bac-Bac baculovirus.

Это, по-видимому, можно объяснить исходя из строения используемой генетической конструкции: рекомбинантные бакуловирусы, полученные из конструкций Bac-to-Bac, все еще несут элементы экспрессионной кассеты вектора для переноса в своем геноме, такие как транспозон и ген устойчивости к антибиотику. Они могут влиять на уровень репликации и экспрессии. Однако рекомбинанты ProEasy больше не несут такие дополнительные генетические элементы.This can probably be explained from the design of the genetic construct used: recombinant baculoviruses derived from Bac-to-Bac constructs still carry elements of the transfer vector expression cassette in their genome, such as the transposon and the antibiotic resistance gene. They can influence the level of replication and expression. However, ProEasy recombinants no longer carry these additional genetic elements.

Детали предпочтительных вариантов осуществления и другие аспекты настоящего изобретения будут описаны ниже.Details of preferred embodiments and other aspects of the present invention will be described below.

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая мутантный белок Orf2 PCV2b, была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов. Более предпочтительно, когда она была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов для соответствия предпочтению кодонов в гене полиэдрина бакуловируса AcMNPV.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding the mutant PCV2b Orf2 protein has been optimized for codon usage. More preferably, it has been optimized in terms of codon usage to match the codon preference in the AcMNPV baculovirus polyhedrin gene.

Наиболее предпочтительная нуклеотидная последовательность, кодирующая мутантный белок Orf2 PCV2b, представляет собой SEQ ID NO:1. Она представляет собой последовательность ORF2 штамма 48285 PCV2b, в которой триплет, кодирующий аминокислоту в положение 131, был мутирован в 5'-ccc-3', кодирующий пролин. К тому же, частота использования кодонов была адаптирована для соответствия предпочтению кодонов в гене полиэдрина AcMNPV. SEQ ID NO:2, в свою очередь, приводит последовательность белка ORF2b-131P, которая кодируется SEQ ID NO:1.The most preferred nucleotide sequence encoding the mutant PCV2b Orf2 protein is SEQ ID NO:1. It is the ORF2 sequence of PCV2b strain 48285 in which the triplet encoding the amino acid at position 131 has been mutated to 5'-ccc-3' encoding a proline. In addition, codon usage has been adapted to match the codon preference in the AcMNPV polyhedrin gene. SEQ ID NO:2, in turn, gives the sequence of the protein ORF2b-131P, which is encoded by SEQ ID NO:1.

В результате мутаций, применяемых к гену ORF2 PCV2b, в частности из-за оптимизации частоты использования кодонов, идентичность нуклеотидных последовательностей между SEQ ID NO:1 и соответствующей областью AF055394, геном ORF2b дикого типа, составляет 77,2%. Однако, поскольку мутации для оптимизации частоты использования кодонов являются молчащими, идентичность аминокислотных последовательностей между SEQ ID NO:2 и AAC35331 (которая является аминокислотной последовательностью белка ORF2 PCV2b дикого типа из штамма 48285) составляет 99,6%, а именно отличается только по аминокислоте в положении 131.As a result of the mutations applied to the PCV2b ORF2 gene, in particular due to optimization of codon usage, the nucleotide sequence identity between SEQ ID NO:1 and the corresponding region of AF055394, the wild-type ORF2b gene, is 77.2%. However, since the mutations to optimize codon usage are silent, the amino acid sequence identity between SEQ ID NO:2 and AAC35331 (which is the amino acid sequence of the wild-type PCV2b ORF2 protein from strain 48285) is 99.6%, namely, it differs only in amino acid in position 131.

Использование клеток от различных насекомых хорошо известно. Некоторые из них могут также использоваться в связи с бакуловирусной системой экспрессии в клетках насекомых, поскольку они могут быть инфицированы бакуловирусом. См., например: Chen et al., 2005, In vitro Cell. Dev. Biol. Anim., vol. 41, p. 43-49.The use of cells from various insects is well known. Some of them may also be used in connection with the baculovirus expression system in insect cells since they can be infected with baculovirus. See, for example: Chen et al., 2005, In vitro Cell. dev. Biol. Anim., vol. 41, p. 43-49.

Следовательно, в одном варианте осуществления клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомых, выбранных из группы, состоящей из: Autographa californica (пяденицы калифорнийской люцерновой), Spodoptera frugiperda (совки травяной), Spodoptera exigua (совки малой), Trichoplusia ni (совки капустной), Lymantria dispar (непарника), Bombyx mori (шелкопряда тутового), Anticarsia gemmatalis (совки бархатных бобов), Heliothis virescens (табачной листовертки), Heliothis subflexa (совки вишневой), Mamestra brassicae (совки капустной), Helicoverpa armigera (совки хлопковой), Helicoverpa zea (совки кукурузной), Agrotis ipsilon (совки-ипсилон), Anagrapha falcifera (совки), Galleria mellonella (большой восковой моли), Rachiplusia ou (серой пяденицы), Plutella xylostella (капустной моли), Drosophila melanogaster (плодовой мушки) и Aedes aegypti (комара).Therefore, in one embodiment, the insect cells of the present invention are derived from insects selected from the group consisting of: Autographa californica (California alfalfa moth), Spodoptera frugiperda (grass cutworm), Spodoptera exigua (small cutworm), Trichoplusia ni (cutworm), cabbage moth), Lymantria dispar (non-moth), Bombyx mori (mulberry silkworm), Anticarsia gemmatalis (velvet bean scoop), Heliothis virescens (tobacco leafworm), Heliothis subflexa (cherry scoop), Mamestra brassicae (cabbage scoop), Helicoverpa armigera (cotton scoop). ), Helicoverpa zea (corn cutworm), Agrotis ipsilon (upsilon cutworm), Anagrapha falcifera (cutworm), Galleria mellonella (great wax moth), Rachiplusia ou (grey moth), Plutella xylostella (cabbage moth), Drosophila melanogaster (fruit fly) ) and Aedes aegypti (mosquito).

В одном варианте осуществления клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого отряда Lepidoptera; более предпочтительно семейства Noctuidae; еще более предпочтительно одного из родов: Spodoptera или Trichoplusia.In one embodiment, the insect cells of the present invention are from the insect order Lepidoptera; more preferably the families Noctuidae; even more preferably one of the genera: Spodoptera or Trichoplusia.

В одном варианте осуществления клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого вида Spodoptera frugiperda.In one embodiment, the insect cells of the present invention are from an insect species Spodoptera frugiperda.

В одном варианте осуществления клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого вида Trichoplusia ni.In one embodiment, the insect cells of the present invention are derived from the insect species Trichoplusia ni.

Известно и осуществимо размножение целых насекомых для экспрессии гетерологичного белка и, таким образом, применение клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением. Однако будет удобнее использовать клетки насекомых в форме линии иммортализованных клеток насекомых, поскольку это сделает возможным более гибкое производство и масштабирование в контролируемых условиях. Такие установленные линии клеток насекомых затем могут использоваться для конструирования клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением, используя обычные способы, описанные здесь.It is known and feasible to propagate whole insects to express a heterologous protein and thus use insect cells in accordance with the present invention. However, it will be more convenient to use the insect cells in the form of an immortalized insect cell line, as this will allow more flexible production and scale-up under controlled conditions. Such established insect cell lines can then be used to construct insect cells in accordance with the present invention using the conventional methods described herein.

Хорошо известными линиями клеток насекомых, подходящими для такого применения, являются: Sf9 и Sf21, обе происходящие от S. frugiperda; High Five™ (Hi-5), происходящая от T. ni; Bm5, происходящая от B. mori; и Ld652Y и LdElta, происходящие от L. dispar.Well-known insect cell lines suitable for this use are: Sf9 and Sf21, both derived from S. frugiperda; High Five™ (Hi-5) derived from T. ni; Bm5, derived from B. mori; and Ld652Y and LdElta from L. dispar.

Следовательно, в одном варианте осуществления клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением готовят из клеток линии клеток насекомых, выбранной из группы, состоящей из Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y и LdElta, или из линии клеток, происходящей от одной из них.Therefore, in one embodiment, insect cells in accordance with the present invention are prepared from cells of an insect cell line selected from the group consisting of Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y and LdElta, or from a cell line derived from one of them. .

Предпочтительно клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением готовят из линии клеток насекомых Sf9 или Sf21.Preferably, the insect cells according to the present invention are prepared from the Sf9 or Sf21 insect cell line.

Процедуры, оборудование и материалы для культивирования линий клеток насекомых хорошо известны и могут применяться в любом желаемом масштабе, например от 5 мл до 5000 литров. В частности, доступны специализированные среды для культивирования клеток насекомых, например: Sf-900™ (Thermo Fisher Scientific); серия Ex-Cell™ 400 (Sigma Aldrich); и Insect-XPRESS™ (Lonza).Procedures, equipment and materials for culturing insect cell lines are well known and can be applied at any desired scale, for example from 5 ml to 5000 liters. In particular, specialized insect cell culture media are available, for example: Sf-900™ (Thermo Fisher Scientific); Ex-Cell™ 400 series (Sigma Aldrich); and Insect-XPRESS™ (Lonza).

В зависимости от характеристик этих сред они либо нуждаются в добавлении определенного процента сыворотки, такой как эмбриональная сыворотка теленка, либо могут использоваться без сыворотки. Могут быть добавлены дополнительные добавки, такие как глютамин, антибиотики, пеногасители и т.д.Depending on the characteristics of these media, they either require the addition of a certain percentage of serum, such as fetal calf serum, or can be used without serum. Additional additives such as glutamine, antibiotics, defoamers, etc. may be added.

Существует несколько способов, с помощью которых клетка насекомого в соответствии с настоящим изобретением может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, одним примером является стабильная интеграция в геном клетки насекомого. Способами достижения интеграции в геном являются, например: случайные вставки, например, с помощью технологии с использованием транспозонов, или направленные вставки с использованием, например, гомологичной рекомбинации или технологии CRISPR-Cas.There are several ways in which an insect cell according to the present invention may contain a heterologous nucleic acid according to the present invention, one example being stable integration into the genome of an insect cell. Methods for achieving integration into the genome are, for example: random insertions, for example, using transposon technology, or targeted insertions, using, for example, homologous recombination or CRISPR-Cas technology.

Альтернативно, клетки насекомых могут быть трансфицированы с помощью химических средств (например, Lipofectin™) или физических способов (например, электропорации) гетерологичной нуклеиновой кислотой, которая сама может находиться на носителе, таком как плазмида. Гетерологичная нуклеиновая кислота может транзиторно или постоянно экспрессироваться клеткой насекомого.Alternatively, insect cells can be transfected by chemical means (eg, Lipofectin™) or physical methods (eg, electroporation) with a heterologous nucleic acid, which itself may be on a carrier such as a plasmid. The heterologous nucleic acid may be transiently or permanently expressed by the insect cell.

Однако предпочтительным способом введения такой гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением является использование рекомбинантного бакуловируса. Такой бакуловирус, например, будет содержать представляющий интерес гетерологичный ген, стабильно интегрированный в его вирусный геном и функционально связанный с сильным бакуловирусным промотором, таким как промоторы очень поздних генов p10 или полиэдрина.However, the preferred method for introducing such a heterologous nucleic acid into insect cells in accordance with the present invention is to use a recombinant baculovirus. Such a baculovirus, for example, will contain a heterologous gene of interest, stably integrated into its viral genome and operably linked to a strong baculovirus promoter, such as the very late p10 or polyhedrin promoters.

Следовательно, в одном варианте осуществления клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением контролирующая транскрипцию последовательность представляет собой промотор гена р10 бакуловируса или промотор гена полиэдрина бакуловируса.Therefore, in one embodiment of the insect cells of the present invention, the transcriptional control sequence is a baculovirus p10 gene promoter or a baculovirus polyhedrin gene promoter.

Затем рекомбинантный бакуловирус побуждают проникать в клетку насекомого; это можно сделать пассивно, например, путем трансфекции генома рекомбинантного бакуловируса или активно путем инфицирования чувствительной клетки насекомого инфекционным рекомбинантным бакуловирусом. Следовательно, клетка насекомого, в результате включения рекомбинантного бакуловируса или его генома внутрь клетки, будет также включать гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. В случае настоящего изобретения «внутри клетки» просто относится к локализации рекомбинантного бакуловирусного генома, находящегося с внутренней стороны клеточной мембраны клетки насекомого, например, в цитоплазме.The recombinant baculovirus is then induced to enter the insect cell; this can be done passively, for example, by transfecting the genome of a recombinant baculovirus, or actively by infecting a susceptible insect cell with an infectious recombinant baculovirus. Therefore, an insect cell, by incorporating the recombinant baculovirus or its genome into the cell, will also include the heterologous nucleic acid of the present invention. In the case of the present invention, "inside the cell" simply refers to the localization of the recombinant baculovirus genome located on the inside of the cell membrane of the insect cell, for example, in the cytoplasm.

Внутри клетки насекомого рекомбинантный бакуловирус или его геном будет реплицироваться, что приведет к экспрессии гетерологичного гена в клетке насекомого. Затем гетерологичный продукт экспрессии можно собрать либо из клеток насекомых, либо из окружающей клетки среды, такой как среда для культивирования клеток.Within the insect cell, the recombinant baculovirus or its genome will replicate, resulting in the expression of the heterologous gene in the insect cell. The heterologous expression product can then be harvested either from insect cells or from the surrounding environment of the cell, such as cell culture medium.

Следовательно, в одном варианте осуществления клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением гетерологичная нуклеиновая кислота содержится в геноме рекомбинантного бакуловируса.Therefore, in one embodiment of insect cells in accordance with the present invention, the heterologous nucleic acid is contained in the genome of the recombinant baculovirus.

«Бакуловирус» является членом семейства Baculoviridae; предпочтительно представителем рода Alphabaculovirus."Baculovirus" is a member of the Baculoviridae family; preferably a member of the genus Alphabaculovirus.

Бакуловирус по настоящему изобретению является «рекомбинантным», если он был изменен в результате вмешательства человека по сравнению с его формой дикого типа, с тем чтобы он включал гетерологичную нуклеиновую кислоту. Предпочтительно, когда такой рекомбинантный бакуловирус создается методами генетической манипуляции.The baculovirus of the present invention is "recombinant" if it has been altered by human intervention from its wild-type form to include a heterologous nucleic acid. Preferably, such a recombinant baculovirus is generated by genetic manipulation techniques.

Как будет понятно специалисту при рассмотрении клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением, в конкретном сосуде для культивирования или в лунке планшета для культивирования число клеток, которые фактически содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, будет динамическим. Это связано с рядом биологических причин, таких как стадия жизненного цикла клетки или уровень инфицирования или трансфицирования. Хотя предпочтительно иметь как можно больше клеток, содержащих и экспрессирующих гетерологичную нуклеиновую кислоту, необязательно, чтобы в определенный момент времени каждая и всякая отдельная клетка насекомого этой группы содержала гетерологичную нуклеиновую кислоту.As one skilled in the art will appreciate when considering insect cells in accordance with the present invention, in a particular culture vessel or well of a culture plate, the number of cells that actually contain the heterologous nucleic acid of the present invention will be dynamic. This is due to a number of biological reasons, such as the stage of the cell's life cycle or the level of infection or transfection. Although it is preferable to have as many cells as possible containing and expressing a heterologous nucleic acid, it is not necessary that at a certain point in time each and every single insect cell of this group contains a heterologous nucleic acid.

Комбинированное использование клеток насекомых и рекомбинантного бакуловируса для экспрессии гетерологичного белка обычно называют «бакусовирусной системой экспрессии в клетках насекомых». Примерами статей, учебников и обзоров этой системы являются: Luckow et al., 1988, Bio-technology, vol. 6, p. 47; Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual by David R. O'Reilly, Oxford University press, 1993, ISBN: 0716770172; The Baculovirus Expression System: A laboratory guide, ed. King & Possee, 1992, ISBN: 9401050473; и обзором является: van Oers et al., 2015, J. of Gen. Virology, vol. 96, p. 6-23.The combined use of insect cells and a recombinant baculovirus to express a heterologous protein is commonly referred to as the "bacusovirus expression system in insect cells". Examples of articles, textbooks and reviews of this system are: Luckow et al., 1988, Bio-technology, vol. 6, p. 47; Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual by David R. O'Reilly, Oxford University press, 1993, ISBN: 0716770172; The Baculovirus Expression System: A laboratory guide, ed. King & Possee, 1992, ISBN: 9401050473; and review is: van Oers et al., 2015, J. of Gen. Virology, vol. 96, p. 6-23.

Эффективная экспрессия с использованием бакусовирусной системы экспрессии в клетках насекомых может быть применена в масштабе от лабораторного до очень крупного промышленного производства. Гетерологичные гены различного происхождения экспрессировали в течение 30 лет, когда была известна бакусовирусная система экспрессии в клетках насекомых, и для применения этой технологии коммерчески доступны многие инструменты.Efficient expression using the bacusovirus expression system in insect cells can be applied at scale from the laboratory to very large scale industrial production. Heterologous genes of various origins have been expressed for 30 years when the bacusovirus expression system in insect cells was known, and many tools are commercially available to apply this technology.

Несколько видов бакуловирусов были использованы в качестве удобных векторов для экспрессии гетерологичных белков в клетках насекомых. Примерами бакуловирусов, используемых в бакусовирусной системе экспрессии в клетках насекомых, являются (мультикапсидные) нуклеополиэдровирусы Autographa californica (пяденица калифорнийская люцерновая): AcMNPV или Bombyx mori: BmNPV.Several baculovirus species have been used as convenient vectors for the expression of heterologous proteins in insect cells. Examples of baculoviruses used in the bacusovirus expression system in insect cells are the (multicapsid) nucleopolyhedrovirus Autographa californica (California alfalfa moth): AcMNPV or Bombyx mori: BmNPV.

В одном варианте осуществления рекомбинантного бакуловируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, указанный бакуловирус представляет собой AcMNPV или BmNPV.In one embodiment of a recombinant baculovirus containing a heterologous nucleic acid of the present invention, said baculovirus is AcMNPV or BmNPV.

Для эффективного создания и отбора рекомбинантных бакуловирусов для использования в настоящем изобретении коммерчески доступны многие инструменты и наборы. Например: Bac-to-Bac™ (Thermo Fisher Sci., Waltham, MA, США); ProEasy™ (AB Vector, San Diego, CA., США); и flashBAC™ (Oxford Expression Technologies, Oxford, Великобритания).Many tools and kits are commercially available for efficient generation and selection of recombinant baculoviruses for use in the present invention. For example: Bac-to-Bac™ (Thermo Fisher Sci., Waltham, MA, USA); ProEasy™ (AB Vector, San Diego, CA., USA); and flashBAC™ (Oxford Expression Technologies, Oxford, UK).

Для оптимизации уровней репликации и экспрессии белка рекомбинантный бакуловирус, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, предпочтительно максимально приближен к бакуловирусу дикого типа, за исключением, конечно, вставки гетерологичной нуклеиновой кислоты и последующего разрушения или делеции в локусе вставки. На практике это означает, что рекомбинантный бакуловирус предпочтительно не содержит дополнительные генетические элементы из процесса рекомбинации в своем геноме, например такие элементы, как: метка, метка, ген-маркер, элемент транспозона, ген устойчивости к антибиотику и т.д.To optimize levels of replication and protein expression, a recombinant baculovirus containing a heterologous nucleic acid of the present invention is preferably as close as possible to wild-type baculovirus, except of course for the insertion of the heterologous nucleic acid and subsequent disruption or deletion at the insertion locus. In practice, this means that the recombinant baculovirus preferably does not contain additional genetic elements from the recombination process in its genome, such as elements such as: tag, tag, marker gene, transposon element, antibiotic resistance gene, etc.

Следовательно, в одном варианте осуществления рекомбинантный бакуловирус, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, не содержит дополнительные генетические элементы из процесса рекомбинации в своем геноме.Therefore, in one embodiment, the recombinant baculovirus containing the heterologous nucleic acid of the present invention does not contain additional genetic elements from the recombination process in its genome.

В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантный бакуловирус не содержит ген устойчивости к антибиотику из вектора для переноса, который использовался для конструирования этого рекомбинантного бакуловируса.In a preferred embodiment, the recombinant baculovirus does not contain the antibiotic resistance gene from the transfer vector that was used to construct the recombinant baculovirus.

В одном варианте осуществления клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением применяется одно, несколько или все условия, выбранные из группы, состоящей из: In one embodiment of insect cells in accordance with the present invention, one, more or all of the conditions selected from the group consisting of:

- нуклеотидная последовательность, кодирующая мутантный белок Orf2 PCV2b, была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов; более предпочтительно: была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов для соответствия предпочтению кодонов в гене полиэдрина бакуловируса AcMNPV;- the nucleotide sequence encoding the mutant Orf2 PCV2b protein has been optimized with respect to the frequency of codon usage; more preferably: has been optimized in terms of codon usage to match the codon preference in the AcMNPV baculovirus polyhedrin gene;

- нуклеотидная последовательность, кодирующая мутантный белок ORF2 PCV2b, представляет собой SEQ ID NO:1;- the nucleotide sequence encoding the mutant PCV2b ORF2 protein is SEQ ID NO:1;

- клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого отряда Lepidoptera; более предпочтительно семейства Noctuidae; еще более предпочтительно одного из родов: Spodoptera или Trichoplusia;the insect cells according to the invention are derived from the insect order Lepidoptera; more preferably the families Noctuidae; even more preferably one of the genera: Spodoptera or Trichoplusia;

- клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого вида Spodoptera frugiperda;the insect cells according to the invention are derived from the insect species Spodoptera frugiperda;

- клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого вида Trichoplusia ni;the insect cells according to the invention are derived from the insect species Trichoplusia ni;

- клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением готовят из клеток линии клеток насекомых, выбранных из группы, состоящей из Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y и LdElta, или из линии клеток, происходящей из одной из них;- insect cells in accordance with the present invention are prepared from cells of an insect cell line selected from the group consisting of Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y and LdElta, or from a cell line derived from one of them;

- клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением готовят из линии клеток насекомых Sf9 или Sf21;.- the insect cells according to the invention are prepared from the insect cell line Sf9 or Sf21;

- контролирующая транскрипцию последовательность представляет собой промотор гена р10 бакуловируса или промотор гена полиэдрина бакуловируса;the transcription control sequence is a baculovirus p10 gene promoter or a baculovirus polyhedrin gene promoter;

- гетерологичная нуклеиновая кислота содержится в геноме рекомбинантного бакуловируса, который находится внутри клетки насекомого;- a heterologous nucleic acid is contained in the genome of a recombinant baculovirus, which is located inside the insect cell;

- рекомбинантный бакуловирус, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, представляет собой AcMNPV или BmNPV; и- the recombinant baculovirus containing the heterologous nucleic acid of the present invention is AcMNPV or BmNPV; and

- рекомбинантный бакуловирус, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, не содержит дополнительные генетические элементы из процесса рекомбинации в своем геноме.- the recombinant baculovirus containing the heterologous nucleic acid of the present invention does not contain additional genetic elements from the recombination process in its genome.

Как здесь описано, мутация белка ORF2 PCV2b, описанного для настоящего изобретения, обеспечивает увеличение экспрессии белка ORF2b-131Р из клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением. В особенности, она позволяет создавать VLP, содержащие белок ORF2 PCV2b, в гораздо большей степени, чем насколько это возможно без этой мутации.As described here, the mutation of the PCV2b ORF2 protein described for the present invention provides an increase in the expression of the ORF2b-131P protein from insect cells in accordance with the present invention. In particular, it allows the creation of VLPs containing the PCV2b ORF2 protein to a much greater extent than would be possible without this mutation.

Следовательно, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам (VLP) из мутантного белка ORF2 PCV2b, отличающимся тем, что мутантный белок ORF2 PCV2b имеет пролин в аминокислотном положении 131.Therefore, in a further aspect, the present invention relates to virus-like particles (VLPs) from a mutant PCV2b ORF2 protein, characterized in that the mutant PCV2b ORF2 protein has a proline at amino acid position 131.

Материалы и способы для характеристики и использования VLP из белка ORF2b-131P хорошо известны в данной области техники.Materials and methods for characterizing and using VLPs from the ORF2b-131P protein are well known in the art.

Предпочтительно, когда экспрессия мутантного белка ORF2 PCV2b по настоящему изобретению в клетках насекомых достигается при использовании бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых, описанной выше.Preferably, expression of the mutant PCV2b ORF2 protein of the present invention in insect cells is achieved using the baculovirus insect cell expression system described above.

Следовательно, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых в соответствии с настоящим изобретением, при этом в способе применяется бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых.Therefore, in a further aspect, the present invention relates to a method for expressing a mutant PCV2b ORF2 protein in insect cells according to the present invention, the method employing a baculovirus expression system in insect cells.

В частности, когда клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением, которые используются для экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b по настоящему изобретению, представляют собой клетки линии клеток насекомых, их можно удобно культивировать с использованием стандартного оборудования для культивирования клеток, что приводит к экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b. Оборудование для культивирования клеток насекомых доступно в любом масштабе; от простого Т-матраса или вращающейся колбы, помещенного(й) в инкубационный шкаф при соответствующей температуре; вплоть до крупномасштабного промышленного ферментера с обогревательной рубашкой, мешалкой и разбрызгивателем, с автоматическим контролированием параметров процесса, таких как температура, pH и растворенный кислород.In particular, when the insect cells of the present invention that are used to express the PCV2b mutant ORF2 protein of the present invention are insect cell lines, they can be conveniently cultured using standard cell culture equipment, resulting in the expression of the mutant ORF2 protein. PCV2b. Insect cell culture equipment is available in any scale; from a simple T-mattress or rotating flask placed(s) in an incubator at the appropriate temperature; up to a large-scale industrial fermenter with heating jacket, agitator and sprinkler, with automatic control of process parameters such as temperature, pH and dissolved oxygen.

После культивирования клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением экспрессированный мутантный белок ORF2 PCV2b собирают из культуры клеток насекомых для дальнейшего использования. Как и культивирование, такой сбор может быть осуществлен с использованием стандартных процедур, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, при необходимости культура может быть сначала инактивирована (т.е. стерилизована) с помощью физических способов (например, нагревания, облучения) или химических средств (например, бромэтиленимина (BEI)).After culturing insect cells according to the present invention, the expressed PCV2b ORF2 mutant protein is harvested from the insect cell culture for further use. As well as cultivation, such collection can be carried out using standard procedures well known in the art. In addition, if necessary, the culture may first be inactivated (ie, sterilized) using physical methods (eg, heat, irradiation) or chemical means (eg, bromoethyleneimine (BEI)).

В зависимости от характеристик используемой клетки насекомого и применяемого типа экспрессии экспрессированный мутантный белок ORF2 PCV2b накапливается внутри клеток насекомых или на их мембране или секретируется из клетки. Даже когда он активно не секретируется, белок может в некоторой степени оказаться в среде для культивирования клеток при разрушении клеток.Depending on the characteristics of the insect cell used and the type of expression used, the expressed PCV2b ORF2 mutant protein accumulates inside insect cells or on their membrane or is secreted from the cell. Even when not actively secreted, the protein may end up in the cell culture medium to some extent when the cells are destroyed.

В таком случае можно выбрать способ сбора экспрессированного белка:In this case, you can choose how to collect the expressed protein:

Когда экспрессированный белок главным образом присутствует в культуральной среде, его можно собрать, например, в виде супернатанта после центрифугирования культуры. Основной объем культуры затем может уменьшить в желаемой степени, например, используя концентратор, обычно с помощью некоторого метода ультрафильтрации, все хорошо известны в данной области техники.When the expressed protein is predominantly present in the culture medium, it can be collected, for example, as a supernatant after centrifugation of the culture. The main culture volume can then be reduced to the desired extent, for example, using a concentrator, usually by some sort of ultrafiltration technique, all well known in the art.

Когда белок находится главным образом в клетках, он может быть выделен из основного объема культуры, например, путем центрифугирования культуры и ресуспендирования осадка клеток в меньшем объеме. Затем клетки могут быть разрушены с использованием более или менее инвазивных методов.When the protein is found primarily in the cells, it can be isolated from the bulk of the culture, for example by centrifuging the culture and resuspending the cell pellet in a smaller volume. The cells can then be destroyed using more or less invasive methods.

Затем экспрессированный белок может быть получен, используя некоторый метод экстракции и/или очистки.The expressed protein can then be obtained using some extraction and/or purification method.

Все это может выполнить специалист в данной области, используя только известные методы и материалы.All this can be done by a person skilled in the art, using only known methods and materials.

Следовательно, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения мутантного белка ORF2 PCV2b, имеющего пролин в аминокислотном положении 131, при этом получение включает одну или обе стадии, выбранные из:Therefore, in a further aspect, the present invention relates to a method for producing a mutant PCV2b ORF2 protein having a proline at amino acid position 131, the preparation comprising one or both of the steps selected from:

- культивирования клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением; и- cultivation of insect cells in accordance with the present invention; and

- сбора мутантного белка ORF2 PCV2b из культуры клеток насекомых.- collection of mutant PCV2b ORF2 protein from insect cell culture.

Особенно полезным результатом настоящего изобретения является то, что мутантный белок ORF2 PCV2b больше не накапливается в ядре клеток насекомых, в которых он экспрессируется. Это не только увеличило общий уровень экспрессии, но также значительно облегчило сбор мутантного белка ORF2 PCV2b из этих клеток насекомых. Это связано с тем, что в этом цитоплазматическом состоянии могли быть использованы очень щадящие и стандартные способы выделения, дающие относительно большие количества мутантного белка ORF2 PCV2b. К тому же, собранный белок имел превосходное иммунологическое качество, поскольку было обнаружено, что основная масса ORF2b-131P эффективно собирается в VLP.A particularly beneficial result of the present invention is that the mutated PCV2b ORF2 protein no longer accumulates in the nucleus of the insect cells in which it is expressed. This not only increased the overall expression level, but also greatly facilitated the collection of the PCV2b ORF2 mutant protein from these insect cells. This is because, in this cytoplasmic state, very gentle and standard isolation techniques could be used, yielding relatively large amounts of PCV2b ORF2 mutant protein. In addition, the assembled protein was of excellent immunological quality since it was found that the bulk of ORF2b-131P was efficiently assembled into VLPs.

Конкретнее: для сбора немутированного белка ORF2 PCV2b в существенных количествах потребовалась бы экстракция с использованием химических веществ, таких как детергенты или хаотропные агенты, например, SDS, мочевина, дезоксихолат или гуанидин-HCl и так далее. Впоследствии они должны быть снова удалены. Использование таких агрессивных химических веществ в большом масштабе, конечно, нежелательно.More specifically, to collect the unmutated PCV2b ORF2 protein in significant amounts, extraction would be required using chemicals such as detergents or chaotropic agents, eg SDS, urea, deoxycholate or guanidine-HCl, and so on. Subsequently, they must be removed again. The use of such aggressive chemicals on a large scale is, of course, undesirable.

Однако сбор мутантного белка ORF2 PCV2b может быть осуществлен с помощью безопасных, удобных и очень мягких методов без использования химических веществ, например, путем обработки ультразвуком или размораживания-оттаивания клеток насекомых.However, PCV2b ORF2 mutant protein can be harvested using safe, convenient, and very gentle methods without the use of chemicals, such as sonication or thaw-thaw insect cells.

Следовательно, в одном варианте осуществления способа получения мутантного белка ORF2 PCV2b в соответствии с настоящим изобретением на стадии сбора мутантного белка ORF2 PCV2b из культуры клеток насекомых не используется детергент или хаотропный агент.Therefore, in one embodiment of the method for producing a mutant PCV2b ORF2 protein according to the present invention, no detergent or chaotropic agent is used in the step of harvesting the mutant PCV2b ORF2 protein from an insect cell culture.

В одном варианте осуществления для сбора используется физический, а не химический способ для лизиса клеток насекомых; примерами физического способа лизиса клеток являются: обработка ультразвуком, размораживание-оттаивание и пресс Френча.In one embodiment, the collection uses a physical rather than a chemical method to lyse the insect cells; examples of the physical method of cell lysis are: sonication, thaw-thaw and French press.

В случае настоящего изобретения «культивирование» клеток насекомых или подобное «культивирование» относится к инкубации клеток насекомых в соответствующих условиях, позволяющих клеткам расти и делиться, и экспрессировать гетерологичную вставку.In the case of the present invention, "culturing" insect cells or similar "culturing" refers to the incubation of insect cells under appropriate conditions to allow the cells to grow and divide and express a heterologous insert.

Такое культивирование клеток насекомых, как правило, включает использование соответствующей среды для культивирования клеток и подходящего оборудования; все они хорошо известны в данной области техники и коммерчески доступны. Например, культуры линий клеток насекомых родов Spodoptera или Trichoplusia обычно культивируют в аэробных условиях, в монослое или в суспензии, при 26-28°C.Such insect cell culture typically involves the use of an appropriate cell culture medium and suitable equipment; all are well known in the art and commercially available. For example, cultures of insect cell lines of the genera Spodoptera or Trichoplusia are usually cultured under aerobic conditions, in monolayer or in suspension, at 26-28°C.

В практических условиях будет удобно иметь отдельный сосуд для культивирования для образования чистых клеток насекомых, сохраняемый на значительном расстоянии от оборудования, используемого для культивирования клеток насекомых, которые будут инфицированы или трансфицированы. Обычно клетки насекомых готовятся как основной запас клеток и рабочий запас клеток. Такой подход обеспечивает уровень контроля качества, который требуется для приготовления рекомбинантных белков для фармацевтического применения.In practical terms, it will be convenient to have a separate culture vessel for producing pure insect cells, kept at a considerable distance from the equipment used for culturing insect cells to be infected or transfected. Typically, insect cells are prepared as a basic cell stock and a working cell stock. This approach provides the level of quality control that is required to prepare recombinant proteins for pharmaceutical use.

В одном варианте осуществления способа получения мутантного белка ORF2 PCV2b в соответствии с настоящим изобретением полученный белок находится в форме VLP.In one embodiment of the method for producing a mutant PCV2b ORF2 protein according to the present invention, the resulting protein is in the form of a VLP.

Применяя способы получения мутантного белка ORF2 PCV2b в соответствии с настоящим изобретением, можно получить мутантный белок ORF2 PCV2b в достаточных количествах и с требуемой иммунологической эффективностью для производства вакцины против PCV2 или связанных с ним признаков заболевания.Using the methods for producing a mutant PCV2b ORF2 protein in accordance with the present invention, it is possible to produce a mutant PCV2b ORF2 protein in sufficient quantities and with the required immunological efficacy to produce a vaccine against PCV2 or related disease symptoms.

Следовательно, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к вакцине для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания, при этом вакцина содержит мутантный белок ORF2 PCV2b в фармацевтически приемлемом носителе, отличающейся тем, что указанный мутантный белок ORF2 PCV2b имеет пролин в аминокислотном положении 131.Therefore, in a further aspect, the present invention relates to a porcine vaccine for suppressing PCV2 infection or associated signs of disease, the vaccine comprising a mutant PCV2b ORF2 protein in a pharmaceutically acceptable carrier, characterized in that said PCV2b ORF2 mutant protein has a proline at the amino acid position 131.

В одном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением предназначена для подавления инфекции, обусловленной PCV2 с генотипом 2a, 2b и/или 2d.In one embodiment, the vaccine in accordance with the present invention is designed to suppress infection caused by PCV2 genotype 2a, 2b and/or 2d.

Более предпочтительной является вакцина для подавления инфекции, обусловленной PCV2.More preferred is a vaccine for suppressing PCV2 infection.

Хорошо известно, что «вакцина» представляет собой композицию, содержащую иммунологически активное соединение в фармацевтически приемлемом носителе. «Иммунологически активное соединение» - в форме «антигена» - будет распознаваться иммунной системой прививаемой мишени, индуцируя иммунологический ответ. Ответ может исходить от врожденной или приобретенной иммунной системы и может быть клеточного и/или гуморального типа.It is well known that a "vaccine" is a composition containing an immunologically active compound in a pharmaceutically acceptable carrier. The "immunologically active compound" - in the form of an "antigen" - will be recognized by the immune system of the grafted target, inducing an immunological response. The response may come from the innate or acquired immune system and may be of the cellular and/or humoral type.

В случае настоящего изобретения «свиньи» относятся к животным семейства Suidae и предпочтительно к животным рода Sus, например: дикой или домашней свинье, дикому кабану, бабирусе или бородавочнику. Сюда также входят свиньи, названные произвольным именем, относящимся к их полу или возрасту, таким как свиноматка, кабан, свинья, ремсвинка, отъемыш или поросенок.In the case of the present invention, "pigs" refers to animals of the family Suidae and preferably animals of the genus Sus, for example: wild or domestic pig, wild boar, babirus or warthog. It also includes pigs named with an arbitrary name referring to their sex or age, such as sow, boar, pig, remig, wean, or piglet.

Вакцина в соответствии с изобретением может обеспечивать «подавление PCV2 инфекции», что относится к предотвращению или подавлению возникновения или распространения продуктивной PCV2 инфекции у животного-мишени. Это достигается, например, путем снижения вирусной нагрузки или сокращения продолжительности репликации вируса. В свою очередь, это приводит к уменьшению числа, интенсивности или тяжести поражений и последующих клинических признаков заболевания, вызванного вирусной инфекцией, у животного-мишени. Такую вакцину в разговорной речи называют «вакциной» против «PCV2» или «противо-PCV2 вакциной».The vaccine according to the invention may provide "inhibition of PCV2 infection", which refers to the prevention or suppression of the occurrence or spread of productive PCV2 infection in the target animal. This is achieved, for example, by reducing the viral load or shortening the duration of viral replication. In turn, this leads to a reduction in the number, intensity or severity of lesions and subsequent clinical signs of disease caused by viral infection in the target animal. Such a vaccine is colloquially referred to as a "vaccine" against "PCV2" or "anti-PCV2 vaccine".

В предпочтительном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением действует как средство для предотвращения PCV2-виремии и/или как средство для предотвращения выделения PCV2 инфицированными животными.In a preferred embodiment, the vaccine according to the present invention acts as an agent to prevent PCV2 viremia and/or as an agent to prevent excretion of PCV2 by infected animals.

В дополнение к эффективности вакцины против PCV2 инфекции, вакцина в соответствии с настоящим изобретением может также обеспечивать «ослабление … связанных с ней признаков заболевания», которое относится к связанному с цирковирусом свиней заболеванию (PCVAD), которое может возникать как вторичное или сопутствующее заболевание. Как и в случае PCV2, вакцина в соответствии с настоящим изобретением может обеспечивать уменьшение тяжести и/или длительности симптомов или последствий такого PCVAD.In addition to the efficacy of a vaccine against PCV2 infection, the vaccine of the present invention may also provide "attenuation of ... its associated signs of disease", which refers to porcine circovirus associated disease (PCVAD), which may occur as a secondary or concomitant disease. As with PCV2, the vaccine of the present invention may provide a reduction in the severity and/or duration of the symptoms or consequences of such PCVAD.

Вакцины против PCV2 уменьшает репликацию и распространение вируса PCV2. Это снижает PCV2-вирусную нагрузку в крови, легких и лимфоидных тканях (например, миндалинах, селезенке и лимфатических узлах) и защищает от истощения лимфоидной ткани, распространения инфекций и от заболеваний, связанных с PCV2. Следовательно, это восстанавливает общее состояние здоровья и продуктивность в стадах вакцинированных свиней, что отражается в одном или более параметров: снижении смертности, увеличении среднесуточного прироста веса, улучшении конверсии корма и улучшении репродуктивной эффективности.The PCV2 vaccine reduces the replication and spread of the PCV2 virus. This reduces the PCV2 viral load in the blood, lungs, and lymphoid tissues (eg, tonsils, spleen, and lymph nodes) and protects against lymphoid tissue depletion, the spread of infections, and PCV2-associated diseases. Therefore, it restores overall health and productivity in vaccinated pig herds, which is reflected in one or more of the following: reduced mortality, increased average daily weight gain, improved feed conversion, and improved reproductive efficiency.

Общее определение эффективности вакцины против PCV2 находится в пределах компетенции обычного практикующего специалиста. Это может быть сделано, например, путем мониторинга иммунологического ответа после вакцинации или путем проверки появления клинических симптомов или смертности после контрольного заражением, например, путем мониторинга признаков заболевания, клинических показателей, серологических параметров у мишени или путем повторного выделения провокационного патогена и сравнения этих результатов с ответом на вакцинацию и последующее заражение, наблюдаемым у псевдовакцинированных животных. В частности, эффективность вакцины и защиту можно определить путем серологического определения уровней антител, специфических для PCV2; детектирования вируса в сыворотке или в секретах животных (оральных, назальных секретах, фекалиях, моче); или путем обнаружения других патогенов, участвующих в PCVAD, с помощью ПЦР, (иммуно)гистологического анализа, гибридизации или серологически.The general determination of the efficacy of a PCV2 vaccine is within the purview of the ordinary practitioner. This can be done, for example, by monitoring the immunological response after vaccination, or by checking for the onset of clinical symptoms or mortality after challenge, for example, by monitoring signs of disease, clinical parameters, serological parameters in the target, or by re-isolation of the challenge pathogen and comparing these results with response to vaccination and subsequent challenge observed in pseudo-vaccinated animals. In particular, vaccine efficacy and protection can be determined by serological determination of levels of antibodies specific for PCV2; virus detection in serum or animal secretions (oral, nasal secretions, feces, urine); or by detection of other pathogens involved in PCVAD by PCR, (immuno)histological analysis, hybridization or serology.

В случае вакцин против PCV2 в соответствии с настоящим изобретением эффективность предпочтительно определяют путем оценки уровня подавления PCV2 инфекции в вакцинированных и невакцинированных группах, в соответствии с чем такая инфекция может быть получена естественным путем, например, в полевых условиях, или может быть преднамеренной, например, в результате заражения в условиях эксперимента.In the case of PCV2 vaccines in accordance with the present invention, efficacy is preferably determined by assessing the level of suppression of PCV2 infection in vaccinated and unvaccinated groups, whereby such infection can be obtained naturally, for example, in the field, or can be deliberate, for example, as a result of infection under experimental conditions.

В зависимости от типа используемого адъюванта эффективность вакцины против PCV2 может основываться больше на гуморальном или клеточном иммунитете. Титры индуцированных антител можно измерить, например, используя один из множества доступных коммерческих наборов для ELISA, специфических для PCV.Depending on the type of adjuvant used, the efficacy of a PCV2 vaccine may be based more on humoral or cellular immunity. Raised antibody titers can be measured, for example, using one of the many available commercial PCV-specific ELISA kits.

Различные варианты осуществления, преимущества и примеры вакцины в соответствии с настоящим изобретением будут изложены ниже.Various embodiments, advantages and examples of a vaccine according to the present invention will be set forth below.

В одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением, содержащей мутантный белок ORF2 PCV2b, имеющий пролин в аминокислотном положении номер 131, мутантный белок ORF2 PCV2b находится в форме вирусоподобных частиц.In one embodiment of a vaccine of the present invention comprising a mutant PCV2b ORF2 protein having a proline at amino acid position number 131, the mutant PCV2b ORF2 protein is in the form of virus-like particles.

Как правило, вакцина содержит «фармацевтически приемлемый носитель», который содержит антиген и может помочь в производстве, применении или сохранении вакцины, не вызывая (тяжелых) неблагоприятных эффектов. Таким носителем может быть водный раствор, например буфер или культуральная среда.Typically, a vaccine contains a "pharmaceutically acceptable carrier" which contains an antigen and can assist in the manufacture, use, or storage of the vaccine without causing (severe) adverse effects. Such a carrier may be an aqueous solution, such as a buffer or culture medium.

Предпочтительным фармацевтически приемлемым носителем для вакцины в соответствии с настоящим изобретением является среда для культивирования клеток насекомых, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) или их комбинация.A preferred pharmaceutically acceptable carrier for the vaccine of the present invention is insect cell culture medium, phosphate buffered saline (PBS), or a combination thereof.

Кроме того, фармацевтически приемлемый носитель может содержать дополнительные добавки и наполнители, такие как наполнитель, стабилизатор, консервант, поверхностно-активное вещество или адъювант. Детали и примеры общеизвестны, например, как описано в справочниках, таких как: Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), и: “Veterinary vaccinology” (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).In addition, the pharmaceutically acceptable carrier may contain additional additives and excipients such as a filler, stabilizer, preservative, surfactant or adjuvant. Details and examples are well known, for example, as described in reference books such as: Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), and: “Veterinary vaccinology” (P. Pastoret et al. ed. ., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

Кроме того, вакцина в соответствии с настоящим изобретением может содержать адъювант. Особенно в случае таких субъединичных вакцин это может значительно увеличить иммунный ответ на субъединичный антиген у мишени.In addition, the vaccine in accordance with the present invention may contain an adjuvant. Especially in the case of such subunit vaccines, this can significantly increase the immune response to the subunit antigen in the target.

Следовательно, в одном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением содержит адъювант.Therefore, in one embodiment, the vaccine in accordance with the present invention contains an adjuvant.

«Адъювант» представляет собой хорошо известный ингредиент вакцины, который стимулирует иммунный ответ у мишени неспецифическим образом. В данной области известно много различных адъювантов. Примерами адъювантов являются: полный и неполный адъювант Фрейнда, витамин Е или альфа-токоферол, неионные блоксополимеры и полиамины, такие как декстрансульфат, Carbopol™, пиран, сапонин, такой как: QuilA™ или Q-vac™, Сапонин и компоненты вакцины могут быть объединены в ISCOM™.An "adjuvant" is a well-known vaccine ingredient that stimulates an immune response in a target in a non-specific manner. Many different adjuvants are known in the art. Examples of adjuvants are: complete and incomplete Freund's adjuvant, vitamin E or alpha-tocopherol, non-ionic block copolymers and polyamines such as dextran sulfate, Carbopol™, pyran, saponin such as: QuilA™ or Q-vac™, Saponin and vaccine components can be integrated into ISCOM™.

Кроме того, в качестве адъюванта часто используются пептиды, такие как мурамилдипептиды, диметилглицин, туфтсин, и минеральное масло, например, Bayol™, Drakeol™, Klearol™ или Marcol™, Montanide™ или легкое минеральное (парафиновое) масло; неминеральное масло, такое как сквален, сквалан; растительные масла или их производные, например этилолеат. Также полезно использовать комбинированные продукты, такие как ISA™ (Seppic) или DiluvacForte™ и Xsolve™ (оба от MSD Animal Health). Дополнительным вариантом является использование адъюванта SVEA (содержащего сквалан и ацетат витамина Е), как раскрыто в ЕР 16206789.In addition, peptides such as muramyl dipeptides, dimethylglycine, tuftsin, and mineral oil such as Bayol™, Drakeol™, Klearol™ or Marcol™, Montanide™ or light mineral (paraffin) oil are often used as an adjuvant; non-mineral oil such as squalene, squalane; vegetable oils or their derivatives, for example ethyl oleate. It is also helpful to use combination products such as ISA™ (Seppic) or DiluvacForte™ and Xsolve™ (both from MSD Animal Health). An additional option is to use an SVEA adjuvant (containing squalane and vitamin E acetate) as disclosed in EP 16206789.

Руководством по адъювантам, их применению и эффектам является ”Vaccine adjuvants” (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O’Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN: 0896037355).A guide to adjuvants, their use and effects is "Vaccine adjuvants" (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O'Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN: 0896037355).

Адъювант может использоваться в различных вакцинных препаратах в соответствии с настоящим изобретением для усиления иммунного ответа на мутантный белок ORF2 PCV2b. Например, когда адъювант представляет собой вещество в виде масла, масляная фаза может обеспечить депо-эффект у вакцинированного животного, медленно высвобождая антиген, тем самым обеспечивая длительную стимуляцию иммунной системы у мишени.The adjuvant can be used in various vaccine formulations according to the present invention to enhance the immune response to the PCV2b ORF2 mutant protein. For example, when the adjuvant is in the form of an oil, the oil phase can provide a depot effect in the vaccinated animal by slowly releasing the antigen, thereby providing a sustained stimulation of the target's immune system.

Вещество в виде масла можно скомбинировать различными способами с водной фазой, содержащей белок ORF2. В одном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена в виде эмульсии водной и масляной фазы; предпочтительно эмульсия имеет тип: «вода в масле» (вода/масло), «масло в воде» (масло/вода), «вода в масле в воде» (вода/масло/вода) или представляет собой двойную масляную эмульсию.The oily material can be combined in various ways with the aqueous phase containing the ORF2 protein. In one embodiment, the vaccine according to the present invention may be formulated as an aqueous/oil phase emulsion; preferably the emulsion is of the water-in-oil (water/oil), oil-in-water (oil/water), water-in-oil-in-water (water/oil/water) type, or is a double oil emulsion.

Более предпочтительной является вакцина в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит масло в качестве адъюванта и приготовлена в виде эмульсии типа «масло в воде». Такая вакцина преимущественно проявляет свойства как в прямой иммунной стимуляции из водной фазы, так и длительной иммунной стимуляции из-за эффекта депо масляной фазы.More preferred is the vaccine according to the present invention, which contains an oil adjuvant and is formulated as an oil-in-water emulsion. Such a vaccine advantageously exhibits both direct immune stimulation properties from the aqueous phase and long-term immune stimulation due to the depot effect of the oil phase.

Следовательно, в одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина приготовлена в виде эмульсии типа «масло в воде».Therefore, in one embodiment of a vaccine according to the present invention, the vaccine is formulated as an oil-in-water emulsion.

Способы и оборудование для приготовления эмульсии вакцины с адъювантом в любом желаемом масштабе коммерчески доступны, например, для гомогенизации, используя такое оборудование, как: Silverson, Ultra Turrax™, реактор Dispax (IKA) или Microfluidiser (Microfluidics).Methods and equipment for emulsifying an adjuvanted vaccine at any desired scale are commercially available, for example for homogenization using equipment such as: Silverson, Ultra Turrax™, Dispax Reactor (IKA) or Microfluidiser (Microfluidics).

Эмульсия типа «масло в воде» вакцины в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно имеет размер частиц дисперсной фазы, который является достаточно маленьким, предпочтительно меньше 1 микрометра; такие эмульсии обычно называют «субмикронными эмульсиями».The oil-in-water emulsion of the vaccine according to the present invention preferably has a dispersed phase particle size that is sufficiently small, preferably less than 1 micrometer; such emulsions are commonly referred to as "submicron emulsions".

В одном варианте осуществления эмульсии типа «масло в воде» вакцины в соответствии с настоящим изобретением эмульсия представляет собой субмикронную эмульсию.In one embodiment of an oil-in-water emulsion of a vaccine according to the present invention, the emulsion is a submicron emulsion.

В одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из: легкого минерального масла, Монтанида, Эмунада и SVEA.In one embodiment of the vaccine according to the present invention, the adjuvant is selected from the group consisting of: light mineral oil, Montanide, Emunad and SVEA.

Известно, что такие адъюванты оказывают положительные эффекты на иммуногенность вакцин для свиней. В одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина представляет собой эмульсию типа «масло в воде», а адъювант представляет собой минеральное масло.Such adjuvants are known to have positive effects on the immunogenicity of swine vaccines. In one embodiment of a vaccine according to the present invention, the vaccine is an oil-in-water emulsion and the adjuvant is a mineral oil.

В предпочтительном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением минеральное масло представляет собой легкое или белое минеральное масло или парафиновое масло, коммерчески доступное под такими торговыми названиями, как: Marcol™ (ExxonMobil), Klearol™ (Sonneborn) или Drakeol™ (Penreco).In a preferred embodiment of the vaccine according to the present invention, the mineral oil is a light or white mineral oil or paraffin oil commercially available under trade names such as: Marcol™ (ExxonMobil), Klearol™ (Sonneborn) or Drakeol™ (Penreco).

Более предпочтительным является использование дополнительного адъюванта, а именно: витамина Е, например альфа-токоферола или альфа-токоферола ацетата.More preferred is the use of an additional adjuvant, namely vitamin E, such as alpha-tocopherol or alpha-tocopherol acetate.

В предпочтительном варианте осуществления вакцинный препарат по настоящему изобретению содержит эмульсию типа «масло в воде» с поверхностно-активным веществом, легким парафиновым маслом и ацетатом альфа-токоферола. Более предпочтительным является препарат, в котором поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 (Tween™ 80), и/или парафиновое масло представляет собой Marcol™ 52, и/или витамин Е представляет собой альфа-токоферола ацетат. Наиболее предпочтительным является препарат с Microsol Diluvac Forte™ или с Xsolve™ (оба: MSD Animal Health).In a preferred embodiment, the vaccine preparation of the present invention contains an oil-in-water emulsion with a surfactant, light paraffin oil and alpha-tocopherol acetate. More preferred is a formulation wherein the surfactant is polysorbate 80 (Tween™ 80) and/or the paraffin oil is Marcol™ 52 and/or the vitamin E is alpha-tocopherol acetate. The most preferred formulation is Microsol Diluvac Forte™ or Xsolve™ (both: MSD Animal Health).

Другим преимущественным эффектом вакцины в соответствии с настоящим изобретением является предотвращение или уменьшение распространения PCV2 в стаде свиней: вертикально потомству и/или горизонтально внутри стада или популяции и в пределах географического района. В результате, применение вакцины в соответствии с настоящим изобретением приводит к уменьшению распространенности PCV2.Another advantageous effect of the vaccine according to the present invention is to prevent or reduce the spread of PCV2 in a swine herd: vertically to offspring and/or horizontally within a herd or population and within a geographical area. As a result, the use of the vaccine in accordance with the present invention leads to a decrease in the prevalence of PCV2.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина предназначена для уменьшения распространенности PCV2 в популяции свиней или в географическом районе.Therefore, in a preferred embodiment of the vaccine of the present invention, the vaccine is designed to reduce the prevalence of PCV2 in a pig population or geographic area.

В одном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением также может содержать стабилизатор. Он может служить для улучшения характеристик эмульсии вакцины, для защиты склонных к деградации компонентов и/или для увеличения срока годности вакцины. Как правило, такие стабилизаторы представляют собой большие молекулы с большой молекулярной массой, такие как липиды, углеводы или белки; например, сухое молоко, желатин, сывороточный альбумин, сорбит, сахароза, трегалоза, спермидин, белковый гидролизат, декстран или поливинилпирролидон, и буферы, такие как фосфаты щелочных металлов.In one embodiment, the vaccine in accordance with the present invention may also contain a stabilizer. It may serve to improve the characteristics of the vaccine emulsion, to protect components prone to degradation, and/or to increase the shelf life of the vaccine. Typically, such stabilizers are large, high molecular weight molecules such as lipids, carbohydrates, or proteins; for example, milk powder, gelatin, serum albumin, sorbitol, sucrose, trehalose, spermidine, protein hydrolysate, dextran or polyvinylpyrrolidone, and buffers such as alkali metal phosphates.

Предпочтительно, когда стабилизатор не содержит соединений животного происхождения (без соединений от животных, ACF) или даже химически определен, например, как описано в WO 2006/094974.Preferably, the stabilizer does not contain compounds of animal origin (no compounds from animals, ACF) or even chemically defined, for example, as described in WO 2006/094974.

Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может содержать консервант, такой как тимеросал, мертиолат, фенольные соединения и/или гентамицин. Предпочтительно, когда консервант не используется.The vaccine according to the present invention may contain a preservative such as thimerosal, merthiolate, phenolic compounds and/or gentamicin. Preferably when no preservative is used.

Само собой разумеется, что примешивание других добавок, которые необходимы или полезны для фармацевтической стабильности или для эффективности вакцины в соответствии с настоящим изобретением, вполне соответствует обычным возможностям специалиста и, следовательно, входит в объем настоящего изобретения.It goes without saying that the admixture of other additives that are necessary or useful for pharmaceutical stability or for the effectiveness of the vaccine in accordance with the present invention, is well within the ordinary ability of a person skilled in the art and, therefore, is within the scope of the present invention.

Животными-мишенями для вакцины в соответствии с настоящим изобретением являются свиньи. Возраст, вес, пол, иммунологический статус и другие параметры вакцинируемой мишени не являются критическими, хотя вакцинировать здоровых, неинфицированных животных и вакцинировать как можно раньше, чтобы предотвратить любую полевую инфекцию, с помощью PCV2, очевидно, выгодно. Поскольку такая инфекция может укорениться уже в молодом возрасте.The target animals for the vaccine according to the present invention are pigs. Age, weight, sex, immunological status, and other parameters of the target being vaccinated are not critical, although it is clearly advantageous to vaccinate healthy, uninfected animals and vaccinate as early as possible to prevent any field infection with PCV2. Since such an infection can take root already at a young age.

Следовательно, в одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина применяется для молодых свиней вскоре после рождения, предпочтительно в пределах 28 дней после рождения, более предпочтительно в пределах 21, 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или даже в пределах 1 дня после рождения, в этом порядке предпочтения.Therefore, in one embodiment of the vaccine according to the present invention, the vaccine is administered to young pigs shortly after birth, preferably within 28 days after birth, more preferably within 21, 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4 , 3, 2, or even within 1 day after birth, in that order of preference.

Альтернативно, вакцину в соответствии с настоящим изобретением можно вводить беременной свиноматке для обеспечения поросят специфическими для PCV2 антителами материнского происхождения либо трансплацентарным путем, и/или посредством передачи через молозиво.Alternatively, the vaccine of the present invention may be administered to a pregnant sow to provide the piglets with PCV2-specific antibodies of maternal origin, either transplacental and/or via colostrum.

Преимущественно, когда на эффективность вакцины в соответствии с настоящим изобретением не влияет в значительной степени уровень антител против PCV2 материнского происхождения, которые молодые свиньи могут получить от своей матери; «молодой» относится к возрасту 4 недели или меньше.Preferably, when the effectiveness of the vaccine according to the present invention is not significantly affected by the level of maternal anti-PCV2 antibodies that young pigs may receive from their mother; "young" refers to 4 weeks of age or less.

Следовательно, в одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина применяется для молодых свиней, имеющим антитела против PCV2 материнского происхождения.Therefore, in one embodiment of the vaccine according to the present invention, the vaccine is administered to young pigs that have maternally derived anti-PCV2 antibodies.

Вакцина в соответствии с настоящим изобретением также может служить в качестве эффективной первичной вакцинации, за которой впоследствии может следовать бустерная вакцинация, и которая может усиливаться в результате бустерной вакцинации. Например, вакцина в соответствии с настоящим изобретением может вводиться поросенку в возрасте приблизительно 2-10 дней и снова приблизительно через 3 недели, при этом каждая вакцинация осуществляется в объеме, составляющем приблизительно 1 мл.The vaccine according to the present invention can also serve as an effective primary vaccination which can subsequently be followed by a booster vaccination and which can be enhanced by the booster vaccination. For example, the vaccine of the present invention may be administered to a piglet at about 2-10 days of age and again about 3 weeks later, with each vaccination in a volume of about 1 ml.

Однако, поскольку вакцина в соответствии с настоящим изобретением эффективна уже после однократного введения, предпочтительным вариантом осуществления является введение однократной дозы, составляющей, например, приблизительно 2 мл, в возрасте приблизительно от 3 недель. Эта вакцинация защищает свиней в течение всего периода откорма, приблизительно до 5-6 месячного возраста.However, since the vaccine according to the present invention is effective already after a single administration, the preferred embodiment is the administration of a single dose of, for example, about 2 ml, from about 3 weeks of age. This vaccination protects pigs throughout the fattening period up to approximately 5-6 months of age.

Если свинью-мишень для вакцины в соответствии с настоящим изобретением намерены содержать в течение более 6 месяцев, например свиноматок для разведения или хряков для производства сперматозоидов, им можно делать обычную бустерную вакцинацию 1, 2 или 3 раза в год, например, в случае свиноматок: одну бустерную вакцинацию перед каждым опоросом, что в среднем составляет приблизительно 2,2 раза в год.If the target pig for the vaccine according to the invention is to be kept for more than 6 months, such as sows for breeding or boars for sperm production, they can be routinely boosted 1, 2 or 3 times a year, for example in the case of sows: one booster before each farrowing, which averages about 2.2 times a year.

В случае настоящего изобретения «приблизительно» означает, что число может варьироваться на ± 25% вокруг указанного для него значения. Предпочтительно «приблизительно» означает ± 20% от его значения, более предпочтительно «приблизительно» означает ± 15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2% от его значения или даже «приблизительно» означает ± 1% от его значения, в этом порядке предпочтения.In the case of the present invention, "approximately" means that the number may vary by ±25% around its stated value. Preferably "about" means ±20% of its value, more preferably "about" means ±15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2% of its value, or even "about" means ±1% of its value. its values, in that order of preference.

Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может использоваться либо в качестве профилактического, либо в качестве терапевтического лечения, либо и того, и другого, поскольку она препятствует как укоренению, так и развитию PCV2 инфекции или связанных заболеваний.The vaccine according to the present invention can be used either as a prophylactic or as a therapeutic treatment, or both, since it prevents both the establishment and development of PCV2 infection or related diseases.

Предпочтительно, когда вакцина в соответствии с настоящим изобретением приготовлена в форме, которая подходит для парентерального введения, т.е. в виде инъецируемой жидкости, такой как суспензия, раствор, дисперсия или эмульсия.Preferably, the vaccine according to the present invention is in a form suitable for parenteral administration, i. e. in the form of an injectable liquid such as a suspension, solution, dispersion or emulsion.

Схема введения вакцины в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно интегрирована в существующие схемы вакцинации с использованием других вакцин, которые могут потребоваться свиньям-мишеням, для уменьшения стресса для животных и сокращения трудозатрат. Эти другие вакцины могут вводиться одновременно, совместно или последовательно, способом, совместимым с их зарегистрированным применением.The vaccine schedule according to the present invention is preferably integrated into existing vaccination schedules using other vaccines that the target pigs may require to reduce animal stress and labor costs. These other vaccines may be administered simultaneously, concurrently, or sequentially, in a manner consistent with their registered use.

Вакцина в соответствии с настоящим изобретением содержит от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 мкг белка ORF2b-131P PCV2b в каждой дозе для животного. Предпочтительно, когда вакцина содержит от 0,5 до 500 мкг, от 1 до 250 или даже от 2 до 200 мкг белка ORF2b-131P PCV в каждой дозе для животного, в этом порядке предпочтения.The vaccine of the present invention contains from about 0.1 to about 1000 μg of PCV2b ORF2b-131P protein per dose to an animal. Preferably, the vaccine contains 0.5 to 500 μg, 1 to 250, or even 2 to 200 μg of ORF2b-131P PCV protein per animal dose, in that order of preference.

Количество белка ORF2b-131P в каждой дозе для животного можно определить в готовой вакцинной эмульсии, используя стандартные биохимические лабораторные процедуры, например, путем разрушения эмульсии и исследования водной фазы, используя электрофорез в SDS-ПААГ. Затем определяют количества путем сравнения с известными количествами эталонного белка, например бычьего сывороточного альбумина. См., например: The Protein Protocols Handbook, 2nd edition, September 2002, ed. J.M. Walker, Humana Press Inc., Totowa, NJ; Chapter 29, p. 237-242.The amount of ORF2b-131P protein at each animal dose can be determined in the finished vaccine emulsion using standard biochemical laboratory procedures, for example by breaking the emulsion and examining the aqueous phase using SDS-PAGE. The amounts are then determined by comparison with known amounts of a reference protein, such as bovine serum albumin. See, for example: The Protein Protocols Handbook, 2nd edition, September 2002, ed. J.M. Walker, Humana Press Inc., Totowa, NJ; Chapter 29, p. 237-242.

Альтернативно, количественное определение белка ORF2 может быть выполнено с использованием масс-спектрометрии.Alternatively, quantification of the ORF2 protein can be performed using mass spectrometry.

Предпочтительно количество белка ORF2b-131P PCV в каждой дозе для животного определяют в водном объеме антигенной фазы перед смешиванием и/или образованием эмульсии с масляной фазой.Preferably, the amount of PCV ORF2b-131P protein at each animal dose is determined in an aqueous volume of the antigenic phase prior to mixing and/or emulsification with the oil phase.

Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может вводиться в объеме, приемлемом для животного-мишени, и ее объем может, например, составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мл. Предпочтительно, когда одна доза составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мл, более предпочтительно, когда одна доза для животных составляет от 0,2 до 3 мл.The vaccine of the present invention may be administered in a volume acceptable to the target animal and may, for example, be from about 0.1 to about 10 ml. Preferably, a single dose is from about 0.1 to about 5 ml, more preferably, a single dose for animals is from 0.2 to 3 ml.

При введении внутримышечно объем одной дозы предпочтительно составляет от приблизительно 1 до приблизительно 3 мл, более предпочтительно приблизительно 2 мл. При внутрикожном введении объем одной дозы предпочтительно составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мл, более предпочтительно приблизительно 0,2 мл.When administered intramuscularly, the volume of a single dose is preferably from about 1 to about 3 ml, more preferably about 2 ml. When administered intradermally, the volume of a single dose is preferably from about 0.1 to about 0.5 ml, more preferably about 0.2 ml.

Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может вводиться свинье-мишени в соответствии со способами, известными в данной области техники. Предпочтительное применение осуществляется парентеральным путем, т.е. через кожу, например: внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подслизисто или подкожно. Более предпочтительным путем введения вакцины в соответствии с настоящим изобретением является внутримышечная или подкожная инъекция. Еще более предпочтительным является введение внутримышечно в заднюю ногу или в шею.The vaccine of the present invention may be administered to the target pig according to methods known in the art. Preferred administration is by parenteral route, ie. through the skin, for example: intramuscularly, intraperitoneally, intradermally, submucosally or subcutaneously. A more preferred route of administration of the vaccine according to the present invention is by intramuscular or subcutaneous injection. Even more preferred is intramuscular injection in the hind leg or neck.

Само собой разумеется, что оптимальный путь применения будет зависеть от характерных особенностей используемой вакцины и от конкретных характеристик мишени.It goes without saying that the optimal route of administration will depend on the characteristics of the vaccine used and on the specific characteristics of the target.

В одном варианте осуществления вакцину в соответствии с настоящим изобретением вводят внутримышечно свинье в возрасте от приблизительно 3 недель в виде однократной дозы, составляющей приблизительно 2 мл.In one embodiment, the vaccine of the present invention is administered intramuscularly to a pig from about 3 weeks of age as a single dose of about 2 ml.

Предпочтительным местом для внутримышечного введения является шея.The preferred site for intramuscular administration is the neck.

В одном варианте осуществления объем дозы введения вакцины в соответствии с настоящим изобретением внутримышечным путем является регулируемым, т.е. вакцину вводят либо в виде однократной дозы, составляющей 2 мл/животное, либо в виде двух последовательных доз по 1 мл/животное. При введении в виде двух доз, обе предпочтительно разделены во времени по крайней мере на 1 неделю, предпочтительно на 2-5 недель, более предпочтительно приблизительно на 3 недели.In one embodiment, the dose volume for administering a vaccine according to the present invention via the intramuscular route is adjustable, i.e. the vaccine is administered either as a single dose of 2 ml/animal or as two consecutive doses of 1 ml/animal. When administered as two doses, both are preferably separated in time by at least 1 week, preferably by 2-5 weeks, more preferably by about 3 weeks.

В одном варианте осуществления вакцину в соответствии с настоящим изобретением вводят внутрикожно свинье в возрасте приблизительно от 3 недель в виде однократной дозы, составляющей приблизительно 0,2 мл.In one embodiment, the vaccine of the present invention is administered intradermally to a pig at about 3 weeks of age as a single dose of about 0.2 ml.

Предпочтительное место для внутрикожного введения выбрано из: шеи, спины и задней ноги.The preferred site for intradermal administration is selected from: neck, back and hind leg.

Специалист вполне может дополнительно оптимизировать вакцину в соответствии с настоящим изобретением. Как правило, это включает точную настройку эффективности вакцины для дальнейшего увеличения обеспечиваемой ею иммунной защиты. Это может быть сделано путем регулирования дозы, объема или содержания антигена в вакцине; путем использования вакцины в другой форме или препарате; путем адаптации других компонентов вакцины (например, стабилизатора или адъюванта); или путем применения другим путем, способом или по другой схеме. Все это входит в объем настоящего изобретения.The person skilled in the art may well further optimize the vaccine in accordance with the present invention. Typically, this involves fine-tuning the effectiveness of a vaccine to further increase the immune protection it provides. This can be done by adjusting the dose, volume, or content of the antigen in the vaccine; by using the vaccine in a different form or preparation; by adapting other components of the vaccine (eg stabilizer or adjuvant); or by administering in another way, manner or scheme. All of these are within the scope of the present invention.

Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать другие соединения, такие как дополнительный антиген, цитокин или иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, содержащая неметилированный CpG и т.д. Альтернативно, вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть преимущественно скомбинирована с фармацевтическим компонентом, например, антибиотиком, гормоном, противовоспалительным или противопаразитарным средством. Или сама вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть добавлена к вакцине.The vaccine according to the present invention may further contain other compounds such as an additional antigen, a cytokine or an immunostimulatory nucleic acid containing unmethylated CpG, etc. Alternatively, the vaccine according to the present invention may advantageously be combined with a pharmaceutical component, such as an antibiotic, hormone, anti-inflammatory or antiparasitic agent. Or the vaccine itself according to the present invention can be added to the vaccine.

Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть преимущественно скомбинирована с одним или более дополнительных антигенов, например, происходящих от другого патогена для свиней. Преимущество такой комбинированной вакцины состоит в том, что она не только индуцирует иммунный ответ на PCV2, но и на другие патогены, в то время как для вакцинации требуется только одно манипулирование животным-мишенью, что также уменьшает стресс от вакцинации у животного, а также сокращает затраты времени и трудозатраты.The vaccine according to the present invention may advantageously be combined with one or more additional antigens, for example derived from another porcine pathogen. The advantage of such a combined vaccine is that it not only induces an immune response to PCV2 but also to other pathogens, while vaccination requires only one manipulation of the target animal, which also reduces the stress of vaccination in the animal, and also reduces time and labor costs.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением содержит дополнительный антиген микроорганизма, патогенного для свиней.Therefore, in a preferred embodiment, the vaccine according to the present invention contains an additional antigen of a microorganism pathogenic for pigs.

«Дополнительный антиген» может быть самим инфекционным микроорганизмом, или быть инактивированным, или субъединицей, и может быть вместе с адъювантом или без него. Дополнительный антиген может состоять из биологической или синтетической молекулы, такой как белок, углевод, липополисахарид, липид или молекула нуклеиновой кислоты. Альтернативно, он может представлять собой продукт экспрессии с нуклеиновой кислоты этого другого микроорганизма или вектора, включающего такую нуклеиновую кислоту; вектор может представлять собой сам микроорганизм или эукариотическую клетку-хозяина.The "additional antigen" may be the infectious microorganism itself, or be inactivated, or a subunit, and may be with or without an adjuvant. The additional antigen may consist of a biological or synthetic molecule, such as a protein, carbohydrate, lipopolysaccharide, lipid, or nucleic acid molecule. Alternatively, it may be an expression product from the nucleic acid of that other microorganism or a vector comprising such a nucleic acid; the vector may be the microorganism itself or a eukaryotic host cell.

Дополнительный антиген может быть «получен» из другого микроорганизма, патогенного для свиньи, любым способом, например, в виде экстракта, фракции, лизата, гомогената или полученного в результате воздействия ультразвука гомогената.The additional antigen may be "obtained" from another porcine pathogen by any means, such as an extract, fraction, lysate, homogenate, or sonicated homogenate.

«Микроорганизм, патогенный для свиней» по настоящему изобретению, хорошо известен в данной области техники. Следовательно, дополнительный антиген может быть получен в принципе из любого вируса, бактерии, паразита, гриба, риккетсии, простейшего и/или паразита, который являются патогенным для свиней.The "swine pathogenic microorganism" of the present invention is well known in the art. Therefore, the additional antigen can in principle be derived from any virus, bacterium, parasite, fungus, rickettsia, protozoan and/or parasite that is pathogenic to pigs.

Примерами таких микроорганизмов, патогенных для свиней, являются: вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), вирус псевдобешенства, парвовирус свиней, вирус классической чумы свиней, вирус гриппа свиней, вирус ящура, вирус эпидемической диареи свиней, вирус трансмиссивного гастроэнтерита, вирус везикулярного стоматита, Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Escherichia coli, Streptococcus suis, или Salmonella, Brachyspira, Clostridia, Pasteurella, Erysipelothrix, Bordetella, Toxoplasma, Isospora или Trichinella.Examples of such microorganisms pathogenic to pigs are: porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), pseudorabies virus, porcine parvovirus, classical swine fever virus, swine influenza virus, foot-and-mouth disease virus, swine epidemic diarrhea virus, transmissible gastroenteritis virus, vesicular stomatitis virus , Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Escherichia coli, Streptococcus suis, or Salmonella, Brachyspira, Clostridia, Pasteurella, Erysipelothrix, Bordetella, Toxoplasma, Isospora, or Trichinella.

В предпочтительном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина содержит наряду с антигеном из PCV2 один или более антигенов микроорганизма, патогенного для свиней, выбранных из группы, состоящей из M. hyopneumoniae, L. intracellularis и PRRSV.In a preferred embodiment of the vaccine according to the present invention, the vaccine contains, along with an antigen from PCV2, one or more antigens of a porcine pathogen selected from the group consisting of M. hyopneumoniae, L. intracellularis and PRRSV.

Поскольку в настоящее время они являются самыми известными патогенами для свиней, их комбинация в готовой вакцине для однократного введения очень выгодна как с экономической, так и с ветеринарной точки зрения.Since they are currently the best known pathogens in swine, their combination in a single dose formulation is very advantageous from both an economic and a veterinary point of view.

В предпочтительном варианте осуществления один или более дополнительных антигенов добавляют в вакцину в соответствии с настоящим изобретением в виде лиофилизированного препарата, и в результате комбинированную вакцину получают путем воссоздания с использованием вакцинной эмульсии по настоящему изобретению. Это описано, например, в WO 2010/106095.In a preferred embodiment, one or more additional antigens are added to the vaccine in accordance with the present invention in the form of a lyophilized preparation, and as a result, a combined vaccine is obtained by reconstitution using the vaccine emulsion of the present invention. This is described, for example, in WO 2010/106095.

В предпочтительном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением представляет собой комбинированную вакцину, содержащую мутантный белок ORF2 PCV2b и антиген из М. hyopneumoniae, и указанную комбинированную вакцину используют для воссоздания лиофилизированного препарата антигена из L. intracellulars и/или из PRRSV.In a preferred embodiment, the vaccine according to the present invention is a combination vaccine containing a mutant PCV2b ORF2 protein and an antigen from M. hyopneumoniae, and said combination vaccine is used to reconstitute a lyophilized preparation of an antigen from L. intracellulars and/or from PRRSV.

В предпочтительном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением представляет собой комбинированную вакцину, содержащую мутантный белок ORF2 PCV2b, антиген из М. hyopneumoniae и антиген из L. intracellulars, и указанную комбинированную вакцину используют для воссоздания лиофилизированного препарата антигена из PRRSV.In a preferred embodiment, the vaccine of the present invention is a combination vaccine comprising a mutant PCV2b ORF2 protein, an antigen from M. hyopneumoniae and an antigen from L. intracellulars, and said combination vaccine is used to reconstitute a lyophilized antigen preparation from PRRSV.

В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания у свиньи, при этом способ включает введение указанному животному вакцины в соответствии с настоящим изобретением.In a further aspect, the present invention relates to a method for suppressing PCV2 infection or associated signs of disease in a pig, the method comprising administering to said animal a vaccine in accordance with the present invention.

Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена способами, хорошо известными специалисту. Как описано, использование мутантного белка ORF2 PCV2b, описанного для настоящего изобретения, или клеток насекомых, описанных для настоящего изобретения, делает возможным производство вакцины для свиней, описанной для настоящего изобретения. В этом отношении мутантный белок ORF2 PCV2b также можно получить способом в соответствии с настоящим изобретением.The vaccine according to the present invention may be prepared by methods well known to the skilled person. As described, the use of the mutant PCV2b ORF2 protein described for the present invention or insect cells described for the present invention enables the production of the swine vaccine described for the present invention. In this regard, a mutant PCV2b ORF2 protein can also be produced by the method of the present invention.

Следовательно, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к применению мутантного белка ORF2 PCV2b, имеющего пролин в аминокислотном положении под номером 131, для производства вакцины для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания.Therefore, in a further aspect, the present invention relates to the use of a mutant PCV2b ORF2 protein having a proline at amino acid position 131 for the production of a pig vaccine for suppressing PCV2 infection or disease associated symptoms.

В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к мутантному белку ORF2 PCV2b, имеющему пролин в аминокислотном положении под номером 131, для применения в вакцине для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания.In a further aspect, the present invention relates to a mutant PCV2b ORF2 protein having a proline at amino acid position 131 for use in a swine vaccine for suppressing PCV2 infection or associated signs of disease.

В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу приготовления вакцины в соответствии с настоящим изобретением, включающему одну или более стадий, выбранных из:In a further aspect, the present invention relates to a method for preparing a vaccine in accordance with the present invention, comprising one or more steps selected from:

- смешивания мутантного белка ORF2 PCV2b, имеющего пролин в аминокислотном положении под номером 131, с фармацевтически приемлемым носителем; иmixing the mutant PCV2b ORF2 protein having a proline at amino acid position 131 with a pharmaceutically acceptable carrier; and

- составления указанной смеси мутантного белка ORF2 PCV2b и фармацевтически приемлемого носителя вместе с адъювантом.- formulating said mixture of the PCV2b ORF2 mutant protein and a pharmaceutically acceptable carrier together with an adjuvant.

Для применения в способе приготовления вакцины в соответствии с настоящим изобретением мутантный белок ORF2 PCV2b получают способом экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых в соответствии с настоящим изобретением и/или получают способом получения мутантного белка ORF2 PCV2b в соответствии с настоящим изобретением.For use in a vaccine preparation method according to the present invention, a mutant PCV2b ORF2 protein is produced by the method of expressing a mutant PCV2b ORF2 protein in insect cells according to the present invention and/or is obtained by a method for producing a mutant PCV2b ORF2 protein according to the present invention.

В одном варианте осуществления способа приготовления вакцины в соответствии с настоящим изобретением мутантный белок ORF2 находится в форме VLP.In one embodiment of the vaccine preparation method according to the present invention, the mutant ORF2 protein is in the form of a VLP.

Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена специалистом в форме, которая подходит для введения свинье-мишени и которая соответствует желаемому пути применения и желаемому эффекту. Обычно такие вакцины готовятся стерильными и при физиологическом pH.The vaccine according to the present invention can be prepared by the person skilled in the art in a form which is suitable for administration to the target pig and which corresponds to the desired route of administration and the desired effect. Typically, such vaccines are prepared sterile and at physiological pH.

Подробности и примеры способа, применения или способа приготовления вакцины в соответствии с настоящим изобретением описаны здесь, и такие процедуры легко применимы специалистом в данной области техники с использованием обычных материалов и способов. Например, мутантный белок ORF2 PCV2b, описанный для настоящего изобретения, можно продуцировать в клетках насекомых в промышленном масштабе, а затем объединить с фармацевтически приемлемыми наполнителями, составить в вакцину, например, путем эмульгирования с маслом в качестве адъюванта и заполнить вакциной контейнеры соответствующего размера. Различные стадии производственного процесса будут контролироваться с помощью соответствующих исследований, например иммунологических исследований на качество и количество антигенов; микробиологических исследований на инактивацию, стерильность и отсутствие посторонних агентов; и, в конечном итоге, путем проведений вакцинаций животных для подтверждения эффективности и безопасности. После завершения проверок качество, количества и стерильности вакцинный продукт может быть разрешен для продажи.Details and examples of the method, use, or method for preparing a vaccine in accordance with the present invention are described herein, and such procedures are readily applicable to a person skilled in the art using conventional materials and methods. For example, the mutant PCV2b ORF2 protein described for the present invention can be produced in insect cells on an industrial scale and then combined with pharmaceutically acceptable excipients, formulated into a vaccine, for example by emulsification with oil as an adjuvant, and filled with appropriately sized containers with the vaccine. The various stages of the manufacturing process will be controlled by appropriate tests, such as immunological tests for the quality and quantity of antigens; microbiological studies for inactivation, sterility and the absence of foreign agents; and, ultimately, by vaccinating animals to confirm efficacy and safety. Once quality, quantity and sterility checks are completed, the vaccine product may be released for sale.

Все это хорошо известно специалисту, и общие методы и соображения, применимые к приготовлению вакцин, описаны, например, в правительственных директивах и правилах (Pharmacopoeia, 9CFR) и общеизвестных руководствах (Pastoret, Lippincot, выше).All of this is well known to those skilled in the art, and general methods and considerations applicable to the preparation of vaccines are described, for example, in government guidelines and regulations (Pharmacopoeia, 9CFR) and well-known guidelines (Pastoret, Lippincot, supra).

Теперь настоящее изобретение будет дополнительно описано с помощью следующих неограничивающих примеров.Now the present invention will be further described using the following non-limiting examples.

ПримерыExamples

Пример 1. Сборка различных рекомбинантных конструкций, экспрессирующих ORF2 PCV2.Example 1 Assembly of various recombinant PCV2 ORF2 constructs.

Для экспрессии белков ORF2 PCV2 в клетках насекомых создавали рекомбинантные бакуловирусы, используя стандартные процедуры. Вкратце:To express PCV2 ORF2 proteins in insect cells, recombinant baculoviruses were generated using standard procedures. In short:

Использованные в этих экспериментах гены ORF2 PCV2 дикого типа были получены из различных источников: исходный вирус PCV2a был из вакцинного штамма из США; PCV2b был из французского изолята Imp1011, с номером доступа в GenBank: AF055394; PCV2d был из Китая, штамма BDH, с номером доступа в GenBank: HM038017.The wild-type PCV2 ORF2 genes used in these experiments were obtained from various sources: the original PCV2a virus was from a US vaccine strain; PCV2b was from the French isolate Imp1011, GenBank accession number: AF055394; PCV2d was from China, BDH strain, with GenBank accession number: HM038017.

Ген ORF2 субклонировали путем амплификации с использованием ПЦР и встраивания в плазмиду для клонирования. Затем некоторые из генов ORF2 были мутированы, также для кодирования пролина в аминокислотном положении 131, используя мутацию с помощью ПЦР. Альтернативно или дополнительно, гены ORF2 оптимизировали в отношении частоты использования кодонов, ради сходства с таблицей частоты использования кодонов в гене полиэдрина AcMNPV. Мутированные последовательности, используемые здесь для PCV2b, представлены в прилагаемом списке последовательностей, как описано.The ORF2 gene was subcloned by PCR amplification and insertion into a cloning plasmid. Then, some of the ORF2 genes were mutated, also to encode a proline at amino acid position 131, using mutation by PCR. Alternatively or additionally, the ORF2 genes have been optimized in terms of codon usage, for the sake of being similar to the codon usage table in the AcMNPV polyhedrin gene. The mutated sequences used here for PCV2b are presented in the attached sequence listing as described.

Синтетические конструкции вставок мутированных генов ORF2 заказывали у коммерческого поставщика (BaseClear, Нидерланды; или Genscript, Piscataway, NJ, США).Synthetic insert constructs for the mutated ORF2 genes were ordered from a commercial supplier (BaseClear, The Netherlands; or Genscript, Piscataway, NJ, USA).

Для использования с системой Bac-to-Bac их субклонировали в вектор для клонирования pFastBad, а для использования с системой ProEasy в вектор для переноса pVL1393. В обоих случаях вставка находилась за промотором гена полиэдрина. Создание и отбор рекомбинантного бакуловируса осуществляли в соответствии с инструкциями производителя. Некоторые из рекомбинантных бакуловирусных конструкций для PCV2a конструировали с использованием классического набора методов трансфекции и выделения рекомбинантов путем посева инфицированных клеток насекомых под мягким агаром и отбора бляшек налета.They were subcloned into the pFastBad cloning vector for use with the Bac-to-Bac system and into the pVL1393 transfer vector for use with the ProEasy system. In both cases, the insert was located behind the promoter of the polyhedrin gene. The creation and selection of recombinant baculovirus was carried out in accordance with the manufacturer's instructions. Some of the recombinant baculovirus constructs for PCV2a were constructed using a classic set of transfection techniques and isolation of recombinants by seeding infected insect cells under soft agar and collecting plaque plaques.

Все рекомбинантные бакуловирусы амплифицировали в клетках Sf9, собирали, хранили в холодильнике или замораживали и титровали. Запасы вирусов, используемые для дальнейших экспериментов, составляли, как правило, от 7,5 до 8,5 Log10 TCID50/мл (дозы заражения 50% культуры ткани/мл).All recombinant baculoviruses were amplified in Sf9 cells, harvested, refrigerated or frozen, and titrated. Virus stocks used for further experiments were typically 7.5 to 8.5 Log10 TCID50/mL (50% tissue culture infection doses/mL).

Набор рекомбинантных бакуловирусов, используемых для экспрессии белка ORF2 PCV2 в клетках насекомых, приведен в таблице ниже:The set of recombinant baculoviruses used to express the PCV2 ORF2 protein in insect cells is shown in the table below:

Примечание: Все вставки находились за промотором гена полиэдрина. Оптимизация в отношении частоты использования кодонов (при применении) была направлена на частоту использование кодонов в гене полиэдрина AcMNPV.Note: All inserts were behind the promoter of the polyhedrin gene. Optimization with respect to the frequency of use of codons (when applied) was directed to the frequency of use of codons in the AcMNPV polyhedrin gene.

Номер вирусаVirus number Генотип PCV2PCV2 genotype Бакуловирусная конструкцияBaculovirus construct Оптимизация частоты использования кодоновCodon frequency optimization Аминокислота в положении 131Amino acid at position 131 1one 2a2a отобранная бляшкаselected plaque НетNot ПролинProline 22 2a2a отобранная бляшкаselected plaque ДаYes ПролинProline 33 2a2a Bac-to-Bacbac-to-bac НетNot ПролинProline 4four 2a2a Bac-to-Bacbac-to-bac ДаYes ПролинProline 55 2a2a ProEasyProEasy ДаYes ПролинProline 66 2b2b Bac-to-Bacbac-to-bac НетNot ТреонинThreonine 77 2b2b Bac-to-Bacbac-to-bac ДаYes ТреонинThreonine 8eight 2b2b Bac-to-Bacbac-to-bac НетNot ПролинProline 99 2b2b ProEasyProEasy ДаYes ПролинProline 10ten 2b2b ProEasyProEasy ДаYes ПролинProline

Пример 2: Экспрессия в клетках насекомых Example 2: Expression in insect cells

Различные рекомбинантные бакуловирусные конструкции, описанные выше, использовали для инфицирования клеток насекомых и экспрессии нескольких вариантов белка ORF2 PCV2. Полученный белок визуализировали и анализировали для оценки эффекта различных введенных мутаций по сравнению с немодифицированным белком или с белком PCV2 другого генотипа. Некоторые рекомбинантные бакуловирусы были масштабированы для производства белка для приготовления субъединичной вакцины против PCV2 для тестирования на свиньях.The various recombinant baculovirus constructs described above have been used to infect insect cells and express several PCV2 ORF2 protein variants. The resulting protein was visualized and analyzed to evaluate the effect of the various introduced mutations compared to the unmodified protein or the PCV2 protein of a different genotype. Several recombinant baculoviruses have been scaled up to produce a protein for the preparation of a PCV2 subunit vaccine for testing in pigs.

2.1 КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ2.1 INSECT CULTURES

Стандартные эксперименты по инфицированию и экспрессии проводились в небольшом масштабе, используя клетки насекомых Sf9, которые были взяты из спин-культуры чистых клеток, которые регулярно разделялись для поддержания экспоненциального роста. Типичные показатели инфицирования составляли от 0,01 до 0,1 MOI (множественность заражения), а продолжительности культивирования составляли от 3 до 5 дней. Культуры регулярно контролировали с помощью световой микроскопии для проверки здорового состояния неинфицированных клеток или для контролирования хода репликации вирусов в инфицированных культурах.Standard infection and expression experiments were carried out on a small scale using Sf9 insect cells that were taken from pure cell spin cultures that were regularly split to maintain exponential growth. Typical infection rates were 0.01 to 0.1 MOI (multiplicity of infection) and culture times were 3 to 5 days. The cultures were regularly monitored by light microscopy to check the healthy state of uninfected cells or to monitor the progress of viral replication in infected cultures.

Используемые сосуды для культивирования представляли собой или T25, или T75 матрасы (Falcon) с однослойными культурами объемом 5 или 15 мл, соответственно. Альтернативно, 100 мл суспензионных культур помещали во вращающиеся колбы (Corning). Колбы инкубировали при 27°С, и использовали культуральную среду Sf-900™ II (Thermo Fisher Scientific). Не добавляли сыворотку, но добавляли смесь антибиотиков: 50 мкг/мл гентамицина и 0,25% натамицина.The culture vessels used were either T25 or T75 mats (Falcon) with 5 ml or 15 ml single layer cultures, respectively. Alternatively, 100 ml of suspension cultures were placed in spinner flasks (Corning). Flasks were incubated at 27° C. and culture medium Sf-900™ II (Thermo Fisher Scientific) was used. Serum was not added, but a mixture of antibiotics was added: 50 μg/ml gentamicin and 0.25% natamycin.

Когда большинство клеток демонстрировали цитопатическое действие (cpe), культуры собирали: в случае культур в T-матрасах требовалось постукивание изо всех сил для отсоединения клеток. Затем собранные культуры центрифугировали, и супернатант культуры отбрасывали, поскольку продуцированный белок ORF2 в основном содержался в клетках насекомых. В зависимости от предполагаемого дальнейшего использования клеточный осадок можно было затем ресуспендировать в требуемой жидкости в желаемой концентрации.When most of the cells showed cytopathic activity (cpe), the cultures were harvested: in the case of cultures in T-matts, a vigorous tapping was required to detach the cells. Then, the harvested cultures were centrifuged and the culture supernatant was discarded because the produced ORF2 protein was mainly contained in insect cells. Depending on the intended future use, the cell pellet could then be resuspended in the desired liquid at the desired concentration.

Мелкомасштабные культуры обычно не инактивировали; образцы либо использовали в защитных приспособлениях, либо обрабатывали денатурирующим буфером для образцов для электрофореза, а затем считали инактивированными.Small-scale cultures are usually not inactivated; the samples were either used in guards or treated with denaturing electrophoresis sample buffer and then considered inactivated.

Крупномасштабные культуры выполняли в основном по той же схеме, с регулированием объема и с адаптацией к оборудованию. В экспериментальных условиях промежуточные крупномасштабные суспензионные культуры клеток насекомых выполняли в объеме от 2 до 10 литров в промышленных ферментерах с автоматическим контролем процесса. Чистые клетки насекомых Sf9 получали из предварительной культуры. MOI составляла от 0,01 до 0,1, и культивирование длилось 5-7 дней. Когда инфекция развивалась в достаточной степени, клетки оставляли оседать под действием силы тяжести. Затем верхние 90% объема культуры удаляли, клетки собирали в 1/10 от исходного объема культуры и лизировали обработкой ультразвуком. Обработку ультразвуком в среднем масштабе выполняли партиями на льду с использованием ультразвукового дезинтегратора с тонким концом (Vibra Cell™, Sonics, CT, США). В больших масштабах (в объемах 100 л или более) обработка ультразвуком проводилась путем пропускания через проточную камеру для обработки ультразвуком (Sonobloc™, Bandelin).Large-scale cultures were performed in basically the same way, with volume control and adaptation to the equipment. Under experimental conditions, intermediate large-scale insect cell suspension cultures were performed in a volume of 2 to 10 liters in industrial fermenters with automatic process control. Pure Sf9 insect cells were obtained from the pre-culture. MOI ranged from 0.01 to 0.1, and the cultivation lasted 5-7 days. When the infection developed sufficiently, the cells were left to settle under the influence of gravity. Then the top 90% of the culture volume was removed, the cells were collected in 1/10 of the original culture volume and lysed by sonication. Medium scale sonication was performed in batches on ice using a fine tip sonicator (Vibra Cell™, Sonics, CT, USA). On a large scale (volumes of 100 L or more), sonication was performed by passing through a sonication flow chamber (Sonobloc™, Bandelin).

Затем гомогенат, полученный при воздействии ультразвука, инактивировали с использованием BEI. Затем его нейтрализовали с использованием Na-тиосульфата. Затем инактивированный сбор осветляли центрифугированием, и супернатант, содержащий белок ORF2, сохраняли в виде водной фазы основной массы антигена. Ее хранили при 2-8°C для контроля качества и дальнейшей обработки. В этих продуктах фармацевтически приемлемый носитель для антигена, таким образом, представляет собой истощенную в результате культивирования клеток насекомых среду. При необходимости основную массу антигена можно было сконцентрировать или подвергнуть диализу против PBS. Альтернативно, антиген мог быть разбавлен свежей средой для культивирования клеток насекомых или PBS.The sonicated homogenate was then inactivated using BEI. It was then neutralized using Na-thiosulfate. The inactivated harvest was then clarified by centrifugation, and the supernatant containing the ORF2 protein was retained as the aqueous phase of the bulk antigen. It was stored at 2-8°C for quality control and further processing. In these products, the pharmaceutically acceptable carrier for the antigen is thus depleted from insect cell culture. If necessary, the bulk of the antigen could be concentrated or dialyzed against PBS. Alternatively, the antigen could be diluted with fresh insect cell culture medium or PBS.

2.2 ELISA2.2 ELISA

2.2.1 Схема ELISA2.2.1 ELISA scheme

Культуры клеток насекомых инфицировали рекомбинантными бакуловирусами под № 6 (Треонин в положении 131) или вирусом под № 8 (с заменой T131P) для проверки эффекта замены T131P в белке ORF2 PCV2b. Оба являются конструкциями в формате Bac-2-Bac и были без оптимизации в отношении частоты использования кодонов. В случае вируса 6 были исследованы два изолята.Insect cell cultures were infected with recombinant baculovirus #6 (Threonine at position 131) or virus #8 (with T131P substitution) to test the effect of the T131P substitution in the PCV2b ORF2 protein. Both are constructs in the Bac-2-Bac format and were not optimized for codon usage. In the case of virus 6, two isolates were tested.

Содержащиеся в T175 матрасах культуры клеток Sf9 инфицировали, инкубировали и собирали центрифугированием всей культуры. Клеточные осадки помещали в 10 мл воды для инъекций, которая эффективно лизировала все клетки. Клеточные лизаты затем исследовали на их антигенную массу в сэндвич-ELISA, кратко следующим образом:Sf9 cell cultures contained in T175 mattresses were infected, incubated and harvested by centrifugation of the entire culture. Cell pellets were placed in 10 ml water for injection, which effectively lysed all cells. The cell lysates were then examined for their antigenic mass in a sandwich ELISA, briefly as follows:

Лунки микропланшета для титрования из полистирола покрывали моноклональным антителом, направленным против ORF2a PCV2. Серийные разведения образцов лизатов инкубировали вместе с рядом разведений известного аналитического стандарта ORF2 PCV2a. Затем планшеты инкубировали с фиксированным количеством второго антитела, также направленного против ORF2a PCV2, которое было конъюгировано с биотином. Наконец, количество связанного конъюгата затем количественно анализировали путем инкубации со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой, с последующим определением хромофоров с помощью автоматического планшет-ридера.The wells of a polystyrene microtiter plate were coated with a monoclonal antibody directed against PCV2 ORF2a. Serial dilutions of lysate samples were incubated with a series of dilutions of the known analytical standard ORF2 PCV2a. The plates were then incubated with a fixed amount of a second antibody, also directed against PCV2 ORF2a, which was conjugated with biotin. Finally, the amount of bound conjugate was then quantified by incubation with peroxidase-conjugated streptavidin, followed by determination of chromophores using an automatic plate reader.

Количество антигена в лизатах рассчитывали по аналитическому стандарту, количество антигена в котором было произвольно установлено на уровне 100 антигенных единиц (AU)/мл.The amount of antigen in the lysates was calculated from an analytical standard, the amount of antigen in which was arbitrarily set at 100 antigenic units (AU)/ml.

2.2.2 Результаты и выводы ELISA2.2.2 ELISA results and conclusions

Количество белка ORF2, обнаруженного в лизатах, было следующим:The amount of ORF2 protein found in the lysates was as follows:

- клетки, инфицированные вирусом 6 (два варианта): 5,5 и 7,4 AU/мл,- cells infected with virus 6 (two variants): 5.5 and 7.4 AU/ml,

- клетки, инфицированные вирусом 8: 68 AU/мл.- cells infected with virus 8: 68 AU/ml.

Лизат, приготовленный в чистой воде из клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом, экспрессирующим белок ORF2 PCV2b без мутации в положении 131, содержал лишь очень незначительное количество белка ORF2, как обнаружено с помощью ELISA. Однако такой лизат из клеток, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим ORF2 с заменой T131P, содержал приблизительно в 10 раз больше белка.A lysate prepared in pure water from cells infected with a recombinant virus expressing PCV2b ORF2 protein without mutation at position 131 contained only a very small amount of ORF2 protein, as detected by ELISA. However, this lysate from cells infected with recombinant baculovirus expressing ORF2 with T131P substitution contained approximately 10 times more protein.

Эти результаты ELISA иллюстрируют большую разницу в количестве белка ORF2, который мог быть без труда выделен из инфицированных клеток насекомых, с заменой или без замены аминокислоты под номером 131 в ORF2. С одной стороны, это было связано с легкостью, с которой белок высвобождается в неденатурирующем лизате. С другой стороны, это также отражало разницу в общей продукции белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых, без или без мутации аминокислоты в положении 131. These ELISA results illustrate the large difference in the amount of ORF2 protein that could be readily isolated from infected insect cells, with or without substitution of amino acid number 131 in ORF2. On the one hand, this was due to the ease with which the protein is released into the non-denaturing lysate. On the other hand, it also reflected a difference in overall PCV2b ORF2 protein production in insect cells, with or without amino acid mutation at position 131.

2.3 ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ2.3 IMMUNOFLUORESCENCE ASSAY

2.3.1 Схема IFT анализов2.3.1 Scheme of IFT analyzes

Для иммунофлюоресцентных исследований (IFT) чистые клетки насекомых высевали в лунки 96-луночного микропланшета для титрования, обычно в количестве 2,5×10⁴ клеток в каждую лунку, в 100 мкл среды. После прикрепления клетки инфицировали конкретным рекомбинантным бакуловирусом, подлежащим исследованию. Как правило, инокулировали ряд разведений вируса для обеспечения возможности наблюдения при различных MOI. Планшеты анализировали через 4-5 дней инкубации, когда клетки насекомых становились должным образом инфицированными, но еще не подвергались лизису. Среду удаляли, клетки фиксировали холодным этанолом и окрашивали соответствующими антителами в соответствии со стандартными процедурами. FITC-конъюгированное второе антитело использовали для визуализации. Клетки насекомых подвергали контрастному окрашиванию голубым Эванса для усиления контраста с фоном.For immunofluorescence assays (IFT), pure insect cells were plated in the wells of a 96-well microtiter plate, typically at 2.5 x 10 ⁴ cells per well, in 100 μl of medium. After attachment, the cells were infected with the specific recombinant baculovirus to be tested. Typically, a number of virus dilutions were inoculated to allow observation at various MOIs. The plates were analyzed after 4-5 days of incubation when the insect cells were properly infected but not yet lysed. The medium was removed, the cells were fixed with cold ethanol and stained with the appropriate antibodies according to standard procedures. The FITC-conjugated second antibody was used for imaging. The insect cells were counterstained with Evans blue to enhance the contrast with the background.

В этих IFT исследованиях используемое первое антитело представляло собой антисыворотку с поликлональными антителами против PCV2a свиней, оно была также способно окрашивать белок ORF2 генотипа PCV2b и PCV2d.In these IFT studies, the first antibody used was a porcine anti-PCV2a polyclonal antiserum, which was also capable of staining the PCV2b and PCV2d genotype ORF2 protein.

2.3.2 Результаты IFT анализов2.3.2 Results of IFT analyzes

При сравнении результатов IFT, наблюдаемых для различных продуктов экспрессии белка ORF2, было сделано несколько наблюдений:When comparing IFT results observed for different ORF2 protein expression products, several observations were made:

- Рекомбинантные вирусы 1-5, описанные выше, все экспрессирующие белок ORF2 PCV2a, все без исключения приводили к картине цитоплазматического окрашивания, в результате чего по существу вся клетка насекомого демонстрировала яркую окраску.- The recombinant viruses 1-5 described above, all expressing the PCV2a ORF2 protein, without exception, all resulted in a cytoplasmic staining pattern, resulting in essentially the entire insect cell showing a bright color.

- Однако клетки насекомых, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом под № 6, экспрессирующим белок ORF2 PCV2b дикого типа, демонстрировали существенно иную картину, когда окрашивание обнаруживалось исключительно вокруг ядра клеток насекомых. Цитоплазматического окрашивания не наблюдалось.- However, insect cells infected with recombinant baculovirus #6 expressing wild type PCV2b ORF2 protein showed a significantly different pattern when staining was found exclusively around the insect cell nucleus. No cytoplasmic staining was observed.

- Эта IFT картина была в значительной степени такой же для клеток насекомых, инфицированных вирусом под № 7, который также экспрессирует белок ORF2 PCV2b, но с оптимизированного в отношении частоты использования кодонов гена. Единственным отличием было то, что небольшое количество (приблизительно 10% клеток насекомых) продемонстрировало цитоплазматическое окрашивание, в то время как большинство клеток все еще демонстрировали ядерное окрашивание.- This IFT pattern was largely the same for insect cells infected with virus no. 7, which also expresses the PCV2b ORF2 protein, but with a codon-optimized gene. The only difference was that a small number (approximately 10% of insect cells) showed cytoplasmic staining, while most of the cells still showed nuclear staining.

- Удивительно, но клетки насекомых, инфицированные вирусом под № 8, давали IFT картину, которая была противоположной картине в случае рекомбинантного вируса под № 7: большинство клеток насекомых демонстрировали цитоплазматическое окрашивание, при этом некоторые клетки все еще демонстрировали ядерное окрашивание. Вирус под № 8 имел ген ORF2 PCV2b, в котором кодон, кодирующий аминокислоту под № 131, был мутирован с заменой треонина на пролин (T131P).- Surprisingly, insect cells infected with virus no. 8 produced an IFT pattern that was the opposite of recombinant virus no. 7: most insect cells showed cytoplasmic staining, while some cells still showed nuclear staining. Virus #8 had the PCV2b ORF2 gene in which the codon encoding amino acid #131 was mutated from threonine to proline (T131P).

- Наконец, клетки насекомых, инфицированные вирусом под № 9 (ген ORF2 PCV2b с оптимизацией в отношении частоты использования кодонов и с заменой T131P, в чистой конструкции), исключительно все продемонстрировали цитоплазматическое окрашивание.- Finally, insect cells infected with virus no. 9 (PCV2b ORF2 gene with codon frequency optimization and T131P substitution, in a pure construct) exclusively all showed cytoplasmic staining.

- Примечательно, что клетки насекомых, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом под № 10 (кодирующим белок ORF2 PCV2d с заменой T131P, с оптимизацией в отношении частоты использования кодонов и в чистой конструкции), все еще демонстрировали картину ядерного окрашивания.- Notably, insect cells infected with recombinant baculovirus #10 (encoding PCV2d ORF2 protein with T131P substitution, optimized for codon frequency and in pure construct) still showed a nuclear staining pattern.

2.3.3 Выводы из IFT анализов2.3.3 Findings from IFT analyzes

Был сделан вывод, что для эффективной экспрессии белка ORF2 из PCV2b в клетках насекомых требуется замена аминокислоты в положении под номером 131 на пролин, демонстрируя картину цитоплазматического окрашивания в IFT с использованием антитела против PCV2a. Без такой мутации белок ORF2 PCV2b демонстрировал окрашивание исключительно в или вокруг ядра клетки насекомого, экспрессирующей этот белок.It was concluded that efficient expression of the PCV2b ORF2 protein in insect cells requires the amino acid change at position number 131 to proline, demonstrating a cytoplasmic staining pattern in IFT using an anti-PCV2a antibody. Without such a mutation, the PCV2b ORF2 protein showed staining exclusively in or around the nucleus of the insect cell expressing this protein.

Мутация в гене ORF2 лишь в результате оптимизации в отношении частоты использования кодонов привела к небольшому смещению картины окрашивания при IFT, вероятно, в результате увеличения эффективности экспрессии.Mutation in the ORF2 gene alone as a result of optimization in terms of codon usage resulted in a slight shift in the IFT staining pattern, probably as a result of increased expression efficiency.

Картина ядерного окрашивания могла быть, кроме того, изменена на противоположную, когда рекомбинантный бакуловирус не был основан на конструкции, содержащей остаточные элементы из вектора для клонирования (например, в рекомбинанте, полученном с использованием системы Bac-to-Bac), но представлял собой «чистую» бакуловирусную конструкцию, т.е. не содержал дополнительные генетические элементы в процессе рекомбинации в своем геноме. Такие чистые рекомбинантные бакуловирусы могут быть получены с использованием классической гомологичной рекомбинации и очистки из бляшек или, что более удобно, с использованием коммерческого набора, такого как система ProEasy.The nuclear stain pattern could also be reversed when the recombinant baculovirus was not based on a construct containing residual elements from a cloning vector (e.g. in a recombinant generated using the Bac-to-Bac system), but was " "pure" baculovirus construct, i.e. did not contain additional genetic elements in the process of recombination in its genome. Such pure recombinant baculoviruses can be obtained using classical homologous recombination and plaque purification, or more conveniently using a commercial kit such as the ProEasy system.

Таким образом: изменение картины ядерного окрашивания при IFT на противоположную, наблюдаемое в клетках насекомых, экспрессирующих белок ORF2 PCV2b, может быть достигнуто путем мутации триплета, кодирующего аминокислоту ORF2 под номером 131, для кодирования пролина. Дальнейшая оптимизация цитоплазматической экспрессии белка ORF2 может быть достигнута с помощью оптимизации в отношении частоты использования кодонов кодирующего гена и использования чистой рекомбинантной бакуловирусной конструкции.Thus: the reversal of the IFT nuclear staining pattern observed in insect cells expressing PCV2b ORF2 protein can be achieved by mutating the triplet encoding ORF2 amino acid number 131 to encode proline. Further optimization of the cytoplasmic expression of the ORF2 protein can be achieved by optimizing the codon frequency of the coding gene and using a pure recombinant baculovirus construct.

2.4 Количественная оценка с помощью гель-электрофореза2.4 Quantification by gel electrophoresis

2.4.1 Схема гель-электрофорезных анализов2.4.1 Scheme of gel electrophoresis analyzes

Для обеспечения количественной оценки уровня экспрессии различных белков ORF2 образцы культур инфицированных клеток насекомых были подвергнуты электрофорезу в SDS-ПААГ, вместе с дорожками с известными количествами бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве маркерного белка. После окрашивания гели сканировали и анализировали. Используя сильно денатурирующий буфер для образцов, этот эксперимент выявил общую способность к экспрессии клеток насекомых, инфицированных различными рекомбинантными бакуловирусными конструкциями.In order to quantify the level of expression of various ORF2 proteins, culture samples of infected insect cells were subjected to SDS-PAGE, along with lanes with known amounts of bovine serum albumin (BSA) as a marker protein. After staining, the gels were scanned and analyzed. Using a highly denaturing sample buffer, this experiment revealed the general expression ability of insect cells infected with various recombinant baculovirus constructs.

Различные рекомбинантные бакуловирусы, подлежащие исследованию, культивировали в T75 матрасах, как описано, собирали, центрифугировали, и клеточные осадки суспедировали в 7,5 мл PBS. Образцы супернатанта и ресуспендированных клеток затем помещали в стандартный денатурирующий буфер для образцов Laemmli для электрофореза в SDS-ПААГ (содержащий индикатор бромфеноловый синий и бета-меркаптоэтанол).The various recombinant baculoviruses to be tested were cultured in T75 mattresses as described, harvested, centrifuged, and the cell pellets were suspended in 7.5 ml PBS. Supernatant and resuspended cell samples were then placed in standard Laemmli SDS-PAGE denaturing sample buffer (containing the indicator bromophenol blue and beta-mercaptoethanol).

Образцы подвергали электрофорезу в стандартных полиакриламидных гелях (готовых Criterion TGX™, Any kD (15%), Bio-Rad) в стандартном электродном буфере Трис-глицин-SDS. После электрофореза гели окрашивали Instant Blue™ (Expedeon). Наконец, гели оцифровывали и анализировали с помощью откалиброванного денситометра Bio-Rad GS-900, используя программное обеспечение Image Lab™, версии 5.2.1, для определения количества белка в отдельных полосах в геле.Samples were electrophoresed on standard polyacrylamide gels (off-the-shelf Criterion TGX™, Any kD (15%), Bio-Rad) in standard Tris-glycine-SDS electrode buffer. After electrophoresis, the gels were stained with Instant Blue™ (Expedeon). Finally, the gels were digitized and analyzed with a calibrated Bio-Rad GS-900 densitometer using Image Lab™ software version 5.2.1 to determine the amount of protein in individual bands in the gel.

2.4.2. Результаты гель-электрофорезного анализа2.4.2. Results of gel electrophoresis analysis

На фиг. 1 и 2 представлены некоторые репрезентативные изображения геля, например, использованные в этих экспериментах: Фиг. 1: образцы культур клеток насекомых, инфицированных вирусами под № 3, 6 или 7; и Фиг. 2: образцы культур с вирусами под № 8 или 9. Для каждого типа вируса первая дорожка содержит образец супернатанта культуры, следующие три дорожки содержат образцы 2х концентрированных клеток в объеме 30, 20 и 10 мкм, слева направо. Самая левая и самая правая дорожки: маркеры молекулярной массы 10-250 кДа (Precision Plus Protein™ Standards, Bio-Rad), размеры полос указаны на фигурах.In FIG. 1 and 2 are some representative images of the gel, for example, used in these experiments: FIG. 1: culture samples of insect cells infected with viruses no. 3, 6 or 7; and Fig. 2: culture samples with viruses numbered 8 or 9. For each type of virus, the first lane contains a sample of the culture supernatant, the next three lanes contain samples of 2 concentrated cells in a volume of 30, 20 and 10 µm, from left to right. Leftmost and rightmost lanes: 10-250 kDa molecular weight markers (Precision Plus Protein™ Standards, Bio-Rad), lane sizes are shown in the figures.

Каждый гель также содержал ряд разбавлений BSA (высококачественного альбумина в качестве стандарта, Thermo Fisher Scientific), который использовался в виде 100 нг/мкл раствора. Используемые количества были следующими: фиг. 1: на дорожках 14-17: 0,25, 0,5, 1 и 2 мкг BSA; фиг. 2: на дорожках 11-15: 0,25, 0,5, 1, 2 и 3 мкг BSA.Each gel also contained a series of dilutions of BSA (high quality albumin as a standard, Thermo Fisher Scientific) which was used as a 100 ng/µl solution. The quantities used were as follows: FIG. 1: in lanes 14-17: 0.25, 0.5, 1 and 2 µg BSA; fig. 2: in lanes 11-15: 0.25, 0.5, 1, 2 and 3 µg BSA.

Анализы с помощью денситометра были сфокусированы на полосах белка ORF2 PCV2 с М.м. 26 кДа. Все образцы были проанализированы в гелях два раза, рассчитанные результаты по выходам являются средними двух повторов.Densitometer analyzes focused on PCV2 ORF2 protein bands with M.m. 26 kDa. All samples were run twice on the gels, calculated yields are the average of two replicates.

Выходы белка ORF2 PCV2 представлены в микрограммах белка на мл исходной культуры в Т75 (объем 15 мл). Было установлено, что выходы были следующими:PCV2 ORF2 protein yields are presented in micrograms of protein per ml of initial culture in T75 (volume 15 ml). The outputs were found to be:

Номер вирусаVirus number Генотип PCV2PCV2 genotype Бакуловирусная конструкцияBaculovirus construct Оптимизация частоты использования кодоновCodon frequency optimization Аминокислота в положении 131Amino acid at position 131 Выход ORF2 (мкг/мл)ORF2 output (µg/ml) 33 2a2a Bac-to-Bacbac-to-bac НетNot ПролинProline 3232 66 2b2b Bac-to-Bacbac-to-bac НетNot ТреонинThreonine 2626 77 2b2b Bac-to-Bacbac-to-bac ДаYes ТреонинThreonine 3636 8eight 2b2b Bac-to-Bacbac-to-bac НетNot ПролинProline 5858 99 2b2b ProEasyProEasy ДаYes ПролинProline 7676

Можно было сделать несколько наблюдений:Several observations could be made:

- В случае вирусных инфекций, обусловленных вирусами под № 8 и 9, двух конструкций для PCV2b ORF2 с заменой T131P, дорожки в геле (см. фиг. 2) выглядели немного темнее, чем в случае других исследованных вирусов, даже несмотря на то, что для всех культур, сравниваемых с помощью электрофореза в SDS-ПААГ, MOE (0,1), время культивирования (4 дня) и другие условия были одинаковыми. Это могло указывать на то, что инфекция могла не развиться так далеко, как в случае других вирусов, что приводит к увеличению количества клеточного материала в образце. Возможно, замена на пролин вызывала небольшую аттенюацию рекомбинантного бакуловируса. Однако уровни экспрессии белка оказались незатронутыми и были выше, чем в случае ORF2 PCV2b без этой мутации.- In the case of viral infections caused by viruses #8 and 9, two constructs for PCV2b ORF2 with T131P substitution, the lanes in the gel (see Fig. 2) appeared slightly darker than in the case of other tested viruses, even though for all cultures compared by SDS-PAGE, MOE (0.1), culture time (4 days) and other conditions were the same. This could indicate that the infection might not have progressed as far as with other viruses, leading to an increase in the amount of cellular material in the sample. It is possible that the proline substitution caused a slight attenuation of the recombinant baculovirus. However, protein expression levels were unaffected and were higher than PCV2b ORF2 without this mutation.

- Ни один из образцов супернатанта не продемонстрировал количество белка ORF2, которое можно было бы визуализировать с помощью окрашивания CBB, которое использовали. Следовательно, в условиях, применяемых в этих экспериментах, фактически весь экспрессированный белок ORF2 содержался в клетках насекомых.- None of the supernatant samples showed an amount of ORF2 protein that could be visualized with the CBB stain that was used. Therefore, under the conditions used in these experiments, virtually all of the expressed ORF2 protein was contained in the insect cells.

- Уровень экспрессии немутированного белка ORF2 PCV2b (вируса 6) был ниже, чем в случае ORF2 PCV2a (вируса 3), 26 мкг/мл в сравнение с 32 мкг/мл. Следует напомнить, что в этих образцах выявляется общее количество всего продуцированного белка из-за используемой агрессивной денатурации (кипячение в SDS и бета-меркаптоэтаноле). Это означает, что общая экспрессия белка с немутированного гена ORF2 PCV2b на самом деле ниже в целом в клетках насекомых.- The expression level of the non-mutated PCV2b ORF2 protein (virus 6) was lower than PCV2a ORF2 (virus 3), 26 µg/ml compared to 32 µg/ml. It should be recalled that these samples show the total amount of total protein produced due to the aggressive denaturation used (boiling in SDS and beta-mercaptoethanol). This means that overall protein expression from the unmutated PCV2b ORF2 gene is actually lower overall in insect cells.

- Примечание: эта разница в выходе намного больше на практике, когда сбор происходит без (сильной) денатурации. В этом случае в лизатах клеток насекомых, экспрессирующих немутированный ORF2 PCV2b, почти не обнаруживался какой-либо определяемый белок ORF2.- Note: this yield difference is much greater in practice when harvesting occurs without (strong) denaturation. In this case, lysates of insect cells expressing unmutated PCV2b ORF2 almost did not detect any detectable ORF2 protein.

- Выход немутированного белка ORF2 PCV2b мог быть немного увеличен при использовании оптимизированного в отношении частоты использования кодонов гена ORF2: сравните выходы вирусных культур 6 и 7, при этом общие выходы составляли 26 и 36 мкг/мл, соответственно.- Yield of unmutated PCV2b ORF2 protein could be slightly increased by using the codon-optimized ORF2 gene: compare the yields of virus cultures 6 and 7, with overall yields of 26 and 36 µg/mL, respectively.

- Однако наиболее значительное увеличение было достигнуто введением замены T131P в белок ORF PCV2b, см. выходы вирусных культур 6 и 8, 26 мкг/мл в сравнение с 56 мкг/мл. Таким образом, замена T131P способна привести к увеличению более чем вдвое общего выхода белка ORF2 даже в этих мелкомасштабных культурах без какой-либо оптимизации.- However, the most significant increase was achieved by introducing the T131P substitution into the PCV2b ORF protein, see virus culture yields 6 and 8, 26 µg/mL versus 56 µg/mL. Thus, the T131P substitution is able to more than double the total ORF2 protein yield even in these small scale cultures without any optimization.

- Еще лучшие выходы белка ORF2 PCV2b могли быть достигнуты, когда все мутации были объединены: замена T131P, оптимизация в отношении частоты использования кодонов и использование чистой бакуловирусной конструкции: сравнение выходов вирусных культур 6 и 9 показывает тройное увеличение выхода белка, 26 мкг/мл в сравнение с 76 мкг/мл.- Even better PCV2b ORF2 protein yields could be achieved when all mutations were pooled: T131P substitution, optimization for codon usage, and use of a pure baculovirus construct: Comparison of viral culture yields 6 and 9 shows a triple increase in protein yield, 26 µg/mL in comparison with 76 μg/ml.

Аналогичный анализ выхода белка также проводили на образцах, которые были получены в промежуточных крупномасштабных культурах объемом 2 литра. Сборы получали в 7,7x концентрации по сравнению с общим объемом культуры. Белок ORF2 из этих культур также использовали для получения экспериментальных вакцин против PCV2, описанных ниже.A similar protein yield analysis was also performed on samples that were obtained from 2 liter intermediate large scale cultures. Harvests were obtained at 7.7x the concentration of the total culture volume. The ORF2 protein from these cultures was also used to prepare the experimental PCV2 vaccines described below.

Были получены следующие выходы белка ORF2, указанные в мкг/мл исходного 2-литрового объема культуры:The following yields of ORF2 protein were obtained, indicated in µg/ml of the original 2-liter culture volume:

Номер вирусаVirus number Генотип PCV2PCV2 genotype Бакуловирусная конструкцияBaculovirus construct Оптимизация частоты использования кодоновCodon frequency optimization Аминокислота в положении 131Amino acid at position 131 Выход ORF2 (мкг/мл)ORF2 output (µg/ml) 55 2a2a ProEasyProEasy ДаYes ПролинProline 44,244.2 99 2b2b ProEasyProEasy ДаYes ПролинProline 103,9103.9

Условия культивирования в ферментерах были явно более оптимальными, чем в мелкомасштабных культуральных T-матрасах. Не только из-за автоматического контроля температуры, pH и растворенного кислорода, но также потому, что это были суспензионные культуры, которые допускают более высокую плотность клеток на мл культуры.The culture conditions in the fermenters were clearly more optimal than in the small-scale culture T-mats. Not only because of the automatic control of temperature, pH, and dissolved oxygen, but also because these were suspension cultures that allow for higher cell densities per ml of culture.

Используемые рекомбинантные бакуловирусы также были сконструированы оптимально в том смысле, что они имели оптимизированный в отношении частоты использования кодонов ген ORF2 в чистой бакуловирусной конструкции (полученной с использованием системы ProEasy).The recombinant baculoviruses used were also optimally engineered in the sense that they had a codon-optimized ORF2 gene in a pure baculovirus construct (produced using the ProEasy system).

Это привело к выходу белка для клеток насекомых, инфицированных вирусом под № 9, превышающему 100 мкг/мл культуры, в то время как в T-матрасах он составлял 76 мкг/мл.This resulted in a protein yield for insect cells infected with virus no. 9 in excess of 100 µg/ml culture, while in T-mattresses it was 76 µg/ml.

Примечательно, что выход белка из клеток насекомых, экспрессирующих мутантный белок ORF2 PCV2b с заменой аминокислоты под номером 131 на пролин, был значительно выше, чем в случае немодифицированного белка ORF2 PCV2a, даже несмотря на то, что использовались одинаковые конструкций и условия культивирования. В частности, из-за того, что ген ORF2 PCV2a, использованный здесь, также имел пролин в аминокислотном положении 131 по сравнению с его нативной последовательностью. Не сразу очевидно, что может вызвать это разницу, хотя она, очевидно, очень благоприятна для производства белка ORF2 PCV2b для производства субъединичных вакцин против PCV2.It is noteworthy that the protein yield from insect cells expressing the mutant PCV2b ORF2 protein with amino acid 131 replaced by proline was significantly higher than in the case of the unmodified PCV2a ORF2 protein, even though the same constructs and culture conditions were used. Particularly because the PCV2a ORF2 gene used here also had a proline at amino acid position 131 compared to its native sequence. It is not immediately obvious what might cause this difference, although it appears to be very favorable for the production of the PCV2b ORF2 protein for the production of PCV2 subunit vaccines.

2.4.3 Выводы из анализов с помощью гель-электрофореза2.4.3 Conclusions from gel electrophoresis analyzes

Хотя не все наблюдаемые эффекты могут быть объяснены в настоящее время, анализ с помощью гель-электрофореза ясно показал, что экспрессия в клетках насекомых белка ORF2 PCV2b без какой-либо адаптации, в лучшем случае, дает меньшее количество белка, чем экспрессия ORF2 PCV2a. Эта разница даже больше, когда клетки собирают в неденатурирующих условиях.Although not all of the observed effects can be explained at present, gel electrophoresis analysis clearly showed that expression of the PCV2b ORF2 protein in insect cells, without any adaptation, yielded, at best, less protein than PCV2a ORF2 expression. This difference is even greater when the cells are harvested under non-denaturing conditions.

Однако недостаток выхода может быть более чем восполнен заменой аминокислоты в положении 131 в ORF2 PCV2b на пролин, которая по крайней мере удваивает выход по сравнению с выходом немутированного белка ORF2 PCV2b.However, the lack of yield can be more than made up for by replacing the amino acid at position 131 in PCV2b ORF2 with proline, which at least doubles the yield compared to that of the unmutated PCV2b ORF2 protein.

Еще большее увеличение выхода может быть достигнуто путем экспрессии мутации 131P с оптимизированного в отношении частоты использования кодонов гена ORF2 и использования чистой бакуловирусной конструкции. Дальнейшие улучшения выходов могут быть достигнуты в крупномасштабных суспензионных культурах.A further increase in yield can be achieved by expressing the 131P mutation from the codon-optimized ORF2 gene and using a pure baculovirus construct. Further improvements in yields can be achieved in large scale suspension cultures.

Вместе эти данные впервые делают возможным коммерческое и крупномасштабное производство белка ORF2 генотипа PCV2b с помощью рекомбинантной экспрессионной системы.Together, these data enable the commercial and large-scale production of the PCV2b genotype ORF2 protein for the first time using a recombinant expression system.

Пример 3. Эксперименты по вакцинации с последующим контрольным заражением на свиньяхExample 3 Vaccination experiments followed by challenge in pigs

3.1. ВВЕДЕНИЕ3.1. INTRODUCTION

3.1.1 Цель.3.1.1 Purpose.

Это исследование было выполнено для сравнения и оценки эффективности вакцин для свиней на основе экспрессированных в клетках насекомых мутантных белков ORF2 PCV2 в соответствии с настоящим изобретением. Для обеспечения тщательной проверки их способности к защите белки ORF2 различных генотипов использовали для такой проверки от контрольного заражения не только гомологичным PCV2 вирусом, но и гетерологичным PCV2 вирусом. Также используемые дозы вакцины содержали относительно низкие количества белка ORF2.This study was performed to compare and evaluate the efficacy of insect vaccines based on insect cell-expressed ORF2 PCV2 mutant proteins in accordance with the present invention. To ensure a thorough test of their ability to protect ORF2 proteins of different genotypes were used for this test against challenge not only with homologous PCV2 virus, but also with heterologous PCV2 virus. The vaccine doses used also contained relatively low amounts of the ORF2 protein.

3.1.2. Схема исследования3.1.2. Study scheme

Для этого исследования использовали 140 поросят, распределенных на 2 совокупности по 7 групп лечения, 10 животных в каждой группе, одна совокупность для каждого из двух заражений. 140 животных были получены от 14 свиноматок. У поросят были обнаруживаемые уровни антител против ORF2 PCV2 в диапазоне от низких до очень высоких титров; средний титр MDA (материнских антител) для всех животных составлял 5,8 Log2 в соответствии с ELISA с использованием антител.For this study, 140 piglets were used divided into 2 sets of 7 treatment groups, 10 animals in each group, one set for each of the two challenges. 140 animals were obtained from 14 sows. Piglets had detectable levels of anti-PCV2 ORF2 antibodies ranging from low to very high titers; the mean MDA (mother antibody) titer for all animals was 5.8 Log2 according to antibody ELISA.

Поросят вакцинировали внутримышечно в шею с использованием 2 мл каждому, когда им было приблизительно три недели. Используемые вакцины содержали различные количества белка ORF2 PCV2, продуцируемого с помощью бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых, одного из трех генотипов: PCV2a, 2b или 2d. Использованные рекомбинантные бакуловирусы имели номера 5, 9 и 10, как описано выше, с пролином в аминокислотном положении 131, экспрессированным с кодирующего ORF2 гена, который был оптимизирован в отношении частоты использования кодонов в направление к таковой в гене полиэдрина AcMNPV, и с использованием чистой бакуловирусной конструкции. Вакцины были приготовлены в виде эмульсий типа «масло в воде» вместе с адъювантом Emunade™. Вакцина дополнительно содержала антиген из Mycoplasma hyopneumoniae (штамм J), для сходства с коммерческой вакциной: Porcilis™ PCV M Hyo. Что касается антигена ORF2 PCV2, то тестируемая вакцина содержала либо четвертую часть, либо шестнадцатую часть стандартной полной дозы на животное.Piglets were vaccinated intramuscularly in the neck using 2 ml each when they were approximately three weeks old. The vaccines used contained varying amounts of PCV2 ORF2 protein produced by a baculovirus expression system in insect cells of one of three genotypes: PCV2a, 2b or 2d. The recombinant baculoviruses used were numbered 5, 9 and 10 as described above, with a proline at amino acid position 131 expressed from the gene encoding ORF2 that was optimized for codon usage towards that of the AcMNPV polyhedrin gene, and using pure baculovirus designs. The vaccines were formulated as oil-in-water emulsions with Emunade™ adjuvant. The vaccine additionally contained an antigen from Mycoplasma hyopneumoniae (strain J) to resemble the commercial vaccine: Porcilis™ PCV M Hyo. For the PCV2 ORF2 antigen, the tested vaccine contained either a quarter or a sixteenth of the standard full dose per animal.

Для обеих совокупностей распределение вакцинотерапий по группам было таким, как указано в таблице ниже.For both populations, the distribution of vaccine treatments across groups was as indicated in the table below.

Примечание: Животных в группе 7 обеих совокупностей не вакцинировали, чтобы они служили в качестве контролей заражения.Note: Animals in Group 7 of both populations were not vaccinated to serve as challenge controls.

ГруппаGroup 1one 22 33 4four 55 66 77 Доза вакцины (мкг белка ORF2/животное) Vaccine dose (µg ORF2 protein/animal) 20twenty 55 20twenty 55 20twenty 55 Без вакцинацииWithout vaccination Генотип вируса для белка ORF2Virus genotype for ORF2 protein 2a2a 2b2b 2d2d

Через две недели после вакцинации всех животных доставляли в помещения, используемые для заражения. Через 3 недели после вакцинации (в возрасте 6 недель) всех животных подвергали контрольному заражению вирулентным PCV2 либо с генотипом 2b, либо с генотипом 2d. Контрольное заражение осуществляли с помощью интраназального введения 6 мл (3 мл в каждую ноздрю) PCV2 в PBS в концентрации 5 Log10 TCID50/мл; используя для совокупности 1: PCV2b (голландский изолят, 2003 г.) в качестве вируса для заражения, а для совокупности 2: PCV2d (немецкий изолят, 2015 г.) в качестве вируса для заражения. Вирусы для заражения получали в клетках PK15, не содержащих PCV, и проверяли на отсутствие бактерий и грибов.Two weeks after vaccination, all animals were taken to the premises used for infection. 3 weeks after vaccination (at 6 weeks of age), all animals were challenged with virulent PCV2, either genotype 2b or genotype 2d. The control infection was carried out using intranasal administration of 6 ml (3 ml in each nostril) PCV2 in PBS at a concentration of 5 Log10 TCID50/ml; using for population 1: PCV2b (Dutch isolate, 2003) as challenge virus and for population 2: PCV2d (German isolate, 2015) as challenge virus. Infection viruses were generated in PCV-free PK15 cells and checked for the absence of bacteria and fungi.

Через три недели после заражения (в возрасте 9 недель) всех животных подвергали эвтаназии и осматривали: внутренние органы обследовали на месте, уделяя особое внимание: легким, паховым и брыжеечным лимфатическим узлам, миндалинам, вилочковой железе, селезенке, печени и почкам. Затем образцы из миндалин, легких, брыжеечного лимфатического узла и пахового лимфатического узла брали и фиксировали для обнаружения используемого для заражения вируса PCV с помощью иммуногистохимического анализа (IHC).Three weeks after infection (at the age of 9 weeks), all animals were euthanized and examined: the internal organs were examined on the spot, paying particular attention to: lungs, inguinal and mesenteric lymph nodes, tonsils, thymus, spleen, liver and kidneys. Then samples from the tonsils, lungs, mesenteric lymph node and inguinal lymph node were taken and fixed for detection of PCV virus used for infection using immunohistochemical analysis (IHC).

Также были выполнены другие анализы, такие как серология на образцах крови и кПЦР на образцах тканей и мазков. Однако данные IHC дали наиболее точные результаты.Other tests were also performed, such as serology on blood samples and qPCR on tissue and swab samples. However, the IHC data provided the most accurate results.

3.2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ3.2 MATERIALS AND METHODS

3.2.1 Белки ORF2 PCV2:3.2.1 PCV2 ORF2 proteins:

Последовательности генов ORF2 PCV2a, 2b и 2d были получены в промежуточных крупномасштабных культурах, как описано в разделе 2.1 выше. Их количественный анализ с помощью гель-электрофореза описан в разделе 2.3.2 выше.PCV2a, 2b and 2d ORF2 gene sequences were generated in intermediate large scale cultures as described in section 2.1 above. Their quantitative analysis by gel electrophoresis is described in section 2.3.2 above.

3.2.2. Подопытные животные3.2.2. experimental animals

Подопытные животные были негативными по PCV2-вирусной нагрузке и имели умеренные уровни антител против PCV2. От тестирования отказались бы, если бы у какого-либо из животных развились клинические признаки PCV2 инфекции до заражения.The test animals were negative for PCV2 viral load and had moderate levels of anti-PCV2 antibodies. Testing would be withheld if any of the animals developed clinical signs of PCV2 infection prior to infection.

Только здоровых животных включали в исследование. Всех поросят наблюдали ежедневно в отношении общего состояния здоровья и клинических или системных признаков заболевания, таких как потеря аппетита, нежелание двигаться, склонность лежать, вялость или сонливость, дрожь, щетина, отек (особенно вокруг глаз), рвота и диарея и одышка.Only healthy animals were included in the study. All piglets were observed daily for general health and clinical or systemic signs of illness such as loss of appetite, unwillingness to move, tendency to lie down, lethargy or drowsiness, trembling, stubble, swelling (especially around the eyes), vomiting and diarrhea, and shortness of breath.

Поросят метили индивидуально с помощью ушных бирок, причем поросят из 14 приплодов делили поровну между исследуемыми группами. После отъема водопроводная вода предоставлялась неограниченно, а кормление осуществлялось в соответствии со стандартными процедурами.Piglets were tagged individually with ear tags, with piglets from 14 litters divided equally between study groups. After weaning, tap water was provided ad libitum and feeding was carried out according to standard procedures.

Вакцинацию делали на ферме для опороса. После транспортировки в используемые для заражения помещения включали акклиматизацию в течение одной недели.Vaccination was done at the farrowing farm. After transport to the premises used for infection, acclimatization was included for one week.

3.2.3 Лабораторные экспериментальные процедуры3.2.3 Laboratory experimental procedures

3.2.3.1 Иммуногистохимический анализ3.2.3.1 Immunohistochemical analysis

Образцы тканей готовили для гистологического исследования путем фиксации в 10% формалине и заливки в парафин. Готовили микроскопические препараты. Их инкубировали с кроличьей поликлональной сывороткой против PCV2 в качестве первого антитела и визуализировали окрашиванием пероксидазой (Envision+™, DAKO). Препараты подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином. При микроскопическом исследовании миндалин и лимфатических узлов характерное коричневое окрашивание оценивалось в зависимости от степени окрашивания:Tissue samples were prepared for histological examination by fixing in 10% formalin and embedding in paraffin. Prepared microscopic preparations. They were incubated with anti-PCV2 rabbit polyclonal serum as the first antibody and visualized by peroxidase staining (Envision+™, DAKO). The preparations were counterstained with hematoxylin. On microscopic examination of the tonsils and lymph nodes, the characteristic brown staining was assessed depending on the degree of staining:

- оценка 0: лимфоидные фолликулы не демонстрировали специфическое положительное окрашивание;- score 0: lymphoid follicles did not show specific positive staining;

- оценка 1: менее 10% лимфоидных фолликулов содержали до 15 клеток со специфическим положительным окрашиванием;- score 1: less than 10% of lymphoid follicles contained up to 15 cells with specific positive staining;

- оценка 2: 10-50% лимфоидных фолликулов содержали до 15 клеток со специфическим положительным окрашиванием, или менее 10% лимфоидных фолликулов содержали более 15 клеток со специфическим положительным окрашиванием;- score 2: 10-50% of lymphoid follicles contained up to 15 cells with specific positive staining, or less than 10% of lymphoid follicles contained more than 15 cells with specific positive staining;

- оценка 3: >50% лимфоидных фолликулов содержали клетки со специфическим положительным окрашиванием.- score 3: >50% of lymphoid follicles contained cells with specific positive staining.

Сумму оценок отдельных тканей регистрировали как общую IHC оценку на животное, и их объединяли для всех животных группы.The sum of individual tissue scores was recorded as the total IHC score per animal and pooled for all animals in the group.

3.2.3.2 Вакцинные препараты3.2.3.2 Vaccines

Исследуемые вакцины готовили в виде эмульсий типа «масло в воде» с Emunade™, это двойной адъювант с минеральным маслом, диспергированным в водной фазе, содержащей антигены вакцины, а также гидроксид алюминия. Препарат с 9% антигена Mhyo соответствовал процедуре, описанной в WO 2016/091998.The study vaccines were formulated as oil-in-water emulsions with Emunade™, a double adjuvant with mineral oil dispersed in an aqueous phase containing vaccine antigens as well as aluminum hydroxide. The preparation with 9% Mhyo antigen followed the procedure described in WO 2016/091998.

Также вакцина была приготовлена в соответствии с EP 1926496, так что 25% полной дозы (2 мл/животное) содержали приблизительно 20 мкг белка ORF2, а 6,25% дозы содержали 5 мкг белка ORF2/животное.Also, the vaccine was prepared according to EP 1926496 such that 25% of the total dose (2 ml/animal) contained approximately 20 μg ORF2 protein and 6.25% of the dose contained 5 μg ORF2 protein/animal.

3.3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ3.3 RESULTS AND CONCLUSIONS

С помощью иммуногистохимического исследования образцы ткани миндалин, брыжеечных и паховых лимфатических узлов, собранные после смерти, анализировали для оценки количества обнаруживаемого заражающего вируса. Графический обзор этих результатов представлен на фиг. 3 и 4. На фиг. 3 представлены результаты для животных в группах 1-7 совокупности 1, подвергнутых контрольному заражению вирулентным вирусом PCV2b; на фиг. 4 представлены данные IHC для всех животных совокупности 2, в которой животных заражали вирулентным вирусом PCV2d. По вертикальной оси представлена оценка интенсивности IHC по шкале, описанной выше. Результаты IHC могут использоваться для определения эффективности вакцин на основе белка ORF2 PCV2 путем сравнения уровня подавления PCV2 инфекции в вакцинированных и невакцинированных группах.Using immunohistochemistry, tissue samples from tonsils, mesenteric and inguinal lymph nodes collected after death were analyzed to estimate the amount of detectable infecting virus. A graphical overview of these results is shown in FIG. 3 and 4. In FIG. 3 shows the results for animals in groups 1-7 of population 1 challenged with virulent PCV2b virus; in fig. 4 shows IHC data for all animals in population 2, in which animals were challenged with virulent PCV2d virus. The vertical axis represents the IHC intensity score on the scale described above. IHC results can be used to determine the effectiveness of vaccines based on the PCV2 ORF2 protein by comparing the level of suppression of PCV2 infection in vaccinated and unvaccinated groups.

Можно было сделать несколько наблюдений:Several observations could be made:

- Невакцинированные животные демонстрировали значительно более высокие IHC оценки, чем вакцинированные группы, что указывает на то, что доза заражения была достаточно высокой, и что контрольное заражением было эффективным, даже в случае средних уровней материнских антитела против PCV2 у поросят.- The unvaccinated animals showed significantly higher IHC scores than the vaccinated groups, indicating that the challenge dose was high enough that the challenge was effective, even with moderate levels of maternal anti-PCV2 antibody in piglets.

- Как можно видеть: дозы вакцины, содержащие 5 или 20 мкг белка ORF2, обеспечивали надежную защиту от репликации заражающего вируса, при этом снижение IHC оценки достигало вплоть до 90%. Поэтому эти вакцины против PCV2 были очень эффективными.- As can be seen: vaccine doses containing 5 or 20 µg of the ORF2 protein provided reliable protection against replication of the infecting virus, with a reduction in IHC score of up to 90%. Therefore, these PCV2 vaccines were very effective.

- Несколько меньшая степень защиты наблюдалась в случае самой низкой дозы белка ORF2 PCV2a от заражения PCV2d. Это означает, что вакцины против PCV2 на основе экспрессированного в клетках насекомых мутантного белка ORF2 из PCV2b или из PCV2d в соответствии с настоящим изобретением очень эффективны в качестве вакцины против PCV2 инфекции даже в однократной дозе и даже в контексте антител материнского происхождения. В равных дозах эти вакцины на основе мутантного белка ORF2 из PCV2b или из PCV2d даже оказались более эффективными, чем традиционная вакцина на основе белка ORF2 PCV2a.- Slightly less protection was observed with the lowest dose of PCV2a ORF2 protein against PCV2d infection. This means that PCV2 vaccines based on the insect cell-expressed mutant ORF2 protein from PCV2b or from PCV2d according to the present invention are very effective as a vaccine against PCV2 infection even in a single dose and even in the context of antibodies of maternal origin. At equal doses, these PCV2b or PCV2d ORF2 mutant vaccines were even more effective than the conventional PCV2a ORF2 vaccine.

- Хотя гомологичный иммунитет был в основном выше гетерологичного иммунитета, существовал четкий уровень перекрестного иммунитета к заражающим вирусам PCV2b и PCV2d по всем трем исследованным генотипам вакцин: вакцины на основе белка ORF2 PCV2a и PCV2d были сопоставимы по защитному эффекту в самой низкой дозе от заражения PCV2b, тогда как белок ORF2 PCV2a был лучше в более высокой дозе. Однако вакцина на основе мутантного белка ORF2 PCV2b была лучше белка ORF2 PCV2a от заражения PCV2d в обеих дозах.- Although homologous immunity was generally superior to heterologous immunity, there was a clear level of cross-immunity to infecting PCV2b and PCV2d viruses across all three vaccine genotypes studied: PCV2a and PCV2d ORF2 protein-based vaccines were comparable in protective effect at the lowest dose against PCV2b challenge, whereas the PCV2a ORF2 protein was better at the higher dose. However, the mutant PCV2b ORF2 protein vaccine was superior to the PCV2a ORF2 protein from PCV2d challenge at both doses.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

Фигура 1: Figure 1 :

Сканограмма геля после электрофореза в SDS-ПААГ с образцами культур клеток насекомых, экспрессирующих различные белки ORF PCV2 посредством инфицирования рекомбинантными бакуловирусами.SDS-PAGE gel scan of insect cell culture samples expressing various PCV2 ORF proteins via infection with recombinant baculoviruses.

Номера дорожек и указание содержания дорожек даны над изображением геля.Lane numbers and an indication of the content of the lanes are given above the image of the gel.

Дорожки 1 и 18: маркеры молекулярной массы; Слева от изображения указаны значения молекулярной массы в кДа.Lane 1 and 18: molecular weight markers; To the left of the image are the molecular weights in kDa.

Дорожки 2-5: клетки, инфицированные вирусом 3; Дорожка 2: супернатант; Дорожки 3-5: клеточный осадок, соответственно: 30, 20 и 10 мкл.Lanes 2-5: cells infected with virus 3; Lane 2: supernatant; Lanes 3-5: cell pellet, respectively: 30, 20 and 10 µl.

Дорожки 6-9: клетки, инфицированные вирусом 6; Дорожка 6: супернатант; Дорожки 7-9 клеточный осадок, соответственно: 30, 20 и 10 мкл.Lanes 6-9: cells infected with virus 6; Lane 6: supernatant; Lanes 7-9 cell pellet, respectively: 30, 20 and 10 µl.

Дорожки 10-13: клетки, инфицированные вирусом 7; Дорожка 10: супернатант; Дорожки 11-13: клеточный осадок, соответственно: 30, 20 и 10 мкл.Lanes 10-13: cells infected with virus 7; Lane 10: supernatant; Lanes 11-13: cell pellet, respectively: 30, 20 and 10 µl.

Дорожки 14-17: контрольные образцы белка BSA, соответственно: 0,25, 0,5, 1 и 2 мкг.Lanes 14-17: BSA protein controls, respectively: 0.25, 0.5, 1 and 2 μg.

Фигура 2: Figure 2 :

Сканограмма геля после электрофореза в SDS-ПААГ с образцами культур клеток насекомых, экспрессирующих различные белки ORF PCV2 посредством инфицирования рекомбинантными бакуловирусами.SDS-PAGE gel scan of insect cell culture samples expressing various PCV2 ORF proteins via infection with recombinant baculoviruses.

Номера дорожек и указание содержания дорожек даны над изображением геля.Lane numbers and an indication of the content of the lanes are given above the image of the gel.

Дорожки 1 и 16: маркеры молекулярной массы; Слева от изображения указаны значения молекулярной массы в кДа.Lane 1 and 16: molecular weight markers; To the left of the image are the molecular weights in kDa.

Дорожки 2-5: клетки, инфицированные вирусом 8; Дорожка 2: супернатант; Дорожки 3-5: клеточный осадок, соответственно: 30, 20 и 10 мкл.Lanes 2-5: cells infected with virus 8; Lane 2: supernatant; Lanes 3-5: cell pellet, respectively: 30, 20 and 10 µl.

Дорожки 6-9: клетки, инфицированные вирусом 9; Дорожка 6: супернатант; Дорожки 7-9: клеточный осадок, соответственно: 30, 20 и 10 мкл.Lanes 6-9: cells infected with virus 9; Lane 6: supernatant; Lanes 7-9: cell pellet, respectively: 30, 20 and 10 µl.

Дорожка 10: пустая.Track 10: empty.

Дорожки 11-15: контрольные образцы белка BSA, соответственно: 0,25, 0,5, 1 и 2 мкг.Lanes 11-15: BSA protein controls, respectively: 0.25, 0.5, 1 and 2 µg.

Фигуры 3 и 4: Figures 3 and 4 :

Графические представления результатов иммуногистохимического исследования на различных тканях свиней, которые подвергались контрольному заражению PCV2, после получения вакцины, приготовленной из экспрессированного в клетках насекомых белка ORF2 PCV2. Результаты по тканям представлены для миндалин, брыжеечных лимфатических узлов («Mes. In») и паховых лимфатических узлов («Ing. In»).Graphical representations of the results of immunohistochemical studies on various tissues of pigs that were challenged with PCV2 after receiving a vaccine prepared from insect-expressed PCV2 ORF2 protein. Tissue results are presented for tonsils, mesenteric lymph nodes ("Mes. In"), and inguinal lymph nodes ("Ing. In").

Различные применяемые (или нет) вакцины указаны по горизонтальной оси; вертикальная ось представляет произвольную оценку IHC интенсивности в соответствии с конкретной количественной оценкой.The various vaccines in use (or not) are indicated on the horizontal axis; the vertical axis represents an arbitrary IHC intensity score according to a particular scoring.

На фиг. 3 представлены результаты IHC для животных в группах 1-7 совокупности 1, подвергнутых контрольному заражению вирулентным вирусом PCV2b;In FIG. 3 shows IHC results for animals in groups 1-7 of population 1 challenged with virulent PCV2b virus;

На фиг. 4 представлены результаты IHC для животных в группах 1-7 совокупности 2, в которой животных заражали вирулентным вирусом PCV2d.In FIG. 4 shows IHC results for animals in groups 1-7 of population 2 in which animals were challenged with virulent PCV2d virus.

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST

<110> Intervet Int. BV<110> Intervet Int. BV

<120> Рекомбинатная экспрессия белка ORF2 PCV2 в клетках насекомых<120> Recombinant expression of PCV2 ORF2 protein in insect cells

<130> 24469<130> 24469

<160> 2 <160> 2

<170> Патент в версии 3.5<170> Patent in version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 702<211> 702

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Мутированный ген ORF2 PCV2b<223> Mutated PCV2b ORF2 gene

<220><220>

<221> Кодирующая последовательность<221> Coding sequence

<222> (1)..(699)<222> (1)..(699)

<400> 1<400> 1

atg acc tac ccc cgt cgt cgt tac cgt cgt cgt cgt cac cgt ccc cgt 48atg acc tac ccc cgt cgt cgt tac cgt cgt cgt cgt cac cgt ccc cgt 48

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15 1 5 10 15

agc cat ctg ggc caa atc ctt cgt cgt cgt ccc tgg ctg gtt cac ccc 96agc cat ctg ggc caa atc ctt cgt cgt cgt ccc tgg ctg gtt cac ccc 96

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30 20 25 30

cgt cat cgt tac cgt tgg cgt cgt aag aac ggt atc ttc aac acc cgt 144cgt cat cgt tac cgt tgg cgt cgt aag aac ggt atc ttc aac acc cgt 144

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45 35 40 45

ctt tca cgt acc ttc gga tac act gtt aag cgt acc act gtg aaa act 192ctt tca cgt acc ttc gga tac act gtt aag cgt acc act gtg aaa act 192

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr

50 55 60 50 55 60

ccc agc tgg gct gtt gac atg atg cgt ttc aac atc aac gac ttc ctt 240ccc agc tgg gct gtt gac atg atg cgt ttc aac atc aac gac ttc ctt 240

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

ccc ccc gga ggt gga agc aac ccc cgt tct gtg ccc ttc gag tac tac 288ccc ccc gga ggt gga agc aac ccc cgt tct gtg ccc ttc gag tac tac 288

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95 85 90 95

cgt atc cgt aag gtt aaa gtg gaa ttc tgg ccc tgc tct ccc atc acc 336cgt atc cgt aag gtt aaa gtg gaa ttc tgg ccc tgc tct ccc atc acc 336

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110 100 105 110

caa ggc gac cgt ggc gtt ggt agc tct gcc gtg atc ctt gac gac aac 384caa ggc gac cgt ggc gtt ggt agc tct gcc gtg atc ctt gac gac aac 384

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125 115 120 125

ttc gtt ccc aaa gct acc gcc ctc act tac gac ccc tac gtg aac tac 432ttc gtt ccc aaa gct acc gcc ctc act tac gac ccc tac gtg aac tac 432

Phe Val Pro Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Phe Val Pro Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140 130 135 140

tca agc cgt cac acc atc act caa ccc ttc tct tac cat tca cgt tac 480tca agc cgt cac acc atc act caa ccc ttc tct tac cat tca cgt tac 480

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160 145 150 155 160

ttc acc ccc aag ccc gtt ctc gac tct act atc gac tac ttc caa ccc 528ttc acc ccc aag ccc gtt ctc gac tct act atc gac tac ttc caa ccc 528

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175 165 170 175

aac aac aaa cgt aac caa ctg tgg ctt cgt ctc caa acc act ggt aac 576aac aac aaa cgt aac caa ctg tgg ctt cgt ctc caa acc act ggt aac 576

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190 180 185 190

gtt gac cac gtg gga ctg ggc acc gct ttc gag aac tca atc tac gac 624gtt gac cac gtg gga ctg ggc acc gct ttc gag aac tca atc tac gac 624

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205 195 200 205

caa gaa tac aac atc cgt gtt act atg tac gtg caa ttc cgt gag ttc 672caa gaa tac aac atc cgt gtt act atg tac gtg caa ttc cgt gag ttc 672

Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220 210 215 220

aac ctc aag gac ccc ccc ctg aac ccc taa 702aac ctc aag gac ccc ccc ctg aac ccc taa 702

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

225 230 225 230

<210> 2<210> 2

<211> 233<211> 233

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Синтетическая конструкция<223> Synthetic construction

<400> 2<400> 2

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30 20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45 35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr

50 55 60 50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95 85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125 115 120 125

Phe Val Pro Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Phe Val Pro Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140 130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160 145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175 165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190 180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205 195 200 205

Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220 210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

225 230 225 230

<---<---

Claims (21)

1. Клетка насекомого, обеспечивающая оптимизированную экспрессию белка ORF2 PCV2b, содержащая гетерологичную нуклеиновую кислоту, включающую:1. Insect cell providing optimized expression of PCV2b ORF2 protein containing a heterologous nucleic acid comprising: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 цирковируса 2 свиней с генотипом 2b (PCV2b), иa) a nucleotide sequence encoding the ORF2 protein of porcine circovirus 2 genotype 2b (PCV2b), and b) контролирующую транскрипцию последовательность, которая функционально связана с указанной нуклеотидной последовательностью, b) a transcription control sequence that is operably linked to said nucleotide sequence, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует мутантный белок ORF2 PCV2b, имеющий пролин в аминокислотном положении 131.characterized in that the nucleotide sequence encodes a mutant PCV2b ORF2 protein having a proline at amino acid position 131. 2. Клетка насекомого по п.1, отличающаяся тем, что контролирующая транскрипцию последовательность представляет собой промотор гена р10 бакуловируса или промотор гена полиэдрина бакуловируса.2. An insect cell according to claim 1, wherein the transcription control sequence is a baculovirus p10 gene promoter or a baculovirus polyhedrin gene promoter. 3. Клетка насекомого по п.1 или 2, отличающаяся тем, что гетерологичная нуклеиновая кислота содержится в геноме рекомбинантного бакуловируса.3. An insect cell according to claim 1 or 2, characterized in that the heterologous nucleic acid is contained in the genome of the recombinant baculovirus. 4. Вирусоподобная частица (VLP) мутантного белка ORF2 PCV2b, более эффективно собранная и имеющая улучшенное антигенное качество, отличающаяся тем, что мутантный белок ORF2 PCV2b имеет пролин в аминокислотном положении 131.4. A virus-like particle (VLP) of a mutant PCV2b ORF2 protein that is more efficiently assembled and has improved antigenic quality, characterized in that the mutant PCV2b ORF2 protein has a proline at amino acid position 131. 5. Способ экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых по любому из пп.1-3, включающий введение в клетки насекомых бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых.5. A method for expressing a mutant PCV2b ORF2 protein in insect cells according to any one of claims 1 to 3, comprising introducing into insect cells a baculovirus expression system in insect cells. 6. Способ получения мутантного белка ORF2 PCV2b, имеющего пролин в аминокислотном положении 131, причем получение включает одну или обе стадии, выбранные из:6. A method for producing a mutant PCV2b ORF2 protein having a proline at amino acid position 131, the preparation comprising one or both steps selected from: - культивирования клеток насекомых по любому из пп.1-3 и- culturing insect cells according to any one of claims 1 to 3 and - сбора мутантного белка ORF2 PCV2b из культуры клеток насекомых.- collection of mutant PCV2b ORF2 protein from insect cell culture. 7. Вакцина для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания, содержащая мутантный белок ORF2 PCV2b в фармацевтически приемлемом носителе, отличающаяся тем, что указанный мутантный белок ORF2 PCV2b имеет пролин в аминокислотном положении 131.7. Vaccine for swine to suppress PCV2 infection or associated signs of disease, containing a mutant ORF2 PCV2b protein in a pharmaceutically acceptable carrier, characterized in that said mutant ORF2 PCV2b protein has a proline at amino acid position 131. 8. Вакцина по п.7, отличающаяся тем, что мутантный белок ORF2 PCV2b находится в форме VLP.8. The vaccine according to claim 7, characterized in that the mutant PCV2b ORF2 protein is in the form of a VLP. 9. Вакцина по п.7 или 8, содержащая адъювант.9. The vaccine according to claim 7 or 8 containing an adjuvant. 10. Вакцина по любому из пп.7-9, содержащая дополнительный антиген микроорганизма, патогенного для свиней.10. The vaccine according to any one of claims 7 to 9, containing an additional antigen of a microorganism pathogenic for pigs. 11. Способ подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания у свиньи, включающий введение указанной свинье вакцины по любому из пп.7-10.11. A method for suppressing a PCV2 infection or associated signs of disease in a pig, comprising administering to said pig a vaccine according to any one of claims 7-10. 12. Применение мутантного белка ORF2 PCV2b, имеющего пролин в аминокислотном положении 131, для получения вакцины для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания.12. Use of a mutant PCV2b ORF2 protein having a proline at amino acid position 131 to produce a pig vaccine for suppressing PCV2 infection or related disease symptoms. 13. Мутантный белок ORF2 PCV2b, имеющий пролин в аминокислотном положении 131, для применения в вакцине для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания, причем белок получен путем экспрессии в бакуловирусной системе экспрессии в клетках насекомых.13. A mutant PCV2b ORF2 protein having a proline at amino acid position 131 for use in a swine vaccine to suppress PCV2 infection or related signs of disease, the protein being produced by expression in a baculovirus expression system in insect cells. 14. Способ получения вакцины по любому из пп.7-10, включающий одну или более стадий, выбранных из:14. A method for producing a vaccine according to any one of claims 7-10, including one or more stages selected from: - смешивания мутантного белка ORF2 PCV2b, имеющего пролин в аминокислотном положении под номером 131, с фармацевтически приемлемым носителем иmixing the PCV2b ORF2 mutant protein having a proline at amino acid position 131 with a pharmaceutically acceptable carrier, and - составления указанной смеси мутантного белка ORF2 PCV2b и фармацевтически приемлемого носителя вместе с адъювантом.- formulating said mixture of the PCV2b ORF2 mutant protein and a pharmaceutically acceptable carrier together with an adjuvant.

Images