CN100494400C - 电压调控钠通道7型α亚单位基因与原发性高血压的相关性 - Google Patents
电压调控钠通道7型α亚单位基因与原发性高血压的相关性 Download PDFInfo
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- CN100494400C CN100494400C CNB031509886A CN03150988A CN100494400C CN 100494400 C CN100494400 C CN 100494400C CN B031509886 A CNB031509886 A CN B031509886A CN 03150988 A CN03150988 A CN 03150988A CN 100494400 C CN100494400 C CN 100494400C
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Abstract
本发明公开了一种检测原发性高血压易感性的方法，它包括检测个体的电压调控钠通道7型α亚单位基因SCN7A、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患原发性高血压的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及人电压调控钠通道7型α亚单位基因(sodium channel，voltage-gated，type VII，alpha polypeptide，SCN7A)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其与原发性高血压的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。
背景技术
原发性高血压(essential hypertension，EH)是最常见的心血管疾病，其发病率逐年上升，并可引起严重的心、脑、肾并发症，是脑卒中和冠心病的主要危险因素。EH是一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找EH相关基因进而阐明高血压发病的遗传机制已经成为目前研究的热点(Harrap SB.Hypertension：genes versus environment.Lancet，1994，344：169-171)。
许多学者认为，钠通道在高血压发病中起很大作用。有研究表明，钠通道通过改变肾脏水钠***功能和影响血管平滑肌收缩活性参与血压调节。上皮钠通道基因(SCN1A)突变可导致一种单基因高血压疾病-Liddle综合征(Gao PJ，Zhang KX，Zhu DL，et al.Diagnosis of Liddle syndrome by genetic analysis of betaand gamma subunits of epithelial sodium channel--a report of five affected familymembers.J Hypertens，2001，19：885-889)。
朱鼎良等曾将中国上海汉族人群的一个EH易感基因定位于2q14～q23一个约10cM的区域内(Zhu D1，Wang HY，Xiong MM，et al.Linkage of hypertension tochromosome 2q14-q23 in Chinese families.J Hypertens，2001，19：55-61)。然而，并没有确定该区域中哪个基因是EH易感基因。
因此，本领域迫切需要寻找EH易感基因，并开发检测原发性高血压的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种诊断(尤其是早期诊断)高血压等高血压的方法及检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种新的治疗高血压的方法。
本发明的再一目的是提供一种治疗高血压等高血压的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤：
检测该个体的SCN7A基因、转录本和/或蛋白，并与正常的SCN7A基因、转录本和/或蛋白相比较，
存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。
在另一优选例中，所检测的是SCN7A的基因或转录本，并与正常SCN7A核苷酸序列比较差异。
更佳地，所述的差异是选自下组的单核苷酸多态性：
5217位A→C；
5323位G→C；
5648位T→C；
5853位A→G；
5897位A→T；
5972位G→T；
6964位T→C；
7378位A→G；
7431位T→C；
16631位C→A；
19652位C→T；
21962位G→A；
21966位G→A；
23652位T→C；
28194位C→T；
28413位T→C；
28785位T→C；
37217位G→C；
50588位A→G；
66196位A→G；
70794位G→T；
70954位G→A；
77424位C→T；
81087位A→C；
83996位T→C；
84201位T→C；
84622位T→C；
84728位C→A；
87778位T→C；
88363位G→C；
88605位A→G；
88627位A→C；
其中，核苷酸位置编号基于NT_005403。
在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在SCN7A基因的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：
(a)用SCN7A基因特异性引物扩增样品的SCN7A基因，得到扩增产物；和
(b)检测扩增产物中是否存在选自下组的单核苷酸多态性：
5217位A→C；
5323位G→C；
5648位T→C；
5853位A→G；
5897位A→T；
5972位G→T；
6964位T→C；
7378位A→G；
16631位C→A；
19652位C→T；
21962位G→A；
23652位T→C；
28194位C→T；
28413位T→C；
28785位T→C；
37217位G→C；
50588位A→G；
66196位A→G；
70794位G→T；
70954位G→A；
77424位C→T；
81087位A→C；
83996位T→C；
84201位T→C；
84622位T→C；
84728位C→A；
87778位T→C；
88363位G→C；
88605位A→G；
88627位A→C；
其中，核苷酸位置编号基于NT_005403。
在另一优选例中，所述的单核苷酸多态性是70794位G→T。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的SCN7A蛋白以及药学上可接受的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种检测高血压的试剂盒，它包括特异性扩增SCN7A基因或转录本的引物。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的试剂：
(a)与突变部位结合的探针；
(b)识别突变位点的限制性内切酶。
更佳地，所述的突变选自：
5217位A→C；
5323位G→C；
5648位T→C；
5853位A→G；
5897位A→T；
5972位G→T；
6964位T→C；
7378位A→G；
7431位T→C；
16631位C→A；
19652位C→T；
21962位G→A；
21966位G→A；
23652位T→C；
28194位C→T；
28413位T→C；
28785位T→C；
37217位G→C；
50588位A→G；
66196位A→G；
70794位G→T；
70954位G→A；
77424位C→T；
81087位A→C；
83996位T→C；
84201位T→C；
84622位T→C；
84728位C→A；
87778位T→C；
88363位G→C；
88605位A→G；
88627位A→C；
其中，核苷酸位置编号基于NT_005403。
更佳地，所述的单核苷酸多态性是70794位G→T。
附图说明
图1显示了SCN7A的一种SNP图像(以SNP021为例)的测序结果。
图2显示了对一种SNP(T3013G)经BclI酶切图的检测电泳图。泳道1-16为不同的样本，泳道17为分子量标准物。其中完全切开是TT型(泳道5、8、9、13、15)，完全切不开是GG型(泳道7)，不完全切开是GT型(泳道1、2、3、4、6、10、11、12、14、16)。
具体实施方式
本发明人经过多年研究，首次发现和证明了SCN7A基因与高血压密切相关，而且发现了它的新功能：SCN7A基因的改变将导致高血压，其中关联研究结果显示，在SCN7A第70794位的SNP021在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P<0.01)，该SNP多态可改变氨基酸的编码序列。在此基础上完成了本发明。
SCN7A总测序长度为13132bp，其中启动子区为2198bp，5′UTR为135bp，编码区为4945bp，内含子为5589bp，3′UTR为201bp，3′末端区为66bp。其详细序列可参见登录号为NT_005403的核苷酸序列(可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
基于本发明的新发现，SCN7A蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗SCN7A蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如高血压)，和用于筛选促进SCN7A蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人SCN7A蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人SCN7A蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人SCN7A DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人SCN7A基因产物或片段。较佳地，指那些能与人SCN7A基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人SCN7A蛋白的分子，也包括那些并不影响人SCN7A蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人SCN7A基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人SCN7A蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人SCN7A蛋白功能的抗体以及不影响人SCN7A蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人SCN7A基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人SCN7A基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人SCN7A蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人SCN7A蛋白。一种优选的抗SCN7A抗体是不识别正常SCN7A但识别突变SCN7A(如在基因70794位的SNP 021所造成的Met→Ile突变)的抗体，或者识别正常SCN7A但不识别突变SCN7A的抗体。利用该抗体对正常和异常SCN7A蛋白的特异性差异，可以方便地进行蛋白质水平的高血压易感性检测。
利用本发明SCN7A蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与SCN7A蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明SCN7A蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。
正常的SCN7A多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于高血压治疗。在使用本发明SCN7A蛋白时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明SCN7A蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的SCN7A蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
人SCN7A蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于SCN7A蛋白的无表达或异常/无活性的SCN7A蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带SCN7A基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人SCN7A基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明还涉及定量和定位检测人SCN7A蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。
一种检测检测样品中是否存在SCN7A蛋白的方法是利用SCN7A蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与SCN7A蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在SCN7A蛋白。
SCN7A蛋白的多聚核苷酸可用于SCN7A蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，SCN7A蛋白的多聚核苷酸可用于检测SCN7A蛋白的表达与否或在疾病状态下SCN7A蛋白的异常表达。如SCN7A DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断SCN7A蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用SCN7A蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测SCN7A蛋白的转录产物。
检测SCN7A基因的突变也可用于诊断高血压。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。SCN7A蛋白突变的形式包括与正常野生型SCN7A DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。一类优选的突变是表2所示的SNP。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 中国人SNP发现和确认样本
为了提高SNP检测的代表性和效力，DNA样本取自30名对象，他们来自我国不同地区(山东、陕西、福建、广东、广西、上海、拉萨、云南、吉林、内蒙、贵州、四川和新疆等)的不同民族(汉、壮、藏、布朗、朝鲜、傣、蒙古、苗、彝、维族等)。
1.1.2 SNP分型和关联分析初步研究样本
所有受试者均为汉族。原发性高血压组(EH组)和正常血压组(NT组)各96例，均来自中国上海地区，彼此无亲缘关系。EH组是上海市瑞金医院高血压科门诊确诊或在上海地区普查中确诊的高血压病患者，其中男46例、女50例，平均年龄49.7±7.13岁，入选标准为：(1)收缩压>150mmHg和/或舒张压>95mmHg(即除外临界高血压患者)，或正在接受抗高血压药物治疗一年以上；(2)在20岁之前或60岁以后发病者除外；(3)临床上除外继发性高血压。NT组为·40岁以上居民，其中男47例、女49例，平均年龄49.4±5.30岁，收缩压<140mmHg，且舒张压<90mmHg。无高血压家族史，排除肝、肾、甲状腺、糖尿病史。EH组和NT组在年龄、性别构成上无统计学差别。
1.1.3 SNP分型和关联分析扩大研究样本
对于在上述初步研究中得到的阳性结果，扩大样本量后(EH组和NT组各288例)进一步验证。EH组男143例、女145例，平均年龄48.1±6.82岁。NT组男149例，女139例，平均年龄47.0±5.68岁。EH组和NT组在年龄、性别构成上无统计学差别。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA提取
常规酚-氯仿法提取外周血白细胞DNA，并标化DNA浓度值至20ng/μl。
1.2.2 PCR及测序引物的设计
根据GenBank中SCN7A的基因组序列，应用prime3软件(美国麻省理工生物医学白头研究所，http://www-gonome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)设计引物。具体引物如下表所示。
表1 引物序列表
| 位置 | 引物名称 | 序列(5′-3′) | SEQ ID NO： |
| 启动子-1： | SCN7AL1N2F： | cca ctc tgt cct ctc ctt tcc | 1 |
| SCN7AL1N2R： | ctg ggc agt cat ctc cta cag | 2 | |
| 启动子-2： | SCN7AL1N3F： | tcc cct gtc cct cag ttt tat | 3 |
| SCN7AL1N3R： | tcc tta ttt cct gct gca cac | 4 | |
| 启动子-3： | SCN7AL1N4F： | gca aat gcc aat ttc att cc | 5 |
| SCN7AL1N4R： | aaa agg ccc tgc att aga gaa | 6 | |
| 启动子-4： | SCN7AL2N1F： | tta ttg gtt tgg gca act tga | 7 |
| SCN7AL2N1R： | ttc tca cct gca ctg tgt gtg | 8 | |
| 启动子-5： | SCN7AL2N2F： | aga gca gcg gtg taa cct tg | 9 |
| SCN7AL2N2R： | gag cac aga cat atc cat ctc a | 10 | |
| 外显子1： | SCN7AL1N1F： | aag ctt cac cca acc aac ttt | 11 |
| SCN7AL1N1R： | cct caa caa cag gca taa acc | 12 | |
| 外显子2： | SCN7AL3N1F： | aat tta aaa tca gat ctt tcc ctg t | 13 |
| SCN7AL3N1R： | tca gtt tac tgg tct cta ttt ttc g | 14 | |
| 外显子3： | SCN7AL4N2F： | ttc aat atg acc caa cat gag a | 15 |
| SCN7AL4N2R： | cgg gtg tag cag tag caa aaa | 16 | |
| 外显子4： | SCN7AL4N1F： | tgg aaa gga atg aaa gtt acc tg | 17 |
| SCN7AL4N1R： | att aat gcc ca t tgt tgt tca | 18 | |
| 外显子5： | SCN7AL5N1F： | ccc cca ctc ctt tca ttc tta | 19 |
| SCN7AL5N1R： | acc tgg tct cac ctt cct gat | 20 | |
| 外显子6： | SCN7AL6N1F： | ttt tct tct ctt tcc tgg agt g | 21 |
| SCN7AL6N1R： | tat tta cct ggc cac ttt cca | 22 | |
| 外显子7： | SCN7AL7N2F： | tgc aat tgt gaa gaa aag agc a | 23 |
| SCN7AL7N2R： | caa tgg agt atg cag ttg ctg | 24 | |
| 外显子8： | SCN7AL7N1F： | tgg gaa gca aca gta aaa gca | 25 |
| SCN7AL7N1R： | aaa atg aaa ccc tgc aca aca | 26 | |
| 外显子9： | SCN7AL8N1F： | aaa aat agc ttg gca aaa acc a | 27 |
| SCN7AL8N1R： | ttc agg taa tcc tga gcc att | 28 | |
| 外显子10： | SCN7AL9N1F： | agg tgg agc cag tgc tta aa | 29 |
| SCN7AL9N1R： | aag cca tag aat cat gag caa a | 30 | |
| 外显子11： | SCN7AL10N1F： | aaa ggc tcc ggg aga ata agt | 31 |
| SCN7AL10N1R： | ttg gtc act ctt tcc aat gtt t | 32 |
| 外显子12： | SCN7AL11N2F： | ggg ttg gag gga taa agc ata | 33 |
| SCN7AL11N2R： | att cac cca cct cgg ctt c | 34 | |
| 外显子13： | SCN7AL11N1F： | taa tgc tcc caa tgt ccc aat | 35 |
| SCN7AL11N1R： | gct gtg aag aat gtg aga gtg a | 36 | |
| 外显子14： | SCN7AL12N1F： | cat ctg gct agt ggg tta ctc t | 37 |
| SCN7AL12N1R： | tga gga tcc cct ggt ctc tta | 38 | |
| 外显子15-1： | SCN7AL13N1F： | tgg ata atc tgg ctg tgg aac | 39 |
| SCN7AL13N1R： | agc ttg cag tgg caa gaa tta | 40 | |
| 外显子15-2： | SCN7AL13N2F： | tga gaa aat ctt ggg tgt tgc | 41 |
| SCN7AL13N2R： | gga gat tga gga gct gtt gat | 42 | |
| 外显子16： | SCN7AL14N1F： | ggc cta taa ctg tca gag gaa aa | 43 |
| SCN7AL14N1R： | tca gtc atg aaa ttg gcc tta | 44 | |
| 外显子17： | SCN7AL15N1F： | gct cag gga tta cag tgg tca | 45 |
| SCN7AL15N1R： | tca cag att atg aaa ttt ggt gct | 46 | |
| 外显子18： | SCN7AL16N1F： | cct gga gcc tac aat ctc tga | 47 |
| SCN7AL16N1R： | gaa aggg tgt cat gta cca aca atg | 48 | |
| 外显子19： | SCN7AL17N1F： | aat aat tca cga att tac tgg taa gc | 49 |
| SCN7AL17N1R： | aag caa tga aac gta aag ttt ttg | 50 | |
| 外显子20： | SCN7AL18N1F： | tcc ttt gca ttc aac cta caa | 51 |
| SCN7AL18N1R： | cag cat gtg ggc tgt taa atc | 52 | |
| 外显子21： | SCN7AL19N2F： | aac cat tgt tgc aaa gtc tgg | 53 |
| SCN7AL19N2R： | tat gga agt gtg gca agc cta | 54 | |
| 外显子22： | SCN7AL19N1F： | cca aag cca att att tga agc | 55 |
| SCN7AL19N1R： | tac cag act ttg caa caa tgg | 56 | |
| 外显子23： | SCN7AL20N1F： | ggg aaa att tgg att aag tgt ga | 57 |
| SCN7AL20N1R： | tgg agc ttg ttc tgt ggg taa | 58 | |
| 外显子24-1： | SCN7AL20N2F： | ttt gtg tcc ctt gac aaa gc | 59 |
| SCN7AL20N2R： | cct gtg atg gag aaa ata acc a | 60 | |
| 外显子24-2： | SCN7AL20N3F： | gtt tcc aag caa tag cca tga | 61 |
| SCN7AL20N3R： | ctg gtg gct tgt atg ca agt | 62 | |
| 外显子25-1： | SCN7AL21N1F： | tgg aag gga tca ata aag gat t | 63 |
| SCN7AL21N1R： | tga aaa ttg cat caa gca tcc | 64 | |
| 外显子25-2： | SCN7AL21N2F： | att ttg aaa cct ttg gca aca | 65 |
| SCN7AL21N2R： | agg tcc aaa gca atg agc tg | 66 | |
| 外显子25-3： | SCN7AL21N3F： | atg gaa aag gtt tga tcc tga | 67 |
| SCN7AL21N3R： | gca tga aca tct ctg tca cca | 68 | |
| 外显子25-4： | SCN7AL21N4F： | gca gtt tca gca acc atc att | 69 |
| SCN7AL21N4R： | ttc cct aga agg cac aca tca | 70 |
1.2.3 SCN7A基因的调控区和编码区分段体外扩增
以提取的DNA为模板，采用半巢式PCR法，第一次先扩增出1.5Kb的长片段，再分别扩增各个0.4-0.5Kb左右的目的片段。第一次反应体系10μl，将多个长片段放在一起，用热启动Taq酶，在GeneAmp9700PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性15分钟，94℃变性30秒，63℃退火1分钟，72℃延伸30-90秒，共9个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；第二循环94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸30-90秒，共25个循环；最后72℃延伸7分钟。第二次反应体系25μl，以第一次PCR扩增产物为模板，各目的片段单独进行扩增，PCR反应程序同上。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。
1.2.4 SNP的发现和检测
PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRISMTM377 DNA测序仪(美国应用生物***公司appliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http://droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和SNP确认。
1.2.5SNP基因分型和关联分析
对距离较近的数个SNP用直接单向测序法进行SNP基因分型，其它SNP用PCR-RFLP法进行分型。对检测到的7个SNP，在96个病人和96正常血压对照组中进行分型和关联分析。
1.2.6 酶切反应
反应体系10μl，PCR产物100ng，用梯度浓度的方法确定内切酶的用量。根据各个酶的具体情况选择不同的温度和酶切时间。酶切产物进行溴乙啶染色的2.5％琼脂糖凝胶电泳，通过紫外线凝胶成像***分析判定结果。
1.3 统计学方法
SNPs各基因型在病人和正常血压对照中分布的比较采用R×C表x2检验。P<0.05认为有统计学差别。
2.结果
2.1 SCN7A基因SNP的发现和分布
SCN7A的基因共有25个外显子，测序总长度是13132bp，共发现32个SNP，包括启动子区7个，编码区10个(其中改变氨基酸编码的共6个)，3′非编码区1个，内含子14个，其中30个是新发现的SNP。SCN7A基因SNP分布情况见表2。测序确认杂合子图像见图1。
表2 中国人SCN7A基因SNP的种类及其分布
| SNP名称 | NT_005403(1-88827)中的位置 | 基因区域 | 等位基因 | 密码子 | 氨基酸 | 检测引物 |
| SNP001 | 5217 | Promoter | A/C | SCN7AL2N2 | ||
| SNP002 | 5323 | Promoter | G/C | SCN7AL2N2 | ||
| SNP003 | 5648 | Promoter | T/C | SCN7AL2N1 | ||
| SNP004 | 5853 | Promoter | A/G | SCN7AL2N1 | ||
| SNP005 | 5897 | Promoter | A/T | SCN7AL2N1 | ||
| SNP006 | 5972 | Promoter | G/T | SCN7AL2N1 | ||
| SNP007 | 6964 | Promoter | T/C | SCN7AL1N2 | ||
| SNP008 | 7378 | Intronl | A/G | SCN7AL1N1 | ||
| SNP009 | 7431 | Intronl | T/C | SCN7AL1N1 | ||
| SNP010 | 16631 | Exon2 | C/A | ACT-AAT | Thr-Asn | SCN7AL3N1 |
| SNP011 | 19652 | Intron2 | C/T | SCN7AL4N2 | ||
| SNP012 | 21962 | Intron5 | G/A | SCN7AL5N1 | ||
| SNP013 | 21966 | Intron5 | G/A | SCN7AL5N1 | ||
| SNP014 | 23652 | Intron6 | T/C | SCN7AL6N1 | ||
| SNP015 | 28194 | Intron6 | C/T | SCN7AL6N1 | ||
| SNP016 | 28413 | Intron7 | T/C | TAT-CAT | Tyr-His | SCN7AL7N2 |
| SNP017 | 28785 | Intron8 | T/C | SCN7AL7N1 | ||
| SNP018 | 37217 | Exon10 | G/C | GGC-CGC | G1y-Arg | SCN7AL9N1 |
| SNP019 | 50588 | Exon13 | A/G | TAT-TGT | Tyr-Cys | SCN7AL11N1 |
| SNP020 | 66196 | Intron17 | A/G | SCN7AL15N1 | ||
| SNP021 | 70794 | Exon18 | G/T | AGT-ATT | Met-Ile | SCN7AL16N1 |
| SNP022 | 70954 | Intron18 | G/A | SCN7AL16N1 | ||
| SNP023 | 77424 | Exon20 | C/T | AAC-AAT | Asn-Asn | SCN7AL18N1 |
| SNP024 | 81087 | Exon21 | A/C | GCA-GCC | Ala-Ala | SCN7AL19N2 |
| SNP025 | 83996 | Intron23 | T/C | SCN7AL20N1 | ||
| SNP026 | 84201 | Intron23 | T/C | SCN7AL20N1 | ||
| SNP027 | 84622 | Intron24 | T/C | SCN7AL20N3 | ||
| SNP028 | 84728 | Intron24 | C/A | SCN7AL20N3 | ||
| SNP029 | 87778 | Exon25 | T/C | TAT-TAC | Tyr-Tyr | SCN7AL21N1 |
| SNP030 | 88363 | Exon25 | G/C | GTT-CTT | Val-Leu | SCN7AL21N1 |
| SNP031 | 88605 | Exon25 | A/G | TCA-TCG | Ser-Ser | SCN7AL2IN4 |
| SNP032 | 88627 | 3′UTR | A/C | SCN7AL21N4 |
说明：
(1)表中第一列为SNP的名称；第二列为SNP在NT_005403中的位置；第三列为SNP在基因中的位置，Promoter为启动子区，Exon为外显子区，Intron为内含子区，3′UTR为3′末端非翻译序列；第四列为在等位基因中SNP的两个碱基；第五列为密码子的改变；第六列为氨基酸改变的类型；第七列为测序所用引物。
(2)：其中除SNP009(rs2293568)和SNP013(rs2293567)外，其余均为新发现的SNP。
2.2 SNP位点的基因分型
在各为96例的EH组和NT组中，对7个SNP的初步基因分型和关联分析的结果见表3，其中SNP021基因型的分布在两组中有显著差异(x2＝6.77，P<0.05)，表明该SNP与高血压显著相关。
表3 七个SNPs基因分型和关联分析结果
| SNP | 等位基因 | 分型方法 | 样本量 | 等位基因频率 | X<sup>2</sup> | P | |
| SNP004 | A/G | 直接测序 | 96：96 | A0.818 | G0.182 | 0.0177 | 0.894 |
| SNP005 | A/T | 直接测序 | 96：96 | T0.523 | A0.177 | 1.622 | 0.203 |
| SNP006 | G/T | 直接测序 | 96：96 | G0.906 | T0.094 | 0.257 | 0.612 |
| SNP012 | G/A | AtaII酶切 | 96：96 | G0.969 | A0.031 | 0.094 | 0.760 |
| SNP014 | T/C | AsuII酶切 | 96：96 | C0.833 | T0.167 | 1.338 | 0.247 |
| SNP021 | G/T | BcII酶切 | 96：96 | T0.620 | G0.380 | 6.328 | 0.012 |
| SNP029 | C/T | Rsal酶切 | 96：96 | T0.932 | C0.068 | 2.713 | 0.100 |
3.讨论
高血压是遗传因素与多种环境因素相互作用而导致的多基因疾病，其遗传机制的研究已经成为目前的研究热点。迄今研究者已经成功地确定了几种单基因遗传性高血压的候选基因，但占高血压约95％的原发性高血压的遗传方式和易感基因仍未确认。探讨原发性高血压易感基因的方法主要是候选基因策略与全基因组扫描策略，两种方法相结合而产生的定位候选克隆被认为是该项研究最有希望获得突破的途径。
本发明人进行了以家系为基础的全基因组扫描，从而确认D2S112～D2S2370(2q14-q23)是上海地区的原发性高血压的一个易感区域。Stoll等通过对小鼠的全基因组扫描，确定了26个与血压调节有关的染色体区段，其中对应于人染色体2q14～2q23的一个区段与本发明定位研究结果完全吻合(Stoll M，Kwitek-Black AE，Cowley AW Jr，et al.New target regions for human hypertensionvia comparative genomics.Genome Res，2000，10：473-482)；Moses等对澳大利亚和新西兰的先兆子痫患者进行的全基因组扫描中确定了一个位点(D2S112～D2S151)，也与本发明研究结果相吻合(Moses EK，Lade JA，Guo G，et al.Agenome scan in families from Australia and New Zealand confirms the presence of amaternal susceptibility locus for pre-eclampsia，on chromosome 2.Am J Hum Genet，2000，67：1581-1585)，因此这个区域很可能存在影响高血压发病的重要基因。
SCN7A基因位于2q14～q23区域内，它编码一种电压门控式钠通道，其功能与可兴奋细胞的动作电位初期细胞膜除极化有关，它通过构象的改变调整钠离子按电-化学梯度进出细胞(George ALJr，Knittle TJ，Tamkun MM.Molecularcloning of an atypical voltage-gated sodium channel expressed in human heart anduterus：evidence for a distinct gene family.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1992，89：4893-4897)。其mRNA长度为5389bp，共25个外显子。
本发明首次在中国人群中对该基因25个外显子及连接区内含子和转录调控区共13132bp进行了SNP检测，共发现32个SNP，平均410个bp中就有一个SNP。在基因调控区的SNP密度最大，平均273bp就有一个SNP，编码区SNP密度最小，内含子居中。这反映了调控区的胞嘧啶因经常发生自发性甲基化脱氨而变为胸腺嘧啶，从而序列变异较多。编码区因为有较大的选择压力，所以变异较少，内含子则处于平均水平。与NCBI SNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)中的数据相比较，本发明在中国人群中发现的32个SNP，该库收录的仅2个，它们分别是SNP009和SNP013，其余30个SNP均为未被该库收录的新SNP。而NCBISNP数据库中序列号为rs3579、rs2091544、rs2103305的3个SNP，在本发明的样本中没有检测到。这反映了SNP在不同种族之间的差异。
由于多基因疾病表现型的复杂性、相关基因的微效性和人群的遗传异质性，其相关基因定位克隆研究一直是一个很大的挑战。在全基因组扫描的基础上筛选多态性标记，然后在病例-对照中进行相关分析是目前寻找疾病相关基因的重要方法。SNP数量多、分布广、密度高，是进行遗传连锁分析和关联研究最理想的遗传标记。本研究从SCN7A基因的32个SNP中选出7个SNP，在上海地区汉族中，通过病例-对照分析，进行它们与高血压间的相关性研究。结果表明这7个SNP在上海地区汉族中都存在，并在一项病例-对照组各为96例的研究中发现SNP021的2种等位基因频率分布，在EH组和NT组之间有显著性差异(P<0.05)。
SCN7A蛋白共有4个跨膜结构域，构成4个离子转运单位。而SNP021在其mRNA中的位置是3013位，位于第3个离子转运亚单位，是一个T/G多态性，将蛋氨酸改变为异亮氨酸，这一改变可能影响钠离子的跨膜转运。本发明的结果提示，SCN7A基因变异与上海汉族人群EH发病相关。
实施例2
原发性高血压易感性检测试剂盒
制备一试剂盒，它含有：
名称 序列(5′→3′) 编号 浓度
正向引物 cct gga gcc tac aat ctc tga SEQ ID NO：47 干粉 2 OD
反向引物 gaa agg tgt cat gta cca aca atg SEQ ID NO：48 干粉 2 OD
PCR反应液 含Taq酶、dNTP、镁离子的PCR反应缓冲液
酶切反应液 BclI内切酶及酶切反应液
抽取待检测病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将高血压检测试剂盒中的PCR引物稀释到1μmol/μl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。使将PCR产物用BclI内切酶进行酶切。第153位含有T的扩增产物可被BclI切开，而第153位含G的PCR产物不能被BclI酶切(注：BcII内切酶能识别TG A TCA序列并在处进行酶切，SNP021G/T两侧的序列为atatatatatG/Tgatcagaga，故含有T等位基因的片段将被BcII内切酶切开，而含有G等位基因的片段则不能被切开。该PCR产物为439bp长度的片段，SNP021G/T位于其153位，因此有T等位基因的片段将被切成153bp和286bp的两个片段，而有G等位基因的酶切后仍为439bp。)。
检测结果图2所示。SNP021的用BclI酶切，其中完全切开是TT型(泳道5、8、9、13、15)，完全切不开是GG型(泳道7)，不完全切开是GT型(泳道1、2、3、4、6、10、11、12、14、16)。其中，含G表示高血压易感性高于正常人群。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市高血压研究所
<120> 电压调控钠通道7型α亚单位基因与原发性高血压的相关性
<130> 034808
<160> 70
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
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Claims (8)
1.一种引物在制备检测高血压易感性的试剂盒中的用途，所述的引物是特异性扩增电压调控钠通道7型α亚单位即SCN7A基因或转录本的引物，并且所述的特异性引物能扩增出含70794位点的SCN7A基因的扩增产物，其中核苷酸位置编号基于NT_005403。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO：47和48所示。
3.一种检测高血压易感性的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增电压调控钠通道7型α亚单位基因即SCN7A基因或转录本的引物，并且所述的特异性引物能扩增出含70794位点的SCN7A基因的扩增产物，其中核苷酸位置编号基于NT_005403。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂：
(a)与突变部位结合的探针，其中所述的突变部位是70794位点；
(b)识别突变位点的限制性内切酶，其中所述的突变位点是70794位点。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是70794位G→T。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，它还含有以下试剂：
(c)与突变部位结合的探针，其中所述的突变部位选自以下突变组：
5217位A→C；
5323位G→C；
5648位T→C；
5853位A→G；
5897位A→T；
5972位G→T；
6964位T→C；
7378位A→G；
7431位T→C；
16631位C→A；
19652位C→T；
21962位G→A；
21966位G→A；
23652位T→C；
28194位C→T；
28413位T→C；
28785位T→C；
37217位G→C；
50588位A→G；
66196位A→G；
70954位G→A；
77424位C→T；
81087位A→C；
83996位T→C；
84201位T→C；
84622位T→C；
84728位C→A；
87778位T→C；
88363位G→C；
88605位A→G；
88627位A→C；
其中，核苷酸位置编号基于NT_005403。
7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO：47和48所示。
8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的识别突变位点的限制性内切酶是BclI。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB031509886A CN100494400C (zh) | 2003-09-15 | 2003-09-15 | 电压调控钠通道7型α亚单位基因与原发性高血压的相关性 |
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-
2003
- 2003-09-15 CN CNB031509886A patent/CN100494400C/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
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|---|
| Molecular cloning of an atypical voltage-gated sodiumchannel expressed in human heart and uterus:evidence.... George AL et al.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,Vol.89 . 1992 |
| Molecular cloning of an atypical voltage-gated sodiumchannel expressed in human heart and uterus:evidence.... George AL et al.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,Vol.89 . 1992 * |
| New target regions for human hypertension via comparativegenomics. Stoll M, Kwitek-Black AE et al.Genome Res,Vol.10 . 2000 |
| New target regions for human hypertension via comparativegenomics. Stoll M, Kwitek-Black AE et al.Genome Res,Vol.10 . 2000 * |
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