KR20050028018A - 형태형성 및 성장촉진 활성을 가지는 신규 화합물 - Google Patents

형태형성 및 성장촉진 활성을 가지는 신규 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해양성 대형 녹조류의 형태형성, 성장촉진을 유발하는 신규 화합물, 미생물을 이용하여 전기 신규 화합물을 제조하는 방법 및 전기 신규 화합물을 포함하는 조류(algae) 배양용 배지에 관한 것이다.

Description

형태형성 및 성장촉진 활성을 가지는 신규 화합물{Novel Chemical Substance Having Activity for Morphogenesis and Growth Promotion}
본 발명은 미생물이 생산하는 신규한 비타민유사 활성물질(vitamin-like active substance) 및 그의 제조방법과 용도에 관한 것이다.
지금까지 갈파래, 홑파래 등의 대형 녹조류의 기존 합성배지를 사용한 실내배양(indoor culture)에서는, 탈분화후의 분화유도에 따라 캘러스(callus) 상이 되기도 하고, 단세포 상태로 조류의 몸체가 붕괴되는 현상이 나타나기도 한다고 알려져 있다(참조: L. Provasoli; Ulva. Biol. Bull., 1958, 114, 375: M. Tatewaki, L. Provasoli and I. J. Pintner; J. Phycol., 1983, 19, 409). 또한, 이처럼 형태를 잃은 조류에 신선한 해수나 토양추출액, 홍조추출액, 갈조추출액 또는 어떤 종의 해양유래의 미생물 배양액을 첨가하면, 엽상체(thallus form) 회복 또는 성장속도의 증대가 일어난다고 알려져 있지만(참조: M. Tatewaki, L. Provasoli and I. J. Pintner; J. Phycol., 1983, 19, 409), 이들 추출액의 유효성분이나 비타민유사 활성물질은 확인되지 않고 있다. 그 때문에, 실내에서의 갈파래, 홑파래 등의 대형 녹조류의 무균배양세포를 이용한 장기적인 생리, 생태연구 또는 배양보존이 곤란하였다.
도 1은 신규 화합물 1의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 신규 화합물 1의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 신규 화합물 1의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 신규 화합물 2의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 실시예 1의 Monostroma oxyspermum 배양실험에 있어서 시료를 첨가하지 않은 경우의 배양 5일 후의 Monostroma oxyspermum 배양세포의 사진이다.
도 6은 실시예 1의 Monostroma oxyspermum 배양실험에 있어서 시료를 첨가한 경우의 배양 5일 후의 Monostroma oxyspermum 배양세포의 사진이다.
도 7은 Me1의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 Me1의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 Me1B의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 Me1H3의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 Me1H1의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 Me1H1Me의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 실시예 5의 배양 10일 후의 7단계 희석을 한 결과를 나타낸 사진이다.
도 14는 실시예 5의 배양 10일 후의 6단계 희석을 한 결과를 나타낸 사진이다.
도 15는 실시예 7의 Ulva pertusa의 실험결과를 나타낸 사진이다.
도 16은 실시예 7의 Enteromorpha interstinalis의 실험결과를 나타낸 사진이다.
도 17은 YM-1-69 주, YM-2-23 주 및 이들의 유사균주의 gyrB DNA 계통도를 나타낸다.
도 18은 YM-1-69 주, YM-2-23 주 및 이들 유사균주의 16S rDNA 계통도 및 이들 균주의 대형 녹조에 대한 형태형성 유도의 특이활성을 나타낸다.
도 19는 신규 화합물 1의 부분구조를 나타낸다.
도 20은 신규 화합물 1의 HBMC 스펙트럼을 해석한 결과를 나타낸다.
도 21은 Me1의 부분구조 및 상대입체배치를 나타낸다.
도 22는 Me1의 HBMC 스펙트럼을 해석한 결과를 나타낸다.
도 23은 Me1H3의 스펙트럼을 해석한 결과를 나타낸다.
도 24는 Me1H3의 HMBC 스펙트럼을 해석한 결과를 나타낸다.
도 25는 Me1H1의 스펙트럼을 해석한 결과를 나타낸다.
도 26은 Me1H1의 HBMC 스펙트럼을 해석한 결과를 나타낸다.
도 27은 Me1H1Me의 스펙트럼을 해석한 결과를 나타낸다.
도 28은 Me1H1Me의 HBMC 스펙트럼을 해석한 결과를 나타낸다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 2002-203608의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.
발명의 개시
해양성 대형 녹조류를 전체성분을 이미 알고 있는 배지 만을 사용하여 무균적으로 장기간 배양하는 것이 가능하다면, 배양대상이 되는 조류(algae)의 생리, 생태연구 외에도 양식종인 식용 홑파래류의 종묘 생산이나 유지, 관리, 녹조류의 종의 보존 등 실용적인 배양방법으로 확립할 수 있다. 이러한 관점에서, 이미 본 발명자는 이러한 관점으로부터 해양성 대형 녹조류의 형태형성, 성장촉진을 유발하는 미생물을 확인하였으나(특원 2001-396342), 그 미생물이 생산하는 유효성분인 비타민유사 활성물질은 알려지지 않은 상태이다.
본 발명은 이러한 신규 비타민유사 활성물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이에, 본 발명자는 신규한 유효성분을 탐색한 결과, YM-2-23 주(수탁번호 FERM BP-8417로, 2001년 8월 20일부(원기탁)로 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1초메 1-1, 츄오다이 6)에 기탁됨(2003년 6월 25일부로 원기탁에서 부다페스트 조약에 근거한 기탁으로 이관청구 수령)), 테나시바큘럼 종(Tenacibaculum sp.) YM-1-69(수탁번호 FERM BP-8418로, 2001년 8월 20일부(원기탁)로 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1초메 1-1, 츄오다이 6)에 기탁됨(2003년 6월 25일 부로 원기탁에서 부다페스트 조약에 근거한 기탁으로 이관청구 수령)) 및 이들의 유사균주의 배양액으로부터 매우 강한 활성을 가지는 활성물질을 단리한 결과, 전기 화합물이 신규물질인 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 현재까지 YM-2-23 주 및/또는 YM-1-69 주에 유사한 플라보박테리움(Flavobacterium), 조벨리아(Zobellia) 또는 테나시바큘럼(Tenacibaculum)이 생산하는 물질로는 리코펜(lycopene), 제아크산틴(zeaxanthin) 등의 카로티노이드 유도체가 보고되고 있지만, 대형 조류의 성장을 촉진하거나 형태를 조절하는 화합물을 단리한 예는 없으며, 세계에서 최초로 보고되는 것이다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) 다음과 같은 이화학적 성질을 가지는 화합물 1:
1. 물질의 색: 무색
2. 분자량: 457
3. 분자식: C24H31N3O4S
질량분석: FABMS: m/z 456 [M-H]- (도 1)
고분해능 질량분석: 실측치 456.1960 [M-H]-
계산치 456.1930 (C24H31N3O4S)
4. 핵자기공명 시그널:
1)1H-NMR (D2O-20mM Na2HPO4 (pH 9), 750MHz): (도 2)
δppm 0.818 (3H, s), 0.837 (3H, s), 0.882 (3H, s), 0.960 (1H, m), 1.058 (1H, m), 1.167 (1H, m), 1.326 (3H, s), 1.37 (1H, m), 1.38 (1H, m), 1.40 (1H, m), 1.58 (1H, m), 1.61 (2H, m), 1.52 (1H, br d, J = 13Hz), 1.76 (1H, br d, J = 14Hz), 2.024 (1H, m), 2.181 (1H, dd, J = 4, 14Hz), 2.291 (1H, dd, J = 14, 16.5Hz), 7.698 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.845 (1H, d, J = 7.5Hz)
2) 13C-NMR(D2O-20mM Na2HPO4 (pH 9), 125MHz): (도 3)
δppm 15.236 (q), 19.037 (t), 20.287 (t), 20.955 (q), 21.835 (q), 25.987 (t), 33.381 (s), 33.636 (q), 37.308 (s), 39.590 (t), 41.199 (t), 42.346 (t), 52.769 (d), 56.381 (d), 79.096 (s), 114.965 (s), 124.399 (d), 139.004 (s), 141.232 (d), 150.282 (s), 152.656 (s), 172.081 (s), 173.538 (s), 174.661 (s).
(2) 다음과 같은 이화학적 성질을 가지는 화합물 2:
1. 물질의 색: 무색
2. 핵자기공명 시그널:
1H-NMR(D2O-20mM Na2HPO4 (pH 9), 500MHz): (도 4)
δppm 0.815 (3H, s), 0.834 (3H, s), 0.877 (3H, s), 0.949 (1H, m), 1.048 (1H, m), 1.163 (1H, m), 1.297 (3H, s), 1.35 - 1.40 (3H, m), 1.52 - 1.63 (4H, m), 1.753 (1H, br d, J = 14Hz), 2.012 (1H, m), 2.158 (1H, m), 2.299 (1H, m), 7.646 (1H, d, J = 8.0Hz), 7.769 (1H, d, J = 8.0Hz).
(3) 전기 (1)의 화합물 1 또는 전기 (2)의 화합물 2를 생산하는 능력을 가지는 미생물을 배지에 배양하고, 배양물 내에서 화합물 1 또는 2를 생성,축적시켜, 전기 생성,축적한 화합물 1 또는 2를 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물 1 또는 2의 제조방법.
(4) 미생물이 YM-2-23 주(FERM BP-8417), 테나시바큘럼 종(Tenacibaculum sp.) YM-1-69(FERM BP-8418) 또는 그들의 유사균주인 전기 (3)의 제조방법.
(5) 전기 (1)의 화합물 1 또는 전기 (2)의 화합물 2를 유효성분으로 포함하는 조류 배양용 배지.
(6) 전기 (1)의 화합물 1을 트리메틸실릴디아조메탄(trimethylsilyldiazomethane)으로 처리하여 수득되는 화합물 1의 모노메틸화체, 디메틸화체 또는 트리메틸화체.
(7) 전기 (6)의 트리메틸화체를 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)으로 처리하여 수득되는 화합물 또는 그 유도체.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 화합물 1과 2는 미생물을 이용하여 생산할 수 있다. 본 발명의 화합물의 제조에 이용하는 미생물로는 전기 화합물의 생산능력을 가지는 미생물이라면 특별히 한정되지는 않으며, 예를 들어 플라보박테리움, 조벨리아, 테나시바큘럼 등의 Cytophaga-Flavobacterium-Bacteriodes complex에 속하는 균주나 이들의 균주에서 유래된 변이주를 들 수 있다. 구체적으로는, YM-2-23 주(FERM BP-8417), 테나시바큘럼 종(Tenacibaculum sp.) YM-1-69나 이들의 균주에서 유래된 변이주를 예로 들 수 있다. YM-1-69 주나 YM-2-23 주에 대신하여, 이들 균주의 유사균주를 사용해도 무방하다. 「YM-1-69 주의 유사균주」로는 예를 들어, 해양성 대형 녹조류에 대해 엽상체 형성활성 또는 생장촉진 활성을 나타내는 균주이며, 서열번호 1의 염기서열과 85% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상동한 염기서열을 가지는 16S rRNA V3 영역 유전자를 가진 균주 또는 서열번호 3의 염기서열과 72% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상동한 염기서열을 가지는 gyrB 유전자를 가진 균주가 포함된다. 「YM-2-23 주의 유사균주」로는 예를 들어, 해양성 대형 녹조류에 대해 엽상체 형성 활성 또는 생장촉진 활성을 나타내는 균주이며, 서열번호 2의 염기서열과 85% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상동한 염기서열을 가지는 16S rRNA V3 영역 유전자를 가진 균주 또는 서열번호 4의 염기서열과 72% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 좀 더 바람직하게는 95% 이상 상동한 염기서열을 가지는 gyrB 유전자를 가진 균주가 포함된다.
「YM-1-69 주의 유사균주」 및 「YM-2-23 주의 유사균주」로는 예를 들어, YM2-10 (MBIC 04671), YM2-11 (MBIC 04672), YM2-12 (MBIC 04673), YM2-13 (MBIC 04674), YM1-66 (MBIC 04663), YM2-24 (MBIC 04684), YM1-51 (MBIC 04662), Zobellia uliginosa (ATCC 14397), YM1-11 (MBIC 04693), T-588 (MBIC 05930), YM2-22 (MBIC 04682), YM2-27 (MBIC 04687), YM2-6 (MBIC 04669), YM1-68 (MBIC 04664), YM1-38 (MBIC 04661), YM2-4 (MBIC 04667), YM2-5 (MBIC 04668), YM2-7 (MBIC 04670), YM2-21 (MBIC 04681), YM2-1 (MBIC 04666), T-565 (MBIC 05877), T-424 (MBIC 05876), [Cytophaga] sp. UP7 (MBIC 01484), T-551 (MBIC 05929), Pedobacter heparinus (IFO 12017), T-561 (MBIC 05879), Cyclobacterium marinum (LMG 13164), Cytophaga sp. (MBIC 01539), Cytophaga sp. (MBIC 01599), Chitinophaga pinensis (DSM 2588)을 들 수 있다.
전기 균주 중, 「MBIC」가 기재된 균주는 해양바이오테크놀로지 연구소 컬처 컬렉션(Marine Biotechnology Institute Culture Collection: MBIC, 일본국 이와테켄 카마이시시 헤이타 3-75-1)(http://seasquirt.mbio.co.jp/mbic/index.php?page=top)에서, 「IFO」가 기재된 균주는 재단법인 발효연구소(Institute for Fermentation, Osaka: IFO, 일본국 오사카후 오사카시 요도가와구 주소혼마치 2초메 17-85)에서, 「ATCC」가 기재된 균주는 미합중국 종균협회(American Type Culture Collection: ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA)에서, 「DSM」이 기재된 균주는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH: DSMZ, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)에서, 「LMG」가 기재된 균주는 BCCMTM/LMG Bacteria Collection(Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms, Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent(RUG), K.L. Ledegancksfaat 35, B-9000 Gent, Brussels, Belgium)에서 각각 입수할 수 있다.
16S rRNA V3 영역 유전자 및/또는 gyrB 유전자의 염기서열이 YM-1-69 주나 YM-2-23 주의 염기서열과 동일한 균주는 이들의 유사균주 중에서도 특히 바람직한 균주이다.
전기 미생물 배양할 때에는, 통상의 해양세균 배양방법이 일반적으로 이용된다. 배지로는 자화(滋化) 가능한 탄소원, 질소원, 무기물 등을 적당하게 포함하는 배지라면, 합성배지, 천연배지, 어느 것이라도 사용가능하다.
탄소원으로는 글루코스, 전분, 덱스트린, 만노스, 프룩토스, 슈크로스, 락토스, 자일로스, 아라비노스, 만니톨 및 당밀(molasses) 등을 단독 또는 조합시켜 사용할 수 있다.
질소원으로는 염화암모늄, 질산암모늄, 황산암모늄, 질산나트륨, 요소, 펩톤, 고기추출물, 효모엑기스, 건조효모, 콘스팁리커(corn steep liquor), 대두분, 카사미노산(casamino acid) 등을 단독 또는 조합시켜 사용할 수 있다.
그 외에, 필요에 따라 염화나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 인산이수소칼륨, 인산마그네슘ㆍ8수화물, 황산제1철, 염화칼슘, 황산망간, 황산아연, 황산구리 등의 무기염류를 가한다.
또한, 사용균의 생육 또는 본 발명의 화합물의 생산을 촉진하는 미량성분(예를 들어, 당류, 아미노산, 무기염류 등)을 적당히 첨가할 수 있다.
배양법으로는 액체배양이 가장 효율이 좋고, 배양온도는 30℃ 정도가 적당하며, 배지의 pH는 통상 7 내지 9, 바람직하게는 7.5 내지 8이 좋다. 배지의 pH 조정에는 수산화나트륨 수용액이나 염산 등을 사용할 수 있다.
액체배양으로 1 내지 4일간 배양을 수행하면, 화합물 1 또는 2가 배양액 내 및 균체 내에 생성,축적된다. 배양은 배양물 내의 생성량이 최대로 도달한 시기에 정지시키는 것이 바람직하며, 특히, 배양 3일 후가 가장 바람직하다.
배양물에서 화합물 1 또는 2를 단리정제할 경우에는, 미생물 대사산물을 그 배양물로부터 단리정제하기 위해 통상의 방법을 사용한다. 예를 들어, 배양물을 여과나 원심분리에 의해 배양여과액과 균체로 나누고, 균체를 함수메탄올, 함수아세토니트릴 등으로 추출한다. 이어, 추출액으로부터 유기용매를 회전 증발기로 감압제거하고, 이 추출액과 배양여과액을 합쳐 폴리스티렌계 흡착제(예를 들어, 스틸렌디비닐벤젠폴리머) 등으로 흡착시킨다. 흡착한 활성물질을 물로 세척하고 탈염하여, 함수메탄올, 함수아세토니트릴 등으로 활성물질을 용출한다. 용출액을 동결건조 등으로 감압농축하고, 스틸렌디비닐벤젠계 폴리머, 음이온 교환수지에 의한 이온교환 크로마토그래피, 젤여과 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피 등에 의해 화합물 1 또는 2를 수득한다. 신규 화합물 2는 매우 불안정한 화합물이지만, 신규 화합물 2를 수산화나트륨 수용액이나 암모니아 수 등의 강알칼리 수용액 내에 두게 되면, 서서히 신규 화합물 1로 변화한다. 신규 화합물 1은 매우 안정한 화합물이다.
신규 화합물 1을 적당한 메틸화제(예를 들어, 트리메틸실릴디아조메탄)로 처리하면, 신규 화합물 1의 모노메틸화체, 디메틸화체 또는 트리메틸화체를 수득할 수 있다. 트리메틸실릴디아조메탄의 신규 화합물 1에 대한 몰비를 조절하거나 반응조건의 선택(예를 들어, 반응온도나 pH의 설정, 디메틸아미노설퍼트리플루오라이드(DAST) 존재 하에서 반응)에 의해, 모노메틸화체, 디메틸화체 또는 트리메틸화체를 선택적으로 수득할 수 있다.
또한, 전기 트리메틸화체를 수소화붕소나트륨으로 처리하면, 아래의 이화학적 성질을 가지는 Me1H3을 수득할 수 있다. 또한, 반응용매의 극성, 반응온도를 변경하여, Me1H3보다도 더 환원된 화합물 Me1H1을 수득할 수 있다. 또한, Me1H1을 강알칼리 조건하에서, RI(여기에서, R은 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 표시)라는 식으로 표시되는 요오드화알킬(예를 들어, 요오드화메틸)을 작용시켜 메틸화체 Me1H1Me 등의 알킬화체를 수득할 수 있다. 이들의 반응과 수득한 생성물의 정보는 신규 화합물 1과 2를 특정하는 경우 등에 유익하다.
본 발명의 신규 화합물 1과 2는 조류 배양용 배지의 유효성분으로 유용하다. 신규 화합물 1과 2는 단독으로 사용해도 좋고, 양자를 병용하여도 좋다.
전기 조류 배양용 배지의 적용대상이 되는 조류로는, 바람직하게는 해양성 대형 녹조류를 들 수 있다. 해양성 대형 녹조류로는 ULVALES 목의 해조로, 예를 들어, 홑파래 과(Monostromataceae), 갈파래 과(Ulvaceae) 등의 녹조를 들 수 있다. 구체적으로, 홑파래 과에 속하는 해조로 Monostroma nitidum, Monostroma oxyspermum, Monostroma angicava, 갈파래 과에 속하는 해조로 Enteromorpha compressa, Enteromorpha intestinalis, Enteromorpha linza, Ulva conglobata, Ulva pertusa 등을 예로 들 수 있다.
해양성 대형 녹조류의 배양에 사용하는 배지는 유효성분인 신규 화합물 1 및/또는 2를 포함하는 것이외에는, 종래의 배양방법(해양성 대형 녹조류가 단세포화 되는 배양방법)으로 사용되고 있던 것과 유사한 배지, 예를 들어, ASP7 배지, PES 배지, PESI 배지 등, 또는 단순히 멸균된 해수를 사용할 수 있다. 배지 중의 신규 화합물 1 및/또는 2의 유효농도는 엽상체 형성을 유도할 수 있는 범위 내에 있다면, 특별히 이에 한정되지 않으나, 10-12 내지 10-3 ㎍/㎖ 으로 하는 것이 바람직하다.
배양시의 온도는 해양성 대형 녹조류가 생존할 수 있는 범위내에 있다면, 특별히 이에 제한되지 않으나, 15 내지 25℃ 정도가 적당하다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
아래에 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 의해 그 기술적 범위가 한정되진 않는다.
참고예 1: 미생물의 단리
본 발명에 사용하는 균주는 아래와 같이 단리하였다. 채집한 신선한 조류 약 1g에 멸균한 해수 10㎖을 첨가하고, 1분 정도 격렬하게 교반하였다. 상등액을 멸균해수로 다시 10배, 100배 희석하고, 그 중 100㎕을 1/10 마린 아가 플레이트(marine agar plate)에 분주하고, 멸균한 콘라디 스틱(Conradi stick)으로 플레이트 전체에 접종하였다. 실온에서 2 내지 3일 후에 성장한 황 내지 적색의 콜로니를 각각 다른 마린 아가 플레이트에 접종하고, 단일 콜로니가 단리될 때까지 배양하였다. 24 내지 48웰 마이크로플레이트에 2 내지 1㎖의 ASP7 배지를 분주하고, 각각의 웰에 단세포화한 Monostroma oxyspermum을 20 세포정도 첨가하였다. 여기에 단균화한 각 분리주의 콜로니를 멸균한 백금루프 등을 사용하여 2웰씩 직접 접종하였다. 이 플레이트를 19 내지 22℃, 명기(light period) 14시간/암기(dark period) 10시간으로 5일간 배양하고 Monostroma oxyspermum의 엽상체 형성을 도립 현미경(inverted microscope)으로 확인하였다. 엽상체의 형성을 보이는 균주에 대해서는 전기와 동일한 방법으로 추가실험을 하여 확인하였다. 상기와 같은 스크리닝 결과, 엽상체 형성 활성을 나타내는 균주로는 YM-1-69 주와 YM-2-23 주가 단리되었다. YM-1-69 주는 Halimeda opuntia(Codiales, Chlorophyta)로부터 단리된 균주이며, YM-2-23 주는 Monostroma nitidum(Ulvales, Chlorophyta)로부터 단리된 균주이다.
참고예 2: 미생물의 동정
참고예 1에서 수득한 미생물의 16S rRNA V3 영역 및 gyrB 유전자의 DNA 염기서열을 결정하였다. YM-1-69 주의 16S rRNA V3 영역 및 gyrB 유전자의 DNA 염기서열을 각각 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시하였다. 또한, YM-2-23 주의 16S rRNA V3 영역 및 gyrB 유전자의 DNA 염기서열을 각각 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시하였다. 수득한 서열에 대해 데이터베이스 검색(DDBJ-fasta)을 수행한 결과, 각 서열은 표 1에 표시한 미생물의 서열과 높은 상동성을 나타내었다.
표 1
서열 상동성 (%) 관련서열을 가지는 생물 Accession Number
1 95.26 Tenacibaculum amylolyticum AB032505
2 94.18 Zobellia uliginosa M62799
3 84.91 Tenacibaculum amylolyticum AB032586
4 78.18 Zobellia uliginosa AB034224
또한, YM-1-69 주 및 YM-2-23 주의 생리 및 생화학적 성질에 대해서 조사한 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2
생리 및 생화학적 성질 YM-1-69 YM-2-23
그램반응(Gram staining) - -
카탈라아제 활성 + +
옥시다제 활성 + +
OF Test O F
마그네슘 또는 칼슘의 요구 + +
질산염의 환원 + +
인돌 생산 - -
젤라틴 가수분해 - -
전분 가수분해 + +
DNA 가수분해 + +
Tween 80 가수분해 + +
에스큘린(esculin) 가수분해 + +
아르기닌 디히드로라제 활성 - -
우레아제 활성 - -
β-갈락토시다제 활성 - +
구연산의 이용 시몬스 배지 - -
크리스텐센 배지 - -
+: 양성, -: 음성
표 1 및 표 2의 결과로 부터, YM-1-69 주는 테나시바큘럼 종(Tenacibaculum sp.)으로 동정되고, YM-2-23 주는 Cytophaga-Flavobacterium-Bacteriodes complex에 속하는 균주로 동정되었다.
실시예 1: Monostroma oxyspermum 배양실험
항생물질 등으로 무균화 처리한 Monostroma oxyspermum은 ASP7 배지 등의 합성배지 중에서는 자연상태에서 보이는 엽상형태를 보이지 않고, 거의 단세포상태로 되었다.
48웰 마이크로플레이트(IWAKI사 제품, 이하 48-MTP로 축약)의 첫째 열에 변형된 ASP7 배지를 1㎖, 둘째 열과 그 이하에 0.9㎖를 첨가하고, 첫째 열에 시험대상이 되는 활성물질 분획을 11㎕씩 첨가하고, 피펫팅으로 잘 교반하면서 다음의 열에 100㎕를 첨가하였다. 이러한 조작을 각 분획에 대해 8 내지 18회 반복하여 10배씩의 희석계열을 8 내지 18 단계로 만들 수 있었다. 최후 열에 남아있던 100㎕는 폐기하였다. 여기에, 최종적으로 세포농도가 1㎖ 당 10 내지 20 세포가 되도록 희석한 Monostroma oxyspermum 배양액을 48-MTP의 전체 웰에 100㎕씩 첨가하여 총량을 1㎖로 하였다. 이 48-MTP을 명기(light period)만의 조건으로 22℃, 3 내지 5일간을 배양하고, 도립 현미경으로 엽상체 형성의 판정을 수행하였다. 엽상체 형성이 보이는 최저 시료농도를 최소 유효농도(MEC)로 정의하고, MEC가 최저인 시료에 활성물질이 집중해 있다고 생각하여 분리의 지표로 하였다.
시료를 첨가하지 않은 경우의 배양 5일 후의 Monostroma oxyspermum 배양세포의 사진을 도 5에 나타내었다. 또한, 시료를 첨가한 경우의 배양 5일 후의 Monostroma oxyspermum 배양세포의 사진을 도 6에 나타내었다. 활성물질이 존재한 경우는 도 6과 같이 엽상체의 형성을 볼 수 있었다.
ASP7 배지의 조성은 아래와 같다.
표 3: 변형된 ASP7 배지(1L분, pH 7.8 내지 8.0)
증류수 950 mlNaCl 25 gMgSO4ㆍ7H2O 9 gKCl 700 mgCaCl2 840 mgTrisㆍHCl 1 gNaNO3 50 mgNa2-glyceroPO4 20 mgNa2SiO3ㆍ9H2O 70 mgVitamin B12 1 ㎍니트릴로트리아세트산 70 mgVitamin Mix S3 *1 10 mlPII metals *2 30 mlS2 metals *3 5 ml
표 4: *1 Vitamin Mix S3
증류수 100 ml염산티아민 5 mg니코틴산 1 mg판토텐산칼슘 1 mgp-아미노안식향산 0.1 mg비오틴 0.01 mg이노시톨 50 mg티민 30 mg엽산 0.02 mg
표 5: *2 PII metals
증류수 1000 mlNa2-EDTA 1 gFeCl3ㆍ6H2O 48 mgH3BO3 1.13 gMnCl2ㆍ4H2O 144 mgZnCl2 5.2 mgCoCl2ㆍ6H2O 4 mg
표 6: *3 S2 metals
증류수 500 mlNa2MoO4ㆍ2H2O 63 mgNaBr 640 mgSrCl2ㆍ6H2O 304 mgRbCl 14 mgLiCl 61 mgKI 0.65 mgV2O5 0.18 mg
실시예 2: 신규 화합물 1의 분리, 정제
종균(seed bacterium)으로 YM-2-23 주(FERM BP-8417)를 이용하였다. 본 배양배지는 마린브로스(Difco사 제품, 37.4g/l 또는 표시성분에 따라 각 시약을 혼합하여 제조)를 이용하였다. 상기 균주를 100㎖ 삼각플라스크 내에서 50㎖의 마린브로스를 이용하여 30℃에서 24시간 진탕(매분 100회전) 배양한 다음, 이것을 다시 배지 450㎖이 들어 있는 1L용 배플플라스크에 전량을 접종하고, 동일한 조건으로 24시간 배양하였다. 본 배양은 배지가 800㎖ 들어있는 1L용 배플플라스크 16개에서 진탕배양(매분 130회전) 및 배지가 450㎖ 들어있는 1L용 삼각플라스크 10개에서 진탕배양(매분 100회전)을 수행하고, 배양온도는 30℃, 배양시간은 3일간으로 하였다. 이렇게 하여 수득한 배양액 약 18L를 원심분리하였다. 균체는 추출 전까지 -20℃에, 배양여과액은 4℃에서 보관하였다. 전기 본 배양 4회분(약 72L 분)의 균체를 50% 아세토니트릴 수용액 1200㎖에서 2회 추출하고 농축하였다. 농축액을 배양여과액 약 72L와 혼합하여 스틸렌디비닐벤젠폴리머인 Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical사 제품) 2500㎖에 흡착시켰다. 수지를 10% 아세토니트릴 수용액 6000㎖로 세척하고 탈염하였으며, 50% 아세토니트릴 수용액 6000㎖로 용출하여 엽상체 형성을 유인하는 분획을 수득하였다. 활성분획을 TOYOPEARL DEAE-650 (M)(Tohso사 제품)에 흡착시키고, 180mM NaCl-20% 아세토니트릴 수용액으로 세척한 후, 450mM NaCl-20% 아세토니트릴 수용액으로 활성분획을 용출하였다. 용출분획을 감압농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical사 제품) 500㎖에 흡착시켜 10% 아세토니트릴 수용액 1000㎖로 세척하고 탈염하였으며, 50% 아세토니트릴 수용액 1000㎖로 활성분획을 수득하였다. 감압농축한 후, 동결건조를 수행하여 엽상체 형성 유인 분획을 수득하였다. 전기 배양과 조분획(coarse fraction)의 조제 2회분(배양액 약 140L 분)을 혼합하여, 이동상으로 100mM NaCl-20mM Na2HPO4-20% 아세토니트릴 수용액(pH 9)을 사용한 겔여과 크로마토그래피(Amersham Bioscience사 제품, Sephacryl S-100 HR 내경 25mm x 길이 1200mm)로 정제하고 엽상체 유인 활성을 보이는 분획을 수득하였다. 이 활성분획을 농축, 탈염 후, 동결건조하고 이동상으로 14 내지 22% 아세토니트릴 5g (NH4)2CO3/L 수용액을 이용한 고속액체 크로마토그래피(Amersham Bioscience사 제품, RESOURCE RPC 3ML, 내경 6.4mm x 길이 100mm x 2개 직렬)로 정제하여, 전기 이화학적 성질을 가지는 본 발명의 신규 화합물 1을 약 140㎍ 수득하였다.
실시예 3: 신규 화합물 2의 분리, 정제
실시예 2를 따라 분리된 신규 화합물 1은 최종정제에서 5 내지 25% 아세토니트릴-1% NH3 수용액인 강알칼리 조건에서 신규 화합물 2가 변화한 형태임이 입증되고 있다. 또한, 신규 화합물 1은 정제 전의 배양액 상등액에 신규 화합물 2와 같이 존재한다. 신규 화합물 2는 중성-약산성에서 매우 불안정하지만, 알칼리 조건에서 유도된 신규 화합물 1은 비교적 안정하다. 실시예 2의 최종정제 단계에서 이동상으로 17% 아세토니트릴- 5g (NH4)2CO3+5㎖ NH3/L 수용액을 사용한 고속액체 크로마토그래피(Amersham Bioscience사 제품, RESOURCE RPC 3 ML, 내경 6.4mm x 길이 100mm x 2개 직렬)에 의해 분리하게 되면, 도 4와 같은 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 화합물 2를 수득할 수 있다.
실시예 4: 신규 화합물 1의 메틸화체 및 그의 유도체의 제조와 이화학적 성질
신규 화합물 1 약 140㎍을 메탄올 40㎕에 용해하고, 벤젠 160㎕, 트리메틸실릴디아조메탄(10%, n-헥산 용액, Tokyo Kasei Kogyo사 제품) 100㎕를 첨가하여 잘 교반하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 디아조메탄의 황색이 없어질 때까지 소량의 아세트산을 조금씩 첨가하고 증발기로 용매를 증류, 제거한 후, 이동상으로 50 내지 100% 아세토니트릴 수용액을 이용한 고속액체 크로마토그래피(Tosho사 제품, TSKgel ODS-80Ts, 내경 4.6mm x 길이 150mm)로 분리한 경우, 거의 정량적(수득량 약 152㎍, 수율 99%)으로 신규 화합물 1의 트리메틸체(이하, Me1으로 축약)를 수득하였다. 또한, 이 트리메틸체는 NMR 측정용매인 중메탄올(deuterium methanol) 내에서 메톡시기(-OCH3)의 하나가 서서히 중메톡시기(-OCD3)로 치환되어 Me1B를 제공한다. Me1 약 152㎍을 메탄올 200㎕에 용해하여 얼음으로 냉각하면서 수소화붕소나트륨 1mg을 첨가하고 1시간 환원시켰다. 반응액을 이동상으로 50 내지 100% 아세토니트릴 수용액을 이용한 고속액체 크로마토그래피(Tosho사 제품, TSKgel ODS-80Ts, 내경 4.6mm x 길이 150mm)로 분리한 경우, 고수득량(수득량 140㎍, 수율 98%)으로 Me1의 환원체(이하, Me1H3으로 축약)를 수득하였다. 여기에서 수득한 Me1H3의 전량을 건조 디에틸에테르 400㎕에 용해시키고, 실온에서 20mg/㎖ 수소화붕소나트륨 에탄올 용액 100㎕를 첨가하여 실온에서 150분간 반응시켰다. 포화 염화나트륨 수용액 100㎕를 첨가하고 10분간 교반한 후, 증발기로 용매를 증류, 제거하였다. 이동상으로 50 내지 100% 아세토니트릴 수용액을 이용한 고속액체 크로마토그래피(Tosho사 제품, TSKgel ODS-80Ts, 내경 4.6mm x 길이 150mm)로 분리한 경우, 거의 정량적(수득량 123㎍, 수율 99%)으로 Me1의 고환원체(이하, Me1H1으로 축약)를 수득하였다. 다시, 여기에 수득한 Me1H1의 전량을 건조 디메틸설폭사이드 400㎕에 용해하고 가늘게 파쇄한 수산화나트륨 1mg을 첨가한 후, 요오드화메틸 40㎕를 가하여 실온에서 30분 반응시켰다. 얼음으로 냉각하면서 증류수 500㎕를 가하여 반응을 정지시킨 후, 이동상으로 50 내지 100% 아세토니트릴 수용액을 이용한 고속액체 크로마토그래피(Tosho사 제품, TSKgel ODS-80Ts, 내경 4.6mm x 길이 150mm)로 반응액을 그대로 분리한 경우, 거의 정량적(수득량 135㎍, 수율 99%)으로 Me1H1의 메틸화체(이하, Me1H1Me로 축약)를 수득하였다.
여기에서 수득한 화합물은 아래와 같은 이화학적 성질을 나타내었다.
[Me1의 이화학적 성질]
1. 물질의 색: 무색
2. 분자량: 499
3. 분자식: C27H37N3O4S
질량분석: FABMS: m/z 500 [M+H]+
고분해능 질량분석: 실측치 500.2569 [M+H]+
계산치 500.2583 (C27H38N3O4S)
4. 핵자기공명 시그널:
1)1H-NMR (중메탄올, 500MHz): (도 7)
δppm 0.916 (3H, s), 0.941 (3H, s), 0.973 (3H, s), 1.086 (1H, ddd, J = 3.5, 12.5, 13.0 Hz), 1.136 (1H, dd, J = 2.0, 12.0 Hz), 1.271 (1H, ddd, J = 4.0, 13.0, 14.0 Hz), 1.380 (3H, s), 1.47 (2H, m), 1.50 (1H, m), 1.65 (1H, m), 1.69 (2H, m), 1.73 (1H, m), 1.84 (1H, m), 2.130 (1H, ddd, J = 3.5, 7.0, 12.5 Hz), 2.34 (2H, m), 3.488 (3H, s), 3.914 (3H, s), 4.034 (3H, s), 7.911 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.258 (1H, d, J = 8.0 Hz)
2)13C-NMR (중메탄올, 125MHz): (도 8)
δppm 15.413 (q), 19.559 (t), 20.797 (t), 20.961 (q), 21.981 (q), 28.416 (t), 33.855(q), 34.164 (s), 37.928 (s), 40.356 (t), 41.722 (t), 42.996 (t), 52.266 (q), 53.255 (q), 52.255 (q), 53.328 (d), 57.432 (d), 79.291 (s), 120.0 (s), 127.392 (d), 140.407 (d), 141.6 (s), 146.659 (s), 149.8 (s), 164.761 (s), 166.027 (s), 167.402 (s)
5. 용해성: 물 및 DMSO에 난용, 50 내지 100% 메탄올 수용액, 50 내지 100% 아세토니트릴수용액 등의 함수용매에 가용, 헥산, 클로로포름 등의 저극성 유기용매에 난용
[Me1B의 이화학적 성질]
1. 물질의 색: 무색
2. 분자량: 502
3. 분자식: C27H34D3N3O4S
질량분석: FABMS: m/z 503 [M+H]+
고분해능 질량분석: 실측치 503.2777 [M+H]+
계산치 503.2772 (C27H35D3N3O4S)
4. 핵자기공명 시그널:
1H-NMR (중메탄올, 500MHz): (도 9)
δppm 0.916 (3H, s), 0.941 (3H, s), 0.973 (3H, s), 1.086 (1H, ddd, J = 3.5, 12.5, 13.0 Hz), 1.136 (1H, dd, J = 2.0, 12.0 Hz), 1.271 (1H, ddd, J = 4.0, 13.0, 14.0 Hz), 1.380 (3H, s), 1.47 (2H, m), 1.50 (1H, m), 1.65 (1H, m), 1.69 (2H, m), 1.73 (1H, m), 1.84 (1H, m), 2.130 (1H, ddd, J = 3.5, 7.0, 12.5 Hz), 2.34 (2H, m), 3.488 (3H, s), 3.914 (3H, s), 7.911 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.258 (1H, d, J = 8.0 Hz)
5. 용해성: 물 및 DMSO에 난용, 50 내지 100% 메탄올 수용액, 50 내지 100% 아세토니트릴수용액 등의 함수용매에 가용, 헥산, 클로로포름 등의 저극성 유기용매에 난용
[Me1H3의 이화학적 성질]
1. 물질의 색: 무색
2. 분자량: 471
3. 분자식: C26H37N3O3S
질량분석: FABMS: m/z 472 [M+H]+
고분해능 질량분석: 실측치 472.2630 [M+H]+
계산치 472.2634 (C26H38N3O3S)
4. 핵자기공명 시그널:
1) 1H-NMR (DMSO-d6, 500MHz): (도 10)
δppm 0.802 (3H, s), 0.810 (3H, s), 0.885 (3H, s), 0.951 (1H, m), 1.018 (1H, m), 1.150 (1H, m), 1.254 (3H, s), 1.35 (1H, m), 1.36 (1H, m) 1.37 (1H, m), 1.50 (1H, m), 1.54 (1H, m), 1.57 (1H, m), 1.58 (1H, m), 1.688 (1H, m), 1.984 (1H, m), 2.174 (2H, br d, J = 8.5 Hz), 3.399 (3H, s), 3.741 (3H, s), 4.570 (2H, br d, J = 5.5 Hz), 5.495 (1H, br t, J = 5.5 Hz), 7.587 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.722 (1H, d, J = 8.0 Hz)
2) 13C-NMR(중메탄올, HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Coherence) 및 HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence) 스펙트럼을 기초로 하여, 화 학적 이동(chemical shift)을 산정):
δppm 14.2 (q), 17.7 (t), 19.0 (t), 20.0 (q), 21.1 (q), 26.7 (t), 33.0 (q), 33.3 (s), 36.1 (s), 38.3 (t), 40.1 (t), 41.1 (t), 51.2 (q), 51.2 (d), 52.0 (q), 55.2 (d), 63.7 (t), 76.8 (s), 119.2 (s), 121.8 (d), 134.1 (s), 138.3 (d), 146.2 (s), 159.8 (s), 162.8 (s), 166.2 (s)
5. 용해성: 물 및 100% 메탄올에 난용, 50% 메탄올 수용액, 50% 아세토니트 릴 수용액 등의 함수용매에 가용, DMSO에 가용, 헥산, 클로로포 름 등의 저극성 유기용매에 난용
[Me1H1의 이화학적 성질]
1. 물질의 색: 무색
2. 분자량: 415
3. 분자식: C24H37N3OS
질량분석: FABMS: m/z 416 [M+H]+
고분해능 질량분석: 실측치 416.2747 [M+H]+
계산치 416.2735 (C24H38N3OS)
4. 핵자기공명 시그널:
1) 1H-NMR (중클로로포름, 500MHz): (도 11)
δppm 0.842 (6H, s), 0.918 (3H, s), 0.97 (1H,m), 1.04 (1H, m), 1.18 (1H, m), 1.327 (3H, s), 1.36 (1H, m), 1.42 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.55 (1H, m), 1.58 (1H, m), 1.64 (1H, m), 1.667 (1H, dd, J = 5.5, 12 Hz), 1.78 (1H, m), 2.02 (2H, m), 2.05 (1H, m), 3.650 (2H, d, J = 12 Hz), 4.647 (2H, d, J = 14 Hz), 4.801 (2H, br s), 7.226 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.474 (1H, d, J = 8.0 Hz)
2) 13C-NMR(중클로로포름, HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Coherence) 및 HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence) 스펙트럼을 기초로 하여, 화 학적 이동을 산정)
δppm 15.1 (q), 18.4 (t), 19.8 (t), 20.9 (q), 21.5 (q), 25.1 (t), 33.2 (s), 33.3 (q), 36.8 (s), 39.2 (t), 40.7 (t), 41.7 (t), 52.5 (d), 56.0 (d), 60.61 (t), 62.33 (t), 64.73 (t), 77.0 (s), 106.0 (s), 119.8 (d), 133.2 (s), 139.7 (d), 148.0 (s), 156.2 (s)
5. 용해성: 물에 난용, 10 내지 100% 메탄올 수용액, 10 내지 100% 아세토니 트릴 수용액 등의 함수용매에 가용, 헥산, 클로로포름 등의 저 극성 유기용매에 가용.
[Me1H1Me의 이화학적 성질]
1. 물질의 색: 무색
2. 분자량: 457
3. 분자식: C27H43N3OS
질량분석: FABMS: m/z 458 [M+H]+
고분해능 질량분석: 실측치 458.3201 [M+H]+
계산치 458.3205 (C27H44N3OS)
4. 핵자기공명 시그널:
1) 1H-NMR(중클로로포름, 500MHz): (도 12)
δppm 0.847 (6H, s), 0.921 (3H, s), 0.96 (1H, m), 1.05 (1H, m), 1.18 (1H, m), 1.331 (3H, s), 1.36 (1H, m), 1.41 (1H, m), 1.43 (1H, m), 1.57 (1H, m), 1.59 (1H, m), 1.67 (1H, m), 1.68 (1H, m), 1.77 (1H, br d, J = 13 Hz), 2.00 (1H, m), 2.09 (1H, m), 2.16 (1H, m), 3.19 (3H, br s), 3.45 (3H, br s), 3.509 (3H, s), 3.564 (2H, d, J = 12 Hz), 4.419 (2H, dd, J = 8.5, 10.5 Hz), 4.644 (2H, br s), 7.356 (1H, d, J = 7.0 Hz), 7.488 (1H, d, J = 7.0 Hz)
2) 13C-NMR(중클로로포름, HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Coherence) 및 HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence)스펙트럼을 기초로하여, 화학 적 이동을 산정)
δppm 15.0 (q), 18.7 (t), 20.0 (t), 20.6 (q), 21.7 (q), 26.2 (t), 33.2 (s), 33.5 (q), 36.9 (s), 39.4 (t), 41.0 (t), 42.0 (t), 52.8 (d), 56.2 (d), 58.4 (q), 59.0 (q), 59.1 (q), 70.2 (s), 74.0 (s), 75.6 (s), 76.9 (s), 109.9 (s), 120.5 (d), 135.1(s), 139.2 (d), 145.7 (s), 155.1 (s)
5. 용해성: 물에 난용, 30 내지 100% 메탄올 수용액, 30 내지 100% 아세토니 트릴 수용액 등의 함수용매에 가용, 헥산, 클로로포름 등의 저 극성 유기용매에 가용.
실시예 5: 신규 화합물 1의 최소 유효농도(MEC)의 검토
실시예 1의 경우와 동일하게, 48-MTP에 단리정제한 신규 화합물 1을 최종농도 1㎍/㎖부터 시작하여, 16단계 희석을 수행하였다. 이 때, Monostroma oxyspermum의 세포는 배지 1㎖ 당 약 20세포로 하였다. 희석할 때, 각 단계 희석마다 피펫 팁을 교환하였다. 이러한 일련의 조작을 3세트 준비하고, 실시예 1과 같이 3일간 배양하였다. 그 결과, 12단계 희석의 열까지 Monostroma oxyspermum의 엽상체 형성을 볼 수 있었다. 이로 부터, 신규 화합물 1의 MEC는 1㎍/㎖ x 10-12 = 1ag/㎖ (atto-gram per milliliter)이었다. 장기의 배양이 될수록 신규 화합물 1은 증식한 Monostroma oxyspermum에 소비되고, 엽상체가 붕괴하기 시작하였다. 배양 10일 후의 7단계 희석(신규 화합물 1의 최종농도 1 x 10-7㎍/㎖)을 한 결과를 나타낸 사진을 도 13에 나타내었다. 엽상체의 원형이 다소 남아있긴 하지만 엽상체 붕괴가 관찰되었다. 배양 10일 후의 6단계 희석(신규 화합물 1의 최종농도 1 x 10-6㎍/㎖)을 한 결과를 나타낸 사진을 도 14에 나타내었다. 엽상체가 붕괴하지 않고 유지되고 있었고, 배양 10일 후의 MEC는 1 x 10-6㎍/㎖ = 1pg/㎖ (pico-gram per milliliter)이었다. Monostroma oxyspermum의 세포는 실시예 1의 조건으로는 하루에 약 2회 세포분열을 수행하기 때문에 초기세포수가 20개의 경우, 3일 후에는 계산상,
20 x (2 x 2)3 = 1,280 세포
이지만, 10일간의 배양으로는 계산상,
20 x (2 x 2)10 = 20,971,520 세포
가 되며, 3일 후와 비교하면 10일 후에는 세포 수가 10,000 배 이상으로 증식하므로 MEC가 세포 수와 배양일 수에 따라 크게 변화함을 설명할 수 있다. 결국, 신규 화합물 1은 배양일 수와 세포의 증식에 따라 적절히 첨가할 필요가 있다.
실시예 6: 신규 화합물 1 및 유도체의 활성
실시예 5와 같이, 신규 화합물 1 및 그 유도체에 대해서 최소 유효농도를 측정한 결과 아래와 같은 결과를 얻었다.
표 7: 최소 유효농도
신규 화합물 1 10-12 ㎍/㎖Me1 10-4 ㎍/㎖Me1H3 10-2 ㎍/㎖Me1H1 활성없음
신규 화합물 1을 메틸화하면 활성이 1/108으로 감소하였다. 이로써 활성에는 실시예 4에 표시한 것과 같이, 트리메틸실릴디아조메탄 등의 메틸화제로 메틸화된 관능기가 중요하다고 사료되었다.
실시예 7: Ulva pertusa, Enteromorpha intestinalis의 배양실험
시즈오카켄 시미즈시 미호에서 채집한 Ulva pertusa, Enteromorpha intestinalis로부터 수득한 유주세포(free-living cell)를 항생물질 혼합액을 첨가한 ASP7 배지에서 주광성을 이용하여 세정 후, 멸균한 커버글래스로 채워진 사각형 페트리 디쉬에 첨가하여 5일간의 무균화 처리를 수행하였다. 커버글래스에 유주세포가 부착하여 자라기 시작할 때, 각 커버글래스를 6-MTP의 각 웰에 넣고, 항생물질 혼합액이 첨가되지 않은 ASP7 배지 10㎖을 첨가하였다. 실험구에는 신규 화합물 1을 1ng/㎖가 되도록 첨가하고, 대조구에는 아무것도 첨가하지 않고 실시예 1과 같은 조건으로 7일간 배양하였다. 10일 후, 실험구, 대조구의 커버글래스를 다시 같은 조건의 배지가 첨가되어 있는 배양 시험관에 옮기고 다시 7일간 배양하였다. Ulva pertusa의 실험결과를 도 15에, Enteromorpha intestinalis의 실험결과를 도 16에 나타내었다. 실험구, 대조구를 비교하면 알 수 있듯이 대조구의 경우는 가근(rhizoid)만이 비정상적으로 발달해 있고, 정상적인 엽상체의 형성은 볼 수 없었으나, 신규 화합물 1을 첨가한 경우는 정상적인 발생과 엽상체의 형성을 볼 수 있었다.
또한, 항생물질 혼합액을 첨가한 ASP7 배지는 ASP7 배지에 아래와 같은 조성을 가지는 항생물질 혼합액을 2% 첨가한 것이다.
표 8: 항생물질 혼합액
증류수 1,000㎖페니실린 100㎎스트렙토마이신 200㎎카나마이신 100㎎
실시예 8: 대형 녹조에 대한 형태형성 유도의 특이활성
실시예 5와 동일하게 하여, YM-1-69 주, YM-2-23 주 및 도 17에 표시한 유사균주에 대해서 최소 유효농도를 측정한 결과, 도 18과 같은 결과를 수득하였다. 여기서, 횡축은 유사균주의 배양 상등액 1㎕로 활성화된 Monostroma oxyspermum 배양액의 ㎖수를 나타낸다. 예를 들어, 도 18에서 YM-2-23 주는 배양 상등액 1㎕로 Monostroma oxyspermum 배양액 약 8,000㎖을 활성화시킬 수 있다.
실시예 9: 신규 화합물 1 및 그의 유도체의 부분구조의 결정
신규 화합물 1의 각종 NMR 스펙트럼 및 Mass 스펙트럼으로부터, 도 19에 표시한 부분구조가 도출되었다. 이들의 부분구조를 HMBC 스펙트럼을 해석함으로써, 도 20에 나타낸 driman 타입의 텔레페노이드 구조와 4치환 벤젠고리를 이을 수가 있었다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 신규 화합물 1의 트리메틸화체 Me1의 NMR 스펙트럼으로부터는 다시 4치환 벤젠고리의 1치환기의 부분구조와 NOESY 스펙트럼을 해석함으로써 상대입체 배치를 결정하였다. 또한, 도 22에 표시한 바와 같이, HMBC 스펙트럼으로부터 지금까지의 추정구조를 확인하였다. 도 23 및 도 24에 표시한 바와 같이, Me1H3에 있어서는 driman 부분과 벤젠 고리의 사이에 NOESY 및 HMBC 스펙트럼의 상관 피크가 관찰되며, 이들 둘의 구조를 탄소번호 11 내지 16, 및 8-O-21로 연결하여 부분구조를 추정하였다. 신규 화합물 1의 환원체 Me1H1에 있어서는 24위의 메틸렌기와 벤젠 고리 상의 21위의 사이에 상관 피크가 관찰되며, 도 25 및 도 26에 표시한 바와 같이 4치환 벤젠 고리의 마지막 치환기를 결정하였다. Me1H1의 메틸화체 Me1H1Me의 각종 NMR 스펙트럼으로부터, 도 27 및 도 28에 표시한 바와 같이, 벤젠 고리, N-메틸기, 24위의 메틸렌 기의 상관이 관측되었고, 지금까지의 추정 부분구조를 확인하였다.
실시예 4에 표시한 바와 같이, Me1H1Me는 신규 화합물 1을 메틸화, 환원반응 및 재 메틸화한 화합물이며, 신규 화합물 1은 아래의 화학식 1과 같은 구조이다.
화학식 1:
또한, 실시예 3에 표시한 바와 같이, 신규 화합물 1은 신규 화합물 2의 알칼리 처리에 의한 유도체이므로, 신규 화합물 2는 전기 화학식 1의 화합물의 케톤체인 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4의 어느 것으로 표시된 화합물 또는 이들의 혼합물이다.
화학식 2:
화학식 3:
화학식 4:
또한, Me1의 구조를 화학식 5에, 실시예 4에서 개시한 Me1의 중메톡시 치환기체 Me1B의 구조를 화학식 6에, Me1의 부분 환원체 Me1H3의 구조를 화학식 7에, Me1의 환원체 Me1H1의 구조를 화학식 8에 Me1H1의 재 메틸화체 Me1H1Me의 구조를 화학식 9에 나타내었다.
화학식 5:
화학식 6:
화학식 7:
화학식 8:
화학식 9:
본 명세서 내에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 참고문헌 으로서 본 명세서 내에 삽입되었다.
본 발명은 신규 화합물을 사용한 Ulva lactuca, Monostroma nitidum 등의 해양성 대형 녹조류의 신규한 배양ㆍ양식기술을 제공한다. 이 방법에 의하면, 실험실 내에서의 무균적인 배양이나 종묘의 안전한 유지관리 뿐만 아니라, 양식현장 등에서의 해양성 대형 녹조류의 안전한 성장과 생산을 수행하는 것이 가능하다.
<110> MARINE BIOTECHNOLOGY INSTITUTE CO., LTD <120> Novel Chemical Substance Having Morphogenetic and Growth-Accelerating Activities <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 190 <212> DNA <213> Tenacibaculum sp. <400> 1 cctacgggag gcagcagtga ggaatattgg tcaatggagg caactctgaa ccagccatgc 60 cgcgtgtagg aagactgccc tatgggttgt aaactacttt tatatgggaa gaaacccctc 120 ttacgtgtag aggcttgacg gtaccataag aataagcacc ggctaactcc gtgccagcag 180 ccgcggtaat 190 <210> 2 <211> 189 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> DNA nucleotide sequence of V3 region in 16S rRNA of YM-2-23 strain being identified as Cytophaga-Flavobacterium-Bacteriodes complex <400> 2 cctacgggag gcagcagtga ggaatattgg acaatgggcg ggagcctgat ccagccatgc 60 cgcgtgcggg aagaaggccc tatgggtcgt aaaccgcttt tatacgggaa gaaaccaccc 120 tacgtgtagg gtactgacgg taccgtaaga ataaggaccg gctaactccg tgccagcagc 180 cgcggtaat 189 <210> 3 <211> 1173 <212> DNA <213> Tenacibaculum sp. <400> 3 gtatctggag gtttacacgg agttggtgta tcttgtgtga atgcactttc agatcattta 60 aaagctacag ttcacagaga aggtaaaata tgggaacaag agtatgaacg tggtaaaaca 120 ctttatcctg taaaaactgt aggtgaaact gatataactg gtacagaagt aactttctta 180 ccagacaaaa gtattttcca acaaaccaca gaatataatt acgaaacgtt agctacacgt 240 atgcgtgagt tagcgtatct taataaagga atcacgatta cgttaacaga taagcgtaat 300 aaagatgatg aaggaaattt tattgctgaa actttccaca gtaacgaagg attatctgaa 360 tttgttaaat atttagatag tactcgtact cctgttattc agcatgtaat ttcaatggaa 420 ggtgagaaaa acggaattcc tgttgaggtt gcaatgattt ataatgattc atatgctgaa 480 aatttacatt cttatgtaaa taacattaat actcacgaag gaggaacaca tttatcagga 540 tttagaagag gtttaacaag tactttaaag aaatatgcag atacttctgg attactaaag 600 aacgttaagt ttgagatttc tggagatgat ttccgtgaag gtttaacggc aattgtatct 660 gtaaaagtag ctgaacctca gtttgaagga caaacaaaaa caaaattagg aaacagagaa 720 gttacttctg cagtatcgca agctgtagca gaaatgttaa ctgattattt agaggaaaat 780 cctaatgatg ctaaaacgat tgtacaaaaa gtaattcttg cagctcaagc gcgtcacgca 840 gctcgtaaag caagagaaat ggtgcaacgt aaaacagtaa tgagtattgg aggtttacct 900 ggtaaactat ctgattgttc tgaaactgat ccagcagttt gtgaaatttt cttagtcgag 960 ggagattcgg caggtggaac tgcaaaacaa ggtcgtgatc gtaatttcca agcaatttta 1020 cccttacgtg gtaagattct taacgtagaa aaagcgatgc agcataaagt ttttgagaat 1080 gaagaaatca aaaacatgtt tacggcttta ggaatcacta tcggaacaga agaagatcca 1140 agagcattaa acttatcaaa attaagatat cat 1173 <210> 4 <211> 1173 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> DNA nucleotide sequence of gyrB gene of YM-2-23 strain being identified as Cytophaga-Flavobacterium-Bacteriodes complex <400> 4 gtatccggtg gtttgcacgg ggtaggtgtt tcttgtgtga acgccctttc caatcatctt 60 aaagctaccg tacatagaga tgggaaagtt tgggaacagg aatatgaacg gggtaaatcc 120 ctttatcccg taaaaagtgt tggggagacc gatgaaactg gaaccattgt taccttcata 180 ccagatgatt caatctttac ccaaacaaca gagtatagtt atgagaccct tgccaacaga 240 atgcgtgagc tttcgttctt gaacaaaggg gttaccatta gcattacgga caaaagagta 300 aaggataaag aaggggagta cctttctgaa actttttatt ccgatgctgg actaagtgaa 360 tttgttaagt tcttggatgg tacccgtgaa cctttgattc aaggggttat cgcgatggaa 420 ggggagaaaa atggtatccc tgtggaagtg gcaatggttt acaacaccag ttacacggag 480 aatttacatt cctatgtgaa taacattaac acgcacgaag ggggtacgca tctttccggt 540 tttagaaggg gattgacctc tactttaaag aaatacgcag attcttctgg aatgctcgag 600 aaattgaagt ttgaggttca gggagatgat ttccgtgaag gacttacagc aattgtttcc 660 gttaaggtcg cagaacctca atttgaaggt cagacgaaaa ccaagcttgg aaaccgcgag 720 gtttcttctg cggtgagcca agctgtttct gaaatgctca cggattattt ggaggagcat 780 ccagatgatg ccaaggttat tgttcaaaaa gttatccttg ccgctcaggc cagacatgcc 840 gctacaaagg cccgtgaaat ggtacagcgt aagacggtaa tgagtattgg tgggctacct 900 ggaaaattgt ccgattgttc tgagcaagat cctgcgcaat gtgaagtatt tcttgtagag 960 ggagattctg caggtggtac ggcaaaaatg ggccgggacc gaaaatttca ggccattctt 1020 ccactaaggg gtaaaatctt gaacgtggaa aaagccatgc agcacaaggt ttttgaaaat 1080 gaggaaataa agaatattta tacggcccta ggggttacta ttggaacgga agaagatagt 1140 aaggccttga acctggaaaa attaagatat cat 1173

Claims (10)

  1. 다음과 같은 이화학적 성질을 가지는 화합물 1:
    (i) 물질의 색: 무색
    (ii) 분자량: 457
    (iii) 분자식: C24H31N3O4S
    질량분석: FABMS: m/z 456 [M-H]- (도 1)
    고분해능 질량분석: 실측치 456.1960 [M-H]-
    계산치 456.1930 (C24H31N3O4S)
    (iv) 핵자기공명 시그널:
    1)1H-NMR (D2O-20mM Na2HPO4 (pH 9), 750MHz): (도 2)
    δppm 0.818 (3H, s), 0.837 (3H, s), 0.882 (3H, s), 0.960 (1H, m), 1.058 (1H, m), 1.167 (1H, m), 1.326 (3H, s), 1.37 (1H, m), 1.38 (1H, m), 1.40 (1H, m), 1.58 (1H, m), 1.61 (2H, m), 1.52 (1H, br d, J = 13Hz), 1.76 (1H, br d, J = 14Hz), 2.024 (1H, m), 2.181 (1H, dd, J = 4, 14Hz), 2.291 (1H, dd, J = 14, 16.5Hz), 7.698 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.845 (1H, d, J = 7.5Hz)
    2) 13C-NMR(D2O-20mM Na2HPO4 (pH 9), 125MHz): (도 3)
    δppm 15.236 (q), 19.037 (t), 20.287 (t), 20.955 (q), 21.835 (q), 25.987 (t), 33.381 (s), 33.636 (q), 37.308 (s), 39.590 (t), 41.199 (t), 42.346 (t), 52.769 (d), 56.381 (d), 79.096 (s), 114.965 (s), 124.399 (d), 139.004 (s), 141.232 (d), 150.282 (s), 152.656 (s), 172.081 (s), 173.538 (s), 174.661 (s).
  2. 다음과 같은 이화학적 성질을 가지는 화합물 2:
    (i) 물질의 색: 무색
    (ii) 핵자기공명 시그널:
    1H-NMR(D2O-20mM Na2HPO4 (pH 9), 500MHz): (도 4)
    δppm 0.815 (3H, s), 0.834 (3H, s), 0.877 (3H, s), 0.949 (1H, m), 1.048 (1H, m), 1.163 (1H, m), 1.297 (3H, s), 1.35 - 1.40 (3H, m), 1.52 - 1.63 (4H, m), 1.753 (1H, br d, J = 14Hz), 2.012 (1H, m), 2.158 (1H, m), 2.299 (1H, m), 7.646 (1H, d, J = 8.0Hz), 7.769 (1H, d, J = 8.0Hz).
  3. 제 1항의 화합물 1을 생산하는 능력을 가지는 미생물을 배지에 배양하고, 배양물 내에서 화합물 1을 생성,축적시켜, 전기 생성,축적한 화합물 1을 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물 1의 제조방법.
  4. 제 2항의 화합물 2를 생산하는 능력을 가지는 미생물을 배지에 배양하고, 배양물 내에서 화합물 2를 생성,축적시켜, 전기 생성,축적한 화합물 2를 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물 2의 제조방법.
  5. 제 3항에 있어서,
    미생물은 YM-2-23 주(FERM BP-8417), 테나시바큘럼 종(Tenacibaculum sp.) YM-1-69(FERM BP-8418) 또는 그들의 유사균주인 것을 특징으로 하는
    화합물 1의 제조방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    미생물은 YM-2-23 주(FERM BP-8417), 테나시바큘럼 종(Tenacibaculum sp.) YM-1-69(FERM BP-8418) 또는 그들의 유사균주인 것을 특징으로 하는
    화합물 2의 제조방법.
  7. 제 1항의 화합물 1을 유효성분으로 포함하는 조류(algae) 배양용 배지.
  8. 제 2항의 화합물 2를 유효성분으로 포함하는 조류(algae) 배양용 배지.
  9. 제 1항의 화합물 1을 트리메틸실릴디아조메탄(trimethylsilyldiazomethane)으로 처리하여 수득되는 화합물 1의 모노메틸화체, 디메틸화체 또는 트리메틸화체.
  10. 제 9항의 트리메틸화체를 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)으로 처리하여 수득되는 화합물 또는 그 유도체.
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