KR20060011977A

KR20060011977A - 갈렉틴 9 유도 인자

Info

Publication number: KR20060011977A
Application number: KR1020057020450A
Authority: KR
Inventors: 미츠오미 히라시마; 노조무 니시; 아키라 야마우치; 나오코 요시다; 마사코 세키
Original assignee: 가르파마 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2004-04-28
Publication date: 2006-02-06
Also published as: US20070042941A1; WO2004096851A1; EP1619203A1; CN1795206A; AU2004234286A1; JPWO2004096851A1; CA2523508A1

Abstract

갈렉틴 9는, 렉틴으로서의 활성을 갖는 생리 활성 물질로 각종 세포에서 발현이 확인되고, 발현량과 종양의 전이능 간에 상관성이 확인되는 등 각종 생리 현상에 관여하는 것으로 예측되고 있다. 이 갈렉틴 9의 생산·유리를 제어하는 것을 가능하게 하는 물질은, 항종양이나 항염증 작용을 유도하는 등의 활성을 기대할 수 있어, 그 해명이 요구되고 있다. 어떤 종류의 종양 세포막 가용화 분획에 갈렉틴 9의 생산·유리를 유도하는 인자 「갈렉틴 9 유도 인자」가 존재하는 것을 발견하였다. 이 인자는 콘카나발린 A 흡착 분획, Resource Q^TM 이온 교환 컬럼, 히드록시 아파타이트 컬럼 등을 이용하여, 농축화 활성 보유 분획으로서 얻을 수 있다. 이 인자의 갈렉틴 9 유도 활성을 이용한 측정 시약, 의약, 분석 등의 개발이 가능하게 된다.

Description

갈렉틴 9 유도 인자{GALETIN 9-INDUCING FACTOR}

본 발명은 갈렉틴 9 유도 활성을 갖는 인자, 즉, 갈렉틴 9 유도 인자에 관한 것이며, 특히 인간의 갈렉틴 9 유도 인자를 포함한 포유동물의 갈렉틴 9 유도 인자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 갈렉틴 9 유도 인자의 이용 기술에 관한 것이다.

본 발명자들의 그룹은 인간 T 세포 유래 호산구 주화성 인자의 클로닝에 성공하여, 그로써 그것이 Tureci 등이 보고한 인간 갈렉틴 9(비특허문헌 1)의 변형체인 에칼렉틴임을 밝혀내었다(비특허문헌 2). 또한, 본 발명자들의 그룹은 에칼렉틴과 갈렉틴 9는 동일한 물질임을 밝혀, 인간의 갈렉틴 9는 그 링크 펩티드의 길이의 차이에 따라, 단형, 중형, 장형의 3 종류가 있음도 밝혀 내었다(비특허문헌 7).

[비특허문헌 1] Tureci O. et al., J Biol Chem., Mar. 7, 1997, 272(10): 6416-22

[비특허문헌 2] Matsumoto R. et al., J Biol Chem., 1998, 273: 16976-84

발명의 개시

갈렉틴 9는, 렉틴으로서의 활성을 갖는 생리 활성 물질이며, 조직 비만 세포, 호산구, 대식세포, T 세포, B 세포, 선유아세포, 혈관내피세포, 각종 종양 세 포 등에서 발현되는 것으로 확인되었으며, 그 발현량과 종양의 전이능 간의 상관성이 확인되는 등, 다양한 생리 현상에 관여하는 것이 예측되고 있다. 이 갈렉틴 9의 생산이나 유리를 제어하는 것을 가능하게 하는 물질은, 항종양 효과나 항염증 작용을 유도하는 등의 활성을 기대할 수 있으므로, 그 해명이 요구되고 있다. 갈렉틴 9는 활성화 T 림프구의 아폽토시스를 유도하는 등 여러가지 생체에 중요한 생리 활성에 관여하고 있는 것으로 생각된다. 따라서, 갈렉틴 9의 생산·유리 등을 제어함으로써, 다양한 생리 현상, 생물 활성 현상을 제어하는 것이 가능하게 된다고 생각된다. 생체에서의 갈렉틴 9의 양, 갈렉틴 9 발현 및 유리의 제어를 가능하게 하는 인자는 의약으로서도 유망할 것으로 기대된다.

본 발명자들은 예의 연구한 결과, 특정 종류의 세포막 가용화 분획(이하 「mf」라 함)에, 갈렉틴 9(이하, 「Gal-9」라고 함) 생산·유리를 유도하는 인자가 존재한다는 것을 발견하였다. 특히, 종양 세포막 가용화 분획에 Gal-9 생산·유리를 유도하는 인자가 존재하는 것을 발견하였다. 또, 이 mf에, 투여 부위에 Gal-9 생산 세포의 침윤과 이들 세포로부터의 Gal-9의 생산·유리를 유도하는 인자가 존재하는 것도 밝혀 내었다. 본 명세서에서는, 이 인자를 「갈렉틴 9 유도 인자」라고 부르기로 한다. 이 인자의 생물 활성·생리 활성으로 보아, 이 인자를 이용함으로써 항종양 효과나 항염증 작용을 유도하는 것이 가능하게 된다.

본 발명은 이하의 것들을 제공한다.

[1] B 세포 림프종 유래 세포주 BALL-1 세포로부터 얻을 수 있는 세포막 가용화 분획에 그 생물 활성이 존재하는 것을 동정(同定)할 수 있는 갈렉틴 9 유도 인자이며, 이 갈렉틴 9 유도 인자의 생물 활성은, 적어도 하기 (1)∼(11)로 구성되는 군에서 선택된 것에 의해 동정할 수 있는 것임을 특징으로 하는 인간 유래의 갈렉틴 9 유도 인자:

(1) 갈렉틴 9 유도 활성,

(2) 표적 종양 세포로서 Meth-A 육종을 사용한 생체내 시험에서 종양 세포의 증식 억제 또는 종양의 거부를 유발하는 것,

(3) 항종양 활성,

(4) 시험관내 시험에서 말초혈 단핵구의 자연 킬러 활성을 유도하는 것,

(5) 말초혈 단핵구를 사용한 시험에서, 갈렉틴 9 mRNA의 발현의 상향 조절,

(6) 말초혈 단핵구를 사용한 시험에서, 세포질에 있어서의 갈렉틴 9 단백질의 발현의 유의적인 상승,

(7) 조직병리학적 검사에서, 주사한 부위에 호산구 및 단핵 세포로 이루어지며 소수의 호중구를 수반한 육아 조직이 확인되는 것,

(8) 주사한 부위의 피근층 위나 아래의 결합 조직에서 다수의 비만 세포가 관찰되는 것,

(9) 종양 주위 조직의 조직병리학적 검사에서, 종양의 주위 또는 종양 조직에 염증 세포(주로 호산구와 약간의 비만 세포)의 침윤을 가진 영역이 관찰되는 것,

(10) 종양 주위 조직의 조직병리학적 검사에서, 핵농축을 보이는 종양 세포가 관찰되는 것,

(11) 종양 주위 조직의 조직병리학적 검사에서, 종양의 주위 또는 종양 조직에 이염성(metachromasia)을 보이는 비만 세포의 집적이 관찰되는 것.

[2] B 세포 림프종 유래 세포주 BALL-1 세포가 방사선 조사 처리된 것임을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재한 갈렉틴 9 유도 인자.

[3] BALL-1 세포를 프로테아제 저해제의 존재 하에, 계면활성제와 함께 균질화 처리하여 가용화한 세포막 가용화 분획에 존재하는 것을 특징으로 하는 상기 [1] 또는 [2]에 기재한 갈렉틴 9 유도 인자.

[4] B 세포 림프종 유래 세포주로부터 얻을 수 있는 세포막 가용화 분획으로부터, 콘카나발린 A 컬럼 크로마토그래피, 음이온 컬럼 컬럼 크로마토그래피 및 히드록시 아파타이트 컬럼 크로마토그래피 등의 컬럼 크로마토그래피로 구성되는 군에서 선택된 처리로 정제 및/또는 농축할 수 있는 것임을 특징으로 하는 상기 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재한 갈렉틴 9 유도 인자.

[5] 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재한 갈렉틴 9 유도 인자를 함유하는 것을 특징으로 하는, 세포에서 갈렉틴 9를 유도하는 시약.

[6] 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재한 갈렉틴 9 유도 인자와 세포를 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 세포에서 갈렉틴 9를 유도하는 방법.

[7] 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재한 갈렉틴 9 유도 인자를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.

[8] 항종양제, 항염증제, 항알레르기제, 면역억제제, 자가면역질환용 제제 또는 부신피질 스테로이드 호르몬 대체제인 것을 특징으로 하는 상기 [7]에 기재한 의약.

[9] 인간 유래의 것임을 특징으로 하는 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재한 갈렉틴 9 유도 인자.

발명의 효과

본 발명에 의해, 갈렉틴 9 유도 인자가 동정되어 그 정제가 이루어졌으므로, 그 정제 갈렉틴 9 유도 인자를 사용한 의약품 개발, 갈렉틴 9가 관여하는 생리 현상, 생물 활성에 대한 연구 개발이 진전된다. 특히, 갈렉틴 9 유도 인자는, 세포막 가용화 분획 및 이 분획으로부터 콘카나발린 A 흡착 분획, Resource Q^TM 이온 교환 컬럼, 히드록시 아파타이트 컬럼 등을 이용함으로써, 농축된 활성 보유 분획으로서 얻을 수 있다. 이 인자를 투여함으로써, NK형 활성을 증강시키는 활성, 항종양 활성 등의 생물 활성을 얻을 수 있으므로, 그 갈렉틴 9 유도 활성을 이용한 측정 시약, 의약, 분석 등의 개발이 가능하게 된다.

본 발명의 그 밖의 목적, 특징, 우수성 및 이것이 갖는 관점은, 이하의 기재로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그렇지만, 이하의 기재 및 구체적인 실시예 등의 기재를 포함한 본 명세서의 기재는 본 발명의 바람직한 형태를 나타내는 것으로, 단지 설명을 위해 제시된 것임을 이해해야 한다. 본 명세서에 개시한 본 발명의 의도 및 범위 내에서, 다양한 변화 및/또는 변경(혹은 수식)을 가하는 것은, 이 하의 기재 및 본 명세서의 그 밖의 부분으로부터의 지식에 의해, 당업자라면 용이하게 이해할 것이다. 본 명세서에서 인용되고 있는 모든 특허 문헌 및 참고 문헌은 설명할 목적으로 인용되고 있는 것으로, 이들은 본 명세서의 일부로서 그 내용은 본원에 포함시켜 해석되어야 할 것이다.

도 1은 BALL-mf의 항종양 활성에 대한 시험 결과를 나타낸다. (a) 종양 증식에 미치는 BALL-mf의 억제 작용을 나타낸다. ●: BALL-mf로 처치된 동물에 있어서의 종양의 중량. ■: Daudi-mf로 처치된 동물에 있어서의 종양의 중량. ○: PBS로 처치된 동물에 있어서의 종양의 중량. 처치한 후 18일째에 BALL-mf에 의한 종양 증식 억제 작용은 현저하였다(n=10, p<0.05). (b) Meth-A 담암(tumor-bearing) 마우스에 있어서의 종양의 거부 작용에 대한 시험 결과를 나타낸다. ●: BALL-mf로 처치된 동물 중 종양 거부가 있는 동물의 수. ■: Daudi-mf로 처치된 동물 중 종양 거부가 있는 동물의 수. ○: PBS로 처치된 동물 중 종양 거부가 있는 동물의 수. χ² 해석(n=10, p=0.0006).

도 2는 조직병리학적 검사: Meth-A 담암 마우스를 처치한 후 27일째에 피부 부위를 잘라내어 고정화 처리한 후, 김사(Giemsa) 염색한 생물 조직의 형태를 나타내는 사진이다. BALL-mf 처리(a). Daudi-mf 처리(b). 호산구는 E → (또는 ← E)로 표시되어 있다.

도 3은 조직병리학적 검사: Meth- A 담암 마우스를 BALL-mf 처치한 후 27일 째에 종양 부위를 잘라내어 고정화 처리한 후, 김사 염색(a) 또는 톨루이딘 블루 염색(b)한 생물 조직의 형태를 나타내는 사진이다. 마찬가지로, Daudi-mf 처리한 마우스의 종양 부위를 잘라내어 고정화 처리한 후, 김사 염색(c)한 생물 조직의 형태를 보여주는 사진도 나타내고 있다. 호산구는 E → (또는 ← E)로 표시되어 있으며, 비만 세포는 M → (또는 ← M)로, 호중구는 N → 로, 그리고 핵농축을 나타내는 Meth-A 세포는 → 만으로 표시되어 있다.

도 4는 BALL-mf를 마우스 등가죽 내에 주사하고 나서 24 시간 후의 조직을 채취해, 김사 염색한 후 조직학적으로 검토한 결과를 보여주는 생물 조직의 형태를 나타내는 사진이다. 림프구나 조직 비만 세포와 함께 매우 분명한 호산구의 침윤을 볼 수 있다. 침윤 세포를 검토하면, 다수의 비만 세포나 호산구(화살표)와 소수의 림프구나 대식세포의 침윤이 확인되었다.

도 5는 대조군으로서 Daudi-mf를 마우스 등가죽 내에 주사한 경우에는, 림프구계 세포의 침윤이 매우 분명하지만 호산구의 침윤은 볼 수 없다. 비만 세포나 호산구의 침윤은 보이지 않고, 림프구의 침윤이 매우 분명하였다.

도 6은 BALL-mf 주사한 후의 침윤 세포가 갈렉틴 9 mRNA를 갖는지의 여부를 검토하기 위해 인시추(in situ) 하이브리드화를 실시하였다. 결과는 (a) 비만 세포는 다량의 갈렉틴 9 mRNA를 보유하고 있었다. 호산구, 대식세포, 선유아세포도 약간 갖고 있었다. (b) 근판(panniculus carnosus muscle) 바로 위쪽 부분에 비만 세포의 침윤이 보이고, 다량의 갈렉틴 9 mRNA를 가지고 있었다. 대조군의 Daudi-mf 주사에서는, 근판부에는 비만 세포의 침윤은 볼 수 없었다(c). 또, 침윤한 림프구 에는 갈렉틴 9는 볼 수 없었다.

도 7은 갈렉틴 9 유도 인자에 의한 생체내 효과를 나타낸다. BALL-mf 주사 국소에 있어서의 갈렉틴 9 생산 세포 및 보유 세포를 분명하게 하기 위해서 인시추 하이브리드화(A) 및 면역염색법(B)을 이용하여 각각 검토하였다. 인시추 하이브리드화(A)에서는, 갈렉틴 9 생산 세포는 비만 세포가 주된 세포이고, 그 외 선유아세포, 림프구, 호산구 등이 갈렉틴 9의 유전자를 갖고 있었다. 면역염색(B)에서도, 상기한 세포가 갈렉틴 9를 세포질 내에 보유하고 있음을 알 수 있었다. 이러한 점에서, BALL-mf 자극에 의해 이들 염증 세포로부터 갈렉틴 9의 생산·유리가 야기되어 염증 반응이 유도되는 것이 시사되었다.

도 8은 BALL-mf에 의한 갈렉틴 9 생산·유리 효과에 대한 검토 결과를 나타낸다. 마우스 복강 세포를 BALL-mf로 자극한 후, mRNA를 추출하여, 갈렉틴 9 mRNA량을 RT-PCR법으로 검토하면, 갈렉틴 9 mRNA의 발현이 BALL-mf에 의해서 약간이지만 증강되는 것을 알 수 있었다. 또한 웨스턴 블롯법이나 FACS 분석을 실시하였다. FACS 분석에 의해 BALL-mf 자극 세포에 있어서 세포질 내 갈렉틴 9 단백질은 감소하고 있음이 밝혀졌다. 이 결과는, BALL-mf는 갈렉틴 9의 생산을 증강시키지만, 오히려 갈렉틴 9 유리를 유도하는 것이 시사되었다.

도 9는 BALL-mf에 의한 갈렉틴 9 생산·유리 효과에 대한 검토 결과를 나타낸다. BALL-mf 자극 PC의 배양 상청 중에 갈렉틴 9의 유리가 유도되었는지의 여부를 검토하기 위해서, 호산구 주화성 활성을 측정하였다. 결과는, 호산구 주화성 활성의 증강이 보이고, 게다가 그 활성은 항-갈렉틴 9 항체 컬럼에 흡수되므로, 갈렉 틴 9의 유리가 증강되는 것을 알 수 있었다. BALL-mf에 의한 호산구 주화성 활성은 항-갈렉틴 9 항체에 의해서는 흡수되지만, 항-갈렉틴-8 항체에 의해서는 흡수되지 않는다. 따라서, 갈렉틴 9 유도 인자에 의한 작용이라고 생각된다. 비만 세포계 세포뿐만 아니라, 호산구계, 대식세포계 세포, T 세포계 세포에서도 갈렉틴 9 유도 인자에 의해서 갈렉틴 9의 생산이 유도되었다.

도 10은 생체내에서의 BALL-mf의 항종양 활성을 조사한 결과를 나타낸다. BALL-mf는 Meth-A 종양의 생착 및 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다. χ² 검정에서도 대조군(PBS 처치군)에서의 35 마리 중 29 마리, Daudi-mf 처치군에서 25 마리 중 22 마리에서 생착, 증식하였지만, BALL-mf 처치군에서는 30 마리 중 24 마리에서 배제되거나, 생착되지 않았다.

도 11은 종양 조직의 면역 조직학적 분석을 실시한 결과를 보여주는 조직의 형태를 나타내는 사진이다. 항-갈렉틴 9 항체를 이용하여 면역 조직 염색을 실시하면, BALL-mf 처치군에서는 주변에는 갈렉틴 9를 매우 분명하게 갖는 비만 세포의 침윤이 보이고(A), 종양 내에도 비만 세포가 침윤되어 있었다(B). 종양 세포 내에도 갈렉틴 9가 발현되어 있었다(A). 한편, Daudi-mf 처치군에서는 갈렉틴 9 발현 세포의 침윤은 보이지 않고, 종양 세포에 있어서의 발현도 거의 볼 수 없었다.

도 12는 갈렉틴 9에 의한 Meth-A 종양 세포의 아폽토시스 유도 활성을 조사한 결과를 나타낸다. 갈렉틴 9는 Meth-A 세포의 아폽토시스를 유도한다.

도 13은 BALL-mf를 렌틸-렉틴(Lentil-Lecftin) 친화성에 의한 갈렉틴 9 유도 인자의 정제와 항종양 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸다. 렌틸-렉틴 컬럼으로 비흡착, 흡착 분획으로 나누어 그 활성에 대해 조사한 결과, 갈렉틴 9 유도 활성은 주로 흡착 분획에 볼 수 있었다. 또한, 항종양 활성 측정 실험에서는, 흡착 분획에는 오리지날에 필적하는 항종양 활성이 확인되었다. 호산구나 비만 세포의 침윤도 오리지날과 같았다. 도면에서, ○은 PBS, □은 유출액(Effluent), ■는 용출액(Eluate), ●는 오리지날(Original)이다.

도 14는 유도 인자의 등전점 분획과 항종양 활성에 대해 조사한 결과를 나타낸다. 렉틴 컬럼 흡착 분획을 Rotofor(등록상표)법으로 등전점 분획하여 얻은 분획으로 자극한 말초혈 단핵구로부터 RNA를 채취하여, 갈렉틴 9 발현을 RT-PCR법으로 검토하였다. RT-PCR법에서 F-1, F-2 및 F-4에 분명한 갈렉틴 9 발현의 증강을 볼 수 있었다.

도 15는 도 14에서 나타낸 등전점 분획하여 얻어진 분획의 항종양 활성에 대해 조사한 결과를 나타낸다. F-2와 F-3에 강한 항종양 활성이 유도된다. F-1 및 F-4에서는, PBS와 같거나, 반대로 종양 세포의 증식을 항진하고 있다. F-2 및 F-3에 포함되는 유도 인자에 항종양 활성이 보인다. 조직 염색으로 호산구나 비만 세포의 침윤이 확인되었다.

도 16은 BALL-mf를 Con A 친화성 컬럼 크로마토그래피로 정제한 결과를 나타낸다. BALL-mf를 Con A 컬럼으로 비흡착, 흡착 분획으로 분획하여, SDS-PAGE를 실시한 결과, 다른 단백질의 밴드를 볼 수 있었다.

도 17은 Con A 컬럼으로 분획된 분획에 대해서, 항종양 효과를 검토한 결과 를 나타낸다. 흡착 분획에 의해 강한 항종양 활성이 보였다. 이로부터 항종양 효과를 보이는 유도 인자는 만노스 또는 글루코스를 갖는 당단백질임을 알 수 있었다.

도 18은 BALL-mf의 Con A 컬럼 흡착 분획의 세포 상해 활성에 대해 검토한 결과를 나타내는 조직의 사진이다.

도 19는 Con A 컬럼 흡착 분획을 음이온 컬럼(RESOURCE Q)으로 정제 처리하여 얻은 분획에 대해서, 각 분획(A∼G)의 항종양 효과를 검토한 결과를 나타낸다.

도 20은 Con A 컬럼 흡착 분획을 음이온 컬럼으로 분획한 결과 얻은 분획 D의 농도를 변화시킨 항종양 활성을 조사한 결과를 나타낸다. 농도 의존적 항종양 활성이 확인된다.

도 21은 음이온 컬럼(RESOURCE Q) 정제 처리하여 취득한 분획 D를 히드록시 아파타이트 컬럼(CHT2-I)으로 분획한 결과(용출 패턴) 및 취득한 각 분획의 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.

도 22는 히드록시 아파타이트 컬럼(CHT2-I)으로 정제 처리되어 얻어진 각 분획에 대해 항종양 활성을 조사한 결과를 나타낸다. 동시에, 분획 D의 전기영동의 결과를 나타내는 사진도 나타내고 있다.

본 명세서에서, Gal-9 생산·유리 세포로서는, 비만 세포, 호산구, 대식세포, T 세포, B 세포, 선유아세포, 혈관내피세포, 각종 종양 세포 등을 들 수 있다. 이 갈렉틴 9 유도 인자를 포함하는 것으로서는, B 세포주 유래의 mf(예를 들어, 인간 급성 림프아구성 백혈병(human acute lymphoblastoid leukemia; ALL)으로부터 수립된 인간 세포주(human cell line) BALL-1 등), 그 콘카나발린 A 흡착 분획에 용출되는 mf, Resource Q^TM 이온 교환 컬럼으로부터 용출되는 mf, 히드록시 아파타이트 컬럼으로부터 용출되는 분획 등을 들 수 있다.

이 갈렉틴 9 유도 인자는 그것이 갖는 생물 활성, 예를 들어 갈렉틴 9 유도 활성을 시험관내 또는 생체내에서 검출·측정함으로써 확인하는 것이 가능하다. 예를 들어, 시험관내에서의 갈렉틴 9 유도 활성은 상기한 것 같은 Gal-9 생산·유리 세포를 mf로 자극한 후, RT-PCR, 웨스턴 블롯법, 유세포 계측법, 면역 조직 염색법, ELISA법, ELISPOT법, RIA법 등에 의해, Gal-9 mRNA나 Gal-9 단백질을 정량적 또는 정성적으로 분석하여 측정된다. 그 세포의 세포 배양액을 사용하여, RT-PCR, 웨스턴 블롯법, 유세포 계측법, 면역 조직 염색법, ELISA법, ELISPOT법, RIA법 등에 의해, Gal-9 단백질을 정량적 또는 정성적으로 분석하여 측정할 수도 있다. 또, 생체내에 있어서의 갈렉틴 9 유도 활성은 마우스, 래트, 몰모트, 토끼, 원숭이 등의 동물에 mf를 투여한 후, 갈렉틴 9 생산 세포의 침윤이나 Gal-9 유리의 증강을 지표로 하여 측정할 수 있다. 또, 종양 세포에 있어서의 Gal-9의 직접적 내지 간접적인 증강을 지표로 하여 그것을 측정할 수도 있다.

이 동물로서는, 대표적으로는 실험 동물을 들 수 있으며, 투여법으로는 피내, 피하, 근육내, 정맥 또는 동맥, 복강내 주사하거나 섭식 등을 들 수 있다.

갈렉틴 9 유도 인자를 작용시킴으로써, 종양 세포의 응집이나 아폽토시스를 유도할 수 있고, 나아가서는 항종양 활성을 얻을 수 있고, CD4 양성 T 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있어, 그 과잉 반응에 기인하는 알레르기나 자가면역 질환을 제어하는 것이 가능하게 되어, 염증의 억제를 도모하는 것이 가능해진다.

본 발명에 의한 갈렉틴 9 유도 인자는 갈렉틴 9의 발현을 유도하는 활성을 갖는 것이 특징이다. 이 인자는, 그 존재 또는 그 발현에 의해, 유의적으로 갈렉틴 9의 발현을 유도하는 것이 특징이다. 이 인자는, 갈렉틴 9를 유도하는 것을 통해 각종 생리 활성 및/또는 생물 활성을 발현한다.

본 발명의 갈렉틴 9 유도 인자는, 예를 들어 방사선 조사 처리된 B 세포 림프종 유래 세포주 BALL-1 세포로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 갈렉틴 9 유도 인자를 얻기 위해서 이용할 수 있는 BALL-1 세포는, 미국 균주 보관 기관(American Type Culture Collection(ATCC), Manassas, Virginia, USA), 후생노동성 국립 의약품 식품 위생 연구소 JCBR Cell Bank: 휴먼 사이언스 연구 자원 뱅크(Japanese Collection of Research Bioresources(JCBR), National Institute of Health Sciences(NIHS), Ministry of Health, Labor and Welfare, Japan: Health Science Research Bioresources Bank, Japan Health Sciences Foundation, Osaka, Japan)로부터 입수할 수 있다. 상기 세포주는 10% 소 태아 혈청(fetal calf serum; FCS) 함유의 RPMI1640 배지 등의 인간 유래 세포의 배양에 이용되는 일반적인 배지에서 배양된다. 배양 배지는 그 세포주가 증식할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 당류, 아미노산류, 비타민류, 그 밖의 유기 영양소, 미량 무기염류 등을 함유하는 액체 영양 배지 등을 사용할 수 있다. 증식시킨 후에, 필요에 따라서 방사선 조사 처리를 하고, 경우에 따라서는, 추가 배양한 후 세포를 회수하여(예를 들어, 원심분리 등으로 회수하여), 완충액 중에서 파쇄 등(예를 들어, 유리 비드를 사용한 물리적 파쇄, 초음파 처리 또는 효소 등에 의한 생화학적 방법)으로 무세포 추출액을 얻는다.

전형적으로는, 본 발명의 갈렉틴 9 유도 인자는, BALL-1 세포로부터 얻을 수 있는 세포막 가용화 분획으로부터 농축 또는 분리 및/또는 정제할 수 있다. 이 세포막 가용화 분획은, 예를 들어 BALL-1 세포를 프로테아제 저해제(예를 들어, 페닐메틸설포닐플루오라이드 등)의 존재 하에 계면활성제와 함께 균질화 처리하여 가용화시킨 다음, 원심 처리하여 상청액을 얻고, 이것을 투석시키고, 이어서 세공 직경 0.2 μm 의 필터에 통과시킴으로써 조제할 수 있다. 본 발명의 갈렉틴 9 유도 인자는, 이 세포막 가용화 분획으로부터, 단백질의 용해도에 의한 분획(유기 용매에 의한 침전이나 황산암모늄 등에 의한 염석 등), 투석, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 소수성 크로마토그래피 또는 킬레이트, 색소, 항체 등을 이용한 친화성 크로마토그래피 등을 단독으로 이용하거나 적당히 조합함으로써 정제할 수가 있다. 예를 들어, DEAE-세파로스(Sepharose) 등을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피, 블루-세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피, Mono Q HR5/5(FPLC 시스템, 아마샴 파마시아 바이오테크) 등의 고성능 액체 크로마토그래피 시스템 등을 거쳐 전기영동적으로 거의 단일 밴드가 되도록 정제할 수 있다. 대표적인 경우에는, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 거의 단일 밴드로서 얻는 것이 가능하다.

구체적으로는, 본 발명의 갈렉틴 9 유도 인자는, 상기 BALL-1 세포의 세포막 가용화 분획으로부터, 콘카나발린 A 컬럼 크로마토그래피, 음이온 컬럼 크로마토그래피 및 히드록시 아파타이트 컬럼 크로마토그래피로 구성되는 군에서 선택된 처리로 정제 및/또는 농축할 수 있다. 한편, 단백질의 정량은 시판되는 단백질 분석 키트를 사용하여 실시하며, 예를 들어 색소 결합법에 의해 실시할 수 있고, 단백질 자동 분석 장치를 사용하여도 실시할 수 있다.

본 발명의 갈렉틴 9 유도 인자를 코딩하는 DNA는, 예를 들어 다음과 같은 방법에 따라 그것을 단리 처리하는 것이 가능하다. 본 발명의 유도 인자를 정제한 후, N 말단 아미노산 서열을 분석한다. 이 유도 인자의 아미노산 서열 분석에서는, 정제물을, 필요에 따라, 리실 엔도펩티다제, V8 프로테아제 등의 효소에 의해 절단한 후, 역상 액체 크로마토그래피 등에 의해 펩티드 단편을 정제한 후, 단백질 분석기에 의해 아미노산 서열을 분석한다. 서열 분석에서는, 복수의 펩티드 단편을 이용하여 그 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 결정한 아미노산 서열을 바탕으로 PCR용의 프라이머를 설계하여, 유도 인자 생산 세포의 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리(시판되는 것이어도 됨)를 주형으로 하고, 아미노산 서열로부터 설계한 PCR 프라이머를 이용하여 PCR를 실시함으로써 본 발명의 DNA의 일부를 얻을 수 있다. 이 때, 인간 게놈 데이터베이스(GenBank^TM, DNA Data Bank of Japan(DDBJ) 등)를, 적절한 프로그램(예를 들어, BLAST 프로그램 등)을 사용하여 검색하는 등의 방식으로 이용할 수 있다. 또한, 얻어진 DNA 단편을 프로브로 하여, 유도 인자 생산 세포의 염색체 DNA의 제한 효소 분해물을 파지, 플라스미드 등에 도입하고, 대장균을 형질전환하여 얻은 라이브러리나 cDNA 라이브러리를 이용하여, 콜로니 하이브리드화, 플라크 하이브리드화 등에 의해, 원하는 DNA를 얻을 수 있다. 또, PCR에 의해 얻어진 DNA 단편의 염기 서열을 분석하고, 얻어진 서열로부터, 기존 DNA의 외측으로 신장시키기 위한 PCR 프라이머를 설계하여, 유도 인자 생산 세포의 염색체 DNA를 적당한 제한 효소로 분해한 후, 자기 환화 반응에 의해 DNA를 주형으로 하여 역(inverse) PCR를 실시함으로써(Ochman, H. et al., Genetics, 120: 621-623(1988); Innis, M. et al.(Ed.), PCR: Application & Protocols, Academic Press, New York(1989)), 또, RACE법(Rapid Amplification of cDNA Ends, Frohman, M.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8998(1988); Innis, M.A. et al.(Ed.), PCR Protocols: A guide to methods and applications, pp28-38, Academic Press, New York(1990), 코마노토오루편, 생물화학실험법 47 PCR 실험 메뉴얼, 학회출판센터(JSSP)) 등에 의해 원하는 DNA를 얻는 것도 가능하다. 한편, 상기 원하는 DNA는 이상과 같은 방법에 따라 클로닝된 게놈 DNA 또는 cDNA 외에, 합성에 의해서 얻을 수도 있다.

본 발명의 갈렉틴 9 유도 인자는, 그 생물 활성을, 적어도 하기 (1)∼(11)로 구성되는 군에서 선택된 것에 의해 동정할 수 있다:

(1) 갈렉틴 9 유도 활성,

(3) 항종양 활성,

(5) 말초혈 단핵구를 사용한 시험에서 갈렉틴 9 mRNA의 발현의 상향 조절,

(7) 조직병리학적 검사에서, 주사한 부위에 호산구 및 단핵 세포로 이루어지며 소수의 호중구를 동반한 육아 조직이 확인되는 것,

(8) 주사한 부위의 피근층의 위나 아래의 결합 조직에서 다수의 비만 세포가 관찰되는 것,

(10) 종양 주위 조직의 조직병리학적 검사에서, 핵농축을 보이는 종양 세포가 관찰되는 것, 및

(11) 종양 주위 조직의 조직병리학적 검사에서, 종양의 주위 또는 종양 조직에 이염성을 보이는 비만 세포의 집적이 관찰되는 것.

전형적으로는, 갈렉틴 9 유도 활성을 지표로 할 수 있다. 갈렉틴 9 유도 활성은, 본 발명의 갈렉틴 9 유도 인자를 첨가했을 경우와 그것을 첨가하지 않는 경우에서, 갈렉틴 9의 존재량의 변화, 갈렉틴 9 활성의 변화, 갈렉틴 9 발현 활성의 변화, 갈렉틴 9 mRNA량의 변화 등을 분석하여 동정할 수 있다. 갈렉틴 9 및 갈렉틴 9 발현 활성은, 예를 들어 국제 공개 제02/37114호 팜플렛(WO02/37114 A1)에 명시된 분석법 등을 참고로 하여 실시할 수 있다.

본 발명에서는, 「유전자 재조합 기술」을 이용하여 소정의 핵산·폴리뉴클레오티드 등을 단리·서열 결정하거나 재조합체를 제작하거나 소정의 단백질·펩티드를 얻을 수 있다. 본 명세서 중에서 사용할 수 있는 유전자 재조합 기술로서는, 당 분야에 공지된 것을 들 수 있으며, 예를 들어 문헌[J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(2nd Edition, 1989 & 3rd Edition, 2001); D.M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 3, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995); "Methods in Enzymology" series, Academic Press, New York, 예를 들어 R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68(Recombinant DNA), Academic Press, New York(1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100(Recombinant DNA, Part B) & 101(Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York(1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153(Recombinant DNA, Part D), 154(Recombinant DNA, Part E) & 155(Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York(1987); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 216(Recombinant DNA, Part G), Academic Press, New York(1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 217(Recombinant DNA, Part H) & 218(Recombinant DNA, Part I), Academic Press, New York(1993); P.M. Conn ed., "Methods in Enzymology", Vol. 302(Green Fluorescent Protein), Academic Press, New York(1999); S. Weissman ed., "Methods in Enzymology", Vol. 303(cDNA Preparation and Characterization), Academic Press, New York(1999)] 등에 기재한 방법 또는 이에 인용된 문헌 기재의 방법 또는 그들과 실질적으로 동일한 방법이나 변경법을 들 수 있다(그 중에 있는 기재는 그것을 참조함으로써 본 명세서의 개시에 포함된다).

본 명세서에서, 「올리고뉴클레오티드」란, 비교적 짧은 1 가닥 사슬 또는 2 가닥 사슬의 폴리뉴클레오티드로, 바람직하게는 폴리데옥시뉴클레오디드를 들 수 있으며, 문헌[Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol.28, p.716-734(1989)]에 기재되어 있는 기존의 방법, 예를 들어, 포스포트리에스테르법, 포스포디에스테르법, 포스파이트법, 포스포아미다이트법, 포스포네이트법 등의 방법에 의해 화학 합성될 수 있다. 통상 합성은, 변형된 고체 지지체 상에서 합성을 편리하게 실시할 수 있다는 것이 알려져 있으며, 예를 들어 시판되는 자동화된 합성 장치, 예를 들어, Applied Biosystems 3400 DNA synthesizer(Applied Biosystems), ABI 3900 High-Throughput DNA synthesizer(Applied Biosystems) 등을 이용하여 실시할 수 있다. 이 올리고뉴클레오티드는, 1개 또는 그 이상의 변형된 염기를 함유하고 있어도 좋고, 예를 들어 이노신 등의 자연 발생이 아닌 염기 또는 트리틸화된 염기 등을 함유하고 있어도 좋으며, 경우에 따라서는, 마커가 붙은 염기를 함유하고 있어도 좋다.

본 명세서에서, 「폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)」 또는 「PCR」이란, 일반적으로, 문헌[H.A. Erlich ed., PCR TechnoLogy, Stockton Press, 1989] 등에 기재된 것과 같은 방법을 가리키며, 예를 들어, 원하는 뉴클레오티드 서열을 시험관내에서 효소적으로 증폭하기 위한 방법을 의미한다. 일반적으로, PCR법은 주형 핵산과 우선적으로 하이브리드화할 수 있는 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 프라이머 신장 합성을 실시하는 사이클을 반복 실시하는 것을 포함하는 것이다. 전형적으로는, PCR법에서 이용되는 프라이머는 주형 내부의 증폭되어야 할 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 프라이머를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 상기 증폭되어야 할 뉴클레오티드 서열과 그 양단에 있어서 상보적이거나, 또는 상기 증폭되어야 할 뉴클레오티드 서열에 인접하고 있는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 프라이머는 바람직하게는 5개 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 10개 이상의 염기로 구성되는 올리고뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 18∼25개의 염기로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

PCR 반응은 당 분야에 공지된 방법 또는 그것과 실질적으로 동일한 방법이나 변경법에 의해 실시할 수 있는데, 상기 문헌 외에, 예를 들어 문헌[R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239: 487, 1988; D.M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995); M.A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York(1990)); M.J. McPherson, P. Quirke and G.R. Taylor(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford(1991); M.A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002(1988)] 등에 기재된 방법 또는 그것을 변형하거나 변경한 방법에 따라서 실시할 수 있다. 또, PCR법은, 거기에 적합한 시판되는 키트를 이용해 실시할 수 있으며, 키트 제조업자 또는 키트 판매업자에 의해 명시된 프로토콜에 따라서 실시할 수도 있다.

PCR 반응은 대표적인 경우에는, 예를 들어 주형(대표적으로는 DNA)과 대상 핵산에 기초하여 디자인된 프라이머를, 10×반응 완충액(Taq DNA 폴리머라제와 함께 포함되어 있음), dNTP(데옥시뉴클레오시드3인산 dATP, dGTP, dCTP, dTTP의 혼합물), Taq DNA 폴리머라제 및 탈이온 증류수와 혼합한다. 혼합물을, 예를 들어 GeneAmp^TM PCR system 2700(Applied Biosystems) 등의 자동 서멀 사이클러를 이용해 일반적인 PCR 사이클 조건 하에 그 사이클을 25∼60회 반복하는데, 증폭을 위한 사이클의 수는 적절하게 목적에 따라 적당한 횟수로 할 수 있다. PCR 사이클 조건으로서는, 예를 들어, 변성 90∼95℃ 5∼100초, 어닐링 40∼60℃ 5∼150초, 신장 65∼75℃ 30∼300초의 사이클, 바람직하게는 변성 94℃ 15초, 어닐링 58℃ 15초, 신장 72℃ 45초의 사이클을 들 수 있지만, 어닐링의 반응 온도 및 시간은 적절히 실험에 의해서 적당한 값을 선택할 수 있으며, 변성 반응 및 신장 반응의 시간도, 예상되는 PCR 생성물의 사슬 길이에 따라 적당한 값을 선택할 수 있다. 어닐링의 반응 온도는 통상 프라이머와 주형 DNA와의 하이브리드의 Tm 값에 따라 변화시키는 것이 바람직하다. 신장 반응의 시간은 통상 1000 bp의 사슬 길이당 1분 정도가 대체적인 기준이지만, 보다 짧은 시간을 선택하는 것도 경우에 따라 가능하다.

소정의 핵산을 동정하려면, 하이브리드화 기술을 이용할 수 있다. 이 하이브리드화는, 상기 「유전자 재조합 기술」을 개시하는 문헌에 기재된 방법 또는 그것과 실질적으로 동일한 방법이나 변경법에 의해 실시할 수 있으며, 예를 들어, 콜로니 하이브리드화법, 플라크 하이브리드화법, 하이브리드화 트랜스레이션 분석법, 플러스·마이너스법 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드화는, DNA 등의 핵산을 함유하고 있는 샘플을 담체(나일론 필터 등의 막을 포함한 것)에 전사하여, 필요에 따라 변성 처리, 고정화 처리, 세정 처리 등을 실시한 후, 그 담체(예를 들어, 막 등)에 전사한 것을, 필요에 따라 변성시킨 표지 프로브 DNA 단편과 하이브리드화용 완충액 중에서 반응시켜 실시한다. 한편, 프로브 등을 방사성 동위원소 등으로 표지하려면, 시판되는 표지 키트, 예를 들어 랜덤 프라임드 DNA 라벨링 키트(Boehringer Mannheim) 등을 사용하여 프로브용 DNA를 [α-³²P]dCTP(Amersham) 등을 이용해 표지하여, 방사 활성을 갖는 프로브를 얻음으로써 실시할 수 있다. 또한, 이 표지는, 당 분야에 공지된 방법으로 실시할 수 있으며, 예를 들어 디곡시제닌(digoxigenin), 형광 색소, 비오틴-아비딘계 등에 의해서 실시할 수도 있다.

하이브리드화 처리는 보통 약 35℃∼약 80℃, 보다 적합하게는 약 50℃∼약 65℃에서, 약 15 분∼약 36 시간, 보다 적합하게는 약 1 시간∼약 24 시간 실시하는데, 적절하게 최적의 조건을 선택하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드화 처리는 약 55℃에서 약 18 시간 실시한다. 하이브리드화용 완충액로서는, 당 분야에서 통상 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있다. 전사한 담체(예를 들어, 막 등)의 변성 처리로서는, 알칼리 변성액을 사용하는 방법을 들 수 있고, 그 처리 후 중화액이나 완충액으로 처리하는 것이 바람직하다. 또 담체(예를 들어, 막 등)의 고정화 처리는, 보통 약 40℃∼약 100℃, 보다 적합하게는 약 70℃∼약 90℃에서, 약 15 분∼약 24 시간, 보다 적합하게는 약 1 시간∼약 4 시간 베이킹함으로써 실시하는데, 적절히 바람직한 조건을 선택하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 필터 등의 담체를 약 80℃에서 약 2 시간 베이킹함으로써 고정화를 실시한다. 전사한 담체(예를 들어, 막 등)의 세정 처리로서는, 당 분야에서 통상 사용되는 세정액, 예를 들어 1 M NaCl, 1 mM EDTA 및 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 함유 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0 등으로 세정하여 실시할 수 있다. 막을 포함한 담체로서는, 당 분야에서 통상 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있으며, 예를 들어 나일론 필터 등을 들 수 있다.

상기 알칼리 변성액, 중화액, 완충액으로서는, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있으며, 알칼리 변성액으로서는, 예를 들어 0.5 M NaOH 및 1.5 M NaCl를 함유하는 액 등을 들 수 있고, 중화액으로서는, 예를 들어 1.5 M NaCl 함유 0.5 M Tris-HCl 완충액, pH 8.0 등을 들 수 있고, 완충액으로서는, 예를 들어, 2×SSPE(0.36 M NaCl, 20 mM NaH₂PO₄ 및 2 mM EDTA) 등을 들 수 있다. 또 하이브리드화 처리에 앞서서, 비특이적인 하이브리드화 반응을 막기 위해서, 필요에 따라 전사한 담체(예를 들어, 막 등)는 사전 하이브리드화 처리하는 것이 바람직하다. 이 사전 하이브리드화 처리는, 예를 들어 사전 하이브리드화 용액[50% 포름아미드, 5×덴하르트 용액(0.2% 소 혈청 알부민, 0.2% 폴리비닐 피롤리돈), 5×SSPE, 0.1% SDS, 100 μg/mL 열 변성 연어 정자 DNA] 등에 침지시켜, 약 35℃∼약 50℃, 바람직하게는 약 42℃에서, 약 4 시간∼약 24 시간, 바람직하게는 약 6 시간∼약 8 시간 반응시킴으로써 실시할 수 있는데, 이러한 조건은 당업자라면 적절히 실험을 반복하여, 보다 바람직한 조건을 결정할 수 있다. 하이브리드화에 이용하는 표지 프로브 DNA 단편의 변성은, 예를 들어 약 70℃∼약 100℃, 바람직하게는 약 100℃에서, 약 1 분간∼약 60 분간, 바람직하게는 약 5 분간 가열하는 등의 방법으로 실시할 수 있다. 한편, 하이브리드화는, 그 자체 공지의 방법 또는 거기에 준한 방법으로 실시할 수 있는데, 본 명세서에서 엄격한(stringent) 조건이란, 예를 들어 나트륨 농도에 대해, 약 15∼약 50 mM, 바람직하게는 약 19∼약 40 mM, 보다 바람직하게는 약 19∼약 20 mM이며, 온도에 대해서는 약 35∼약 85℃, 바람직하게는 약 50∼약 70℃, 보다 바람직하게는 약 60∼약 65℃의 조건을 나타낸다.

하이브리드화 완료 후, 필터 등의 담체를 충분히 세정 처리하여, 특이적인 하이브리드화 반응을 한 표지 프로브 DNA 단편 이외의 표지 프로브를 제거한 다음 검출 처리를 할 수 있다. 필터 등의 담체의 세정 처리는 당 분야에서 통상 사용되는 것 중에서 선택 이용하여 실시할 수 있으며, 예를 들어 0.1% SDS 함유 0.5×SSC(O.15 M NaCl, 15 mM 구연산) 용액 등으로 세정하여 실시할 수 있다.

하이브리드화한 핵산은, 대표적으로는 오토 라디오그래피에 의해 검출할 수 있는데, 당 분야에서는 각종 기법이 알려져 있으며, 그러한 방법 중에서 적절하게 선택하여 검출에 이용할 수도 있다. 검출한 시그널에 해당하는 핵산 밴드를, 적절한 완충액, 예를 들어 SM 용액(100 mM NaCl 및 10 mM MgSO₄ 함유 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5) 등에 현탁하고, 이어서 이 현탁액을 적절히 희석하여, 소정의 핵산을 단리·정제, 그리고 새로운 증폭 처리를 수행할 수 있다. 소정의 핵산을 보유하는 샘플(예를 들어, 파지 입자, 재조합 플라스미드 또는 벡터 등)은 당 분야에서 통상 사용되는 방법으로 그것을 정제 분리할 수 있으며, 예를 들어 글리세롤 구배 초원심분리법(Molecular cloning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989) 등에 의해 정제할 수 있다. 파지 입자 등으로부터는, 당 분야에서 통상 사용되는 방법으로 DNA를 정제 분리할 수 있으며, 예를 들어, 얻어진 파지 등을 TM 용액(10 mM MgSO₄ 함유 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.8) 등에 현탁하여, DNase I 및 RNase A 등으로 처리한 후, 20 mM EDTA, 50 μg/ml 프로테이나제 K 및 0.5% SDS 혼합액 등을 첨가하여, 약 65℃, 약 1 시간 보온한 후, 이것을 페놀 추출 디에틸에테르 추출한 후, 에탄올 침전에 의해 DNA를 침전시키고, 이어서 얻어진 DNA를 70% 에탄올로 세정한 후 건조하고, TE 용액(10 mM EDTA 함유 10 mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0)에 용해하는 등으로 얻을 수 있다. 또, 원하는 DNA는, 서브클로닝 등에 의해 대량으로 얻는 것도 가능하며, 예를 들어 서브클로닝은, 숙주로서 대장균을 이용하고 플라스미드 벡터 등을 이용하여 실시할 수 있다. 이러한 서브클로닝에 의해 얻어진 DNA도, 상기와 같은 식으로 하여 원심분리, 페놀 추출, 에탄올 침전 침전 등의 방법에 의해 정제 분리할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 핵산은 1 가닥 사슬 DNA, 2 가닥 사슬 DNA, RNA, DNA:RNA 하이브리드, 합성 DNA 등의 핵산이며, 또 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 세포 유래의 cDNA, 합성 DNA의 어느 것이라도 좋다.

본 발명에 따르면, 해명되고 있는 갈렉틴 9 유전자의 구조 및 이 DNA 서열에 대한 지견을 이용하여, 표적인, 게놈 DNA, mRNA의 스크리닝 및 갈렉틴 9 발현 활성, 갈렉틴 9 활성, 나아가서는 갈렉틴 9 유도 활성 등의 검출을 위한 프로브 및 프라이머의 설계 등이 가능하다. 특이적 검출용 프로브 및 프라이머로서는, 실질적으로 갈렉틴 9 유도 활성을 특이적으로 검출하는 것을 가능하게 하는 것이면 된다. 대표적으로는, 국제 공개 제02/37114호 팜플렛(WO 02/37114 A1)에 명시된 유전자 중 특징적인 서열 부분을 검출하는 것을 가능하게 하는 것을 들 수 있으며, 바람직하게는 특이적 검출에 도움이 되는 것이라면 이 갈렉틴 9 유전자의 일부를 검출하는 것도 허용된다. 예를 들어, 인간 갈렉틴 9를 PCR로 얻으려면,

Gal-9 센스 서열: CAGGCACCCATGGCTCAAACTAC [서열 번호 1]

안티센스 서열: TATCAGACTCGGTAACGGGGGT [서열 번호 2]

의 프라이머 세트를 사용할 수 있는 것 외에, 실시예에 기재한 프라이머 세트 등을 사용할 수 있다.

검출에 사용되는 프로브 및 프라이머는, 적합하게는 핵산 단편 또는 올리고뉴클레오티드이며, 그러한 것은 소정의 유전자에 특이적으로 하이브리드화할 것이 요구된다. 검출에 유효한 경우에는, 하이브리드화 형성을 하여 유효하게 결합하고 있는 것이 바람직하며, 그러한 목적에서는, 예를 들어 5개 또는 10개 이상의 연속된 염기를 포함하고 있는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 15개 또는 25개 이상의 연속된 염기를 포함하고 있는 올리고뉴클레오티드, 한층 더 바람직하게는 30개 또는 50개 이상의 연속된 염기를 포함하고 있는 올리고(또는 폴리)뉴클레오티드를 들 수 있다. 표적 서열로 유효하게 하이브리드를 형성할 수 있는 염기 서열을 갖는 올리고(또는 폴리)뉴클레오티드는, 그 선택된 염기 서열의 일단 또는 양단에 다른 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬이 부가되어 있더라도 좋고, 본 명세서에서 설명되어 있는 표지(마커 또는 리포터 등도 포함함) 등이 결합되어 있어도 좋다. 표지는, 예를 들어 PCR 과정에서 부착되는 것이라도 좋다. 표지는, 당 분야에서 광범위하게 이용되고 있는 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어 방사성 물질, 형광성 물질, 발광성 물질, 효소 등, 또한 비오틴-아비딘계 등이면 된다. 적합하게는 프로브는, 검출을 용이하게 하기 위해 표지되고 있어도 좋다. 유전자의 단리에 있어서는, PCR법, 또한 역전사 효소(RT)를 이용한 PCR법(RT-PCR)을 이용할 수 있다. 정량적 측정을 목적으로 하여 경합 PCR법을 실시할 수도 있다. 예를 들어, 소정의 cDNA를 프로브로서 이용하면, 예를 들어 노던 블로팅, 서던 블로팅, 인시추 하이브리드화 등에 의해 세포 중에서의 특유의 유전자 등을 검출·측정할 수 있다.

검출함에 있어서 소정의 유전자를 특이적으로 증폭하기 위해서는, 프라이머로서는 증폭해야 할 서열의 양단을 규정하는 1쌍의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것을 사용하는데, 본 명세서에서 개시한 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명에서 정의한 소정의 특이적 올리고뉴클레오티드 하나와 유니버설 프라이머 하나로 구성되는 1쌍의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것을 사용할 수도 있다.

상기 프라이머는 증폭해야 할 서열의 사슬의 연장 개시에 사용되며, PCR법뿐만 아니라, LCR법, TAS법 등의 증폭법에서 사용할 수 있다. 이 프라이머의 용도는 특정의 핵산 증폭법에 한정되는 것이 아니라, 여러가지 용도·적용·목적으로 이용할 수 있다.

이 검출 방법에서는, 핵산 시료를 상기 「유전자 재조합 기술」에 기재한 방법으로 입수하여, 필요에 따라서, 표적 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 이용해 증폭 반응을 실시하여, 증폭되었는지의 여부를 검정한다. 따라서, 본 발명의 방법에 있어서는, 기존의 DNA, mRNA 등의 핵산 추출법 또는 다른 적당한 핵산 추출 방법을 이용할 수 있다. 추출된 DNA, mRNA 등의 핵산의 증폭은 임의의 증폭 방법, 예를 들어 PCR법, RT-PCR법 등에 의해 실시할 수 있다. 증폭 조작으로부터의 생성물은, 예를 들어 전기영동, 예를 들어 아가로스 겔 전기영동을 실시한 후, 증폭된 DNA의 유무에 대해 통상의 방법에 의해, 예를 들어 에티듐브로마이드의 염색제로 염색한 후 UV 조사에 의해 검출할 수 있다. 혹은, 소정의 프로브에 의해 검출할 수 있다. 예를 들어, 갈렉틴 9 유전자의 발현이 피시료 중에 없는 경우에는 증폭이 생기지 않거나 또는 낮은 수준이므로, 예를 들어, 블로팅법, 역블로팅법 등, 증폭 생성물의 분리를 동반하지 않는 검출 방법을 이용할 수도 있다.

본 명세서 중에서 표적으로 하는 관련 단백질 또는 폴리펩티드, 그 단편, 또 DNA를 포함한 핵산(mRNA나 올리고뉴클레오티드를 포함함)은, 그들을 단독 또는 유기적으로 사용하여, 나아가서는 안티센스 기술, 모노클로날 항체를 포함한 항체, 재조합 세포(형질전환체) 등과도 적절히 조합하여, 유전학 및 단백질학 기술에 응용할 수 있다. 핵산 어레이, 단백질 어레이를 사용한 유전자 발현 분석, 유전자 기능 분석, 단백질간 상호 작용 분석, 관련 유전자 분석을 하는 것이 가능하다. 예를 들어, 핵산 어레이 기술에서는, cDNA 라이브러리를 사용하거나, PCR 기술로 얻은 DNA를 기판 상에 스포팅 장치로 고밀도로 배치하여, 하이브리드화를 이용해 시료의 분석이 이루어진다.

상기 어레이화는, 시린지 또는 핀을 사용하거나, 또는 잉크젯 프린팅 기술 등으로, 슬라이드 글라스, 실리콘판, 플라스틱 플레이트 등의 기판의 각각 고유의 위치에 DNA를 부착시켜 실시할 수 있다. 이 핵산 어레이 상에서의 하이브리드화의 결과 얻을 수 있는 시그널을 관찰하여 데이터를 획득한다. 이 시그널은 형광 색소 등의 표지(예를 들어, Cy3, Cy5, BODIPY, FITC, Alexa Fluor dyes(상품명), Texas red(상품명) 등)로부터 얻을 수 있는 것이라도 좋다. 검출에는 레이저 스캐너 등을 이용할 수도 있으며, 얻어진 데이터는 적당한 알고리즘에 따른 프로그램이 구비된 컴퓨터 시스템으로 처리되어도 좋다. 또, 단백질 어레이 기술에서는, 태그를 붙인 재조합 발현 단백질 생성물을 이용하여도 좋고, 2차원 전기영동(2-DE), 효소 분해 단편을 포함한 질량 분석(M8)(이것에는 전기분무 이온화법(electrospray ionization: ESI), 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화법(matrix-assisted laser desorption/ionization: MALDI) 등의 기술이 포함되며, MALDI-TOF 분석계, ESI-3 연사중극 분석계, ESI-이온 트랩 분석계 등을 사용하여도 좋음), 염색 기술, 동위원소 표지 및 분석, 화상 처리 기술 등이 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명에는 상기에서 얻을 수 있는 또는 이용할 수 있는 효소 유전자계 등 및 그것에 대한 항체에 관련된 소프트웨어, 데이터베이스 등이 포함되더라도 좋다.

본 발명에서의 검출·측정은, 면역염색, 예를 들어 조직 또는 세포 염색, 면역 전자 현미경, 면역분석, 예를 들어 경합형 면역분석 또는 비경합형 면역분석으로 실시할 수 있으며, 방사 면역 측정법(RIA), FIA, LIA, EIA, ELISA 등을 이용할 수 있고, B-F 분리를 실시하여도 되거나, 또는 실시하지 않고서 그 측정을 할 수 있다. 바람직하게는 RIA, EIA, FIA, LIA이며, 또한 샌드위치형 분석을 들 수 있다. 예를 들어 샌드위치형 분석에서는, 한 쪽을 본 발명의 갈렉틴 9 폴리펩티드에 대한 항체 또는 갈렉틴 9의 관련 펩티드 단편에 대한 항체로 하고, 다른 쪽을 갈렉틴 9의 C 말단측 잔기에 대한 항체로 하고, 그리고 한 쪽을 검출 가능하게 표지화한다(물론, 그 외의 조합도 가능하며, 목적에 따라 적절하게 디자인할 수 있음). 동일한 항원을 인식할 수 있는 다른 항체를 고상으로 고정화한다. 검체와 표지화 항체 및 고상화 항체를 필요에 따라서 순차 반응시키기 위해 항온 처리하고, 여기서 비결합 항체를 분리한 후, 표지물을 측정한다. 측정된 표지의 양은 항원, 즉 갈렉틴 9 폴리펩티드 항원의 양과 비례한다. 이 분석에서는, 불용화 항체나, 표지화 항체의 첨가의 순서에 따라 동시 샌드위치형 분석, 포워드(forward) 샌드위치형 분석 또는 역샌드위치형 분석 등으로 불린다. 예를 들어 세정, 교반, 진탕, 여과 또는 항원의 예비 추출 등은 특정한 상황 하에서 그들 측정 공정 중에서 적절하게 채용된다. 특정의 시약, 완충액 등의 농도, 온도 또는 항온처리 시간 등의 그 밖의 측정 조건은, 검체 중의 항원의 농도, 검체 시료의 성질 등의 요소에 따라 변화시킬 수 있다. 당업자는 통상의 실험법을 이용하면서 각 측정에 대해서 유효한 최적의 조건을 적당하게 선정하여 측정을 할 수 있다.

갈렉틴 9의 측정계로서는, 예를 들어 조직에 대해서는 면역염색(METHODS, 24, 289-296(2001); J Immunol Methods, 47(2), 129-144(1981); ibid., 150(1-2), 5-21, 23-32 & 151-158(1992); Cancer J, 7(1), 24-31(2001) 등), 면역 전자 현미경(Mol Biotechnol, 7(2), 145-l51(1997); J Electron Microsc Tech., 19(1), 57-63 & 64-79(1991); ibid., 19(3), 305-315(1991) 등)과 같은 단백 측정계, 인시추 하이브리드화와 같은 발현 유전자 측정계가, 조직 추출물에 대해서는 EIA, RIA, FIA, LIA, 웨스턴 블로팅(J Electron Microsc(Tokyo), 45(2), 119-127(1996); Methods Biochem Anal., 33, 1-58(1988); Methods Enzymol., 271, 177-203(1996); ibid., 305, 333-345(2000); J Immunol Methods, 152(2), 227-236(1992); ibid., 170(2), 177-184(1994); ibid., 195(1-2), 149-152(1996); 쿠치노요시유키 외 편, 「유전자·단백질, 실험 조작 블로팅법」, 주식회사 소프트사이언스사, 1987년 11월 10일 발행 등)과 같은 단백 측정계, 노던 블로팅, 도트 블롯, RNase 프로텍션 분석, RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), Real-Time PCR(Clinical Chemistry, 46:11, 1738-1743(2000))과 같은 발현 유전자 측정계, 그리고 혈중, 체액 등에 대해서는 ElA, RIA, FIA, LIA, 웨스턴 블로팅과 같은 단백 측정계를 유리하게 이용할 수 있다. 또 직접 갈렉틴 9 유도 인자의 측정계를 구축하여 그것을 유리하게 이용할 수 있다.

EIA의 측정계에 있어서, 예를 들어 경합법에서는, 항-갈렉틴 9 항체를 고상화 항체로서 사용하고, 표지 항원 및 비표지 항원(항원으로서는, 갈렉틴 9 또는 그 단편 펩티드 등을 들 수 있음)을 사용하며, 또 비경합법으로, 예를 들어 샌드위치법에서는, 고상화 항-갈렉틴 9 항체나 표지 항-갈렉틴 9 항체를 이용할 수 있는 것 외에, 항-갈렉틴 9 항체를 직접 표지하거나 고상화하지 않고, 항-갈렉틴 9 항체에 대한 항체를 표지하거나 고상화하여 실시할 수도 있다. 감도 증폭법으로서는, 예를 들어, 비효소 표지 1차 항체와의 조합에서는, 고분자 폴리머와 효소와 1차 항체를 이용하는 것(Envision 시약을 응용한 것; Enhanced polymer one-step staining(EPOS))을 들 수 있고, 비효소 표지 2차 항체와의 조합에서는, 예를 들어 PAP(peroxidase-antiperoxidase)법 등의 효소와 항효소 항체 복합체의 조합, SABC(avidin-biotinylated peroxidase complex)법 등의 비오틴 표지 2차 항체와 비오틴 표지 효소-아비딘 복합체의 조합, ABC(streptavidin-biotin complex)법, LSAB(labeled streptavidin-biotin)법 등의 비오틴 표지 2차 항체와 비오틴 표지 효소 스트렙타비딘 복합체의 조합, CSA(catalyzed signal amplification)법 등의 SABC와 비오틴 표지 티라마이드와 효소 표지 스트렙타비딘의 조합, 고분자 폴리머로 2차 항체와 효소를 표지하고 있는 것 등을 들 수 있다.

본 발명의 측정법에 있어서는, 적합하게 면역학적 측정법이 이용되는데, 그 때의 고상 담체로서는, 항체 등 단백질을 잘 흡착하는 폴리스티렌제, 폴리카보네이트제, 폴리프로필렌제 또는 폴리비닐제의 볼, 마이크로플레이트, 스틱, 미립자 또는 시험관 등의 각종 재료 및 형태를 임의로 선택하여 사용할 수 있다.

측정함에 있어서는 최적의 pH, 예를 들어 pH 약 4∼약 9로 유지하도록 적당한 완충액계 중에서 실시할 수 있다. 특히 적절한 완충제로서는, 예를 들어 아세테이트 완충제, 구연산염 완충제, 포스페이트 완충제, 트리스 완충제, 트리에탄올아민 완충제, 보레이트 완충제, 글리신 완충제, 탄산염 완충제, 트리스-염산 완충제, 베로날 완충제 등을 들 수 있다. 완충제는 서로 임의의 비율로 혼합하여 이용할 수 있다. 항원 항체 반응은 약 0℃∼약 60℃ 사이의 온도에서 실시하는 것이 바람직하다.

이들 개개의 면역학적 측정법을 포함한 각종 분석·정량법을 본 발명의 측정 방법에 적용함에 있어서는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요하지 않다. 각각의 방법에 있어서의 통상의 조건, 조작법에 당업자의 통상의 기술적 고려를 더하고, 본 발명의 해당 대상 물질 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 물질에 관련한 측정계를 구축하면 된다.

이러한 일반적인 기술 수단에 대한 상세한 설명에 대해서는, 총설, 성서 등을 참조할 수 있다[예를 들어, 이리에히로시 편, 「방사성면역분석(radioimmunoassay)」, 코단샤, 1974년 발행; 이리에히로시 편, 「속 라디오면역분석」, 코단샤, 1979년 발행; 이시카와에이지 등 편, 「효소 면역 측정법」, 이가쿠쇼잉, 1978년 발행; 미기카와에오사무 등 편, 「효소 면역 측정법」(제2판), 이가쿠쇼잉, 1982년 발행; 이시카와에이지 등 편, 「효소 면역 측정법」(제3판), 이가쿠쇼잉, 1987년 발행; H.V. Vunakis et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 70(Immunochemical Techniques, Part A), Academic Press, New York(1980); J.J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 73(Immunochemical Techniques, Part B), Academic Press, New York(1981); J.J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 74(Immunochemical Techniques, Part C), Academic Press, New York(1981); J.J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 84(Immunochemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York(1982); J.J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 92(Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Academic Press, New York(1983); J.J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121(Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York(1986); J.J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 178(Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Press, New York(1989); M. Wilchek et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 184(Avidin-Biotin Technology), Academic Press, New York(1990); J.J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 203(Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B: Anibodies and Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New York(1991) 등 또는 이에 인용된 문헌(이들 중에 있는 기재는 본 명세서에 참고 인용됨)].

갈렉틴 9 발현 유전자(cDNA 등의 DNA 및 mRNA 등의 RNA를 포함함)를, 상기한 「유전자 재조합 기술」에 따라, 당 분야에서 특정의 유전자 발현을 검출 측정하기 위해서 알려진 기법, 예를 들어 인시추 하이브리드화, 노던 블로팅, 도트 블롯, RNase 프로텍션 분석, RT-PCR, Real-Time PCR(Journal of Molecular Endocrinology, 25, 169-193(2000) 및 이에 인용된 문헌), DNA 어레이 분석법(Mark Shena 편, "Microarray Biochip Technology", Eaton Publishing(2000년 3월)) 등에 의해 검출·측정하여, 갈렉틴 9 유도 인자 활성을 검출할 수 있다. 이러한 기술을 이용한 갈렉틴 9 발현 유전자 측정계, 이에 이용되는 시약, 방법, 프로세스 등은 모두 본 발명의 갈렉틴 9 유도 인자 활성 검출제, 갈렉틴 9 유도 인자 활성 검출법 및 거기에 이용하는 시스템에 포함된다. 이 인시추 하이브리드화에는, 예를 들어 비-RI 인시추 하이브리드화가 포함되더라도 좋고, 거기에는, 예를 들어 직접법 및 간접법이 포함되어도 좋다. 상기 직접법은, 예를 들어 핵산 프로브에 검출 가능한 분자(리포터)가 직접 결합하고 있는 것을 사용하고, 상기 간접법은, 예를 들어 리포터 분자에 대한 항체 등을 사용하여 시그널을 증폭시키는 방법이다. 핵산 프로브 중의 올리고뉴클레오티드에는, 작용기(예를 들어, 제1급 지방족 아미노기, SH기 등)가 도입되며, 이러한 작용기에 합텐, 형광 색소, 효소 등이 결합되어도 좋다. 핵산 프로브의 표지로서는, 대표적으로는 디곡시제닌(DIG), 비오틴, 플루오레세인 등을 들 수 있지만, 상기한 바와 같이 항체에 대한 부분에서 설명한 표지로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있고, 또 다중 표지화도 이용할 수 있으며, 또한 표지 항체도 이용할 수 있다. 핵산 프로브의 표지법으로서는, 당 분야에 공지된 방법에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있는데, 예를 들어 랜덤 프라임법, 닉 트랜스레이션법, PCR에 의한 DNA의 증폭, 라벨링/테일링법, 시험관내 전사법 등을 들 수 있다. 처리된 시료의 관찰에는, 당 분야에 공지된 방법에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있는데, 예를 들어 암시야 현미경, 위상차 현미경, 반사 콘트라스트 현미경, 형광 현미경, 디지털 영상화 현미경, 전자 현미경 등도 사용할 수 있고, 또한 유세포 계측법 등에 의할 수도 있다. 본 발명에서는, 갈렉틴 9 및 갈렉틴 9 발현 유전자를 갈렉틴 9 유도 인자의 마커로서 사용할 수 있으며, 그로써, 여러 형태의 갈렉틴 9 유도 인자 활성 검출제 또는 갈렉틴 9 유도 인자 검출 및/또는 측정제, 갈렉틴 9 유도 인자 활성 검출법 또는 갈렉틴 9 유도 인자 검출 및/또는 측정법, 또한 갈렉틴 9 유도 인자 활성 검출 또는 갈렉틴 9 유도 인자 검출 및/또는 측정 시약 세트 또는 시스템을 구성할 수 있어, 갈렉틴 9 유도 인자의 정제·동정·단리·이용에 있어서 도움이 될 뿐만 아니라, 이들은 우수하다.

본 발명에서는, 갈렉틴 9의 생산·유리를 유도함에 의한, 암 전이 억제 작용을 얻기 위한 방법, 이에 사용하는 시약, 또는 키트, 시스템(검출·측정계를 포함함) 등을 제공한다. 갈렉틴 9의 생체내 농도 또는 발현을 제어함으로써, 항종양제, 항알레르기제, 면역억제제, 자가면역 질환용제, 항염증제 및 부신피질 스테로이드 호르몬 대체용 활성 성분제를 제공할 수 있다. 또, 갈렉틴 9 유도 인자를 이용하여, 당질코르티코이드가 나타내는 약리 작용·생물 활성을 이용한 분야에의 응용이 가능하다.

알레르기나 자가면역 질환은 CD4 양성 T 림프구의 과잉 면역 반응에 의해 야기되며, 난치성 알레르기나 자가면역 질환의 치료에는 스테로이드나 면역억제제가 이용된다. 갈렉틴 9가 이러한 반응에 관여한다는 것은 분명하므로, 갈렉틴 9 유도 인자가 면역 억제 작용, 항염증 작용, 항알레르기 활성을 나타낼 것으로 기대할 수 있으며, 항종양제, 항알레르기제, 면역억제제, 자가면역질환용 제제, 항염증제 및 부신피질 스테로이드 호르몬 대체제로서 이용 가능하다.

본 발명의 활성 성분[예를 들어, 갈렉틴 9 유도 인자, 이것을 함유하는 액체 등]을 의약으로서 이용하는 경우, 통상 단독 또는 약리적으로 허용되는 각종 제제 보조제와 혼합하여, 의약 조성물 또는 의약 조제물 등으로서 투여할 수 있다. 바람직하게는, 경구 투여, 국소 투여, 또는 비경구 투여 등의 사용에 적절한 제제 조제물의 형태로 투여되며, 목적에 따라 어느 투여 형태(흡입법, 또는 직장 투여도 포함됨)에 의하여도 된다.

또, 본 발명의 활성 성분은 각종 의약, 예를 들어 항종양제(항암제), 종양 전 이 저해제, 혈전 형성 저해제, 관절 파괴 치료제, 진통제, 소염제 및/또는 면역 억제제와 배합하여 사용할 수도 있으며, 상기 제제는, 유리한 기능을 갖는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있어, 예를 들어 당 분야에 공지된 것 중에서 선택할 수 있다.

그리고, 비경구적인 투여 형태로서는, 국소, 경피, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 또는 복강내 투여를 포함할 수 있는데, 환부에의 직접 투여도 가능하고, 또 어떤 경우에는 매우 적합하기도 하다. 바람직하게는 인간을 포함한 포유동물에 경구적으로, 또는 비경구적(예, 세포내, 조직내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 복강내, 흉강내, 척수강내, 점적법, 주장(注腸), 경직장, 점이, 점안이나 점비, 치아, 피부나 점막에의 도포 등)으로 투여할 수 있다. 구체적인 제제 조제물의 형태로서는, 용액 제제, 분산 제제, 반고형 제제, 분립체 제제, 성형 제제, 침출 제제 등을 들 수 있으며, 예를 들어, 정제, 피복 정제, 당의제, 환약, 트로키제, 경캡슐제, 연캡슐제, 마이크로캡슐제, 매입제, 분말제, 산제, 과립제, 세립제, 주사제, 액제, 에릭시르제, 에멀션제, 관주제, 시럽제, 수제, 유제, 현탁제, 리니먼트제, 로션제, 에어졸제, 스프레이제, 흡입제, 분무제, 연고 제제, 경고 제제, 점부제, 페이스트제, 습포제, 크림제, 유제, 좌제(예를 들어, 직장좌제), 팅크제, 피부용 수제, 점안제, 점비제, 점이제, 도포제, 수액제, 주사용 액제 등을 위한 분말제, 동결 건조 제제, 겔 조제품 등을 들 수 있다.

의약용의 조성물은 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있다. 예를 들어, 적절하게 필요에 따라서, 생리학적으로 허용되는 담체, 의약으로서 허용되는 담체, 보조제(adjuvant), 부형제, 보형제, 희석제, 향미제, 향료, 감미제, 비히클, 방부제, 안정화제, 결합제, pH 조절제, 완충제, 계면활성제, 기제, 용제, 충전제, 증량제, 용해보조제, 가용화제, 등장화제, 유화제, 현탁화제, 분산제, 증점제, 겔화제, 경화제, 흡수제, 점착제, 탄성제, 가소제, 붕괴제, 분사제, 보존제, 항산화제, 차광제, 보습제, 완화제, 대전방지제, 무통화제 등을 단독 또는 조합하여 이용하여, 그것과 함께 본 발명의 단백질 등을 혼화함으로써, 일반적으로 승인된 제제 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 하여 제조할 수 있다.

비경구적 사용에 적절한 제제로서는, 활성 성분과 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 매체와의 무균성 용액 또는 현탁액제 등, 예를 들어 주사제 등을 들 수 있다. 일반적으로는, 물, 식염수, 덱스트로스 수용액, 그 외에 관련된 당의 용액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 글리콜류를 바람직한 주사제용 액체 담체로서 들 수 있다. 주사제를 조제할 때는 증류수, 링거액, 생리 식염액과 같은 담체, 적당한 분산화제 또는 습화제 및 현탁화제 등을 사용하여, 당 분야에 공지된 방법으로 용액, 현탁액, 에멀션과 같은 주사할 수 있는 형태로 조제한다.

주사용의 수성액으로서는, 예를 들어 생리 식염액, 포도당이나 그 밖의 보조약(예를 들어, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등)을 포함한 등장용액 등을 들 수 있으며, 약리적으로 허용되는 적당한 용해 보조제, 예를 들어 알코올(예를 들어 에탄올 등), 폴리알코올(예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제(예를 들어 폴리솔베이트 80^TM, HCO-50 등) 등과 병용하여도 좋다. 유성액으로서는 참기름, 콩기름 등을 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질알코올 등과 병용하여도 좋다. 또, 완충제(예를 들어, 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액 등) 또는 침투압 조절을 위한 시약, 무통화제(예를 들어, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제(예를 들어, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제(예를 들어, 벤질알코올, 페놀 등), 아스코르브산 등의 산화방지제, 흡수촉진제 등과 배합하여도 된다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전된다.

비경구 투여에는, 계면활성제 및 그 밖의 약학적으로 허용되는 조제를 가하거나, 또는 가하지 않고, 물, 에탄올 또는 기름과 같은 무균의 약학적으로 허용되는 액체 중의 용액 또는 현탁액의 형태로 제제화된다. 제제에 사용되는 유성 비히클 또는 용제로서는, 천연 또는 합성 또는 반합성인 것 또는 디글리세리드류 또는 트리글리세리드류, 천연, 반합성 또는 합성의 유지류 또는 지방산류를 들 수 있으며, 예를 들어 땅콩유, 옥수수유, 콩기름, 참기름 등의 식물유를 들 수 있다. 예를 들어, 이 주사제는, 통상 본 발명 화합물을 0.1∼10 중량% 정도 함유하도록 조제될 수 있다.

국소적, 예를 들어 구강, 또는 직장용에 적절한 제제로서는, 예를 들어 세구제, 치약제, 구강 분무제, 흡입제, 연고제, 치과 충전제, 치과 코팅제, 치과 페이스트제, 좌제 등을 들 수 있다. 세구제, 그 밖의 치과용제로서는, 약리적으로 허용되는 담체를 이용하여 통상의 방법에 의해 조제된다. 구강 분무제, 흡입제로서는, 본 발명 화합물 자체 또는 약리적으로 허용되는 불활성 담체와 함께 분무 또는 연무용의 용액에 용해시키거나, 또는 흡입용 미분말로서 치아 등에 투여할 수 있다. 연고제는, 통상 사용되는 기제, 예를 들어 연고 기제(백색 바셀린, 파라핀, 올리브유, 매크로골 400, 매크로골 연고 등) 등을 첨가하여 통상의 방법에 의해 조제된다.

치아, 피부에의 국소 도포용의 약품은, 적절하게 살균한 물 또는 비수(非水)부형제의 용액 또는 현탁액으로 조제할 수 있다. 첨가제로서는, 예를 들어 아황산수소나트륨 또는 에데트산이나트륨과 같은 완충제; 초산 또는 초산페닐수은, 염화벤잘코늄 또는 클로로헥시딘과 같은 살균 및 항진균류제를 포함한 방부제 및 히프로멜로스와 같은 농후제를 들 수 있다.

좌제는, 당 분야에 있어서 주지된 담체, 바람직하게는 비자극성의 적당한 보형제, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜류, 라놀린, 카카오지, 지방산트리글리세라이드 등의, 바람직하게는 상온에서는 고체이지만 장관(腸管)의 온도에서는 액체로 직장 내에서 융해하여 약물을 방출하는 것 등을 사용하여 통상의 방법에 의해 조제되는데, 통상 본 발명 화합물을 0.1∼95 중량% 정도 함유하도록 조제된다. 사용하는 부형제 및 농도에 따라 약품은 부형제에 현탁시키거나 또는 용해시킬 수 있다. 국부 마취제, 방부제 및 완충제와 같은 보조약은 부형제에 용해 가능하다.

경구적 사용에 적절한 제제로서는, 예를 들어 정제, 환약, 캡슐제, 분말제, 과립제, 트로키와 같은 고형 조성물이나, 액제, 시럽제, 현탁제와 같은 액상 조성물 등을 들 수 있다. 제제 조제 시에, 당 분야에 공지된 제제 보조제 등을 이용한다. 정제 및 환약은 또한 장용피 코팅하여 제조할 수도 있다. 조제 단위 형태가 캡슐인 경우에는, 상기 타입의 재료에 또한 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다.

또, 활성 성분이 단백질이나 폴리펩티드인 경우, 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 포유동물 중에서 극히 독성이 낮으므로, 그것을 결합시키는 것은 특히 유용하다. 또, PEG를 결합하게 하면, 이종성 화합물의 면역원성 및 항원성을 효과적으로 감소시킬 수 있는 경우가 있다. 이 화합물은, 마이크로 캡슐 장치 안에 넣어 부여하여도 좋다. PEG와 같은 폴리머는 아미노 말단의 아미노산의 α-아미노기, 리신 측쇄의 ε-아미노기, 아스파라긴산 또는 글루타민산 측쇄의 카르복실기, 카르복시 말단의 아미노산의 α-카르복실기, 또는 어떤 종류의 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기에 부착한 글리코실 사슬의 활성화된 유도체에 간편하게 부착시킬 수 있다.

단백질과의 직접적인 반응에 적절한 많은 활성화된 형태의 PEG가 알려져 있다. 단백질의 아미노기와 반응시키는 데 유용한 PEG 시약으로서는, 카르본산, 카르보네이트 유도체의 활성 에스테르, 특히, 이탈기가 N-히드록시숙신이미드, p-니트로페놀, 이미다졸, 또는 1-히드록시-2-니트로벤젠-4-술포네이트인 것을 들 수 있다. 마찬가지로, 아미노히드라진 또는 히드라지드 기를 함유하는 PEG 시약은 단백질 중의 과옥소산 산화에 의해 생성된 알데히드와의 반응에 유용하다.

본 발명의 활성 성분은 그 투여량을 넓은 범위에 걸쳐 선택하여 투여할 수 있지만, 그 투여량 및 투여 횟수 등은 처치 환자의 성별, 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 식사, 투여 시간, 투여 방법, 배설 속도, 약물의 조합, 환자의 그 때에 치료를 하고 있는 질환의 상태의 정도에 따라, 이들 또는 이 밖의 요인을 고려해서 결정할 수 있다.

의약품을 제조함에 있어는, 그 첨가제 등이나 조제법 등은, 예를 들어 일본약방 해설서 편집위원회 편, 제14 개정 일본약방해설서, 2001년 6월 27일 발행, 주식회사 히로가와쇼텡; 이치방가세히로시 외 편, 의약품의 개발 12권(제제소제[I]), 1990년 10월 15일 발행, 주식회사 히로가와쇼텡; 동, 의약품의 개발 12권(제제 소재[II]) 1990년 10월 28일 발행, 주식회사 히로가와쇼텡 등의 기재를 참고로 하여 이들 중에서 필요에 따라 적절히 선택하여 적용할 수 있다.

본 발명의 활성 성분은, 본 명세서에서 설명하고 있는, (a) 갈렉틴 9 생산 및 유리의 유도를 통해, 갈렉틴 9가 담당하는 생물 활성을 제어하고, 예를 들어 인간 갈렉틴 9가 정상 세포에는 상해 활성을 보이지 않고 종양 세포에 대해서 세포 상해 활성을 보인다고 하는 성상, 종양 세포에 대해서 아폽토시스를 유도하지만 정상 세포에는 아폽토시스를 유도하지 않는다고 하는 성상, 악성 세포의 전이성을 억제한다고 하는 성상, 활성화된 면역 세포, 특히 활성화된 CD4 양성 T 세포의 아폽토시스를 유도하는 활성(이에 반해 휴지 T 세포, 특히 CD4 양성 휴지 T 세포(헬퍼 T 세포)의 아폽토시스 유도는 그것을 유도하지 않는다고 하는 성상) 등을 이용함에 있어서 유용하며, 항종양제, 항알레르기제, 면역억제제, 자가면역질환용 제제, 항염증제, 부신피질 스테로이드 호르몬과 같은 활성을 이용하는 약제로서 유망하다.

본 명세서에 있어서, 자연 킬러 세포의 세포 상해성 측정을 실시할 수 있다. 활성 물질의 자극에 의한 자연 킬러(NK) 세포의 세포 상해성의 측정법은, 당 분야에 공지된 방법 중에서 선택하여 적용할 수 있으며, 시판되는 분석 키트를 이용해 실시할 수 있다. 시판되는 분석 키트로서는, 예를 들어 LDH Cytotoxicity Detection Kit(TaKaRa) 등을 들 수 있다. 대표적인 세포 상해성의 측정법은, 세포로부터 방출되는 젖산 탈수소 효소(LDH)를 측정함으로써 세포 상해를 측정하는 것으로, 이 LDH는 통상은 세포막을 통과하지 않지만, 세포막이 상해를 받으면 세포 외, 즉 배지 속으로 방출된다. 거기에 방출된 LDH를 그 젖산을 탈수분해하여 피루브산과 NADH를 생성하는 활성에 기초하여 분석하는 것이다. 이 생성 NADH는 디아포라아제의 촉매로 테트라졸륨염을 환원하여, 490 nm의 흡수를 갖는 적색의 포마잔(formazan) 색소를 형성하기 때문에, 490 nm의 흡광도량의 증대로 LDH 활성을 측정할 수 있다. 이 기법에서는, 사세포 또는 세포막에 상해를 받은 세포의 수는, 배양 상청 중의 LDH 효소 활성의 증가로서 나타나므로, 이로써 세포 상해 활성이 측정된다.

다른 분석법에서는, 단핵 백혈구(mononuclear leukocyte; MNL)를 취득하고, 이 세포(3×10⁶개/mL)를 활성 물질(예를 들어, BALL-mf, IL-2 등)에 의해 자극하거나 대조군으로 무자극하여(예를 들어, PBS에 의한 처리), 적절한 배지(예를 들어, 항균·항진균류성 용액(antibiotic antimycotic solution; Sigma chemicals, St. Louis, MO, USA)을 첨가한 10% FCS 함유 RPMI 1640 배지 등) 중에서 배양한다. 배양한 후 그 세포를 표적 세포에 대한 이펙터(effector) 세포로서 사용한다. 한편, 표적 세포 K562는 Na₂ ⁵¹ CrO₄(Daiichi Radioisotope Laboratories, 도쿄; 비활성, 1 mCi/mL)로 처리하여 표지한다(50 μCi/10⁶개 세포). 그 세포를 2회 세정한 후, 또한 37℃에서 30분간 배양한다. 세포는 세정한 후에 1×10⁵개/mL가 되도록 재현탁된다. 그 표지된 세포를 96웰의 둥근 바닥 미량적정 플레이트의 각 웰에 넣어(1×10⁴개 세포/웰, 3 세트), 이펙터 세포:표적 세포비(E:T비) 10∼40로 이펙터 세포와 함께 항온처리한다. 자연 발생하는 Cr 방출을 모니터하기 위해서 배지에서만 항온처리한 표적 세포를 사용하고, 최대의 Cr 방출을 모니터하기 위해서 1 N HCl을 첨가하여 항온처리한 표적 세포를 사용한다.

플레이트는, 37℃에서 4 시간 항온처리되고, 350 g로 6분간 원심분리 처리되어 상청액(100 μL)을 얻고, 감마 카운터(Aloka, 도쿄)를 사용하여 상청액의 방사 활성을 측정한다.

세포의 용해율(%)을 다음 식에 의해 계산한다:

(실험으로 얻어진 방출량 - 자연 발생하는 방출량)

----------------------------------------------- × 100

(최대 방출량 - 자연 발생하는 방출량)

평균치 ±SE로 세포 독성을 나타내고, 통계적 유의성은 Student's 테스트를 사용하여 평가할 수 있다.

명세서 및 도면에 있어서 용어는, IUPAC-IUB 위원회 생화학 명명법에 준한 용어, 또는 당 분야에 있어서 관용적으로 사용되는 용어의 의미에 근거하는 것이다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이 실시예는 단지 본 발명의 설명을 위해 그 구체적인 형태를 참고하기 위한 것이다. 이러한 예시는 본 발명의 특정한 구체적인 형태를 설명하기 위한 것이지만, 본원에서 개시하는 발명의 범위를 한정하거나 또는 제한하는 것은 아니다. 본 발명에서는, 본 명세서의 사상에 근거한 다양한 실시 형태가 가능하다는 것이 이해되어야 한다.

모든 실시예는 이 밖에 상세하게 기재하는 것 이외에는 표준적인 기술을 이용하여 실시한 것 또는 실시할 수 있는 것으로, 이것은 당업자에게 있어서 주지이며 관용적인 것이다.

한편, 이하의 실시예에 있어서, 특별히 지적하지 않는 경우에는, 구체적인 조작 및 처리 조건 등은, DNA 클로닝에서는 문헌[J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989) 및 D.M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995)]; PCR법을 사용하는 경우에는 문헌[H.A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989; D.M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995) 및 M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols", Academic Press, New York(1990)]에 기재한 방법으로 준하여 실시하였고, 또 시판되는 시약 또는 키트를 이용하고 있는 경우는 그들에 첨부된 지시서(프로토콜) 또는 첨부된 약품 등을 사용하고 있다.

실시예 1

[종양 세포막 가용화]

종양 세포로서 B 세포 림프종 유래 세포주, BALL-1 세포 및 Daudi 세포를 사용하여 그 세포막 가용화 분획을 조제하였다. 가용화 처리는 문헌[Hirashima, M. et al., Immunol. Letters, 36: 273-281(1993) 및 Seki, M. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 114:2-5(1997)]에 기재된 방법에 변경을 더한 방법으로 실시하였다. 10% FCS 함유의 RPMI 1640 배지 속에서 배양된 BALL-1 세포를 출발 원료로 하였다. 수거된 BALL-1 세포를 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)-PBS로 재부유하였다(1×10⁹ 세포/5 mL). 액체 질소와 실온수를 사용하여, 동결·융해 처리를 4회 하였다(동결·융해×4회). 이어서 초음파 처리(Output=4, duty Cycle% = 50, 빙상, 4분간(실질 2분간 정도))를 하였다. 초음파 처리는 2분간 실시한 후 중지하고, 또 2분간 실시하는 방식으로 조작을 하였다. 얻어진 파쇄물은 원심분리하였다. 원 심분리 처리는 100,000 G, 1 시간, 4℃의 조건으로 실시하였다.

원심분리 처리하여 얻어진 펠릿을, 상기 BALL-1 세포를 1 mM PMSF-PBS로 재부유했을 때와 동량인 50 mM Tris-HCl(pH 8.2), 1 mM EDTA 및 1% CHAPS로 구성되는 액에 재부유하여 균질화 처리하였다. 균질화 처리는, 10 mL 또는 20 mL의 테플론(등록상표)·유리 균질화기(homogenizer)를 사용하여, 빙상에서 펠릿이 완전히 없어질 때까지 수분간 실시하였다. 얻어진 생성물은 원심분리하였다. 원심분리 처리는 20,000 G(15,000 rpm), 30분간, 4℃의 조건으로 실시하였다.

상청액(Sup(MF))을 회수하였다. 흡광도(Optical Density: OD)를 측정하였다. 블랭크에는, 50 mM Tris-HCl(pH 8.2), 1 mM EDTA 및 1% CHAPS로 구성되는 액을 이용하였다. 얻어진 상청액을 PBS에 대하여 철저히 투석시키고, 이어서 세공 직경 0.2 μmL의 필터에 통과시켜, 종양 세포막 가용화 분획(mf)을 얻는다. 그것을 사용까지 -80℃에서 보존하였다. 또한, 20% FCS 함유의 RPMI1640 배지 속에서 배양된 Daudi 세포(2×10⁸개/mL)에 대해서도 같은 식으로 처리하여 mf를 얻고, 이것을 사용까지 -80℃에서 보존하였다.

[종양 세포의 조제]

표적 종양 세포로서 Meth-A 육종을 사용하였다. Meth-A 육종 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 0.25 μg/mL 암포테리신 B를 함유하는 RPMI 1640 배지 속에서 유지되었다. 배양된 세포(1×10⁶개/100 μL PBS액)를 Balb/c 마우스의 등에 피하 접종하였다. 3 주간 후, 생육한 종 양을 잘라내어 2 cm의 크기로 절단하고, 1 mg/mL 콜라게나제(I형, Sigma C-0130; Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가한 10% FBS 함유 RPMI 1640 배지 중에 두었다. 혼합물을 자석 교반기로 일정하게 교반하면서 37℃에서 1.5 시간 균질화 처리하여, 면(綿) 거즈에 통과시킨 후, PBS로 2회 세정하고, 이어서 PBS로 재차 현탁하였다(2×10⁶ 개/mL; 생세포율, 약 90%).

[종양의 증식 및 거부]

Meth-A 세포(1×10⁵개/50 μL)를 BALB/c 마우스(7 주령 수컷, n=10/군)의 등에 피하 접종하였다. 접종한 후 즉시 100 ng/200 μL의 BALL-mf 또는 Daudi-mf를 그 동물의 상기 종양 세포 접종 부위 주위에 피하 주사하였다(100 μL/부위). 대조군으로서는 PBS를 사용하였다. 주사를 3일마다 반복하였다. 주 3회 그 동물의 체중 및 상기 종양의 크기(단축, a 및 장축, b)를 측정하였다. 종양의 용적(V)을 문헌[Attia et al., Cancer Res., 26: 1787-1800(1966)]에 기재한 방법에 따라서 다음 식: V(mm³)=0.4×a×b²에 의해 계산하여 구하였다.

[갈렉틴 9의 RT-PCR]

BALL-mf, Daudi-mf 또는 PBS로 처리된 세포로부터 TRIZOL 시약(Gibco, BRL)을 사용하여 전체 RNA를 단리하였다. Gene Amp RNA PCR 키트(Perkin Elmer)를 사용하여 0.5 μg의 전체 RNA를 1 단계의 역전사 처리를 하여 DNA를 조제하고, 이어서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해, 마우스 갈렉틴 9 또는 인간 갈렉틴 9 및 GAPDH의 전사 생성물을 증폭하였다. 역전사(RT) 반응 및 PCR는 키트 제조업자의 지시에 따라 실시하였다. 즉, 아머샴 파마시아 바이오테크를 통해 합성한 다음의 프라이머 서열:

인간 갈렉틴 9

센스 서열, hG9S: CGTCAATGGCTCTGTGCAGCTGTC [서열 번호 3]

안티센스 서열, hG9AS: AGATCCACACTGAGAAGCTCTGGC [서열 번호 4]

마우스 갈렉틴 9

센스 서열, mG9SQ1: GGTCAGAGTTCAAGGTGATGGTGA [서열 번호 5]

안티센스 서열, mG9SQ2: GCCTGATATCATGATGGACTTGGA [서열 번호 6]

를 사용하였다.

30회 PCR 사이클을 반복하여 모든 전사 생성물을 증폭하였다. 모든 반응은 GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer Applied Biosystems)에서 실시하였다. PCR 생성물은 UV로 가시화하도록 브롬화에티듐(1 μg/mL)을 함유하는 1.5% 아가로스 겔에 적용하였다. 각각의 PCR 생성물은 정제하였다. 갈렉틴 9 PCR 생성물의 서열분석은 ABI PRISM Big Terminator Dye Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin Elmer Applied Biosystems)를 사용하여 실시하였다.

각 반응에 있어서, 다음의 시약: 8 μL의 종결 반응 혼합물(Terminator Reaction Mix), 500 ng의 PCR 생성물, 3.2 pmol의 Gal-9용 프라이머 및 탈이온수를 튜브에 첨가하였다. DNA의 서열분석은 GeneAmp PCR System 2400 상에서 실시하였다.

저분자의 밴드인 곳의 PCR 생성물 및 고분자의 밴드인 곳의 PCR 생성물의 쌍 방으로부터 얻어진 서열이, 링커 펩티드 영역의 길이가 다른 갈렉틴 9의 서열에 대응하였다. 최종적으로는, NIH image 1.61 프로그램을 사용하여 밴드의 강도를 측정하였다.

[웨스턴 블로팅]

(1) 토끼 항-인간 재조합체 갈렉틴 9CT 혈청으로부터의 인간 재조합체 갈렉틴 9CT 특이 항체의 정제

인간 Gal-9의 C-말단측 도메인으로 면역화한 토끼로부터 정제 폴리클로날 항체(인간 Ga1-9에 대한 항체)를 얻었다. 그 항체는 Gal-9의 C-말단측 도메인 결합 세파로스를 사용하여 정제한 것으로, 이 항체는 또한 마우스 Gal-9를 인식하는 것으로 확인되었다.

1. 항혈청의 황산암모늄 분획(미정제 IgG 분획의 제조)

빙냉 하에 유리제 비이커에 항혈청(토끼 항인간 재조합체 갈렉틴 9CT 혈청, 100 mL)과 인산 완충 생리 식염액(이하, PBS, 100 mL)을 넣어, 이 액을 30 mm의 테플론(등록상표) 교반자를 사용하여 자석 교반기 상에서 교반하면서 포화 황산암모늄 용액(100 mL)을 매분 5 mL의 속도로 적하하였다. 포화 황산암모늄 용액을 전부 첨가한 후, 또 30분간 교반을 계속하였다. 얻어진 액을 원심관에 옮겨, 13,000 rpm(RPR-16 로터, 17,000 x G, 고속원심기, 히타치고키(주))로 30분간(4℃; 이하 특별히 지정하지 않는 경우, 원심 조작은 4℃에서 실시함) 원심분리하였다. 상청액은 버리고, 침전물에 100 mL의 PBS(빙냉; 이하 특별히 지정하지 않는 경우 빙냉 PBS를 사용함)를 가하여 용해하였다. 얻어진 액을 20 mm의 테플론(등록상표) 교반 자를 넣은 비이커로 옮겼다. 상기와 같은 조작으로, 빙냉하 포화 황산암모늄 용액(67 mL)을 적하하여, 30분간 더 교반하였다. 얻어진 액을 원심관으로 옮겨, 13,000 rpm(RPR-16 로터, 고속원심기, 히타치고키(주))로 30분간 원심분리하였다. 상청액은 버리고, 침전물은 PBS(50 mL)에 용해하였다. 액을 투석 튜브(다이알리시스 멤브레인 27, 와코쥰야쿠고교(주))에 넣어 PBS에 대하여 투석 처리하였다. 투석 후 투석 튜브 내의 액을 원심관으로 옮겨 13,000 rpm(RPR-16 로터)로 30분간 원심분리하였다. 상청액 10 mL당 0.05 mL의 10%(w/v) 아지드화나트륨을 가하여 플라스틱 병에 넣고, 4℃에서 보존하였다(미정제 IgG 분획).

2. 항원 컬럼을 이용한 친화성 정제

상기 단계 1에서 제작한 미정제 IgG 분획(50 mL)에 동량의 PBS(40 mmol/L 락토스 및 0.05%(w/v) 아지드화나트륨을 함유)를 가하여, 희석된 미정제 IgG 분획액을 만들었다. GST-재조합체 갈렉틴 9CT(10∼20 mg) 고정화 하이트랩 NHS-활성화 컬럼(5 ml, Amersham Biosciences사)을 페리스타(peristaltic) 펌프에 접속하여, 20 mL의 PBS(20 mmol/L 락토스 함유)로 컬럼을 세정함으로써 평형화하였다(유속: 매분 2 ml). 평형화한 컬럼에 희석된 미정제 IgG 분획액을 흘려보내(유속: 매분 1 ml), 컬럼으로부터 유출하는 최초의 5 mL는 버리고, 그 후의 유출액을 플라스틱 병에 모았다. 미정제 IgG 분획을 다 흘려보냈으면, 또한 5 mL의 PBS를 흘려보내 그 유출액도 동일한 플라스틱 병에 모았다. 플라스틱 내의 액을 재차 동일한 조건으로 컬럼에 흘려보내, 그 때의 유출액도 플라스틱 병에 모았다. 이어서, 컬럼을 50 mL의 PBS(20 mmol/L 락토스 함유)로 세정한다(유속: 매분 2 mL). 유출액의 최후의 2 mL 을 시험관에 모아, PBS(20 mmol/L 락오토스 함유)를 대조군으로 하여 280 nm의 흡광도를 측정한다. 흡광도가 0.02 이상인 경우에는, 또한 10 mL의 PBS(20 mmol/L 락토스 함유)로 세정한다. 유출액의 최후의 2 mL의 흡광도를 측정하고, 흡광도가 0.02 이하가 될 때까지 이 조작을 반복한다. 이어서, 컬럼에 30 mL의 0.2 mol/L 글리신-염산(pH 2.5)을 흘려보내(유속: 매분 1 mL), 유출액을 2 mL씩 분획한다. 각 분획의 280 nm의 흡광도를 측정하여, 흡광도 0.1 이상의 분획을 하나로 모은다. 1 mol/L 2-아미노-2-히드록시메틸 1,3-프로판디올(이하, 트리스)와 pH 미터를 이용하여, 이 용출 분획의 pH를 7∼7.5로 조절한다. 컬럼은, 40 mL의 PBS(0.05%(w/v) 아지드화나트륨 함유)로 평형화하여(유속: 매분 2 mL) 4℃에서 보존하였다. 용출 분획을 투석 튜브(다이알리시스 멤브레인 20, 와코쥰야쿠고교(주))에 넣어, PBS에 대하여 투석 처리하였다(4℃). 투석 튜브 내의 액을 원심관으로 옮겨, 13,000 rpm(RPR-18 로터, 17,000 x G, 고속원심기, 히타치고키(주)))로 30분간 원심분리하였다. 상청 10 mL당 0.1 mL의 10%(w/v) 아지드화나트륨을 가하고, 플라스틱 병에 넣어 4℃에서 보존하였다(친화성 정제 항-9CT 항체).

3. 친화성 정제 항-재조합체 갈렉틴 9CT 항체로부터의 재조합체 갈렉틴 7 교차 항체의 제거

GST-재조합체 갈렉틴 7(5-10 mg) 고정화 하이트랩 NHS-활성화 컬럼(5 mL, Amersham Biosciences사)를 페리스타 펌프에 접속하여, 20 mL의 PBS로 세정하였다(유속: 매분 2 mL). GST-재조합체 갈렉틴-7 고정화 컬럼 컬럼에 상기 단계 2에서 얻어진 친화성 정제 항-재조합체 갈렉틴 9CT 항체를 흘려보내(유속: 매분 0.5 mL), 컬럼으로부터 유출하는 최초의 4 mL을 버리고 그 후의 액을 플라스틱 병에 모았다. 친화성 정제 항-재조합체 갈렉틴 9CT 항체를 다 흘려보냈으면, 또한 5 mL의 PBS를 흘려보내 그 유출액도 동일한 플라스틱 병에 모았다. 플라스틱 병에 모은 유출액을, 재차 동일한 조건으로 컬럼에 흘려보내 동일한 방식으로 유출액을 모은다. 280 nm의 흡광도를 측정하여, 4℃에서 보존하였다(최종 정제 항-재조합체 갈렉틴 9CT 항체 표품). 이 컬럼에 0.2 mol/L 글리신-염산(pH 2.5)을 흘려보내(유속: 매분 1 mL), 흡착한 갈렉틴-7 교차 항체를 용출하여 얻을 수 있다.

(2) 면역염색

세포 펠릿에 용해 완충액(10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 21 mM EDTA, 2 mM EGTA, 그리고 새롭게 첨가한 0.51 mM PMSF, 10 μg/mL의 루펩틴, 안티페인, 펩스타틴 A 및 1 mM DTT)를 가하고 나서 초음파 처리하여 세포 용해물을 조제하였다.

그 후 세포 용해물에 SDS를 가하여, 샘플 혼합물을 100℃에서 5분간 가열 처리한 후 얼음 위에 두었다. 각 샘플은 12% 아크릴아미드-SDS 겔에서 전기영동하여, 분리된 단백질을 PVDF 막(BioRad Laboratories)에 전사시켰다. 비특이적 결합을 0.1% Tween-20 함유 PBS액(PBS-T) 중의 5% 탈지유를 사용하여 차단하였다. 이 PVDF 막을 PBS-T로 수회 세정한 후, PBS-T로 희석한 10 μg/mL의 정제 항-재조합체 갈렉틴 9CT 항체와 함께 1 시간 항온처리하였다. 이어서 PVDF 막을 세정한 후, 퍼옥시다제 결합 염소 항-토끼 IgG(Amersham Pharmacia Biotech)를 함유하는 PBS-T와 함께 45 분간 항온처리하였다. ELC 키트(Amersham Pharmacia Biotech) 속의 ECL-HRP 기질액에 상기 PVDF 막을 침지하여, XJB-1 X선 필름(Kodak)에 맞추어 노광시켜 밴 드를 가시화시켰다.

[유세포 계측법 해석]

세포 표면에 결합한 갈렉틴 9의 발현을 조사하기 위해서, 원심분리하여 세포를 모으고, 0.05% NaN₃ 및 2% 송아지 태아 혈청(FCS)을 함유하는 PBS(PBS+)로 세정하여 25 μg/mL의 토끼 항-인간 Gal-9 항체의 존재 하에 얼음 위에서 30분간 항온처리하였다. 세포를 PBS+로 수회 세정한 후, FITC 결합 염소 항-토끼 IgG 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 30분간 얼음 위에서 항온처리하였다.

갈렉틴 9의 세포 내에서의 발현을 조사는, 문헌[Jacob, M.C. et al., Cytometry, 12: 550-558(1991) 및 Sumner, H. et al., J. Immunol. Methods, 136: 259-267(1991)]에 기재한 방법을 약간 변경하여 실시하였다.

즉, 세포를 빙냉 4% 파라포름알데히드 함유의 PBS로 10분간 고정화 처리하였다. 세포를 PBS+로 세정한 후, 사포닌 완충액(0.1% 사포닌 및 0.01 M HEPES 완충액을 함유하는 PBS, pH 7.4) 중의 25 μg/mL의 토끼 항-인간 Gal-9 항체를 첨가한 후, 그 세포를 실온에서 30분간 항온처리하고, 이어서 얼음 위에서 30분간 FITC 결합 염소 항토끼 IgG 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 항온처리하였다.

SYSTEM II^TM Software Version 1.0을 사용하는 COULTER EPICS XL-MCL 유세포 계측법으로 스캐터 게이지(15000 events)로 규정한 세포 전부의 갈렉틴 9 염색에 관하여 분석하였다. 유세포 계측법의 최적 배치 및 유동계를 확인하기 위해서는, Flow-check^TM 형광 입자(fluorospheres; COULTER Corporation)를 이용하였다.

[조직 병리 해석]

종양 세포의 접종 27일 후에 종양을 잘라내어, 그 중량을 측정하였다. 10% 중성으로 완충된 포름알데히드 용액으로 조직 병리 검사용 샘플을 고정화한 후, 파라핀 포매 조직을 4 μm 두께의 절편으로 절단하여, 탈파라핀 처리, 재수화화(再水和化) 처리, 그리고 헤마톡실린과 에오신 또는 김사 시약(Giemsa's reagent)으로 염색하였다.

[인시추 하이브리드화]

BALL-mf를 주사한 부위에 축적한 세포가 갈렉틴 9 mRNA를 함유하고 있는지의 여부를 조사하기 위해서 인시추 하이브리드화를 실시하였다.

DIG RNA 라벨링 키트(SP6/T7; Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, 독일)를 사용하여 시험관내 전사법에 의해 디곡시제닌으로 라벨된 RNA 프로브를 합성하였다. PCR로 증폭된 갈렉틴 9의 cDNA 단편(뉴클레오티드 서열의 제500∼1208번의 염기; Matsumoto, R. et al., J. Biol. Chem., 273: 16976-13984(1998))을, pGEM-T Easy Vector(Promege, Madison, WI, 미국)에 넣어 클로닝하고, 선형으로 된 플라스미드 DNA를 시험관내 전사를 주형 DNA로서 사용하였다. 센스 프로브 및 안티센스 프로브를 합성하여, 음성 대조군으로서 센스 프로브를 사용하였다. 하이브리드화 프로토콜은 4 μm의 파라핀 절편에 적용되어, 시약 제조업자의 프로토콜에 따라 실시하였다. 37℃에서 2 시간 프로테이나제 K로 분해 처리한 후, 하이브리드화는 20 μL의 하이브리드화액 중의 1 μg/mL의 프로브와 함께 43℃에서 하룻밤 커버슬립 하에 실시하였다. 엄격한 조건 하에 세정한 후, 디곡시제닌 검출 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 디곡시제닌 라벨을 가시화하였다. 대조군으로서는, 상기 센스 프로브를 사용한 경우 및 프로브를 제외한 경우를 사용하였다.

[결과]

[종양의 증식 곡선 및 종양의 거부 비율]

Balb/c 마우스에게 Meth-A 육종을 접종한 후, 종양의 증식이 미치는 BALL-mf, Daudi-mf 및 PBS의 효과를 조사한 결과, 모든 군에서 종양 세포는 최초의 2 주간 같은 식으로 증식하였다(도 1(a)). Daudi-mf 처치군 및 PBS 처치군의 마우스의 쌍방에 있어서는, 그 후에도 종양 세포는 증식을 계속하여, 이 2개 군의 마우스 중에는 종양의 크기에 있어서는 현저한 차이는 없었다(도 1(a)).

한편, BALL-mf 처치군의 마우스에서는, 2 주간 후에는 종양의 크기는 감소로 바뀌기 시작하여, 18일 후에는 Daudi-mf 처치군 및 PBS 처치군의 마우스의 경우보다도 현저히 종양의 크기는 작아졌다(도 1(a)). 그런데, 실험 기간 중에 이들 3 군의 마우스 사이에서는 그 체중에 각별한 차이는 없었다. 10 마리의 마우스 중 1 마리에서는 처음으로 BALL-mf 처치후 제20 일째에 종양이 거부되고 있음이 관찰되고, 그리고 제22 일째에는 또 3 마리의 마우스에서, 제25 일째에는 또한 4 마리의 마우스에서도 각각 관찰되었다. BALL-mf 처치된 마우스 10 마리 중 8 마리에서 종양은 제27 일째에는 완전히 거부되었지만, PBS 처치군의 마우스나 Daudi-mf 처치군의 마우스에서는 10 마리 중 조금 1 마리에서 거부되었을 뿐이었다.

이들 결과로부터, BALL-mf가 항종양 활성(도 1(b), 카이제곱(χ²) 해석, p= 0.0006)을 갖는 것으로 나타났다.

[조직병리학적 검사]

조직병리학적으로 조사하여, 종양 주위의 BALL-mf 주사 부위에 있어서의 세포의 반응을 해명하였다. 도 2(a)에 도시한 바와 같이, BALL-mf를 주사한 마우스에서는 그 주사한 부위에 주로 호산구(E → 또는 ← E) 및 단핵 세포로 이루어지며 소수의 호중구를 수반한 육아 조직을 볼 수 있었다. Daudi-mf로 처리된 마우스에서도 육아 조직이 보였지만, 침윤 세포는 주로 단핵 세포이며, 호산구가 아니었다(도 2(b)). BALL-mf를 주사한 부위의 피근층의 위나 아래의 결합 조직에는 많은 비만 세포가 관찰되었는데, Daudi-mf를 주사한 부위의 피근층 위의 결합 조직에서는 단지 약간의 비만 세포가 있었을 뿐이었다.

또한, 종양 주위 조직의 조직병리학적 검사를 실시하였다. 도 3(a)에 도시한 바와 같이, BALL-mf로 처리된 마우스에서는 종양의 주위에 또는 종양 조직에 염증 세포[주로 호산구(E → 또는 ← E)와 약간의 비만 세포(M → 또는 ← M)로서, 호중구가 아님]의 침윤을 갖고 있는 영역이 관찰되었다(도 3(a)). 핵농축(←)을 보이는 종양 세포도 관찰되었다(도 3(a)). 도 3(b)에 도시한 바와 같이, 종양의 주위 또는 종양 조직에 이염성을 보이는 비만 세포의 집적이 확인되었다. 비교해 보면, Daudi-mf로 처리된 마우스의 종양 주위의 조직에서는 현저한 세포내 침윤이 보였지만(도 3(c)), 놀랍게도, 무수한 호중구(N →) 및 단핵 세포가 종양 조직의 주위에 관찰되었다. 이 부위에는 소수의 호산구 및 비만 세포가 검출되어, 핵농축을 보이는 종양 세포를 발견할 수는 없었다(도 3(c)).

[인시추 하이브리드화]

주사 부위에서 갈렉틴 9를 발현하고 있는 세포의 종류를 결정하기 위해서 인시추 하이브리드화를 실시하였다. 그 결과, 피하의 근판(panniculus carnosus muscle) 하에 호산구의 침윤이 보이고, 그 부위에서는 주로 비만 세포, 그 밖의 선유아세포, 림프구, 호산구가 갈렉틴 9를 생산하고 있음을 알 수 있었다(도 6(a)). 정상에서는 통상 근판의 주변에서는 비만 세포는 보이지 않지만, BALL-mf 주사에 의해 근판부에 갈렉틴 9를 갖는 비만 세포의 침윤이 보였다(도 6(b)). 도 6(a)에 도시한 바와 같이, BALL-mf를 주사한 부위에 Gal-9 mRNA를 발현하고 있는 세포를 발견하였다. 그 Gal-9 mRNA를 강하게 발현하고 있는 세포는, 형태학적 및 김사 염색에서는 비만 세포인 것처럼 보인다(도 6(a) 및 도 6(b)). 이 부위의 단핵 세포, 호산구, 선유아세포 등도 Gal-9 mRNA를 발현하고 있었지만, 비만 세포와 비교하면 훨씬 낮은 레벨이었다(도 6(a)). 한편, Daudi-mf를 주사한 부위에서는 양성의 세포는 거의 볼 수 없었다(도 6(c)).

Meth-A 육종 담암 마우스를 BALL-mf로 생체내 처치하면 종양의 배제를 볼 수 있으며, 그 종양 배제는 아마 자연 킬러(NK) 세포의 활성화나 갈렉틴 9의 생산·유리 증강에 의한 것이다. 또한, 종양의 주위 조직에 호산구 증가가 발생하고 있다. 약성 종양의 예후와 종양의 지지 조직 중에 침윤하는 세포의 종류 사이에는 상관성이 있다는 것은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 종양 주위에 림프구 침윤이 있는 환자에게서는 양호한 예후이다. 이것은 림포카인 생산 및/또는 NK 세포의 활성화의 결과일지도 모른다.

종양의 지지 조직의 호산구 증가는 양호한 예후와 결부되어 있을지도 모르지만, 호중구가 증가하고 있는 조직 및/또는 말초혈 중의 호중구 : 림프구의 비율이 높으면, 예후가 좋지 않음에 상관되어 있는 듯하다. 이 설명의 하나로서는, 호산구는 호중구보다도 더 세포 독활성을 보이며, 아마도 그것은 호산구 퍼옥시다제에 의존한 히드록시 라디칼의 생성에 의한 것일지도 모른다. 살종양성 호산구가 종양 세포에 접착하는 것이 단백질 키나제의 활성화와 관련성이 있음도 개시되어 있다.

BALL-mf로 처리된 마우스에서는 종양의 주위 조직에서 호중구가 아니라 호산구의 침윤이 발견되었다. 한편, Daudi-mf로 처리된 마우스에서는 주로 호중구의 침윤이 유도되었다(도 2(a) 및 도 2(b)).

BALL-mf로 유도된 조직의 호산구 증가는 BALL-mf에 의해 그 부위로 유도된 갈렉틴 9와 상관이 있는 것으로 생각된다. 지금까지 본 발명자들은 갈렉틴 9가 갈렉틴 패밀리에 속하는 것으로, 신규이며 또 강력한 호산구 주화성 인자임을 발견하였다.

호산구에 더하여, 비만 세포의 침윤이 종양 및 BALL-mf의 주사 부위의 주위 조직에서 유도되고 있다(도 2 및 도 6). 그런데, 비만 세포도 호산구와 마찬가지로 양호한 예후와 연결될지도 모른다는 것이 이미 제시되었다. 또한, 호산구는 IL-4에 의해 매개되는 항종양 활성에 관여할지도 모른다는 것이 이미 개시되었다. 본 발명자들은 지금까지 IL-4에 의한 단시간의 자극에 의해 PPD의 유도에 의한 갈렉틴 9의 생산이 증가되는데, 말초혈 단핵 세포로부터의 IL-5 생산이 억제되는 것을 보이고 있다. 비만 세포는, 염증 부위에 있어서의 주요한 IL-4원일 수 있으므로, 그 부위 의 비만 세포는 호산구의 집적에 관여하고 있을지도 모른다. 또한, 인시추 하이브리드화 결과에 기초하면 비만 세포는 BALL-mf 처치 부위에 있어서의 중요한 갈렉틴 9원인 것으로 볼 수 있다(도 6).

또한, 본 발명자들은 지금까지 인간의 말초혈 단핵 세포를 방사선 조사 처리 BALL-1 세포와 함께 배양하면, NK 활성[종양 세포주 K562(NK-감수성 세포) 및 그 밖의 종양 세포주(예를 들어, LAK-감수성 세포 Daudi, KMG-2(교아종 세포), KATOIII(위암) 등)의 양방에 대하여]이 증강되는 것으로 나타난다. 본 발명에서는, 갈렉틴 9에 의해 Meth-A에 대하여 세포 상해성과 NK형 활성(그 활성은 낮은 것이지만)을 증강시킨다는 것을 발견하였다. 종합하면, BALL-mf에 의해 활성화된 NK 세포는 그 밖의 종양 세포에도 유효하다는 것이 시사된다.

종양 접종한 후 2 주간에는 BALL-mf로 처리된 마우스, Daudi-mf로 처리된 마우스 및 PBS로 처리된 마우스 사이에서는 종양의 성장은 동일하였다(도 1(a)). 이로써, BALL-mf는 NK 활성이나 갈렉틴 9 생산의 원인이 되는 인자를 갖고 있음이 시사된다.

BALL-mf로 처리된 마우스와 Daudi-mf로 처리된 마우스 사이에서는 종양 세포의 외관은 다르다. BALL-mf로 처리된 마우스에서는 종양 주위의 섬유형의 조직에 매우 근접한 종양 세포의 몇 개에서 핵농축이 발견되었지만, 한편, Daudi-mf로 처리된 마우스에서는 핵농축을 보이는 세포는 보이지 않았다(도 3(a) 및 도 2(c)). 갈렉틴류가 아폽토시스에 중요한 역할을 하고 있다는 것은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 갈렉틴-1은 T 세포의 아폽토시스를 유도하는 것이 나타난 한편, 갈렉틴 3은 세포사를 방해하는 것으로 나타났다. 최근, 갈렉틴 7의 지나친 발현이, UVB로 유도되는 햇볕 그을림의 각질세포의 아폽토시스 과정에 관여할 수도 있는 것으로 나타났다. 갈렉틴 9에 대해서는, 마우스의 갈렉틴 9가 흉선 세포나 활성화 T 림프구의 아폽토시스를 유도한다는 것이 보고되어 있다.

BALL-mf로 종양 세포를 자극하더라도 갈렉틴 9의 발현이나 아폽토시스의 유도는 보이지 않았다. 갈렉틴 9 그 자체에서는, 종양 세포의 아폽토시스가 유도되었다. 이로부터 BALL-mf는 종양 세포에 직접 작용함으로써 항종양 효과를 보이는 것은 아니며, T 세포나 비만 세포에 있어서의 갈렉틴 9 발현이나 유리를 유도함으로써 항종양 효과를 보이는 것이 시사되었다.

시험관내의 조직 표본의 결과 및 PC에서의 면역염색의 결과를 종합하면, 비만 세포, 대식세포, 과립구(특히 호산구)가 갈렉틴 9 보유 세포인 것이 분명하며, 비만 세포주 MC9를 이용하여 실험을 수행하였다. 비만 세포주 MC9에 있어서의 갈렉틴 9 발현을 조사하였다. MC9 세포를 BALL-mf로 자극하면, 세포 표면 갈렉틴 9 발현은 24 시간에서는 약간 증강되었지만, 세포질 내 갈렉틴 9 발현의 증강은 보이지 않는다.

실시예 2

[갈렉틴 9 유도 인자의 정제]

실시예 1에서 얻어진 BALL-1 세포 유래 막 가용화 분획(BALL-1 mf)을 출발 물질로서 사용하여, 정제 처리를 하였다.

렌틸-렉틴 컬럼으로 비흡착 분획과 흡착 분획으로 나눈 바, 주로 흡착 분획 에 갈렉틴 9 유도 활성이 보였다. 또한, 항종양 실험에서는, 그 흡착 분획에 오리지널에 필적하는 항종양 활성이 확인되었다. 호산구나 비만 세포의 침윤도 오리지널과 같은 결과를 얻을 수 있었다.

렉틴 컬럼 흡착 분획을 Rotofor법으로 등전점 분획하여 얻어진 분획을 사용하여 자극한 말초혈 단핵구로부터 RNA를 채취하여, RT-PCR법으로 갈렉틴 9 발현에 대해서 검토하였다. RT-PCR법에서는, 상기 등전점 분획하여 얻어진 분화 F-1, F-2 및 F-4에 분명한 갈렉틴 9 발현의 증강이 확인되었다. 이들 등전점 분획하여 얻어진 분획의 항종양 활성에 대해 검토하였다. 그 결과, 분화 F-2와 F-3에 강한 항종양 활성이 유도되고 있는 것이 확인되었다. F-1 및 F-4에서는, PBS와 같거나, 반대로, 종양 세포의 증식을 항진시키고 있다. 분획 F-2와 F-3에 포함되는 유도 인자에 항종양 활성이 확인된다. 그 분획에서는, 조직 염색으로, 호산구나 비만 세포의 침윤이 확인되었다.

실시예 3

[BALL-1 세포의 가용화]

10% FCS 함유의 RPMI 1640 배지 속에서 배양된 BALL-1 세포를 출발 원료로 하였다. 수거된 BALL-1 세포를 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)-PBS로 재부유하였다(1×10⁹ 세포/5 mL). 액체 질소와 실온수를 사용하여, 동결·융해 처리를 4회 실시하였다(동결·융해×4회). 이어서 초음파 처리(output=4, duty cycle%=50, 빙상, 4분간(실질 2분간 정도))를 실시하였다. 초음파 처리는 2분간 실시한 후 정 지하고, 또 2분간 실시하는 방식으로 조작하였다. 얻어진 파쇄물은 원심분리하였다. 원심분리 처리는 100,000 G, 1시간, 4℃의 조건으로 실시하였다.

원심분리 처리하여 얻어진 펠릿을, 상기 BALL-1 세포를 1 mM PMSF-PBS로 재부유했을 때와 동량인 50 mM Tris-HCl(pH 8.2), 1 mM EDTA 및 1% CHAPS로 구성되는 액에 재부유하여 균질화 처리하였다. 균질화 처리는 10 mL 또는 20 mL의 테플론(등록상표)·유리 균질화기를 사용하여, 빙상에서 펠릿이 완전히 없어질 때까지 수분간 실시하였다. 얻어진 생성물은 원심분리하였다. 원심분리 처리는 20,000 G, 30분간, 4℃의 조건으로 실시하였다.

상청액(Sup(MF))을 회수하였다. 흡광도(Optical Density: OD)를 측정하였다. 블랭크에는 50 mM Tris-HCl(pH 8.2), 1 mM EDTA 및 1% CHAPS로 구성되는 액을 이용하였다.

[컬럼 크로마토그래피 정제]

(1) 상기에서 얻어진 MF를 콘카나발린 A(Con A)를 리간드로 한 담체를 사용한 컬럼 크로마토그래피에 적용하였다.

Con A 세파로스 비드와 MF를 (1:1)로 혼합하고, 4℃, O/N으로 회전시켜 항온처리하였다. MF의 농도가 높을 때는, PBS(-)로 2배로 희석하여 혼합하였다. 이어서, 이것을 컬럼에 적용하였다.

컬럼 조건:

폴리프렙(등록상표) 크로마토그래피 컬럼(BIO-RAD 731-1550)

컬럼 부피 1.6∼2 mL

낙하 = Elu: 22 G로 자연 낙하, Ft, 세정: 시린지 없이 자연 낙하

비드 = Con A 세파로스 비드(Pharmacia)

(비드 전처리: H₂O로 세정한 후, 1,000 rpm으로 1 분간, 4℃에서 원심한 후 평형화하였다)

평형화 완충액 = 1 mM CaCl₂, 0.1% CHAPS 함유의 TBS

(겔량의 10배 이상의 양을 흘려보냄)

WASH = 평형화 완충액

용출액 = Fr. 1∼2: 0.1 M 붕산 완충액(pH 6.5)(보레이트)

Fr. 3∼: 0.2 M 붕산, 0.15 M NaCl

보존 = 0.02% NaN₃ 함유 PBS, 4℃ 유지

용출된 분획을 회수하였다. WASH는 평형화 완충액을 적용 부피와 동일한 양을 흘려보냈다. 용출(Elution) 완충액을 적용하고 마개를 하여 20분간 실온으로 유지한다. 1 mL씩 5분 마다 튜브에 회수한다. OD(280 nm)를 측정한다.

(2) Con A 친화성 컬럼 크로마토그래피 처리 분획을 음이온 컬럼 크로마토그래피에 적용하였다.

상기에서 얻어진 BALL-1 Mf ConA-분획, 9 mL(0.1 M 보레이트-NaOH(pH 6.5)로 용출)를 음이온 컬럼 RESOURCE Q 컬럼(1 mL, 아마샴 바이오사이언스)의 크로마토그래피에 적용하였다.

완충액: A, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.03% CHAPS

B, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 M NaCl, 0.03% CHAPS

구배: %B = 0 → 100, 25 분 내로.

유속: 1 mL/min.

분획 용량: 1 mL

모니터: UV(A_{280 nm}) 0∼0.05

전도성, 0∼100 mS

샘플은 Strata Clean Resin(Stratagene, CA, USA)을 사용하여 농축하였다(×10). 농축한 샘플은 SDS-PAGE: 12% 겔, SYPRO Orange(Molecular Probes, Inc., USA)로 염색)에 적용하였다.

(3) RESOURCE Q 컬럼 크로마토그래피 처리 분획을 히드록시 아파타이트 컬럼 크로마토그래피에 적용하였다.

상기에서 얻어진 RESOURCE Q-분획(분획 번호: 14∼17)을 히드록시 아파타이트 컬럼 CHT2-I 컬럼(Bio-Rad)을 사용한 크로마토그래피에 적용하였다.

컬럼: CHT2-I(Bio-Rad), 2 mL

완충액: A, 10 mM Na-Pi(pH 6.8), 0.03% CHAPS, 0.05% NaN₃

B, 500 mM Na-Pi(pH 6.8), 0.03% CHAPS, 0.05% NaN₃

구배: %B = 0 → 80, 30분 이내.

유속: 1 mL/min.

분획 용량: 1 mL

모니터: UV(A_{280 nm}) 0∼0.02

전도성, 0∼50 mS

샘플은 Strata Clean Resin(Stratagene, CA, USA)을 사용하여 농축하였다(×40). 농축한 샘플은 SDS-PAGE : 12% 겔, SYPRO Orange(Molecular Probes, Inc., USA)로 염색)에 적용하였다.

(4) RESOURCE Q 컬럼 크로마토그래피 처리 분획 D를 히드록시 아파타이트 컬럼 크로마토그래피에 적용하였다.

상기한 RESOURCE Q 처리로 얻어진 분획 D를 히드록시 아파타이트 컬럼 CHT2-I 컬럼(Bio-Rad)을 사용한 크로마토그래피에 적용하였다.

컬럼: CHT2-I(Bio-Rad)

완충액: A, 10 mM Na-Pi(pH 6.8), 0.03% CHAPS

완충액: B, 500 mM Na-Pi(pH 6.8), 0.03% CHAPS

구배: %B 0 → 180, 30분 이내.

유속: 1 mL/min.

분획 용량: 1 mL

모니터: UV(A_{280 nm}) 0∼0.02

전도성, 0∼50 mS

[BALL-mf 크로마토그래피 정제 분획의 생물 활성]

세포 종양주 막 가용화 분획을 렌틸-렉틴 컬럼, 이어서 등전점 분획에 의해 정제함으로써, 항종양 활성을 갖는 4 분획이 갈렉틴 9 유도 인자 함유 분획 후보로서 좁혀졌다. 그러나, 회수되는 단백량이 적고, 다음 정제 단계로 진행하기 위해서는 많은 노동력과 시간이 필요하기 때문에, 다시 추출법이나 정제법을 조사하여, 검토하였다. 이리하여, 렌틸-렉틸 컬럼과 같은 결합 특이성을 지니고, 또한 결합량이 많은 콘카나발린 A(Con A) 컬럼을 이용하여 정제를 하였다. 막 가용화 분획을 Con A 컬럼의 흡착·비흡착 분획으로 분획하였다. BALL-mf를 Con A 컬럼으로 비흡착 분획, 흡착 분획으로 분획하여, SDS-PAGE로 전기영동한 바, 다른 단백질의 밴드가 확인되었다(도 16). 각 분획을 Meth-A 담암 마우스에게 피하 주사한 바, 흡착 분획(A)에 강한 항종양 활성이 확인되었다(도 17). 비흡착 분획(B)에서는 PBS에 비하여 종양 증식은 억제되었지만, 종양은 배제되지 않았다(표 1). 흡착 분획을 투여한 주위의 조직 표본을 광학현미경 하에서 관찰하면, 종양 세포에서는 표층의 세포에 핵농축을 보이는 세포가 보여, 아폽토시스의 가능성이 시사되었다(도 18). 한편, 정상 세포에 대한 세포 장해 활성은 확인되지 않았다.

이어서, 음이온 교환 컬럼(RESOURCE Q)에 의해 정제를 시도하였다. 각 분획의 전기영동 패턴으로부터, 7개로 분획(용출 순으로 가칭: A, B, C, D, E, F, G)하여, 각 분획의 항종양 활성을 검토한(도 19) 바, 분획 D에 가장 강한 항종양 활성이 확인되었다. 더욱이 분획 D의 농도를 변화시켜(희석 배율: 1, 200, 6,000, 30,000배) 항종양 활성을 조사한 바, 농도 의존성에 항종양 활성이 확인되었다(도 20). 조직 표본을 제작한 실험에 의해, 세포 장해 활성의 암 세포 특이성에 관해서 검토할 수 있다.

콘카나발린 A 컬럼 정제 분획의 항종양 효과

콘카나발린 A 컬럼	소실/생착(마리)
흡착 분획	15/5
비흡착 분획	2/18
PBS	3/17

음이온 컬럼 RESOURCE Q로 정제한 후, RESOURCE Q 컬럼 크로마토그래피 처리 분획 D를 히드록시 아파타이트 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, A∼E의 분획을 얻었다(도 21). 도 21에는 각 분획의 SDS-PAGE의 결과도 나타내고 있다. 상기와 같은 식으로 하여 항종양 활성을 조사한 바, 히드록시 아파타이트 컬럼 CHT2-I 분획 D의 항종양 활성이 다른 분획과 비교하여 가장 강한 것을 관찰하였다(도 22). 도 22에는 그 분획의 SDS-PAGE의 결과도 도시한다.

도 1에 있어서, 각 부호는 다음을 나타낸다.

도 1(a)에서는,

● : BALL-mf로 처치된 동물에 있어서의 종양의 중량

■ : Daudi-mf로 처치된 동물에 있어서의 종양의 중량

○ : PBS로 처치된 동물에 있어서의 종양의 중량

도 1(b)에서는,

● : BALL-mf로 처치된 동물 중 종양 거부가 있었던 동물의 수

■ : Daudi-mf로 처치된 동물 중 종양 거부가 있었던 동물의 수

○ : PBS로 처치된 동물 중 종양 거부가 있었던 동물의 수

산업상 이용가능성

본 발명에서는, 갈렉틴 9 유도 인자가 동정되어 그 정제가 이루어졌으므로, 그 정제 갈렉틴 9 유도 인자를 사용한 의약품 개발, 갈렉틴 9가 관여하는 생리 현상, 생물 활성에 관한 연구 개발에 이용할 수 있다. 특히, 갈렉틴 9 유도 인자는 세포막 가용화 분획 및 이 분획으로부터 콘카나발린 A 흡착 분획, Resource Q^TM 이온 교환 컬럼, 히드록시 아파타이트 컬럼 등을 이용함으로써, 농축한 활성 보유 분획으로서 얻어진다. 이 인자를 투여함으로써, NK형 활성을 증강하는 활성, 항종양 활성 등의 생물 활성을 얻을 수 있기 때문에, 그 갈렉틴 9 유도 활성을 이용한 측정 시약, 의약, 분석 등의 개발이 가능하다.

본 발명은 전술한 설명 및 실시예에 특별히 기재한 것 이외에도 달리 실행할 수 있음은 분명하다. 전술한 교시를 감안하여, 본 발명의 다수의 변경 및 변형이 가능하고, 따라서 이들도 본 건 특허 청구의 범위 내에 속한다.

<서열표 프리 텍스트>

서열 번호 1, PCR용 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드

서열 번호 2, PCR용 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드

서열 번호 3, PCR용 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드

서열 번호 4, PCR용 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드

서열 번호 5, PCR용 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드

서열 번호 6, PCR용 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드

SEQUENCE LISTING <110> GALPHARMA Co., Ltd. <120> Galectin 9-inducing factor <130> GL-04PCT <150> JP 2003-124452 <151> 2003-04-28 <160> 6 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 1 caggcaccca tggctcaaac tac 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2 tatcagactc ggtaacgggg gt 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 3 cgtcaatggc tctgtgcagc tgtc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 4 agatccacac tgagaagctc tggc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 5 ggtcagagtt caaggtgatg gtga 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 6 gcctgatatc atgatggact tgga 24

Claims

B 세포 림프종 유래 세포주 BALL-1 세포로부터 얻어지는 세포막 가용화 분획에 그 생물 활성이 존재하는 것을 동정할 수 있는 갈렉틴 9 유도 인자로서, 이 갈렉틴 9 유도 인자의 생물 활성은, 적어도 하기 (1)∼(11)로 구성되는 군에서 선택된 것에 의해 동정할 수 있는 것을 특징으로 하는 인간 유래의 갈렉틴 9 유도 인자:

(1) 갈렉틴 9 유도 활성,

(2) 표적 종양 세포로서 Meth-A 육종을 사용한 생체내 시험에서 종양 세포의 증식 억제 또는 종양의 거부를 유발하는 것,

(3) 항종양 활성,

(4) 시험관내 시험에서 말초혈 단핵구의 자연 킬러 활성을 유도하는 것,

(5) 말초혈 단핵구를 사용한 시험에서, 갈렉틴 9 mRNA의 발현의 상향 조절,

(6) 말초혈 단핵구를 사용한 시험에서, 세포질에 있어서의 갈렉틴 9 단백질의 발현의 유의적인 상승,

(7) 조직병리학적 검사에서, 주사한 부위에 호산구 및 단핵 세포로 이루어지며 소수의 호중구를 수반한 육아 조직이 확인되는 것,

(8) 주사한 부위의 피근층의 위나 아래의 결합 조직에서 다수의 비만 세포가관찰되는 것,

(9) 종양의 주위 조직의 조직병리학적 검사에서, 종양의 주위 또는 종양 조 직에 염증 세포(주로 호산구와 약간의 비만 세포)의 침윤을 갖고 있는 영역이 관찰되는 것,

(10) 종양의 주위 조직의 조직병리학적 검사에서, 핵농축을 보이는 종양 세포가 관찰되는 것, 및

(11) 종양의 주위 조직의 조직병리학적 검사에서, 종양의 주위 또는 종양 조직에 이염성(metachromasis)을 보이는 비만 세포의 집적이 관찰되는 것.
제1항에 있어서, B 세포 림프종 유래 세포주 BALL-1 세포가 방사선 조사 처리된 것을 특징으로 하는 갈렉틴 9 유도 인자.
제1항 또는 제2항에 있어서, BALL-1 세포를 프로테아제 저해제의 존재 하에, 계면활성제와 함께 균질화 처리하여 가용화한 세포막 가용화 분획에 존재하는 것을 특징으로 하는 갈렉틴 9 유도 인자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포 림프종 유래 세포주로부터 얻어진 세포막 가용화 분획으로부터, 콘카나발린 A 컬럼 크로마토그래피, 음이온 컬럼 컬럼 크로마토그래피 및 히드록시 아파타이트 컬럼 크로마토그래피 등의 컬럼 크로마토그래피로 구성되는 군에서 선택된 처리로 정제 및/또는 농축할 수 있는 것을 특징으로 하는 갈렉틴 9 유도 인자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재한 갈렉틴 9 유도 인자를 함유하는 것을 특징으로 하는, 세포에서 갈렉틴 9를 유도하는 시약.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재한 갈렉틴 9 유도 인자와 세포를 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 세포에서 갈렉틴 9를 유도하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재한 갈렉틴 9 유도 인자를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.
제7항에 있어서, 항종양제, 항염증제, 항알레르기제, 면역억제제, 자가면역질환용 제제 또는 부신피질 스테로이드 호르몬 대체제인 것을 특징으로 하는 의약.