KR20050065411A

KR20050065411A - 핵산 표식 방법 및 액 조성물

Info

Publication number: KR20050065411A
Application number: KR1020040111871A
Authority: KR
Inventors: 이시이미에; 스즈키토모히로
Original assignee: 캐논 가부시끼가이샤
Priority date: 2003-12-25
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2005-06-29
Also published as: JP2005185183A; US7534566B2; JP4508632B2; CN100590201C; EP1548132A1; CN1661111A; KR100704296B1; US20050186595A1

Abstract

표식 물질의 사용량을 최소로 억제할 수 있고, 또 효율 좋게 표식 물질을 검사대상 산물인 타겟 핵산에 편입시킬 수 있는 핵산 표식 방법을 제공한다. 산물중의 타겟 핵산 서열을 PCR로 증폭하면서 표식화할 때에, A, T, C 및 G의 4종의 기질 가운데 적어도 1종을 표식화할 기질로서 선택해서, 선택된 기질의 농도를 선택하지 않았던 기질의 농도보다도 낮게 조정하고, 또한, 선택된 기질에 적어도 표식화된 기질을 포함시킨다.

Description

핵산 표식 방법 및 액 조성물{NUCLEIC ACID LABELING METHOD AND LIQUID COMPOSITION}

본 발명은, DNA 칩에 이용되는 표식 PCR(polymerase chain reaction) 산물(product)에 관한 것이며, 또한, 시료 핵산을 표식하는 방법 및 핵산 표식에 이용되는 액 조성물에 관한 것이다. 본 발명은, 또한, 검체에 대한 고감도의 검출방법에 관한 것이다.

인간 게놈 계획으로 대표되는 바와 같이, 각종의 생물의 유전자가 해명되어 있다. 생명 활동의 메카니즘, 병, 체질 등의 인자와 유전자의 관련이 차례로 조사되어 있다. 그 결과, 특이 유전자의 유무나 그의 발현량(존재량)을 구함으로써, 병을 보다 상세히 특징짓거나 분류할 수 있고, 또 그의 효과적인 치료 방법을 선택할 수 있는 것을 알게 되었다.

시료에 포함되어 있는 특정 유전자의 유무나 그 존재량을 조사하는 방법은, 옛부터 많은 방법이 제안되어 있지만, 타겟 유전자 혹은 핵산의 특이적인 부분서열을 선택해서, 시료중에 그 부분서열의 유무나 그 양을 조사하는 방법이, 그 중에서도 응용범위가 넓기 때문에, 이러한 유전자의 유무를 아는데 널리 이용되고 있다. 구체적으로는, 이 방법은, 선택된 부분 서열의 상보 쇄(사슬)에 상당하는 핵산(프로브)을 준비해서, 시료와 프로브간의 하이브리다이제이션을 어떠한 수단으로 검출함으로써, 시료중의 핵산 서열의 유무를 정하고 있다.

하이브리다이제이션을 이용한 특정의 핵산의 검출은, 고상이든 액상이든 어느 것에서도 수행할 수 있다. 예를 들면, 고체 기질상에서 하이브리다이제이션을 수행하는 경우에는, 대표적인 방법은, 프로브를 고체 기질상에 고정 또는 흡착시키고 나서, 그것에 어떠한 검출 가능한 표식 물질에 의해 표식한 시료를 첨가해서, 고체 기질상의 표식 물질의 신호를 측정함으로써 검출한다. 특히, 1개이상의 프로브를 유리나 금속 등의 평면 기판상에 고정 혹은 흡착시킨 칩, 혹은 미립자의 표면에 고정한 프로브를 담지한 비즈 등은 고상 하이브리다이제이션에 사용되는 대표적인 형태이다. 고상의 하이브리다이제이션이 선호되는 이유는, B/F분리가 용이한 점, 검출 영역을 물리적으로 미소화할 수 있어 고감도화를 기대할 수 있는 점, 복수종의 프로브를 물리적으로 격리함으로써 동시 다항목의 검출이 가능한 점 및 고상이기 때문에 그 취급이나 응용분야를 용이하게 할 수 있는 점 때문이다.

예를 들면, 미국 특허 제 6,410,229호 명세서에서 개시되어 있는 바와 같이, 평면 기판상에 합성된 올리고 DNA에 대해, 표식된 시료 핵산을 작용시켜, 그 하이브리다이제이션을 형광 검출에 의해 측정하여, 그 시료중의 특정의 핵산의 유무나 그 양을 검출하고 있다. 또, 일본국 공개특허 제 2001-128683호 공보에 개시되어 있는 바와 같이, 아미노기가 도입된 기판을 이용해서 DNA 어레이를 제작하여, 표식된 22 mer의 1본쇄 DNA를 검출하고 있다.

그런데, 상기와 같은 하이브리다이제이션을 이용한 특정의 핵산의 검출 방법에서는, 시료 핵산이 표식되어 있을 필요가 있다. 해당 시료에 표식 물질을 편입(incorporation)시키는 하나의 방법은, PCR에 있어서 표식된 데옥시뉴클레오티드(예를 들면, Cy3-dUTP)를 부가시키는 것이다.

그 경우, PCR시의 기질로 4종의 데옥시뉴클레오티드(dATP, dCTP, dGTP, dTTP: 총칭해서 dNTP)와 표식된 데옥시뉴클레오티드(예를 들면, Cy3-dUTP)를 조제해서, 모든 dNTP의 최종농도를 동일하게 한다. 예를 들면, 일본국 특허 제 3,001,919호 공보에 개시되어 있는 바와 같이, 4종의 기질 뉴클레오티드중 1종을, 형광 표식된 뉴클레오티드로 부분적으로 치환해서, 해당 산물의 표식화를 행한다.

상기 설명한 바와 같이, 고상의 하이브리다이제이션을 이용한 검출 방법은, 다른 검출 방법에 비해 보다 고감도라고 하는 점에서 장점은 있지만, 흔적량의 핵산 검출에 대한 요구는 그 이상으로 높고, 따라서, 이러한 검출방법에 대해서는, 보다 고감도의 고특이적인 검출을 실현하기 위한 새로운 개량이 요구되고 있다. 검출 성능의 향상에 대응하기 위해서, 여러가지 시도가 행해지고 있다. 그 하나의 방법은, 예를 들면 프로브-타겟 하이브리드체의 Tm값을 증가시키도록 프로브를 설계해서, 프로브의 타겟에 대한 결합력을 증대시키는 것이다. 또 다른 방법은, 타겟을, 강한 신호를 내는 물질로 표식시키거나, 혹은 표식 물질 그 자체를 수개의 표식 물질을 이용해서 증강(증감제(sensitizer))시키는 것이다.

그러나, 프로브의 타겟에 대한 결합력을 높이는 방법은, 비특이적인 흡착이나 결합을 일으켜, 특이성을 크게 저하시키는 경우가 있으므로, 이러한 방법의 이점은 한정적이다. 한편, 표식 물질의 신호를 증폭하는 방법은, S/N비나 정량성을 현저하게 저하시키는 경우가 있어, 이러한 방법의 이점은 한정적이다.

따라서, 핵산 검출을 보다 효율적으로 가능하게 하는 시료에의 표식 물질의 효과적인 편입 방법의 개발이 강하게 요구되고 있었다. 상기 설명한 종래의 시료에의 표식 물질의 편입 방법에서는, PCR동안 표식된 데옥시뉴클레오티드를 부가하는 것인 바, PCR시의 기질로서 표식안된 데옥시뉴클레오티드가 다량 존재하므로, 증폭 산물에는 그다지 많지 않은 표식 물질이 편입되어, 합성된 증폭산물의 양에 대해서 하이브리다이제이션에 의한 검출량이 일치하지 않는 경우가 생길 수 있다고 하는 문제점이 있다.

또, 최종 농도를 동일하게 한 dNTP를 이용하는 표식방법의 경우, 어느 정도 표식된 데옥시뉴클레오티드의 비율을 증가시키면, 효율 좋게 표식 물질이 편입되지만, 표식된 데옥시뉴클레오티드는 매우 고가여서, 그 적용 범위가 한정되는 경우가 있다.

본 발명의 목적은, 상기 문제점을 해결하기 위하여, 표식 물질의 사용량을 가능한 한 저감시켜, 효율 좋게 표식 물질을 산물(검출 대상으로 되는 타겟 핵산)에 편입시킬 수 있는 핵산 표식 방법을 제공하는 것에 있다.

상기 목적을 달성하기 위해 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은, 표식된 데옥시뉴클레오티드를 4종의 기질 데옥시뉴클레오티드중 하나에 부가할 경우, 선택되었으나 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 농도를 다른 뉴클레오티드의 농도보다도 낮게 조정해서 표식된 데옥시뉴클레오티드의 비율을 증가시키면, 표식 기질(표식된 데옥시뉴클레오티드)이 효율적으로 산물에 편입될 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일측면은, 표식 물질을 산물에 편입시키면서 PCR에 의해 타겟 핵산의 증폭을 행하는 핵산 표식 방법에 있어서, 상기 PCR용 반응액이 염기종 A, T, C 및 G의 4종의 데옥시뉴클레오티드 기질을 포함하고, 1종류에서 3종류의 기질을 표식용으로 선택해서, 각 선택된 기질의 농도를, 임의의 선택되지 않은 기질의 농도보다도 낮게 조정하고, 상기 각 선택된 기질은, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드와 표식된 데옥시뉴클레오티드를 포함하고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 측면은, 타겟 핵산을 함유하는 시료를 고체 기질상에 고정된 프로브와 반응시켜, 해당 고체 기질상에 고정된 프로브와 하이브리다이즈한 상기 타겟 핵산을, 해당 타겟 핵산에 편입된 표식 물질을 이용해서 검출하는 타겟 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법에 의한 핵산 표식 방법에 의해 준비된 표식된 PCR 산물인 것을 특징으로 한다.

또, 본 발명의 또 다른 측면은, 표식 물질을 산물에 편입시키면서 PCR에 의해 타겟 핵산의 증폭에 이용하기 위한 염기종 A, T, C 및 G의 4종의 데옥시뉴클레오티드를 포함하는 액 조성물에 있어서, 1종류에서 3종류의 기질을 표식용으로 선택해서, 각 선택된 기질의 농도를, 임의의 선택되지 않은 기질의 농도보다도 낮게 조정하고, 상기 각 선택된 기질은, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드와 표식된 데옥시뉴클레오티드를 포함하고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일측면은, 하기 (A) 내지 (C): (A) 타겟 핵산의 증폭을 위한 PCR프라이머; (B) 표식 기질을 산물에 편입시키면서 PCR에 의해 타겟 핵산의 증폭에 이용하기 위한 염기종 A, T, C 및 G의 4종의 데옥시뉴클레오티드를 포함하고, 1종류에서 3종류의 기질을 표식용으로 선택해서, 각 선택된 기질의 농도를, 임의의 선택되지 않은 기질의 농도보다도 낮게 조정하고, 상기 각 선택된 기질이, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드와 표식된 데옥시뉴클레오티드를 포함하고 있는 액 조성물; 및 (C) 상기 타겟 핵산과 반응하기 위한, 고체 기질상에 배치된 프로브를 지닌 고상 프로브를 구비한 것을 특징으로 한다.

상기 고상 프로브는 DNA 마이크로어레이인 것이 바람직하다.

본 발명의 기타 특징 및 이점 등은 첨부도면과 관련해서 취한 바람직한 실시형태의 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이고, 도면에 있어서 동일 또는 유사한 부분은 동일한 참조 문자로 표기한다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 첨부도면을 참조해서 상세히 설명한다.

표식 기질을 증폭 산물(산물)에 편입시키면서 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의해 타겟 핵산의 증폭을 행하는 본 발명의 핵산 표식 방법은, dATP(데옥시아데노신 트리포스페이트), dTTP(데옥시티민 트리포스페이트), dCTP(데옥시시티딘 트리포스페이트) 및 dGTP(데옥시구아노신 트리포스페이트)의 4종의 데옥시뉴클레오티드 기질중, 1종류에서 3종류의 기질을 표식화하고자 선택하고, 임의의 선택되지 않은 기질의 농도에 비해 선택된 기질의 농도를 적게 조정하고, 각 선택된 기질은 표식된 데옥시뉴클레오티드와 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드를 포함하고 있는 것을 특징으로 한다. 특히, 표식된 데옥시뉴클레오티드와 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드를 포함하고 있는 선택된 기질의 총농도는, 임의의 선택되지 않은 기질의 농도보다도 낮게 조정한다. 이러한 표식화 조건을 이용한 PCR 증폭에 의해 산물을 조제함으로써, 타겟 핵산은 증폭 과정에서 효율 좋게 표식 물질을 편입시키는 것이 가능해진다.

또, 표식된 데옥시뉴클레오티드의 농도가 높을 수록, 표식 물질의 편입에는 유리하다. 선택된 기질에 함유된 표식된 데옥시뉴클레오티드의 농도는, PCR 반응액중에서 20μM이상으로 조정하면, 본 발명은 한층 더 효과적이다. 각 선택되지 않은 기질의 농도를 PCR 반응액중에서 150μM에서 300μM사이로 조정하고, 선택된 기질의 농도를 선택되지 않은 기질의 농도의 5몰%에서 80몰%사이로 조정하고, 선택된 기질에 있어서, 표식된 데옥시뉴클레오티드의 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드에 대한 몰비를 0.25이상으로 조정하는 조건하에서 산물을 조제하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 선택된 기질은 각 선택되지 않은 기질의 10몰%에서 40몰%사이로 되도록 조정한다. 한층 더 바람직하게는, 선택된 기질에 있어서, 표식된 기질의 표식되지 않은 기질에 대한 비율(몰수기준)을 1이상으로 조정한다. 이러한 조건하에서 산물을 조제하면, 적은 양의 표식된 기질을 이용해도, 효율 좋게 타겟 핵산에 표식 물질을 편입시킬 수 있다.

표식 물질의 종류는 특히 제한되지 않고, 어떠한 표식물질도 본 발명에 이용가능하다. 일반적으로, 고감도 검출을 행하는 것이 가능한 형광 물질 등을 이용한다. 그 중에서, Cy3, Cy5 등의 CyDye(상품명, 아머샴 바이오사이언스사 제품)는, 핵산 표식용의 형광 물질로서 통상 이용되며, 이들 형광 물질은 본 발명에 있어서 특히 유효하다. 또, 비오틴, 아미노알릴계 화합물 등의 핵산 표식용 물질도 본 발명의 산물 제조 방법에 유효하다.

본 발명의 표식 방법에 의해 조제한 타겟 핵산은, 고체 기질상에서 하이브리다이제이션에 의해 검출하는데 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조한 타겟 핵산의 양은 저하하는 경우가 있지만, 적은 양의 산물을 감도 좋게 검출할 수 있는 검출 디바이스, 특히 DNA 마이크로어레이에 이용할 때 특히 유효하다. 게다가, DNA 마이크로어레이의 1개의 스폿의 면적은 10^-6㎡ 이하가 바람직하다. 또, 스폿 면적의 하한은, 목적으로 하는 분석 용도에 이용되는 스캐너 등의 측정장치의 감도에 따라 설정할 수 있다. 예를 들면, 스폿 면적은, 거의 1O^-12㎡까지 작게 할 수도 있다.

또, 본 발명은 상기 조제 방법에 이용하는 액 조성물도 제공한다.

이하, 본 발명의 핵산 표식 방법에 대해 상세히 설명한다.

본 발명의 핵산 표식 방법에서는, 타겟으로서의 핵산을 PCR로 증폭할 때에, PCR용의 기질로서 이용되는 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP의 4종의 데옥시뉴클레오티드중, 1종류에서 3종류의 기질을 표식용으로 선택한다. 선택된 기질의 농도를, 선택되지 않은 기질의 농도보다도 낮게 조정하고, 선택된 기질은, 적어도 표식된 데옥시뉴클레오티드를 포함한다. 표시될 선택된 기질에 대해서는, 표식된 데옥시뉴클레오티드와 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드를 조합해서 이용한다. 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 농도를, 표식대상으로서 선택되지 않은 기질의 농도보다도 낮게 조정하므로, 표식된 데옥시뉴클레오티드의 비율이 증가해서, 표식된 기질을 효율 좋게 편입시킬 수 있다.

또, 선택된 기질의 총농도를 임의의 선택되지 않은 기질의 총농도보다도 낮게 조정함으로써, 그 효과가 증대된다. 예를 들면, dTTP를 표식용의 기질로서 선택했을 경우는, dTTP와 표식된 dUTP의 총농도를, 선택되지 않은 기질 dATP, dCTP 및 dGTP의 총농도보다도 낮게 조정한다(dTTP + 표식된 dUTP의 농도 < dATP, dCTP 또는 dGTP의 농도).

또한, 선택된 기질과 선택되지 않은 기질과의 관계는, 각 기질에 대해 독립적으로 적용된다. 예를 들면, 2종이상의 기질이 선택된 경우, 선택된 2종의 기질의 각각은, 2종의 선택되지 않은 기질의 각각의 농도의 관계를 만족한다.

여기서 이용되는 용어 "기질"은, PCR용의 기질, 즉, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP중의 하나를 의미한다.

PCR에 있어서, DNA 폴리메라제(TaKaRa사 제품인 Ex Taq)에 대한 데옥시뉴클레오티드의 최적농도는, 200μM정도인 것으로 여겨진다. 일반적으로, 효소의 기질 특이성 때문에, 화학적으로 표식된 데옥시뉴클레오티드의 편입은 본래의 데옥시뉴클레오티드보다도 어렵다. 그래서, 예를 들면, 표식된 데옥시뉴클레오티드와 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 총농도는, 100μM로 조정하고, 표식된 데옥시뉴클레오티드의 농도를 50μM로 조정하는 것이 바람직하다. 그 결과, PCR 산물에는 보다 많은 양의 표식 물질이 편입되게 된다. 선택된 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 양을 적게 함으로써, 반응이 감쇄되어, 본질적으로는 편입되기 어려운 부피가 커진 표식된 데옥시뉴클레오티드를 PCR산물에 편입시키는 것이 가능해진다. 또, 데옥시뉴클레오티드의 양을 30% 정도 증감시켜도 본 발명의 산물 조제 방법은 허용가능하다.

따라서, 표식화용으로 선택된 기질의 농도(표식된 데옥시뉴클레오티드와 표식화되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 총 농도)를, 표식화용으로 선택되지 않은 기질의 농도의 5몰% 내지 80몰%로, 보다 바람직하게는, 10몰% 내지 40몰%로 조정하는 것이 바람직하다. 또, 표식화용으로 선택되지 않은 각 기질의 농도를 150μM 내지 300μM로 하는 것이 바람직하다. 또한, 표식화용으로 선택된 각 기질의 농도(표식화된 데옥시뉴클레오티드와 표식화되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 총 농도)를 20μM이상으로 하는 것이 바람직하다. 더욱이, 표식화용으로 선택된 기질에 있어서 표식된 데옥시뉴클레오티드의 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드에 대한 몰비는 0.25이상, 바람직하게는 1이상 약 50이하로 조정한다.

타겟 핵산의 염기 서열을 지닌 PCR 증폭 산물의 염기길이는 특히 제한은 없지만, 100bp에서 2000 bp 사이일 경우 특히 유효하다.

표식 물질로서는 형광 물질 등을 이용할 수가 있다. 특히, Cy3, Cy5를 대표예로 하는 CyDye(아머샴 바이오사이언스사 제품)는, 핵산 표식용의 형광 물질로서 통상 이용되고, 이들 형광 물질은 본 발명에 대해 특히 유효하다. 또, 비오틴, 아미노알릴 등도 본 발명의 핵산 표식 방법에는 유효하다. 비오틴은 Cy3에 비해 분자의 크기가 작기 때문에, PCR때의 입체 장해는 비교적 적지만, 본 발명의 방법에 의해, 비오틴의 PCR 산물에의 편입이 향상될 수 있다. 표식될 데옥시뉴클레오티드로서는, 티민이 통상 이용되고 있어, 티민에 대응하는 표식 시약도 많이 시판되고 있다. 본 발명은 이들에도 적용할 수가 있다.

본 발명의 표식 방법에 의해 표식된 타겟 핵산은, 고체 기질의 표면에 고정된 프로브와의 하이브리다이제이션에 의해 2본쇄로 된다. 이 프로브와 결합하고 있는 타겟 핵산중의 표식 물질의 신호를 측정함으로써, 고감도 검출을 행할 수 있다. 고상 하이브리다이제이션을 이용한 고감도의 검출 디바이스로서는, 여러가지 물질 및 형태가 알려져 있지만, 이것들에 대해서 본 발명은 제한없이 적용가능하다. 이러한 디바이스의 대표예는, 유리 기판상에 핵산을 고정화함으로써 형성된 DNA 마이크로어레이이며, 이러한 DNA 마이크로어레이는, 본 발명의 방법에 의해 작성된 타겟 핵산의 검출에 특히 바람직하게 이용될 수 있다. 고체 기질에 이용가능한 재질로서는, 수지, 금속, 금속 박막, 섬유 등을 들 수 있다. 또, 고체 기질의 형태의 예로서는, 미립자, 광섬유 에지, 다공질 재료, 섬유 등을 들 수 있다.

고체 기질에의 프로브의 결합 방법으로서는 흡착이나 화학 결합 등 여러가지 방법이 있지만, 어느 결합 방법도, 본 발명의 방법에 적용 가능하다. 예를 들면, 이온 결합의 경우, 아미노기로 피복되어 있는 유리 혹은 수지 기판의 표면에 대해, 본래의 핵산을 부가하는 것만으로 해당 핵산을 결합시킬 수가 있다. 또는, 5'말단 혹은 3'말단상에 아미노기나 티올기 등의 작용기를 지닌 변성 올리고뉴클레오티드를 이용해 고정화하는 일도 가능하다. 예를 들면, 아미노기를 이용하는 경우, 고체 기질 표면에 아미노기와 효율적으로 반응하는 숙신이미드기를 미리 고정화시켜, 아미노변성 올리고뉴클레오티드를 해당 고체 기질 표면에 부가함으로써, 공유결합을 형성시킨다. 이 결합된 올리고뉴클레오티드를, 본 발명의 타겟 핵산을 검출하기 위한 프로브로서 바람직하게 이용하는 것이 가능하다. 또, 올리고뉴클레오티드를 변성해서 티올기를 지니도록 하는 경우에는, 예를 들면, 고체 기질에 말레이미드기를 도입해서, 아미노기를 이용하는 경우와 같이, 올리고뉴클레오티드와 공유결합을 용이하게 형성하여, 이 결합된 올리고뉴클레오티드를, 본 발명의 타겟 핵산을 검출하기 위한 프로브로서 바람직하게 이용하는 것이 가능하다. DNA용액은, 고체 기질에 잉크젯 인자법에 따라 공급할 수 있다. 이 잉크젯 인자법으로 제작된 DNA 마이크로어레이는, 프로브의 스폿이 매우 작은 것이 특징이며, 검출에는 S/N비도 중요한 팩터가 되지만, 본 발명의 표식 방법에 의해 증폭된 타겟 핵산은, 타겟 분자 당 보다 많은 표식 화합물량을 함유하기 때문에, S/N비의 향상 효과도 있어, 특히 효과적이다.

또, 본 발명의 표식 방법은, 1종류의 타겟를 증폭하는 싱글 PCR 뿐만 아니라, 멀티플 PCR이나, 프라이머의 농도가 다르게 설정되어 어느 한 쪽 1본쇄를 적극적으로 증폭시키는 비대칭 PCR에 대해도 유효하다.

또한, 본 발명의 핵산 표식방법에 이용되는 데옥시뉴클레오티드를 포함하는 액조성물은, 진단 키트나 PCR 프레믹스의 형태로 제공하는 일도 가능하다. 이러한 액조성물은, 예를 들면 PCR용으로 적용가능한 물을 주체로 하는 수성 매체와, 상기의 데옥시뉴클레오티드의 조합, 효소가 기능하기 위해서 필요한 성분 및 프라이머가 어닐링하기 위해서 필요한 염농도를 얻기 위한 각종 첨가제, 구체적으로는 Tris-Cl, KCl, (NH₄)₂S0₄, MgCl₂ 등을 함유한다.

따라서, 본 발명의 표식 방법에 의하면, 시료에 있어서의 검출대상으로 되는 타겟 서열을 증폭해서 표식화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 표식방법은, 고상 하이브리다이제이션법 등의 표식된 핵산 산물을 프로브와 하이브리다이즈시키는 분석 방법에 이용될 표식된 산물의 조제 방법으로서 바람직하게 이용할 수 있다.

또, 본 발명은, 하기 (A) 내지 (C):

(A) 타겟 핵산의 증폭에 이용되는 PCR프라이머;

(B) 4종의 데옥시뉴클레오티드 A, T, C 및 G를 포함하고, 이들 4종의 데옥시뉴클레오티드로부터 1종류에서 3종류의 데옥시뉴클레오티드를 선택해서, 각 선택된 데옥시뉴클레오티드의 농도를, 임의의 선택되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 농도보다도 낮게 조정하고, 상기 각 선택된 데옥시뉴클레오티드가, 표식된 데옥시뉴클레오티드를 포함하고 있는 액 조성물; 및

(C) 고체 기질상에 배치된 상기 타겟 핵산과 반응하기 위한 프로브를 구비한 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 검출용 키트를 제공한다. 고상 프로브는 DNA 마이크로어레이가 바람직하다.

상기 구성에 의하면, 검출용 키트는, 타겟 핵산의 검출감도를 높게 할 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해, 본 발명을 한층 더 구체적으로 설명한다. 다만, 이하의 실시예는, 단지 본 발명을 수행하기 위한 최량의 실시 형태의 수개의 예이지만, 본 발명의 범위는 이것들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

I. pUC118 EcoRI/BAP의 PCR

(1) 프라이머의 설계

시판의 벡터 pUC118 EcoRI/BAP(3,162bp)(타카라(Takara)사 제품)의 염기 서열에 의거해서, 후술하는 프라이머 2종을 설계하였다. 또, pUC118 EcoRI/BAP의 전체 염기 서열에 관한 정보는, 타카라사 또는 공개되고 있는 데이타베이스 등으로부터 입수 가능하다. 프라이머는, pUC118 EcoRI/BAP중의 소망의 부분 염기 서열이 해당 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 특이적이고 효율적으로 증폭될 수 있도록, 서열, GC% 및 ds융해 온도(Tm값)를 충분히 고려해서 설계하였다.

이와 같이 해서 설계된 2종의 프라이머는, 포워드 프라이머(F)와, 리버스 프라이머(R)이다. pUC118 EcoRI/BAP를 템플릿으로 이용하여, F와 R을 조합해서 이용하여 PCR 증폭을 행함으로써, 1,324bp의 PCR 산물이 증폭되게 된다. 설계된 프라이머의 염기서열 및 Tm값을 표 1에 표시한다.

명칭	염기서열	Tm(℃)
F	5' TGATTTGGGTGATGGTTCACGTAG 3'	60.9
R	5' ATCAGCAATAAACCAGCCAGCC 3'	61.5

또, pUC118 EcoRI/BAP 전체 길이에 있어서의 2종의 프라이머(F 및 R)와 프로브(P)의 위치는, 도 1에 표시되어 있다. 또한, 이 도 1에 있어서, 화살표는, 각 프라이머의 5'에서 3'방향을 나타내고 있다.

(2) 프라이머의 합성

상기 실시예 1의 (1)에서 설계한 2종의 프라이머를 합성하였다. 각 프라이머는, 소정의 서열의 DNA사슬을, 종래의 방법 및 DNA 합성기를 이용해서 합성하여 준비하였다. 얻어진 산물을 카트리지 정제하여, 2종의 프라이머를 얻었다. 얻어진 프라이머는, TE완충액으로 10μM로 희석하였다.

(3) PCR 증폭 반응

상기 (2)에서 합성한 2종의 프라이머, 템플릿으로서 타카라사 제품인 벡터 pUC118 EcoRI/BAP 및 시판의 PCR 키트(TaKaRa Ex Taq, 타카라 바이오 주식회사 제품)를 이용해서, PCR 증폭을 실시하였다. 이 PCR키트에는, dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP의 4종의 데옥시뉴클레오티드로 이루어진 dNTP 혼합물(mixture)(각각 2.5mM)이 포함되어 있다. 각각의 농도를 조정하기 위해서, 아머샴 바이오사이언스사 제품인 시퀀싱 그레이드 솔루션(Sequencing Grade Solution) dNTPs를 이용하였다. 또, PCR 산물을 형광 표식에 의해 표식하기 위해, 아머샴 바이오사이언스사 제품인 Cy3-dUTP를 이용하여, 상기 산물을 Cy3에 의해 표식하였다. 또한, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 용액에 관해서는, 해당 혼합물중의 농도를 하기 표 2에 표시한 바와 같이 해서 dNTP 혼합물을 조제하였다. 비교를 위해서, 종래의 방법에 의해 dNTP혼합물(STd.)도 조제하였다.

dNTP 혼합물의 조성

	Std.	Mix1	Mix2	Mix3	Mix4	Mix5	Mix6
dATP	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM
dCTP	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM
dGTP	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM	5.0mM
dTTP	5.0mM	4.0mM	2.0mM	1.0mM	0.5mM	0.25mM	0mM

상기 (1)에 기재한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 이용해서 PCR 증폭을 행하였다. 하기 기재한 프로토콜에 의해, 표 2에 표시한 dNTP 혼합물(Std., Mix1 - Mix6)을 이용해서 표 3에 표시한 반응액을 조제하였다.

반응액의 조성

성분	조성
Takara Ex Taq	0.5㎕(2.5U)
10×Ex Taq Buffer(20mM Mg²⁺)	5.0㎕
Template DNA(Takara사 pUC118 희석물)	1.0㎕(10ng)
포워드 프라이머(F)	2.5㎕(25pmo1/tube)
리버스 프라이머(R)	2.5㎕(25pmo1/tube)
dNTP 혼합물(Std., Mix1~Mix6)	2.0㎕(*)
Cy3 dUTP(1.0mM, 아머샴 바이오사이언스사 제품)	2.0㎕(40μM)
H₂O	34.5㎕
합계	50㎕

(*) Mix1 ~ Mix6 및 Std.는 dTTP농도가 다르므로, 별도로, 표식된 dNTP와 표식되지 않은 dNTP의 최종농도는 표 4에 표시한다.

표 3에 표시한 바와 같이 조제한 반응 용액중의 dNTP 농도를 하기 표 4에 표시한다. 또, dATP, dCTP 및 dGTP는 표 4에서 200μM의 농도로 함유되었으며, 이것은, 이하의 실시예에 대해서도 마찬가지이다.

반응액중의 데옥시뉴클레오티드의 농도

	Std.	A(Mix1)	B(Mix2)	C(Mix3)	D(Mix4)	E(Mix5)	F(Mix6)
dATP, dCTP, dGTP	200μM	200μM	200μM	200μM	200μM	200μM	200μM
dTTP	200μM	160μM	80μM	40μM	20μM	10μM	0μM
Cy3-dUTP	40μM	40μM	40μM	40μM	40μM	40μM	40μM
dTTP+Cy3-dUTP	240μM	200μM	120μM	80μM	60μM	50μM	40μM

이와 같이 해서 조제된 각 반응액에 대해, 시판의 서멀 싸이클러를 이용해서 하기 표 5에 표시한 온도 사이클 프로토콜에 따라, PCR 증폭을 실시하였다.

PCR 증폭시의 온도조건

스텝	온도		유지시간	반복회수
1	94℃	(변성)	30초	25사이클
2	55℃	(어닐링)	45초
3	72℃	(신장)	1분
4	72℃		10분

증폭반응종료후, PCR 증폭 산물은, 정제용 컬럼(퀴아겐 퀴아퀵 PCR 정제 키트)(QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit)를 이용해서 정제하였다. 정제완료후, PCR 증폭 산물 용액을 50㎕로 조정하였다. 다음에, 얻어진 정제된 PCR 증폭 산물 용액의 일부를 종래의 방법에 의해 전기영동을 행하여, 7종의 PCR 산물 각각에 대해서 소망의 염기길이를 지닌 밴드가 나타난 것이 확인되었다. PCR 증폭 산물의 농도를 표 6에 표시한다.

PCR 증폭 산물의 농도

	Std.	A(Mix1)	B(Mix2)	C(Mix3)	D(Mix4)	E(Mix5)	F(Mix6)
산물의 농도	50.0nM	47.9nM	30.1nM	14.2nM	9.6nM	3.0nM	0nM

표 6에 표시한 바와 같이, 반응액중에 dTTP의 양이 증가할 수록, 얻어진 PCR 증폭산물의 양도 많아졌다.

II. DNA 마이크로어레이의 제작

(1) 프로브의 설계 및 합성

프로브는, 상기 PCR산물에 대해서, 설계된 부분핵산서열을 특이적으로 인식할 수 있도록 서열, GC% 및 융해 온도(Tm값)를 충분히 고려해서 설계하였다.

설계된 프로브의 염기서열 및 Tm값을 하기 표 7에 표시한다

명칭	염기서열	Tm(℃)
P	5' GATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGC 3'	75.7

이 프로브 설계에 대해서는, R 프라이머로부터 신장한 DNA사슬이, 프로브와 하이브리다이제이션되어, 프로브와 하이브리드체를 형성한다.

(2) 유리 기판의 세정

합성 석영 유리로 이루어진 기판(크기(W×L×T): 25mm×75mm×1㎜; 이이야마 특수 유리사 제품)을 내열·내알칼리성의 랙(rack)에 놓았다. 이어서, 해당 랙을, 소정의 농도를 지니도록 조정한 초음파 세정용의 세정액에 담그었다. 상기 랙을 하룻밤 세정액에 담근 후, 20분간 초음파 세정을 실시하였다. 계속해서, 유리 기판을 용액으로부터 꺼내, 가볍게 순수로 헹군 후, 초순수중에서 20분간 초음파 세정을 실시하였다. 그 후, 80℃로 가열한 1N 수산화 나트륨 수용액중에 10분간 유리 기판을 담그었다. 다시, 순수 세정과 초순수 세정을 실시한 후, DNA 칩용의 세정된 석영 유리 기판을 준비하였다.

(3) 표면 처리

실란커플링제 KBM-603(신에츠 실리콘사 제품)을, 1%의 농도가 되도록 순수중에 용해시켰다. 얻어진 용액을 실온에서 2시간 교반하였다. 계속해서, 상기 세정된 석영 유리 기판을, 이 실란커플링제 수용액에 담그어, 20분간 실온에 방치하였다. 그 후, 유리 기판을 해당 용액으로부터 끌어올려, 해당 기판의 표면을 가볍게 순수로 세정하였다. 그 후, 유리 기판의 양면에 질소 가스를 내뿜어 건조시켰다. 다음에, 질소 가스 불어넣기에 의해 건조한 유리 기판을, 120℃의 오븐중에서 1시간 소성해서, 실란커플링제에 의한 처리를 완결시켰다. 이 실란커플링제 처리결과, 유리 기판 표면에, 실란커플링제로부터 유래된 아미노기가 도입되었다.

한편, 도진도 화학 연구소사(Dojindo Laboratories) 제품인 N-말레이미도카프로일옥시숙신이미드((N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드); 이하, "EMCS"라 약칭함)를, 디메틸술폭시드와 에탄올로 이루어진 1:1 혼합 용매중에 최종 농도가 0.3 mg/㎖가 되도록 용해시켜, EMCS 용액을 준비하였다. 소성 종료후, 커플링제로 처리된 유리 기판을 냉각상태로 방치한 후, 상기 조제한 EMCS 용액중에 실온에서 2시간 담그었다. 이 침지 처리동안에, 커플링제처리에 의해 유리 기판의 표면에 도입되고 있는 아미노기와 EMCS의 숙신이미드기가 반응해서, 유리 기판 표면에 EMCS로부터 유래된 말레이미드기가 도입되었다. 상기 유리 기판을 EMCS 용액으로부터 끌어올리고 나서,상기 디메틸술폭시드와 에탄올로 이루어진 혼합 용매로 세정하였다. 그 후, 상기 기판을 에탄올에 의해 세정한 후, 질소 가스 분위기하에서 건조시켰다.

(4) 프로브 DNA의 합성

상기 II항의 (1)에서 설계한 프로브를 합성하였다.

그 후, 프로브 DNA는, 표면에 말레이미드기가 도입된 유리 기판에 대해서 공유결합시키기 위해, 정법에 따라, 그의 5'말단을 티올로 변성하였다. 그 후, DNA 합성시에 있어서의 부반응을 피하기 위해서, 도입되어 있었던 보호기를 프로브 DNA로부터 제거하고, HPLC 정제 및 탈염 처리를 실시하였다.

얻어진 프로브 DNA를, 순수에 용해시키고, 얻어진 용액을, 각각, 최종 농도(잉크 용해시)가 10μM이 되도록 분주(分注)하였다. 이어서, 프로브용 DNA를 동결건조해서, 물을 제거하였다.

(5) BJ프린터에 의한 프로브 DNA의 토출 및 기판 표면에의 프로브 DNA의 결합

글리세린 7.5질량%, 티오디글리콜 7.5질량%, 요소 7.5질량% 및 아세틸레놀 EH(카와켄 파인 케미컬사 제품) 1.0질량%를 함유하는 수용액을 준비하였다. 이어서, 분 주한 프로브 DNA를 상기의 혼합 용매에 소정 농도(10μM)가 되도록 용해시켰다. 얻어진 프로브 DNA 용액을, 버블젯 프린터(상품명: BJF-850 캐논사 제품)용 잉크 탱크에 충전하고, 인자 헤드에 장착하였다.

단, 상기 버블젯 프린터는, 평판에의 잉크젯 인쇄가 가능하도록 개조한 것이다. 또, 해당 개조한 버블젯 프린터는, 소정의 파일 작성 방법에 따라 인자 패턴을 입력함으로써, 약 5pl의 DNA 용액의 액적을, 약 120㎛ 피치로 스폿팅하는 것이 가능하게 되어 있다.

계속해서, 이 개조 버블젯 프린터를 이용해서, 유리 기판 표면에, 프로브 DNA 용액을 스폿팅하였다. DNA 마이크로어레이 1매에 대해, 각 프로브 마다 16스폿의 토출을 하도록 인자 패턴을 미리 작성해서, 잉크젯 인자를 행하였다. 목적으로 하는 패턴을 얻도록 DNA 용액의 스폿팅이 확실히 행해지고 있는 것을 확대경 등에 의해 확인하였다. 그 후, 상기 유리 기판을 30분간 상온에서 가습실내에 두어, 유리 기판 표면상에 존재하는 말레이미드기와 프로브 DNA의 5'말단에 존재하는 술파닐기(-SH)를 반응시켰다.

(6) 세정

가습실내에 있어서 30분간 행한 반응의 종결 후, 100mM의 NaCl을 함유하는 10mM의 인산 완충액(pH 7.0)으로 유리 기판 표면에 남아 있는 미반응의 프로브 DNA부분을 씻어 버렸다. 이와 같이 해서, 유리 기판 표면에, 각 DNA 칩 당 16스폿에 소정의 1본쇄 프로브 DNA가 각각 고정된 DAN 마이크로어레이형 DNA 칩이 얻어졌다.

III. 하이브리다이제이션 반응

상기의 II항에서 제작한 DNA 마이크로어레이와, 상기 I항에서 핵산 산물로서 제작한 7종의 PCR 산물을 이용해서, 마이크로어레이상에서의 하이브리다이제이션을 실시하였다.

(1) DNA 마이크로어레이의 블로킹

BSA(소혈청알부민 Fraction V: Sigma사 제품)를 1질량%가 되도록, 100mM NaCl/10mM 인산 완충액에 용해시켰다. 얻어진 용액에 상기 II항에서 제작한 DNA 마이크로어레이를 실온에서 2시간 담그어, 유리 기판의 표면의 블로킹을 실시하였다. 블로킹 종료후, 0.1질량% SDS(도데실 황산나트륨)를 함유하는 0.1×SSC 용액(NaCl 15mM, 시트르산 나트륨(trisodium citrate dihydrate, C₆H₅Na₃·2H ₂O) 1.5mM, pH 7.0)으로 세정을 실시한 후, 순수로 헹구었다. 그 후, 스핀 드라이 장치를 이용해서 DNA 마이크로어레이의 탈수를 실시하였다.

(2) 하이브리다이제이션 용액의 조제

이하의 구성의 각 PCR 산물에 대해 하이브리다이제이션 용액을 조제하였다. 각 PCR 증폭 산물 용액은 각각 2.0㎕의 양으로 사용해서, 최종 체적이 120㎕로 되도록 하였다.

<하이브리다이제이션 용액>

6×SSPE /10% 포름아미드 / PCR 증폭 산물 용액

(6×SSPE: NaCl 900mM, NaH₂PO₄·H₂O 60mM, EDTA 6mM, pH 7.4)

(3) 하이브리다이제이션

물을 제거한 후, DNA칩을, 하이브리다이제이션 장치(Genomic Solutions Inc. Hybridization Station)에 설치하였다. 상기 조성의 하이브리다이제이션 용액을 이용해서, 하기 표 8에 표시한 순서 및 조건으로 하이브리다이제이션 반응을 행하였다.

하이프리다이제이션의 조건과 순서

조작	조작순서 및 조건
반응	65℃ 3분 →92℃ 2분 → 55℃ 4시간
세정	2×SSC/0. 1% SDS
세정	20℃에서 2×SSC
(헹굼)	H₂O(수동 헹굼)
건조	스핀 건조

(4) 형광 측정

하이브리다이제이션 반응 종료후, DNA 칩을 스핀건조하고, DNA 마이크로어레이용 형광 검출 장치(Axon사 제품, Genepix 4000B)를 이용해서 DNA칩에 대한 하이브리드체의 형광을 측정하였다. 각 PCR증폭 산물 Std. 및 A 내지 F에 대해서 구한 형광 강도를 하기 표 9에 표시한다. 강도를 산출하기 위해서, DNA 칩상에 프로브 DNA의 스폿이 없는 부분에서 관측된 형광 강도를 배경값으로서 이용해서, 각 스폿의 겉보기 형광 강도로부터 상기 배경값을 공제하였다. 얻어진 값을, 형광 강도의 실측치로 정의하였다. 또 측정은 2회 실시해서, 그 평균치를 이하의 표 9에 표시한다.

	Std.	A(Mix1)	B(Mix2)	C(Mix3)	D(Mix4)	E(Mix5)	F(Mix6)
산물의 농도	51.0nM	47.9nM	30.1μM	14.2nM	9.6nM	3.0nM	0nM(*)
형광강도	3243	5052	10565	29659	29948	16956	176

(*) 산물의 농도는 검출한계이하였다.

표 9에 표시한 결과로부터, 종래의 방법에 의해 제작한 Std.에 비해 각 PCR증폭산물 A 내지 E의 합성량은 적기는 하지만, 하이브리다이제이션후에 그의 형광강도는 Std.에 비해 높으며, 즉, 시료 A 내지 E는 표식 물질에 의해 매우 효율좋게 표식되어 있는 것을 알 수 있다. 즉, PCR반응액중에 가해진 표식 물질의 양이 적을 경우에도, 선택된 염기종의 표식된 데옥시뉴클레오티드와 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 총농도를 다른 선택되지 않은 뉴클레오티드의 농도보다도 낮게 조정하하면, 효율 좋게 표식 물질이 PCR산물에 편입된다. 그러나, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 농도가 O이면, PCR 증폭은 거의 일어나지 않고, 해당 산물은 하이브리다이제이션에 의해서도 검출되지 않는다(시료 F). 이들 결과로부터, 표식용으로 선택된 염기종의 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드(여기에서는, dTTP)의 농도를, 표식용으로 선택되지 않은 염기종의 데옥시뉴클레오티드(여기에서는, dATP, dCTP, dGTP)의 농도의 5몰%에서 80몰%사이로 조정함으로써, 핵산은 효율 좋게 PCR증폭에 의한 표식이 행해지는 것을 알 수 있다.

또, 표 9에 표시한 바와 같이, 시료 C 및 D의 하이브리드체의 휘도강도는, 종래의 방법에 의해 생성된 Std.의 것에 비해 약 10배 큰 것을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 핵산 표식 방법에 있어서는, 표식된 데옥시뉴클레오티드를 가한 뉴클레오타이드의 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드(여기에서는, dTTP)의 농도를, 표식된 데옥시뉴클레오티드를 가하지 않은 뉴클레오타이드중의 데옥시뉴클레오티드(여기에서는, dATP, dCTP, dGTP)의 농도의 10몰%에서 40몰%사이로 조정함으로써, 가장 효율 좋게 핵산 표식이 수행된다. 또한, 본 실시예에서는 1종류의 염기에 대해 표식 물질을 편입하였으나, 복수의 염기종에 대해 복수의 표식 물질을 편입시킬 경우에도, 마찬가지의 효과를 얻을 수 있다.

실시예 2

실시예 1의 표 6에 표시한 PCR 산물 A - D를, 등몰농도로 조정하였다. 그 후, 각 PCR 증폭 산물 용액을 2.0㎕의 양으로 사용해서 하기 표시한 최종 농도가 되도록 하이브리다이제이션용액(농도 120㎕)을 조제하였다.

<하이브리다이제이션 용액>

6×SSPE / 10% 포름아미드 / PCR 증폭 산물 용액

(6×SSPE: NaCl 900mM, NaH₂PO₄·H₂O 60mM, EDTA 6mM, pH 7.4)

이어서, 표 8에 표시한 하이브리다이제이션 조건 및 순서로 하이브리다이제이션 반응을 수행하였다. 또, 각 DNA 칩에 대해서 실시예 1의 III항의 (4)와 같은 형광 측정을 행하였다. 그 평균치를 표 10에 표시한다.

하이브리다이즈된 PCR 증폭 산물의 형광 강도

	A(Mix1)	B(Mix2)	C(Mix3)	D(Mix4)
형광 강도	5052	14351	60530	63600

이들 결과로부터, 시료 A에 비해서, 1본쇄 시료 C 및 D에 있어서 훨씬 많은 양의 표식 물질이 편입된 것으로 확인되었다. 또한, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드에 대한 표식된 데옥시뉴클레오티드의 비율이 1이상인 경우, 보다 효과적이라는 것도 알 수 있었다.

실시예 3

데옥시뉴클레오티드의 농도가 표 11에 표시한 바와 같이 되도록 3개의 PCR 반응액을 표 3에 따라 조제하였다. 그 후, 표 5에 표시한 온도조건하에서 PCR 증폭 반응을 수행하였다.

PCR 반응액중의 데옥시뉴클레오티드의 농도

	G(Mix7)	H(Mix8)	C(Mix3)
dATP, dCTP, dGTP	200μM	200μM	200μM
dTTP	100μM	60μM	40μM
Cy3-dUTP	100μM	60μM	40μM
dTTP+Cy3-dUTP	200μM	120μM	80μM

PCR 증폭 산물의 농도를 표 12에 표시한다.

PCR 증폭 산물의 농도

	G(Mix7)	H(Mix8)	C(Mix3)
산물의 농도	35.0nM	26.4nM	14.2nM

반응액중의 dTTP의 양이 많아질 수록, PCR 증폭 산물의 양이 많아지게 되었다.

실시예 1과 같은 조건으로, 표 12에 표시한 각 PCR 증폭 산물을 이용해서, 하기 표시한 최종 농도가 얻어지도록 하이브리다이제이션 용액을 조제하였다. 각 PCR 증폭 산물 용액은, 2.0㎕의 양으로 사용해서 최종 체적이 120㎕가 되도록 하였다.

<하이브리다이제이션 용액>

6×SSPE / 10% 포름아미드 / PCR 증폭 산물 용액

(6×SSPE: NaCl 900mM, NaH₂PO₄·H₂O 60mM, EDTA 6mM, pH 7.4)

이어서, 표 8에 표시한 하이브리다이제이션 조건 및 순서로 하이브리다이제이션 반응을 수행하였다. 또, 실시예 1의 III항의 (4)와 같은 형광 측정을 행하여, 각 DNA 칩의 형광을 구하였다. 그 평균치를 표 13에 표시한다.

PCR 증폭 산물의 형광 강도

	G(Mix7)	H(Mix8)	C(Mix3)
형광 강도	24447	35457	29659

이들 결과에 의하면, H가 하이브리다이제이션시 가장 높은 형광 강도를 보이는 것을 알 수 있다. 따라서, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드에 대한 표식된 데옥시뉴클레오티드의 비가 PCR시 1인 경우에도, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 농도가 시료 H 및 C와 같은 다른 뉴클레오티드의 농도보다도 낮은 경우 보다 적은 양의 표식물질로 보다 높은 편입효율이 얻어진다.

실시예 4

데옥시뉴클레오티드의 농도가 표 14에 표시한 바와 같이 되도록 5개의 반응액을 표 3에 따라 조제하였다. 그 후, 표 5에 표시한 온도조건하에서 PCR 증폭 반응을 수행하였다. 즉, 표식되지 않은 뉴클레오티드 A, C 또는 G의 농도를 바꾼 이들 반응액을 이용해서 핵산의 표식를 행하였다.

반응액중의 데옥시뉴클레오티드의 농도

	I(Mix9)	J(Mix10)	C(Mix3)	K(Mix11)	L(Mix12)
dATP, dCTP, dGTP	100μM	150μM	200μM	250μM	300μM
dTTP	40μM	40μM	40μM	40μM	40μM
Cy3-dUTP	40μM	40μM	40μM	40μM	40μM
dTTP+Cy3-dUTP	80μM	80μM	80μM	80μM	80μM

PCR 증폭 산물의 농도를 표 15에 표시한다.

PCR 증폭 산물의 농도

	I(Mix9)	J(Mix10)	C(Mix3)	K(Mix11)	L(Mix12)
산물의 농도	10.7nM	13.5nM	14.2nM	14.8nM	14.3nM

PCR 증폭 산물의 농도는, 시료 I(Mix9)가 비교적 적지만, 다른 시료에 있어서는, PCR 증폭 산물의 농도는 거의 같다.

실시예 1과 같은 조건으로, 표 14에 표시한 PCR 증폭 산물을 이용해서, 하이브리다이제이션 용액을 조제하였다. 각 PCR 증폭 산물 용액은, 2.0㎕의 양으로 사용해서 최종 체적이 120㎕가 되도록 하였다.

<하이브리다이제이션 용액>

6×SSPE / 10% 포름아미드 / PCR 증폭 산물 용액

(6×SSPE: NaCl 900mM, NaH₂PO₄·H₂O 60mM, EDTA 6mM, pH 7.4)

이어서, 표 8에 표시한 하이브리다이제이션 조건 및 순서로 하이브리다이제이션 반응을 수행하였다. 그 후, 실시예 1의 III항의 (4)와 같은 형광 측정을 행하여, 각 DNA 칩의 형광을 구하였다. 그 평균치를 표 16에 표시한다.

PCR 증폭 산물의 형광 강도

	I(Mix9)	J(Mix10)	C(Mix3)	K(Mix11)	L(Mix12)
형광 강도	8073	22369	29659	26758	26239

이들 결과에 의하면, 시료 I 이외의 시료 J, C, K 및 L에서 거의 같은 형광강도가 얻어진 것을 알 수 있다. 즉, 표식 효율은 표식에 선택되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 농도에 의존하지 않고, 그의 농도를 150μM에서 300μM 사이로 조정하는 것이 타당하다.

이상, 본 발명은 상기 각종 실시형태로 한정되지 않고, 본 발명의 정신과 범위내에서 각종 변형과 변경이 가능하다. 따라서, 본 발명의 범위를 공중에게 알리기 위해, 이하의 특허청구범위를 작성하였다.

이 출원은, 여기에 참고로 편입된 2003년 12월 25일자로 출원된 일본국 특허출원 제 2003-430805호로부터 우선권을 청구하고 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 핵산 표식 방법에 따라 산물에 표식물질을 편입하면서 PCR에 의해 타겟 핵산의 증폭을 행하는 경우에, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드 기질의 농도를 다른 선택되지 않은 기질 뉴클레오티드의 농도보다도 낮도록 표식된 데옥시뉴클레오티드와 표시되지 않은 데옥시뉴클레오티드를 포함하는 선택된 기질을 설정하므로, 상기 산물에 표식물질을 효율좋게 편입시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 타겟 핵산의 검출 방법에 의하면, 고상 하이브리다이제이션에 의한 타겟 핵산의 검출 감도를 향상시킬 수가 있다.

도 1은 pUC118 EcoRI/BAP에 대해, 2개의 프라이머 및 1개의 프로브를 나타낸 도면으로, 화살표는 각각의 프라이머의 5'→ 3'방향을 나타내고 있음.

<110> CANON KABUSHIKI KAISHA <120> Nucleic acid labeling method and liquid composition <150> JP2003-430805 <151> 2003-12-25 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgatttgggt gatggttcac gtag 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atcagcaata aaccagccag cc 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> probe <400> 3 gataaagttg caggaccact tctgc 25

Claims

표식 물질을 산물(product)에 편입시키면서 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 타겟 핵산의 증폭을 행하는 핵산 표식 방법에 있어서,

상기 PCR용 반응액이 염기종 A, T, C 및 G의 4종의 데옥시뉴클레오티드 기질을 함유하고, 1종류에서 3종류의 기질을 표식용으로 선택해서, 각 선택된 기질의 농도를, 임의의 선택되지 않은 기질의 농도보다도 낮게 조정하고, 상기 각 선택된 기질은, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드와 표식된 데옥시뉴클레오티드를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 1항에 있어서, 상기 선택된 기질의 농도를, 선택되지 않은 기질의 농도의 5%에서 80%사이로 조정하는 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 1항에 있어서, 상기 선택된 기질의 농도를, 선택되지 않은 기질의 농도의 10%에서 40%사이로 조정하는 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 2항에 있어서, 상기 선택되지 않은 기질의 농도를 150μM에서 300μM사이로 조정하는 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 2항에 있어서, 상기 선택된 기질에 있어서의 표식된 데옥시뉴클레오티드의 농도를 20μM이상으로 조정하는 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 5항에 있어서, 상기 선택된 기질에 있어서의 표식된 데옥시뉴클레오티드의 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드에 대한 비율을 0.25이상으로 조정하는 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 5항에 있어서, 상기 선택된 기질에 있어서의 표식된 데옥시뉴클레오티드의 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드에 대한 비율을 1이상으로 조정하는 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 1항에 있어서, 상기 표식 물질이 형광 물질인 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 8항에 있어서, 상기 형광 물질이 Cy3 또는 Cy5인 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 1항에 있어서, 상기 표식 물질이 비오틴인 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 1항에 있어서, 상기 표식 물질이 아미노알릴계 화합물인 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 1항에 있어서, 1종류의 기질이 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
제 12항에 있어서, 상기 선택된 염기종이 T인 것을 특징으로 하는 핵산 표식 방법.
타겟 핵산을 함유하는 시료를 고체 기질상에 고정된 프로브와 반응시켜, 해당 고체 기질상에 고정된 프로브와 하이브리다이즈한 상기 타겟 핵산을, 해당 타겟 핵산에 편입된 표식물질을 이용해서 검출하는 타겟 핵산의 검출 방법에 있어서,

상기 타겟 핵산이, 청구항 제 1항 내지 제 13항중 어느 한 항에 기재된 핵산 표식 방법에 의해 조제된 표식된 PCR 산물인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 검출 방법.
제 14항에 있어서, 상기 프로브가 DNA 마이크로어레이로서 상기 고체 기질상에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 검출 방법.
제 15항에 있어서, 상기 DNA 마이크로어레이에 있어서의 상기 프로브를 포함하는 스폿의 면적이 10^-6㎡이하인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 검출 방법.
제 14항에 있어서, 상기 타겟 핵산의 염기길이가 100bp에서 2,000bp사이인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 검출 방법.
표식 기질을 산물에 편입시키면서 PCR에 의해 타겟 핵산의 증폭에 이용하기 위한 염기종 A, T, C 및 G의 4종의 데옥시뉴클레오티드를 포함하는 액 조성물에 있어서,

1종류에서 3종류의 기질을 표식용으로 선택해서, 각 선택된 기질의 농도를, 임의의 선택되지 않은 기질의 농도보다도 낮게 조정하고, 상기 각 선택된 기질은, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드와 표식된 데옥시뉴클레오티드를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 액 조성물.
하기 (A) 내지 (C)를 구비한 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 검출용 키트:

(A) 타겟 핵산의 증폭을 위한 PCR프라이머;

(B) 표식 기질을 산물에 편입시키면서 PCR에 의해 타겟 핵산의 증폭에 이용하기 위한 염기종 A, T, C 및 G의 4종의 데옥시뉴클레오티드를 함유하고,

1종류에서 3종류의 기질을 표식용으로 선택해서, 각 선택된 기질의 농도를, 임의의 선택되지 않은 기질의 농도보다도 낮게 조정하고, 상기 각 선택된 기질이, 표식되지 않은 데옥시뉴클레오티드와 표식된 데옥시뉴클레오티드를 포함하고 있는 액 조성물; 및

(C) 상기 타겟 핵산과 반응하기 위한, 고체 기질상에 배치된 프로브를 지닌 고상 프로브.
제 19항에 있어서, 상기 고상 프로브가 DNA 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 검출용 키트.