KR20050092366A

KR20050092366A - 펩티드, 이에 대한 항체, 및 중추 신경계 손상의 치료에있어서의 이의 용도

Info

Publication number: KR20050092366A
Application number: KR1020057010276A
Authority: KR
Inventors: 지-쳉 샤오
Original assignee: 싱가포르 제너럴 하스피털 피티이 엘티디.
Priority date: 2002-12-06
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2005-09-21
Also published as: WO2004052922A2; CA2508847A1; US7408028B2; CN1745094A; AU2003288434B2; WO2004052922A3; AU2003288434A1; US20060205668A1; EP1567545A2; JP2006526382A; ATE466870T1; EP1567545B1; DE60332481D1

Abstract

본 출원은 마이엘린 단백질 Nogo, TNR 및 MAG의 억제성 도메인과 상호작용하는 펩티드를 제공한다. 이 펩티드는 CNS 손상의 치료법 및 추가 치료법의 개발에 사용될 수 있다. 본 출원은 또한 CNS 손상의 치료를 위해, 마이엘린 단백질의 억제성 도메인에 대하여 피험체를 면역화하기 위한 방법 및 물질을 제공한다.

Description

펩티드, 이에 대한 항체, 및 중추 신경계 손상의 치료에 있어서의 이의 용도{PEPTIDES, ANTIBODIES THERETO, AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM DAMAGE}

본 발명은 CNS 손상, 예를 들어 척수 손상 또는 뇌졸중의 치료법 또는 치료법의 개발에 유용한 물질 및 방법에 관한 것이다.

피부, 간 및 말초 신경과 같은 신체의 대부분의 조직은 손상 후에 스스로 회복하는 놀라운 능력을 갖는다. 이와는 달리, 뇌와 척수를 포함하는 중추 신경계(CNS)는 선천적 회복 능력이 거의 없다. 축색돌기가 배아 CNS 및 성체의 말초 신경계에서는 효율적으로 재생할 수 있음에도 불구하고, 성체 뇌 또는 척수에 있어서 축색돌기 연결부가 손상될 경우, 이들은 매우 제한적인 재생 능력만 보인다. CNS 축색돌기를 재생 불가능하게 하는 요인들은 두 개의 카테고리로 분류될 수 있다: 재생을 불가능하게 만들 수 있는 CNS 뉴런의 내인적 특성; 및 축색돌기 생장을 저해하는 CNS 환경에 있어서의 외인적 요인.

CNS 환경에 있어서의 요인이 재생을 저해할 수 있다는 생각은 20 세기 초반으로 거슬러 올라간다. Ramon y Cajal은 성체 CNS 뉴런이 축색돌기를 연장시킬 수 없는 현상은 말초 신경의 허용성 환경에 노출시켜 극복할 수 있다는 것을 관찰하였다. 이어서, 약 20년 전에, David 및 Aguayo는 망막 뉴런이 말초 신경 이식편에서 긴 돌기를 형성할 수 있음을 제시하였다. 후에, Schwab은 배양 시 후근신경절 뉴런이 슈반 세포를 가로질러 그들의 축색돌기를 연장시키지만, 희소돌기아교세포와 지방 마이엘린 수초는 피한다는 것을 발견하였다(Schwab et al 1993).

이러한 결과들은 재생 불능이 순수하게 CNS 뉴런의 고유 결함에 의한 것이 아니라 CNS 환경에 있어서의 억제 인자 역시 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 이러한 억제 인자들은 손상 영역에서, 백질 트랙에서 축색돌기를 수초화하는 마이엘린에 의해 형성되는 아교세포의 반흔에 주로 위치한다.

CNS 손상 후, 세포괴사의 중심 영역은 아교세포 및 기타 비뉴런 세포에 의해 침윤되며, 섬유성 반흔이 형성된다. 축색돌기는 반흔을 통해서는 연장되지 않으며, 그들의 성장은 반흔에 의해 억제되는 것으로 보인다. 이러한 억제 활성에 기여할 수 있는 분자적 성분들은 세포외 기질 당단백질 테나신-R(TN-R) 및 마이엘린 연합 신경돌기 성장 억제제 마이엘린 연합 당단백질(MAG) 및 Nogo를 포함한다.

TN-R

TN-R은 발생 및 CNS의 재생 과정에서 축색돌기 안내 및 신경 세포 이동의 분자적 제어에 관여하는 다양한 세포-기질 상호작용에 연루되어 있다(Erickson에 의해 재고찰됨, 1993; Chiquet-Ehrismann et al., 1994; Pesheva et al., 2000; 2001). TN-R은 테나신 패밀리의 가장 작은 구성원이고, 4개의 구조적 모티프로 구성된다: N-말단의 시스테인 풍부 세그먼트에 이어 4.5개의 EGF 유사 반복체가 존재한다. 이러한 영역 다음에는 9개의 연속 피브로넥틴 III형 유사 도메인이 위치하고, C-말단의 TN-R은 피브리노겐의 베타- 및 감마-사슬에 연결된다.

TN-R은 마이엘린 형성의 개시 및 초기 단계 중에 희소돌기아교세포에 의해 주로 발현되며, 성체에서도 몇몇 희소돌기아교세포에 의해 발현이 유지된다. TN-R은 척수, 망막, 소뇌 및 해마에 있는 몇몇 뉴런 및 인터뉴런에서도 발현된다(Fuss et al., 1991; 1993). TN-R은 CNS 유수 축색돌기의 랑비에 결절에 고농도로 다른 아교세포 유래의 분자들(즉, 마이엘린 연합 당단백질 및 포스파칸 관련 분자)과 함께 위치한다(Xiao et al., 1997: Yang et al, 1999).

TN-R은 뉴런 세포의 유형 및 이것에 제시되는 환경에 따라 신경돌기 성장을 억제 또는 촉진할 수 있다. TN-R이 뚜렷한 기질 경계로서 작용하도록 제공되었을 때, 후근신경절(DRG), 소뇌 및 망막 신경절 뉴런 성장 원추는 이러한 분자들 상에서 성장하는 것을 피하였으나, 붕괴되도록 유도되지는 않았다. 반면, TN-R이 균일한 기질로서 라미닌(배아 및 성체 축색돌기의 성장을 강력하게 촉진함)과의 혼합물로서 제공되었을 때, DRG 성장 원추는 붕괴된 형태를 나타내었으며, 라미민 단독에서보다 더 빠른 속도로 전진할 수 있었다.

테나신 분자 상의 별개의 에피토프에 결합하는 몇 종의 모노클로날 항체를 사용하여, 표피세포 성장 인자(EGF-L) 반복체 및 피브로넥틴 III형 동족 반복체 4∼5개가 성장 원추 반발에 관여할 수 있음을 확인하였다.

시험관내에서, 마우스 망막 외식편으로부터의 배아 및 성체 망막 신경절 세포 축색돌기의 성장은 테나신-R의 균질한 기질 또는 EGF-L 도메인을 포함하는 박테리아에서 발현된 테나신-R 단편 상에서 현저히 감소된다. 상기 양 분자가 뚜렷한 기질 경계로서 작용하도록 제공되었을 때, 재생중인 성체 축색돌기는 테나신-R 또는 EGF-L을 포함하는 영역을 관통하지 않는다. 모든 시험관내 실험은 라미닌 존재 하에 수행되었는데, 이는 테나신-R 및 EGF-L이 축색돌기 성장을 능동적으로 억제한다는 것을 제시한다. 신경돌기 및 성장 원추는 상기 EGF-L(아미노 말단 시스테인 풍부 도메인 + EGF-유사 반복체)을 포함하는 단편들로 코팅된 영역으로부터 반발되었으며, TN-R의 FN(피브로넥틴) 1-2, FN3-5 및 FG(피브리노겐) 도메인 및 EGF-L은 해마 뉴런의 신경돌기 성장을 억제한다.

TN-R은 또한 EGF-L 도메인을 통해 시험관내 축색돌기의 구조적 변화를 유도한다(Taylor et al., 1993; Xiao et al., 1996, 1997, 1998; Becker et al, 1999 Becker et al, 2000).

성체 래트의 올리브소뇌계의 3-아세틸피리딘 유도된 손상 후에, TN-R 전사체를 포함하는 세포의 밀도는 하올리브핵과 소뇌 피질의 백질에서 현저히 증가하였다. 면역조직화학적 연구는 단백질 수준에서 이러한 관찰들을 확증하였다.

래트의 척수가 물리적으로 손상된 후, TN-R mRNA 역시 상향조절되었다(Wintergerst et al, 1997; Deckner et al, 2000).

이러한 발견들은 손상된 CNS의 연속적인 TN-R 과발현이 생체내에서 성체 축색돌기 재생의 불능에 기여할 수 있음을 제시하였다.

테나신-R은 테나신 패밀리의 한 구성원이며, 뉴런 이동, 신경돌기발생 및 뉴런 재생과 같은 발달하는 신경계에서 세포 상호작용에 있어서 중요한 역할을 한다. 테나신-R은 마이엘린 형성의 개시 및 초기 단계 중에 희소돌기아교세포에 의해 주로 발현되며, 성체에서 몇몇 희소돌기아교세포에 의해 발현이 유지된다(Pesheva et al., 1989; Fuss et al., 1991, 1993; Wintergerst et al., 1993; Ajemian A. et al., 1994). TN-R은 다작용성 분자이며(Lochter and Schachner, 1993; Pesheva et al., 1993; Taylor et al., 1993; Xiao et al., 1996, 1997, 1998), 이것은 상기 분자가 마이엘린 추출의 억제성 성분이라는 것을 시사하였다. Xiao는 TN-R의 EGF-L 도메인이 신경돌기 성장을 억제할 수 있음을 발견하였다.

MAG

MAG는 중추 신경계 및 말초 신경계의 수초화 아교 세포에 의해 발현된 면역글로불린 수퍼패밀리의 경막 단백질이며, 여기서 MAG는 총 마이엘린 단백질의 각각 1% 및 0.1%를 차지한다(Heape et al, 1999). MAG는 축색돌기 재생의 강력한 억제제이며, 또한 뉴런의 나이 및 유형에 따라 축색돌기 성장을 촉진할 수 있다. MAG 억제제는 모든 생후 연령대에서 망막, 상경수신경절, 척수 및 해마 및 후근신경절(DRG)의 뉴런의 신경돌기 성장을 억제하지만, 배아 척수 뉴런 및 신생 DRG 뉴런의 신경돌기 성장은 증강시킬 수 있다(DeBellard et al, 1996; Turnley et al, 1998; Shen et al, 1998; Yang et al, 1999).

MAG는 또한 성장 원추 붕괴를 유도할 수 있다. 생후 1일된 해마 뉴런은 코팅된 재조합 MAG(rMAG)에 노출되었을 때 축색돌기 성장 원추의 60%가 붕괴되었다. 그러한 붕괴는 변성된 rMAG에 의해서는 관찰되지 않았다(Li et al, 1996). 가용성 dMAG (MAG의 세포외 도메인의 단백질 분해 단편, 이것은 마이엘린으로부터 풍부하게 방출되며, 생체내에서 발견됨) 및 키메라 MAG-Fc는 P6 DRG 뉴런으로부터의 신경돌기 성장을 강력하게 억제할 수 있다. 이러한 억제는 MAG 모노클로날 항체가 포함되었을 때 차단되었다.

이러한 결과들은 생체내에서 검출된 가용성 dMAG가 외상 후 포유동물 CNS에서의 재생 결여에 기여할 수 있음을 나타낸다(Tang et al, 1997; 2001).

MAG는 뉴런에 대해 2개의 인식 부위, 즉 R118에 있는 시알산 결합 부위 및 처음 3개 Ig 도메인이 없는 독특한 억제 부위를 갖는다(Tang et al, 1997).

MAG는 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리의 잘 규명된 구성원이며, 미성숙 소뇌 뉴런 및 성체 후근신경절(DRG) 뉴런으로부터의 신경돌기 성장에 강력한 억제 효과를 나타낸다(Mukhopadhyay et al., 1994). MAG는 626개의 아미노산을 갖는 막 단백질이다. 세포외 도메인으로 이루어진 가용성 MAG는 신경돌기 성장에 억제 효과를 나타낸다는 것이 보고된 바 있다(Mckerracher et al., 1994). MAG의 세포외 도메인은 5개의 Ig 유사 도메인으로 구성되며, 처음 2개의 Ig 유사 도메인은 MAG와 뉴런 막 사이의 상호작용에 있어 중요한 반면, 나머지 3개의 Ig 유사 도메인은 억제 효과에 관여할 수 있음이 입증되었다(Collins et al., 1997).

Nogo

Nogo는 PNS 마이엘린에는 아니고 CNS 마이엘린에 집중 위치하는 고분자량의 내재성 막 단백질이다. Nogo는 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 3개의 동형체, 즉 Nogo-A, Nogo-B 및 Nogo-C를 갖는다. NI-250 및 NI-35이 최초로 동정되었으며, 이를 Nogo의 2 동형체로 명명하였다. 현재는 NI-250이 Nogo-A이고 NI-35가 Nogo-B인 것으로 확립되어 있다. Nogo는 CNS의 백질에 존재하는 희소돌기아교세포에 의해 발현되며, 마이엘린의 내부 또는 외부 리플릿과 소포체에서 발견된다.

Nogo의 시험관내 규명은 이것의 축색돌기 연장의 강력한 억제제로서의 기능을 입증하였다. Nogo 활성의 생체내 중화는 CNS 손상 후 강화된 축색돌기 재생 및 기능 회복뿐 아니라 비손상 CNS 섬유에 있어서의 증가된 유연성을 유도하였다. 모노클로날 항체 mAb IN-1은 척수 손상 성체 래트에 적용될 때 생체내에서 원거리 재생 및 기능 회복을 촉진하는 것으로 확인되었다(Chen et al, 2000; GrandPre et al; Merkler et al).

이러한 발견들은 Nogo가 CNS 환경의 비허용성 성질에 대한 주된 기여 인자일 수 있음을 시사한다. Nogo의 두 가지의 상이한 억제성 도메인이 확인되었다: Nogo A의 세포내 아미노 말단 도메인(NogoN) 및 3개의 동형체, Nogo-A, Nogo-B 및 Nogo-C의 2개의 소수성 도메인 사이에 위치하는 짧은 66개 잔기 영역(Nogo-66)(Chen et al, 2000; GrandPre et al, 2000; Fournier et al, 2001; Filbin, 2003). 상기 도메인들은 문헌[Science, Vol 297 (5584), 16 Aug 2002, p. 1132-1134]에 예시되어 있다.

Nogo-A는 슈반 세포에 의해서가 아니라 희소돌기아교세포에 의해 발현된다. 이것은 축색돌기 연장을 억제하고 후근신경절 성장 원추를 붕괴시킨다(GrandPre et al., 2000). Nogo의 신경돌기 성장 억제 활성은 모노클로날 항체 IN-1에 의해 중화될 수 있으며, 이는 척수 손상 후에 축색돌기 재생 및 기능 회복을 가능하게 한다(Chen et al., 2000). Nogo는 1163개의 아미노산을 갖는 막 단백질이다. C-말단 테일은 66개 잔기의 소수성 세포외 도메인에 의해 분리되는 2개의 소수성 경막 도메인을 포함한다. 상기 66개 잔기 세포외 도메인은 축색돌기 성장을 억제할 수 있다(Fournier et al., 2001).

Huang 등의 문헌(1991)은 성체 척수에 있어서 축색돌기 재생을 자극하기 위한 치료용 백신을 개시한다.

본 발명의 목적은 축색돌기 재생에 대한 마이엘린의 억제 효과를 극복함에 의한, CNS 손상, 예를 들어 척수 손상의 치료법 또는 치료법의 개발에 유용한 물질 및 방법을 제공하는 것이다.

발명의 개요

본 발명자들은 제1 양태로서 CNS 손상의 보조 치료법으로서, 또한 추가 치료법의 개발을 위해, 주요 마이엘린 단백질의 억제성 도메인과 상호작용하는 분자를 사용하는 방법을 제안한다.

본 발명자들은 제2 양태로서 CNS 손상의 보조 치료법으로서 주요 마이엘린 단백질의 억제성 도메인을 사용하여 피험체를 면역화하는 방법을 제안한다.

마이엘린 항원에 대하여 피험체를 면역화하는 것은 비현실적으로 보일 수 있는데, 이 방법이 자가면역 탈수초 질환을 유도하여 허용되지 않는 부작용을 초래할 수 있기 때문이다. 또한, 일부 마이엘린 항체는 재수초화를 촉진하며(Rodriguez et al., 1987), 이는 축색돌기가 재생되는 동안 유익하지 않다. 그러나 본 발명자들의 접근법은 전체 마이엘린 단백질이 아니라 주요 마이엘린 단백질의 특이적인 억제성 부분에 대한 백신에 기초한 것이다. 억제성 부분에 대해 생성된 항체는 축색돌기 재생에 대한 마이엘린의 억제 효과를 차단할 것이다.

제1 양태

따라서 본 발명은 아미노산 서열이 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인 펩티드를 제공한다.

YLTQPQS (서열 번호 1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7).

상기한 서열은 각각 파지 디스플레이에 의해, 뉴런 성장 억제성 분자 Nogo(구체적으로 Nogo-66 도메인), MAG 및 TN-R(구체적으로 TNR-EGFL) 중 하나 이상에 결합할 수 있는 것으로 확인된 몇 개의 펩티드의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다.

서열 번호 1은 Nogo-66에 결합할 수 있는 43개의 동일한 펩티드의 서열, 및 MAG에 결합할 수 있는 19개의 동일한 펩티드의 서열을 나타낸다.

서열 번호 2는 Nogo-66에 결합할 수 있는 8개의 동일한 펩티드의 서열을 나타낸다.

서열 번호 3은 TNR-EGFL에 결합할 수 있는 18개의 동일한 펩티드의 서열을 나타낸다.

서열 번호 4는 TNR-EGFL에 결합할 수 있는 3개의 동일한 펩티드의 서열을 나타낸다.

서열 번호 5는 TNR-EGFL에 결합할 수 있는 1개의 동일한 펩티드의 서열을 나타낸다.

서열 번호 6은 TNR-EGFL에 결합할 수 있는 1개의 동일한 펩티드의 서열을 나타낸다.

서열 번호 7은 MAG에 결합할 수 있는 5개의 동일한 펩티드의 서열을 나타낸다.

이들 중에서 서열 번호 1은 시험관내 분석에서 뉴런 세포 부착에 대한 Nogo-66 및 MAG의 억제 효과를 차단하는 것으로 파지 결합에 의해 확인되었다. 유사하게, 서열 번호 3은 TNR-EGFL의 억제 효과를 차단하는 것으로 확인되었다. 따라서 바람직한 펩티드는 서열 번호 1로 구성되며; 또 다른 바람직한 펩티드는 서열 번호 3이다.

본 발명은 또한 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 길이가 아미노산 60개 이하인 펩티드를 제공한다:

YLTQPQS (서열 번호 1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7)

여기서, 상기 펩티드는 Nogo(바람직하게는 Nogo-66), MAG 및/또는 TN-R(바람직하게는 TNR-EGFL)에 결합할 수 있다.

바람직하게는, 상기 펩티드는 길이가 아미노산 50개 이하, 더욱 바람직하게는 40개 이하, 30개 이하, 25개 이하, 20개 이하, 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 또는 8개 이하이다.

바람직한 펩티드는 서열 번호 1을 포함한다; 또 다른 바람직한 펩티드는 서열 번호 3을 포함한다.

본 발명은 또한 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 내의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 5개 이상 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 길이가 아미노산 60개 이하인 펩티드를 제공한다:

YLTQPQS (서열 번호 1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7)

상기 펩티드의 바람직한 크기는 전술한 바와 같다. 서열 번호 1의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 5개 이상 갖는 펩티드, 또는 서열 번호 3의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 5개 이상 갖는 펩티드가 바람직하다.

바람직하게는, 동일한 잔기의 최소 수는 6이다.

본 발명은 또한 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분과 함께 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직하게는 이 조성물은 생체내에 주사하기 위해, 바람직하게는 CNS에 직접 주사하기 위해 제형화된다.

본 발명은 또한 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 이러한 용도는 CNS 손상의 치료법에, 특히 척수 손상 및 뇌졸중의 치료법에 적용될 수 있다.

본 발명은 또한 CNS 손상, 특히 척수 손상 및 뇌졸중의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 펩티드의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 CNS 손상의 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 환자의 CNS 손상 부위에 또는 그 부근에 본 발명의 펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 SCI 또는 뇌졸중의 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 서열 번호 1 또는 3으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩티드를, 환자의 SCI 또는 뇌졸중 손상 부위에 직접 주사함으로써 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 뉴런 성장 억제성 분자 Nogo(바람직하게는 Nogo-66), MAG 및/또는 TN-R(바람직하게는 TNR-EGFL) 중 하나 이상에 결합할 수 있는 모방체를 디자인함에 있어서의 본 발명의 펩티드 및/또는 이의 컴퓨터 생성 모델의 용도를 제공한다.

유사하게, 본 발명은 본 발명의 펩티드의 모방체를 디자인하는 방법을 제공하는데, 상기 모방체는 뉴런 성장 억제성 분자 Nogo(바람직하게는 Nogo-66), MAG 및/또는 TN-R(바람직하게는 TNR-EGFL) 중 하나 이상에 결합할 수 있으며, 상기 방법은

(i) 뉴런 성장 억제성 분자 Nogo(바람직하게는 Nogo-66), MAG 및/또는 TN-R(바람직하게는 TNR-EGFL) 중 하나 이상에 결합할 수 있는 본 발명의 펩티드를 분석하여, 활성에 필수적이고 중요한 아미노산 잔기를 결정하여, 약리활성점(pharmacophore)을 규정하는 단계; 및

(ii) 약리활성점을 모델링하여, 생물학적 활성을 갖는 후보 모방체를 디자인 및/또는 스크리닝하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 본 방법 및/또는 용도는 시험관내에서 Nogo(바람직하게는 Nogo-66), MAG 및/또는 TN-R(바람직하게는 TNR-EGFL)에 대한 후보 모방체의 결합을 분석하는 단계를 포함한다. 그와 같이 시험관내 결합을 할 수 있는 후보 모방체를 동정한 후에 후보 모방체는 생체내 사용을 위해 최적화하는 것이 바람직하다. 그러한 최적화 후에, 최적화된 모방체는 바람직하게는 약학적으로 허용되는 하나 이상의 성분과 함께 제형화한다.

본 발명은 또한 펩티드가 박테리오파지 비리온의 표면 상에 디스플레이되도록 펩티드 및 박테리오파지 코트 단백질로 이루어진 융합 단백질을 발현하는 박테리오파지를 제공하는데, 상기 펩티드는 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 4개 이상 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 길이가 아미노산 60개 이하이다:

YLTQPQS (서열 번호 1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7).

바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 길이가 아미노산 50개 이하, 더욱 바람직하게는 40개 이하, 30개 이하, 25개 이하, 20개 이하, 또는 15개 이하이다. 더욱 더 바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 길이가 아미노산 8∼12개이고, 더욱 바람직하게는 6∼10개이다. 바람직하게는, 동일한 잔기의 최소 수는 5 또는 6이다.

본 발명은 또한 Nogo(바람직하게는 Nogo-66), MAG 및/또는 TN-R(바람직하게는 TNR-EGFL)에 결합할 수 있는 펩티드를 스크리닝하는 방법을 제공하는데, 이 방법은

각각 상이한 펩티드를 발현하는 본 발명의 박테리오파지를 제공하는 단계; 및

Nogo(바람직하게는 Nogo-66), MAG 및/또는 TN-R(바람직하게는 TNR- EGFL)에 결합할 수 있는 능력에 대해 박테리오파지를 스크리닝하는 단계를 포함한다.

그 후 Nogo(바람직하게는 Nogo-66), MAG 및/또는 TN-R(바람직하게는 TNR-EGFL)에 결합할 수 있는 것으로 확인된 박테리오파지, 또는 이들이 디스플레이하는 펩티드는 시험관내 분석에서 뉴런 세포 부착에 대한 Nogo(바람직하게는 Nogo-66), MAG 및/또는 TN-R(바람직하게는 TNR-EGFL)의 억제 효과를 차단하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 시험관내 분석에서 뉴런 세포 부착에 대한 Nogo(바람직하게는 Nogo-66), MAG 및/또는 TN-R(바람직하게는 TNR-EGFL)의 억제 효과를 차단할 수 있는 펩티드(또는 펩티드를 디스플레이하는 파지)의 확인 후에, 펩티드는 바람직하게는 생체내 투여를 위해 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 제형화한다.

본 발명은 또한 TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 감소시킬 가능성이 있는 인자들을 탐색하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 내의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 5개 이상 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 확인하기 위해 서열 데이터베이스를 검색하는 것을 포함한다:

YLTQPQS (서열 번호 1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7).

상기 데이터베이스는 바람직하게는 cDNA 데이터베이스이다. 이것은 EST 데이터베이스일 수 있다. 바람직하게는 이것은 포유동물 CNS에서 발현되는 서열들의 데이터베이스이다. 덜 특이적인 데이터베이스는 더 그릇된 양의 결과를 산출할 수 있지만, 이것 역시 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 감소시킬 가능성이 있는 인자들을 탐색하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 내의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 5개 이상 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다:

YLTQPQS (서열 번호1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7).

상기 cDNA 라이브러리는 바람직하게는 포유동물 라이브러리이며, 더욱 바람직하게는 인간의 라이브러리이다. 라이브러리는 바람직하게는 CNS 조직으로부터 유래된 것이다.

상기한 두 가지 방법 각각은 바람직하게는 후보 폴리펩티드 또는 후보 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 확인 후에, TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 감소시킬 수 있는 능력에 대해 폴리펩티드를 테스트하는 단계를 포함한다. 바람직한 추가 단계는 전술한 바와 같다.

제2 양태

제2 양태에 있어서 본 발명은 하기 (a)∼(d)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 벡터를 제공한다:

(a) Nogo-A의 N-말단(NogoN) 도메인;

(b) Nogo-B의 세포외 루프(Nogo66)(Nogo-A 및 Nogo-C에도 존재함);

(c) MAG의 제3∼제5 면역글로불린 유사 반복체; 및

(d) TN-R의 EGF 유사 도메인.

TN-R EGF-L 도메인은 Xiao 등(1996)에 의해 뉴런 세포 계통 및 1차 뉴런의 시험관내 신경돌기 성장을 억제할 수 있는 것으로 확인되었다.

벡터는 포유동물 세포에서 상기 핵산의 발현에 필요한 제어 서열들을 포함한다. 바람직하게는 벡터는 벡터 내에 상기 핵산이 삽입되어 있는 백신 벡터이다. 적합하고 바람직한 시판용 백신 벡터는 pcDNA 3.1 벡터 패밀리, 특히 pcDNA 3.1⁺, 및 pVAX1(모두 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐에서 시판됨)을 포함한다.

일반적으로 핵산은 DNA이다.

바람직하게는, 핵산은 도메인 중 2개 이상, 더욱 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 모두를 코딩한다. 핵산은 도메인 중 어느 하나 이상의 복수개의 카피를 코딩할 수 있다.

핵산이 하나 이상의 도메인을 코딩하는 경우, 그 도메인은 바람직하게는 융합 폴리펩티드로서 발현된다. 바람직하게는 도메인은 도메인의 정확한 폴딩을 촉진하기 위해 가요성 링커(바람직하게는 폴리-Ala 링커, 예를 들어 Ala₃ 링커)로부터 서로 이격되어 있다.

단백질 Nogo A, Nogo B, TN-R 및/또는 MAG(및/또는 바람직하게는 Nogo-C) 중에서, 벡터는 표시된 도메인만 실질적으로 발현할 수 있는 것이 바람직하다. Nogo N은 Nogo A 동형체의 도메인이다. Nogo 66은 3 가지의 모든 동형체, 즉 Nogo-A, Nogo-B 및 Nogo-C에서 발견되는 도메인이다. 특히, 벡터는 단백질의 다른 에피토프 함유 부분을 발현할 수 없는 것이 바람직하다. 단백질 Nogo A, Nogo B, TN-R 및/또는 MAG(및/또는 바람직하게는 Nogo-C) 중에서, 벡터는 상기한 도메인의 외부에 위치하는 단백질을 20% 이하, 더욱 바람직하게는 15% 이하, 12% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하 발현하는 것이 바람직하다. 이것은 단백질 중 단 하나의 도메인 또는 도메인들을 포함하는 벡터에 대해 특히 바람직하다.

Nogo A, Nogo B, Nogo C, TN-R 및 MAG의 아미노산 서열은 GenBank로부터, 예를 들어 하기 수탁 번호로 시판된다:

MAG - X05301 (GI 56611)

TN-R - Z67996 (GI 1261914)

Nogo B - AJ251384 (GI 9408097)

Nogo A - AF320999 (GI 11878297)

Nogo C - CAB99250 (GI 9408100)

도메인은 바람직하게는 하기에 나타낸 아미노산 서열, 즉 도메인 (c)의 경우 MAG의 508 잔기 아미노산 서열(1∼508); 도메인 (d)의 경우 TNR의 205 잔기 아미노산 서열(125∼329); 도메인 (a)의 경우 Nogo N의 185 아미노산 서열(1∼185); 및 도메인 (b)의 경우 Nogo 66의 66 아미노산 서열(823∼888)을 갖는다.

벡터는 바람직하게는 아미노산 서열 MAG(1∼508)-Ala_n-TNR(125∼329)-Ala_n-NogoN(1∼185)-Ala_n-Nogo66(823∼888)(서열 번호 12)(여기서, Ala_n은 폴리알라닌 링커를 나타내고, n은 바람직하게는 3임)를 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.

도메인은 바람직하게는 하기의 서열, 즉 도메인 (c)의 경우 MAG의 508 코돈 핵산 서열(126∼1649); 도메인 (d)의 경우 TNR의 205 코돈 핵산 서열(454∼1068); 도메인 (a)의 경우 NogoN의 185 코돈 핵산 서열(1∼155); 및/또는 도메인 (b)의 경우 Nogo66의 66 코돈 핵산 서열(2467∼2664)에 의해 코딩되는 것이 바람직하다.

이 서열은 출발 코돈으로 시작되며, 임의의 다른 서열이 핵산의 5' 말단에 사용된다면 출발 코돈이 필요할 것이다. 물론, 이것을 소정의 임의의 핵산 서열로 삽입 조작하는 것은 당 분야의 통상적인 기술이며, 단, Nogo(1∼555) 역시 출발 코돈으로 시작된다는 것에 유념해야 한다.

그러나, 이러한 특이적인 도메인의 단편, 유도체 또는 변형체 역시 유효한 백신을 생성할 것으로 생각된다. 따라서 본 발명의 범주에 속하는 폴리펩티드 도메인은 상기한 4개 아미노산 서열 중 어느 하나의 단편일 수 있으며, 이 단편은 바람직하게는 상기 서열로부터의 15개 이상의 연속 아미노산, 더욱 바람직하게는 17개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상 또는 60개 이상의 아미노산으로 이루어진다. MAG, NogoN 및 TNR의 경우, 단편의 크기는 더욱 바람직하게는 80개 이상, 더욱 바람직하게는 100개 이상, 120개 이상, 140개 이상, 160개 이상 또는 180개 이상의 아미노산이다. TNR 및 MAG의 경우, 그 길이는 더욱 바람직하게는 200개 아미노산이다. MAG의 경우, 그 길이는 더욱 바람직하게는 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상 또는 450개 이상의 아미노산이다. 단편은 그 서열이 상기에 제시된 특이적인 도메인의 하나 이상의 에피토프를 포함하며, 생체내에서 항체 반응을 생성할 수 있는 도메인의 능력을 보유할 것이다. 따라서 본 단편은 상응하는 도메인과 교차 반응하는 항체를 생체내에서 생성할 수 있다. 선형 에피토프 맵핑은 당업자의 통상적인 기술 수준에 속한다.

마찬가지로, 본 발명의 범주에 속하는 폴리펩티드 도메인은 상기에 제시된 어느 하나의 아미노산 서열(기준 아미노산 서열)의 변형체일 수 있다. 이러한 점에서, 변형체는 기준 아미노산 서열과 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드이며, 단 이것은 기준 서열의 해당 부분과 65% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 15개 이상의 아미노산의 일부를 포함한다. 바람직하게는, 동일성 수준은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%이다. 바람직하게는, 상기 부분은 길이가 17개 이상의 아미노산이며, 보다 바람직한 길이는 단편의 길이에 대하여 전술한 단락에서 제시한 것이다. 역시, 변형체는 일반적으로 그 서열이 상기에 제시된 특이적 도메인의 하나 이상의 에피토프를 포함하며, 생체내에서 항체 반응을 생성할 수 있는 도메인의 능력을 보유할 것이다. 따라서, 변형체는 해당 도메인과 교차 반응하는 항체를 생체내에서 생성할 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 (치료용) 백신으로서 사용하기 위한, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분과 함께 제형화된 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는 이 조성물은 주사에 의한 투여용으로 제형화된다.

본 발명은 또한 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 벡터를 제공한다. 치료는 CNS 손상, 특히 SCI 또는 뇌졸중의 치료일 수 있다.

본 발명은 또한 CNS 손상, 특히 SCI 및 뇌졸중의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 치료용 백신으로서 환자에게 본 발명의 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 환자의 CNS 손상을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 벡터는 통상적으로 주사에 의해 투여되지만, 다른 백신 전달 방법이 당 분야에 공지되어 있고(예컨대 경구 또는 경피 전달 방법 및 "무바늘" 주사), 이러한 방법들이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 주사는 통상적으로 근육내 주사이다. 혈액-뇌 장벽은 일반적으로 항체의 통과에 장애물이 되기 때문에, CNS 손상(특히, 상해, 예를 들어 외상)은 일반적으로 항체가 손상 부위에서 혈액-뇌 장벽을 관통할 수 있게 한다. 따라서 본 발명의 벡터에 의한 백신접종에 반응하여 생성된 항체가 혈액-뇌 장벽을 관통하는 데에는 특수한 조치가 요구되지 않는 것으로 간주된다.

본 발명은 또한 하기 (a)∼(d)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드 도메인으로 실질적으로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다:

(a) Nogo-A의 N-말단(NogoN) 도메인;

(b) Nogo-B의 세포외 루프(Nogo-A 및 Nogo-C에도 존재함);

(c) MAG의 제3∼제5 면역글로불린 유사 반복체; 및

(d) TN-R의 EGF 유사 도메인.

상기 폴리펩티드의 바람직한 특징은 벡터에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대해 상기에 정의된 바와 같다.

본 발명은 또한 (치료용) 백신으로서 사용하기 위해 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 제형화된 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는 이 조성물은 주사 투여용으로 제형화된다.

본 발명은 또한 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다. 치료는 CNS 손상, 특히 SCI 또는 뇌졸중의 치료일 수 있다,

본 발명은 또한 CNS 손상, 특히 SCI 및 뇌졸중의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 치료용 백신으로서 환자에게 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 환자의 CNS 손상을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

투여는 바람직하게는 벡터에 대해 전술한 바와 동일하다.

본 발명은 또한 도메인 (a)∼(d) 중 어느 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 또는 바람직하게는 도메인 (a)∼(d) 중 2개, 3개 또는 4개 모두에 함께 결합할 수 있는 항체들의 혼합물을 CNS 손상, 특히 SCI 또는 뇌졸중의 치료에 사용하는 유사한 방법 및 용도를 제공한다. 본 항체는 항체 반응을 생성하기 위해 핵산 또는 폴리펩티드 백신을 투여하는 대신에, 환자에게 직접 투여된다(바람직하게는 제1 양태의 펩티드에 대한 것과 같이, 예를 들어 CNS로의 직접 주사, 손상 부위로의 직접 주사, 또는 뇌-척수액으로의 직접 주사에 의함). 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편은 본 목적을 위한 항체인 것으로 간주된다.

펩티드

"펩티드"란 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된 인접한 아미노산들의 쌍인 몇 개의 아미노산으로 이루어진 분자를 의미한다. 펩티드 결합은 -CO-NH- 구조를 갖는다. 아미노산은 자연 발생 또는 비 자연발생일 수 있다. 말단 아미노산은 말단 변형을 포함할 수 있다. 자연 발생 키랄 아미노산(즉, 비-키랄 글리신 이외의 아미노산)은 L-동형체이다. 그러나 본 발명의 펩티드는 D-동형체의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 그러한 D-아미노산은 자연 발생 L-아미노산의 D-동형체이거나 또는 자연 발생 L-동형체를 가지지 않을 수 있다. 본 발명의 펩티드 내에 D-아미노산이 포함되는 것은 생체내에서의 이 펩티드의 제거율을 감소시키는 데 도움이 될 수 있다.

펩티드의 합성

펩티드는 화학적 합성에 의해 전부 또는 일부 생성할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개괄적인 설명의 입수처가 광범위한, 잘 확립된 표준 액체상 또는 바람직하게는 고체상 펩티드 합성 방법에 따라 쉽게 제조할 수 있거나(참조 문헌: J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), in M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984); and Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California), 또는 이들은 액체상 방법에 의해 또는 고체상 방법, 액체상 방법 및 용액 화학을 병용하여 용액 중에서, 예를 들어 먼저 개개의 펩티드 부분을 완성하고 그 후 필요에 따라 적절하다면 존재하는 임의의 보호기를 제거한 후, 개개의 탄산 또는 설폰산 또는 이의 반응성 유도체의 반응에 의한 잔기 X의 도입에 의해 제조할 수 있다.

파지 디스플레이

파지 디스플레이는 항체 수용체 또는 기타 결합 단백질에 대한 강한 결합을 위해 짧은 펩티드를 수천만 개 조사할 수 있는 분자생물공학에 있어서 최신의 유망한 기법이다. 파지 디스플레이는 1985년에 처음 소개되었으며(Smith et al, 1985), 펩티드 또는 단백질이 박테리오파지의 코트 단백질과의 융합체로서 발현되어 비리온의 표면 상에 융합된 단백질의 디스플레이를 유도하는 한편, 융합체를 코딩하는 DNA는 비리온 내에 존재하게 하는 선별 기법이다. 파지 디스플레이는 랜덤 펩티드 서열의 광대한 라이브러리와 각 서열을 코딩하는 DNA 간의 물리적 결합을 생성하여 패닝(panning)으로 불리는 시험관내 선별 방법에 의해 다양한 표적 분자에 대한 펩티드 리간드의 신속한 확인을 가능하게 한다(Scott et al, 1990; Arap et al, 1998).

특정 단백질 도메인을 관련시키는 상호작용(단백질/단백질 또는 단백질/비단백질 상호작용)은 일반적으로 8∼12개의 아미노산만을 필요로 하며, 이 중에서 5∼8개 아미노산이 중요한 역할을 한다. 6∼10개의 아미노산 잔기의 펩티드를 디스플레이하는 파지 디스플레이 라이브러리는 에피토프 맵핑, 단백질-단백질 접촉 맵핑, 비-단백질 리간드의 펩티드 모방체의 동정 및 신규 백신 및 신규 약물의 디자인을 비롯하여 다수의 용도에 성공적으로 사용되어 왔다(Scott et al, 1990; Cwirla et al, 1990; Devlin et al 1990; Felici et al, 1991; Motti et al, 1994; Hong et al, 1995; Arap et al, 1998; Nilsson et al, 2000).

최근의 연구는 표적으로서 광범위한 효소를 사용하여 분리된 일련의 펩티드가 각 표적에 대하여 유사한 아미노산 서열을 포함하고 경쟁 분석에 의해 표적당 1개 또는 2개의 부위에 결합한다는 것을 보여 주었다. 테스트한 17개 펩티드 중에서, 13개가 효소 기능의 특이적인 억제제인 것으로 확인되었다. 파지 디스플레이를 사용하여 확인된 펩티드 대용 리간드는 효소 기능을 억제하는 제한된 수의 부위에 우선적으로 표적화된다(Hyde-DeRuyscher et al, 2000).

모방체

비-펩티드 "소 분자"는 흔히 생체내 의약 용도를 위한 펩티드로 선호된다. 따라서 본 발명의 펩티드의 모방체는 의약 용도를 위해 디자인될 수 있다.

공지된 약리 활성 화합물에 대한 모방체의 디자인 작업은 "선도" 화합물에 기초한 의약 개발에 대한 공지된 접근법이다. 이것은 활성 화합물이 합성하기가 어렵거나 비용이 많이 들거나 또는 특정 투여 방법에 부적합한 경우, 예를 들어 펩티드의 경우처럼 소화관에서 프로테아제에 의해 신속히 분해되는 경향이 있기 때문에 경구용 조성물에 부적합한 활성제인 경우에 바람직할 수 있다. 모방체 디자인, 합성 및 테스트는 일반적으로 표적 특성에 대해 다수의 분자들을 무작위적으로 스크리닝하는 것을 피하는 데 이용된다.

소정의 표적 특성을 갖는 화합물로부터 모방체를 디자인하는 데에는 통상적으로 몇 단계가 이용된다. 첫째, 표적 특성을 결정하는 데 있어서 필수적 및/또는 중요한 화합물의 특정한 부분을 결정한다. 펩티드의 경우, 이것은, 예를 들어 각 잔기를 순차적으로 치환함으로써 펩티드 내의 아미노산 잔기를 체계적으로 변화시켜 수행할 수 있다. 펩티드의 알라닌 스캔은 통상적으로 그러한 펩티드 모티프를 정제하는 데 이용된다. 화합물의 활성 영역을 구성하는 이러한 부분 또는 잔기들은 화합물의 "약리활성점"으로 알려져 있다.

일단 약리활성점이 발견되면, 일군의 공급원으로부터의 데이터를 이용하여, 예를 들어 분광분석 기법, X-선 회절 데이터 및 NMR을 이용하여 물리적 특성, 예를 들어 입체화학, 결합, 크기 및/또는 전하에 따라 그 구조를 모델링한다. 컴퓨터 분석, 유사성 맵핑(원자들 간의 결합이 아니라 약리활성점의 전하 및/또는 부피를 모델링함) 및 기타 기법들을 이러한 모델링 과정에 이용할 수 있다.

이러한 방법의 변형법에서는, 리간드의 3 차원 구조 및 그 결합 파트너를 모델링한다. 이것은 리간드 및/또는 결합 파트너가 결합 시 배좌를 변화시켜, 그 모델이 모방체의 디자인에 있어 이를 고려하는 경우에 특히 유용하다.

그 후 주형 분자를 선별하여 그 위에 약리활성점을 모방하는 화학 기를 그래프팅할 수 있다. 주형 분자 및 그 위에 그래프팅된 화학 기는 편의상 모방체의 합성이 용이하도록 선별할 수 있으며, 약리학적으로 허용될 수 있을 것이며, 선도 화합물의 생물학적 활성을 유지하면서 생체내에서 분해되지 않는다. 대안으로, 모방체가 펩티드에 기초한 것인 경우, 펩티드를 고리화하여 그 강성도를 강화시켜 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다. 이러한 방법에 의해 확인된 모방체 또는 모방체들은 그 후 이들이 표적 특성을 갖는 지, 또는 이들이 어느 정도로 표적 특성을 나타내는 지를 알기 위해 스크리닝할 수 있다. 그 후 추가의 최적화 또는 변형을 수행하여 생체내 또는 임상적 테스트를 위해 하나 이상의 최종 모방체에 도달할 수 있다.

서열 동일성

기준 서열에 대한 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성은, 최대 퍼센트 서열 동일성에 도달하기 위해 서열을 정렬하고, 필요에 따라, 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고, 기준 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 서열의 백분율로서 정의된다. % 동일성 값은 WU-BLAST-2(Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996))에 의해 결정할 수 있다. WU-BLAST-2는 대부분이 디폴트 값으로 설정된 몇 개의 검색 파라미터를 이용한다. 조정 가능한 파라미터는 하기의 값에 따라 설정한다: 중복 범위 = 1, 중복 비율 = 0.125, 워드 한계치(T) = 11. % 아미노산 서열 동일성 값은 WU-BLAST-2에 의해 결정된 바와 같은 일치하는 동일한 잔기들의 수를 기준 서열의 총 잔기수(정렬 점수를 최대화하기 위해 WU-BLAST-2에 의해 기준 서열로 도입된 갭은 무시함)로 나누고 100을 곱하여 결정한다.

엄격한 조건

엄격한 조건은 (1) 세척에 저 이온 강도 및 고온을 이용하는 것, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 설페이트를 이용하는 것; (2) 하이브리드화 시에 변성제, 예컨대 포름아미드를 이용하는 것, 예를 들어 42℃에서 0.1% 송아지 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/760 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)을 함유하는 50%(v/v) 포름아미드를 이용하는 것; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트로 세척하고, 42℃에서 0.2 x SSC(염화나트륨/시트르산나트륨)로 세척하고, 55℃에서 50% 포름아미드로 세척하고, 그 후 55℃, EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 이루어진 고 엄격도 세척 조건으로 세척하는 것을 이용하는 것에 의해 확인할 수 있다.

피험체

본 발명의 조성물 및/또는 치료제가 투여되는 피험체는 포유동물, 바람직하게는 설치류와 같은 실험 동물(예를 들어 토끼, 래트 또는 마우스), 개, 고양이, 원숭이 또는 유인원, 또는 농장 동물, 예컨대 소, 말, 양, 돼지 또는 염소이다. 보다 바람직하게는 피험체는 인간이다.

일반적으로 피험체는 CNS 손상, 통상 CNS 손상, 예를 들어 머리 손상을 갖는다. 그러나 더욱 바람직하게는 손상은 척수 손상, 예를 들어 SCI이다. 실험 동물에서 손상은 실험적인 것일 수 있다. CNS 손상은 또한 질병 또는 장애, 예를 들어 간질, 뇌졸중 또는 신경퇴행성 질환, 학습 기억 관련 장애 및/또는 알츠하이머병 또는 파킨슨병과 같은 치매로부터 발생한 것일 수 있다.

본 발명의 치료법은 다른 치료법, 예를 들어 수술 및/또는 재활과 병행하여 사용하기 위한 것이다.

제형

본 발명의 펩티드, 모방체 및 벡터는, 이에 국한되는 것은 아니지만 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제, 완충제, 보존제 및 안정화제를 비롯하여 당 분야에 공지된 하나 이상의 기타 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 상기에 정의된 바와 같은 하나 이상의 활성 화합물을 포함하는 약학 제형(예, 조성물, 제제, 약제)으로서 제공되는 것이 바람직하다. 이 제형은 다른 활성제를 추가로 포함할 수 있다.

따라서 본 발명은 당 분야에 공지된 약학적으로 허용되는 성분들, 예를 들어 담체, 보조제, 부형제 등과 함께 본 발명의 하나 이상의 펩티드 또는 벡터를 혼합하는 것을 포함하는, 상기에 정의된 바와 같은 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본원에 사용되는 "약학적으로 허용되는"이란 용어는 지나친 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제 또는 합병증을 수반하지 않고 해당 피험체(예, 인간)의 조직과 접촉시키는 데 사용하기에 적합하며, 합리적인 이익/위험비와의 균형이 잡힌 분별있는 의학적 판단의 범위에 속하는, 화합물, 성분, 물질, 조성물, 제형 등을 의미한다. 각각의 담체, 보조제, 부형제 등 역시 제형의 다른 성분들과 화합성이라는 측면에서 "허용되는" 것이어야 한다.

적합한 담체, 보조제, 부형제 등은 표준 약학 참고서, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994]에서 찾아볼 수 있다.

제형은 적합하게는 주사 가능한 제형, 예를 들어 활성 화합물이 용해되어 있는 수성, 등장성, 무발열원, 멸균 용액일 수 있다. 그러한 액체는 추가로 다른 약학적으로 허용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 완충제, 보존제, 안정화제, 항균제, 현탁제, 증점제, 및 제형이 혈액 또는 뇌척수액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있다. 그러한 제형에 사용하기 위한 적합한 등장성 담체의 예로는 염화나트륨 주사액, 링거액, 또는 락테이트 링거 주사액을 들 수 있다. 통상적으로, 상기 액체 중의 활성 화합물의 농도는 약 1 ng/ml∼약 10 ㎍/ml, 예를 들어 약 10 ng/ml∼약 1 ㎍/ml이다. 이 제형은 단위 용량 또는 다중 용량의 밀폐된 용기, 예를 들어 앰풀 및 바이알에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균액 담체(예를 들어 주사수)의 첨가만을 요하는 동결건조 상태로 보관될 수 있다. 즉석 주사 용액 또는 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조할 수 있다.

투여

본 발명 펩티드의 투여는 일반적으로 주사에 의해, 바람직하게는 CNS에 직접 주사함으로써 투여한다. 주사는 손상 부위, 예를 들어 손상 부위로 직접 주사할 수 있다. 대안으로, 주사는 뇌척수액으로, 통상적으로 상처 부위 부근의 뇌척수액으로 주사할 수 있다.

이하에서는 본 발명의 기초가 되는 실험적 연구 및 본 발명의 실시 형태를, 첨부하는 도 1을 참고하여 단지 예시를 위해 설명할 것이다. 도 1은 단백질 MAG, TN-R 및 Nogo로부터 억제 도메인을 분리하기 위해 사용된 프라이머를 도시한다. 코딩 서열(또는 상보 가닥)은 진하게 표시하였다. 출발(Met) 및 종결(***) 코돈은 두 줄의 밑줄로 표시하였다. 제한 부위는 밑줄로 표시하였다. 서열 번호는 다음과 같다:

프라이머 서열 번호

MAG1 17

MAG2 18

TNR1 19

TNR2 20

NogoN1 21

NogoN2 22

Nogo66-1 23

Nogo66-2 24

생성된 PCR 생성물의 분해 및 순차 결합에 의해 얻어진 생성된 구조체(서열 번호 25) 역시 개략적으로 도시하였다. 제한 부위는 밑줄로 표시하였다. Ala-코딩 코돈은 표지를 하였다. 각 억제성 도메인에 대한 코딩 서열은 괄호 안의 도메인명으로 표시하였다. 종결 코돈은 ***로 표시하였다.

제1 양태, 실시예 1

억제 특성을 담당하는 Nogo 도메인의 확인

반발 분석

NG108 세포(마우스 신경아세포종-래트 신경교종 하이브리드 세포, 미국 버지니아주 매너사스 소재의 미국 모식균 배양 수집소에서 수탁 번호 ATCC HB-12317로 시판됨)를 Nogo1-25, Nogo1-50, Nogo1-66 및 GST-Nogo-66 및 대조군으로서 GST를 사용하여 코팅된 기재 상에 도말하였다. 단독으로서 또는 GST와의 융합 단백질로서의 Nogo의 재조합 도메인의 생성 및 정제에 대해서는 이전에 기술된 바 있다(Xiao ZC et al, 1996).

NG108 세포는 Nogo1-50, Nogo1-66, 및 GST-Nogo-66으로부터 유의적으로 반발되었으나, Nogo1-25 및 GST로부터는 반발되지 않았다.

신경돌기 성장 분석

NG108 세포를 Nogo1-25, Nogo1-50, Nogo1-66, 및 GST-Nogo-66 및 대조군으로서 GST를 사용하여 코팅된 기재 상에 도말하였다.

NG108 세포의 신경돌기 성장은 Nogo1-50, Nogo1-66, 및 GST Nogo-66으로부터는 유의적으로 억제되었으나, Nogo1-25 및 GST로부터는 억제되지 않았다.

제1 양태, 실시예 2

파지 디스플레이 기법을 통한 뉴런 성장 억제성 분자 TN-R, MAG, 및 Nogo에 대한 신규한 짧은 펩티드의 스크리닝

성체 마우스 뇌로부터의 TN-R, MAG 및 Nogo의 정제는 공지된 바와 같이 면역친화성 크로마토그래피에 의해 수행하였다(Pesheva, P et al, 1989). GST와의 융합 단백질로서의 TN-R, MAG, Nogo의 재조합 도메인의 생성 및 정제는 공지된 바와 같이 수행하였다(Xiao ZC et al, 1996). 이러한 모든 단백질들은 Ph.D-7TM 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 리미티드)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 신속 스크리닝을 위한 파지 결합 표적으로서 사용하였다.

요약하면, 상이한 펩티드 서열들을 디스플레이하는 파지 라이브러리를 표적 단백질로 코팅된 평판에 노출시켰다. 비결합 파지는 세척해 내고, 특이적으로 결합된 파지는 pH를 낮추어 용출시켰다. 용출된 파지의 풀은 증폭시켰고, 이 과정을 3∼4회 반복하였다.

친화성 선별 3∼4회 후에, 몇 개의 특이적 파지 클론을 7량체 랜덤 펩티드 파지가 디스플레이된 라이브러리로부터 분리하여 ELISA에 의해 확인하였다. 특이적 파지 클론의 펩티드 코딩 서열은 자동 서열 분석에 의해 확인하였다. 표적 단백질에 특이적으로 결합한 펩티드의 서열들을 얻었다.

각 파지로 7량체 펩티드 코딩 서열이 삽입된 파지 코트 단백질의 프레임워크 서열은 다음과 같다:

...은 7량체 펩티드 코딩 서열의 삽입 부위를 나타낸다. Kpn1 부위는 밑줄로 표시하였고, Eag1 부위는 두 줄의 밑줄로 표시하였다.

예시적인 7량체 펩티드 코딩 서열은 하기에 나타내었다. "n"은 제시된 서열을 갖는 펩티드를 디스플레이하는 분리된 파지의 수를 나타낸다(단, 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 코딩 핵산 서열 내에 약간의 가변성이 존재할 수 있다). "SIN"은 "서열 번호"의 약어이며, 펩티드 서열을 지칭한다. 핵산 서열의 서열 번호는 28∼35이다.

제1 양태, 실시예 3

뉴런 부착에 대한 Nogo, MAG 및 TN-R의 억제 효과를 감소시키는 펩티드를 디스플레이하는 파지에 대한 시험관내 분석

직경 3.5 cm의 조직 배양 페트리 디쉬(벡턴 디킨슨)를 Lagenaur 및 Lemmon (1987)에 따라 메탄올 가용화된 니트로셀룰로스로 코팅하고, 멸균 후드에서 공기 건조시켰다. 그 후 페트리 디쉬를 5 ㎍/ml의 폴리-DL-오르니틴을 함유하는 PBS와 함께 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 그 후에, 디쉬를 PBS로 3회 세척하고 멸균 후드에 공기 건조시켰다.

단백질 스팟(5 μM GST, 5 μM GST-Nogo66, 100 μM Nogo66, 100 μM Nogo1-50 또는 100 μM Nogo1-25 1.5 ㎕)을 페트리 디쉬의 니트로셀룰로스 코팅 표면에 적용하고, 함습 대기 하에 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 스팟을 PBS로 3회 세척하였다. 그 후 디쉬를 열 불활성화된 2% 탈지 BSA(시그마)를 함유하는 PBS로 수세하고, 남아있는 비특이적 단백질 결합 부위를 차단하기 위해 밤새 항온처리하였다.

그 후, 디쉬를 PBS로 세척하고, NG108 세포를 2.5 x 10⁵ 밀도로 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 2 ml에 도말하고, 함습 대기 하에 37℃에서 항온처리하였다. 12 시간 후, 디쉬를 PBS로 3회 가볍게 세척하고, 2.5% 글루타르알데히드를 함유하는 PBS로 수세하여 세포를 고정시켰다. 고정 후, 배양물을 2.5% 탄산나트륨 중의 0.5% 톨루이딘 블루(시그마)로 염색하였다. 그 후 염색된 배양물은 물로 3회 세척하고 공기 건조시켰다.

다양한 스팟에 부착한 세포의 사진을 찍어 그 갯수를 세었다. 모든 실험은 3회 이상 수행하였다. 통계 분석은 스튜던트 검정으로 수행하였다. 유의성 수준은 p < 0.05로서 선택하였다.

GST-Nogo66, Nogo66 및 Nogo1-50은 모두 GST에 비하여 유의적으로 감소된 NG108 세포 총계를 나타내었으나, Nogo1-25은 그렇지 않았다.

NG108 세포는 단일 세포 현탁액으로서 폴리-DL-오르니틴 처리된 조직 배양 페트리 디쉬에 도말하였다. 전술한 바와 같은 Nogo66-, MAG- 및 TNR-결합 펩티드를 디스플레이하는 특이적 파지를 세포 배양물에 첨가하였다. 세포는 고정 및 톨루이딘 블루를 사용한 염색 전에 24 시간 동안 유지시켰다. 세포 부착은 전술한 바와 같이 측정하였다.

펩티드 YLTQPQS(서열 번호 1)를 디스플레이하는 파지는 NG108 세포 결합에 대한 Nogo-66 및 MAG의 억제 효과를 차단할 수 있었다; 펩티드 TQLFPPQ(서열 번호 3)를 디스플레이하는 파지는 NG108 세포 결합에 대한 TNR-EGFL의 억제 효과를 차단할 수 있었다.

제1 양태, 실시예 4

뉴런 부착에 대한 Nogo, MAG 및 TN-R의 억제 효과를 감소시키는 펩티드에 대한 시험관내 분석

스크리닝된 모든 컨센서스 펩티드는 펩티드 합성기 모델 1000을 사용하여 고체상 방법을 이용하여 합성하였다. 신경돌기 성장 및 성장 원추 반발 분석은 공지된 바와 같이 수행하였다(Xiao ZC et al, 1997). 정제된 완전한 TN-R, MAG 및 Nogo 및 TN-R, MAG 및 Nogo의 재조합 도메인을 기질로서 코팅하여 TN-R, MAG 및 Nogo의 억제 도메인의 확인을 가능하게 하였다. 추가 분석에서는, 합성된 펩티드를 코팅 전에 해당 단백질/도메인과 혼합하여 시험관내에서 TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 중화시킬 수 있는 펩티드를 확인한다.

제1 양태, 실시예 5

척수 손상을 완화시킬 수 있는 펩티드에 대한 생체내 테스트

시험관내에서 TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 중화시킬 수 있는 짧은 컨센서스 펩티드를 이들이 척수 손상을 완화시키는 지를 확인하기 위해 생체내에서 사용한다(Bregman et al, 1995). 이들 펩티드는 척수가 손상된 성체 래트에 주사한다. 축색돌기의 재생은 미처리 대조군과 비교하여 면역조직화학에 의해 분석한다. 기능 향상 역시 분석한다.

제1 양태, 실시예 6

TN-R, MAG, 및/또는 Nogo의 억제 효과를 파괴할 수 있는 후보 인자에 대한 스크리닝

시험관내 및/또는 생체내(바람직하게는 둘 다)에서 TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 중화시킬 수 있는 펩티드에 대하여 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열들을 결정한다. 이 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열들을 사용하여 EST 데이터베이스(바람직하게는 CNS 유래 EST의 데이터베이스)를 검색한다. 표지된 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 CNS cDNA 라이브러리를 스크리닝한다. 히트는 TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 파괴할 수 있는 후보 인자를 나타낸다. 이러한 후보 인자는 GST-융합 단백질로서 정제하며, 중화 효과는 이 펩티드에 대해 전술한 바와 같이 테스트한다.

생체내 중화 효과를 테스트하는 대안의 방법은 후보 인자로 형질감염된 뉴런을 실험 동물의 손상된 척수로 이식하여 중화 결과를 관찰하는 것이다.

그 결과, TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 파괴할 수 있는 새로운 인자를 얻었고, 이것은 CNS 손상, 특히 척수 손상의 치료 또는 치료 방법의 개발에 유용하다.

제2 양태, 실시예 1

벡터 구성

하기 도메인들을 코딩하는 핵산을 PCR에 의해 얻었다: Nogo-A의 N-말단 및 66-Aa 세포외 도메인, 인간 TNR의 MAG 및 EGF 유사 도메인의 제3∼제5의 Ig 유사 도메인.

PCR 프라이머는 제한 효소 부위를 포함하고, 부분 클로닝된 서열의 말단에 Ala 링커를 코딩하도록 디자인하였다(도 1 참조). 그 결과, PCR 생성물이 제한 효소에 의해 이중 분해되고 그 후 순차적으로 결합되었을 때, Ala 링커를 코딩하는 DNA는 이웃 도메인의 각 쌍 사이에 위치하였다(역시 도 1 참조). Ala 링커는 도메인의 정확한 폴딩을 촉진한다.

그 후, 순차적으로 결합된 DNA를 BamH I 및 Xba I으로 이중 분해하고, 이어서 pcDNA 3.1 벡터(인비트로겐)에 삽입하여 재조합 벡터를 생성하였다. 재조합 벡터는 아가로스 젤 또는 서열 분석에 의해 확인하였다.

제2 양태, 실시예 2

시험관내 재조합 벡터의 억제 기능의 확인

DNA 백신을 테스트 동물에 주사하기 전에, 그 백신이 포유동물 세포에 의해 발현될 수 있고 세포가 숙주의 면역계를 자극하도록 분비될 수 있는 지를 확인하기 위해 시험관내 테스트를 수행하여야 한다.

이를 확인하기 위해, COS-1 세포를 재조합 벡터로 형질감염시켰다. 일시적 발현 후에, 세포 및 배지를 각각 수집하고, 억제성 분자에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하여(Xiao et al, 1996), 벡터가 백신으로서 생체내에 투여될 경우 재조합 단백질이 세포 밖으로 분비되고 숙주 면역계를 자극하기 위한 항원으로서 작용할 수 있는 지를 확인하였다.

형질감염된 세포는 비형질감염 세포에 비해 MAG 및 TNR 항체에 대해 양성인 것으로 검출되었다. Nogo에 대한 면역반응성은 형질감염 및 비형질감염 세포 둘 다에서 검출되었다.

재조합 플라스미드로 일시적 형질감염시킨 지 48 시간 후, 배지를 수집하고, 단백질 A-아가로스를 사용하여 항-NogoN 또는 항-TNR-EGFL 항체로 면역침전시켰다. 침전물은 10% 및 6% SDS-PAGE로 분리하고, Nogo 및 TNR에 대하여 각각 프로빙(probing)하였다. 각 침전물은 해당 항체에 대하여 면역반응성을 나타내었으며, 이는 그 단백질이 분비된다는 것을 나타낸다.

제2 양태, 실시예 3

면역전 혈청 및 항-혈청을 사용한 GST 융합 단백질의 도트-블롯

재조합 플라스미드로 2 개월 백신 접종한 후 루이스 래트로부터 항-혈청을 수집하였다. 일련의 농도의 GST-Nogo66, GST-NogoN, GST-TNR/EGFL, GST-MAG Ig3-5 및 GST를 기질로서 도팅(dotting)하고, 이어서 혈청으로 블로팅하였다. 항혈청은 GST 융합 단백질은 특이적으로 인식하였으나, GST는 인식하지 않았다. 면역전 혈청은 융합 단백질 및 GST 둘 다 인식하지 않았다.

제2 양태, 실시예 4

DNA 백신으로서의 재조합 벡터의 시험

DNA 백신으로 면역화한 후 손상된 척수의 재생을 확인하기 위해, 재조합 DNA 벡터를 테스트 동물에 주사한다. 면역화된 동물의 항혈청을 분석하여 DNA 백신 주사 후의 면역 반응을 확인한다.

척수 손상에 대한 반-절개 모델을 사용한다. 일정 시간 후, 손상된 척수 뉴런/축색돌기의 형태 조사 및 동물의 거동 조사를 수행한다.

(1) 면역화 및 척수 손상

6 주령의 암컷 루이스 래트에 이전 실시예로부터의 재조합 벡터 100 ㎍을 주 1회 주사하여 면역화한다. 삽입체가 없는 pcDNA3.1 벡터는 대조군으로서 사용한다. 벡터는 래트의 등에 주사한다. 래트가 항혈청을 생성한 후, 척수를 손상시킨다. 래트는 6주간 더 주 2회 면역화를 계속한다.

래트를 솜니톨(체중 20 g당 1 mg)로 마취시키고, 하부 흉추 추궁절제술을 수행한다(T9). 그 후 미세 가위를 사용하여 척수의 등쪽 1/2을 절개하여 피질척수로를 분할한다. 각 병변의 깊이는 약 1 mm이며, 미세 가위의 끝에 표시된 마크에 의해 추정한다. 손상 후 6 주간 생존시킨 후에, 래트를 마취시키고, 5% WGA-HRP(맥아 어글루티닌-호스래디쉬 퍼옥시다제) 용액을 공지된 바와 같이 감각 운동 피질에 주사한다(Li et al., 1996). WGA-HRP를 주사한 지 48 시간 후에, 동물들을 심장내 관류에 의해 희생시키고, 척수의 세로 동결 절편을 HRP 조직화학에 대하여 공지된 바와 같이 반응시킨다(Li et al., 1996).

(2) 면역화된 동물들의 면역 반응의 확인

면역화된 동물들의 항혈청이 신경돌기 성장에 대한 억제성 도메인의 억제 효과를 차단하는 기능을 갖는 지를 확인하기 위해, 신경돌기 성장 분석을 이용하여 면역화된 동물들의 혈청을 테스트한다. 4-웰 디쉬를 먼저 가용화된 니트로셀룰로스로 코팅하고, 5 ㎍/ml 폴리-L-리신과 함께 사전 항온처리한다. GST 융합 억제성 도메인 또는 펩티드를 웰에 2 ㎕ 소적으로서 첨가하고, 그 후 37℃에서 4 시간 동안 항온처리한다. 그 후 이들 웰을 대조군 마우스 또는 DNA 백신으로 면역화한 마우스로부터의 혈청과 함께 4℃에서 밤새 항온처리한다. 혈청을 제거하고, 퍼콜 밀도 구배 원심분리에 의해 정제한 생후 10일된 래트의 소뇌 뉴런을 웰당 1 x 10⁶ 세포의 밀도로 도말한다. 세포를 무혈청의 화학적으로 정의된 배지에서 24 시간 동안 배양하고, 4% 포름알데히드로 고정시키고, 코마시 블루로 염색한다. 신경돌기 길이는 유니버설 이미지 I(Universal Image I) 이미지 분석기를 사용하여 측정한다. 데이터는 스튜던트-뉴먼-쿨 검정을 이용하여 분석하여 통계적으로 유의적인 차이를 결정한다(Li et al., 1996).

(3) 손상된 척수의 형태 조사

절개된 축색돌기의 재생을 확인하기 위해, 래트를 4% 포름알데히드로 관류시키고, 10 ㎛ 두께의 세로 동결 척수 절편을 젤라틴 코팅된 유리 슬라이드 위에 올린다. 절편을 비오틴화된 염소 항-래트 항체와 함께 밤새 항온처리하고, 이어서 스트렙타비딘-접합 플루오레세인과 1 시간 동안 항온처리하여 순환 항체를 검출한다.

(4) 동물들의 기능 테스트

실험용 래트의 기능 회복 역시 수행한다. 접촉 위치 반응(contact placing response)은 관절 전치를 유발하지 않으면서 뒷다리의 등 부분을 가볍게 건드려서 테스트한다. 그 후 동물들이 발을 들어 지지대 표면 위로 올려 놓는 능력을 3∼6회 반복하여 평가한다. 30%를 초과하는 반응은 양의 값으로 채점한다(Kukel-Bagden et al., 1993).

(5) 안전성 테스트

이러한 백신화 방법의 안전성은 테스트 동물들(비손상 및 손상)에 백신을 투여하고, 역효과, 특히 감각 또는 운동 기능의 손실 및 거동 또는 인식 손상을 관찰함으로써 평가한다.

CNS 조직은 자가면역 손상을 관찰하기 위해, 예를 들어 모노클로날 항-CNPase를 사용한 면역염색에 의해 조직학적으로 관찰한다(Sigma C5922, lot 71k4889). CNPase는 희소돌기아교세포에 의해 발현되는 단백질, 2',3'-시클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제이다.

전술한 발명은 명료함과 이해를 목적으로 예증 및 실시예에 의해 어느 정도 상세히 설명하였으나, 첨부된 청구범위의 정신 및 범주로부터 벗어나지 않도록 본 발명에 특정한 변화 및 변경이 가해질 수 있음은 본 발명의 교시의 견지에서 당업자에게 명백할 것이다.

본원에서 인용하는 모든 문헌들은 모든 목적을 위하여 그 전문을 본원에서 참고 문헌으로 포함한다.

참고 문헌

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Artificial sequence <220> <223> From a phage library that displays random 7-mers <400> 6 Tyr Thr Thr Pro Pro Ser Pro 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> From a phage library that displays random 7-mers <400> 7 Gln Leu Pro Leu Met Pro Arg 1 5 <210> 8 <211> 508 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 8 Met Ile Phe Leu Thr Thr Leu Pro Leu Phe Trp Ile Met Ile Ser Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gly His Trp Gly Ala Trp Met Pro Ser Ser Ile Ser Ala 20 25 30 Phe Glu Gly Thr Cys Val Ser Ile Pro Cys Arg Phe Asp Phe Pro Asp 35 40 45 Glu Leu Arg Pro Ala Val Val His Gly Val Trp Tyr Phe Asn Ser Pro 50 55 60 Tyr Pro Lys Asn Tyr Pro Pro Val Val Phe Lys Ser Arg Thr Gln Val 65 70 75 80 Val His Glu Ser Phe Gln Gly Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Leu Gly 85 90 95 Leu Arg Asn Cys Thr Leu Leu Leu Ser Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gly 100 105 110 Gly Lys Tyr Tyr Phe Arg Gly Asp Leu Gly Gly Tyr Asn Gln Tyr Thr 115 120 125 Phe Ser Glu His Ser Val Leu Asp Ile Ile Asn Thr Pro Asn Ile Val 130 135 140 Val Pro Pro Glu Val Val Ala Gly Thr Glu Val Glu Val Ser Cys Met 145 150 155 160 Val Pro Asp Asn Cys Pro Glu Leu Arg Pro Glu Leu Ser Trp Leu Gly 165 170 175 His Glu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Val Leu Gly Arg Leu Arg Glu Asp 180 185 190 Glu Gly Thr Trp Val Gln Val Ser Leu Leu His Phe Val Pro Thr Arg 195 200 205 Glu Ala Asn Gly His Arg Leu Gly Cys Gln Ala Ala Phe Pro Asn Thr 210 215 220 Thr Leu Gln Phe Glu Gly Tyr Ala Ser Leu Asp Val Lys Tyr Pro Pro 225 230 235 240 Val Ile Val Glu Met Asn Ser Ser Val Glu Ala Ile Glu Gly Ser His 245 250 255 Val Ser Leu Leu Cys Gly Ala Asp Ser Asn Pro Pro Pro Leu Leu Thr 260 265 270 Trp Met Arg Asp Gly Met Val Leu Arg Glu Ala Val Ala Glu Ser Leu 275 280 285 Tyr Leu Asp Leu Glu Glu Val Thr Pro Ala Glu Asp Gly Ile Tyr Ala 290 295 300 Cys Leu Ala Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Asp Asn Arg Thr Val Glu Leu 305 310 315 320 Ser Val Met Tyr Ala Pro Trp Lys Pro Thr Val Asn Gly Thr Val Val 325 330 335 Ala Val Glu Gly Glu Thr Val Ser Ile Leu Cys Ser Thr Gln Ser Asn 340 345 350 Pro Asp Pro Ile Leu Thr Ile Phe Lys Glu Lys Gln Ile Leu Ala Thr 355 360 365 Val Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Gln Leu Glu Leu Pro Ala Val Thr Pro 370 375 380 Glu Asp Asp Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Glu Asn Gln Tyr Gly Gln 385 390 395 400 Arg Ala Thr Ala Phe Asn Leu Ser Val Glu Phe Ala Pro Ile Ile Leu 405 410 415 Leu Glu Ser His Cys Ala Ala Ala Arg Asp Thr Val Gln Cys Leu Cys 420 425 430 Val Val Lys Ser Asn Pro Glu Pro Ser Val Ala Phe Glu Leu Pro Ser 435 440 445 Arg Asn Val Thr Val Asn Glu Thr Glu Arg Glu Phe Val Tyr Ser Glu 450 455 460 Arg Ser Gly Leu Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr Leu Arg Gly Gln Ala 465 470 475 480 Gln Ala Pro Pro Arg Val Ile Cys Thr Ser Arg Asn Leu Tyr Gly Thr 485 490 495 Gln Ser Leu Glu Leu Pro Phe Gln Gly Ala His Arg 500 505 <210> 9 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Cys Pro Cys Ala Ser Ser Ala Gln Val Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg 1 5 10 15 Ile Glu Met Leu Glu Arg Glu Val Ser Val Leu Arg Asp Gln Cys Asn 20 25 30 Ala Asn Cys Cys Gln Glu Ser Ala Ala Thr Gly Gln Leu Asp Tyr Ile 35 40 45 Pro His Cys Ser Gly His Gly Asn Phe Ser Phe Glu Ser Cys Gly Cys 50 55 60 Ile Cys Asn Glu Gly Trp Phe Gly Lys Asn Cys Ser Glu Pro Tyr Cys 65 70 75 80 Pro Leu Gly Cys Ser Ser Arg Gly Val Cys Val Asp Gly Gln Cys Ile 85 90 95 Cys Asp Ser Glu Tyr Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Leu Arg Cys Pro 100 105 110 Thr Asp Cys Ser Ser Arg Gly Leu Cys Val Asp Gly Glu Cys Val Cys 115 120 125 Glu Glu Pro Tyr Thr Gly Glu Asp Cys Arg Glu Leu Arg Cys Pro Gly 130 135 140 Asp Cys Ser Gly Lys Gly Arg Cys Ala Asn Gly Thr Cys Leu Cys Glu 145 150 155 160 Glu Gly Tyr Val Gly Glu Asp Cys Gly Gln Arg Gln Cys Leu Asn Ala 165 170 175 Cys Ser Gly Arg Gly Gln Cys Glu Glu Gly Leu Cys Val Cys Glu Glu 180 185 190 Gly Tyr Gln Gly Pro Asp Cys Ser Ala Val Ala Pro Pro 195 200 205 <210> 10 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro 1 5 10 15 Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu 20 25 30 Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp 35 40 45 Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser 50 55 60 Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp 65 70 75 80 Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95 Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro 100 105 110 Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val 115 120 125 Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro 130 135 140 Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr 145 150 155 160 Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro 165 170 175 Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val 180 185 <210> 11 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly 1 5 10 15 His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu 20 25 30 Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr 35 40 45 Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser 50 55 60 Leu Lys 65 <210> 12 <211> 973 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> VARIANT <222> (509)..(511) <223> Polyalanine linker. <220> <221> VARIANT <222> (717)..(719) <223> Polyalanine linker. <220> <221> VARIANT <222> (905)..(907) <223> Polyalanine linker. <400> 12 Met Ile Phe Leu Thr Thr Leu Pro Leu Phe Trp Ile Met Ile Ser Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gly His Trp Gly Ala Trp Met Pro Ser Ser Ile Ser Ala 20 25 30 Phe Glu Gly Thr Cys Val Ser Ile Pro Cys Arg Phe Asp Phe Pro Asp 35 40 45 Glu Leu Arg Pro Ala Val Val His Gly Val Trp Tyr Phe Asn Ser Pro 50 55 60 Tyr Pro Lys Asn Tyr Pro Pro Val Val Phe Lys Ser Arg Thr Gln Val 65 70 75 80 Val His Glu Ser Phe Gln Gly Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Leu Gly 85 90 95 Leu Arg Asn Cys Thr Leu Leu Leu Ser Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gly 100 105 110 Gly Lys Tyr Tyr Phe Arg Gly Asp Leu Gly Gly Tyr Asn Gln Tyr Thr 115 120 125 Phe Ser Glu His Ser Val Leu Asp Ile Ile Asn Thr Pro Asn Ile Val 130 135 140 Val Pro Pro Glu Val Val Ala Gly Thr Glu Val Glu Val Ser Cys Met 145 150 155 160 Val Pro Asp Asn Cys Pro Glu Leu Arg Pro Glu Leu Ser Trp Leu Gly 165 170 175 His Glu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Val Leu Gly Arg Leu Arg Glu Asp 180 185 190 Glu Gly Thr Trp Val Gln Val Ser Leu Leu His Phe Val Pro Thr Arg 195 200 205 Glu Ala Asn Gly His Arg Leu Gly Cys Gln Ala Ala Phe Pro Asn Thr 210 215 220 Thr Leu Gln Phe Glu Gly Tyr Ala Ser Leu Asp Val Lys Tyr Pro Pro 225 230 235 240 Val Ile Val Glu Met Asn Ser Ser Val Glu Ala Ile Glu Gly Ser His 245 250 255 Val Ser Leu Leu Cys Gly Ala Asp Ser Asn Pro Pro Pro Leu Leu Thr 260 265 270 Trp Met Arg Asp Gly Met Val Leu Arg Glu Ala Val Ala Glu Ser Leu 275 280 285 Tyr Leu Asp Leu Glu Glu Val Thr Pro Ala Glu Asp Gly Ile Tyr Ala 290 295 300 Cys Leu Ala Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Asp Asn Arg Thr Val Glu Leu 305 310 315 320 Ser Val Met Tyr Ala Pro Trp Lys Pro Thr Val Asn Gly Thr Val Val 325 330 335 Ala Val Glu Gly Glu Thr Val Ser Ile Leu Cys Ser Thr Gln Ser Asn 340 345 350 Pro Asp Pro Ile Leu Thr Ile Phe Lys Glu Lys Gln Ile Leu Ala Thr 355 360 365 Val Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Gln Leu Glu Leu Pro Ala Val Thr Pro 370 375 380 Glu Asp Asp Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Glu Asn Gln Tyr Gly Gln 385 390 395 400 Arg Ala Thr Ala Phe Asn Leu Ser Val Glu Phe Ala Pro Ile Ile Leu 405 410 415 Leu Glu Ser His Cys Ala Ala Ala Arg Asp Thr Val Gln Cys Leu Cys 420 425 430 Val Val Lys Ser Asn Pro Glu Pro Ser Val Ala Phe Glu Leu Pro Ser 435 440 445 Arg Asn Val Thr Val Asn Glu Thr Glu Arg Glu Phe Val Tyr Ser Glu 450 455 460 Arg Ser Gly Leu Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr Leu Arg Gly Gln Ala 465 470 475 480 Gln Ala Pro Pro Arg Val Ile Cys Thr Ser Arg Asn Leu Tyr Gly Thr 485 490 495 Gln Ser Leu Glu Leu Pro Phe Gln Gly Ala His Arg Ala Ala Ala Cys 500 505 510 Pro Cys Ala Ser Ser Ala Gln Val Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Ile 515 520 525 Glu Met Leu Glu Arg Glu Val Ser Val Leu Arg Asp Gln Cys Asn Ala 530 535 540 Asn Cys Cys Gln Glu Ser Ala Ala Thr Gly Gln Leu Asp Tyr Ile Pro 545 550 555 560 His Cys Ser Gly His Gly Asn Phe Ser Phe Glu Ser Cys Gly Cys Ile 565 570 575 Cys Asn Glu Gly Trp Phe Gly Lys Asn Cys Ser Glu Pro Tyr Cys Pro 580 585 590 Leu Gly Cys Ser Ser Arg Gly Val Cys Val Asp Gly Gln Cys Ile Cys 595 600 605 Asp Ser Glu Tyr Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Leu Arg Cys Pro Thr 610 615 620 Asp Cys Ser Ser Arg Gly Leu Cys Val Asp Gly Glu Cys Val Cys Glu 625 630 635 640 Glu Pro Tyr Thr Gly Glu Asp Cys Arg Glu Leu Arg Cys Pro Gly Asp 645 650 655 Cys Ser Gly Lys Gly Arg Cys Ala Asn Gly Thr Cys Leu Cys Glu Glu 660 665 670 Gly Tyr Val Gly Glu Asp Cys Gly Gln Arg Gln Cys Leu Asn Ala Cys 675 680 685 Ser Gly Arg Gly Gln Cys Glu Glu Gly Leu Cys Val Cys Glu Glu Gly 690 695 700 Tyr Gln Gly Pro Asp Cys Ser Ala Val Ala Pro Pro Ala Ala Ala Met 705 710 715 720 Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro Pro 725 730 735 Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu Asp 740 745 750 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp Leu 755 760 765 Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser Ala 770 775 780 Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp Phe 785 790 795 800 Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala Ala 805 810 815 Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro Val 820 825 830 Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val Ser 835 840 845 Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro 850 855 860 Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr Pro 865 870 875 880 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro Lys 885 890 895 Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Ala Ala Ala Arg Ile Tyr Lys Gly 900 905 910 Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala 915 920 925 Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr 930 935 940 Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg 945 950 955 960 Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys 965 970 <210> 13 <211> 1524 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 13 atgatattcc ttaccaccct gcctctgttt tggataatga tttcagcttc tcgagggggg 60 cactggggtg cctggatgcc ctcgtccatc tcagccttcg agggcacgtg tgtctccatc 120 ccctgccgtt tcgacttccc ggatgagctc agaccggctg tggtacatgg cgtctggtat 180 ttcaacagtc cctaccccaa gaactacccg ccagtggtct tcaagtcccg cacacaagtg 240 gtccacgaga gcttccaggg ccgtagccgc ctgttgggag acctgggcct acgaaactgc 300 accctgcttc tcagcacgct gagccctgag ctgggaggga aatactattt ccgaggtgac 360 ctgggcggct acaaccagta caccttctcg gagcacagcg tcctggacat catcaacacc 420 cccaacatcg tggtgccccc agaagtggtg gcaggaacgg aagtagaggt cagctgcatg 480 gtgccggaca actgcccaga gctgcgccct gagctgagct ggctgggcca cgaggggcta 540 ggggagccca ctgttctggg tcggctgcgg gaggatgaag gcacctgggt gcaggtgtca 600 ctgctacact tcgtgcctac tagagaggcc aacggccacc gtctgggctg tcaggctgcc 660 ttccccaaca ccaccttgca gttcgagggt tacgccagtc tggacgtcaa gtaccccccg 720 gtgattgtgg agatgaattc ctctgtggag gccattgagg gctcccacgt cagcctgctc 780 tgtggggctg acagcaaccc gccaccgctg ctgacttgga tgcgggatgg gatggtgttg 840 agggaggcag ttgctgagag cctgtacctg gatctggagg aggtgacccc agcagaggac 900 ggcatctatg cttgcctggc agagaatgcc tatggccagg acaaccgcac ggtggagctg 960 agcgtcatgt atgcaccttg gaagcccaca gtgaatggga cggtggtggc ggtagagggg 1020 gagacagtct ccatcctgtg ttccacacag agcaacccgg accctattct caccatcttc 1080 aaggagaagc agatcctggc cacggtcatc tatgagagtc agctgcagct ggaactccct 1140 gcagtgacgc ccgaggacga tggggagtac tggtgtgtag ctgagaacca gtatggccag 1200 agagccaccg ccttcaacct gtctgtggag tttgctccca taatccttct ggaatcgcac 1260 tgtgcagcgg ccagagacac cgtgcagtgc ctgtgtgtgg taaaatccaa cccggaaccc 1320 tccgtggcct ttgagctgcc ttcccgcaac gtgactgtga acgagacaga gagggagttt 1380 gtgtactcag agcgcagcgg cctcctgctc accagcatcc tcacgctccg gggtcaggcc 1440 caagccccac cccgcgtcat ttgtacctcc aggaacctct acggcaccca gagcctcgag 1500 ctgcctttcc agggagcaca ccga 1524 <210> 14 <211> 615 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tgtccatgtg ccagttcagc ccaggtgctg caggagctgc tgagccggat cgagatgctg 60 gagagggagg tgtcggtgct gcgagaccag tgcaacgcca actgctgcca agaaagtgct 120 gccacaggac aactggacta tatccctcac tgcagtggcc acggcaactt tagctttgag 180 tcctgtggct gcatctgcaa cgaaggctgg tttggcaaga attgctcgga gccctactgc 240 ccgctgggtt gctccagccg gggggtgtgt gtggatggcc agtgcatctg tgacagcgaa 300 tacagcgggg atgactgttc cgaactccgg tgcccaacag actgcagctc ccgggggctc 360 tgcgtggacg gggagtgtgt ctgtgaagag ccctacactg gcgaggactg cagggaactg 420 aggtgccctg gggactgttc ggggaagggg agatgtgcca acggtacctg tttatgcgag 480 gagggctacg ttggtgagga ctgcggccag cggcagtgtc tgaatgcctg cagtgggcga 540 ggacaatgtg aggaggggct ctgcgtctgt gaagagggct accagggccc tgactgctca 600 gcagttgccc ctcca 615 <210> 15 <211> 555 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 atggaagacc tggaccagtc tcctctggtc tcgtcctcgg acagcccacc ccggccgcag 60 cccgcgttca agtaccagtt cgtgagggag cccgaggacg aggaggaaga agaggaggag 120 gaagaggagg acgaggacga agacctggag gagctggagg tgctggagag gaagcccgcc 180 gccgggctgt ccgcggcccc agtgcccacc gcccctgccg ccggcgcgcc cctgatggac 240 ttcggaaatg acttcgtgcc gccggcgccc cggggacccc tgccggccgc tccccccgtc 300 gccccggagc ggcagccgtc ttgggacccg agcccggtgt cgtcgaccgt gcccgcgcca 360 tccccgctgt ctgctgccgc agtctcgccc tccaagctcc ctgaggacga cgagcctccg 420 gcccggcctc cccctcctcc cccggccagc gtgagccccc aggcagagcc cgtgtggacc 480 ccgccagccc cggctcccgc cgcgcccccc tccaccccgg ccgcgcccaa gcgcaggggc 540 tcctcgggct cagtg 555 <210> 16 <211> 198 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 aggatataca agggtgtgat ccaagctatc cagaaatcag atgaaggcca cccattcagg 60 gcatatctgg aatctgaagt tgctatatct gaggagttgg ttcagaagta cagtaattct 120 gctcttggtc atgtgaactg cacgataaag gaactcaggc gcctcttctt agttgatgat 180 ttagttgatt ctctgaag 198 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer MAG1 <400> 17 cgggatccat gatattcctt accaccct 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer MAG2 <400> 18 tccccgcggc tcggtgtgct ccctggaa 28 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer TNR1 <400> 19 tccccgcggc atgtccatgt gccagttca 29 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer TNR2 <400> 20 ttgcggccgc tggaggggca actgctga 28 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer NogoN1 <400> 21 ttgcggccgc aatggaagac ctggaccagt ct 32 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer NogoN2 <400> 22 aaactgcagc cactgagccc gaggagcccc t 31 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer Nogo66-1 <400> 23 aaactgcagc aaggatatac aagggtgt 28 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer Nogo66-2 <400> 24 gctctagatc acttcagaga atcaacta 28 <210> 25 <211> 2934 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct resulting from sequentially connected PCR products <400> 25 ggatccatga tattccttac caccctgcct ctgttttgga taatgatttc agcttctcga 60 ggggggcact ggggtgcctg gatgccctcg tccatctcag ccttcgaggg cacgtgtgtc 120 tccatcccct gccgtttcga cttcccggat gagctcagac cggctgtggt acatggcgtc 180 tggtatttca acagtcccta ccccaagaac tacccgccag tggtcttcaa gtcccgcaca 240 caagtggtcc acgagagctt ccagggccgt agccgcctgt tgggagacct gggcctacga 300 aactgcaccc tgcttctcag cacgctgagc cctgagctgg gagggaaata ctatttccga 360 ggtgacctgg gcggctacaa ccagtacacc ttctcggagc acagcgtcct ggacatcatc 420 aacaccccca acatcgtggt gcccccagaa gtggtggcag gaacggaagt agaggtcagc 480 tgcatggtgc cggacaactg cccagagctg cgccctgagc tgagctggct gggccacgag 540 gggctagggg agcccactgt tctgggtcgg ctgcgggagg atgaaggcac ctgggtgcag 600 gtgtcactgc tacacttcgt gcctactaga gaggccaacg gccaccgtct gggctgtcag 660 gctgccttcc ccaacaccac cttgcagttc gagggttacg ccagtctgga cgtcaagtac 720 cccccggtga ttgtggagat gaattcctct gtggaggcca ttgagggctc ccacgtcagc 780 ctgctctgtg gggctgacag caacccgcca ccgctgctga cttggatgcg ggatgggatg 840 gtgttgaggg aggcagttgc tgagagcctg tacctggatc tggaggaggt gaccccagca 900 gaggacggca tctatgcttg cctggcagag aatgcctatg gccaggacaa ccgcacggtg 960 gagctgagcg tcatgtatgc accttggaag cccacagtga atgggacggt ggtggcggta 1020 gagggggaga cagtctccat cctgtgttcc acacagagca acccggaccc tattctcacc 1080 atcttcaagg agaagcagat cctggccacg gtcatctatg agagtcagct gcagctggaa 1140 ctccctgcag tgacgcccga ggacgatggg gagtactggt gtgtagctga gaaccagtat 1200 ggccagagag ccaccgcctt caacctgtct gtggagtttg ctcccataat ccttctggaa 1260 tcgcactgtg cagcggccag agacaccgtg cagtgcctgt gtgtggtaaa atccaacccg 1320 gaaccctccg tggcctttga gctgccttcc cgcaacgtga ctgtgaacga gacagagagg 1380 gagtttgtgt actcagagcg cagcggcctc ctgctcacca gcatcctcac gctccggggt 1440 caggcccaag ccccaccccg cgtcatttgt acctccagga acctctacgg cacccagagc 1500 ctcgagctgc ctttccaggg agcacaccga gccgcggcat gtccatgtgc cagttcagcc 1560 caggtgctgc aggagctgct gagccggatc gagatgctgg agagggaggt gtcggtgctg 1620 cgagaccagt gcaacgccaa ctgctgccaa gaaagtgctg ccacaggaca actggactat 1680 atccctcact gcagtggcca cggcaacttt agctttgagt cctgtggctg catctgcaac 1740 gaaggctggt ttggcaagaa ttgctcggag ccctactgcc cgctgggttg ctccagccgg 1800 ggggtgtgtg tggatggcca gtgcatctgt gacagcgaat acagcgggga tgactgttcc 1860 gaactccggt gcccaacaga ctgcagctcc cgggggctct gcgtggacgg ggagtgtgtc 1920 tgtgaagagc cctacactgg cgaggactgc agggaactga ggtgccctgg ggactgttcg 1980 gggaagggga gatgtgccaa cggtacctgt ttatgcgagg agggctacgt tggtgaggac 2040 tgcggccagc ggcagtgtct gaatgcctgc agtgggcgag gacaatgtga ggaggggctc 2100 tgcgtctgtg aagagggcta ccagggccct gactgctcag cagttgcccc tccagcggcc 2160 gcaatggaag acctggacca gtctcctctg gtctcgtcct cggacagccc accccggccg 2220 cagcccgcgt tcaagtacca gttcgtgagg gagcccgagg acgaggagga agaagaggag 2280 gaggaagagg aggacgagga cgaagacctg gaggagctgg aggtgctgga gaggaagccc 2340 gccgccgggc tgtccgcggc cccagtgccc accgcccctg ccgccggcgc gcccctgatg 2400 gacttcggaa atgacttcgt gccgccggcg ccccggggac ccctgccggc cgctcccccc 2460 gtcgccccgg agcggcagcc gtcttgggac ccgagcccgg tgtcgtcgac cgtgcccgcg 2520 ccatccccgc tgtctgctgc cgcagtctcg ccctccaagc tccctgagga cgacgagcct 2580 ccggcccggc ctccccctcc tcccccggcc agcgtgagcc cccaggcaga gcccgtgtgg 2640 accccgccag ccccggctcc cgccgcgccc ccctccaccc cggccgcgcc caagcgcagg 2700 ggctcctcgg gctcagtggc tgcagcaagg atatacaagg gtgtgatcca agctatccag 2760 aaatcagatg aaggccaccc attcagggca tatctggaat ctgaagttgc tatatctgag 2820 gagttggttc agaagtacag taattctgct cttggtcatg tgaactgcac gataaaggaa 2880 ctcaggcgcc tcttcttagt tgatgattta gttgattctc tgaagtgatc taga 2934 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> M13 coliphage <400> 26 ttattcgcaa ttcctttagt ggtacctttc tattctcact ct 42 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> M13 coliphage <400> 27 ggtggaggtt cggccgaaac tgttgaaagt tgt 33 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary 7-mer peptide-encoding sequence <400> 28 tatctgacgc agcctcagtc g 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary 7-mer peptide-encoding sequence <400> 29 ggttctctgc ctcattcgct g 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary 7-mer peptide-encoding sequence <400> 30 acgcagctgt ttcctcctta g 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary 7-mer peptide-encoding sequence <400> 31 cattctattc ctgataatat t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary 7-mer peptide-encoding sequence <400> 32 catcatatgc ctcatgataa g 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary 7-mer peptide-encoding sequence <400> 33 tatacgacgc ctccgagtcc t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary 7-mer peptide-encoding sequence <400> 34 cagcttccgc ttatgcctcg t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary 7-mer peptide-encoding sequence <400> 35 acgcagctgt ttcctcctca g 21

Claims

아미노산 서열이 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인 펩티드:

YLTQPQS (서열 번호 1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7).
제1항에 있어서, 아미노산 서열은 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 것인 펩티드:

YLTQPQS (서열 번호 1); 및

TQLFPPQ (서열 번호 3).
하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 길이가 아미노산 60개 이하이며, Nogo, MAG 및/또는 TN-R에 결합할 수 있는 펩티드:

YLTQPQS (서열 번호 1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7).
제3항에 있어서, 아미노산 서열 YLTQPQS(서열 번호 1) 또는 TQLFPPQ(서열 번호 3)를 포함하는 것인 펩티드.
하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 내의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 5개 이상 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 길이가 아미노산 60개 이하이며, Nogo, MAG 및/또는 TN-R에 결합할 수 있는 펩티드:

YLTQPQS (서열 번호 1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7).
제5항에 있어서, 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 내의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 5개 이상 갖는 것인 펩티드:

YLTQPQS (서열 번호 1); 및

TQLFPPQ (서열 번호 3).
제5항 또는 제6항에 있어서, 동일한 잔기의 수가 6개 이상인 펩티드.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Nogo-66 및/또는 TNR-EGFL에 결합할 수 있는 것인 펩티드.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 길이가 아미노산 40개 이하인 펩티드.
제9항에 있어서, 길이가 아미노산 20개 이하인 펩티드.
제10항에 있어서, 길이가 아미노산 10개 이하인 펩티드.
하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분들과 함께, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 방법에 사용하기 위한 것인 펩티드.
CNS 손상 치료용 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 용도.
환자의 CNS 손상 부위 또는 그 부근에 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, CNS 손상의 치료 방법.
하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 환자의 척수 손상 부위 또는 뇌졸중 손상 부위에 직접 주사하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상 또는 뇌졸중의 치료 방법:

YLTQPQS (서열 번호 1); 및

TQLFPPQ (서열 번호 3).
뉴런 성장 억제성 분자 Nogo, MAG 및/또는 TN-R 중 하나 이상에 결합할 수 있는 모방체를 디자인함에 있어서의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 및/또는 컴퓨터 생성된 이의 모델의 용도.
(i) 뉴런 성장 억제성 분자 Nogo, MAG 및/또는 TN-R 중 하나 이상에 결합할 수 있는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 펩티드를 분석하여, 활성에 필수적이고 중요한 아미노산 잔기를 결정하여, 약리활성점(pharmacophore)을 규정하는 단계; 및

(ii) 약리활성점을 모델링하여, 생물학적 활성을 갖는 후보 모방체를 디자인 및/또는 스크리닝하는 단계

를 포함하는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 펩티드의 모방체를 디자인하는 방법으로서, 상기 모방체는 뉴런 성장 억제성 분자 Nogo, MAG 및/또는 TN-R 중 하나 이상에 결합할 수 있는 것인 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 시험관내에서 Nogo, MAG 및/또는 TN-R에 대한 후보 모방체의 결합을 분석하는 단계를 포함하는 것인 용도 또는 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 결합할 수 있는 후보 모방체를 확인한 후에, 생체내 사용에 대해 후보 모방체를 최적화하는 단계를 포함하는 것인 용도 또는 방법.
제20항에 있어서, 최적화된 모방체를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 제형화하는 것인 용도 또는 방법.
펩티드가 박테리오파지 비리온의 표면 상에 디스플레이되도록 펩티드 및 박테리오파지 코트 단백질로 이루어진 융합 단백질을 발현하는 박테리오파지로서, 상기 펩티드는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인 박테리오파지.
각각 상이한 펩티드를 발현하는 제22항의 박테리오파지를 제공하는 단계; 및

Nogo, MAG 및/또는 TN-R에 결합할 수 있는 능력에 대해 박테리오파지를 스크리닝하는 단계

를 포함하는, Nogo, MAG 및/또는 TN-R에 결합할 수 있는 펩티드를 스크리닝하는 방법.
제23항에 있어서, Nogo, MAG 및/또는 TN-R에 결합할 수 있는 것으로 확인된 박테리오파지, 또는 이들이 디스플레이하는 펩티드를 시험관내 분석에서 뉴런 세포 부착에 대한 Nogo, MAG 및/또는 TN-R의 억제 효과를 차단하는 능력에 대해 스크리닝하는 후속 단계를 포함하는 것인 방법.
제24항의 모든 단계를 포함하고, 시험관내 분석에서 뉴런 세포 부착에 대한 Nogo, MAG 및/또는 TN-R의 억제 효과를 차단할 수 있는 펩티드, 또는 펩티드를 디스플레이하는 파지를 확인한 후에, 생체내 투여를 위해 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 펩티드를 제형화하는 추가 단계를 포함하는 방법.
TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 감소시킬 가능성이 있는 인자들을 탐색하는 방법으로서, 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 내의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 5개 이상 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드또는 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 확인하기 위해 서열 데이터베이스를 검색하는 것을 포함하는 방법:

YLTQPQS (서열 번호 1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7).
TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 감소시킬 가능성이 있는 인자들을 탐색하는 방법으로서, 하기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 내의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 5개 이상 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함하는 방법:

YLTQPQS (서열 번호 1);

GSLPHSL (서열 번호 2);

TQLFPPQ (서열 번호 3);

HSIPDNI (서열 번호 4);

HHMPHDK (서열 번호 5);

YTTPPSP (서열 번호 6); 및

QLPLMPR (서열 번호 7).
제26항 또는 제27항에 있어서, 후보 폴리펩티드 또는 후보 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 확인한 후에, TN-R, MAG 및/또는 Nogo의 억제 효과를 감소시키는 능력에 대하여 폴리펩티드를 테스트하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제28항의 모든 단계를 포함하고, 시험관내 분석에서 뉴런 세포 부착에 대한 Nogo, MAG 및/또는 TN-R의 억제 효과를 차단할 수 있는 폴리펩티드를 확인한 후에, 생체내 투여를 위해 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 폴리펩티드를 제형화하는 추가 단계를 포함하는 방법.
(a) Nogo-A의 N-말단 도메인(NogoN), 또는 이의 변형체 또는 단편;

(b) Nogo-B의 세포외 루프(Nogo66), 또는 이의 변형체 또는 단편;

(c) MAG의 제3∼제5 면역글로불린 유사 반복체, 또는 이의 변형체 또는 단편; 및

(d) TN-R의 EGF 유사 도메인, 또는 이의 변형체 또는 단편

으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 벡터로서,

상기 단편은 상기 도메인으로부터의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하며, 상기 도메인의 하나 이상의 에피토프를 포함하며, 생체내에서 항체 반응을 생성할 수 있는 능력을 보유하며, 상기 변형체는 상기 도메인의 상응하는 부분에 대하여 65% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 15개 이상의 아미노산의 일부를 포함하는 것인 벡터.
제30항에 있어서, 핵산은 도메인 중 2개 이상을 코딩하는 것인 벡터.
제31항에 있어서, 도메인은 융합 폴리펩티드로서 발현되는 것인 벡터.
제32항에 있어서, 도메인은 가요성 링커에 의해 서로 분리되어 있는 것인 벡터.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 Nogo A, Nogo B, TN-R 및/또는 MAG 중에서, 벡터는 바람직하게는 제30항에 기재된 도메인 (a), (b), (c) 및/또는 (d)만 실질적으로 발현할 수 있는 것인 벡터.
제34항에 있어서, 벡터는 단백질의 다른 에피토프 함유 부분을 발현할 수 없는 것인 벡터.
제34항 또는 제35항에 있어서, 단백질 Nogo A, Nogo B, TN-R 및/또는 MAG 중에서, 벡터는 바람직하게는 제30항에 기재된 도메인 (a)∼(d) 외부에 위치하는 단백질의 20% 이하를 발현하는 것인 벡터.
제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 도메인 (a)는 NogoN의 아미노산 서열(1∼185)(서열 번호 10)을 가지고, 도메인 (b)는 Nogo66의 아미노산 서열(823∼888)(서열 번호 11)을 가지고, 도메인 (c)는 MAG의 아미노산 서열(1∼508)(서열 번호 8)을 가지고, 도메인 (d)는 TNR의 아미노산 서열(125∼329)(서열 번호 9)을 가지는 것인 벡터.
제30항에 있어서, 아미노산 서열 MAG(1∼508)-Ala_n-TNR(125∼329)-Ala_n-NogoN(1∼185)-Ala_n-Nogo66(823∼888)(서열 번호 12)(여기서, Ala_n은 폴리알라닌 링커를 나타냄)을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 벡터.
치료용 백신으로서 사용하기 위한, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 제형화된 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물.
제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 방법에 사용하기 위한 것인 벡터.
CNS 손상 치료용 약제의 제조에 있어서의 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항의 벡터의 용도.
치료용 백신으로서 환자에게 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항의 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 환자의 CNS 손상의 치료 방법.
제30항에 정의된 하나 이상의 폴리펩티드 도메인으로 실질적으로 이루어진 폴리펩티드.
제43항에 있어서, 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항의 벡터에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
치료용 백신으로서 사용하기 위한, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 제형화된 제43항 또는 제44항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
제43항 또는 제44항에 있어서, 치료 방법에 사용하기 위한 것인 폴리펩티드.
CNS 손상 치료용 약제의 제조에 있어서의 제43항 또는 제44항의 폴리펩티드의 용도.
치료용 백신으로서 환자에게 제43항 또는 제44항의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 환자의 CNS 손상의 치료 방법.
치료 방법에 사용하기 위한, 제37항에 정의된 도메인 (a)∼(d) 중 어느 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 또는 제37항에 정의된 도메인 (a)∼(d) 중 2개, 3개 또는 4개 모두에 결합할 수 있는 항체들의 혼합물.
CNS 손상 치료용 약제의 제조에 있어서의, 제37항에 정의된 도메인 (a)∼(d) 중 어느 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 또는 제37항에 정의된 도메인 (a)∼(d) 중 2개, 3개 또는 4개 모두에 결합할 수 있는 항체들의 혼합물의 용도.
제37항에 정의된 도메인 (a)∼(d) 중 어느 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 또는 제37항에 정의된 도메인 (a)∼(d) 중 2개, 3개 또는 4개 모두에 결합할 수 있는 항체들의 혼합물을 치료용 백신으로서 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 CNS 손상의 치료 방법.
치료용 백신에 사용하기 위한, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 제형화된, 제37항에 정의된 도메인 (a)∼(d) 중 어느 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 또는 제37항에 정의된 도메인 (a)∼(d) 중 2개, 3개 또는 4개 모두에 결합할 수 있는 항체들의 혼합물을 포함하는 조성물.
제12항, 제39항, 제45항 및 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 주사에 의한 투여용으로 제형화된 것인 조성물.
제13항, 제40항, 제46항 및 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 CNS 손상의 치료인 펩티드, 벡터, 폴리펩티드, 항체.
제13항, 제40항, 제46항 및 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 척수 손상 또는 뇌졸중의 치료인 펩티드, 벡터, 폴리펩티드, 항체.
제14항, 제41항, 제47항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 척수 손상 또는 뇌졸중의 치료인 용도.