KR20050086907A - 3중 작용 시약에 의해 연결된 작동성 및 친화성 기능을갖는 항림프종 표적화제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항림프종 항체에 접합된 시약을 포함하는 의약제 및 당해 의약제를 함유하는 키트, 의약제의 용도 및 림프종의 치료 방법에 관한 것이다. 당해 시약은 효능인자, 예를 들어, 항종양제 또는 진단 마커 및 제제를 체외 제거할 수 있게 하는 친화성 리간드를 포함할 수 있다. 3개의 성분들은 3중 작용성 링커에 의해 결합되어 있다.

Description

3중 작용 시약에 의해 연결된 작동성 및 친화성 기능을 갖는 항림프종 표적화제 {ANTILYMPHOMA TARGETING AGENTS WITH EFFECTOR AND AFFINITY FUNCTIONS LINKED BY A TRIFUNCTIONAL REAGENT}
본 발명은 항림프종 항체에 접합된 시약을 포함하는 의약제, 림프종을 치료하거나 진단하기 위한 키트, 당해 의약제의 용도 및 림프종의 치료 방법에 관한 것이다.
림프종은 림프계에 악성 종양 세포가 침투한 것이다. 림프계는 목, 겨드랑이 및 서혜부에 위치한 결절을 포함한다. 이들 결절은 혈관망에 의해 서로 연결되고 비장, 흉선, 편도선의 일부, 위 및 소장에 연결되기 때문에 단지 림프계의 일부일뿐이다. 혈관은 림프구를 함유하는 림프로 호칭되는 유체를 운반한다. 일단 악성 종양이 림프계의 어느 한 부위에서 개시되는 경우, 이는 흔히 검출되기 전에 림프계 나머지 전반에 걸쳐 전이된다.
각각의 유형의 암에 대한 질환 단계를 정의하기 위해 정확하고 국제적으로 협의된 기준이 있다. 림프종에 대해서, 이것은 얼마나 많은 림프절이 영향받았는지를 조사하는 것을 의미한다. 또한 림프종이 림프계 이외의 기타 기관으로 전이되었는지를 확인하는 것을 의미한다. 단계 I: 림프 결정의 한 군 또는 림프계 외부의 단일 기관 또는 부위에 국한된 암. 단계 II: 다이아프램(diaphragm)의 동일한 측면상의 모든 림프절의 2개 이상의 군내 암. 단계 III: 림프계 외부가 아닌 다이아프램 양 측면상의 암. 단계 IV: 림프계 외부로 광범위하게 전이된 암.
림프종은 세포 유형에 따라 많은 서브그룹으로 나누어진다. 일반적으로, 이들은 비호즈킨(non-Hodgkin's) 및 호즈킨(Hodgkin) 군으로 분류된다. 현재, 호즈킨 림프종은 비호즈킨 보다는 치료될 가능성이 높다. 비호즈킨 림프종은 B 세포 및 T 세포에서 유래하고 여기서, 모든 경우중 90%는 B 세포 유래이고 나머지 10%는 T 세포 유래이다.
모든 유형의 림프종에 대한 치료는 질환 유형, 단계 및 등급에 의존한다. 단계 및 등급은 하기에 명시되어 있다.
단계:
I: 골수와는 관련이 없는 암 부위.
II: 골수와는 관련이 없는 다이아프램 이상 또는 이하 모두의 2개의 부위.
III: 골수와는 관련이 없는 다이아프램 이상 또는 이하의 부위들.
IV: 골수가 영향받거나 암 세포가 림프계 외부로 전이됨.
등급:
고등급: 일반적으로 B 세포 및 T 세포 유형에서 발견됨.
중등급: 일반적으로 B 세포 및 T 세포 유형에서 발견됨.
저등급: 주로 B 세포 유형에서 발견됨.
림프종은 일반적으로 화학치료, 방사선, 수술 및/또는 골수 이식의 조합으로 치료된다. 치료율은 림프종의 유형 및 질환의 진행정도에 따라 크게 다양하다.
림프 조직은 신체 많은 부위에서 발견되기 때문에, 비호즈킨 림프종은 신체 거의 모든 부위에서 개시할 수 있다. 암은 간, 골수, 췌장 및 코를 포함하는 신체 거의 모든 기관 또는 조직으로 전이할 수 있다.
조직학을 기준으로, 비호즈킨 림프종은 2개의 군으로 나누어진다: 보다 서서히 성장하고 증상을 거의 나타내지 않는 지연성 림프종 및 보다 신속하게 성장하는 공격형 림프종.
림프종은 여포성 소형 접착된 세포 림프종, 성인 확산 혼합 세포 림프종, 여포성 혼합 세포 림프종, 성인 확산 거대 세포 림프종, 여포성 대형 세포 림프종, 성인 면역모세포성 대형 세포 림프종, 성인 확산 소형 접착된 세포 림프종, 성인 면역모세포성 림프종, 소형 림프구(경계 영역) 성인 소형 비접착된 림프종을 포함한다.
기타 유형의 지연성 비호즈킨 림프종/백혈병은 림프혈장모양 림프종, 단핵구모양 B 세포 림프종, 점막 연관 림프계 조직(MALT) 림프종, 비장 경계 영역 림프종, 모발 세포 백혈병 및 피부 T 세포 림프종(균상식육종/세자리(Sezary) 증후군)이다.
기타 유형의 공격형 비호즈킨 림프종은 역형성 대형 세포 림프종, 성인 T 세포 림프종/백혈병, 외투 세포 림프종, 정맥내 림프종증, 혈관면역모세포 T 세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 장 T 세포 림프종, 원발성 세로칸 B 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 림프모세포 림프종, 이식후 림프증식성 장애, 진정한 조직구 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종 및 원발성 삼출물 림프종이다. 공격형 림프종은 또한 HIV 양성(AIDS 관련 림프종)인 환자에게서 보다 흔히 나타난다.
재발성 성인 비호즈킨 림프종은 림프계에서 또는 신체 다른 부위에서 재발될 수 있다.
지연성 림프종은 공격형 림프종으로 재발할 수 있다. 공격형 림프종은 지연성 림프종으로서 재발할 수 있다.
비호즈킨 림프종(NHL)은 암 이환율 및 치사율에 있어서 5번째의 주요 원인이다[문헌참조: Wingo P, Tong T, Bolden S. Cancer statistics, 1995. CA Cancer J. clin 1995; 45, 8-30 & Parker SL, Tong T, Bolden S., Wingo PA. Cancer statistics, 1996. CA Cancer J. Clin 1996; 46:5-27]. 과거 20년에 걸쳐, 미국에서 만연된 당해 림프종은 급속히 증가하였다. 5년전에는, 52,000명 이상이 새롭게 진단되었고 NHL로 인해 23,000명이 사망하였으며 발생건수는 연간 7%의 비율로 증가하고 있다[문헌참조: Parker SL, Tong T, Bolden S., Wingo PA. Cancer statistics, 1996. CA Cancer J. Clin 1996; 46:5-27]. 이것은 과거 50년에 걸쳐 인구를 기반으로 새로운 NHL 건수가 150%증가하였음을 나타낸다.
압도적인 대다수의 환자(약 80%)는 B 세포 기원의 NHL을 갖는 환자를 구성한다[문헌참조: Harris N. L. , Jaffe E. S. , Stein H. et. al.. Lymphoma classifica- tion proposal: clarification [letter]. Blood 1995 ; 85: 857-860]. 진전된 단계의 중등급 및 고등급 림프종에 대해 다양하게 조합된 화학치료 섭생을 사용했음에도 불구하고 치료받은 환자중 약 절반이 완전히 치유되지 않거나 치유 후 결국 재발한다. 당해 상황은 거의 20년 동안 현저히 개선되지 않았다[문헌참조: Gordon LI, Harrington D, Andersen J, et. al. N. Engl. J. Med. 1992 ; 327: 1342-9 & Fisher RI, Gaynor ER, Dahlberg S, et. al. N. Engl. J. Med. 1993; 328: 1002-6].
표준 용량의 구제 화학치료요법을 사용한 치료는 거의 영구적으로 치유되도록 하지 못하였고 흔히 심각한 독성을 갖는다. 골수 이식과 함께 고용량의 화학치료요법이 전망이 있는 것으로 밝혀졌지만 모든 환자가 이러한 유형의 치료로부터 장기간의 수혜를 받을 수 있는 것은 아니다[문헌참조: Armitage JO. Blood 1989 ; 73: 1749-58]. 진전된 저등급의 림프종을 앓는 환자의 병에 효과적인 치료는 아직도 확실히 개발되지 못하였다[문헌참조: DeVite VT Jr. , Jaffe ES, Mauch P, Longo DL. Lymphocytic lymphomas. In: DeVita VT Jr. , Hellman S., Rosenberg SA. Eds. Cancer: principles and practice of oncology. 3rd ed. Vol. 2. Philadelphia: J. B. Lippincott, 1989 ; 1741-98]. 안트라사이클린 기본 화학치료 섭생을 사용한 치료는 중등급 및 고등급의 비호즈킨 림프종을 갖는 환자의 50 내지 90%를 완전히 치유시켰고 30 내지 60%가 장기간동안 질환 부재인 상태로 생존하였다.
불행하게도, 저등급의 림프종을 앓거나 재발된 임의의 유형의 림프종을 갖는 환자들은 통상적인 방법으로는 거의 치유될 수 없다[문헌참조: Armitage JO. N. Engl. J. Med. 1993 ; 328: 1023-30]. 골수 이식과 함께 고용량의 화학치료요법은 재발된 림프종을 앓는 환자중 10 내지 50%를 치유하지만 40 내지 80%가 다시 재발하고 5 내지 20%이 이식과 관련된 합병증으로 사망한다[문헌참조: Appelbaum FR, Sullivan KM, Buckner CD et. al. J. Clin. Oncol. 1987; 5: 1340-7 & Freedman AS, Takvorian T, Anderson KC et. al. J. Clin. Oncol. 1990 ; 8 : 784-91]. 대용량의 화학치료요법의 사용은 수용될 수 없는 이환율 및 치사율때문에 실행가능하지 못하였다[문헌참조: Bearman SI, Appelbaum FR, Bruchner CD. et. al. J. Clin. Oncol. 1988 ; 6: 1562-8].
의약제의 조직 또는 기관 특이적 국소화는 이의 효과적인 적용을 위해 매우 중요한 인자이다. 특정 조직 국소화의 결핍은 특히, 암 치료와 같은 특정 유형의 세포를 사멸시키는 효과가 요구되는, 세포독성 제제를 사용한 치료에서 중요하다.
숙주세포에는 유해하지 않고 종양 세포에 대해 특이적인 제제를 사용한 암의 치료는 종양학에서의 오랜 숙원이었다. 모노클로날 항체의 개발이 종양 표적화된 치료가 언젠가는 암의 치료에서 특정 역할을 수행할 수 있다는 희망을 제공했다. 실질적으로, 전망있는 결과가 여러 분야에서 제공되었지만 대부분의 치료 방식은 흔히 기술적으로 어려운 것으로 입증되었고 이의 효능은 실망스러웠고 흔히 소정의 악성 종양을 갖는 환자에게 광범위하게 적용될 수 없었다.
림프종을 앓는 환자의 치료는 예외이다. 진행된 단계 또는 재발된 저등급 비호즈킨 증후군(NHL)을 앓는 환자는 통상적인 방법을 사용하여 치유가능하지 않고 일반적으로 질환을 감소시키고 증상을 일시적으로 완화시키는데 요구되는 강도를 증가시키는 조합된 화학치료 섭생으로 치료된다. 방사선치료에 이어서 골수 이식과 조합된 극치사량의 화학치료요법을 사용한 최근 시도는 약 20%의 장기 질환 부재 생존율을 나타내었다[문헌참조: F. Applebaum et al, J. Clin. Oncol. 5: 1340, 1987]. 그러나, 당해 방식으로 치료된 대부분의 환자는 림프종 또는 치료 합병증으로 사망한다. 따라서, 비호즈킨 림프종을 치료하기 위한 새로운 전략이 요구된다. 이들 전략은 독성의 최소화와 더불어 치료 효과의 극대화를 겨냥해야만 한다.
한가지 방법은 약제 또는 방사선동위원소를 종양 세포로 표적화하는 수단으로서 종양 관련 항원을 인지하는 모노클로날 항체의 사용을 포함한다. 당해 방법은 특히, 림프종 종양 세포는 이의 세포 표면상에 표적될 수 있는 종양 특이적인 다양한 항원을 나타냄으로써 NHL의 경우에 매력적이다[문헌참조: A. J. McMichael, Leukocyte Typing III, pp 302-363 and 432-469, Oxford University Press, Oxford, England, 1987]. 당해 방법을 사용하는 근거는 추가로 모노클로날 자체가 생체내에서 항종양 효과를 나타낼 수 있다는 관찰에 의해 지지된다. 지금까지 모노클로날 항체로 치료된 모든 악성 종양중에서, 림프종은 가장 인상적인 결과를 초래하였다. 모노클로날 항유전자형 항체로 처리된 환자에서 종양이 상당히 퇴화된다는 것이 보고되었다[문헌참조: R. A Miller et, New Eng. J. Med. 306: 517,1982 ; T. C. Meeker et al, Blood 65: 1349,1985]. 그러나, 대부분의 종양 반응은 불완전하였고 비교적 짧게 지속되었다. 항유전자형 항체를 제조하는데 있어서 실질적인 문제점이 당해 방법의 사용을 제한한다[문헌참조: T. Meeker et al, New. Eng. J. Med 312: 1658,1985].
최근에, 악성 종양과 정상적인 인간 B 세포 둘다의 항원 부위를 인지하는 다수의 모노클로날 항체가 개발되었다. 이들 범 B-세포 항체들은 림프종을 분류하고 정상 B 세포의 개체발생 및 생물학을 규명하는데 있어서 유용하다.
일반적으로 비변형된 항체의 제한된 효능때문에, 최근에는 세포독성 제제와 접합된 항체를 사용하는 것에 관심이 집중되었다. 고려될 수 있는 세포독성 제제중에는, 특히, 방사선동위원소가 매력적인데 그 이유는 림프종이 특히, 방사선의 효과에 민감하기 때문이다. 더욱이, 당해 방사선표지된 항체는 종양 관련 부위를 진단적으로 영상화한다는 측면에서, 상당히 유용할 수 있다. 당해 세포독성 항림프종 항체 대부분은 CD20에 대해 유도된다.
CD20은, 말초 혈액 또는 림프 기관으로부터 기원하는 90% 초과의 B 세포 표면상에 발견되는 35킬로돌턴의 비당화된 인단백질인 항원이다. 항원은 실질적으로 배양물에 유지되는 모든 휴지기의 B 세포 표면상에서 발현되지만 단백질 A에 의한 세포의 활성화와 또는 엡스타인 바르 바이러스로의 노출에 의해 대략 집단의 3분의 1에서는 소실된다. 이러한 결과는 CD20이 B 세포의 말기 분화동안에 소실됨을 의미하는 것으로 해석된다[문헌참조: L. M. Nadler, Lymphcyte typing II, vol 2 pp 3-37 and 65 Appendix, E. L. Renling et al eds Springer Verlag, 1986].
CD19와 같은 다수의 기타 항원은 또한 B 가계의 세포 표면상에서 발현된다. 그러나, CD20과는 반대로, CD19에 결합하는 항체는 신속하게 내재화된다. 당해 유형의 세포로 결합함으로써 동정된 기타 항체는 CD21 항원에 결합하는 B2; CD22 항원에 결합하는 B3 및 CD10 항원에 결합하는 J5이다. 범 B 세포 항체 MB-1은 또한 관심대상이고 CD37과 결합하는 것으로 밝혀져있다.
CD20에 대해 유도된 나체(naked) 항체는 효율적인 것으로 밝혀졌다. 하나의 등록된 나체 항체인 리툭시맵(Rituximab)은 지연성 림프종의 치료, 특히, 여포성 림프종에서 효율적인 것으로 밝혀진 키메라 마우스/인간 항-CD20 항체이다. 지연성 림프종을 갖는 환자에 대한 전체 반응율은 50%이고 완전한 반응율은 10%이다[문헌참조: McLaughlin P et al, J. Clin. Oncol. 16: 2825-2833,1998.]. 진행 시간은 13개월인 것으로 보고되었다. 리툭시맵은 또한 낮은 반응율에도 불구하고 공격형 림프종을 실재적으로 경감시킨다. 그럼에도 불구하고, 단일 제제로서 리툭시맵으로 처리된 모든 환자는 결국 재발한다.
전신 방사선 치료요법은 확립된 치료 형태이다. 갑상선의 파종성 암의 치료에서 방사선 요오드의 사용은 흔히 치료의 본보기이다. 방사선면역치료(RIT)는, 방사선핵종이 항체에 의해 종양 세포로 표적화되는 전신 방사선 치료의 또 다른 형태이다. 몇몇 경우에, RIT는, 항체 자체가 항종양 효과를 발휘할 수 있기 때문에 방사선치료와 면역치료간의 조합된 형식이다. RIT의 사용은 아직 실험적인 것이지만 몇몇 대담한 연구가 보고되었다. B 세포 림프종의 치료에서, 몇몇 군은 RIT 후 장기간 경감되어 있는 것으로 보고되었다. 대부분의 연구자는 CD20 항원에 대해 유도된 131I 또는 90Y 표지된 마우스 항체를 사용하였다[문헌참조: Kaminski, M. S. et al, J. Clin. Oncol., 14: 1974-1981,1996, Knox, S. J et al, Clin. Cancer Res. , 2: 457-470,1996.]
B 세포 림프종의 치료를 위한 키메라 및 방사선표지된 항체의 치료적 적용은 앤더슨, 디.알. 등이 보고하였다[문헌참조: Anderson, D. R. et. al. 유럽 특허 제0 752 248 B1호; 유럽 특허 제669 836 B1호 및 미국 특허 제5,843, 439호; 제5,776, 456호; 제5,736, 137호.]. B 세포 특이적 항체를 투여하는 림프종 치료 방법은 가민스키, 엠.에스등[문헌참조: Kaminski, M. S. et. al. 미국 특허 제5,595, 721호; 제6,015, 542호; 제5,843, 398호; 제6,090, 365호] 및 골덴버그 디.엠.등[문헌참조: 미국 특허 제6,183,744 B1호]이 보고하였다. 주요 요지와 관련된 기타 특허 및 특허 출원은 미국 특허 제6,399, 061 B1호, 유럽 특허 제1 005 870 A2호, WO 98/42378, WO 99/57981, WO 00/09160, WO 00/27428, WO 00/27433, WO 01/34194 Al, WO 01/10462 Al, WO 01/10460 Al, WO 00/67795, WO 00/52473이다.
리툭시맵은 이의 마우스 모항체인 이브리투모맵으로부터 가공된 키메라 마우스/인간 항체이다. 이브리투모맵이 90Y로 표지되는 경우, 이는 제발린(Zevalin)TM으로 호칭된다. 와이즈맨(Wiseman) 등[문헌참조: Critical reviews in Oncology/Hematology 39(2001), 181-194]은 제발린TM이 사전 용량측정 없이 혈소판 수가 > 149 x 109/L인 환자에게 15MBq/kg의 활성으로 투여될 수 있음을 보고하였다. 혈소판 수가 100 내지 149 x 109인 환자에 대해서는 11.1 MBq/kg의 활성인 것이 널리 허용된다. 표준 과정의 리툭시맵과 비교하여 재발성이거나 치료하기 힘든 지연성 또는 형질전환된 림프종을 앓는 환자에서 제발린에 대한 전망있는 무작위 시험이 보고되었다. 연구된 143명의 환자중에서, 제발린 군에 대해서는 총 반응이 80%인 것으로 밝혀졌고 비표지된 리툭시맵이 투여된 군에서는 56%(P = 0.002)였고 제발린을 사용한 완전한 치유는 30%이고 리툭시맵에 대해서는 16%(P = 0.04)였다. 제발린은 또한 리툭시맵으로 치료하기 힘든 여포성 림프종을 앓는 환자에서 평가되었다. 반응 지속시간은 선행 기술 분야의 리툭시맵(P = 0.008)과 비교하여 제발린이 상당히 길었다(8.4 + 대 4개월).
토시투모맵(Tositumomab)은 CD20 항원에 대해 유도된 쥐 IgG2a 람다 모노클로날 항체이다. I131-토시투모맵(BexxarR)은 요오드-131과 공유적으로 연결된 토시투모맵의 방사선 요오드화된 유도체이다. 요오드-131은 물리적 반감기가 8.04일이고 베타 및 감마선을 방출하면서 붕괴한다. I131-토시투모맵의 치료적 섭생의 가능한 작용 기작은 유도 아폽토시스, 보체 의존성 세포독성(CDC)(및 항체에 의해 매개되는 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 포함한다[문헌참조: Cardarelli PM et. al. Cancer Immunol Immunother. 2002 Mar; 51 (1) : 15- 24; Stashenko P, et. al. J Immunol 1980; 125: 1678-85]. 추가로, 세포 사멸은 방사선동위원소로부터 방출되는 이온화 방사선과 연관되어 있다.
치료적 섭생은 2개의 별도의 단계로 구성된다: 용량측정 단계 및 치료적 단계. 각각의 단계는 토시투모맵에 이어서 I131-토시투모맵을 연속적으로 주입하는 것으로 구성된다. 임상 시험에서 투여되는 I131-토시투모맵 치료적 섭생의 최대 용량은 88 cGy이다. 3명의 환자는 단계적 용량 상승 연구에서 요오드 I131-토시투모맵을 총 신체 용량 85cGy로 처리되었다. 3명의 환자중 2명은 후속적인 회복과 함께 5주의 지속 시간동안 4등급 독성을 나타내었다. 추가로, 1명의 환자에서 총 신체 용량 88cGy의 치료적 섭생이 뜻밖에 과용량인 것으로 나타났다.
정상적인 기관 독성은 환자에게 안전하게 투여될 수 있고 이로써 종양으로 흡수되는 용량인 활성양을 제한한다. 제1 용량 제한 기관은 골수이다. 국소화된 B 세포 림프종은 30 내지 44Gy 용량과 함께 외부 빔 방사선 치료에 의해 치유될 수 있다. 줄기 세포 지지체의 사용없이 통상적인 면역치료 요법으로 성취될 수 있는 용량은 실질적으로 보다 낮다. 와이즈맨등은 임상 단계 III에서 B 세포 림프종에 대한 평균 용량은 15Gy임을 보고하였다[문헌참조: Wiseman G et al., Critical reviews in Oncology/- Hematology 39 (2001) 181-194]. 반응율은 80%의 객관적인 반응과 34%의 완전한 반응이다. 줄기 세포 지지체를 사용한 시애틀 군은 최고의 경감율이 80%인 완전한 경감율을 보고하였다[문헌참조: Liu Steven Y. et al. , J. Clin. Oncol. 16 (10): 3270-3278, 1998]. 이들은 27 내지 92Gy를 성취하기 위한 종양 부위를 평가하였다.
비혈액학적 용량 제한 독성은 폐에 대해 27 Gy 이상인 용량에서 나타나는 가역적 폐 기능부전이다. 당해 연구는 매우 비교가능하지는 않지만 이들은 RIT에서 용량 효과 관계를 지적한다. 용량 관계가 존재한다면 종양으로 고용량이 전달될 수 있는 경우 효능을 증가시킬 수 있다. 이것은, RIT 후 완전한 경감이 보다 오래 지속적인 경감과 연관되어 있기때문에 가장은 임상적으로 적절하다[Wahl et al., J.Nucl. Med. 39:21S-26S, 1998].
이에 대한 방해 요소는 골수의 방사선 민감성이다. 골수로 흡수되는 용량이 커질수록 골수파괴를 유발할 수 있다. 따라서, 보다 효과적인 치료를 거두기 위해 필요한 용량은 혈액 순환내 방사선활성이 축적되어 골수와 같은 정상적인 기관에 독성을 유발하여 제한된다. 정맥내 투여 후 혈액에 세포독성 표적화 생체분자(예를 들어, 치료적 또는 진단학적 모노클로날 항체)가 존재하지 않도록 하기 위한 다양한 수단이 보고되었다[문헌참조: article by Schriber G. J. and Kerr D. E. , Current Medical Chemistry 2: 616-629, (1995)].
소위 아비딘 추적 방식에서, 아비딘 또는 스트렙트아비딘은 바이오틴이 부착된 치료적 또는 진단학적 항체의 투여후 충분한 양의 항체가 종양에 축적되는 시점에 전신적으로 투여한다. 아비딘 또는 스트렙트아비딘은 항체와 연관될 것이고 이와 같이 형성된 면역복합체는 망상내피계(RES)를 통해 혈액 순환으로부터 제외되고 간을 통해 환자로부터 배출된다. 이들 과정은 바이오티닐화된 세포독성 항체의 제거를 개선시킬 것이다. 동일한 목적을 위한 또 다른 방법은 항유전자형 항체를 사용하는 것이다. 그러나, 모든 이들 방법은 혈액 제거를 위해 간 또는 신장에 의존하고 따라서 이들 필수 기관중 하나 또는 둘다 및 방광은 고용량의 세포독성에 노출된다.
당해 방법의 또 다른 주요 결점은, 면역반응이 일단 생성된 후 반복 치료를 방해하는 당해 제제, 특히, 스트렙트아비딘의 면역원성이다. 혈액 보호를 위한 체외 기술은 독성 물질이 신장 기능의 결핍으로 인해 혈액내 증강되는 간 투석을 위해 광범위하게 사용된다. 체외 장치가 사용될 수 있는 기타 의학적 적용은 방사선활성 물질의 제거, 독성 수준의 금속 제거, 세균 또는 바이러스로부터 생성된 독소의 제거, 독소 수준의 약제의 제거 및 전세포의 제거(예를 들어, 암 세포, 특정 조혈 세포- 예를 들어, B, T 또는 NK 세포) 또는 세균 및 바이러스의 제거를 포함한다.
종양이 진단 또는 치료될 수 있도록 충분한 양의 면역접합체를 축적한 후 혈액 순환으로부터 방사표지된 항체를 신속하게 제거하기 위한 다양한 방법이 제안되었다. 사용되는 몇몇 방법은 면역복합체의 형성을 통한 신체 자신의 제거 기작의 증진을 포함한다. 혈액으로부터 방사선 표지된 항체의 제거는 치료적 항체에 대해 유도된 기타 모노클로날 항체와 같은 치료적 항체[문헌참조: Klibanov et al, J. Nucl. Med 29: 1951-1956 (1988); Marshall et al, Br. J. Cancer 69: 502-507 (1994); Sharkey et al, Bioconjugate Chem. 8: 595-604, (1997)]에 결합하는 분자, 아비딘/스트렙트아비딘[문헌참조: Sinitsyn et al J. Nucl. Med. 30: 66-69 (1989), Marshall et al Br. J. Cancer 71: 18-24 (1995)] 또는 간 세포상의 수용체에 의해 제거되는 글리코실 함유 화합물[문헌참조: Ashwell and Morell Adv. Enzymol. 41: 99-128 (1974)]을 사용함에 의해 증진될 수 있다. 여전히 또 다른 방법은 체외 방법을 통해 순환 면역접합체를 제거함을 포함한다[문헌참조: article by Schreiber G.J. and Kerr D.E., Current Medical Chemistry 2:616-629(1995)].
혈액 순환으로부터 의약제를 제거하는데 사용되는 체외 기술은 특히, 독성 물질이 체내로부터 신속하게 제거되기 때문에 매력적이다.
면역치료에 당해 방법의 적용은 이전에 보고되었다[문헌참조: Henry Chemical Abstract 18: 565 (1991); Hofheinze D. et al Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 28: 391 (1987); Lear J. K. et al Antibody Immunoconj. Radiopharm. 4: 509 (1991); Dienhart D. G. et al Antibody Immunoconj. Radiopharm. 7: 225 (1991); DeNardo S. J. et al J. Nucl. Med 33: 862-863 (1992); DeNardo G. L. et al J. Nucl. Med 34: 1020-1027 (1993); DeNardo G. L. J. Nucl. Med 33: 863-864 (1992); 및 미국 특허 번호 제5,474,772호 (Method of treatment with medical agents)].
혈액으로부터의 제거가 보다 효과적이도록 하고 상기 방법이 언급하는 혈장 보다는 전혈의 프로세싱을 가능하게 하기 위해, 의약제(예를 들어, 종양 국소화를 위한 종양 특이적 모노클로날 항체 운반 세포 사멸 제제 또는 방사선핵종)는 바이오티닐화되고 칼럼 매트릭스상에서 아비딘계 흡착제에 의해 제거된다. 다수의 공보는 당해 기술이 바이오티닐화되고 방사선핵종 표지된 종양 특이적 항체의 제거를 위해 효과적이고 실용적임을 보여주는 데이타를 제공한다[문헌참조: Norrgren K. et al, Antibody Immunoconj. Radiopharm. 4: 54 (1991), Norrgren K. et al J. Nucl. Med 34: 448-454 (1993) ; Garkavij M. et al Acta Oncologica 53: 309-312 (1996) ; Garkavij M. et al, J. Nucl. Med. 38: 895-901 (1997)].
이들 기술은 또한 유럽 특허 제0 567 514호 및 미국 특허 제6,251,394호에 기재되어 있다. 제조원[Mitra Medical Technology AB, Lund, Sweden]에 의해 개발되고 제조된 장치인 미트라뎁(Mitradep)은 당해 기술을 기초로한다. 바이오틴 표지된 치료적 항체와 연계된 아비딘 피복된 필터를 사용함에 의해, 혈액으로부터의 제거 기술은 키메라 또는 완전히 인간화된 항체에 균등하게 적용될 수 있다. 실험 데이타는 3시간 흡착 과정동안에 90%이상의 순환 바이오티닐화된 항체가 미트라뎁시스템[문헌참조: Clinical Investigator's Brochure-MitradepR]에 의해 제거될 수 있음을 밝힌다.
체외 필터에 흡착되도록 하기 위해, 세포독성 제제(예를 들어, 방사선핵종)를 운반하는 모노클로날 항체는 환자에게 투여되기 전에 바이오티닐화(바이오틴은 비가역적으로 필터내 아비딘에 결합한다)될 필요가 있다. IgG 분자당 다수의 바이오티닐 부분은 3 내지 6의 범위에 있고, 전형적으로 4이다.
바이오틴과 방사선핵종을 동시에 표지시킴과 함께 당해 방법의 추가의 개선은 에스, 윌버 및 비.이.비. 샌드버그의 특허 출원(PCT/SE98/01345)에 기재되어 있고 당해 문헌은 3중 작용 시약을 생체분자에 접합시키는 방법을 기재하고 있다.
후자 방법은 방사선핵종의 연속 표지화 및 바이오티닐화 보다 다수의 잇점을 갖고 특히, 나체(비-킬레이트화된) 항체가 병원에 공급되는 경우, 킬레이팅 기 및 바이오티닐 기 둘다는 방사선 표지 단계에 추가로 항체에 접합되어야만 하기 때문에 매력적이다.
그러나, 대부분의 경우, 항체상의 동일한 유형의 작용기(ε-아미노 기)는 킬레이팅 기와 바이오티닐 기를 결합시켜 가장 근접가능한 부위에 대해 경쟁을 유도한다.
항체가 킬레이트화되고/되거나 바이오티닐화됨으로써 이종성 제제가 된다. 예를 들어, 킬레이트화된 항체가 항체당 3개의 킬레이트를 갖는 것으로 측정된 경우, 당해 제제는 1개의 킬레이트/항체 내지 7개의 킬레이트/항체를 갖는 항체의 혼합물을 포함한다. 킬레이트 및 바이오틴이 항체상의 동일한 부분에 연결됨으로써, 보다 많은 수의 킬레이트를 갖는 항체는 보다 낮은 수의 바이오틴을 갖는다. 이것은 또한 다수의 킬레이트를 갖지만 바이오틴을 전혀 갖지 않는 항체를 유도한다.
이것은, 통계학적으로, 방사선핵종을 운반하지만 바이오틴을 갖지 않은 특정 집단의 항체는 혈액 순환하고 당해 항체는 미트라뎁 필터에 의해 제거되지 않는다.
나체 치료적 또는 진단학적 항체의 표지화를 촉진시키고 바이오틴과 방사선표지의 비율이 1:1이도록 보장하기 위해, 제조원[Mitra Medical Technology AB, Lund, Sweden]은 2개 유형의 작용기를 갖는 함유한 일련의 수용성 구조를 개발하여 킬레이팅 기(방사선표지를 위해) 및 바이오틴 기의 동시로 및 부위 특이적으로 접합될 수 있다.
킬레이팅 기 DOTA로 표지된 태그-시약은 미트라태그(MitraTag)-1033로서 호칭된다.
본 발명은 항림프종 항체에 접합된 시약을 포함하는 의약제 및 림프관 암, 즉, 림프종 및 특히 NHL의 치료를 위한 다양한 방법을 포함한다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 특정 림프종 질환의 치료와 관련된 상기 논의된 문제점을 해결하기 위한 것이다. 당해 목적은 하기의 명시된 바와 같은 본 발명에 의해 성취된다.
본 발명은 한 측면에서, 항림프종 항체 또는 이의 변이체와 접합된 시약을 포함하는 의약제에 관한 것이고 여기서, 시약은 하기 3개 이상의 작용 부분 b) 내지 d)를 갖는 단일 분자이다: 상기 시약은
a) 3중 작용성 가교 결합 부분이 결합되고,
b) 상기 3중 작용 가교 부분에 링커 1을 통하여 결합된 친화성 리간드,
c) 상기 3중 작용 가교 부분에 링커 2를 통하거나 통하지 않고, 공유 결합된 작동성 제제(effector agent), 및
d) 상기 3중 작용 가교 부분에 링커 3를 통하거나 통하지 않고, 림프종 종양 세포의 표면상에 존재하는 하나 이상의 상이한 CD 항원과 상호작용하는 항림프종 항체 또는 이의 변이체와 결합하여 결합체를 형성할 수 있는 항 림프종 항체 반응 부분인 생체분자 반응 부분이 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 당해 의약제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 포유동물 숙주의 혈장 또는 전혈에서 상기 언급된 바와 같은 비조직 결합 치료적 또는 진단학적 의약제의 농도를 적어도 감소시키거나 체외 제거하기 위한 키트에 관한 것이고 여기서, 당해 의약제는 사전에 포유동물 숙주로 도입되었고 특정 조직 또는 여기에 부착된 세포로 농축되도록 하기 위해 특정 시간동안 유지되고, 당해 숙주는,
a) 의약제 및
b) 친화성 리간드가 부착되는 고정화된 수용체를 포함하는 체외 장치를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 림프종, 바람직하게는, 비호즈킨 림프종의 치료를 위한 당해 의약제의 용도에 관한 것이다.
여전히 추가의 측면에서, 본 발명은 의약제를 투여함에 의해 림프종, 바람직하게는 비호즈킨 림프종의 치료 방법에 관한 것이다.
여전히 추가의 측면에서, 본 발명은 의약제를 투여함에 의해 림프종, 바람직하게는 비호즈킨의 림프종을 진단하는 방법 및 조합된 치료 방법 및 림프종을 진단하는 방법에 관한 것이다.
현재 본 발명의 추가의 잇점 및 목적은 첨부된 도면을 참조로 보다 상세하게 기재될 것이다.
도 1은 축소된 미트라뎁을 통해 재순환 동안에 1033-리툭시맵 접합체가 고갈되는 것을 보여준다.
도 2는 CD20 양성 세포주 Raji에 결합하는 유 세포분석 분석을 보여준다.
도 3은 CD20+(SB) 및 CD20-(HSB) 세포주에 대한 1033 접합체의 결합을 보여준다.
도 4는 냉각된 리툭시맵 및 1033-리툭시맵 접합체에 의해 SB 세포에 결합하는 125I-표지된 리툭시맵의 경쟁적 억제를 보여준다.
도 5는 퍼센테이지 ± 표준 편차로서 표현되는, 111In-1033-리툭시맵 항체 접합체가 주사된 랫트에서 방사선활성의 전신 제거를 보여준다.
도 6은 % 주사된 용량/그램 ± 표준 편차로서 표현되는, 혈액으로부터 111In-1033-리툭시맵 항체의 제거를 보여준다.
도 7은 랫트에서 IIIIn-1033-리툭시맵(4.6 1033/IgG)의 생체분포를 보여준다.
도 8은 IIIIn-1033-리툭시맵(4.6 1033/IgG)으로 주사된 랫트로부터 채혈된 혈액 샘플의 HPLC 크기 배제 분리를 보여준다.
본 발명에 의해, 파종성 혈액학적 암종, 특히, 림프종 치료시 세포독성 제제의 투여 후 혈액 순환중의 세포독성 의약제의 농도를 감소시킴으로써 고용량의 투여 및 필수 기관을 보다 높은 독성에 노출시키지 않으면서 보다 효과적인 치료 섭생을 촉진시킴에 의해 세포독성 표적화제의 종양 대 비종양의 비율을 개선시킬 수 있다. 추가로, 본 발명은 특히, 림프구 암 및 NHL의 치료시 신규 의약 및 당해 제제의 용도를 제공한다.
한 양태에서, 방사선표지된 항림프종 항체는 골수 이식을 통해 또는 몇몇 기타 수단("저용량")에 의해 조혈 기능의 재구성 없이 환자에게 허용가능한 것으로 간주되는 양으로 제한되는 단일 용량으로 투여된다. 용량 범위는 90Y-항림프종 항체 10 내지 20 MBq/kg 체중, 바람직하게는 11 내지 15MBq/kg이고 표적 국소화를 위한 111In-항림프종 항체에 대한 범위는 20 내지 250MBq, 바람직하게는 50 내지 150MBq이다. 당해 양태에서, 비결합 방사선표지된 치료적 또는 진단학적 항체의 체외 제거는 선택적이다.
또 다른 양태에서, 방사능표지된 항림프종 항체는 환자에게 고량의 방사선활성을 전달하는 것으로 지정된 단일 용량으로 주어진다. 당해 "고용량 방법"은 골수를 재구성하거나 바람직하게 미트라뎁 시스템을 사용하여 골수에 대한 방사선 효과를 감소시키는 방법과 조합되어야만 한다. 90Y-항림프종 항체에 대해, "고용량"은 20MBq/kg의 체중을 초과하는 단일 용량을 의미한다.
바람직한 양태에서, 50 내지 150MBq의 용량에서 111In-항림프종은 "고용량"(> 20MBq/kg 체중)의 90Y-항림프종 항체와 배합되고 6 내지 8일 간격으로 연속으로 주입되거나 동시에 주입된다.
본 발명의 하기의 양태는 또한 본 발명을 상세하게 설명하기 위해 제공된다.
림프종은 림프구로부터 기원하는 종양이다. 림프종의 정상적인 대응물, 즉, 정상적인 림프구는 골수에서 다중강력한 줄기 세포로부터 기원하고 완전히 성숙한 림프구로 분화한다. 이들의 분화동안에, 이들은 상이한 페소 표면 항원(CD-항원)을 발현하는 반면 이의 몇몇은 가계 및/또는 단계 특이적이다. 림프종은 다양한 분화 단계에서 림프구로부터 발생할 수 있고 흔히 당해 단계에서 발현되는 CD-항원을 제공한다. 당해 CD-항원은 진단학적 목적 뿐만 아니라 상이한 종류의 항체 치료를 위한 표적물로서 사용될 수 있다.
주로, 모노클로날 항체 기술에 의한 인간 백혈구 항원의 연구는 기본 연구 및 임상 연구에서 급속하게 변화하는 분야이다. 항체에 의해 규명된 백혈구 표면 분자는 일련의 국제 워크샵(Paris, 1982; Boston, 1984; Oxford, 1986; Vienna, 1989, Osaka, 1996)에서 클러스터 분화(CD) 번호(CD-항원)로 할당되었다. 이들 항원의 CD 분류는 공개 문헌에서 표준 형태가 되었고 임상 보고를 표준화하기 위한 기준을 제공한다. 현재 CD 분류는 목록 형태로 제공되어 있고 각각의 기재사항 뿐만 아니라 항원에 대해 간략히 요약하고 있다.
2002년 2월 7일자로 개정됨 [email protected]
본원에 사용된 바와 같은, 표현 "CD1 내지 CD247의 군"은 상기 목록에 있는 모든 CD 분자를 의미한다.
가장 바람직한 양태에서, 항림프종 항체는 CD19, CD20, CD22, CD30, 특히, CD20에 대해 유도된 것이다.
본 특허 출원에서, 면역표적화제(면역접합체)는 일반 세포독성 의약제와 반대로 고친화성으로 림프구 종양 세포에 특이적으로 결합하고 경구로, 바람직하게는 정맥내로 인간에게 투여될 수 있는 세포독성 부분을 운반하는 제제이다. 바람직한 출원에서, 면역표적화제는 상이한 이소타입일 수 있고 임의의 종으로부터 유래할 수 있는 항체이다. 특히, 모노클로날 항체 및 이의 유도체이다. 후자는 F(ab')2, F(ab') 및 F(ab)등과 같은 단편을 포함한다. 이들은 또한 하나 이상의 표적 특이적 모노클로날 항체, 예를 들어, 키메라 또는 인간화된 항체, 단일쇄 항체등의 항원 결합 영역의 특이성을 기본으로 유전학적으로 가공된 하이브리드 또는 화학적으로 합성된 펩타이드를 포함한다.
항림프종 항체 반응성 부분인 생체분자 결합 부분은 108M-1 이상의 친화성 결합 상수로 항림프종 항체에 공유 또는 비공유 결합되거나 접합된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항림프종 항체"는 5 x 106M-1 이상, 바람직하게는 108M-1 이상의 친화성 결합 상수로 림프종 종양 세포상의 CD 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 항체를 의미하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 항림프종 항체의 용어 "변이체"는 CD 항원 분자에 결합하는 경우, 동일하거나 본질적으로 유사한 친화성 결합 상수, 즉, 5 x 106M-1 이상, 바람직하게는 108M-1 이상의 친화성 결합 상수를 갖는 임의의 변형체, 이의 단편 또는 유도체를 의미한다.
이들 임의의 변이체는 다양한 수의 폴리에틸렌 글리콜 쇄와 결합시킴에 의해 변형되어 체액에서의 반감기와 종양 조직에서의 항체 또는 항체 단편 또는 유도체의 체류를 최적화할 수 있다. 가장 바람직한 응용에서, 항체 또는 항체 유도체는 표적화제의 결합 성질을 상당히 감소시키지 않으면서 고정화된 아비딘과 상호작용함에 의해 체외 제거를 위해 사용되는 충분한 수의 바이오틴 부분과 접착될 수 있다.
특이성을 증진시키기 위해, 종양 특이적 모노클로날 항체는 방사선핵종, 화학적치료 약제, 합성 또는 천연 존재 독소, 면역억제제, 면역조절제 및 프로드럭 프로토콜에 사용되는 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 세포독성 부분의 운반체(면역접합체)로서 사용된다. 세포독성 부분은 바람직하게 감마선 방출물질, 예를 들어, 요오드-131 또는 금속 이온 접합체와 같은 방사선핵종이고 여기서,금속은 이트륨 또는 레늄과 같은 베타 입자 방출물질로부터 선택된다. 간소우(Gansow) 등의 미국 특허 제4,472,509호는 방사선 금속을 모노클로날 항체에 결합하기 위한 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 킬레이트 제제의 용도를 기술한다. 당해 특허는, 특히, 결합되지 않고 우연히 결합된(비-킬레이팅된) 금속을 방사선약제로부터 제거하기 위한 정제 기술에 관한 것이지만 방사선핵종 표지된 항체를 제조하기 위한 당업계에 인지된 프로토콜을 예시하고 있다.
당해 일반적인 방법에 따르면, 표적 조직 연관 항원과 특이적으로 반응하는 항체는 단백질 결합 및 금속 결합 작용기를 갖는 선택된 특정 양의 2중 작용 킬레이팅 제제와 반응하여 킬레이터/항체 접착제를 생성한다. 킬레이터와 항체를 접합시키는데 있어서, 과량의 킬레이팅 제제가 항체와 반응하고 이의 특이적 비율은 시약의 특성 및 항체당 목적하는 수의 킬레이팅 제제에 따라 다양하다. 방사선핵종은 이들이 생체분자 접합체가 사용되는 조건(예를 들어, 환자에서)하에 바이오티닐화/방사선표지 화합물로부터 분리되지 않은 방식으로 금속에 대해서는 킬레이팅에 의해 결합되거나 공유 결합에 의해 결합되어야만 한다. 따라서, 가장 안정한 킬레이트 또는 공유 결합 배열이 바람직하다. 당해 결합/결합된 부분의 예는 할로겐의 방사선핵종에 대한 아릴 할라이드 및 비닐 할라이드; Tc 및 Re 방사선핵종에 대한 N2S2 및 N3S 킬레이트; EDTA와 같은 아미노-카복시 유도체, DTPA, Me-DTPA의 유도체 및 사이클로헥실-DTPA 및 In, Y, Pb, Bi, Cu, Sm, 및 Lu 방사선핵종에 대한 트리에틸렌테트라아민헥사아세트산 유도체(문헌참조: Yusangfang and Chuanchu, Pure & Appl. Chem 63, 427-463, 1991)이고 여기서, 방사선핵종은 임의의 하기의 원소들이지만 이에 제한되지 않는다.
세포독성 제제로서 유용한 베타 방사선 방출물질은 스칸듐-46, 스칸듐-47, 스칸듐-48, 구리-67, 갈륨-72, 갈륨-73, 이트륨-90, 루테늄-97, 팔라듐-100, 로듐-101, 팔라듐-109, 사마륨-153, 루테튬-177, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 골드-198, 라듐-212 및 납-212와 같은 동위원소를 포함한다. 가장 유용한 감마 방출물질은 요오드-131 및 인듐-m114이다. 본 발명에 유용한 기타 금속 이온은 포지트론 방출물질(예를 들어, 갈륨-68 및 지르코늄-89)뿐만 아니라 알파 방사선 방출 물질(예를 들어, 212-비스무쓰, 213-비스무쓰 및 At-211)을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 방사선핵종 표지된 표적화제는 림프구암의 치료 뿐만 아니라 당해 암을 영상화하는데 유용하다.
투여 후 적합한 시점에, "세포독성 표적화제"는 체외 수단에 의해 혈액계로부터 제거된다. 체외 고갈을 촉진하기 위해, 전혈 또는 혈장의 체외 순환용 장치는 배관선 및 혈액 접근 장치를 통해 환자에게 연결된다. 당해 장치는 혈액을 흡착 장치에 수송하기 위한 도관 및 가공된 혈액 또는 혈장을 환자에게 복귀시키기 위한 도관을 제공해야만 한다. 혈장이 흡착 장치를 통해 가공되는 경우, 농축된 혈액을 가공된 혈장과 혼합시키는 수단으로서 뿐만아니라 혈장 분리 장치가 요구된다. 후자는 일반적으로 2개의 성분을 혼합이 일어나는 공기 트랩으로 이동시킴에 의해 성취된다.
전혈이 가공되는 경우에, 일반적인 투석 기계는 당해 장치를 위한 기본 장치를 구성할 수 있다. 투석 기계는 일반적으로 시스템의 용이한 조작을 허용할 뿐만 아니라 환자의 안정성 요구를 충족시키는 모든 필요한 안전 장치 및 모노터링 장치가 장착되어 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 전혈은 가공되고 표준 투석 기계는 하드웨어를 단지 최소로 변형시켜 사용된다. 그러나, 당해 기계는 새롭게 의도된 목적에 적합한 신규 프로그램을 요구한다.
장치 뿐만 아니라, 환자 및 기계로부터의 의도된 유동 및 원거리에 적합한 특별한 혈액 배관선이 요구된다. 이들 배관선은 혈액 또는 혈장과 화합성인 임의의 재료로 제조도리 수 있고 투석에 사용되는 통상적인 배관에 사용되는 재료를 포함한다.
혈액 접근은 말초 정맥 카테터 또는 고도의 혈류가 요구되는 경우, 서브클라비안 또는 대퇴부 카테터와 같은 중앙 정맥 카테터를 통해 성취될 수 있다.
친화성 흡착을 위해, 매트릭스는 다양한 형태 및 화학적 조성물일 수 있다. 예를 들어, 미립자 중합체로 충전된 칼럼 하우스를 구성할 수 있고 후자는 천연 기원 또는 인공적으로 제조된다. 입자는 거대다공성일 수 있거나 이들의 표면은 이식될 수 있고 후자는 표면적을 증가시킨다. 입자는 구형 또는 과립형일 수 있고 폴리사카라이드, 세라믹 재료, 유리, 실리카, 플라스틱 또는 이들 또는 유사한 재료들의 혼합물을 주성분으로 할 수 있다. 이들의 배합물은 예를 들어, 적합한 천연 기원 또는 인공적으로 제조된 중합체로 피복된 고체 입자일 수 있다. 인공막이 또한 사용될 수 있다. 이들은 충분히 불활성이고, 생물화합성이고 무독성이고 막 표면의 화학적 변형 후 또는 직접적으로 수용체가 고정화될 수 있는, 셀룰로스, 폴리아미드, 폴리설폰, 폴리프로필렌 또는 기타 유형의 재료로 구성된 평평한 쉬트 막일 수 있다. 셀룰로스, 폴리프로필렌 또는 상기 유형의 막에 적합한 임의의 재료로부터 제조된 속빈 섬유와 같은 모세관막이 또한 사용될 수 있다. 바람직한 양태는 아가로스 계열의 미립자 재료이고 체외 응용을 위해 적합하다.
한 양태에서, 친화성 표지는 항림프종 항체에 접착되어 있고 흡착 장치는 친화성 리간드에 특이적으로 결합하는 고정화된 수용체를 함유한다. "항체 및 항원/합텐" 및 "단백질 및 조인자"와 같은 임의의 유형의 친화성 리간드/고정화된 수용체 조합물이 본 응용분야에 사용될 수 있고 단, 이들은 종양 마커에 대해 충분히 및 선택적으로 고친화성 결합을 나타내고 친화성 리간드-수용체 상호작용은 면역표적화제 및/또는 장치와 접촉하고 있는 혈액 또는 기타 체액 또는 조직에 의해 방해받지 말아야 한다.
가장 바람직한 응용중 하나에서, 친화성 리간드/고정화된 수용체 조합물은 특히, 친화성 리근드가 바이오틴 또는 이의 유도체이고 고정화된 수용체가 아비딘 또는 스트렙트아비딘 또는 임의의 기타 바이오틴 결합 분자인 경우 바이오틴 또는 바이오틴 유도체 및 바이오틴 결합 분자이다. 바이오틴/아비딘 및 바이오틴/스트렙트아비딘의 친화성 리간드 쌍은 흔히 생체분자와 함께 사용된다. 바이오틴과 단백질 아비딘 및 스트렙트아비딘과의 매우 강한 상호작용(즉, K= 1013 - 1015 M-1)[문헌참조: Green, Methods Enzymol. 184,51-67, 1990; Green, Adv. Prot. Chem. 29,85-133, 1975]은 시험관내 및 생체내 둘다에 대한, 대다수의 응용에서 이들을 사용하기 위한 기초를 제공한다. 본 발명의 추가의 응용은 동일한 체외 과정을 통해 여러 상이한 바이오티닐화된 "항암제"를 동시에 제거하는 것이다.
본 발명에 사용되는 시약은 도식적으로 하기에 나타내고 여기서 생체분자 반응성 부분은 항림프종의 반응성 부분이다.
본 발명에 따른 의약제는 도식적으로 하기에 나타내고 여기서, 항림프종 항체는 시약의 항림프종 항체 반응성 부분을 통해 시약에 결합되거나 접합되어 있다.
각각, 도식적으로 나타낸 시약 및 의약제에서, 상이한 성분들이 하기에서 보다 상세하게 제공된다.
항림프종 항체 반응성 부분은 N-하이드록시-숙신이미드 에스테르, 설포-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 및 페놀산 에스테르로 이루어진 활성 에스테르; 아릴 및 알킬 이미데이트; 항림프종 항체상의 아미노 기와 반응하는 알킬 또는 아릴 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트 또는 항림프종 항체상의 설피들릴 기와 반응하는 말레이미드 또는 알파-할로이미드; 또는 천연적으로 존재하거나 합성적으로 항림프종 항체 또는 이의 변이체상에 생성된 알데하이드 또는 케톤 기와 반응하는 아릴 또는 알킬하이드라진 또는 알킬 또는 아릴하이드록실아민의 군으부터 선택된다.
작동성 제제는 방사선핵종 결합 부분이고 임의로 방사선핵종, 합성 또는 천연에 존재하는 독소, 프로드럭을 활성 약제로 전환시킬 수 있는 효소, 면역억제제 또는 면역자극제, 방사선감작제, X-선 또는 MRI 또는 초음파에 대한 증진제, 비방사선활성 원소들과 함께 제공되고 이들은 당해 원소를 운반하는 항림프종 항체가 특정 세포 또는 조직에 축전된 후 외부 조사에 의해 방사선 활성 원소들 또는 광활성 화합물 또는 광 영상화 또는 광 역학적 치료에 사용되는 화합물 또는 직간접적으로 림프종 세포 또는 림프종 조직상에 동일하거나 유사한 효과를 갖는 임의의 기타 분자로 전환될 수 있다. 보다 정확하게, 작동성 제제는 Me-DTPA, CITC-DTPA 및 사이클로헥실-DTPA를 포함한다.
친화성 리간드는 106 M-1 이상의 친화성 상수로 기타 분자와 결합하는 임의의 부분일 수 있다. 바람직한 친화성 리간드는 특이적으로, 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 임의의 기타 유도체, 본질적으로 친화성 리간드에 동일한 결합 작용을 갖는 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 돌연변이체 또는 단편과 결합하는 부분이다. 바람직하게, 친화성 리간드는 바이오틴 또는 바이오틴과 동일하게 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 결합 작용을 본질적으로 갖는 바이오틴 유도체이다. 당해 바이오틴 유도체는 바이오틴과 본질적으로 동일한 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로의 결합 작용을 갖는 바이오틴 유동체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
당해 항림프종 항체 반응성 부분과 접합되는 능력을 갖는 항림프종 항체는 림프종 종양 세포의 표면상에 존재하는 하나 이상의 상이한 세포표면 항원과 상호작용하고 하나 이상의 세포 표면 항원은 하나 이상의 상이한 CD 항원 또는 이의 변이체이고 항림프종 항체는 바람직하게, 항-CD20 항체, 바람직하게는 리툭시맵, 이브리투모맵 및 토시투모맵으로부터 선택된다.
3중 작용 가교 연결 부분은 트리아미노벤젠, 트리카복시벤젠, 디카복시아닐린 및 디아미노벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
링커 1은 3중 작용 가교 연결 부분과 친화성 부분, 바람직하게는 바이오틴 부분사이의 접착 부분 및 스페이서인 화학적 부분이고 아비딘 또는 스트렙트아비딘 또는 임의의 기타 바이오틴 결합 종은 입체 장애에 의해 감소되지 않는다. 링커 1은 또한 증가된 수용성 및 바이오티니다제 안정화를 부여할 수 있고 바람직하게는 알파 카복실레이트 또는 N-메틸 기의 도입시 바이오티니다제에 의한 절단에 대해 안정화시킨다. 추가로, 이것은 수소 결합형성 원자, 바람직하게는 에테르 또는 티오에테르 또는 이온가능한 기, 바람직하게는 카복실레이트, 설포네이트 또는 암모늄 기를 포함하고 바이오틴 부분의 수용성화를 도와준다.
바이오틴 함유 부분의 구조적 요구사항에 대해, 본 발명의 하기의 양태를 참조로 적용한다:
1033-항CD20 항체의 일반화된 구조
상기 구조물은 작동성 제제에 결합되고, 여기서, 항-CD20 항체는 바람직하게 리툭시맵이고 n은 2 내지 4이고 바람직하게는 3이고 o는 1 내지 6이고 바람직하게는 3이고, p는 1 내지 6이고 바람직하게는 3이고 R2는 =CH2OH 또는 -CO2H이고 R1은 CH3, -CH2OH 또는 -H이다.
1033 구조물에는 본 응용에서 중요한 3개 측면의 바이오틴 부분이 있다: (1) 바이오티니다제 절단의 차단, (2) 고친화성 바이오틴 결합의 유지 및 (3) 합당한 수용성 달성. 이들 특성들을 제공하기 위해, 바이오틴 접합체는 가교 연결 부분으로 결합되는 바이오틴 분자와 적당한 링커로 구성되어야만 한다.
바이오틴 접합체는 펜타노산 측쇄(n = 3)상의 카복실레이트와 접합시켜 제조되어야만 한다. 바이오틴 분자에서 기타 위치에서의 접합은 아비딘 및 스트렙트아비딘과의 결합을력을 완전히 소실시킨다. 이것은 본 응용에 대해 바이오틴 분자를 무용지물로 만든다. 바람직한 형태의 접합은 화학식으로 나타낸 바와 같이 카보실레이트 기와 아미드 결합을 형성하는 것이다. 아비딘 및 스트렙트아비딘과의 바이오틴 결합은 깊은 포켓(예를 들어, 9Å)에 있기 때문에, 펜타노산 측쇄의 단축(n<3) 또는 연장은 결합 친화성을 저하시키고 이는 본 응용을 위해 바람직하지 못하다.
바이오티니다제의 활성은 적절한 치환체를 바이오틴아미드 아민(즉, R1) 또는 당해 아민에 인접한 원자(즉, R2)에 부착시킴으로써 차단된다. 바이오티니다제는 바이오틴 카복실레이트 접합체의 아미드 결합을 절단하는(가수분해하는) 효소이다. 당해 효소는 동물 및 인간에서 바이오틴을 재활시키는데 매우 중요하다. (여러 상이한) 단백질 카복실라제에 의한 바이오틴 대사는 바이오틴-w-N-라이신(비오시틴)을 방출시키고 바이오티니다제는 아미드 결합을 특이적으로 절단하여 유리된 바이오틴을 방출시킨다. 바이오티니다제는 또한 (비특이적으로) 기타 바이오틴아미드 결합을 절단할 수 있다. 본 응용에서, 바이오티니다제는 접합체로부터 바이오틴을 절단시키지 않는 것이 중요하고 그렇지 못하다면 목적하는 결과가 성취되지 못한다. 따라서, 유용한 바이오틴 접합체 구조는 작용 기(R1 또는 R2)를 혼입하여 바이오티니다제의 효소 활성을 차단하는 것이다. R1에 대한 임의의 구조가 바이오티니다제를 차단할 가능성이 있지만, 메틸 기가 바이오티니다제 활성을 완전히 차단함으로써 이의 구조는 일반적으로 메틸(CH3) 기로 제한된다. N-메틸 기는 바이오틴의 아비딘과 스트렙트아비딘과의 결합 친화성을 상당히 감소시키지만 본 응용을 위해 여전히 유용하다. R1에 대한 보다 큰 기(예를 들어, 에틸, 아릴등)는 결합 친화성을 상실시키기 때문에 유용하지 못하다. 치환체 R1을 갖는 것 대신에 바이오틴아미드 아민에 인접한 원자상에 치환체 R2(예를 들어, 메틸렌)를 가질 수 있다. 보다 크고 보다 다양한 치환체가 바이오틴의 결합 친화성에 어떠한 영향을 미치지 않으면서 당해 위치에 사용될 수 있다. R2가 CH3 또는 CH2CH3인 경우 절단이 완전히 차단되지 않지만 절단율은 상당히 저하된다(즉, 각각 25% 및 10%). 바이오티니다제 활성은 R2가 CH2OH 및 CO2H 작용기인 경우 완전히 차단된다. 당해 기가 R2로서 혼입되는 경우 결합 친화성에는 어떠한 감소도 없다는 것이 중요하게 고려된다. 대형 작용 기는 또한 R2로서 사용되어 바이오티니다제 활성을 차단할 수 있지만 결합 친화성을 감소시킨다. R2로서 대형 작용 기가 본 응용에 유용하지만 이들은 R1이 CH3인 경우 수득되는 것보다 결합 친화성을 감소시키지 말아야한다.
1033에서 바이오틴 부분의 바이오틴 친화성 및 수용성은 사용되는 링커 부분에 의해 영향받는다. 링커 부분(링커 1)의 길이 및 특성은 어느정도 접합되는 분자의 특성에 의존할 것이다. 링커 부분은 바이오틴 부분과 접합체의 나머지간에 스페이서를 제공하는 작용을 하여 바이오틴 결합이 단백질(또는 기타 접합된 분자)로부터 입체 장애에 의해 영향받지 않도록 한다. 링커의 길이(직쇄에서의 원자 수)는 소분자(예를 들어, 스테로이드)와의 접합체에 대한 o= 4 내지 20에서부터 대형 접합체 분자(예를 들어, IgG 분자)에 대한 o=0 > 20에 이르기까지 다양하다. 링커(이로부터 직쇄 또는 측쇄)내에서 원자의 특성은 또한 수용성을 증가시키기 위해 다양할 것이다. 예를 들어, 4개 이상의 메틸렌 유니트를 함유하는 링커는 산소 또는 황 원자를 혼입시켜(에테르 또는 티오 에테르를 형성) 개선되거나 이온화 가능한 작용기(예를 들어, 설포네이트, 카복실레이트, 아민 또는 암모늄 기)를 부착시켜 개선된다.
존재하는 경우, 링커 2는 방사선핵종 결합 부분을 3중 작용 가교연결 부분으로 부착시키는데 사용되는 화학적 부분이다. 이것은 1 내지 25개 원자의 스페이서 길이, 바람직하게는 6 내지 18개의 원자들의 길이 또는 원자 군을 제공한다. 링커 2는 또한 수소 결합형성 원자, 바람직하게는 에테르 또는 바이오에테르 또는 이온화 가능한 기의 존재로 인해 수용해도를 증가시켜 물에서의 용해를 도와줄 수 있다.
링커 3은 요구되지는 않지만 생체분자 반응성 부분을 3중 작용 가교연결 부분에 접착시키는데 사용되는 화학적 부분으로서 유리하다. 링커 3은 1 내지 25개 원자, 바람직하게는 6 내지 18개의 원자의 길이 또는 원자 군을 갖는 스페이서로서 사용될 수 있고 이것은 에테르 또는 티오에테르 또는 이온화 가능한 기, 바람직하게는 카복실레이트, 설포네이트 또는 암모늄 기와 같은 수소 결합형성 원자가 존재하여 화합물의 수 용해도를 증가시켜 물에서의 용해를 도와줄 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 시약은 3중 작용 또는 4중 작용 가교결합 부분으로 결합되는 하나 이상의 친화성 리간드 및/또는 하나이상의 작동성 제제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 의약제의 바람직한 양태는 하기의 도식적 구조를 갖는다:
여기서,
킬레이팅 기는 하기의 임의의 화합물이지만 이에 제한되지 않는다: 할로겐의 방사선핵종에 대한 아릴 할라이드 및 비닐 할라이드; Tc 및 Re 방사선핵종에 대한 N2S2 및 N3S 킬레이트; EDTA와 같은 아미노-카복시 유도체, DTPA, Me-DTPA의 유도체 및 사이클로헥실-DTPA 및 In, Y, Pb, Bi, Cu, Sm, 및 Lu 방사선핵종에 대한 사이클릭 아민(예를 들어, NOTA, DOTA, TETA,CITC-DTPA) 및 트리에틸렌테트라아민헥사아세트산 유도체(문헌참조: Yusangfang and Chuanchu, Pure & Appl. Chem 63, 427-463, 1991)이고 여기서, 방사선핵종은 임의의 하기의 원소들이지만 이에 제한되지 않는다: 세포독성 제제로서 유용한 베타 방사선 방출물질은 스칸듐-46, 스칸듐-47, 스칸듐-48, 구리-67, 갈륨-72, 갈륨-73, 이트륨-90, 루테늄-97, 팔라듐-100, 로듐-101, 팔라듐-109, 사마륨-153, 루테튬-177, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 골드-198, 라듐-212 및 납-212와 같은 동위원소를 포함한다. 가장 유용한 감마 방출물질은 요오드-131 및 인듐-m114이다. 본 발명에 유용한 기타 금속 이온은 포지트론 방출물질(예를 들어, 갈륨-68 및 지르코늄-89)뿐만 아니라 알파 방사선 방출 물질(예를 들어, 212-비스무쓰, 213-비스무쓰 및 At-211)을 포함한다.
본 발명의 가장 바람직한 양태에서, 의약제는 1 내지 5개 기의 3-(13'-티오우레아벤질DOTA)트리옥사디아민-1-(13"-바이오틴-Asp-OH)트리옥사디아민-5-이소티오시아네이토-아미노이소프탈레이트를 갖는 리툭시맵 접합체이다(하기 참조). 방사선핵종은 치료적 적용을 위해서는 90Y이고 생체내 진단학적 적용을 위해서는 111In이다. 매우 가장 바람직한 양태에서, 리툭시맵 접합체는 1.5 내지 3.5 군의 3-(13'-티오우레아벤질DOTA)트리옥사디아민-1-(13"-바이오틴-Asp-OH)트리옥사디아민-5-이소티오시아네이토-아미노이소프탈레이트를 함유한다.
이브리투모맵 또는 토시투모맵은 또한 의약제에서 항림프종 항체로서 효과적이다.
하기의 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되지 말아야 하고 본 발명의 응용에 대한 증거로서 간주되어야만 한다.
실시예 1 - 리툭시맵의 접합 및 방사선표지
본 실시예 및 후속 실시예에서, 인듐-111은, 이것이 감마선 방출물질이고 이트륨-90 보다는 덜 해로운 방사선을 소유하고 있기 때문에 이트륨-90에 대한 대용물로서 사용되는 경우가 있다.
모노클로날 항체인 리툭시맵은 문헌[참조: Wilbur D.S et al in Bioconjugate Chem. 13:1079-1092, 2002]에 기재된 방법을 사용하여, 하기에서 약칭으로 "1033"으로 또한 호칭되는 3-(13'-티오우레아벤질DOTA)트리옥사디아민-1-(13"-바이오틴-Asp-OH)트리옥사디아민-5-이소티오시아네이토-아미노이소프탈레이트(미트라태그-1033)과 접합시켰다. 5mg의 모노클로날 항체를 3일동안 4℃에서 최소 5회로 완충액을 교환해주면서 1L의 금속 부재 HEPES에 대해 투석하였다. 미트라태그-1033의 용액을 물에서 제조하고 적당한 용적을 항체 용액에 첨가하였다. 실온에서 밤새 항온처리한 후 항체-접합체를 4℃에서 3일동안 최소 3회 완충액을 교환해주면서 1L의 금속 부재 500mM의 암모늄 아세테이트 완충액(pH 5.3)에 대해 투석하였다. 탈금속 접합된 항체를, 방사선표지 실험에 사용될때까지 4 내지 8℃에서 저장하였다.
500mM의 암모늄 아세테이트 완충액(pH 5.3)중의 275㎕의 항체 접합체(1375㎍; 1033-리툭시맵)를 50mM HCl에서 15㎕의 111InCl3( 또는 90YCl3)과 혼합하였다. 표지화는 45℃에서 16분동안 수행하였다. 28㎕의 DTPA를 첨가하여 반응을 종료하였다. 방사선 접합체의 질은 TLC 및 HPLC로 측정하였다. 모노클로날 항체 분자당 미트라태그-1033의 수는 HABA 방법으로 측정하였다.
실시예 2 - 1033-접합된 모노클로날 항체의 아비딘-흡착제로의 결합
미트라뎁 장치에 사용되는 아비딘-흡착제에 결합하는 1033-리툭시맵 방사선 접합체의 분획물은 마이크로-칼럼을 사용하여 분석하였다.
2.4 접합체/IgG 1033-리툭시맵의 비결합 단백질 분획물은 9%였고 4.6 접합체/IgG 1033-리툭시맵은 3%였다. 이것은 접합체의 포이슨(Poisson)분포와 잘 일치한다. 따라서, 상기 리툭시맵 접합체는 미트라태그-1033으로 표지되지 않은 분획물을 함유해야만 한다. 따라서, 비결합 분획물은 비접합된 리툭시맵의 예상된 분획물, 즉 비방사선활성 분획물과 일치한다.
방사선표지된 1033-접합체 샘플에서 99% 이상의 방사선활성은 아비딘-흡착제와 함께 마이크로-칼럼에 결합되어 있다.
실시예 3- 시험관내 모방된 치료동안에 1033-리툭시맵 접합체의 고갈
환자 치료동안에 1033-리툭시맵의 고갈 역학은 문헌[참조: Schindhelm K.(Artificial Organs 13:21-27(1989)]에 기재된 원칙을 기준으로 하는 재순환 방법을 사용하여 시험관내에서 모방하였다.
1033-리툭시맵은 인간 혈액과 동일한 상대적 점도를 갖는 용액중에 희석하고 소규모 모델의 미트라뎁 장치를 통해 시험관내에서 재순환시켰다. 10mg의 1033-리툭시맵을 함유하는 125ml의 혈액 대용물을 6.25ml/분(미트라뎁에서 100ml/분에 상응함)에서 재순환시켰다. 3개의 저장소 용적을 처리하였다. 저장소내 1033-리툭시맵 수준을 모니터하였다.
상이한 수의 리툭시맵 분자당 미트라태그TM-1033 부분을 갖는 2개의 1033-리툭시맵의 제제를 분석하여 도 1에 제시된 결과를 수득하였다. 나타낸 바와 같이, 1033-리툭시맵의 고갈은 이론적인 고갈 수준과 상이하지 않았는데 즉, 장치를 통과하는 용액내 존재하는 모든 1033-리툭시맵이 제거되었다. 바이오티닐화된 인간 IgG를 사용한 연구는 1.4 바이오틴/IgG(시험된 가장 낮은 비율)로 저하된 바이오틴/IgG 비율에서 효율적으로 고갈되었음을 보여준다.
1033-리툭시맵은 장치 미트라뎁을 사용하는 체외 친화성 흡착 과정동안에 효율적으로 제거될 수 있는 것으로 결론지었다.
실시예 4 - 표적 항원 CD20으로의 1033-접합체의 결합
미트라태그TM-1033으로 접합시킨 후, 1033-리툭시맵 접합체는 표적 항원 CD20으로의 결합에 대해 분석하여 접합 과정이 결합된 항원을 변성시키지 않았음을 확인하였다. CD20 항원은 정제된 형태 및 가용성 형태로 시판되고 있지 않다. 따라서, CD20을 발현하는 B-세포 림프종 세포주를 시험하는 동안에, Raji 및/또는 SB를 표적으로서 사용하였다.
항원 결합의 특이성은 유세포분석(FACS) 방법에서 면역형광에 의해 분석하였다. 간략하게, Raji 세포는 바이오티닐화된 리툭시맵 및 1033-리툭시맵 접합체로 항온처리하였다. 항온처리한 후, 세포를 세척하고 형광 표지된 아비딘으로 항온처리하였다. 세척한 후 세포를 FACS 장치로 분석하였다. 양성 대조군으로서, CD20에 대한 바이오티닐화된 마우스 모노클로날 항체를 사용하고 음성 대조군으로서 PBS 완충액을 사용하였다. 세포상의 Fc-수용체에 결합하는 대조군을 위해, 바이오티닐화된 정상 인간 IgG를 사용하였다. 당해 결과는 그래프로 제공되었고 여기서 x-축은 대수적 스케일상에서 세포당 형광 양을 제공하고 Y-축은 특정 형광을 나타내는 세포의 수를 제공한다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 아비딘의 세포로의 비특이적 결합은 검출되지 않았다. 어느것도, 바이오티닐화된 인간 IgG를 사용하는 경우 Fc-수용체와 결합하는 것으로 나타나지 않았다. 대조군 마우스 항체, 바이오티닐화된 리툭시맵 또는 시험된 2개의 미트라태그TM-1033 접합체간의 결합에는 어떠한 상당한 차이가 없었다.
또한 특이성은 동일한 개체로부터 확립된 CD20-양성 세포주(SB) 및 CD20-음성 세포주(HSB)로의 접합체 결합을 분석함에 의해 측정하였다. 세포를 ELISA 플레이트 웰로 건조 부착시켰다. 1033-리툭시맵 접합체와 항온처리 한 후, 결합된 항체는 효소 접합된 스트렙트아비딘으로 검출하였다. 바이오티닐화된 리툭시맵 및 바이오티닐화된 정상 인간 IgG는 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포로의 비특이적 결합은 미미하였다.
리툭시맵은 미트라태그TM-1033 시약으로 접합시킨 후 항원 CD20과의 결합 특이성을 보유하고 있는 것으로 결론지었다.
실시예 5 - CD20 항원에 대한 결합 친화성의 분석
리툭시맵의 표적 항원 CD20으로의 결합 친화성(강도)에 대한 접합 과정의 영향은 경쟁 억제 분석을 사용하여 연구하였다.
간략하게, 증가하는 양의 비-방사선표지된 리툭시맵 및 1033-리툭시맵 접합체를, 볼톤-헌터(Bolton-Hunter) 시약을 사용하여 표지된 일정양의 125I-표지된 리툭시맵과 혼합하였다. 당해 혼합물을 96플레이트 웰에 고정화된 SB 림프종 세포에 첨가하였다. 2시간동안 실온에서 항온처리한 후, 웰을 세척하고 세포에 결합된 방사선활성을 자동 NaI(TI) 섬광 웰 계수기를 사용하여 측정하였다.
냉각된 리툭시맵 및 1033-리툭시맵 접합체의 각각의 농도에 대해, 세포 결합 방사선활성의 % 억제를 계산하였다. % 억제는 농도에 대해 플롯팅하였고(도 4) 50% 억제를 위해 요구되는 농도(IC50)를 그래프로부터 계산하였다(표 1). IC50은 시험된 항체의 상대적 친화성(애비더티:avidity)에 대한 측정이고 친화성의 감소는 IC50 농도를 증가시키는 것으로 나타난다. 친화성이 상당히 변화하기 위해서는 흔히, IC50의 차이가 10배이상이어야만 하는 것으로 진술된다.
샘플 IC50(nM) IC50(상대적 리툭시맵)
리툭시맵 26 1.0
1.6 1033-리툭시맵(1) 106 4.1
2.4 1033-리툭시맵 100 3.8
3.4 1033-리툭시맵 350 13.5
4.6 1033-리툭시맵 440 16.9
인간 IgG 억제되지 않음 --
(1) 1.6 1033-리툭시맵은 1.6 미트라태그/리툭시맵과 접합된 1033-리툭시맵을 나타낸다.
1.6 및 2.4 1033-리툭시맵 접합체에 대한 친화성이 약간 감소하는 것으로 나타난 반면 3.4- 및 4.6- 1033-리툭시맵 접합체는 리툭시맵의 IC50 농도와 비교하여 약 10 배이상 감소하는 것으로 나타난다. 3.4- 및 4.6- 1033-리툭시맵 접합체에 대한 친화성은 환자에서 적당한 종양을 표적화하는데 아마도 여전히 높은 것이다.
임상적 연구에서, 친화성의 10배 차이는 종양 표적에 큰 차이를 유도하지 못하는 것으로 나타났다(참조문헌 6). 따라서, 항체당 3 내지 4개의 접합체를 갖는 리툭시맵의 접합은 생체내에서 항체의 결합 성질을 감소시키지 않을 것으로 결론지었다.
실시예 6- 리툭시맵의 미트라태그-1033 접합체의 약리역학
스프라크 다울리 계열의 랫트의 정맥내에 비접합된 리툭시맵 1.2mg/랫트와 혼합된 3 내지 4개의 MBq 111인듐으로 표지된 약 50㎍의 1033-리툭시맵(항체당 4.6 1033 부분)를 주사하였다. 전신(WB) 영상화는 중간 에너지 콜리메이터(collimator)를 장착한 섬광 카메라(제조원: General Electric 400T, GE, Milwaukee, WI, USA)를 사용하여 수행하였다. 영상을 저장하고 핵 MAC 2.7 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 영상으로부터, 전신에서의 총 카운트 수를 수득하였다. 방사선활성 붕괴 보정 및 기본 공제 후, 카운트를, 체내 활성 유지에 대한 계산(%)을 위해 사용하였다. 도 5 참조.
111In-1033-리툭시맵의 약리역학을 규명하고 이를 111In-DOTA-hMn14와 비교하기 위해, 약 0.2ml의 혈액을 하기의 시간대에서 안와주변 정맥 맥락얼기로부터 채취하였다: 주사 후 10분, 1, 8, 24, 48 및 96시간. 방사선활성은 자동 NaI(TI) 섬광 웰 계수기로 측정하였고 혈액 그램당 주사된 활성의 %(%/g)로 표현하고 111In 붕괴에 대해 보정하였다(도 6).
실시예 7 - 기관 및 조직으로의 접합체의 생체분포
주사한지 1, 8, 24, 48 및 96시간 후에 수행된 절개에서, 목적하는 기관 및 조직을 제거하고 칭량하고 방사선활성 함량에 대해 측정하였다. 방사선활성은 자동 NaI(Tl) 섬광 웰 계수리로 측정하였고 카운트는 붕괴에 대해 보정하였다. 주입된 활성의 분포는 도 7 및 표 2에 나타낸다.
111In-1033-리툭시맵의 흡수(% 주사된 용량/g)
조직 1시간 8시간 24시간 48시간 96시간
근육 0.06 0.06 0.12 0.13 0.11
신장 0.98 0.91 0.83 0.86 1.00
간 1.22 1.79 1.86 1.92 3.42
비장 1.02 0.99 1.04 1.30 1.31
장 0.10 0.29 0.32 0.29 0.20
림프절 0.26 1.03 1.99 2.88 2.54
폐 0.74 0.89 0.71 0.52 0.38
골수 0.79 0.62 0.57 0.65 0.52
실시예 8 - 방사선표지된 미트라태그-1033 항체 접합체의 생체내 안정성
생체내 미트라태그TM-1033 부분의 안정성을 아비딘-마이크칼럼에 결합하는 혈중 방사선활성의 %를 분석함에 의해 측정하였다.
약 0.1ml의 혈액을 하기의 시간대에서 안와주변 정맥 맥락얼기로부터 채취하였다: 주사한지 1, 8, 24, 48 및 96시간 후. 50㎕의 혈액을 아비딘-아가로스(0.3ml 흡착제)를 갖는 마이크로-칼럼에 적용하였다. 10분동안 항온처리한 후, 결합되지 않은 방사선활성을 칼럼으로부터 세척하였다. 칼럼 및 수거된 세척액에서 방사선활성을 자동 NaI(Tl) 섬광 웰 계수기로 측정하고 결합된 분획물을 칼럼에 적용된 총 방사선활성의 %로 표현하였다.
주사 후 시점(시간) % 아비딘-결합 범위(%) 분석된 동물
0 99.2 99.1 - 99.3 -
1 99.4 99.4 - 99.5 3
8 99.4 99.4 - 99.4 3
24 99.3 99.2 -99.4 2
48 99.1 98.9 - 99.3 3
96 98.5 97.7 - 99.1 3
샘플 0은 주사된 접합체에 대한 것이다.
연구 기간동안에, 혈액내 존재하는 방사선활성의 아비딘으로의 결합이 감소하지 않았음을 검출할 수 있었다.
따라서, 바이오틴과 DOTA 킬레이트간의 연결은 주사한 후 96시간까지 혈액 순환에서 안정한 것으로 결론지었다.
혈장을 HPLC 크기 배척 칼럼상에서 분리하는 경우, 10분된 샘플을 47시간 샘플과 비교하는 경우 크기 분포의 상당한 변화가 나타나지 않았다(도 8).
실시예 9 - 발명의 가장 바람직한 양태에 따라 B 세포 림프종에서의 치료 섭생
치료 섭생은 하기의 반응들로 분리될 수 있다:
● 치료 전에(-7일) 모든 환자에게 1주일에 250mg/m2 용량의 리툭시맵을 투여하여 순환하는 B 세포를 제거하는 즉시, 진단학적 용량의 50 내지 150 MBq(1.5-4mCi) 111In-1033-리툭시맵을 투여한다.
● 0일째에, 모든 환자에게 250mg/m2의 리툭시맵을 투여한 후 즉시, 치료적 용량의 90Y-1033-리툭시맵(> 10MBq/kg 체중)을 투여한다. 환자에게 임의로 진단측정으로서 영상화하기 위해 사용되는 특정 용량의 150 내지 250 MBq(4 내지 7mCi) 111In-1033-리툭스맵을 투여할 수 있다.
● 1 또는 2일째에, 환자에게 미트라뎁을 처리하여 3개의 혈액 용적이 미트라뎁 장치를 통과하도록 한다.

Claims (40)

  1. 항림프종 항체 또는 이의 변형체로 접합된 3개 이상의 작용 부분 b) 내지 d)를 가지는 단일 분자인 시약을 포함하는 의약제로서, 상기 시약은,
    a) 3중 작용성 가교 결합 부분,
    b) 상기 3중 작용 가교 부분에 링커 1을 통하여 결합된 친화성 리간드,
    c) 상기 3중 작용 가교 부분에 링커 2를 통하거나 통하지 않고, 공유 결합된 작동성 제제, 및
    d) 상기 3중 작용 가교 부분에 링커 3를 통하거나 통하지 않고, 림프종 종양 세포의 표면상에 존재하는 하나 이상의 상이한 CD 항원과 상호작용하는 항림프종 항체 또는 이의 변이체와 결합하여 결합체를 형성할 수 있는 항 림프종 항체 반응 부분인 생체분자 반응 부분인 의약제.
  2. 제1항에 있어서, 항림프종 항체 또는 이의 변이체가 모노클로날이고 CD1 내지 CD247의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CD 항원(들)과 상호작용하는 의약제.
  3. 제2항에 있어서, 항림프종 항체 또는 이의 변이체가 CD19, CD20, CD22 및 CD30과 상호작용하고, 가장 바람직하게는 CD20과 상호작용하는 의약제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항림프종 항체가 이브리투모맵(ibritumomab), 리툭시맵(rituximab) 또는 토시투모맵(tositumomab)이고, 바람직하게는 리툭시맵인 의약제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항 림프종 변이체가, 림프종 종양 세포 표면상의 항 림프종 항체 반응 부분 및 상기 CD 항원/항원들 둘 모두에 대해 항 림프종 항체와 동일한 결합 능력 또는 본질적으로 동일한 결합 능력을 가지고, 상기 변이체가 항체 유도체, 바람직하게는 F(ab')2, F(ab') 또는 F(ab) 단편; 유전학적으로 조작된 하이브리드 또는 화학적으로 합성된 펩타이드, 바람직하게는 키메라 또는 인간화된 항체 및 단일쇄 항체인 의약제
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항림프종 항체 또는 이의 변이체가 5 x 106M-1 이상, 바람직하게는 108M-1 이상의 친화성 결합 상수로 림프종 종양 세포상의 세포 표면 항원에 결합하는 의약제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항림프종 항체 반응 부분 및 항림프종 항체 또는 이의 변이체간에 형성된 결합이 108M-1 이상의 결합 친화성 상수로 공유결합 또는 비공유 결합인 의약제.
  8. 제1항에 있어서, 항림프종 항체 반응 부분이 N-하이드록시-숙신이미드 에스테르, 설포-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 및 페놀산 에스테르로 이루어진 활성 에스테르; 아릴 및 알킬 이미데이트; 항림프종 항체상의 아미노 기와 반응하는 알킬 또는 아릴 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트 또는 항림프종 항체상의 설피들릴 기와 반응하는 말레이미드 또는 알파-할로이미드; 또는 천연적으로 존재하거나 합성적으로 항림프종 항체상에서 생성된 알데하이드 또는 케톤 기와 반응하는 아릴 또는 알킬하이드라진 또는 알킬 또는 아릴하이드록실아민의 군으로부터 선택된 의약제.
  9. 제8항에 있어서, 항림프종 항체 반응성 부분이 또한 본질적으로 항림프종 항체와 결합하는 것과 동일한 능력을 가지는 변이체를 포함하는 의약제.
  10. 제1항에 있어서, 작동성 제제가, 방사선핵종, 합성 또는 천연적으로 존재하는 독소, 프로-드럭을 전환시킬 수 있는 효소, 면역억제제 또는 면역자극제, 방사선감작제, X선 또는 MRI 또는 초음파에 대한 증진제, 비 방사선 활성 원소를 보유하는 항림프종 항체가 특정 세포 또는 조직에 축적된 후에 외부 조사에 의해 방사선 활성 원소로 전환될 수 있는 비방사선활성 원소, 또는 광활성 화합물 또는 광 영상화 또는 광 역학 치료에 사용되는 화합물, 또는 직간접적으로 림프종 세포 또는 림프종 조직상에 동일하거나 유사한 효과를 가지는 다른 분자를 가지거나 가지지 않는 방사선핵종 결합 부분인 의약제.
  11. 제10항에 있어서, 작동성 제제가 할로겐의 방사선핵종의 경우 아릴 할라이드 및 비닐 할라이드, Tc 및 Re 방사선핵종의 경우 N2S2 및 N3S 킬레이트, In, Y, Pb, Bi, Cu, Sm, 및 Lu 방사선핵종 또는 킬레이트와 복합체를 형성할 수 있는 다른 방사선핵종의 경우 아미노-카복시 유도체, 바람직하게는 EDTA 및 DTPA 또는 이의 유도체 및 사이클릭 아민, 바람직하게는 NOTA, DOTA 및 TETA 및 이의 유도체를 포함하는 의약제.
  12. 제11항에 있어서, DTPA 유도체가 Me-DTPA, CITC-DTPA 및 사이클로-헥실-DTPA인 의약제.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 작동성 제제가 DOTA를 포함하고 치료학적 적용을 위한 Y-90 및 진단학적 적용을 위한 In-111을 가지는 의약제.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 작동성 제제가 포지트론(positron) 영상화 방사선핵종, 바람직하게는, F-18, Br-75, Br-76 및 I-124; 치료 방사선핵종, 바람직하게는 Y-90, I-131, In-114m, Re-186, Re-188, Cu-67, Sm-157, Lu-177, Bi-212, Bi-213, At-211, Ra-223; 감마 영상화 방사선핵종, 바람직하게는 Tc-99m, In-111, I-123 및 I-125; 베타 방사선 방출물질, 바람직하게는 스칸듐-46, 스칸듐-47, 스칸듐-48, 구리-67, 갈륨-72, 갈륨-73, 이트륨-90, 루테늄-97, 팔라듐-100, 로듐-101, 팔라듐-109, 사마륨-153, 루테튬-177, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 골드-198, 라듐-212 및 납-212, 바람직하게는 요오드 131 및 인듐-m114; 및 포시트론 방출물질, 바람직하게 는 갈륨-68 및 지르코늄-89을 가지는 의약제.
  15. 제1항에 있어서, 친화성 리간드가 친화성 결합 상수가 106M-1 이상이고 바람직하게 108M-1 이상인, 상기 리간드에 대한 친화성을 가지는 또 다른 분자와 결합할 수 있는 의약제.
  16. 제15항에 있어서, 친화성 리간드가 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 임의의 다른 유도체, 상기 친화성 리간드와 본질적으로 동일한 결합 작용을 가지는 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 돌연변이체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 부분인 의약제.
  17. 제16항에 있어서, 친화성 리간드가 바이오틴, 또는 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 대해 바이오틴과 본질적으로 동일한 결합 작용을 가지는 바이오틴 유도체인 의약제.
  18. 제17항에 있어서, 바이오틴 유도체가 노르바이오틴, 호모바이오틴, 옥시바이오틴, 이미노바이오틴, 데스티바이오틴, 디아미노바이오틴, 바이오틴 설폭사이드 및 바이오틴 설폰 또는 본질적으로 동일한 결합 작용을 가지는 이의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택되는 의약제.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오틴을 방출시키기 위한 바이오틴아미드 결합의 효소적 분해, 바람직하게는 바이오티니다제에 의한 분해에 대한 안정성이 바이오틴 유도체, 바람직하게 노르바이오틴 또는 호모바이오틴을 사용함에 의해 개선되는 의약제.
  20. 제1항에 있어서, 3중 작용성 가교 결합 부분이 트리아미노벤젠, 트리카복시벤젠, 디카복시아닐린 및 디아미노벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 의약제.
  21. 제1항에 있어서, 링커 1이 부착부분 및 3중 작용성 가교 결합 부분와 친화성 리간드, 바람직하게는 바이오틴 부분 사이의 스페이서로서 작용하여 아비딘 또는 스트렙트아비딘 또는 다른 바이오틴 결합 종과의 결합이 입체 장애에 의해 감소되지 않는 의약제.
  22. 제21항에 있어서, 링커 1이 수소 결합형성 원자, 바람직하게는, 에테르 또는 티오에테르 또는 가이온 기, 바람직하게는 카복실레이트. 설포네이트 또는 암모늄 기를 함유하여 바이오틴 부분의 수 용해화를 보조하는 의약제.
  23. 제22항에 있어서, 바이오틴을 방출시키기 위한 바이오틴 아미드 결합의 효소적 분해, 바람직하게는 바이오티니다제에 의한 분해에 대한 안정성이 링커 1에 알파 카복실레이트 또는 N-메틸 기를 도입하여 제공되는 의약제.
  24. 제1항에 있어서, 링커 2가 1 내지 25개 원자, 바람직하게는 6 내지 18개 원자의 스페이서 길이를 가지는 의약제.
  25. 제24항에 있어서, 링커 2가 수소 결합형성 원자, 바람직하게는 에테르 또는 티오에테르, 또는 가이온 기를 함유하여 수 용해화를 보조하는 의약제.
  26. 제1항에 있어서, 링커 2가 배제되어 있는 의약제.
  27. 제1항에 있어서, 링커 3이 1 내지 25개 원자, 바람직하게는 6 내지 18개 원자의 스페이서 길이를 가지는 의약제.
  28. 제27항에 있어서, 링커 3이 에테르 또는 티오에테르와 같은 수소 결합형성 원자 또는 가이온 기, 바람직하게는 카복실레이트, 설포네이트, 또는 암모늄 기를 함유하여 수 용해화를 보조하는 의약제.
  29. 제1항에 있어서, 링커 3이 배제되어 있는 의약제.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 친화성 리간드 및/또는 하나 이상의 작동성 제제가 3중 작용성 또는 4중 작용성 가교결합 부분에 결합되어 있는 의약제.
  31. 제1항 내지 제25항 및 제27항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 작동성 제제에 결합되어 있고 항-CD20 항체가 바람직하게 리툭시맵이고, n이 2 내지 4이고, 바람직하게는 3이고, o가 1 내지 6이고, 바람직하게는 3이고, p가 1 내지 6이고, 바람직하게는 3이고, R2가 =CH2OH 또는 -CO2H이고 R1이 CH3, -CH2OH 또는 -H인 하기에 도시된 의약제.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 3-(13'-티오우레아벤질(DOTA)트리옥사디아민-1-(13"-바이오틴-Asp-OH)트리옥사민-5-이소티오-시아네이토-아미노이소프탈레이트-이브리토무맵, 3-(13'-티오우레아벤질(DOTA)트리옥사디아민-1-(13"-바이오틴-Asp-OH)트리옥사민-5-이소티오-시아네이토-아미노이소프탈레이트-리툭시맵 또는 1-이소시아네이토-3-((1S'-(N-바이오티닐)-β-L-아스파르틸)-4',7',10'-트리옥사-펜타-데카닐아미노)-1-((13-(벤질티오우레아-CHX-A")-4,7,10-트리옥사트리데칸디아민)-아미노시오프탈레이트-리툭시맵, 바람직하게는, 3-(3"-티오우레아-벤질(DOTA)트리옥사디아민-1-(13"-바이오틴-Asp-OH)트리옥사민-5-이소티오-시아네이토-아미노이소프탈레이트-리툭시맵인 의약제.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 의약제를 함유하고 생리학적으로 허용되는 첨가제, 바람직하게는 암모늄 아세테이트 용액을 추가로 포함하는 조성물.
  34. a) 의약제 및
    b) 친화성 리간드가 부착되는 고정화된 수용체를 포함하는 체외 장치를 포함하는, 포유동물 숙주의 혈장 또는 전혈에서 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 조직에 결합되지 않은 치료 또는 진단 의약제 농도를 체외 제거하거나 적어도 감소시키기 위한 키트로서, 상기 의약제가 이전에 포유동물 숙주로 도입되어 있고 숙주에서 부착되어 특정 조직 또는 세포 농축되도록 상기 숙주내에서 특정 시간 동안 유지되는 키트.
  35. 림프종, 바람직하게는 비호즈킨 림프종 치료용 약물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 의약제의 용도.
  36. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 항림프종 항체 또는 이의 변이체를 이를 필요로하는 환자에게 투여하여, 상기 항림프종 항체 또는 이의 변이체와 하나 이상의 세포 표면 항원을 가지는 백혈구간에 형성된 복합체가 환자의 신체로부터 제거된 후 제1항 내지 32항 중 어느 한 항에 따른 의약제를 상기 항림프종 항체 또는 이의 변이체와 함께 투여하여 세포의 림프종 종양상의 세포 표면 항원에 결합되지 않은 의약제를 체외 제거하는, 림프종, 바람직하게는 비호즈킨 림프종을 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 의약제의 작동성 제제가 90Y이고 의약제가 20MBq/kg 체중 이상의 단일 용량으로 투여되는 방법.
  38. 제2항 내지 제6항중 어느 한 항에 기재된 항림프종 항체 또는 이의 변이체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하고, 항림프종 항체 또는 이의 변이체와 하나 이상의 세포표면 항원을 가지는 백혈구간에 형성된 복합체가 환자의 신체로부터 제거된 후 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 의약제를 항림프종 항체 또는 이의 변이체와 함께 투여하여 림프종 종양 세포상의 세포 표면 항원에 결합되지 않은 의약제를 체외 제거하는, 림프종, 바람직하게는 비호즈킨 림프종을 진단하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 의약제의 작동성 제제가 90Y 또는 111In이고 의약제가 90Y 의 측면에서 10 내지 20, 바람직하게는 11 내지 15의 MBq/kg 체중의 용량 범위로 투여되고 111In 측면에서 20 내지 250, 바람직하게는 50 내지 150의 MBq/kg 체중의 용량 범위로 투여되는 방법.
  40. 작동성 제제가 111In인 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 의약제가 50 내지 150MBq/kg 체중의 용량범위로 환자에게 투여되고 작동성 제제가 90Y인 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 의약제가 20이상의 MBq/kg 체중의 용량범위로 투여되며 모두가 6 내지 8일 간격으로 연속적으로 또는 동시에 투여되는, 림프종, 바람직하게는, 비호즈킨 림프종의 조합된 진단 및 치료 방법.
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