KR20050010956A - 집광 다발색단을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 검출 및분석하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20050010956A KR10-2004-7020729A KR20047020729A KR20050010956A KR 20050010956 A KR20050010956 A KR 20050010956A KR 20047020729 A KR20047020729 A KR 20047020729A KR 20050010956 A KR20050010956 A KR 20050010956A
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바잔길레모시.
게이로드브렌트에스.
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더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드(target polynucleotide)용 샘플 분석용으로 제조된 방법, 조성물 및 물품에 관한 것으로서,
표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 추측되는 샘풀을 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 다중양이온 다발색단(polycationic multichromophore)과 센서 PNA 접촉시키고, 상기 센서 PNA는 신호표시 발색단을 포함하여, 자극된 다발색단으로부터 에너지를 흡수하고, 표적 뉴클레오티드의 존재하에 광을 방출하며, 상기 방법은 멀티플렉스 형태로 사용될 수 있고, 상기 방법을 실행시키기 위한 시약들을 포함하는 킷트를 또한 제공하는 것을 특징으로 한다.

Description

집광 다발색단을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 검출 및 분석하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION AND ANALYSIS OF POLYNUCLEOTIDES USING LIGHT HARVESTING MULTICHROMOPHORES}
실시간으로 DNA 서열을 고감도로 검출하는 방법들은 과학적 및 경제적으로 매우 관심을 끌고 있다.1,2,3이들의 용도들로는 의료 진단, 유전적 변이의 동정, 유전자 전달 모니터링 및 특이적 게놈 기술들이 있다.4양이온 유기 염료들, 가령 에티디움 브로마이드 및 티아졸 오렌지는 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 홈에 삽입될때 빛을 발산하며, 직접적인 DNA 하이브리드화(hybridization) 프로브로서 제공하지만, 서열 특이성이 없다.5,6가닥 특이적 분석을 위한 에너지/전자 이동 발색단 쌍이 존재하지만, 2개의 핵산들의 화학적 표지 또는 동일한 변형 가닥[예를 들면, 분자 비콘(molecular beacon)]의 이중 변형이 요구된다다.7,82개의 DNA 부위들을 표지시키는 것의 곤란한 점은 낮은 수득율, 높은 비용 및 하나씩 표지된 불순물들로 인해 검출 감도가 낮아진다는 점이다.9
최근 펩티드 핵산(PNA)을 도입함으로써 새로운 연구 및 진단 용도를 위한 기회가 주여졌다.10,11PNA에서, DNA 중의 음전하 인산 결합들이 펩티도미메틱(peptidomimetic) 중성 아미드 결합으로 치환된다. PNA/DNA 복합체들은 보다 신속하게 높은 결합력으로 형성되며, 유사한 DNA/DNA 복합체들보다 더 특이적이다.12음전하 DNA 가닥들 사이에서 일어나는 쿨롱 반발력(Coulombic repulsion)이 없어지면서 특성들이 개선된다. 따라서 PNA 복합체들은 열적으로 보다 안정하며, 이들의 골격에 의해 뉴클레아제, 프로테아제 및 펩티다아제들에 의한 생 분해에 덜 민감하다.13,14또한, 하이브리드화 중에 이온 세기 및 pH에 대한 이들의 일반적인 둔감성이 DNA 검출을 위한 폭넓은 플랫폼을 제공한다.18
샘플 중의 특정 폴리뉴클레오티드를 검출 및 분석하기 위한 방법들, 및 이 방법들에 사용가능한 조성물 및 물품들이 당 분야에 요구되고 있다.
발명의 요약
샘플 중의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출 및 분석하기 위한 방법들, 조성물들 및 제조물품들이 제공된다. 표적 폴리뉴클레오티드를 함유할 것 같은 샘플을다중양이온 다발색단, 및 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 센서 펩티드 핵산(PNA)과 접촉시킨다. 센서 PNA가 신호표시 발색단에 콘쥬게이트된다. 이론에 구애받지 않는다면, 샘플 중의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재하에서, 센서 PNA로 하이브리드화한 표적 폴리뉴클레오티드의 골격과의 정전기 상호 작용을 사용하여 신호표시 발색단(signaling chromophore)이 양이온 다발색단과 근접해지는 것으로 알려져 있다(도 1 참조). 그후, 신호표시 발색단은 여기된(excited) 다중양이온 다발색단으로부터 에너지를 수득할 수 있으며, 검출가능한 빛을 방출한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 샘플 중에서 자연발생할 때 분석할 수 있거나, 또는 분석 이전에 또는 분석과 결합하여 증폭될 수 있다. 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용가능한 시약들을 포함하는 용액이 상기 시약들을 함유하는 킷트(kit)로서 제공된다. 복수의 다른 표적 폴리뉴클레오티드들을 분석하기 위해 복수의 다른 센서 PNA들이 사용되는 방법들이 다중 장치들에 사용될 수 있다. 상기 방법들은 표면 상에서 표면-관련된 다중양이온 다발색단을 사용하여 선택적으로 수행될 수 있으며; 표면이 센서가 될 수 있다. 상기 방법들은 균일한 포맷으로 제공될 수도 있다. 본 명세서의 방법들 및 물품들은 폴리뉴클레오티드들을 검출하기 위한 다른 기술들에 대한 대안책으로서 사용될 수 있다.
본 발명은 샘플 중의 폴리뉴클레오티드를 검출 및 분석하기 위한 방법, 물품들 및 조성물에 관한 것이다.
도 1은 다중양이온 폴리머를 집광 다발색단으로서 사용하는 본 발명의 방법을 도시한 것이다. 신호표시 발색단을 포함하고, 원하는 표적 폴리뉴클레오티드에대해 상보적인 염기 서열을 갖는 센서 PNA(PNA-C*)를 제공한다. 샘플 중의 표적 폴리뉴클레오티드와의 접촉에 의해, 다중야이온 다발색단이 표적 폴리뉴클레오티드와의 정전기적 상호 작용으로 인해 신호표시 발색단과 근접해진다. 그후, 다발색단이 여기(excitation)되어 신호표시 발색단으로부터 빛이 방출된다.
도 2는 폴리머1(이하 참조) 및 센서 펩티드 핵산 PNA-C*의 각각의 흡수(녹색 및 오렌지색) 및 방출(청색 및 적색) 스펙트럼들을 도시한 것이다. 폴리머1및 PNA-C*에 대해 각각 380 ㎚ 및 480 ㎚에서 여기가 수행되었다.
도 3은 폴리머1의 여기에 의한, 상보적(적색) 및 비상보적(흑색) DNA의 존재하에서 PNA-C*의 방출 스펙트럼을 도시한 것이다. PNA-C*및 각 DNA를 pH = 5.5의 물에 함께 첨가하였다. 폴리머1의 방출과 관련하여 스펙트럼들을 정상화시켰다.
도 4는 올리고머2의 여기에 의한, 상보적(적색) 및 비상보적(흑색) DNA의 존재하에서 PNA-C*의 방출 스펙트럼을 도시한 것이다. PNA-C*및 각 DNA를 pH = 5.5의 물에 함께 첨가했다. 올리고머2의 방출과 관련하여 스펙트럼들을 정상화시켰다.
("유전자-칩" 및 "DNA-칩"을 포함하는) DNA 및 RNA 센서들을 위한 종래의 기술들은 DNA의 단일 가닥에 대한 형광 태그[루모포어(lumophore)]의 공유 부착에 따라 다르다. 상기 센서들은 대부분 어날라이트(analyte) 샘플의 표지에 따라 유지되며, 복잡한 교차-교정을 필요로 하는, 샘플에서 샘플의 표지 반응의 효능 변화로부터 바람직하지 않은 문제들이 야기된다. 다른 시스템들은 정확하게 처리된 서열들에 대한 루모포어 및 퀸처들의 부착을 필요로 하는 "분자 비콘" 접근법에 의존한다.
본 발명의 한 방법은 주요 수용액 중의 2개 이상의 성분들: (a) 집광, 발광 다발색단 시스템, 가령 예를 들면 콘쥬게이트화 폴리머, 반도체 양자점 또는 수용성인 수지상 구조물; 및 (b) 발광 신호표시 발색단 또는 "PNA-C*"에 콘쥬게이트된 센서 PNA와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 다발색단의 여기에 의한 신호표시 발색단-C*의 광 특성들의 파장 방출은 표적 폴리뉴클레오티드가 용액중에 존재한다는 것을 가리킨다. 복수개의 다른 센서 PNA들[각각 다른 염기 서열 및 다른 신호표시 발색단(PNA1-C1 *, PNA2-C2 *, PNA3-C3 *, PNA4-C4 *등)을 가짐]을 사용함으로써, 복수개의 다른 폴리뉴클레오티드들이 독립적으로 검출 및 분석될 수 있다.
집광 발색단 및 신호표시 발색단(C*)은 2개의 발색단의 흡수 밴드가 최소한 일치되고, 두 종의 발광 방출 스펙트럼이 다른 파장에서 있도록 선택된다. 수용액에서 제조될 때, 집광 발광 다발색단 시스템이 양하전되거나, 또는 양이온성이며, 바람직하게는 다중양이온(예를 들면, 다중양이온 콘쥬게이트된 다중전해질임)이다.센서 PNA는 하전되어 있지 않기 때문에, 센서 PNA와 양이온성 집광 발광 다발색단 시스템 사이에 최소의 쿨롱 상호작용이 있다. 센서 PNA의 서열에 대해 상보적인 표적 폴리뉴클레오티드를 첨가할 때, 표적 폴리뉴클레오티드는 센서 PNA와 하이브리드화한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 음하전되어 있기 때문에, 센서 PNA는 다중양이온 다발색단과 결합하고, 포스터 에너지(Foerster energy) 전달 기작을 통해 다중양이온 다발색단으로부터 신호표시 발색단으로 에너지가 전달된다. 센서 PNA의 서열과 상보적이지 않은 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 첨가될 때, 염기 쌍 하이브리드화가 일어나지 않으며, 다발색단과 센서 PNA 사이의 정전기적으로 매개된 착화가 일어나지 않는다. 다중양이온 다발색단과 신호표시 발색단 사이의 평균 거리가 상기 하이브리드화 부재시에 효과적인 에너지 전달을 하기에 너무 크기 때문에, 신호표시 발색단으로부터 방출이 적거나 없다. 시험 용액 중에 표적 폴리뉴클레오티드가 존재하는지를 검출하기 위해 전체적인 계획을 제공한다. 또한, PNA들은 dsDNA에 결합하고, 침범하고, 같은 서열의 DNA 가닥을 치환시킴으로써 3중 구조체를 형성할 수 있는 능력을 가진다.15,16,17상기 센서 PNA/다중양이온 다발색단 플랫폼들은 직접적인 dsDNA 검출을 위한 시스템에 혼입될 수 있다.18
상기 방법에 더해, 본 발명은 2개 이상의 성분들: (a) 양이온성 다발색단, 및 (b) 신호표시 발색단에 콘쥬게이트된 펩티드 핵산을 포함하는 "센서 PNA(sensor PNA)"(PNA-C*)를 포함하는 수용액을 제공한다.
실시예에서 입증되는 바와 같이, 콘쥬게이트된 폴리머와 같은 수용성 다발색단에 의해 부여되는 광학 증폭은 PNA 센서에 대한 폴리뉴클레오티드 하이브리드화를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 다중양이온 다발색단과 다른 구조체들 또는 고분자량 수용성 콘쥬게이트된 폴리머들을 사용함으로써 증폭이 개선될 수 있다. 본 발명은 형광 검출법의 용이성을 이용하고, PNA-DNA 상호작용에서 발견된 개선된 하이브리드화 특성에 이용하는 균일한 포맷으로 부여될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 증폭용으로 필요로 하지 않으면서 가닥 단독 분석법과 같은 대형 신호 증폭 때문에, 본 발명은 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는데 사용될 수 있다.
따라서, 종래의 유전자-칩 기술보다 유리한 본 발명의 유일한 잇점들로는 분석 이전에 샘플 중에 함유되어 있거나 또는 샘플로부터 유도된 폴리뉴클레오티드에 대한 루모포어 또는 발색단의 공유 결합에 의해 분석되는 각 샘플을 첫번째로 표지시킬 필요성이 없어진다는 점이 있다. 상기 결합 방법들은 결합 효능의 재생성에 있어서 본래 어려움을 가지며, 샘플에서 샘플로 교차-교정을 필요로 한다.
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드와 연관되어 샘플이 시험될 수 있는 분석법이면 어느 분석법에나 사용가능하다. 전형적인 분석법으로는 샘플 중에 표적 폴리뉴클레오티드가 존재하는지 또는 그의 상대량을 측정하는 방법이 있으며, 또는 분석법들이 정량적 또는 반-정량적이다.
본 발명의 방법들은 모두 멀티플렉스 포맷으로 수행될 수 있다. 복수개의 다른 센서 PNA들은 각 센서 PNA에 콘쥬게이트된 다른 신호표시 발색단을 사용하여 샘플 중의 대응하는 다른 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위해 사용될 수 있다.대응하는 다른 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 분석하기 위해 동시에 사용될 수 있는 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 50개, 100개, 200개, 400개 이상의 다른 센서 PNA들을 사용하는 멀티플렉스 방법들이 제공된다.
용액 중에 뿐만 아니라 기질 상에서 방법이 수행될 수 있지만, 용액 포맷이 확산으로 인해 보다 신속해질 것으로 기대된다. 따라서, 예를 들면 기질 상의 배열 포맷으로 분석이 수행될 수 있으며, 이는 센서가 될 수 있다. 이는 센서 폴리뉴클레오티드, 다중양이온 다발색단 또는 둘 다와 같은 기질에 분석 성분을 고정 또는 첨가함으로써 수행될 수 있다. 상기 기질들은 유리, 실리콘, 종이, 플라스틱, 또는 광전 변환기(optoelectronic transducer)로서 사용되는 광전 반도체들의 표면(가령, 인듐-도프된 질화 갈륨 또는 중합성 폴리아닐린 등)일 수 있다. 주어진 센서 폴리뉴클레오티드의 위치는 공지되어 있거나, 또는 배열 포맷으로 측정가능하며, 배열 포맷은 마이크로어드레스할 수 있거나(microaddressable) 또는 나노어드레스할 수 있다(nanoaddressable).
본 발명이 보다 상세하게 설명되기 이전에, 본 발명은 특정 방법론, 장치, 해결방법 또는 기구들에 제한되지 않으며, 상기 방법들, 장치들, 해결방법들 또는 기구들은 다양할 수 있다. 또한, 본 명세서의 방법들은 특정 실시형태들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않는 것으로 이해된다.
특별히 특정하지 않는한, 단수 형태("a", "an" "the")를 사용하는 것은 복수를 포함한다. 따라서, "표적 폴리뉴클레오티드(target polynucleotide)"는 복수의표적 폴리뉴클레오티드를 포함하며, "신호표시 발색단(signaling chromophore)"는 복수의 상기 발색단을 포함하고, "센서 PNA(sensor PNA)"는 복수의 센서 PNA 등을 포함한다. 또한, "2개(two)", "3개(three)" 등과 같은 특정 복수를 사용하면, 특별히 특정하지 않는 한 동일한 대상물의 복수로 해석된다.
"연결된(connected)", "부착된(attached)", "결합된(linked)" 및 콘쥬게이트와 같은 용어들은 상호 교환가능하게 사용되며, 특별히 특정하지 않는 한, 직접 및 간접 연결, 부착, 결합 또는 콘쥬게이트를 의미한다. 값의 범위가 인용되는 곳에서, 각 조정된 정수 값, 및 범위의 상한과 하한 사이의 각 프랙션이 상기 값들 사이의 각 서브범위에 따라 특별히 개시되는 것으로 이해된다. 범위의 상한과 하한들은 독립적으로 범위에 포함되거나 또는 범위로부터 배제되며, 상한 또는 하한이 포함되거나, 포함되지 않거나 또는 둘다 포함된 각 범위가 본 발명에 포함된다. 본 명세서에 기재된 값이 고유의 한계점인 경우에, 예를 들면 성분이 0 % 내지 100 %의 농도로 존재하거나 또는 수용액의 pH가 1 내지 14일 수 있는 경우에, 상기 고유의 한계점이 특별히 개시된다. 값이 명시적으로 인용되는 경우에는, 인용된 값과 동일한 정량 또는 양인 값도 또한 본 발명의 범주내에 그에 기초한 범위로서 속하는 것으로 이해된다. 결합물이 개시되는 경우에는, 결합되는 소자들의 각 서브결합이 명시되며, 본 발명의 범주내에 속한다. 역으로, 다른 소자들 또는 소자들 그룹들이 명시는 경우에는 그들의 결합물들도 포함된다. 복수의 대체물들을 갖는 본 발명의 소자가 개시되는 경우에, 각 대체물이 단독으로 또는 다른 대체물과 결합해서 배제되는 발명의 예가 개시되며; 본 발명의 1개 이상의 소자가 상기 배제물들을 가질 수 있고, 상기 배제물들을 갖는 소자들의 모든 결합물들도 개시되어 있다.
다르게 정의되거나 또는 명확하게 특정하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야에 통상의 기술을 가진 자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법들 및 물질들이 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들과 물질들은 이제 기술된다.
본 명세서의 모든 문헌들은 참고문헌이 인용되는 특정 물질들 및 방법들을 개시하고 설명하기 위한 목적으로 참고 문헌으로 이후에 통합된다. 본 명세서의 공보들은 본 출원의 출원일 이전에 개시된 것이다. 본 발명이 종래의 발명에 의해 상기 개시를 앞당길 권리가 없는 것으로 인정된다고 간주하지 않는다.
정의들
본 발명을 설명하는데 있어서, 이하의 용어들이 사용될 것이며, 이하에 설명된 바와 같이 정의된다.
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)", "핵산(nucleic acid)" 및 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"와 같은 용어들은 특정 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태를 의미하는 것으로 상호교환가능하게 사용되며, 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이들의 유사체들 또는 이들의 혼합물들을 포함한다. 상기 용어들은 분자의 1차 구조만 의미한다. 따라서, 상기 용어들은 3중-가닥, 2중-가닥 및 단일-가닥 데옥시리보핵산("DNA") 뿐만 아니라 3중-가닥, 2중-가닥, 및 단일-가닥 리보핵산("RNA")을 포함한다. 또한, 알킬화 및/또는 캡화에 의해 변형된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 변형되지않은 형태도 포함한다.
변형되었거나, 또는 변형되지 않은 경우에, 폴리머 표적 뉴클레오티드는 다중음이온 골격, 바람직하게는 본 명세서에 기술된 방법에서 다중양이온 다발색단과 정전기적으로 상호 작용하기에 충분한 음전하의 당-인산 배경을 가져야 하지만, 다른 힘들도 추가로 상호 작용에 참여할 수 있다. 센서 폴리뉴클레오티드는 펩티드 핵산의 예이지만, 표적의 부재하에서 다발색단과 최소로 상호 작용하는 다른 하전되지 않은 폴리뉴클레오티드도 사용될 수 있다. 주어진 분석 포맷을 위한 적당한 하이브리드화 조건들은 당업자에 의해 결정될 수 있으며; 조정가능한 비제한적인 변수들은 분석 성분들의 농도, pH, 사용되는 염들 및 이들의 농도, 이온 세기, 온도 등을 포함한다.
특히, "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)", "핵산(nucleic acid)" 및 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"와 같은 용어는 (2-데옥시-D-리보오스를 함유하는) 폴리데옥시리보뉴클레오티드, (D-리보오스를 함유하는) 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 스플라이싱되거나 또는 스플라이싱되지 않은 tRNA, rRNA, hRNA 및 mRNA, 및 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드 또는 C-글리코시드인 다른 종류의 폴리뉴클레오티드, 및 인산 또는 다른 다중음이온 골격을 함유하는 다른 폴리머들, 및 다른 합성 서열-특이적 핵산 폴리머들을 포함하며, 단 폴리머들은 DNA 및 RNA에서 발견되는바와 같은 염기 쌍 및 염기 적층을 위한 배열로 뉴클레오염기들을 함유한다. 따라서, 상기 용어들은 예를 들어, 3'-데옥시-2',5'-DNA, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 N3'P5' 포스포아미데이트, 2'-O-알킬-치환된 RNA, 2중-가닥 및 단일-가닥 DNA 뿐만 아니라 2중-가닥 및 단일-가닥 RNA, 및 DNA와 RNA 사이의 하이브리드를 포함하는 이들의 하이브리드를 포함하며, 또한 공지된 변형 종류들, 예를 들어 유사물에 의한 1개 이상의 뉴클레오티드들의 표지, 알킬화, "캡(cap)", 치환, 뉴클레오티드간 변형들, 가령 예를 들어, 음하전된 결합들을 갖는 변형물(예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 성분들을 함유하는 변형물, 가령 예를 들면 [효소(예를 들면, 뉴클레아제), 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)를 포함하는] 단백질, 인터칼레이터를 갖는 변형물(예를 들면, 아크리딘, 소라렌 등), (예를 들면, 금속, 방사성 금속들, 붕소, 산화적 금속 등의) 킬레이트 함유 변형물, 알킬화제 함유 변형물, 변형된 결합을 갖는 변형물(예를 들면, α 아노머 핵산 등) 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서, "뉴클레오시드(nucleoside)" 및 "뉴클레오티드(nucleotide)"와 같은 용어들은 공지된 퓨린 염기 및 피리미딘 염기들만 포함하지 않고, 변형된 다른 헤테로환형 염기들도 포함하는 성분들을 포함하여 의미할 것이라는 것을 잘 알 것이다. 상기 변형 염기들은 메틸화 퓨린 또는 피리미딘, 아크릴화 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 헤테로환형물들을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드들은 또한 당 성분에서의 변형을 포함하며, 여기서 1개 이상의 히드록실기가 할로겐, 지방족기로 치환되고, 에테르, 아민 등에 의해서 관능화될 수 있다. "뉴클레오티드 유닛(nucleotidic unit)"은 뉴클레오시드와 뉴클레오티드를 포함하는 경향이 있다.
또한, 뉴클레오티드 유닛으로의 변형은 재배열, 부가, 각각 상보적인 피리미딘 또는 퓨린에 수소 결합을 형성하는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기상에 관능기를 변경하기위한 치환을 포함한다. 생성된 변형 뉴클레오티드 유닛은 선택적으로 상기 다른 변형 뉴클레오티드 유닛을 갖는 염기쌍을 형성할 수 있지만, A, T, C, G 또는 U를 갖는 염기쌍을 형성할 수 없다. 비염기(abasic) 위치는 폴리뉴클레오티드의 작용을 방해하지 않도록 혼입될 수 있으며; 바람직하게 폴리뉴클레오티드는 비염기 위치를 포함하지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드내 잔기의 일부 또는 전부는 선택적으로 1개 이상의 방법으로 변형시킬 수 있다.
표준 A-T 및 G-C 염기쌍은 티미딘의 N3-H 및 C4-옥시와 아데노신의 각각 N1 및 C6-NH2 사이 및 시티딘의 C2-옥시, N3 및 C4-NH2와, 구아노신의 C2-NH2, N'-H 및 C6-옥시 사이에 수소 결합을 형성하도록 하는 조건하에 형성된다. 그러므로 예를들면 구아노신(2-아미노-6-옥시-9-β-D-리보푸라노실-퓨린)이 변형되어 이소구아노신(2-옥시-6-아미노-9-β-D-리보푸라노실-퓨린)을 형성한다. 상기 변형으로 뉴클레오시드 염기에서 더 이상 시토신과 표준 염기쌍을 형성하지 않을 것이다. 그러나 시토신(1-β-D-리보푸라노실-2-옥시-4-아미노-피리미딘)의 변형으로 이소시토신(1-β-D-리보푸라노실-2-아미노-4-옥시-피리미딘)을 형성하여 변형된 뉴클레오티드에서 더 이상 구아노신과의 효과적인 염기쌍이 아닌 이소구아노신과의 염기쌍을형성할 것이다. 이소시토신은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)에서 이용할 수 있으며; 이소시티딘은 Switzer 등의 (1993) Biochemistry 32:10489-10496 및 여기에 인용된 문헌에 기술된 방법에 의해서 제조될 수 있고; 2'-데옥시-5-메틸-이소시티딘은 Tor 등 (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467 및 여기에 인용된 참고문헌에 기술된 방법에 의해서 제조될 수 있고; 및 이소구아닌 뉴클레오티드는 상기의 Switzer 등(1993)에 의한 방법 및 Mantsch 등의 (1993) Biochem. 14:5593-5601의 방법 또는 Collins 등의 미국 특허 제5,780,610호에 개시된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 비자연적 염기쌍이 Piccirilli 등의 (1990) Nature 343:33-37에 2,6-디아미노피리미딘 및 이의 상보적인(1-메틸피라졸로-[4,3]피리미딘-5,7-(4H, 6H)-디온)의 합성에 대해서 기술된 방법에 의해서 합성될 수 있다. 독특한 염기쌍을 형성하는 다른 변형된 뉴클레오티드 유닛이 공지되어 있으며, Leach 등의 (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 및 상기의 Switzer 등에 기재되어 있다.
"상보적(complementary)" 또는 "실질적으로 상보적(substantially complementary)"은 뉴클레오티드들 또는 핵산들 사이의 염기쌍, 예컨대 센서 펩티드 핵산과 표적 폴리뉴클레오티드 사이의 염기쌍을 하이브리드화할 수 있는 능력을 의미한다. 상보적 뉴클레오티드는 통상 A와 T(또는 A와 U), 또는 C와 G이다. 2개의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 PNA는 1개의 가닥의 염기가 최적으로 배열 및 비교되는 경우 실질적으로 상보적이라할 수 있으며, 다른 가닥의 염기의 약 80% 이상, 통상 약 90% 내지 95%, 더 바람직하게는 약 98% 내지 100%의 염기가 적당하게 삽입 또는 결실되어 있다.
선택적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 PNA는 선택적 하이브리드화 조건하에 이의 상보물로 하이브리드화되는 경우 실질적으로 상보성이 존재한다. 전형적으로 선택적 하이브리드화는 14 내지 25개의 염기의 신축에 대해서 약 65%의 상보성, 바람직하게는 약 75%의 상보성, 더 바람직하게는 약 90%의 상보성이 있는 경우에 발생될 것이다. M. Kanehisa Nucleic Acids Res. 12:203 (1984) 참조.
"우선적 결합(preferential binding)" 또는 "우선적 하이브리드화(preferential hybridization)"는 샘플 중의 비상보적 폴리머와 비교하여 샘플 중의 1개의 폴리뉴클레오티드 또는 PNA가 이의 상보물과 결합하려는 경향이 증가되는 것을 나타낸다.
하이브리드화(hybridization) 조건은 전형적으로 약 1 M 이하, 더 통상적으로 약 500 mM 이하, 바람직하게는 약 200 mM 이하의 농도의 염을 포함한다. 펩티드 핵산과 다중음이온(polyanionic) 폴리뉴클레오티드 사이에 하이브리드화의 경우에, 하이브리드화는 염을 조금 함유하거나 또는 전혀 함유하지 않는 용액 중에서 실시할 수 있다. 하이브리드화 온도는 5 ℃ 이하이지만, 전형적으로 22 ℃ 이상, 더 전형적으로는 약 30 ℃ 이상이며, 바람직하게는 약 37 ℃ 이상이다. 더 긴 단편은 특정 하이브리드화에서 더 높은 하이브리드화 온도를 요구할 수 있다. 다른 인자들이 하이브리드화 요건에 영향을 줄 수 있으며, 예를들면 염기 조성물 및 상보적인 가닥의 길이, 유기 용매의 존재, 및 염기 부적합 정도를 포함하며, 사용된 파라미터들의 조합 형태는 상기 단독의 형태들의 절대적 조치보다 더욱 중요하다. 제어될 수 있는 다른 하이브리드화 조건으로 완충 형태 및 농도, 용액 pH, 반복 서열과 같은 배경 결합(background binding)을 감소시키는 차단제의 존재 및 농도, 또는 단백질 용액 차단제의 존재 및 농도, 디터전트 형태(들) 및 농도, 폴리뉴클레오티드의 상대 농도를 증가시키는 폴리머와 같은 분자, 금속 이온(들) 및 이들의 농도(들), 킬레이트제(들) 및 이들의 농도 및 당분야에 공지된 다른 조건들을 포함한다.
여기서 "멀티플렉싱(multiplexing)"은 다수의 분석물을 동시에 분석할 수 있는 분석 방법을 나타낸다.
"선택적(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"라는 표현은 연이어 기술된 경우 또는 상황이 발생될 수도 있고 또는 발생되지 않을 수도 있는 것으로 이해되며, 명세서에서는 경우 또는 상황이 발생하는 예와 발생되지 않는 예를 포함한다.
샘플(sample)
표적의 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 또는 포함하는 것으로 사료되는 샘플의 일부는 생물체[세포, 조직 또는 유액(fluid)을 포함함]와 상기 생물체(바이러스, 마이코플라즈마 및 화석을 포함함)에 의해 남겨진 퇴적물로부터 직접 또는 간접적으로 수득될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생물학적 물질이 공급원일 수 있다. 상기 샘플은 합성 수단을 통해서 제조된 표적의 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 샘플은 주로 수성 배지의 형태로 또는 수성 배지 중에 분산된 형태로 수득될 수 있다. 상기 샘플의 비제한적인 예로는 혈액, 소변, 정액, 우유, 객담, 점액, 구강상피세포의 채취(buccal swab),질액 채취(vaginal swab), 직장세포의 채취(rectal swab), 아스피레이터(aspirate), 경피경침생검(needle biopsy), 수술 또는 부검에 의해서 수득된 조직, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부, 호흡기, 장 및 비뇨생식관의 외부 분비물, 눈물, 타액, 종양, 기관, 시험관내(in vitro) 세포 배양 성분의 샘플(세포 배양 배지, 추정의 바이러스 감염된 세포, 재조합 세포 및 세포 성분에서 세포의 성장으로부터 기인되는 조건화된 배지에 제한되지 않고 포함됨), 및 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 라이브러리(recombination library)를 포함한다.
상기 샘플은 표적 폴리뉴클레오티드 또는 이의 대용물을 포함하는 것으로 알려져 있는 포지티브 조절된 샘플(positive control sample)일 수 있다. 비록 표적 폴리뉴클레오티드를 포함할 것으로 기대되지 않는다 하더라도 이를(1개 이상의 시약의 오염을 통해) 또는 인공의 포지티브를 생성할 수 있는 또 다른 성분들을 포함할 것으로 사료되고, 주어진 분석에 사용되는 표적 폴리뉴클레오티드에 의한 오염의 결여를 확인할 뿐만 아니라 주어진 분석 조건들의 세트가 인공의 포지티브(상기 샘플내 표적의 폴리뉴클레오티드의 부재하에도 포지티브 신호)를 생성하는지를 결정하기 위하여 시험되는 네가티브 조절된 샘플(negative control sample)이 또한 사용될 수 있다.
상기 샘플이 희석, 용해, 현탁, 추출될 수 있고, 또는 그 밖에 존재하는 표적 폴리뉴클레오티드를 용해 및/또는 정제하기 위해서 처리하거나, 또는 증폭에 사용되는 시약 또는 검출 시약에 접근가능하도록 만들 수 있다. 상기 샘플은 세포를 포함하며, 상기 세포는 분해 또는 삼투되어, 세포내의 폴리뉴클레오티드를 방출할수 있다. 1단계 침투(permeabilization) 완충액을 사용하여 세포를 분해시키고, 분해 이후에 직접 실행되는 추가의 단계로, 예를 들면 중합효소 연쇄 반응을 한다.
표적 폴리뉴클레오티드 및 이로부터 생성된 증폭 생성물
표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 그 이상의 가닥일 수 있으며, 직쇄형 또는 고리형일 수 있다. 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 예로는 mRNA, rRNA, tRNA, hnRNA, ssRNA 또는 ssDNA 바이러스 게놈을 포함하며, 이들 폴리뉴클레오티드는 내부에 상보 서열 및 중요한 2차 구조를 포함할 수 있다. 2중 가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 예로는 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 엽록체 DNA, dsRNA 또는 dsDNA 바이러스 게놈, 플라스미드, 파아지 및 비로이드(viroid)를 포함한다. 상기 표적 폴리뉴클레오티드는 합성으로 제조될 수 있거나 또는 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다. 상기 표적 폴리뉴클레오티드는 정제되어 샘플 중의 1개 이상의 목적하지 않는 성분들을 감소시키거나 또는 표적 폴리뉴클레오티드를 농축시킬 수 있다. 반대로 표적 폴리뉴클레오티드가 특정의 분석을 위해서 너무 농축되면, 표적 폴리뉴클레오티드를 희석시킬 수 있다.
샘플 수집 및 선택적 핵산 추출에 이어, 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플의 핵산 일부가 1 이상의 예비 반응으로 처리될 수 있다. 예비 반응들로는 시험관내 전사(IVT), 라벨링(labelling), 단편화(fragmentation), 증폭 및 기타 반응을 포함한다. mRNA는 먼저 역전사효소와 프라이머로 처리되어 검출 및/또는 증폭 이전에 cDNA를 제조한다: 이는 시험관내에서 정제된 mRNA로 실시하거나 또는 슬라이드에 고정시킨 세포 또는 조직에서 인 시츄(in situ)로 실시한다. 핵산 증폭으로 표적의 폴리뉴클레오티드와 같은 목적하는 서열의 복제수가 증가된다. 다양한 증폭 방법을 사용하기에 적당하며, 여기에는 중합효소 연쇄 반응법(PCR), 리가아제(ligase) 연쇄 반응(LCR), 자기 부양 서열 복제(self sustained sequence replication, 3SR), 핵산 서열계 증폭(NASBA), Q 베타 복제효소의 사용, 역전사, 닉 해독(nick translation) 등을 포함한다.
표적 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥인 경우, 제1 증폭 사이클은 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 프라이머 연장 생성물을 형성한다. 표적 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥 RNA인 경우 역전사효소 활성을 갖는 중합효소가 제1 증폭에 사용되어 RNA에서 DNA로 역전사하고, 추가의 증폭 사이클이 실시되어 프라이머 연장 생성물을 복제할 수 있다. PCR용 프라이머는 이들의 상응하는 주형내 영역(region)들로 하이브리드화되도록 설계되어 증폭가능한 생성물을 형성할 것이며; 그러므로 각 프라이머는 하이브리드화되어 이의 3' 뉴클레오티드가 이의 상보적인 주형 가닥애서 뉴클레오티드와 한 쌍을 이루어 PCR 중 상보적 주형 가닥을 복제하는데 사용되는 프라이머의 3' 뉴클레오티드로부터 3'에 위치한다.
표적 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 적당한 활성을 갖는 중합효소 및 프라이머와 표적 폴리뉴클레오티드의 1개 이상의 가닥과 접촉함에 의해서 증폭되어 프라이머를 연장하고, 표적 폴리뉴클레오티드를 복제하여 완전한 길이의 상보 폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부를 생성한다. 표적 폴리뉴클레오티드를 복제할 수 있는 중합효소 활성을 갖는 효소가 사용될 수 있으며, 이에는 DNA 중합효소, RNA 중합효소, 역전사, 1개 이상의 중합효소 활성을 갖는 효소를 포함하며, 상기 효소는 열불안정성이거나 또는 열안정성일 수 있다. 효소의 혼합물들이 또한 사용될 수 있다. 효소의 예로는 DNA 중합효소[예컨대, DNA 중합효소 I("Pol I"), Pol I의 클레노우(Klenow) 단편, T4, T7, 시쿼네이즈(Sequenase)(상표명) T7, 시쿼네이즈(상표명) 버젼 2.0 T7,Tub,Taq,Tth,Pfx,Pfu,Tsp,Tfl,Tli및 파이로코커스 종(Pyrococcus sp) GB-D DNA 중합효소]; RNA 중합효소(예컨대,E. coli, SP6, T3 및 T7 RNA 중합효소); 및 역전사효소[예컨대, AMV, M-MuLV, MMLV, RNAse H-MMLV(SuperScript(상표명)), SuperScript(상표명) Ⅱ, ThermoScript(상표명), HIV-1, 및 RAV2 역전사효소]를 포함한다. 상기 모든 효소는 시판품을 이용할 수 있다. 다수의 특이성을 갖는 중합효소의 예로는 RAV2 및Tli(exo-) 중합효소를 포함한다. 열안정성 중합효소의 예로는Tub,Taq,Tth,Pfx,Pfu,Tsp,Tfl,Tli및 파이로코커스 종 GB-D DNA 중합효소를 포함한다.
적당한 반응 조건으로 pH, 완충액, 이온 세기, 1개 이상의 염의 존재 및 농도, 반응물 및 보조인자[예컨대 뉴클레오티드 및 마그네슘 및/또는 다른 금속 이온(예를들면 망간)]의 존재 및 농도, 선택적 조용매, 온도, 중합효소 연쇄 반응을 포함하는 증폭을 위한 가열 사이클 프로필(thermal cycling profile)을 선택함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키며, 샘플의 특성 뿐만아니라 중합효소가 사용된 부분에 의존할 수 있다. 조용매는 포름아미드(전형적으로 약 2 % 내지 약 10 %), 글리세롤(전형적으로 약 5 % 내지 약 10 %), 및 DMSO(전형적으로 약 0.9 % 내지 약 10 %)를 포함한다. 인공의 포지티브 또는 증폭하는 동안 생성된 인공물의 생성을최소화하기위한 증폭 기술이 사용될 수 있다. 상기는 "터치다운(touchdown)" PCR, 열-개시 기술(hot-start techniques), 네스트 프라이머(nested primer)의 사용 또는 설계된 PCR 프라이머를 포함하며, 이들은 프라이머-이량체 형성의 경우에 줄기-루프(stem-loop) 구조를 형성하여 증폭되지 않는다. PCR을 촉진시키는 기술로는 원심(centrifugal) PCR(이는 상기 샘플내에서 더 큰 대류를 일으킴)을 사용할 수 있고, 상기 샘플의 급속 가열 및 냉각을 위한 적외선 가열 단계를 포함한다. 1개 이상의 증폭 사이클이 실행될 수 있다. 1개 이상의 프라이머가 사용되어 PCR 동안에 1개 이상의 프라이머 연장 생성물을 생성하며; 바람직하게 과량으로 생성된 프라이머 연장 생성물은 검출되는 증폭 생성물이다. 수 개의 다른 프라이머가 사용되어 다른 표적의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 샘플내에서 특정의 표적 폴리뉴클레오티드의 다른 영역을 증폭시킬 수 있다.
증폭된 표적 폴리뉴클레오티드가 증폭 이후에 처리될 수 있다. 예를 들면 몇가지 경우에, 이는 좀 더 용이하게 접근 가능한 세그먼트를 제공하기 위해서 하이브리드화되기 이전에 표적 폴리뉴클레오티드를 단편화하는 것이 바람직하다. 상기 핵산의 단편화는 실행되는 분석에서 유용한 크기의 단편을 생성하는 방법에 의해서 실행될 수 있으며; 적당한 물리적, 화학적 및 효소적 방법이 당분야에 알려져 있다.
증폭 반응은 증폭 사이클의 일부 또는 전부 동안 센서 폴리뉴클레오티드를 하이브리드화하여 증폭 생성물로 하는 조건하에서 실행될 수 있다. 상기 방법으로 분석을 실시하고, 상기 하이브리드화의 실시간 검출로 증폭 동안 상기 하이브리드화하자마자 발생되는 신호표시 발색단으로부터 광 방출율에서의 변화를 기록함에 의해서 실시될 수 있다.
다중양이온 다발색단(the polycationic multichromophore)
집광 다발색단 시스템으로 이를 포함하는 다수의 발색군에 의한 광흡수기가 효과적이라는 것이 입증되었다. 이의 예로는 콘쥬게이트된 폴리머, 콘쥬게이트된 분자의 응집체, 포화된 폴리머에 곁사슬을 통해 부착된 발광 염료, 반도체 양자점(quantum dot) 및 수지상 구조(dendritic structure)를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를들면 콘쥬게이트된 폴리머상에 각 반복 단위는 분배된 발색단으로 간주될 수 있으며, 양자점은 많은 원자로 구성되며, 포화된 폴리머는 곁사슬에 많은 발광 염료에 의해서 관능화될 수 있으며, 덴드리머(dendrimer)는 많은 공유 결합을 갖는 개개의 발색단을 포함하도록 합성될 수 있다. 고형 지지체(가령 폴리머 비드 또는 표면)상에 발색단 조립체시킴으로써 집광에 사용될 수 있다.
집광 다발색단 시스템은 바로 옆의 발광 종(예를들면 신호표시 발색단[signaling chromophores)]으로 효과적으로 에너지를 전달한다. 예를들면 에너지 전달 기작은 포스터 에너지 전달(Foerster(또는 형광) 포스터 에너지 전달, FRET), 양자 전하 교환(quantum-charge-exchange)(Dexter 에너지 전달) 등을 포함한다. 그러나 전형적으로 상기 에너지 전달 기작은 상대적으로 범위가 짧으며; 즉 신호표시 발색단에 집광 다발색단 시스템의 접근이 효율적인 에너지 전달을 위해서 요구된다. 효율적인 에너지 전달을 위한 조건하에, 신호표시 발색단으로부터 방출의 증폭은 집광 다발색단 시스템내 많은 개개의 발색단이 커졌을때 발생하고; 즉 신호표시 발색단으로부터의 방출은 입사광("펌프광(pump light)"은 집광 다발색단 시스템에 의해서 흡수되는 파장에 있을 때가 신호표시 발색단이 펌프광에 의해서 직접 여기되는 것보다 더 강하다.
콘쥬게이트된 폴리머(CPs)는 비편재화된 전자 구조를 특징으로 하며, 화학적 표적 및 생물학적 표적에 대한 높은 반응 광 리포터(highly responsive optical reporter)로서 사용될 수 있다.19,20효율적인 콘쥬게이트 길이는 폴리머 사슬보다 실질적으로 짧기 때문에, 골격은 다량의 콘쥬게이트 세그먼트를 포함한다. 그러므로 콘쥬게이트된 폴리머는 집광에 효율적이며, 포스터 에너지 전달을 통한 광 증폭할 수 있다.21수용성 CP는 반대 전하 수용체의 존재하에 예외적인 형광 퀀칭 효율을 보이며, 특히 생물학적 인식 경우의 형질 도입에 관심이 있다.22,23
양이온 다전해질(polyelectrolyte)과 DNA 사이의 자발 내부폴리머 복합성이 개시되어 있으며, 공동의 정전기력을 낸다.24,25,26방향족 폴리머 단위와 DNA 사이의 소수성 반응이 또한 최근에 알려졌다.27,28다전해질/DNA 반응의 자유 에너지가 용액 변수(예컨대, pH, 이온 강도 및 온도)와 조합되어 사용된 참여 분자종의 구조에 의해서 제어된다.29상기 반응의 강도 및 특이성이 최근에 조정되어 플라스미드 DNA의 3차 구조를 인식하였다.30
본 발명에서 사용된 다발색단은 다중양이온이여서 이들은 표적의 폴리뉴클레오티드와 정전기적으로 반응하여 전하를 띠지 않은 센서 PNA상에 신호 발색군을 에너지-수용 부근으로 센서 PNA와 표적의 폴리뉴클레오티드 사이의 하이브리드화에 의해서 전달한다. 광을 흡수할 수 있고, 에너지를 센서 PNA상의 신호 발색군으로 전달할 수 있는 다중양이온 다발색단이 기술된 방법으로 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 다 발색단의 예로는 콘쥬게이트된 폴리머(올리고머를 포함함), 포화 폴리머 또는 다양한 방법으로 다수의 발색군을 포함하는 덴드리머 및 반도체 나노크리스탈(SCNCs)을 포함한다. 콘쥬게이트된 폴리머, 포화 폴리머 및 덴드리머가 제조되어 다수의 양이온 분자종을 포함하거나 또는 유도되어 이들을 합성 후에 다양이온성으로 만들 수 있고; 반도체 나노크리스탈은 양이온 분자종을 이들의 표면에 첨가함에 의해서 다양이온성으로 만들 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 콘쥬게이트된 폴리머는 다중양이온 다발색단으로 사용된다. 특정 예로서 화학식 1에 개시되어 있으며, 여기서 양이온 수용성 콘쥬게이트된 폴리머는 요오드화물 짝음이온을 갖는 폴리((9,9-비스(6'-N,N,N-트리메틸암모늄)-헥실)-플루오렌 페닐렌)이다(하기의 화학식 1의 폴리머 1로서 표시됨).23 상기 폴리머의 특정 크기는 중요하지 않지만, 신호 발색군을 근접하도록 하기위한 광 흡수 및 에너지 전달을 할 수 있어야 한다. "n"의 전형적인 값은 2 내지 약 100,000이다. 상기 특정의 분자 구조는 중요하지 않지만; 상대적으로 높은 발광 양자 효율을 갖는 수용성 양이온성 콘쥬게이트된 폴리머가 사용된다.
수용성 콘쥬게이트된 올리고머가 다중양이온 다발색단으로 또한 사용될 수 있다. 요오드화물 짝음이온을 갖는 상기 수용성 양이온성 발광 콘쥬게이트된 올리고머의 예로는 하기 화학식 2에 개시되어 있다(화학식 2에 올리고머 2로 표시됨).
비록 작은 올리고머(화학식 2)는 고분자량 폴리머의 큰 신호 증폭 특성을 나타내지는 않지만, 작은 분자는 구조 특성 관계를 해리해석(deconvolute)하는데는 유용하며, 폴리머에서 발견되는 고유 다분산성 및 배치 대 배치 변수(batch-to-batch variation)를 결정하는 것이 어렵다. 또한, 수성 매질 중에, 올리고머(예컨대, 화학식 2)는 이들의 중합성 대응물보다 다 가용성이며, 중성 PNA와의 소수성 반응으로 폴리머 구조에서 보다 화학식 2에서 중요성이 떨어질 것으로 예측된다. 그러므로 올리고머의 조립체가 특정 적용에 있어서 바람직할 수 있다.
센서 PNA(sensor PNA)
센서 PNA는 분석될 표적의 폴리뉴클레오티드에 대해 상보성을 제공하며, 선정된 서열을 갖는다. 상기 센서 PNA는 분지쇄형, 다중결합(multimeric) 또는 고리형일 수 있지만, 그러나 전형적으로 직쇄형이며, 비자연적(nonnatural) 염기를 포함할 수 있다. PNA의 분자 구조는 잘 알려져 있다. PNA는 목적하는 염기 서열에 의해서 제조될 수 있다. 신호 발색군을 센서 PNA에 부착시키는 화학적 방법이 잘 알려져 있다.10발색군에 콘쥬게이트된 구조를 포함하는 특정 센서 PNA 구조는 시판품 또는 화학적으로 합성된 것을 사용하여 제조될 수 있다.
신호 발색군(signaling chromophore)
상기에 기술된 본 발명에서 유용한 발색군은 적당한 용액에서 다중양이온 다발색단으로부터 에너지를 흡수할 수 있고, 광을 방출할 수 있는 물질을 포함한다. 복잡한 분석을 위해, 수 개의 다른 신호 발색군은 검출가능한 다른 방출 스펙트럼으로 사용될 수 있다. 발색군은 발광(lumophore) 또는 형광일 수 있다. 전형적인 형광으로는 형광 염료, 반도체 나노크리스탈, 란탄화물 킬레이트 및 녹색 형광 단백질을 포함한다.
형광 염료의 예로는 플루오레신, 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민 6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민 110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(상표명), Cy3(상표명), Cy3.5(상표명), Cy5(상표명), Cy5.5(상표명), Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어(Alexa Fluor, 상표명) 350, 알렉사 플로어(상표명) 430, 알렉사 플로어(상표명) 488, 알렉사 플로어(상표명) 532, 알렉사 플로어(상표명) 546, 알렉사 플로어(상표명) 568, 알렉사 플로어(상표명) 594, 알렉사 플로어(상표명) 633, 알렉사 플로어(상표명) 647, 알렉사 플로어(상표명) 660, 알렉사 플로어(상표명) 680, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY, 상표명) FL, 보디피(상표명) FL-Br2, 보디피(상표명) 530/550, 보디피(상표명) 558/568, 보디피(상표명) 564/570, 보디피(상표명) 576/589, 보디피(상표명) 581/591, 보디피(상표명) 630/650, 보디피(상표명) 650/665, 보디피(상표명) R6G, 보디피(상표명) TMR, 보디피(상표명) TR, 이의 콘쥬게이트화물, 이들의 배합물을 포함한다. 란탄화뭏 킬레이트의 예로는 유로피윰(europium) 킬레이트, 테르비윰(terbium) 킬레이트 및 사마리윰(samarium) 킬레이트를 포함한다.
다양한 형광 반도체 나노크리스탈(SCNC)가 당분야에 공지되어 있으며; 반도체 나노크리스탈을 제조 및 사용하는 방법이 발명자인 Bawendi 등의 PCT 공개 제WO99/26299호(1999년 5월 27일 공개), Weiss 등의 USPN 5,990,479(에 의해1999년 11월 23일 등록) 및 Bruchez 등의 Science 281:2013(1998년)에 개시되어 있다. 반도체 나노크리스탈이 좋은 피크 방출 파장으로 매우 좁은 방출 밴드로 수득되어,선택적으로 다른 비-SCNC 형 신호 발색군과 배합하는, 같은 분석에서 신호 발색군으로 많은 다른 SCNC을 사용하게 된다.
"녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)"이라는 것은 네이티브 애쿼리아(Aequorea) 녹색 형광 단백질과 변경된 형광 특성을 나타내는 것으로 인식되는 성숙된 버젼을 나타내며, 변경된 여기 및 최대 방출을 포함하고, 다른 형태의 여기 및 방출 스펙트럼을 포함한다(Delagrave, S. et al.(1995) Bio/Technology 13:151-154; Heim, R.et al. (1994) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504; Heim, R. et al.(1995) Nature 373:663-664). Delagrave 등은 적색-전이 여기 스펙트럼을 갖는 클론된 에쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) GFP의 변이체를 분리하였다. Bio/Technology 13:151-154(1995), Heim등은 청색 형광을 갖는 변이체(Tyr 66 to His)를 보고하였다(Proc. Natl. Acad. Sci.(1994) USA 91:12501-12504).
기질(substrate)
기질은 넓은 범위의 물질인, 생물학적, 비생물학적, 유기적, 무기적 또는 이들의 조합 형태의 물질을 포함할 수 있다. 예를들면 기질은 중합성 Langmuir Blodgett 필름, 관능화된 유리, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO2, SiN4, 변형된 실리콘, 겔 또는 폴리머의 다양한 것으로 가령 (폴리)테트라플루오로에틸렌, (폴리)비닐리덴디플로오라이드, 폴리스티렌, 가교된 폴리스티렌, 폴리아크릴, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(락티드 코글리콜라이드), 폴리무수물, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리실록산, 중합성 실리카, 라텍스, 덱스트란 폴리머, 에폭시, 폴리카르보네이트 또는 이들의 배합물을 포함한다. 실행(conducting) 폴리머 광유도 물질을 사용할 수 있다.
기질은 평명의 결정성 물질로 가령 실리카계 물질(예를들면 유리, 석영 등), 또는 반도체 및 마이크로프로세스 산업에 사용되는 결정성 물질, 가령 실리콘, 갈륨 비소화물, 인듐 혼입된(doped) GaN 등이 있고, 반도체 나노크리스탈을 포함한다.
기질은 포토다이오드, 광전(optoelectronic) 센서로, 가령 광전 반도체 칩 또는 광전 박층 반도체, 또는 바이오칩(biochip)의 형태로 취할 수 있다. 기질상에 개개의 센서 폴리뉴클레오티드(들)의 위치(들)가 어드레서블(addressable)이 가능하고; 이는 고밀도 포멧을 실시할 수 있고 위치는 마이크로어드레서블(microaddressable) 또는 나노어드레서블(nanoaddressable)일 수 있다.
실리카 에어로겔(aerogel)은 또한 기질로서 사용될 수 있고, 당분야에 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 에어로겔 기질은 자유 스탠딩 기질 또는 다른 기질에 대한 표면 코팅제로서 사용될 수 있다.
기질은 어떠한 형태도 가능하며, 전형적으로 평판형, 슬라이드형, 비드형, 펠렛형, 디스크형, 입자형, 미세입자형, 모세광형, 패드형, 슬라이스형, 필름형, 칩형, 멀티웰 플레이트형 또는 디쉬형, 광섬유형 등일 수 있다. 기질은 견고하거나 또는 반견고한 형태일 수 있다. 기질은 상승된 또는 하강된 영역을 포함할 수 있으며, 상기 영역에 센서 폴리뉴클레오티드 또는 기타 분석 성분이 위치한다. 상기 기질의 표면이 공지된 기술에 의해서 부식되어 목적하는 표면 특성(예컨대 트렌치, V-홈, 메사 구조 등)을 제공한다.
기질 표면은 기질과 동일한 물질로 이루어지거나 또는 다른 물질로 이루어질 수 있으며, 화학적 수단 또는 물리적 수단에 의해서 기질에 결합될 수 있다. 상기 결합된 표면은 다양한 물질로, 예를들면 폴리머 플라스틱 수지, 폴리사카라이드, 실리카 또는 실리카계 물질, 탄소 물질, 무기 유리, 막, 또는 상기 기질 중 어느 것으로 이루어질 수 있다. 상기 표면은 선택적으로 투명할 수 있고, 표면 Si-OH 관능성, 예컨대 실리카 표면상에서 발견되는 것을 가질 수 있다.
상기 기질 및/또는 이의 선택적 표면이 선택되어 사용되는 합성 및/또는 검출 방법에서 적당한 광학 특성을 제공한다. 기질 및/또는 표면은 투명하여 다수의 방향으로부터 적용되는 광에 의해서 기질을 노출시킬 수 있다. 기질 및/또는 표면은 반사성 "거울" 구조를 가질 수 있어서 광의 회수율을 증가시킬 수 있다.
기질 및/또는 이의 표면은 사용 중 노출되어야 하는 조건에 일반적으로 저항하며, 저항하도록 처리되고, 상기 조건에 노출된 후 임의의 내성 물질을 제거하기 위해 선택적으로 처리될 수 있다.
센서 폴리뉴클레오티드는 임의의 적당한 방법, 예를 들어 U.S. Pat. No. 5,143,854, PCT Publ. No. WO 92/10092, U.S. Patent Application Ser. No. 07/624,120, filed Dec. 6, 1990(현재 금지됨), Fodor et al., Science, 251: 767-777(1991), 및 PCT Publ. No. WO 90/15070)에 기재되어 있는 방법에 의해 기질에 부착되거나 또는 제조될 수 있다. 기계적으로 합성하는 방법을 사용하여 상기 배열을 합성하는 기술은 예를 들어 PCT Publication No. WO 93/09668과 U.S. Pat.No. 5,384,261에 기재되어 있다.
또한 추가의 기술은 PCT Appl. No. PCT/US93/04145에 기재된 방법과 같은 기술을 기본으로 하는 비드(bead)와 U.S. Pat. No. 5,288,514에 기재된 방법과 같은 방법을 기본으로 하는 핀(pin)을 포함한다.
기질에 센서 폴리뉴클레오티드를 부착할 수 있는 추가의 유동 채널 또는 스폿팅 방법은 U.S. Patent Application Ser. No. 07/980,523 filed Nov. 20, 1992와 U.S. Pat. No. 5,384,261에 기재되어 있다. 시약은 (1) 미리 규정된 구역에 규정된 채널내의 유동화, 또는 (2) 미리 규정된 구역상에 "스폿팅(spotting)"에 의해서 기질에 운반된다. (용매의 특성에 따라 다른) 친수성 또는 소수성 코팅재와 같은 보호 코팅재는 다른 구역내 반응물 용액에 의해 습윤을 촉진시키는 물질과 때로는 결합하여, 보호되는 기질의 부분 상에 사용될 수 있다. 상기 방법에서, 유동화 용액은 추가로 이들의 표시되는 유동 경로의 외부를 통과하는 것으로부터 보호된다.
통상적인 디스펜서는 선택적으로 로봇으로 조절되는 미세파이펫, 잉크-젯 프린터, 일련의 튜브, 매니폴드, 파이펫 셋트 등을 포함하여, 다양한 시약을 순서대로 또는 동시에 운반할 수 있다.
발색단의 여기 및 검출
다중양이온 다발색단을 여기할 수 있고, 검출되는 방출 파장(들) 보다 짧은 파장을 제공하는 임의의 기구를 여기용으로 사용할 수 있다. 여기 공급원은 신호표시 발색단을 직접적으로 크게 여기하지 않는 것이 바람직하다. 공급원은: 적당한 필터와 자외선(deuterium) 램프와 같은 광대역 UV 광원, 목적하는 파장을 추출하는 모노크로마터를 통과시킨 후의 제논(xenon) 램프 또는 자외선 램프와 같은 백광원의 방출, 연속 파장(cw) 가스 레이저, 고형 상태 디오드(diode) 레이저, 또는 임의의 펄스된 레이저일 수 있다. 신호표시 발색단에서 방출된 광은 임의의 적당한 장치 또는 기술(여러가지 적합한 접근법이 당업에 공지되어 있음)로 검출할 수 있다. 예를 들어, 형광측정기 또는 분광광도계를 다발색단의 여기에 의해 신호표시 발색단의 파장 특성의 광을 시험 샘플이 방출하는 지의 여부를 검출하기 위해 사용할 수 있다.
킷트
본 발명의 방법을 실행하기 위해 유용한 시약들을 포함하는 킷트가 또한 제공되어 있다. 하나의 실시형태에서, 킷트는 원하는 표적 폴리뉴클레오티드와 골격 다발색단에 상보적인 단일 가닥의 센서 PNA을 포함한다. 센서 PNA는 신호표시 발색단에 콘쥬게이트된다. 샘풀내 표적 폴리뉴클레오티드의 존재로, 센서 PNA는 골격 다발색단과 정전기적으로 관련있는 표적에 하이브리드화됨에 의해 다발색단에 근접하게 된다.
킷트의 구성분들은 보호하는 틀로 보존될 수 있다. 본 발명의 방법을 실행하기 위해 킷트를 사용하기 위한 기구가 제공되며, 임의의 고정 매질도 제공될 수 있다. 기구는 보호하는 틀 내부 또는 외부에 두며, 기구를 판독하기 쉽게 보호하는 틀을 형성하는 특이 표면의 내부 또는 외부에 인쇄를 할 수 있다. 킷트는 대응하는 다른 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화할 수 있는 1개 이상의 다른 센서 PNA들을 다수 포함하는 멀티플렉스 형태일 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명을 사용하고 본 발명을 어떻게 했는지의 완벽한 설명으로 당업에 통상의 지식을 가진 자들에게 제공하기 위해 설명하였으며, 본 발명에 범주에 제한하지는 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)을 명확하게 하기 위해서 노력하였지만, 몇몇 실험은 실수와 오차가 계산되었다. 부분은 중량 부분이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 거의 대기압에 가까우며, 모든 재료는 시판되는 것이다.
실시예 1
FRET용 다발색단/신호표시 발색단 쌍의 확인
센서 PNA상에서 신호표시 발색단에 집광 다발색단 시스템으로부터 에너지를 이동시키는 능력은 폴리머 폴리((9,9-비스(6'-N,N,N-트리메틸암모늄)-헥실)-플루오렌 페닐렌), 기재된 참고문헌23과 같이 제조된 요오드화 주변음이온을 갖는 폴리머1, 및 5'-CAGTCCAGTGATACG-3'서열을 가지며, 5' 위치에 플루오레세인(C*)을 콘쥬게이트한 센서 펩티드 핵산 PNA-C*와 콘쥬게이트된 양이온 수용액을 사용하여 설명하였다. 폴리머1의 예상 흡수(녹색과 오랜지색)와 방출(청색과 적색) 스펙트럼, 및 센서 펩티드 핵산 PNA-C*는 도 2에 나타내었다. 여기는 폴리머1과 PNA-C*각각 380 nm와 480 nm에서 실행하였다. 폴리머1의 특이 여기용으로 최적의 창을 데이타에서 알 수 있다. 또한, 폴리머1의 방출과 C*의 흡수 사이에 FRET를 허락하는 탁월한 겹침이 있다.31
실시예 2
표적 폴리뉴클레오티드의 존재하에 FRET의 설명
PNA-C*프로브([PNA-C*]=2.5 ×10-8M)는 폴리머1의 부재하에 분리된 용기에서 등몰량의 상보적인 15개 염기쌍 ssDNA, (5'-CGTATCACTGGACTG-3')3, 및 비-상보적인 15개의 염기 ssDNA, (5'-ACTGACGATAGACTG-3')4을 동일한 방식으로 첩촉시켰다. 어닐링 단계는 완충제의 부재하에, 즉 PNA-C*(10-8M, pH=5.5에서 72 ℃)의 Tm보다 2 ℃ 낮은 온도와 저 이온 세기에서 실행하였다.32,33용융 실험을 실행하고, 260 nm에서 UV/Vis 분광기로 흡광도를 기록하였다.18온도를 증가시키면 하이브리드화 듀플렉스 보다 더 높게 흡수하는 2개의 단일 가닥인 상보적 ssDNA를 함유하는 샘플내 하이브리드화 듀플렉스의 용융에 의해 흡광도가 증가한다. 기대되는 것과 같이, 비-상보적인 ssDNA를 함유하는 샘플은 이러한 샘플에 듀플렉스가 형성되지 않는 것과 같이, 흡광도가 증가하지 않는다.
FRET는 상보적 및 비-상보적인 ssDNA들과 폴리머1([1]=2.3 ×10-7M)을 함유하는 어닐링된 샘플로 측정하였다. 폴리머1의 여기에 의해 상보적(적색) 및 비-상보적(흑색) DNA의 존재하 정상화 방출 스펙트럼은 도 3에 나타내었다. PNA/DNA하이브리드에 있어서 비-상보적인 쌍과 비교해서 FRET 비율이 11 배 이상 더 높게 검출되었다.34상기 FRET의 차이는 주어진 표적 폴리뉴클레오티드에 있어서 상기 기재된 방법의 특이성을 설명한다. 또한, 플루오레세인 방출은 폴리머1의 부재에서 직접 C*여기로부터 수득된 것 보다 8 배 이상이다.35센서 PNA, 표적 폴리뉴클레오티드 및 골격 다발색단을 포함하는 에너지 이동 착체내 상기 증가된 C*방출은 다발색단에 의해 제공되는 광 증폭을 나타낸다(폴리머1). 상기 감작화 수용체 방출은 상보적 표적 폴리뉴클레오티드의 존재하에서만 설명된다.
실시예 3
에너지 이동의 최적화
에너지 이동은 화합물1대 PNA-C*의 비율을 다양하게 변화시킴으로써 최적화하였다. [PNA-C*]=2.5 ×10-8M의 농도에서,1를 초기에 첨가하면 FRET 비율이 즉각 올라간다. [1]이 [PNA-C*]를 크게 초과하는 경우, 감소된다. FRET 비율이 최대이면 이전에 공고된 분자량 정보에 따라, 폴리머 사슬 대 PNA 가닥의 비율이 거의 1:1에 대응한다.23[1]/[PNA-C*]이 1 미만인 경우, 모든 ssDNA/PNA-C*하이브리드 가닥이 독립적인 폴리머 사슬과 효과적으로 복합체를 이루지 않기 때문에 상기 관계가 예상되었다. 대조적으로, [1]/[PNA-C*]이 1 이상인 경우,1(공여자)이 활용하는 모든 광자는 DNA/PNA-C*하이브리드(수용자)로 이동시킬 수 없다. 포화 시점에서 C*방출은 폴리머1의 다중 발색단 구조에 의한 신호 증폭의 추가 증거를 주는, 직접 C*여기(480 nm)에 의해 수득되는 것 보다 25 배 이상 더 높다.
실시예 4
배경 신호표기를 감소시키기 위한 유기 용매의 사용
도 3의 설명으로1과 PNA-C*사이의 소수성 상호작용으로부터 야기되는, 비-하이브리드화 PNA 브로브로부터의 작은 플루오레세인 신호를 알 수 있다.36실시예 2에서 나타내는 실험과 동일한 조건 하에서 최종 농도가 10 %의 에탄올이 되도록 분석 용액에 에탄올을 첨가하면 배경 C*방출이 감소한다. 유기 용매의 존재로 소수성 상호작용이 감소하고, 3 요소에 의한 배경 C*방출이 감소하며, 상기 시점에 배경 신호는 표준 형광분석기를 사용하여 거의 탐지할 수 없다.37
실시예 5
제2 다중양이온 다발색단을 사용하는 표적 폴리뉴클레오티드 검출
평균 n=20로 기재된 것과 같이 제조된 올리고머2와 콘쥬게이트된 수용액은 집광 발색단으로 이용하였다.23올리고머2의 여기에 의해 상보적(적색) 및 비-상보적(흑색) DNA의 존재하에 PNA-C*의 정상화 방출 스펙트럼은 도 4에 나타내었다.분석은 [2]=6.7 ×10-8M 및 [PNA-C*]=2.5 ×10-8M으로, 실시예 2에 기재된 것과 같이 실행하였다. 도 4는 C*방출이 단지 상보적 표적 폴리뉴클레오티드가 존재하는 경우에만 검출됨을 보여준다. 도 3과 도 4의 비교는 더 높은 분자량이 더 높은 FRET 비율을 유도하는 콘쥬게이트화 폴리머(올리고머)를 사용하는 것을 설명한다. 따라서, 매우 높은 FRET 비율과 상응하는 높은 감작성은 실시예에서 사용되는 것 보다 더 높은 분자량을 갖는 다중양이온 다발색단으로 기대할 수 있다.
본 발명은 바람직한 실시형태를 참고하여 보다 자세하게 설명되었지만, 당업에 통상의 지식을 가진 자에게 본 명세서의 기술의 도움으로 본 발명의 범주나 정신에서 벗어나지 않는 범위내에서의 어떤 변화 및 변형이 가능할 수 있음은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 청구범위에 의해서만 제한된다.
참고문헌

Claims (30)

  1. - 표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것으로 추측되는 샘플을 준비하는 단계;
    - 표적 폴리뉴클레오티드와 정전기적으로 상호 작용하며, 여기(excitation)에 의해 신호표시 발색단(signaling chromophore)에 에너지를 이동시킬 수 있는 다중양이온 다발색단(polycationic multichromophore)을 준비하는 단계;
    - 단일 가닥이며, 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 센서 펩티드 핵산(PNA)을 준비하는 단계(상기 센서 PNA는 신호표시 발색단에 콘쥬게이트되어 있음);
    - 센서 PNA가 표적 폴리뉴클레오티드(존재하는 경우)에 하이브리드화(hybridization)될 수 있는 조건하에서 용액 중에 센서 PNA 및 다발색단과 샘플을 접촉시키는 단계;
    - 다발색단을 여기시킬 수 있는 용액에 광원을 적용하는 단계; 및
    - 신호표시 발색단에서 광이 방출되는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    다발색단은 포화 폴리머, 콘쥬게이트화 폴리머(conjugated polymer), 덴드리머(dendrimer) 및 반도체 나노결정(semiconductor nanocrystal)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    다발색단은 포화 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    다발색단은 덴드리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    다발색단은 반도체 나노결정을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  6. 제 2 항에 있어서,
    다발색단은 콘쥬게이트화 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    콘쥬게이트화 폴리머 구조는 하기 화학식으로 표시돠는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
    (화학식 1)
  8. 제 6 항에 있어서,
    콘쥬게이트화 폴리머 구조는 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
    (화학식 2)
  9. 제 1 항에 있어서,
    샘플은 전하비(charge ratio)가 대략 1:1인 센서 PNA 및 다발색단과 접촉되는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    샘플은 충분한 양의 유기 용매의 존재하에 센서 PNA 및 다발색단과 접촉되어, 센서 PNA와 다발색단 사이의 소수성 상호작용을 감소시키는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    샘플은 대응하는 다른 서열을 갖는 다수의 다른 센서 PNA들(상기 다른 센서 PNA들은 대응하는 다른 신호표시 발색단을 포함함)과 접촉되며, 각각의 상기 다른 센서 PNA들은 대응하는 다른 표적 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 하이브리드화될 수 있는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    발색단은 형광발색단(fluorophore)인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    형광발색단은 반도체 나노결정, 형광 염료(fluorescent dye) 및 란타니드 킬레이트(lanthanide chelate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    형광발색단은 반도체 나노결정인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    형광발색단은 형광 염료인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    형광발색단은 플루오레세인(fluorescein)인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  17. 제 13 항에 있어서,
    형광발색단은 란타니드 킬레이트인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  18. 제 1 항에 있어서,
    표적 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  19. 제 1 항에 있어서,
    표적 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  20. 제 1 항에 있어서,
    샘플은 단일 가닥의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  21. 제 1 항에 있어서,
    샘플은 이중 가닥의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  22. 제 1 항에 있어서,
    표적 폴리뉴클레오티드는 증폭 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  23. - 단일 가닥이며, 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 센서 펩티드 핵산(PNA)(상기 센서 PNA는 신호표시 발색단에 부착되어 있음); 및
    - 표적 폴리뉴클레오티드의 인산 골격(phosphate backbone)과 정전기적으로 상호작용할 수 있으며, 표적 폴리뉴클레오티드에 센서 PNA가 하이브리드화됨에 의해 신호표시 발색단에 근접하게 될 때 여기에 의해 신호표시 발색단에 에너지를 이동시킬 수 있는 다중양이온 다발색단을 포함하는 것을 특징으로 폴리뉴클레오티드 탐지 용액(sensing solution).
  24. - 단일 가닥이며, 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 센서 펩티드 핵산(PNA)(상기 센서 PNA는 신호표시 발색단에 콘쥬게이트됨); 및
    - 표적 폴리뉴클레오티드의 인산 골격과 정전기적으로 상호작용할 수 있으며, 표적 폴리뉴클레오티드에 센서 PNA가 하이브리드화됨에 의해 신호표시 발색단에 근접하게 될 때 여기에 의해 신호표시 발색군에 에너지를 이동시킬 수 있는 다중양이온 다발색단을 포함하는 것을 특징으로 표적 폴리뉴클레오티드용 샘플 분석 키트(kit).
  25. 제 1 항에 있어서,
    역치 레벨(threshold level) 위에서 신호표시 발색단으로부터 방출되는 광은 샘플에 존재하는 표적 폴리뉴클레오티드를 나타내는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  26. 제 1 항에 있어서,
    신호표시 발색단으로부터 방출되는 광의 양은 정량되어, 샘플내 표적 폴리뉴클레오티드의 양을 결정하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  27. 제 12 항에 있어서,
    형광발색단은 녹색 형광 단백질(green fluorecent protein)인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  28. 제 1 항에 있어서,
    표적 뉴클레오티드는 증폭되지 않는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  29. 제 1 항에 있어서,
    상기 방법은 기질상에서 실행하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    기질은 복수의 다른 센서 PNA에 콘쥬게이트되는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
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