KR20040105717A - 저비용 세포 분석기에서의 세포 계산 방법 및 알고리즘 - Google Patents

저비용 세포 분석기에서의 세포 계산 방법 및 알고리즘 Download PDF

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Abstract

유세포 분석에 의한 유체내 세포 계산은 상이한 체액내 백혈구조 또는 환경 시료, 식품 및 체액내 박테리아 오염의 평가와 같은 여러 분야에 걸쳐 폭넓게 사용된다. 이러한 여러 응용시, 장비의 비용, 크기 및 복잡성이 더욱 폭넓은 사용, 예컨대, 자원이 부족한 국가에서 HIV 모니터링시 CD4 분석과 같은 사용을 방해한다. 본 명세서에 공개된 장치, 방법 및 알고리즘은 이러한 제한점을 크게 극복한다. 간단히, 생물학적 시료내 모든 시료를 형광 표지하고, 목표 세포만을 자기적으로 표지한다. 챔버 또는 큐벳내의 표지된 시료를 2개의 쒜기 형태의 자석 사이에 두어, 자기적으로 표지된 세포가 큐벳의 관찰 표면으로 선택적으로 이동하도록 한다. LED는 세포로 방사되고, CCD 카메라는 목표 세포에서 방출된 형광 빛의 이미지를 포착한다. 신규한 알고리즘으로 수행된 이미지 분석은 표면상의 세포의 계수를 제공하며, 이는 원래 시료의 목표 세포 농도와 관련될 수 있다. 본 소형 세포 분석기 시스템은 원격 위치에서도 사용될 수 있는 견고하고, 입수 가능하며, 사용이 용이한 기술이다.

Description

저비용 세포 분석기에서의 세포 계산 방법 및 알고리즘{METHODS AND ALGORITHMS FOR CELL ENUMERATION IN A LOW-COST CYTOMETER}
체액 내의 세포 및 이들의 조(組, subset)의 절대치의 계산은 인간 및 널리 포유류의 건강 상태를 결정하는데 매우 중요하다. 이러한 분석을 수행하기 위한 주된 분석 기반은 유세포 분석인데, 이 때 표본은 직접 또는 극소 세포 분석에서는 사전 배양 후에 주입된다. 유세포 분석 및 유사한 복합 분석 시스템은 장비 및 시약의 고비용, 기술 지원의 부족, 빈번한 서비스가 요구되는 견고성의 결여, 및 AC전력의 요구로 인하여, 자원이 부족한 국가에서 통상 임상 용도로 널리 사용하기에는 아직 불가능한 상태이다. 이에, 더욱 간단하고 소형의 저가 시스템이면서, 비상시에는 DC 전지 전력으로 작동이 가능한, 종래에 필적하는 바람직한 수행 특성을 나타내는 시스템이 명백히 요구된다.
벡튼 디킨슨 및 벡맨-컬터(Becton Dickinson and Beckman-Coulter)로부터 입수 가능한 전술한 보통 크기의 유세포 분석 시스템과는 별도로, 위 판매자는 또한 축소된 저가 형태를 판매하는데, 이 형태 역시 열거된 또 다른 제약을 받는다. 파르텍 게엠베하(Partec GmbH, 독일, 문스테르)사의 소형 사이플로우(CyFlow?) 및 구아바 퍼스널 세포 분석기(Guava Personal Cytometer, 캐나다, 버링에임)도 유사한 제약을 받는다. 미국 특허 제6,097,485호(미국 남다코타주 인터그레이티드 웨이브 가이즈(Integrated Wave Guides)사에 양도)는 저가의 초소형 퍼스널 유세포 분석기(pFCM)을 개시하고 있는데, 이는 여전히 복합체, 전자 회로, 광학 디자인, 데이터 정리로, 이 모두 제3 세계에 세팅하기에는 복잡하다. 이러한 모든 시스템들은 유동 개념을 사용하는데, 이는 장비 디자인을 명백히 복잡하게 한다. 이러한 축소된 형태의 유세포 분석 시스템은 진정한 간단하고 소형이며 튼튼하고 전지로 작동 가능한 알맞은 형태의 세포 분석기에 대한 명백한 요구를 충족시키지 못한다.
간단한 세포 분석기의 여러 임상적 응용 중, HIV 내의 CD4 세포, 화학 요법으로 치료된 환자의 과립구 및 혈소판, 및 혈액 자루의 백혈구의 계수가 무엇보다도 중요하다. 현재의 세포 분석용 시스템 및 방법은 몇가지 중요한 결점을 갖는다. 이들은 초기 비용 및 유지 비용의 양측면에서 고가인 장비의 사용 및 고도로숙련된 기술자에 대한 요구를 포함하여, 일반적으로 복잡한 기술을 요한다. 이 때문에 자원이 부족한 국가의 실험실에서 종래 시스템을 사용하는 것은 적합하지 않다. 따라서, 예컨대, CD4 세포 계산인 경우, 저가이고, 사용이 용이한 방법이 필요하다. 이러한 방법은 테스트 외에 의사의 치료 또는 여러 분야 세팅에 적합한 현재 세포 분석 시스템에 대한 소형 대체품으로 제공될 수 있다.
HIV 및 에이즈는 아프리카에서 주된 사망 원인이며, 전세계적으로도 4번째 사망 원인이다. 에이즈 주감염 국가에서는 평균 수명이 10년 정도 감소하였으며, 유아 사망률이 2배로 치솟았다. 보츠와나, 남아프리카, 짐바브웨와 같은 높은 HIV 유병률을 갖는 국가에서는, 감염자들이 최근에 명백한 증상까지 발병되지 않으므로 이 전염병의 완전한 영향을 아직 체감하지 못하고 있다. HIV로 인한 사망이 가족, 사회 체계, 및 국가 성장 및 개발에 미치는 영향도 동등하게 중요하다. 국가의 국내 총생산에 실질적으로 기여하는 10대 후반의 청소년이 가장 통상적으로 영향을 받는다. HIV 감염자에 대한 가장 효과적인 개입 요법은 항레트로바이러스 약제들의 복합 사용이다. 그러나, 이러한 섭생의 고비용 및 이들의 사용을 모니터링하는데 필요한 기본 시설은 대부분의 HIV 감염자를 약물 치료하기에는 부족하다. 이러한 약물의 가격이 내려가고 있음에도, 더 많은 사람들의 치료를 가능케하고 이러한 약물 치료의 효과적인 사용을 지원하는 기본 시설은 여전히 불충분하므로, 이의 증원이 요구된다. 예후를 예측하고 요법을 계획하기 위한 목적으로 개인의 질병을 특정하기 위해, 임상 의학자들은 질병이 어떻게 진행하는지를 알 필요가 있다.
HIV 질병에서 CD4 계수에 의한 지시가 현재 가장 유용하다. HIV는 T-림프구의 CD4 양성 조에 감염하여, 이들의 고갈 및 에이즈에서 명백히 나타나는 다양한 통성 감염의 발병을 초래한다. HIV 감염 과정 동안, CD4+ T-림프구의 수는 정상 수치인 약 500 내지 1300 세포/㎕에서 200 세포/㎕ 이하로 감소한다. 치료되지 않은 전형적인 환자에서 HIV의 자연적 과정은 혈액내 바이러스의 급격한 증가로 시작하여, CD4+ T-세포의 결과적 감소로 나타난다. 면역 시스템은 곧 일정 범위로 회복하나, HIV 수치는 수년 동안 상당히 일정하게 유지된다. 어떤 경우에는, 바이러스가 우세해 지기도 한다. CD4+ T-세포 수치가 혈액 mm3당 200 세포 이하로 감소할 때 또는 통성 감염(실패된 면역성을 반영함)이 나타날 때 중 어느 쪽이든 먼저 발생될 때 에이즈로 진단한다. 따라서, CD4+ T-세포 수치는 HIV 질병 진행을 결정하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 절대 CD4 계수의 일상적 모니터링은 요법에 대한 반응은 물론, 요법의 유효성을 결정하는데 있어 중요한 정보를 제공해준다.
상기 요구들에 기초하여, 이하 디자인 분류 기준은 본 발명을 사용하여 HIV 환자에서의 CD4 세포의 검출 및 계산을 위해 확립하였다:
1. 계산은 100 내지 2500 CD4+ T-세포/㎕ 혈액의 범위에서 가능하나, 100-500 범위에서 가장 정확하다. 500 세포/㎕ 이상의 계수는 부정확하다. 또한, 200 세포/㎕ 이하는 요법의 임상적 도입점으로 주장되는 실제로 중요한 수치이다(자원 부족 세팅시 WHO 치료법 참고). 최근의 가이드라인은 CD4를 매우 간단하게 계층화하며, 헤모글로빈(Hb)을 사용하여 한자들을 임상적으로 계층화한다.
2. 위양성(false positive)의 수(단구, 기타 세포들)는 10% 이하이다. 이는 단구가 많은, 예컨대, TB로 동시 감염된 경우 특히 중요하다. TB는 200/㎕의 CD4이하에서 에이즈 정의 질환으로 간주되며, 남아프리카의 경우 실제로, 대부분의 CD4 계수가 200-400 범위 이하이다.
3. $1000 또는 그 이하의 하드웨어 비용.
4. $1 또는 그 이하의 시험당 최대 비용(화학물질, 항체 등 포함). 일반 시약을 사용한 유세포 분석은 시험당 $1-2 이하의 비용이 든다.
5. 요구되는 실험 조작의 최소 양. 이는 자원 부족 세팅에 적용시 필수적인 점이다.
6. 세척 단계를 피하며 안전상 이유로 일회용품(큐벳 등)의 사용. 이는 일회용품 시스템만이 개발되어야 한다는 의미는 아니다. 매우 자원이 부족한 경우에 세팅시, 일회용품은 사용하기 어려울 수 있으며, 깨끗하게 할 수 있는 챔버가 더 나을 것이다. "모든" 일회용품 및 혈액이 일반 쓰레기통으로 버려지거나 하수구로 흘러가는 것을 방지하기 위해, 일회용품에 대한 간단한 멸균 시스템을 포함하는 것은 좋은 아이디어일 수 있다.
7. 전체 시스템은 견고하고 운반 가능하며, 낮은 전력 소비를 가지고(전지로 작동되며), 자동 데이타 기록이 가능해야 한다.
본 명세서에 서술된 발명은 상기 분류 기준과 부합한다. 본 발명은 CCD 카메라를 사용하여 시료를 이미지화 한다. 대상 검출 알고리즘은 포착된 이미지 상에서 수행되어 시료내 존재하는 목표 실체(entity)의 수를 계수한다.
선행 기술에는 여러 컴퓨터-보조 현미경들이 포함된다. 미국 특허 제5,018,209호는 이미지가 관찰되는 동안 사용자가 양성 사건을 수동으로 선택하는컴퓨터 유도 현미경을 소개한다. 명백하게, 이는 특히 원격 세팅에 있어, 효과적인 분석기로서의 충분히 높은 처리량을 갖지 못한다.
미국 특허 제5,287,272호에서, 자동화된 세포학 표본 분류 시스템 및 방법이 공개된다. 이 시스템은 형태에 기초한 세포 이미지를 처리하기 위해 복잡한 신경 네트워크에 의존한다. 대상을 그 이미지로 분류하는데 매우 효과적인 반면, 막대한 양의 계산 자원들을 요구한다. 더욱이, 인간의 입력 및 수반되는 분석이 여전히 요구된다. 다른 장치들, 예컨대, 미국 특허 제5,073,857호 및 제5,077,806호에 서술된 것들은 예측되는 역(threshold)을 사용함으로써, 이미지 분석을 위해 윈도우 서브-이미지 화소 계수 알고리즘을 사용한다.
선행 기술 상의 다른 세트의 장비들은 벤치 탑 분석기로 디자인된다. 미국 특허 제5,073,857호에서는, 팹 스미어(pap smear)가 컴퓨터로 조절되는 현미경, 및 이미지 분석을 유도하는 카메라 및 컴퓨터로 분석된다. 미국 특허 제6,221,607호에서, 생물학적 표본 내 인 시투 하이브리드화 사건 분석을 위한 자동화 현미경을 공개한다.
전술된 선행 기술에서 장치는 슬라이드를 이미지화하기 위해 디자인되었다. 그 어떤 것도 본 명세서에 서술된 바와 같이 생물학적 표본내 목표 집단을 검출 및 계산할 수 없었다. 더욱이, 그 어떤 것도 휴대 가능하거나 고 처리 장치가 아니었다. 이러한 장비들은 현미경 및 카메라를 조절하고, 이미지 분석 알고리즘을 수행하기 위해 데스크탑 컴퓨터에 의존하도록 디자인되어 있다. 본 발명은 선행 기술에 존재하던 많은 난점들을 극복하였다.
관련된 출원의 상호 참고
본 출원은 2002년 2월 14일자로 제출된 미국 가출원 제60/357,170호의 일부를 우선권 주장하여 출원한 비-가출원으로, 상기 미국 가출원은 본 명세서에 참고 문헌으로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 2차원 평면에 분포된 미세 입자를 계산하기 위한 간단하며 저비용인 전자 광학 장치, 방법 및 알고리즘에 관한 것이다. 본 신규한 계수 기술은 특히 저가의 세포 분석기로 혈액과 같은 복합 생물학적 표본에서 자기적으로 선택된 형광 세포를 계산하는데 적용 가능하다.
도 1: 광학 및 방사 배열의 개략적 대표도. (A)에서, LED 유래 빛은 컨덴서, 한 세트의 필터 및 10X 대물 렌즈를 통해 시료에 초점이 맞추어 진다. 세포의 형광 이미지는 투영되어, CCD 카메라에 포착된다. (B)에서, 2개 LED의 빛은 직접 시료상에 투영된다.
도 2: (A) x-및 z-방향인 챔버내 자기 구배. 구배의 x-성분은 무시 가능하다. (B) 자기적으로 표지된 백혈구는 챔버내에서 위로 이동하는 반면, 비표지된 적혈구는 아래로 이동한다.
도 3: 상이한 세포 속도 분포에 대해 시간 함수로서 표면상의 세포의 수. 곡선의 초기 기울기는 평균 세포 속도를 나타낸다: a. 일정한 평균 세포 속도 0.02 mm/s, 상이한 σ수치. b. 상이한 평균 세포 속도, 0.02 mm/s의 일정한 σ.
도 4: 전형적인 세포 이미지의 확대도 및 이들의 강도 프로파일. 이 이미지에 기초하여, 세포를 2차원 가우시안 스팟으로 모델화할 수 있음이 추정된다.
도 5: 카메라에서 획득된 3개의 세포 이미지의 역 수치 곡선. 계수된 세포의 수는 선택된 역 수치에 강하게 의존한다.
도 6: 표준화된 템플레이트 h(x,y)의 단면적. 템플레이트는 0의 평균을 가진다.
도 7: 필터 템플레이트 h(x,y｜C0(x,y)=0)의 단면적.
도 8: 필터 폭의 함수로서 무한 인테그랄의 사용 및 필터 템플레이트의 한정으로 인해 도입된 절단 오류(%). 이 오류는 더 큰 수치인 W/σ에 대해 무시 가능한데, 이는 가우시안 이하 면적이 (x,y)>W에 대해 상대적으로 작기 때문이다.
도 9: 시그날 f(x,y)의 필터 템플레이트 h(x,y)로의 회선 결과.
도 10: 필터의 가우시안 화이트 노이즈에 대한 영향. 필터는 노이즈를 현저하게 억제한다.
도 11: 필터링 전후의 전형적인 세포 이미지의 선 자취. 일정한 백그라운드수치는 억제되며, 세포는 증강된다. 이미지에서 음성 수치는 0으로 조절된다.
도 12: 3개의 전형적인 세포 이미지의 역 수치 곡선. (a) 필터링 전. 게수된 세포의 수는 선택된 역 수치에 강하게 의존한다. (b) 필터링 후. 필터는 역 곡선의 평탄역(plateau)을 연장하여, 모든 이미지의 예측되는 역 수치를 더 용이하게 얻도록 한다.
도 13: 상이한 필터링 단계에서 전형적인 세포 이미지의 선 자취. 라플라시안(Laplacian) 예비-필터는 이미지에서 세포를 증강하며, 매치된 필터는 노이즈를 억제한다.
도 14: 라플라시안 예비-필터 및 매치된 필터의 적용 후 역 수치 곡선. 필터의 영향은 더 긴 수평 평탄역이며, 이는 계수 알고리즘을 매우 견고하게 한다.
도 15: 완전한 계수 알고리즘의 블록 다이아그램.
도 16: 이미지-처리 알고리즘의 상이한 단계에서의 세포 이미지. (a) 원래 세포 이미지. (b) 라플라시안 예비 필터 후. (c) 매치된 필터 후. (d) 역 이후.
도 17: 광학 시스템의 개략적 대표도. 에폭시 렌즈에서 관찰되는 LED 칩 VV'는 lOx 대물 렌즈의 후방 초점면에 이미지화되어, 시료면의 평행 빔 방사를 초래한다.
도 18: BB' 크기에 대한 2개의 제한 상황. (a) BB'는 대물 렌즈의 입구 퍼필보다 더 크다(노트: 입사각은 작으며 빛은 입구 퍼필 밖에서 소실된다). (b) BB'는 매우 작아, 큰 빔 직경을 초래하며, 빛은 시료면 상에서 소실된다. BB'에 대한 광학 수치는 이러한 2개의 제한 조건 사이 어딘가에서 예측된다.
도 19: 기하학적 광선-자취 알고리즘의 가시화. 레드 광선은 방해된 광선이며, 그린 광선은 시료면의 시야 이내에 유지된다. 관통하는 광선의 상대적인 수는 방사 효율에 상응한다(스케일되지 않은 이미지).
도 20: 광선-자취 알고리즘의 데이타에 알맞는 표준화된 방사 효율의 실험 데이타. 실험 수치는 알고리즘에 의해 예측된 수치와 잘 일치한다.
도 21 : 카메라의 암 전류 노이즈의 평균 수치 및 표준 편차. 적분 시간이 길면 카메라는 포화된다.
도 22: LED의 출력 시그날을 조정하기 위해, 포토다이오드를 시료면에 두고 상이한 LED 추진 전류에 대해 복사 전력을 측정하였다. 알려진 LED 시그날에 대한 카메라 반응을 측정하기 위해, CCD 카메라를 시료면에 두고 평균 화소 강도를 측정하였다.
도 23: 어떤 시그날 대 노이즈 비로 나타낸 적분 시간 t 및 전력 밀도 M의 조합.
도 24: 3개의 "제로" 이미지를 포함하는 45개의 세포 이미지의 역 수치 곡선. 이러한 곡선에 기초하여, 100과 150 사이의 유효 역 수치 간격이 확인되었다.
도 25: 상이한 시그날 대 노이즈 비(SNR)를 갖는 모의 세포 이미지로, 이는 SNR 비의 계수 정확도에 대한 영향을 조사하는데 사용하였다. (a) SNR=3 (b) SNR=10 및 (c) SNR=20.
도 26: 2개의 모의 이미지의 역 수치 곡선. 이 곡선과 도 24의 실제 이미지에서 얻은 곡선간의 유사점을 주목해라.
도 27: 모의 이미지의 시그날 대 노이즈 비의 함수로 세포 계수의 오류 %. 실제 세포 이미지의 평균 시그날 대 노이즈 비(SNR=20)에서 , 데이타는 약 2%의 오류를 나타낸다.
도 28: 계수된 세포의 수 대 예측된 세포의 수. 이 시스템은 약 1500 세포/이미지까지는 직선이다(기울기=0.98, R2=0. 99). 세포 밀도가 높으면, 세포 계수는 이 시스템으로 낮게 측정된다. 작은 시료 크기로 인해 낮은 세포 밀도에서 오류가 증가한다.
도 29: 챔버 표면의 상이한 측면 위치에서의 세포의 수/이미지. 표면의 모서리에서 세포 밀도가 감소한다. 자석은 세포 계수가 가장 정확한 자석들 사이에 위치하도록 디자인된다.
도 30: 본 이미지화 시스템 및 시스멕스(Sysmex?)혈액 분석기 간의 절대 백혈구 계수의 상관 관계. 100 세포/㎕ 내지 16,000 세포/㎕의 범위의 세포 계수에서 0.97의 기울기, R2=0.95로 밝혀졌다.
도 31 : 본 발명의 이미지화 시스템 및 BD 트루카운트(Trucount?)시스템을 사용한 유세포 분석간의 CD4 계수의 상관 관계.
도 32: CD4-표지된 자기 입자로 분리된 세포내 RNA 함량 대 DNA 함량의 산포 플랏. 2개의 상이한 무리들은 CD4+ 림프구 및 단구를 나타낸다.
도 33: 전체 백혈구 계수에 대한 이미지에서 세포 계수의 시간 자취. 본 모델은 세포 전체 수 N0=1113에 대해 평균 세포 속도 v0=0.24 mm/s, 표준 편차σ=0.21 mm/s인 데이타에 적합하였다.
도 34: 균등 분포에 대한 단구 및 림프구의 N(t). N단구=N림프구=500, v단구=0.2 mm/s; v림프구=0.06 mm/s. (a) σ단구=림프구=0 (b) σ단구=0.02 mm/s; σ단구=0.06 mm/s.
도 35: 균등 분포에 대한 단구 및 림프구의 N(t)의 시뮬레이션 및 적합성. N단구=400, N림프구=600 v단구=0.07 mm/s, v림프구=0.2 mm/s. (a) σ단구=0.002 mm/s, σ림프구=0.006 (b) σ단구=0.02 mm/s, σ단구=0.06 mm/s.
도 36: 챔버의 바닥에서 개시된 모든 세포를 갖는 단구 및 림프구의 N(t) 및 DN(t)/dt. N단구=400, N림프구=600, v단구=0.07mm/s, v림프구=0.2 mm/s. (a) σ단구=0.002 mm/s, σ림프구=0.006 mm/s (b) σ단구=0.02 mm/s, σ단구=0.06 mm/s.
발명의 개요
본 발명(본 명세서에서는 본 발명의 프로젝트명인 "이지카운트(EasyCount)"로도 종종 언급됨)은 자기적으로 표지된 목표 세포 또는 입자의 검출 및 계산을 위한 소형 전자 광학 장비, 분석 방법, 이미지 획득, 및 데이타 정리 알고리즘에 대해 서술한다. 예로 전체 혈액을 사용시, 혈액 세포는 DNA 염색 염료와 같은 하나 이상의 목표 특이적 형광 염료를 사용하여 형광 표지된다. 혈액 시료 내 흥미로운 세포 또는 목표 세포는 페로자기 입자에 컨주게이트된 모노클로날 항체와 항온 처리하여 표지된다. 그 후, 시료를 적절한 광학 검출 챔버 또는 큐벳에 두고, 번갈아 자기적으로 표지된 세포를 챔버의 상부 관찰 표면으로 선택적으로 이동시키는 자기장 구배에 둔다. 목표 세포를 회수하고, 그 후 챔버의 광학 투명 표면상에 균일하게 고정한다. 이 표면의 단편 및 그 위에 표지된 목표 세포를 하나 이상의 LED(발광 다이오드)로 방사한다. 그 후, 개별적 목표 세포에 의해 방출된 빛은 CCD(전하 결합 소자)에 의해 포착된다. 본 명세서에 공개된 바와 같은 본 시스템에 대해 특이적으로 고안된, 신규한 이미지 획득 방법, 처리 방법, 및 알고리즘은 포착된 발광 세포의 수를 계수하는데 사용된다. 그 후, 데이타 출력은 챔버내 시료, 및 궁극적으로 원래 표본 mL당 목표 세포를 나타낸다.
본 발명의 한 구체예는 전체 혈액 시료의 면역 자기적으로 표지된 세포를 정의된 높이의 시료 챔버의 상부 유리 관찰 표면을 향해 자기 조작하는 것이다. 본 시스템은 정의된 면적의 관찰 표면에 존재하는 세포의 수를 계수한다. 챔버의 높이 및 관찰 부위의 면적을 알고 있으므로, 추출된 세포의 부피를 결정할 수 있으며, 관찰 표면에 존재하는 세포의 수는 시료 내 세포의 절대 수로 직접 전환될 수 있다.
간단히, 분석 방법 구체예들 중 하나는 아래와 같이 수행될 수 있다: 특이적 유형의 세포가 존재하는지 및 얼마나 많은지를 조사하기 위한 시료를 획득한다. 시료 내 모든 세포 또는 핵산을 함유하는 모든 세포를 표지하는 형광 프로브를 시료에 첨가한다. 시료에서 이 세포 유형을 다른 세포들과 구별하는 바이오체(bioentity)로 표지된 면역자기 입자를 시료에 첨가한다. 세포 표지는 분석용 큐벳 또는 챔버 내에서 일어나거나, 세포 표지가 일어날 만큼의 충분한 시간이 경과한 후에 이러한 큐벳 또는 챔버로 옮겨진다. 큐벳 또는 챔버를 자기적으로 표지된 모든 세포들이 상부 관찰 표면으로 이동하도록 디자인된 2개의 쒜기 형태 자석 사이에 둔다. 형광 표지는 LED에 의해 여기되도록 선택되며, 전망 표면에서 세포에 의해 방출된 형광은 개별적 세포들이 CCD 카메라에 의해 포착된 이미지로 확인되기 충분하다. 알고리즘은 이미지를 확인하고 각각의 대상 또는 세포를 계산하는데 적용된다. 알고리즘은 CCD 카메라에 내장된 프로세서로 프로그램되는 것이 바람직하다. 최종적으로, 시료 mL당 세포 계수가 LCD 상에 표시된다.
세포는 백그라운드와 이들의 형광 강도 차이에 기초하여 계수된다. 여기 광원으로서 형광 표지의 흡수 스펙트럼과 매치되는 470nm의 최대 방출을 갖는 LED가 사용된다. 방출된 형광은 CCD 카메라에 이미지화된다. 시스템 내에 코드화된 반복적이고 힘든 이미지 분석은 존재하는 세포 수, 및 이후 단위 부피당 세포의 수를결정한다. 이미지 획득 및 데이타 정리를 위한 알고리즘의 개발은 상당히 수고스러운 실험 및 최적화를 요구한다. 본 명세서에 서술된 바와 같이 뛰어난 수행 특징, 그 중에서도 특히 예상외의 높은 S/N을 보이는 본 발명의 구성이 그 결과이다.
본 발명의 특히 유리한 한 양태는 세포 생물학에서의 탐구 도구 및 다양한 세포, 진균 및 바이러스 병리학(HIV 및 암을 포함하나, 이로 제한되지는 않음)의 진단에 있어서의 임상 도구 양자 모두에 유용하다. 더욱이, 본 발명에 의해 제공되는 이점들에는 디자인의 기능적 단순함, 견고함, 소형, AC 또는 DC 전력 옵션, 및 견줄만한 수행 특징을 갖는 종래의 시판 장치와 비교시 실질상 낮은 구매 비용 및 작동 비용이 있다. 본 발명 장치의 특징 및 개선은 소형 임상 세포 세포 분석기의 경우를 예로 들면, 특히 구식 실험실 또는 자원이 부족한 국가에서 널리 퍼진 현지 조건하에서 작동하기 유용하게 하는 것이다.
본 발명에 따른 이러한 발견은 단지 본 기술 분야의 당업자에 의해 계획될 수 있는 장치, 방법 및 알고리즘의 많은 추가적인 잠재적 응용의 예시일 뿐이므로, 이것이 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것은 아니라는 것을 이해 및 인식해야 한다. 따라서, 본 발명의 다른 대상 및 이점은 부가된 청구항과 함께 이하 상세한 설명으로부터 본 기술 분야의 당업자에게 명백할 것이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 명세서에 사용된 생물학적, 임상적, 전자적, 수학적 및 통계적 표현에 관한 기술적 용어는 종래의 통념적 정의와 부합된다.
용어 "시료" 또는 "표본"은 본 명세서에서 혼용해서 사용되며, 조직, 척수액, 골수, 혈액 또는 기타 출처에서 얻은 생물학적 재료를 나타낸다. 시료에는 또한 바이러스, 박테리아, 또는 기타 병원체들도 포함될 수 있다. 전형적인 생물학적 표본의 예는 피험체에서 얻은 혈액일 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는 분리되거나 집합적으로 확인 가능한 동물 또는 식물 세포, 세포성 박테리아, 진균을 나타낸다. 예컨대, 세포는 인간 적혈구(RBC) 및 백혈구(WBC) 집단, 암, 또는 기타 비정상 세포들일 수 있다. 용어 "목표" 또는 "목표 집단"은 본 명세서에서 분석하고자 하는 생물학적 표본내에 존재할지도 모르는 흥미로운 생물학적 실체를 나타낸다. 목표 집단의 구성원의 정형적인 예는 혈액 시료내 CD4 양성 세포일 수 있다. 역으로, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "비목표" 또는 "비목표 집단"은 분석의 피험체가 아닌 생물학적 표본내 존재하는 실체를 나타낸다.
시스템 디자인
장치의 상이한 성분들(본 명세서에서는 본 발명의 프로젝트명인 "이지카운트(EasyCount)"로도 종종 언급됨)을 도 1에 나타내었다. 장치의 이미지화 부분은 에피-방사 형광 현미경에 기초한다. 시료 챔버의 표면은 중앙 파장 470nm의 발광 다이오드로 방사된다(NSPB500S, Nichia Corp., 일본). 챔버 내부 표면의 형광 표지된 세포에서 방출된 빛은 대물 렌즈에 의해 회수되어, CCD 카메라 상에 초점이 맞추어진다(EDC2000-N, Electrim Corp, 뉴저지주 프린스톤). 이는 0.55 mm2의 시료면적에 대응되는 652x494 화소의 이미지로 나타나며, 세포는 암 백그라운드에 명 스팟으로 나타난다.
면역자기 표지
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "특이적 결합쌍"은 다른 분자나 실체를 실질상 배제하고 서로와 결합 친화도를 갖는 분자를 나타낸다. 특이적 결합쌍의 예에는 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용제-길항제, 렉틴-탄수화물, 핵산(RNA 또는 DNA) 하이브리드화 서열, Fc 수용체 또는 마우스 IgG-단백질 A, 아비딘-바이오틴, 스트렙타비딘-바이오틴 및 바이러스-수용체 상호작용이 포함된다. 구 "실질상 배제하는"은 바이오특이적 리간드 또는 바이오특이적 시약과 이의 대응되는 목표 결정자간의 결합 반응의 특이성을 나타낸다. 바이오특이적 리간드 및 시약은 목표 결정자에 대해서는 상대적으로 높은 친화도를 갖는 특이적 결합력을 가지나, 다른 시료 성분들에 대해서는 실질상 낮은 친화도를 갖는 비특이적 결합의 낮은 수치를 나타낼 수 있다.
전술한 목표 바이오체에 대해 언급시 사용되는 용어 "결정자"는 종종 이질친화성 면역 반응을 유도하는 고분자 항원에 존재하는 화학적 모자이크를 폭넓게 나타낸다. 그러므로, 결정자는 "바이오특이적 리간드" 또는 "바이오특이적 시약"에 특이적으로 결합될 수 있으며, 선택적 반응이 일어나는데 요구되는 존재인 특이적 결합 물질(예컨대, 리간드 또는 시약)에 선택적 결합하는데 포함되고 책임이 있는 목표 바이오체의 일부분을 나타낸다. 기본적인 용어에서, 결정자는 특이적 결합쌍 반응에서 결합 친화도를 갖는 약제, 리간드 및/또는 시약에 의해 인식되는 목표 바이오체 상의 분자 접촉 부위이다.
용어 "검출가능한 표지"는 본 물질의 검출 또는 측정이, 직접 또는 간접적으로, 물리적 또는 화학적 수단에 의해, 시험 시료내 목표 바이오체의 존재를 지시해주는 물질을 나타내는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 유용한 검출가능한 표지의 대표적인 예에는 이하의 것들이 포함되나, 이로 제한되지는 않는다: 흡광도, 형광도, 반사도, 광확산, 인광성, 또는 발광성에 기초하여 직접 또는 간접적으로 검출가능한 분자 또는 이온; 이들의 방사성 성질에 의해 검출 가능한 분자 또는 이온; 이들의 핵자기 공명 또는 상자성 성질에 의해 검출 가능한 분자 또는 이온. 흡광도 또는 형광도에 기초하여 간접적으로 검출가능한 분자들의 군 중에는 예컨대, 적절한 기질을 예컨대, 비-광흡수 분자에서 광흡수 분자로, 또는 비형광성 분자에서 형광 분자로 전환시키는 다양한 효소들이 포함된다.
용어 "자기적으로 반응하는" 및 "자기적으로 표지된"은 본 명세서에서 혼용해서 사용되며, 이들에 결합하는 자기 입자를 갖는 실체를 나타낸다. 예컨대, 이러한 자기 표지는 생물학적 표본내에 존재하는 세표의 표면에 결합하거나, 세포내 실체에 결합할 수 있다. 본 명세서에 서술된 구체예들 대부분에서, 자기 입자들은 소정의 목표 집단의 구성원에 특이적으로 결합하고, 비목표 실체를 실질상 배제한다. 용어 "자기 조작"은 자기적으로 표지된 실체를 비자기적으로 표지된 실체에서 분리하기 위해 생물학적 표본을 자기장 구배에 두는 것을 나타낸다. 자기 조작은 또한 전자기와 같이 자기장 구배가 생물학적 표본 주위에 생성될 때 발생할 수도 있다.
예컨대, 전체 혈액 시료로부터 흥미로운 목표 세포를 선택 및 분리하기 위해, 이들을 미국 특허 제5,579,531호 및 제5,698,271호 및 미국 출원 제10/208,939호(각각은 본 명세서에 참고 문헌으로 편입됨)에 개시된 바와 같이 자기 입자, 페로유체 또는 초상자성 입자에 컨주게이트된 목표 특이적 항체로 면역자기적으로 표지한다. 자기 입자는 전형적으로 약 180 nm의 직경이며, 스트렙타비딘이 컨주게이트된 제1 중합층에 의해 둘러싸인 자기 산화철 코어로 구성된다. 목표-특이적 항체는 이후 바이오틴화된 항체에 의해 스트렙타비딘에 결합될 수 있다. 그러나, 다른 페로자기 물질, 예컨대, 니켈(유사한 또는 더 큰 약 5 ㎛까지의 크기)로 제조된 초상자성 입자는 유사하게 코팅되어, 목표 세포의 자기 표지에 사용될 수 있다.
최종적으로, 목표 세포 상의 글리코시딕 수용체를 인식하는 렉틴 및 붕소 유도체와 같은 선택적 결합제 또한 이러한 자기 포착 입자상에 항체 대신 또는 이에 추가적으로 사용될 수 있다.
예컨대, 흥미로운 세포가 전체 백혈구 집단이라면, 혈액 시료내 모든 백혈구 집단에 실질상 특이적으로 결합하는 총백혈구 CD45 모노클로날 항체를 사용할 수 있다. 세포 표지 반응은 시험 튜브 또는 바이알에서 수행될 수 있으며, 엘리큇은 시료 챔버로 이동될 수 있다. 선택적으로, 챔버 자체가 약 200 ㎕까지의 표본 부피를 항온 처리하는데 사용될 수 있다. 비결합한 비자기 물질은 자기 분리 후 상징액으로부터 쉽게 제거된다. 목표 세포에 대한 자기 표지 효율을 증진하기 위해, 자기 항온 처리 또는 장내 항온 처리가 사용될 수 있다(PCT/USOO/02034, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 편입됨). 이를 수행하기 위해, 시료를 시험 튜브에서 자기 페로유체와 혼합하고, 이를 단순히 4극자 고구배 자기 분리기(HGMS) 자석 내에 두고(미국 특허 제5,186,827호; 제5,466,574호; 제5,641,072호, 본 명세서에 참고 문헌으로 편입됨), 이후 자석을 제거하고 보르텍스로 재혼합한다. 이 단계를 두번이상 반복한다. 4극자 자석은 항온 처리 동안 방사 자기 구배로 전달되므로, 자기 입자가 벽 표면에 축적되기 이전에 시료를 쓸어내는 구슬 체인으로 측면으로 이동하도록 자기 입자에 힘이 가해진다. 이 다중 힘에 의한 자기 입자의 이동은 시료내 자기 입자 및 목표 세포의 단순한 확산이나 브라운 충돌에 비교하여, 자기 입자들이 더 큰, 실제로 움직일 수 없는 세포들과 충돌하거나 만날 수 있는 가능성을 증가시킨다.
시료 챔버 및 자석 용기
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "관찰 표면"은 시료 챔버의 광학 투명 벽을 나타낸다. 생물학적 표본을 시각적으로 분석시, 목표 집단을 관찰 표면에 인접시킬 필요가 있다. 이는 정확한 분석을 제공하기 위해 목표 집단에 명확히 초점을 맞추는 광학 배열로 가능해 진다. 목표 집단의 구성원이 자기적으로 표지되면, 이들은 시각적 분석을 위해 전망 표면으로 조작될 수 있다.
챔버 및 자기 이음쇠 용기는 이미 서술되었다(5,985,153; 6,136,182; PCT/US02/04124, 각각은 본 명세서에 참고 문헌으로 편입됨). 챔버는 내부 용적 30x2.7x4 mm(각각, 길이x폭x높이)의 주형체로 구성된다. 이는 필요에 따라 제거가능한 플러그 캡으로 밀폐가능한 파이렉스 유리(7740 Pyrex?; 코닝 인터내셔날사, 독일)의 광학 투명 평면 상부 표면을 가진다. 수직 광선으로 프로빙하기 위해 수평면으로 향해 놓여진 시료 챔버를 도 2에 나타낸다. 그러나, 선택적인 장비 디자인은 뚜껑이 없는 검출 챔버 또는 기타 적절한 시료 큐벳을 수직 방향의 자기 용기 및 수평 방향의 광선으로 설비한 것일 것이다.
자기 챔버 용기 또는 이음쇠는 챔버가 2개의 자기 극 피이스의 상부 2 mm 아래에 위치하도록 디자인된다. 극 피이스는 13,700 가우스의 내부 자기화를 갖는 네오디뮴 철 붕소 합금으로 만들어진다(Crumax Magnetics Inc, Elizabethtown, KT). 2개의 피이스는 z-축에 대해 70°각도가 되도록 이들의 면간에 3 mm 간격을 형성하도록 설치된다. 도 2A 및 B에 묘사된 이 배열은 z-방향을 가리키는 챔버내 자기 구배를 형성하며, x-방향에 무시 가능한 성분을 가진다. 따라서, 면역자기적으로-표지된 세포 및 비결합된 페로유체 입자는 상부 표면에 대해 수직 방향으로 이동한다. 이미지화된 표면 면적은 이미지화된 면적 아래의 부피 부분에 직접 대응된다(도 2B). 단위 부피당 대표적이고 정확한 세포의 수를 얻기 위해, 세포를 전망 표면에 걸쳐 균일하게 분포하여 고정하는 것이 중요하며, 또한 유리 표면 전체 면적에 걸쳐 균일한 자기장이 요구된다.
전술된 자기 배열에 대한 추가 개선은 "스프링 로드" 이음쇠 어셈블리이다. 이는 각 시료 카트리지를 반복가능한 위치로 위치시킨다. 이 때문에, 분석되는 표본들은 이미지화시 항상 Z-축에 초점이 있다. 각각의 시료 카트리지에 대해 독립적인 초점 조정이 더이상 필요하지 않기 때문에, 이는 본 발명의 장치를 빠른 분석기로 사용하는데 있어 매우 중요하다. 시료 카트리지가 정확히 조작시, 이음쇠 어셈블리는 모든 시료가 항상 초점에 있도록 위치시킬 수 있다.
챔버내 세포 역학
시료 내 모든 세포가 자기적으로 회수되는 것이 결정적이므로, 세포들이 회수 표면에 도착하는데 필요한 시간을 아는 것이 중요하다. 자기장에 놓여진 면역자기적으로-표지된 세포의 이동은 세포에 미치는 전체 힘, F에 의존한다. 이 힘은 방정식(1)로 주어진다:
(1)
전체 힘은 자기력, 중력 및 점성 항력의 결과이다. 상기 식에서, ｜m｜은 세포의 자기 모멘트도이고, B는 자기 유도이다. M'는 세포의 질량에서 세포가 현탁된 등가 부피 혈청의 질량을 뺀 질량이며, g는 중력 가속도이다. 항력은 스토크 법칙으로 추정되며, 이 때 η은 배지의 점도이고, R은 세포 반경이며, v는 세포의 속도이다. 상응하는 세포의 y-방향 이동 방정식은 방정식(2)로 표현된다:
(2)
이 이차 미분 방정식은 (3)에 나타낸 바와 같이 초기 위치 y(0)=0 및 초기 속도 v(0)=0을 갖는 세포에 대해 풀 수 있다:
(3)
세포의 질량 및 반경, 및 배지의 속도는 주어진 수치이다. 세포의 자기 모멘트는 세포막에 존재하는 자기 입자의 수에 의존하며, 따라서, 자기 표지에 사용된 항체 유형에도 의존한다. 세포의 자기 모멘트의 계산을 위해, 세포 당 100개의 자기 입자로 가정하였다. 자기 유도는 자기 극의 물질 및 기하학으로 결정된다. 자기적으로 표지된 세포에 작용하는 힘 및 이들의 자기장내 이동의 계산에 사용된변수들은 4 ㎛의 세포 반경, R; 77 kg/m3의 상대적 세포 밀도, M'; 9.32x 10-14Am2의 자기 모멘트, m; 1.8x 10-3Pa의 혈장의 점도, η; 및 챔버 바닥 250 가우스/mm 내지 챔버 상부 400 가우스/mm 범위의 자기 구배, ▽B이다. 방정식 (3)으로부터, 세포가 수초 이내에 최종 속도에 도달함이 계산될 수 있다. 따라서, 챔버내 세포의 속도, vi는 본질적으로 일정하다. 명백하게, 세포의 속도는 세포 표면에 존재하는 자기 입자의 수에 의존한다. 모든 세포가 이들의 표면상에 동일한 에피토프 밀도나 항원 수를 가지는 것은 아니기 때문에, 세포의 자기 입자의 수 (및 이에 따른 속도) 분포가 존재할 것이다. 챔버내 세포의 특정 하부집단의 속도는 평균 속도, v0, 및 표준 편차, σ의 정규 분포로 표현될 수 있다. 초기 위치 y0,i및 속도, vi를 갖는 시료내 특정 세포에 대해, 시간 t에서의 챔버내 위치는 (4)로 표시된다:
(4)
세포가 챔버 표면에 도달할 확률은 시간과 세포 속도의 함수이다. 후자는 정규 분포 (5)로 결정되는 추계학 변수이다:
(5)
특정 시간 t에서, 세포 i가 표면에 도달할 확률은 (6)으로 주어진다:
(6)
상기 식에서, y표면은 챔버의 높이이다.
시료가 챔버내 삽입 후 바로 자기장에 노출되므로, 시료내 세포의 분포는 균일하다고 가정할 수 있다. 큰 집단의 세포들인 경우, 표면상에 기대되는 세포의 수(N)는 (7)로 주어진 챔버내 모든 세포에 대한 개별 확률 Pi의 적분으로 밝혀질 수 있다:
(7)
상기 식에서, N0는 시료내 존재하는 세포의 전체 수이다.
표면에 존재하는 기대되는 세포의 수는 주어진 세포 집단(N0= 500)에 대한 시간의 함수로 도 3에 플랏하였으며, 이 때 상이한 곡선은 상이한 속도 분포를 나타낸다. 도 3a에서, 평균 세포 속도 v0는 일정하나, 상이한 수치의 σ가 사용된다. 도 3b에서, σ는 일정하게 유지되며, 상이한 평균 세포 속도가 사용된다. 곡선의 초기 기울기가 챔버내 평균 세포 속도에 대응됨이 관찰되며, 실제로 방정식 (8)은 방정식 (7)을 푼 결과이다:
(8)
다른 시료 챔버 디자인도 계획된다. 예컨대, 더 얕은 카트리지는 분리 시간을 더 단축시킬 수 있으며, 분석시 목표 실체에 대해 더욱 특이적이다. 저수치의 항원 발현을 통해 또는 자기 입자의 비특이적 결합을 통해 가능한, 자기적으로 표지된 비목표 실체가 관찰되었다. 그러나, 이러한 자기적으로 표지된 비목표 실체는 특이적으로 표지되는 목표 실체보다 훨씬 덜 자기적으로 반응한다. 만약 시료 챔버의 크기가 상이하다면, 이러한 더 약한 자기 실체는 시료 챔버의 관찰 표면으로 이동하지 않을 것이며, "위양성" 계수에 기여하지 않을 것이다.
시료 투명도
기포가 시료 챔버의 관찰 또는 이미지 포착 면적으로 도입되는 것을 막기 위해, 자석/챔버 어셈블리를 수평면과 약 8°각도로 두었다. 그 후, 세포 계수에 대한 영향을 약 0, 10, 20 및 90도의 각도에서 측정하였다. 다양한 경사 각도에서 뚜렷한 차이점들이 관찰되지 않았다.
이미지화 시스템
백혈구의 형광 염색
유핵 세포를 검출 가능하게 하기 위해, 시료를 세포질내 여러 구성 성분들은 물론 살아있는 세포의 핵을 염색하는 생체 염료인 아크리딘 오렌지(AO; Molecular Probes, Inc., 오리건주, 유진)로 염색하였다. 아크리딘 오렌지는 DNA에 결합시 490 nm에서 흡수 피크, 및 520 nm에서 방출 피크를 가진다. 훼이스트(Hoechst) 33258 및 훼이스트 33342와 같은 기타 형광 염료도 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포, 세포질, 세포내 핵 물질 또는 핵 그 자체를 비특이적으로 염색하는 어떠한 형광 염료도 사용될 수 있다. 이러한 염료를 본 명세서에서는 "비특이적 형광 염료"로 언급한다.
일반적으로, 형광 현미경내 방사는 아크 또는 석영-할로겐 램프로 이루어진다. 일부 현미경 시스템에서, 매우 값비싼 레이저가 방사에 사용된다. 그러나, 최근 반도체 기술의 진보는 백열 광원 및 레이저와 경쟁할 만한 저전력, 고선명 발광 다이오드의 개발을 초래했다. LED를 광원으로 사용시의 이점은 이들이 상대적으로 소형이고 값싸며, 긴 수명을 가지고, 쉽게 대체된다는 것이다. LED의 스펙트럼 전력 분포는 기재 물질에 따라 약 20 내지 50 nm의 반-밴드폭으로 상당히 좁다. LED는 고도로 포화된, 거의 단색광을 생산하며, 이는 소형이고 값싼 본 발명의 세포 분석기 장치를 구성하는데 이상적이다.
광학
LED 유래 빛은 27 mm의 초점 거리를 갖는 컨덴서 렌즈에 의해 회수되고, 455DF70 밴드-통과 필터(Omega Optical Inc., Brattleboro, VT)를 통과하고, 515DRLP 이색성 거울(Omega Optical)에 의해 반사되어, lOx, 0.25 NA 대물 렌즈의 후방 초점면에 초점이 맺힌다(Nikon Corporation, 일본). 이 광학 구성은 시료면적의 균등 방사를 초래한다. 550DF30 밴드-통과 필터(Omega Optical)에 의해 여과되고, CCD 카메라(EDC2000-N, Electrim Corp, 뉴저지, 프린스톤)로 초점이 맞추어진 후, 챔버의 유리 표면 아래면에 회수된 형광 세포에서 방출된 빛은 대물 렌즈에 의해 회수된다. 도 1A는 종래의 에피-방사 방식을 나타낸다. 도 1B는 충분한 여기 에너지를 제공하는 "투광조명" 배열에서 하나 이상의 LED로 전망 표면의 직접 측면 방사를 나타내며, 이는 더욱 간단하고, 덜 비싼 방사 방식일 수 있다.
카메라
이 셋업에 사용된 CCD(EDC2000-N, Electrim Corp, 뉴저지, 프린스톤)는 0-30,000 전자의 역학 범위를 가진다. 제조자에 의해 제공된 리드아웃 노이즈의 제곱 평균(r.m.s.)은 20 전자이다. 암 전류 노이즈 및 증폭기 노이즈에 관계된 데이타는 제공되지 않았다. 이미지는 소프트웨어에 의해 카메라에서 검색하고, 컴퓨터 메모리에 8-비트 TIF 이미지로 저장된다.
이미지 처리 및 분석
알고리즘은 광학 시스템에서 얻어진 이미지에서 세포를 계수하기 위해 개발되었다. 먼저, 모델은 세포 이미지를 묘사하기 위해 존재한다. 그 후, 이미지내 스팟 검출 방법이 도입된다. 초기에 이러한 알고리즘은 데스크탑 컴퓨터에서 수행되었다. 본 발명의 개선된 구체예는 CCD 카메라에 내장된 프로세서를 사용하여, 이미지를 분석한다.
이미지 모델
본 시스템에서, 형광 표지된 세포는 대상면의 무작위적 위치에 위치한다. 이러한 세포들은 이미지면에서 약 20-50 화소를 커버하는 스팟으로서 이미지화된다. 도 4A 세포에 존재하는 이미지에서 세포 이미지의 시료는 폭, σp를 갖는 2차원 가우시안으로 모델화될 수 있다(방정식 (9)):
(9)
백그라운드 및 노이즈 시그날을 포함하는 무작위적으로 분포된 세포들의 전체 이미지 f(x,y)는 이하 모델로 서술된다:
(10)
상기 식에서, Ci는 세포의 피크 강도이다. C0는 세포에 첨가되는 느리게 변화하는 백그라운드 수치를 나타낸다. 이 백그라운드 시그날은 시료내 유리된, 비결합된 염료에 의해 초래되며, 비균등 방사의 결과로 천천히 변동할 수 있다. 추계학 화이트 노이즈 성분은 성분 n으로 모델화된다. 노이즈원에는 CCD 카메라 유래의 열 및 리드아웃 노이즈가 포함된다. 이 모델에 기초하여, 이미지내 세포 i의 시그날 대 노이즈 비(SNR)를 정의할 수 있다:
(11)
상기 식에서, σn은 노이즈 성분 n의 표준 편차이다.
이미지 모델은 존재하는 세포 이미지를 분석하여 예측될 수 있는 변수들을 함유한다. 이 목적을 위해, 장비에 의해 얻어진 전형적인 이미지를 나타내는 10개의 이미지가 분석되었다. 표 1에서, 10개의 시험 이미지에 대한 이미지 변수들을 나타내었다. 이미지들은 상이한 피크 강도를 갖는 세포들을 함유한다. 평균 SNR은 이미지내 평균 피크 강도를 갖는 세포의 시그날 대 노이즈 비이다.
10개의 전형적인 세포 이미지들의 이미지 변수들
이미지 세포 수 평균 Ci 평균 C0 평균 σn 평균 SNR
1 800 99 51 2.5 19.2
2 932 114 53 3.5 17.4
3 631 131 60 3 23.7
4 470 127 59 3.4 20.0
5 737 130 48 2.7 30.4
6 261 129 56 3.8 19.2
7 320 99 43 2.8 20.0
8 611 109 49 2.5 24.0
9 396 104 46 2.8 20.7
10 426 110 47 2.5 25.2
평균 558 115 51 3 22
스팟 검출
표 1에서 나타낸 바와 같이, 이미지의 시그날 대 노이즈 비(약 22)는 놀랍게도 크며, 전체 전망 면적을 통해 거의 일정하다. 이는 세포 계수가 고도로 특이적임을 제시한다. 최적화된 방법은 세포는 수치 1(화이트)을 얻고, 백그라운드 및 노이즈는 수치 0(블랙)을 얻는 이원 이미지를 생성하도록 하는 역의 적용으로 구성되며, 이미지내 "화이트" 스팟이 계수된다. 명백하게, 세포를 계수하는 가장 쉬운 방법은 모든 이미지에 대해 일정한 미리 조절된 역 수치를 이용하는 것이다. 그러나, 실제로 이 방법은 선택된 역 수치에 매우 의존적임이 밝혀졌다. 이는 역 수치 곡선으로 정의된 곡선을 포함하는 도 5에 가시화 되어있다. 이 곡선은 적용된 역 수치에 대해 플랏된 세포 이미지내 계수된 대상의 수를 나타낸다. 전형적인 세포 이미지의 역 수치 곡선을 3개 나타낸다.
도 5의 곡선은 계수된 대상의 초기 증가를 나타내며, 이 때 역 수치는 이미지의 노이즈 수치와 동일한 범위이다. 이는 많은 노이즈 화소가 1로 할당되기 때문이다. 역 수치를 추가 증가시킴으로써, 평탄역 이후 최대값에 도달한다. 이 평탄역에서, 노이즈는 역 이하이고. 모든 세포는 역 이상이다. 따라서, 이 평탄역은 실제 세포의 수에 대응된다. 그러나, 평탄역이 상대적으로 평평한 것은 단지 제한된 역 수치 범위에서 만이다. 이는 이하 사항들의 결과이다:
1. 세포의 강도 분포. 흐릿한 형광 세포는 노이즈 수치 바라 이상인 반면, 더 밝은 세포들은 큰 시그날 대 노이즈 비를 가지며, 증가하는 역 수치에서 점차적으로 감소하는 계수된 세포의 수를 초래한다.
2. CCD 카메라내 밝은(깨진) 화소와 같은 비전형적인 인위 산물의 존재.
역 수치가 이미지의 최대 화소 강도인 255까지 증가함에 따라, 곡선은 점차적으로 0까지 감소한다. 도 5는 미리 조절된 수치가 정확한 세포 계수를 나타내는 경우 단지 좁은 범위만이 이용가능하다는 것을 보여준다. 더욱이, 백그라운드 강도의 변화는 곡선을 수평으로 쉬프트하므로, 세포 계수를 선택된 역 수치에 매우 의존하게 한다. 따라서, 계수를 더욱 견고하고 선택된 역 수치에 덜 의존적으로 하는 것이 바람직한 방법이다. 그러므로, 도 5의 세포의 실제 수에 대응되는 평탄역을 연장하는 방법을 개발하는 것이 필요하며, 선택된 접근법은 역 이전에 이미지를 증강하는 매취된 필터 알고리즘을 사용한다. 이 알고리즘은 세포 계수 프로세스를 개선하기 위해 비선형 라플라시안 예비 필터링 단계로 확장된다. 또한, 이하 이미지 분석 방법이 세포들이 무리로 가깝게 있을 때, 개별 세포를 성공적으로 구별하리라는 것을 예측하지 못했었다.
매치된 필터 알고리즘
매치된 필터 알고리즘은 관찰된 이미지 f(x,y) 및 적절히 선택된 템플레이트 h(x,y) 사이의 상관 관계를 계산한다. 상관관계는 템플레이트와 이미지간의 유사성의 측정이다. 이미지 f(x,y)와 h(x,y)간의 상관관계는 2개의 함수를 콘볼빙하여 계산된다:
(12)
상관관계는 세포의 위치가 이하와 같을 때 최대화된다:
(13)
세포의 훌륭한 검출은 실제 세포가 소실될 확률이 낮으며, 실제 세포가 아닌 이미지 점이 계수될 확률이 낮은 것을 의미한다. 이는 시그날 대 노이즈 비(SNR)로 수학적으로 표현된다. 양쪽 확률 모두 SNR의 함수를 단조롭게 감소시킨다. 따라서 훌륭한 검출은 SNR의 최대화를 요구한다.
모멘트 백그라운드를 무시하는 경우, 이미지내 스팟 i의 SNR은 세포 피크 강도의 지수 및 노이즈의 표준 편차로 정의된다:
(14)
이미지를 템플레이트 h(x,y)로 콘볼빙하는 것은 SNR을 이하와 같이 변화시킬 것이다:
(15)
SNR이 h(x,y)=p(-x,-y)일 때 최대화됨을 스와쯔 부등식을 사용하여 나타낼 수 있다. 이는 최적 템플레이트가 간단히 세포의 거울 이미지임을 의미한다. 이는 본 방법이 일반적으로 매치된 필터링 또는 템플레이트 매칭을 나타내며 이로 정의되는 이유이다. 본 모델의 경우, 백그라운드 시그날, C0(x,y)이 없는 경우, h(x,y)는 대칭적이고, 따라서 p(x,y)와 같다:
(16)
상기 식에서, 가우시안 이하의 부피는 통일되도록 표준화된다. 템플레이트의 단면적을 도 6에 나타낸다. 느리게 변화하는 백그라운드 수치 C0(x,y)의 영향을 제거하기 위해, DC 제거가 요구된다. 이는 템플레이트 h(x,y)가 0 평균 수치를 갖도록 표준화하여 얻어질 수 있다(도 7 참고).
(17)
상기 식에서, Eh는 h(x,y｜C0(x,y)=0)의 평균 수치이다. 일정한 시그날은 필터링 후 0 수치를 나타내는데, 이는 일정한 수치로 h(x,y)를 콘볼빙하여 쉽게 나타낼 수 있다.
C0(x,y)가 비균등 방사의 결과이므로, DC 제거는 또한 방사 프로파일을 결정하고, 이를 이미지 f(x,y)에서 공제하여 수행될 수 있다. 그러나, DC 제거가 공간 필터링에 의해 동시에 성취될 수 있다는 사실은 이를 바람직한 방법으로 만들 것이다. C0(x,y)는 백그라운드의 공간 빈도가 충분히 낮은 한 제거될 것이며, 이는 C0(x,y)를 템플레이트의 면적 이내에서 거의 일정하게 한다.
템플레이트가 유한하므로, h 및 f의 적분은 -W에서 W까지 하였다. 이하 계산에서, 무한 인테그랄은 (유한) 매치된 필터의 효과를 어림잡는데 사용될 것이다. 이는 절단 오류를 도입한다. 그러나, 이후 보여질 경우에서처럼, W > 2σp이라면, ｜x｜> W일때 가우시안 아래 면적이 상대적으로 작기 때문에 오류는 무시 가능할 것이다. 유한 템플레이트를 사용하는 동안 무한 인테그랄을 계산하여 만들어진 오류를 도 8에 나타낸다.
매치된 필터 h(x,y)를 이미지 f(x,y)상에 적용하는 것은 필터된 이미지 g(x,y)를 초래한다:
(18)
세포 i의 중앙 위치에서의 g(x,y)의 시그날 부분은 f 및 h의 점 산물로 기록될 수 있다:
(19)
W > 2σp인 경우 Eh~1/4W2임을 알고, 필터링 후이 세포 i의 피크 수치를 예측할 수 있다:
(20)
도 9에서, 회선 결과를 나타낸다. 이 경우에, σp=2, W=4.5이다. g의 최대 수치는 모델에서 예측되는 바와 같이 f의 최대값의 거의 0.34배이다. 음성 면 로브(lobe)는 필터 템플레이트의 음성 부분의 결과처럼 보인다. f의 일정한 백그라운드는 g에서 억제된다.
노이즈는 변화가 없으며, 시그날-독립적인 0의 기대값을 갖는 화이트 가우시안 노이즈이다. 필터 적용 후 이의 표준 편차 σn은 이하로 나타낸다:
(21)
필터는 노이즈의 고빈도 성분을 억제하므로, σn이 감소된다. 가우시안 화이트 노이즈가 필터링 전후에 자극되는 부위를 도 10에 나타낸다. 본 모델에 따른 필터링 후 표준 편차는 0.17 σn이다.
따라서, W > 2 σp인 경우 세포 i의 SNR은 이제 이하와 같다:
(22)
필터링 전, SNRi= Ci/ σn이고, SNR의 증가는 이하와 같다:
(23)
σp=2 및 W=4.5인 경우, SNR의 증가인 A=2.1은 가우시안의 폭, σp에 비례한다. 가우시안의 폭이 증가할 때, 더 많은 노이즈가 여과되는 경향이 있음이 관찰되었다. 따라서, 이미지를 매치된 필터로 필터링하면 시그날 대 노이즈 비가 증강됨이 밝혀졌다. 부수적으로, 분리된 선명한 화소와 같은 템플레이트에 매치되지 않는 대상이 효과적으로 저해되기 때문에 필터는 검출을 증강시킨다.
알고리즘 변수들
시료내 세포들이 형태 및 크기가 상이함에도, 세포 이미지내 모든 세포들은 유사한 형태 및 거의 동일한 크기를 갖는다. 이는 광학 시스템의 배율 인자 및 결과적인 점 스프레드 함수의 영향에 기인한다. 이미지내 세포의 대략의 폭 σp를 알고있으므로, 이를 매치된 필터 알고리즘에 직접 사용할 수 있다. 필터가 정확히 세포 크기와 매치되는 경우 최상으로 수행된다는 것을 이전 섹션에서 나타내었다. 세포 이미지내 여러 세포들의 시각적 관찰로 σp=2의 평균 수치가 결정되었다. 최적화를 위해 남아있는 최종 변수는 템플레이트 윈도우의 폭 W이다. 템플레이트 경계의 화소 분포는 W > 2σp이면 0에 가까와 지므로 거의 효과를 미치지 않을 것이다. 작은 템플레이트 사용시, 더 적은 노이즈 및 인위 산물이 여과될 것이다. 경험적으로, W=4.5가 세포 검출에 최적임이 밝혀졌다. 이는 9x9 화소 템플레이트를 초래한다. W > 2σp이므로, 이전 섹션의 근사치 조건을 만족한다.
도 11은 원래 및 여과된 버젼의 전형적인 세포 이미지의 선 자취이다. W=4.5 및 σp=2인 경우 매치된 필터의 효과를 보여준다. 도 11에서 음성 수치는 0으로 조절했음을 주의해라.
역
대상 계수가 단지 이원 이미지로만 수행되므로, 필터된 이미지는 필수적 단계인 역을 위해 준비된다. 하기 연산을 g(x,y)에 적용한다:
(24)
여기서, 세포는 백그라운드 및 노이즈와 분리되야 한다. t0의 선택이 세포 계수 프로세스에서 결정적임은 명백하다. 너무 적은 t0는 대상이 실제 세포와 대응되지 않게 하고, 반면 너무 큰 t0는 너무 낮게 어림되거나 부정확한 세포 계수가 된다.
알고리즘의 수행
템플레이트-매칭 알고리즘의 효과를 도 12에 나타낸다. 반복하여 계수된 이미지내 대상의 수를 역 수치에 대해 플랏하였다. 이 경우에, 9x9 화소 템플레이트는 σp=2로 사용된다. 필터를 3개의 상이한 세포 이미지에 적용하였다. 도면들은 일정한 세포의 수가 있는 경우의 역 수치가 비필터된 경우보다 길다는 것을 보여준다. 또한, 곡선은 DC 제거의 결과로 왼쪽으로 쉬프트된다. 이는 평탄역이 원래 이미지에서의 백그라운드 수치와 관계없이 동일한 개시점을 항상 가지므로 예측하지 못했던 이점이 된다. 이같은 발견은 모든 이미지에 적용 가능한 예측되는 역 수치를 더욱 용이하게 얻게 해준다.
비선형 라플라시안 예비 필터링
이전 섹션에 나타낸 역 곡선은 계수 프로세스가 매치된 필터 단독에 의해 더욱 견고해지나, 높은 역 수치에서는 여전히 곡선의 점진적 감소가 관찰됨을 알려준다. 이는 이미지내 세포 강도들의 현저한 평방 편차가 존재한다는 사실에 기인한다. 선형 매치된 필터는 이 평방 편차를 변화시키지 않는다. 알고리즘의 견고성을 추가 개선하는 한가지 방법은 매치된 필터링 이전에 예비 필터링 단계를 적용하는 것인데, 이는 세포 강도의 편차를 감소시킨다. 이는 라플라시안 필터로 이루어지며, 이는 이미지 내 모서리를 강하게 증폭한다. 이는 하기 5x5 커넬을 가진다:
(25)
이 필터는 이미지내 세포를 강하게 증강할 것이며, 이는 노이즈의 표준 편차를 증가시킨다. 정말로, SNR은 이 필터의 적용으로 다소 감소한다. 그러나, 이 필터가 유용한 이유는 세포의 형태가 다소 변화하지 않고 유지됨이 밝혀진 점과 증폭이 너무 커서 대부분의 세포가 더 높은 강도 수치의 이미지로 클립한다는 점이다. 이는 필터 적용 후 세포 강도의 평방 편차가 감소된다는 것, 즉, 모든 세포가 거의 동일한 피크 강도를 갖는다는 것을 내포한다.
매치된 필터는 다시 적용되나, 이 때는 예비 필터된 이미지에 적용된다. 매치된 필터는 단지 필터와 매치된 대상만을 증폭하므로, 매치된 필터 세포들을 다소 증가한 노이즈 수치에서 추출해낸다. 세포들은 필터에 매치되는 반면, 노이즈는 상당히 고빈도이다. 도 13은 3개의 상이한 단계의 이미지의 선 자취가 존재할 때를 나타낸다. 피크가 클립된다는 사실은 매치된 필터의 수행에 실제로 영향을 주지 않는다.
도 14는 라플라시안 예비 필터 및 매치된 필터의 적용 후 역 수치 곡선을 나타낸다. 평탄역은 더 길며, 이는 다소 동일한 강도를 갖는 세포들에 의한 결과이다. 단지 3개의 이미지의 역 구치 곡선만을 나타냈음에도, 다수의 이미지들이 분석되며, 알고리즘이 모든 경우에 매우 견고하다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.
세포 계수
이원 이미지내 대상의 계수는 소프트웨어로 수행되는 잘 알려진 방법이다. 따라서, 계수 알고리즘의 간략한 설명만을 제시할 것이다:
1. 이원 이미지가 화소대 화소로 스캔된다(위아래 및 좌우로).
2. 스캐닝 연산자가 화소 p를 수치 1로 히트한 경우, 표지가 할당된다. 첫번째 p 파운드는 표지 1을 얻는다.
3. 연산자는 이미 스캔된 p의 이웃한 것들(즉, p의 왼쪽, p의 위쪽, 및 2개의 상부 대각선쪽 이웃)을 조사한다. 이 정보에 기초하여, p의 표지는 이하와 같이 일어난다:
⊙ 만약 4개의 이웃 모두 0이라면, 새 표지는 p로 할당되며, 그 밖에,
⊙ 만약 단지 1개의 이웃만이 수치 1을 가진다면, 이의 표지는 p로 할당되고, 그 밖에
⊙ 만약 하나 이상의 이웃이 수치 1을 가진다면, 표지들 중 하나는 p로 할당되며, 2개의 이웃 표지는 동등하다는 것을 주의해라.
스캔 완료 후, 두번째 통과는 모든 동등한 표지가 단일 표지로 대체되도록수행된다. 이제, 표지의 수는 이미지내 부위의 수에 대응된다. 완전한 세포 계수알고리즘의 개략적 대표도를 도 15에 나타낸다. 라플라시안 필터로 첫번째 회선 후, 이미지 수치는 0 내지 255(8-비트 포멧) 사이의 수치로 제한된다. 그 후, 매치된 필터가 적용된다. 결과적으로, 음성 수치 및 255 이상의 수치의 발생이 관찰되었다. 그 후, 이미지를 8-비트 포멧으로 스케일-백하여, 이를 원래 이미지와 부합하도록 하고, 원래 이미지와 필터된 이미지의 비교를 가능케 한다. 도 16은 전형적인 비처리된 세포 이미지 및 세포 계수 프로세스의 상이한 처리 단계 후 이 결과로 극적으로 개선된 이미지를 나타낸다. 이러한 이미지화 단계는 본 발명의 알고리즘에 필수적인 놀랍고 예측하지 못했던 이미지 품질 및 해상도의 개선에 큰 영향을 주었다.
간이화된 템플레이트 매칭 분석
이미지 분석의 대안적 방법이 개발되어, 이하와 같이 적용되었다. 이미지를 획득하고(소니 ICX085AL 센서가 장착된 CCD 카메라), 메모리로 저장한 후, 이미지 크기는 1300x1030 화소였다. 광학 배열은 각각의 화소가 6.7x6.7 ㎛ 면적을 나타내도록 한다. 그 후, 전용 이미지 분석 루틴이 덜 밝은 백그라운드에 대해 밝은 대상(세포)을 찾는다(화이트는 255이고, 블랙은 0임). 이 이미지 분석 방법은 2개의 부위, 내부 직사각형(커넬) 및 둘러싸인 부위의 분석에 의존한다. 현 조작으로, 커넬은 7x7 화소이고, 외부 부위는 내부 커넬 직사각형에 둘러싸인 13x13 화소 직사각형이다.
먼저, 커넬을 포함하지 않은 외부 면적의 평균 선명도를 계산한다. 다음으로, 커넬의 평균 선명도를 계산한다. 이 평균들을 모든 화소로 둘러싸인 부위에 대해 계산한다(커넬 중앙이 화소수를 확인함). 다음으로, 내부 커넬 면적의 평균을 외부 면적 평균에서 뺀다. 만약 이 차이가 역 수치보다 크다면, 이벤트가 밝혀지고 기록된다. 분석 면적은 이후 1 화소 만큼 쉬프트되며, 평균을 다시 계산한다. 만약 이 차이가 역 수치보다 크다면, 새로운 사건이 밝혀질 것이다.
그 후, 만약 사건들간의 거리가 7 화소보다 작으면, 2개의 사건은 동일한 대상에 속한다. 대상의 중앙은 커넬 부위와 외부 부위의 평균 강도간의 차이가 가장 클때(최상의 적합성)의 화소를 결정하여 밝혀진다. 둘러싸인 부위의 크기가 13x13 화소이므로, 대상의 중앙의 이미지의 모서리(수평 및 수직)까지의 최소 거리는 13/2 = 7 화소이다. 최초 7 화소에 존재하는 사건은 검출되지 않았다.
이 변형된 템플레이트 매칭 방법은 이전 템플레이트 매칭 방법에 비해 몇몇 이점을 가진다. 첫째, 컴퓨터 사용 전력 및 시간이 적게 든다. 전형적인 템플레이트 매칭 알고리즘은 대상 형태의 전체 가우시안 프로파일을 관찰하기 때문에, 이미지의 처리 시간이 데스크탑 워크 스테이션 사용시 약 1시간이다. 그러나, 간이화된 템플레이트 매칭 알고리즘(내부 직사각형 및 외부 둘러싸인 면적) 사용시, 분석 시간은 수분이다. 더욱이, 이 분석은 CCD 카메라 내부에 있는 프로세서로 수행될 수 있다.
간이화된 템플레이트 매칭 알고리즘의 또 다른 이점은 예비 필터링이 더이상 필요하지 않다는 것이다. 간이화된 방법은 커넬 부위를 둘러싸인 부위에 비교할 때, 백그라운드 노이즈를 고유적으로 제거한다. 간이화된 방법 사용시의 분석 시간의 감소는 예비 필터링 단계가 필요없게 된 결과이기도 하다.
유저 인터페이스
한 구체예에서, 처리된 이미지의 데이타는 종래의 LabView 유저 인터페이스를 통해 평가된다. 여러 다른 전용 인터페이스가 이들 자신의 적용 분야를 가지며 개발되어왔다. 이러한 인터페이스 중 하나는 유저로 하여금 이미지를 로드하고, 필터 변수들을 조절하며, 필터링 및 역 단계를 수행하고, 역 곡선을 얻으며, 이미지내 세포의 수를 계산하게 한다. 다른 유저 인터페이스들은 다중 이미지의 처리, 이미지 막대 그래프의 획득 및 카메라로부터 이미지의 실시간 포착을 포함하는 다른 목적들을 위해 개발되어왔다.
초기에는 데스크탑 컴퓨터가 카메라에서 얻은 이미지를 처리하는데 요구되었다. 그러나, 자원이 부족한 경우의 세팅에 세포 계수와 같은 적용시에는, AC 전력 공급 및 광범위한 컴퓨터 지식에 의존하지 않으며, 용이하게 수행되는 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 현재 사용되는 컴퓨터를 대체할 수 있는 가능한 성분은 "스마트 카메라", 즉, 보드상에 통합된 이미지를 처리하는 하드웨어 및 소프트웨어를 갖는 디지탈 카메라이다. 이러한 카메라는 이미지 처리 알고리즘 및 예컨대, 팜탑 컴퓨터 또는 디지탈 디스플레이로 출력을 수행할 수 있어야 한다. 이러한 스마트 디지탈 카메라는 현재 시판되고 있다. 이들은 일반적으로 이미지 처리 태스크를 프로그래밍하는 CCD 및 디지탈 시그날 프로세서로 구성된다. 이러한 카메라가 컴퓨터를 대체시, 광원 및 전자학 양자 모두에 대한 전력 공급원으로 전지를 사용하는 것이 가능해진다. 또한, 처리시 물리적 용적 및 장치의 풋프린트도 현저하게 감소하므로, 본 발명에 공개된 소형 장치의 구성을 가능케 한다.
방사 효율
광원
2개의 상이한 LED의 방출 스펙트럼은 냉각된 CCD 카메라(Princeton Instruments Inc., 뉴저지, 몬마우쓰 정션)와 결합된 모노크로마터(HR460, Jobin Yvon SA, 프랑스)를 사용하여 측정하였다. 모노크로마터는 1200 선/mm의 회절 격자가 장착되어 있으며, LED 빛을 회절하고, 이를 CCD 카메라에 투영시킨다. 네온 램프의 스펙트럼 라인은 파장 스캐일의 교정에 사용된다. 1, 25, 및 50 mA의 추진 전류에서 측정하였다. 측정된 스펙트럼은 LED 1(NSPB500S, Nichia Corp, 일본) 및 LED 2(110106, Marl International Ltd., Ulverston, UK)가 거의 동일한 스펙트럼 특징을 가짐을 보여준다. 이는 LED가 다른 회사에서 얻은 것이더라도 모두 유사한 다이오드를 포함한다는 것을 제안해준다. 현미경에 의한 시각적 관찰은 이같은 추측을 지지해준다: 양쪽 다이오드 모두의 구조 및 형태가 동일하다. 스펙트럼의 넓어짐은 물론, 470 nm에서 467 nm으로의 스펙트럼 블루-쉬프트가 증가하는 추진 전류에서 관찰된다. 이는 GaN 물질내 위치상의 밴드 필링에 기여할 수 있다.
방사 모델
방사 광학 경로의 개략적 대표도를 도 17에 나타내었다. 다이오드 앞면의 에폭시 렌즈는 다이오드 칩에서 방출된 빛을 시준한다. 이는 15°방출각을 갖는 빔을 초래한다. 컨덴서 렌즈(f=27 mm, φ30 mm)는 입구 퍼필 a대물렌즈가 5 mm인 10X 대물 렌즈의 후방 초점면에 다이오드의 빛-방출 면적의 이미지를 초래하며, 이 결과 시료면의 수평 빔 방사를 초래한다. 다이오드와 에폭시 렌즈 사이의 거리는 이 렌즈의 초점 거리보다 짧으므로, 에폭시 렌즈의 앞면에 다이오드의 확대된 시각 이미지를 초래한다. 다이오드 및 에폭시 렌즈가 LED 하우징에 고정되므로, 다이오드의 확대된 시각적 이미지를 본 분석의 나머지에서 근원 대상으로 처리할 수 있다. 다음 렌즈인 컨덴서 렌즈까지의 대상 거리는 이하와 같이 나타낸다:
(26)
상기 식에서, d는 에폭시 렌즈와 컨덴서 렌즈 간의 거리이다. 이는 이미지 거리 b컨덴서에 대해 다음과 같다:
(27)
만약 bLED+ d = f컨덴서(=27 mm)라면, 컨덴서가 무한대로 갈 것이라는 것을 방정식 (27)에서 얻을 수 있다.
상이한 수치의 d에서 b컨덴서를 결정하여, bLED가 19 mm임을 실험적으로 밝혔다. 균등 방사가 보존되는 동안 변화되는 유일한 변수는 대물 렌즈의 앞면의 다이오드 이미지의 크기인 BB'이다. 시료면에서의 빛 강도를 최대화하기 위해, BB'의 최적 수치를 결정하는 것이 필요하다. 2개의 제한된 상황은 구별될 수 있다:
1. BB'>> a대물렌즈: 다이오드 이미지는 대물 렌즈의 입구 퍼필 보다 더욱 크며, 입사각은 작다. 이는 대물렌즈로 입사되는 모든 빛이 시야 이내에 가두어짐을 내포한다. 그러나, 빛의 일부는 대물 렌즈의 앞, 입구 퍼필의 밖에서 실제로 소실된다(도 18a).
2. BB'<< a대물렌즈: 다이오드 이미지는 점광원과 같다. 빛이 큰 각도로 대물 렌즈로 입사하나, 단지 작은 입사각을 갖는 빛만이 시야 내에서 끝난다. 빛의 일부는 시료면에서 소실된다(도 18b).
확장 광원, 이로 인한 오프-축 광선을 다루고 있기 때문에, 방사 효율에 대한 분석적 표현을 수행하는 것은 용이하지 않다. 또한, 상이한 조리개 스톱이 에폭시 렌즈, 대물 렌즈 입구 퍼필 및 시료면의 시야에 사용된다. 이러한 조리개 스톱은 빛의 일부를 방해하나, 그 실제 양은 광학 성분의 구성에 의존한다.
분석적 해결을 얻기가 어렵기 때문에, 근본적인 기하학적 광선-자취 알고리즘이 방사 효율을 예측하기 위해 개발되었다. 근원은 2 mm 직경(VV'와 동일)의 원형 디스크로 모델화되었다. 근원은 이 면적 및 모든 방향으로 균등하게 방출된다. 효율을 계산하기 위해, 근원에서 유래한 많은 수의 광선들을 광학 시스템을 통해 추적하고, 모든 조리개 스톱에서, 광선이 차단되는지 아니면 통과하는지를 체크하였다.
효율은 시료면에 도달한 광선을 LED의 에폭시 렌즈를 떠난 전체 광선의 양으로 나눈 수로 정의된다. 알고리즘의 가시화를 도 19에 나타내었으며, 여기에 차단된 광선 및 시료면에 도달하는 광선 양쪽 모두를 나타내었다. LED 유래 광선의 최대 각도가 에폭시 렌즈에 의해 결정되며, 일부 광선이 대물 렌즈 앞에서 차단됨이 도 19에서 관찰된다. 더욱이, 일부 광선은 시료면의 시야 바깥에서 끝난다. 방사 효율을 다양한 크기의 BB'에 대해 계산하였다. BB'를 조절하기 위해, 대상 거리 v컨덴서및 이미지 거리 b컨덴서를 변화시켰다. 방사가 가장 밝고, 이 최적치가 BB'= 4 mm에서 밝혀질 때, BB'가 최적 수치이었다.
교정 카트리지
알려진 양의 합성 형광 구슬을 함유하는 교정 시료 챔버를 제조하고, 본 시스템의 CCD로 검출가능함을 보였다. 이러한 대조군 챔버는 중합체 매트릭스에 내장된 구슬을 가진다. 이러한 카트리지를 이미지화하여, 본 장비가 이러한 시스템(방사, 광학, 검출, 계산, 및 기록)을 잘 작용하도록 하는지를 확인하기 위해 시험하였다. 더욱이, 이 카트리지는 장비 제조 동안 품질 조절 및 초기 교정에 매우 유용할 것이다.
다양한 실험들의 서술은 본 시스템을 최적화 및 특징화하기 위해 수행되는 것이다. 광범위한 실험 및 측정은 광원의 스펙트럼 특징, 방사의 광학 방법 및 CCD 카메라의 수행을 결정하기 위해 수행되었다. 더욱이, 이전 섹션에서 서술된 이미지 분석 알고리즘의 실행을 시험하여, 이것이 매우 효율적임을 밝혔다. 하기 실시예에 서술된 실험들은 본 발명의 적응성을 설명하기 위한 것이다. 이들은 본 발명의 범위나 용도를 제한하지 않는다.
실시예 1: 시스템 특징
이론적 예측치를 계산하기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 포토다이오드를 대물 렌즈 앞, 시료면에 두었다. 조리개는 포토다이오드상의 방사된 면적을 1.6 mm 직경의 디스크로 제한시킨다. 다이오드 칩의 이미지가 대물 렌즈의 후방 초점면에 생성되고, 이 이미지의 크기가 거의 핀-점광원 내지 25 mm로 다양하도록, LED 및 컨덴서 렌즈를 상이한 구성으로 두었다.
실험 결과를 도 20에 나타내었으며, 여기서 광선-자취 알고리즘에서 얻은 곡선을 실험 데이타와 함께 나타내었다. 알고리즘에 의해 예측되는 바와 같이, 최적 수치는 대물 렌즈의 후방 초점면에서의 이미지 크기로 밝혀졌다. 곡선의 형태는 큰 수치의 BB'라는 점을 제외하고는 알고리즘에 의해 예측되는 상황과 유사하며, 실험은 거의 0의 효율을 보인다. 이는 실제 광원이 균등하거나 원형이 아니라, 비균등하고 사각형이라는 사실의 결과일 수 있다. 모델 및 실험 양쪽 모두의 결과는 양쪽 모두 BB'의 광학 수치가 4 mm임을 나타내어 일치한다. 이는 V컨덴서= 46 mm 및 b컨덴서=83 mm 변수들을 사용하여 실현되었다. 셉업의 물리적 용적은 이 변수들을 허용하므로, 최적 방사를 얻기 위해 이들을 선택하였다.
배율
광학 시스템의 배율은 교정 그리드를 이미지화하여 결정하였다. 그리드의 간격은 25 ㎛/라인이다. 그러므로, 시야는 0.65 mm x 0.8 5mm이고, 이미지 크기는 494 x 652 화소이므로, 단일 화소는 시료면내 1.7 ㎛2에 대응된다. 이미지를 포함한 시료면의 전체 면적은 0.55 mm2이다.
측정 부피
시료내 유리된 및 비결합된 염료는 CCD 카메라에서 백그라운드 시그날을 초래한다. 이 시그날은 LED에 의해 방사된 시료 부피에 의존하며, 또한 시료의 광학 성질에 의존함이 밝혀졌다. 전체 혈액의 lOx 희석 시료에서 방사된 부피를 결정하기 위해, 예컨대, 아크리딘 오렌지를 최종 농도 5 μM로 첨가하고, 시료를 쒜기-형태의 챔버에 둔다. 이 챔버를 다른 위치에서 이미지화하고, 결과 이미지의 평균강도를 측정하였다. 백그라운드 시그날이 4 내지 5 mm의 깊이에서 증가함을 밝혔다. 챔버 깊이가 더 큰 경우, 백그라운드 시그날은 일정하게 유지되었다. 이는 측정된 깊이가 약 4 mm임을 나타내는데, 이는 일반적으로 사용되는 표준 챔버의 깊이와 일치하는 것이다.
카메라
카메라의 입력 시그날(즉, 시료면 유래 광자) 및 출력 시그날(8-비트 이미지내 강도 수치)간의 관계를 결정하는 것이 바람직하다. 만약 이 관계가 알려져 있다면, 디지탈 이미지내 화소의 측정된 강도에 기초하여 시료내 예컨대, 세포의 형광 강도을 결정할 수 있다. 선형 카메라 반응의 경우, 이미지내 화소의 강도 수치는 이하와 같이 정의된다:
(28)
상기 방정식에서, A는 카메라의 증가이고, P화소는 화소 면적에서의 복사 전력이며, t는 적분시간이고, b는 암 전류이며, c는 리드아웃 노이즈이고, n은 적분 시간에 대한 함수인 샷 노이즈이다. 화소 강도의 단위는 DN(디지탈 수)이다. 암 전류 및 리드아웃 노이즈 변수들은 카메라 조리개를 커버하고, CCD의 모든 화소의 평균 출력 시그날을 측정하여 용이하게 결정된다. b와 t의 관계를 도 21에 나타내었다. 암 노이즈 평방 편차 σb또한 이 도면에 나타내었다. 평균 암 전류 노이즈 수치가 열 노이즈에 대해 예측되는 바와 같이 적분 시간에 따라 선형으로 증가하며, 카메라의 리드아웃 노이즈로 인한 오프셋을 가짐이 도 21에서 관찰되었다. 도면들로부터, 변수들을 이끌어낸다:
(29)
적분 시간이 20초 보다 길때, 카메라는 노이즈로 포화된다. 열 전자 분포가 포이즌 프로세스이기 때문에, 암 전류 노이즈의 표준 편차는 적분 시간의 제곱근의 함수로 예측된다. 그러나, 도 21의 데이타는 예측했던 바와 달리 다소 상이한 행동을 나타내며, 적분 시간에 대한 의존도가 선형이 아님이 밝혀졌다. 이와 같은 발견의 이유는 불명확하나, 아마도 카메라내 다른 노이즈원 또는 전자에 의한 것일 것이다. 표준 편차는 카메라의 포화로 인해 다시 t> 20초에서 감소한다. σb는 이하 식으로 얻어진다:
(30)
증가 변수 A를 결정하기 위해, 알려진 입력 시그날에 대한 카메라 반응을 측정해야 한다. 만약 입력 시그날이 강도 또는 노출 시간에 의해 조절된다면, 결과적인 직선 곡선의 기울기를 추축하여, A를 유도할 수 있다. 셋업의 표준 광원인 블루 LED가 입력 시그날이 카메라에 발생하도록 하는데 사용하였다. 이를 수행하기 위해, CCD 카메라를 대물 렌즈의 앞면에 직접 시료면에 둔다(도 22 참고). 복사 전력은 추진 전류를 LED로 다양하게 하여 조절하였다. 시료면의 LED의 추진 전류와 복사 전력간의 상관관계는 대물 렌즈의 앞면에 바로 위치한 알려진 반응도를 갖는 실리콘 포토다이오드를 사용하여 먼저 교정하였다. 이 관계가 일단 수립되면, CCD 이미지내 화소 강도를 LED 빛의 복사 전력의 함수로 측정하였다. 알려진감쇠 인자를 갖는 그레이 필터를 LED에서의 시그날을 감쇠하는데 사용하였다. 이는 카메라가 포화되는 것을 방지하는데 필수적이다. 카메라 출력 시그날이 적분 시간에 따라 선형으로 증가한다는 가정을 확인하기 위해, 염료 용액(AO)을 시료로 사용하여, 상이한 적분 시간에서 이미지화 하였다. 이 결과는 정말로 선형 관계이었다. 카메라 반응은 이하와 같다:
(31)
또는
(32)
감도 및 노이즈에 관한 카메라의 특징이 이제 정의되었으므로, 이 변수들을 사용하여 이미지내 검출가능한 시그날을 초래하는데 요구되는 최소한의 복사 전력을 결정하였다. 이미지내 단일 화소에 대한 시그날 대 노이즈 비(SNR)는 이하와 같다:
(33)
이미지내 단일 화소는 시료면에서 1.7 ㎛2의 빛을 수용하며, 시료면내 상응하는 전력 밀도는 다음과 같다:
(34)
시그날 대 노이즈 비 및 전력 밀도간의 관계는 아래와 같이 기재할 수 있다:
(35)
도 23은 M과 t의 조합이 SNR=3, SNR=5 및 SNR=10의 시그날 대 노이즈 비를 초래하기 위해 요구됨을 보여준다.
이미지 분석
이미지에 적용된 필터가 역 수치에 현저하게 의존하지 않는 견고한 계수 알고리즘을 초래함을 밝혔다. 이 알고리즘이 모든 상황에서 잘 수행되는지를 확인하기 위해, 상이한 수의 세포들을 갖는 많은 수의 이미지들을 분석하였다. 이미지 처리 단계의 정확성 및 안정성을 추가 조사하기 위해, 모의 세포 이미지를 사용하였다. 모의 이미지는 CCD 카메라에서 얻은 실제 세포 이미지와 유사하나, 이들의 특징이 알려져 있는 것이다. 실제 및 모의 이미지 양쪽의 분석은 최적 역 수치의 선택을 가능케 한다.
역 수치
최적 역 수치를 결정하기 위해, 7 세포/이미지 내지 1150 세포/이미지 범위의 세포 수를 갖는 45개의 세포 이미지를 분석하고, 역 곡선을 계산하였다. 세포가 없는 3개의 이미지 또한 분석하였다. 이 결과를 도 24에 나타내었다. 이 도면에서, 유효한 역 수치 범위를 나타낸다. 하한은 0개의 이미지가 세포 계수에 추가 기여하지 않는 경우의 위치로 측정하였고, 상한은 이들의 점진적 붕괴로 인해 역 곡선의 형태로 결정하였다. 이미지내 시그날 대 노이즈 비를 조절하고, 시그날 대 노이즈 비의 계수 정확성에 대한 영향을 조사하기 위해, 모의 이미지를 사용하였다. 모의 세포 이미지는 평균 I0및 표준 편차 σ의 정규 강도를 갖는 알려진 세포의 수 N으로 구성된다. 세포는 2차원 가우시안으로 모델화한다. 이 이미지는 또한 일정한 백그라운드 수치 C0, 노이즈 성분 n 및 실제 세포 이미지와 유사한 밝은 분리된 화소의 수를 가진다. 세포 이미지의 수는 1 내지 25까지의 상이한 시그날 대 노이즈 비를 모의한다. 여러 모의 이미지들을 도 25에 나타내었다(SNR=3, SNR=10, SNR=20). 모의 이미지에 대한 이미지 변수들은 실제 세포 이미지의 변수들에서 유래된다. 이 결과는 I0= 110, σ= 20, C0= 50, 및 N = 600이다. 그 후, 모의 이미지를 이미지 처리 소프트웨어로 분석하였다. 도 26은 2개의 모의 세포 이미지, 세포가 없는 이미지 및 600개의 세포를 갖는 이미지에 대한 역 곡선을 나타낸다. 시그날 대 노이즈 비는 실제 이미지와 유사하게 20이었다. 도면에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 모의 이미지의 역 곡선의 형태는 도 24의 실제 이미지 곡선의 형태와 유사하다. 모의 이미지를 분석하여 계수 알고리즘의 수행을 평가하였다. 검출 오류는 아래와 같이 정의된다:
(36)
도 27은 4개의 상이한 역 수치인 80, 100, 120 및 140에 대한 결과를 나타낸다. 오류는 시그날 대 노이즈 비가 증가함에 따라 감소한다. 실제 세포 이미지의 시그날 대 노이즈 비는 전형적으로 20이다. 이러한 발견은 이같은 시뮬레이션에 기초하여, 이미지 처리 부정확성으로 인한 오류가 약 2%로 예측됨을 설명한다.
실시예 2: 전체 백혈구 계수
분리된 백혈구를 알려진 백혈구 농도로 백혈구가 방혈된 5 내지 30,000 세포/㎕의 범위의 적혈구 농축액에 스파이크하였다. 그 후, 시료를 하기 전체 백혈구 선택 프로토콜에 따라 처리하였다. 12x75 mm 유리 튜브내 100 ㎕의 EDTA 항응고 전체 혈액에, 20 ㎕의 100 ㎕/ml 바이오틴화된 CD45 모노클로날 항체를 첨가하였다. 실온에서 30분 항온 처리 후, 10 ㎕의 0.4 mg/ml 스트렙타비딘-페로유체를 첨가하였다. 그 후, 시료를 HGMS 자기 4극자(QMS 13, Immunicon?Corp., PA)의 안팎에 3번(각 10초씩) 두었다. 다시 30분간 방치 후, 5 ㎕의 3 mg/ml 아크리딘 오렌지를 첨가하고, 시료를 최종 부피가 2 ml가 되도록 세포 완충액(Immunicon Corp, 주로 포스페이트로 완충화된 염수 또는 PBS를 포함)으로 희석하고난 후, 320 ㎕의 시료 엘리큇을 시료 챔버에 넣었다. 챔버 뚜껑을 덮고, 즉시 자기 챔버 용기에 두었다. 각 시료마다 3개의 이미지를 제조하였다.
선택적 방식에서, 시료 챔버는 뚜껑이 없는 큐벳으로 구성될 것이며, 수평 광선을 갖는 방사에 수평이라기 보다는 수직 방향일 수 있는 광학적으로 평평한 표면을 초래한다.
선형성
혈액 ㎕당 세포의 수는 사람마다 현저하게 다양할 수 있으며, 어떤 질병에서는 이 수가 극적으로 증감한다. 이는 적용시 적어도 3개 등급의 범위가 기대될 수 있다는 것을 의미한다. 광범위한 백혈구 농도에 걸친 선형성이라는 면에서 본 시스템의 적용은 알려진 수의 백혈구를 갖는 혈액 시료를 측정하여 평가될 필요가 있다.
연관된 실험의 결과를 도 28에 나타내었다. 0.90의 기울기(R2=0.99)가 관찰되었다. 이 낮은 기울기는 약 1500 세포/이미지의 높은 세포 농도에서의 3개의 비정상 측정을 포함한 결과를 보여준다. 만약 높은 데이타 점이 무시된다면, 선의 기울기는 0.98(R2=0.99)까지 현저하게 증가한다. 따라서, 약 1500 세포/이미지가 시스템이 정확히 수행되는 상한으로 간주될 수 있다. 오류 막대는 이미지당 세포의 수가 낮은 경우 현저하게 증가하므로, 시스템의 역학 범위의 하한이 조절된다. 표면에서의 세포 밀도는 혈액 시료의 희석률에 기초한다. 만약 시료내 대략의 세포 농도를 알고있으면, 최적 표면 세포 밀도를 위해 희석률을 증감할 수 있다. 그러나, 희석 인자가 1보다 작을 수 없으므로, 하나 이상의 표면 위치가 이미지화되지 않는한, 통계적 정확성 < 5%로 계수될 수 있는 최소 세포 수/㎕는 약 180 세포/㎕이다.
재현성
세포 계수의 재현성은 시료를 반복하여 재계수시 계수된 세포의 수의 평방 편차에 대응된다. 자기 구성은 챔버의 중앙선을 따라, 표면상의 세포가 표면이 단편되는 아래의 단편 챔버 부피에서 유래된 표면을 단편화하도록 디자인되었다. 그러나, 챔버의 측면 위치를 따라 세포 밀도에 약간의 편차가 있을 수 있다는 것이 예측된다.
부가적으로, 시료를 상이한 표면 위치 또는 단편 또는 상이한 유형의 챔버에서 분석시 편차가 있을 수 있다. 이상적인 시스템에서, 이러한 편차는 포이즌 분포 통계를 따르며, 평방 편차는 계수된 세포의 수에 의존할 것이다. 다른 인자들 또한 세포 계수에 편차를 부여할 수 있다. 측면 위치에서의 세포 분포는 상이한 측면 위치에서 4개의 (부분적으로 오버랩되는) 이미지들을 취해, 세포의 수의 평균의 변화를 계산하여 결정하였다. 이 결과를 도 29에 나타내었다. 이 도면에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 정말로 표면의 측면 위치에 의존하여 세포 표면 밀도의 편차가 존재하였다. 이러한 편차는 챔버의 중앙선을 따라 측정하는 한 중요한 것처럼 여겨지지 않는다. 표면상의 세포 밀도의 편차는 세로 선을 따라서도 측정하였는데, 이는 이 선을 따라 상이한 위치들에서 이미지를 취하여 수행하였다. 이 편차는 포이즌 통계에 대해 3%의 기대치에 비해 약 5%이었다. 5%의 더 큰 편차는 시료내 세포의 초기 이질성, 챔버 용적의 부정확성, 자기 구조의 균등성의 결여 또는 이미지 분석 그 자체에 의해 유래될 수 있다.
정확성
본 실험에서, 세포 계수에 대한 본 시스템의 정확성은 15개의 상이한 혈액 시료의 세포 계수를 상업적 혈액 분석기에 의해 얻어진 데이타와 대응시켜 평가하였다. 다른 환자들로부터 15개의 EDTA-항응고 혈액 시료들을 회수하고, 같은 날 분석을 수행하였다. 각 시료에서, 5-부 상이한 혈액 분석기(Sysmex?SE 9500, Sysmex?Corp., Long Grove, IL) 및 전술된 시스템에서의 분석을 위해 엘리큇을 취하였다. l2x75 mm 유리 튜브내 100 ㎕의 EDTA 항응고 전체 혈액에, 40 ㎕의 25 ㎍/ml 바이오틴화된 CD45 모노클로날 항체를 첨가하였다. 실온에서 30분 항온 처리 후, 25 ㎕의 0.4 mg/ml 스트렙타비딘-페로유체를 첨가하였다. 그 후, 시료를자기 4극자(QMS 13, Immunicon?Corp., PA)의 안팎에 3번 각 10초씩 두었다. 다시 30분간 방치 후, 5 ㎕의 3 mg/ml 아크리딘 오렌지를 첨가하고, 시료를 최종 부피가 2 ml가 되도록 세포 완충액(Immunicon?Corp)으로 희석하였다. 320 ㎕의 시료 엘리큇을 시료 챔버에 넣었다. 챔버 뚜껑을 덮고, 즉시 자기 용기에 두었다. 10분 후, 3개의 이미지를 챔버 표면의 다른 위치에서 취했으며, 이미지 내 세포의 수는 세포 계수 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 세포 분석 시스템상의 계수 및 혈액 분석기상의 계수간의 상관 관계를 계산하였다. 두 시스템간의 상관 관계를 도 30에 나타내었다. 세포의 수가 100 및 15,000 세포/㎕의 범위로 다양할 때, R2는 0.95이었으며, 회귀선은 0.98의 기울기를 가졌다. 수직 오류 막대는 앞선 실시예에 서술된 바와 같은 오류 측정을 나타낸다.
실시예 3: CD4+ 세포 계수
모든 정상 개체의 95%인 CD4+ 림프구의 수는 355 내지 1298 세포/㎕이다. 에이즈 환자에서, 500 세포/㎕이라는 CD4 계수는 종종 항레트로바이러스 요법을 개시하는데 사용되며, 200 CD4/㎕의 계수는 예방적 항미생물제 처리를 개시하는데 사용되고, 100 CD4/㎕의 계수는 종종 통성 감염의 증가와 관련되며, 50 CD4/㎕ 이하의 계수는 HIV 관련 사망의 고도 발생을 가진다. 따라서, CD4를 발현하는 림프구의 수를 정확히 결정하는 것이 중요하다.
선형성
CD4 계수는 Becton Dickinson's TruCount?유세포 분석기 및 이하 서술될 본 발명의 방법에 의해, 10명의 기증자 유래 전체 혈액 시료에서 측정하였다. 전체혈액(200 ㎕)을 12 mm x 75 mm 폴리스티렌 시험 튜브에 첨가하고, 20 ㎕의 0.1 mg/ml 1Ox 바이오틴화된-항-CD4 Mab(2 ㎍이 Mab에 첨가) 및 8.5 ㎕의 0.47 mg/ml 스트렙타비딘 페로유체(4 ㎍이 철에 첨가)와 혼합하였다. 시료를 혼합하고, QMS13에서 10분 동안 항온 처리하였다. 항온 처리 후, 40 ㎕의 1 mM 아크리딘 오렌지 염료(최종 농도 = 20 μM) 및 1731 ㎕의 세포 완충액, 즉, 최종 부피 = 2 ml를 첨가, 혼합하고, ~350 ㎕의 시료를 챔버에 넣었다. 챔버를 자기 이음쇠에 삽입하고, 10분 후 5개의 상이한 챔버 위치에서의 계수를 얻었다(세포/㎕). 상관 계수 R = 0.96이고, 기울기는 본 방법이 참조 방법보다 더욱 많은 세포가 계수됨을 나타내는 53의 절편을 갖는 1.15이었다. 데이타를 도 31에 플랏하였다.
방출 차이에 기초한 CD4+ 단구 및 림프구간의 구별
CD4 마커는 단구 및 림프구 모두에서 발현된다. 따라서, 자기 분리에 CD4 모노클로날 항체를 사용하는 것은 챔버 표면상에 단구 및 림프구 모두의 존재를 나타낼 것이다. 양 세포 집단의 절대 계수를 얻기 위해, 아크리딘 오렌지로 염색시의 차이를 기초로 이들을 구별할 수 있다. 전체 백혈구 계수에도 사용되는 염료인, 아크리딘 오렌지는 메타크로마틱하다고 알려져 있다. 염료가 이중가닥(ds) 대 단일가닥(ss) 핵산에 결합시 이의 방출 스펙트럼에 큰 쉬프트를 보인다(표 2). 아크리딘 오렌지는 ds-핵산에 삽입되어 결합하며, 삽입 형태는 블루 빛에 의해 여기시 그린 형광을 나타낸다. DNA에 삽입된 아크리딘 오렌지의 최대 흡광도는 500 내지 506 nm이며, 방출도는 520 내지 524 nm이다. 아크리딘 오렌지의 ss-핵산과의 상호작용은 이웃하는 염기간에 아크리딘 오렌지의 삽입, 양이온 염료에 의해 중합체 차지의 중화, 및 이어지는 산물의 응축 및 응집(침전: 용질 대 고체 상 전이)으로 개시되는 복잡한 다중-단계 프로세스이다. 이 침전 산물에서의 아크리딘 오렌지의 흡수 스팩트럼은 핵산의 염기 조성에 따라 최대 흡수 범위가 426-458 nm인 삽입된 아크리딘 오렌지에 비교할 때 블루-쉬프트된다. 이 복합체에서의 아크리딘 오렌지의 방출 또한 630-644 nm 사이로 다양하며, 또한 염기 조성에 의존한다.
아크리딘 오렌지 및 핵산-염료 복합체의 스펙트럼 특징
염료 또는 복합체 최대 흡수(nm) 추천 여기(nm) 최대 방출(nm)
AO(단량체) 492 - 525
AO-dsDNA(삽입) 502 488 520-524
AO-ssDNA(침전) 426-458 457 630-644
아크리딘 오렌지의 메타크로마틱 행동은 단구를 림프구와 구별하는데 사용될 수 있는데, 이는 염료의 농도가 정확한 구별을 하는데 결정적임에도 불구하고, 단구가 림프구보다 더 많은 양의 RNA를 가지기 때문이다. 따라서, 약 630-644 nm 범위에서 아크리딘 오렌지의 방출은 림프구보다 단구에서 더 크리라 예측된다. 하기 실험은 아크리딘 오렌지의 메타크로마틱성의 사용 및 두 하위집단 세포들의 RNA 함량의 차이를 사용하여, CD4+ 단구 및 림프구가 단일 표지 단계를 사용하여 분리하여 계수되는지의 여부를 조사하기 위해 수행한 것이다. 동일한 표지 프로토콜을 전체 백혈구 계수를 위해 사용하였으나, CD4+ 림프구 및 단구를 표지하기 위해 항-CD4 모노클로날 항체를 CD45 항체 대신 사용하였다. 자기 분리기 내부에서 회수한지 10분 후, 챔버 표면의 이미지를 455df30 밴드-통과 필터를 사용하여 얻었다. 이 이미지에서 단지 세포의 DNA 함량에 컨주게이트된 염료의 형광(모두 백혈구에도사용됨)만이 검출되었다. 그 후, 다른 이미지는 640df20 밴드-통과 필터로 얻어졌으며, 이는 세포내 RNA 함량을 측정하기 위해 사용된 것이다. 첫번째 이미지는 모든 세포의 위치를 확인하는데 사용되었으며, 이러한 위치는 컴퓨터 메모리에 저장되었다. 두번째 이미지에서, 모든 위치에서의 RNA 함량에 따른 평균 화소 강도를 측정하였다. 도 32는 자기적으로 표지된 CD4+ 세포의 시료에서 얻은 산포 플랏을 나타낸다. 그린 채널의 이미지에서 세포의 평균 화소 강도로 측정된 DNA 함량을 레드 채널의 이미지에서 평균 화소 강도로 측정된 RNA 함량에 대해 플랏하였다. 두 집단은 레드 채널에서 림프구보다 더 높은 강도를 갖는 단구에 의해 구별될 수 있다. 단구 및 림프의 수를 유세포 분석에서 통상 행해지는 바와 같이 산포 플랏에서 검색할 수 있다.
자기 로딩/항원 밀도의 차이에 기초한 CD4+ 단구 및 림프구간의 구별
만약 표면에 도착한 세포의 수를 시간의 함수로 측정한다면, 챔버내 자기 회수 동안의 세포의 평균 속도를 결정할 수 있다. 이는 CCD 카메라에서 얻은 이미지를 연속적으로 처리하는 실시간 이미지 처리 알고리즘을 사용하여 행해질 수 있다. 이러한 알고리즘은 0.25 이미지/초의 최대 속도로 세포 계수 측정이 가능하도록 개발되었다. 예측되는 역학에 기초하여(방정식 (7) 참고), 시간 자취를 방정식 (7)에 대입하여 세포의 평균 속도(v 0 ), 속도 분포의 표준 편차(σ) 및 회수 이전 이미지화된 표면 아래 부피에 존재하는 전체 세포의 수(N0)를 추정한다. 도 33은 비선형 가장 작은 정사각형 조정 알고리즘을 나타내는 결과(점선)와 함께 전체 백혈구계수에서 얻어진 전형적인 시간 자취를 나타낸다. 세포의 평균 속도는v 0 =0.24 mm/s, 표준 편차 σ=0.21 mm/s 및 전체 세포의 수 N0=1113으로 추정된다. 이 곡선-조정 알고리즘을 사용하면, 비록 모든 세포들이 표면에 도달할 만큼 자기화되지 않았음에도 전체 수(세포/㎕)의 추정치를 얻는게 가능하다. 그러나, 항원 발현(및 이에 따른 자기 모멘트)은 백혈구 하위집단마다 상이할 수 있으며, 이 모델은 추가적 개량 없이는 모든 백혈구 집단에 엄격히 적용할 수 없다는 것을 주의해야만 한다. 백혈구를 자기적으로 표지하기 위해 모노클로날 CD4+ 항체를 사용시, CD4+ 단구 및 림프구 모두가 표지된다. 단지 CD4+ 림프구 계수만이 HIV-감염 진행의 모니터링시 임상적으로 관련되므로, 전체 CD4+ 계수에서 단구 및 림프구의 수를 구별하는 방법이 필요하다. CD4 항원 발현은 CD4+ 단구 및 림프구와 상이하므로, 자기 표지의 양 또한 상이할 것이며, 표지된 단구의 경우 낮은 자기 모멘트 및 낮은 평균 속도를 나타낸다. 세포의 수를 시간의 함수로 계수시, 단구 및 림프구의 수를 N(t) 곡선의 형태에서 추론할 수 있다. CD4+ 림프구상의 정상 항원 밀도는 47±14xl03/세포이고, CD4+ 단구상의 정상 항원 밀도는 17±5xlO3/세포로 보고되었다. 단구 및 림프구 양쪽 모두에서 표면 항원이 동일한 %를 차지하고, 양쪽 모두 유사한 중량 및 형태를 가진다고 가정하면, 항원 밀도는 이들의 회수률과 관련될 수 있다. 초기 실험에서, CD4+ 단구의 평균 속도는 0.2 mm/s로 밝혀졌으며, 따라서 단구의 경우 0.07 mm/s의 평균 속도가 예측된다. 도 34에서 전체 세포 계수를 단구 및 림프구의 수와 함께 나타내었다. 만약 N1, N2, T1 및 T2가 결정된다면, N단구및 N림프구는 아래와 같이 계산될 수 있다:
(37)
항원 밀도의 표준 편차를 사용하여, 속도의 표준 편차는 단구의 경우 0.02 mm/s로, 림프구의 경우 0.06 mm/s로 예측된다. 도 34b에서, 이러한 속도 편차를 갖는 동일한 세포 계수 시뮬레이션을 나타낸다. NI, N2, T, 및 T2의 수치가 정확히 결정될 수 없다는 것은 도면에서 명백하다. 더 나은 대안은 2가지 세포 유형에 대해 N(t)의 분석 해식에 기초하여 비선형 곡선 조정 알고리즘에 적용하는 것이다. 한가지 세포 유형의 경우, 해식은 아래와 같다:
(38)
상기 식에서,ysurf는 챔버의 크기이고,v0는 세포의 평균 속도이며,σO는 편차이고,erf는 오류 함수이다. 이 알고리즘은 뉴턴 반복법에 기초한다. 도 35에서, "알려진" 값으로 조절된 v0, v1, σO및 σ1및 추정된 N1 및 N2를 갖는 (모의) 조정을 나타낸다. 그러나, v는 생물학적 시료의 점도, 표지된 표면 항원의 % 차이, 및 자기 입자의 자기 모멘트의 차이에 의존하기 때문에, 실제 측정시 v0및 v1은 정확히 안다고 가정할 수 없다. 이 모든 관계를 선형이라 가정시, v0/v1비는 일정하게 유지되야 한다. 따라서, 조정 알고리즘은 v0, v1, σO및 σ1이전에 점도상수 Cv또한 예측하도록 변형된다. 도 36에서, 구획 아래에서 개시된 모든 표지된 세포를 갖는 시뮬레이션을 나타낸다. 이는 자기장을 충분한 시간동안 역으로 하여 수행될 수 있다. N1 및 N2는 도면으로부터 꽤 정확히 예측될 수 있다.
동일한 비선형 곡선 조정 방법을 적용시, 그 결과는 도 36에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 균등 시료로 곡선 조정을 행한 경우보다 전체적으로 뛰어났다. 이 도면에서, 계수된 세포 수의 차이 또한 나타낸다. 가우시안 함수는 낮은 시그마 수치에서 구별될 수 있는 반면, 예측되는 시그마를 갖는 함수는 사용된 작은 시간-단편(0.57초) 동안 표면에 도착한 세포의 큰 편차로 인해 노이지하다.
임상적으로 관련있는 CD4+ 림프구를 단구와 구별하는 추가적 수단을 이하 열거한다:
1. 상이한 크기의 자기 입자로 차별적인 자기 로딩을 하여, CD4+ 림프구의 이동률을 증강한다;
2. 자기 배열내 틈 폭 및 이에 따른 자기장력을 최적화하여, 단구에 비해 CD4+ 림프구에 대한 차별적인 결합을 증가시킨다;
3. 유리된 CD4 Mab을 첨가하여, CD4-특이적 자기 입자가 단구에 결합하는 것을 저해하도록 돕는다;
4. 단구에 특이적인 비자기 구슬을 도입한다;
5. 자기 포착 입자상의 항체 밀도를 변화하여, CD4+ 림프구를 선호하게 한다; 및
6. 부가적으로 표지된 CD45, 예컨대, 항 CD45-형광제를 CD45 자기 포착 및아크리딘 오렌지와 함께 사용하여, 림프구 검출을 증강시킨다.
실시예 4: 투광조명 직접 방사
앞서 서술된 실시예에서, LED는 방사 빛을 발생한다. 빛은 컨덴서 렌즈, 455DF 70 밴드통과-필터를 통과하여, 시료 방향으로 515 DRLP 이색성 거울에 의해 반사된다. 컨덴서 렌즈는 대물 렌즈의 후방 초점면상에 빛의 초점을 맞추어, 시료의 수평 방사를 초래한다.
대부분의 성분들을 제거하기 위한 수월한 방법은 2개의 LED 빛이 직접 시료상에 투영되는 직접 시료 방사이다. 본 실행은 앞선 시스템과 비교시 방사의 강도 및 균등성의 감소, 및 백그라운드 시그날의 증가에 의해 영향을 받을 수 있다.
방사 강도 및 균등성
빛은 더 이상 초점이 맞추어지지 않으므로, 방사 강도는 LED의 지향성에 의해 제한된다. 현재 사용되는 LED(NSPB500S, Nichia Corp., 일본)는 30°의 지향성(2θ1/2)을 가진다. 이는 15°각도의 LED 축에서 강도가 50% 감소했음을 의미한다.
가우시안 강도 분포를 추정시, (d < l)에 대해 표준화된 강도 분포 함수 I(θ)는 이하로 주어진다:
(39)
거리 l(m)에서 크기 d(m)의 표면 상에 투영된 전체 광력(P/P전체) 인자는 아래와 같다:
(40)
중앙에서 강도의 표면 모서리에서 강도의 비를 정의하여, 균등성-인자 H를 H=I(θ=θ최대)/I(θ=0)로 정의할 수도 있다.
(41)
여기 필터 부재시 증가하는 백그라운드
LED에서 방출된 빛의 작은 부분(도 2,4 참고)은 아크리딘 오렌지(AO)의 방출된 형광 스펙트럼 부분이다. 저 통과 필터를 사용하지 않고, 방사 빛을 형광 시그날에서 백그라운드로 검출할 수 있다. 긴-통과 또는 밴드-통과 필터(중앙 파장 550 nm 밴드 통과 30 nm가 이전 방사 구체예에서 사용됨)는 이 백그라운드를 감소시킬 수 있다. 530 nm 긴-통과 필터가 현재 방사 구체예에서 최적임이 밝혀졌다.
실행 및 시험
상기 수학적 처리는 LED의 균등 방사장을 가정하며, 이는 매우 현실적이고; LED의 구조 및 에폭시 캡슐화의 초점 성질은 가까운 범위에서(< 1 cm) 매우 변칙적인 장을 형성한다. 따라서, 최적 위치는 표면에서 ~4 mm에서 경험적으로 발견된다. 2개의 LED를 셋업에 사용하였는데, 이는 단일 LED 보다 더 균등한 방사를 형성하기 때문이다. 또한 더 큰 방사 강도에 도달할 수 있다. 본 적용에 요구되는 방사에 따라 더 많은 LED가 사용될 수 있다.
양쪽 방사 방법의 수행을 시험하기 위해, 아크리딘 오렌지 및 비형광 흡수 시료 용액을 사용하여 이들을 시험하였다. 양쪽 방법 모두에서, LED는 40 mA의 최대 추천 전류에서 유도되었다. CCD 카메라에서 출력된 강도의 측정치인 디지탈 단위의 수를 전기 에너지 소비[DU's/줄]로 나눈다. 이 수치가 시료내 AO 농도에 의존하므로, 이는 상대적 비교로 사용될 수 밖에 없다. 이미지에서 발견되는 최대 강도로 나눈 최소 강도는 %(형광 시료)로 나타낸다. 비형광 시료의 최대 강도는 DU's로 나타낸다.
양쪽 유형의 방사의 수행
방사 유형 효율(DU's/줄) 균등성(I최소/I최대*100%) 백그라운드 수치(DU's)
에피 방사 3.1*103 80.2% 10
직접 방사 3.1*103 80.5% 12
표 3에 나타낸 결과는 효율 및 균등성이 양쪽 유형의 방사 모두에서 유사한 반면, 백그라운드 수치는 다소 높다(시험된 시료의 경우 2 DU's임)는 것을 나타낸다.
기타 구체예
본 발명의 알고리즘 및 방법의 추가 예 및 응용은 자원이 부족한 경우의 세팅시 적합한 소형이고 견고하며 저비용인 시스템으로서, 정확한 세포 계산을 가능케 한다. 본 시스템의 실행은 혈액 세포의 분석을 포함하는 임상적으로 관련있는 여러 응용 분야에서 수행될 수 있으나, 여러 다른 응용들도 계획될 수 있다. 예컨대, 앞서 언급한 바와 같이, 우유내 소 백혈구의 계수(체세포 계수)는 중요한 응용분야일 수 있다. 현재 우유의 분석은 우유 시료를 특수화된 실험실로 이송해야 하며, 비싸고 시간이 소비되는 유세포 분석 시스템에 의해 수행되고 있다. 본 명세서에 서술된 분석은 현장에서 또는 종래 실험실에서 이미 수행될 수 있다.
추가적으로 폭넓게 정의된 응용에는 인간 또는 동물, 물 공급 및 대기 시료에서 박테리아, 진균 및 바이러스 병원균을 검출하는 것이 포함된다. 세포 아닌 대상들 또한 본 발명의 방법 및 알고리즘의 시스템으로, 적절한 형광 염색 시약을 이용하여 계수될 수 있다. 본 시스템은 신속한 면역검사 분석에도 이상적일 것이다. 예컨대, 분석물질(analyte)에 대해 특이적인 자기 입자는 세포에 대해 서술한 방법과 유사하게 자기 표지에 사용될 수 있다. 그 후, 형광 폴리스티렌 구슬과 같은 검출가능한 표지를 첨가한다. 자기 입자-분석물질-검출가능한 표지 복합체는 자기 표면에서 자기적으로 조작되며, 장비가 분석물질을 검출 및 계산할 수 있을 것이다.
본 발명의 장치는 유체공학 또는 펌프가 불필요하고, 밀폐된 또는 밀폐가능한 용기에서 수행되며, 소형이므로, 우주 용기 및 기타 외계 응용의 보급과 같은 낮은 g 조건 및 갇힌 공간하에서 작동이 가능하다.
앞서 서술된 바와 같은 이러한 개선을 포함하는 본 발명의 바람직한 구체예들이 상기 열거된 것들에 추가하여, 예측하지 못한 여러 분야 및 응용에 본 발명을 사용할 수 있음을 또한 밝혔다.
기타 응용
이하는 본 시스템의 일부 잠재적 응용을 나열한다.
연구: 유체내 면역학적으로 정의된 조, 예컨대, 세포 생존도, CD20, B-림프구, CD3 T-림프구, CD8 억제자 T-림프구, CD14 단구, CD83 수상 돌기 세포의 일반 세포 계수기
세포 혈액학: 백혈구 계수(CD45), 과립구 계수(CD15, 저항원 밀도에 기초한 단구 분화), 왼쪽 쉬프트(미성숙/성숙 과립구, CD64 항원 밀도에 기초), 쉬프트 망상적혈구(CD71), 선구체 세포 계수(CD34), 선구체 세포 계수(CD34)
혈액 뱅킹: 적혈구 자루내 잔여 백혈구, 루코페레시스(leukophoresis) 산물에서 선구체 세포 계수, 심장혈관 질환, 활성화된 혈소판 계수(CD62P), 내피 세포 계수(CD146)
류머티즘학: 관절 흡인물내 세포 조, 간염성 질병, CD4 계수(HIV), 타액/소변내 백혈구/내피/RBC 세포 계수, 타액/소변내 박테리아 계수
환경: 생물학적 교전제
농업: 소 유선염(우유내 백혈구)
우주 공간 프로그램: 임상 분석, 환경 분석
본 발명의 특정 구체예들이 본 명세서에 예시 및 서술되었으나, 이는 본 발명을 이러한 개시로 제한하고자 하는 것은 아니다. 하기 청구항의 범위 이내에서 변화 및 변형이 일어날 수 있다.

Claims (55)

  1. a) 생물학적 표본을 피험체에서 획득하는 단계; b) 상기 생물학적 표본내의 목표 집단을 표지하는 단계; c) 상기 표지된 목표 집단을 분리하는 단계; d) 상기 표지된 목표 집단을 함유하는 상기 생물학적 표본의 이미지를 획득하는 단계; 및 e) 상기 이미지를 분석하여 상기 표지된 목표 집단을 검출 및 계산하는 단계를 포함하는 생물학적 표본내 목표 집단의 검출 및 계산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 목표 집단의 구성원은 세포들로 구성된 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포들은 CD4+ 세포들로 구성된 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 표지하는 단계는 비특이적 형광 염료를 상기 생물학적 표본에 도입하는 단계를 포함하며, 상기 염료는 상기 목표 집단의 구성원을 표지하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 염료는 아크리딘 오렌지, 훼이스트(Hoechst) 33258, 및 훼이스트 33342로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 표지하는 단계는 상기 목표 집단의 구성원을 특이적으로 표지할 수 있는 자기 입자를 비목표 집단이 실질상 배제된 것에 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 자기 입자는 콜로이드 나노입자, 페로유체, 자기 미소구체, 및 페로자기 조밀 입자로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 자기 입자는 CD4 항원에 특이적인 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 분리 단계는 상기 목표 집단의 상기 자기적으로 표지된 구성원을 자기적으로 조작하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 자기 조작은 상기 목표 집단의 구성원을 관찰 표면에 인접하여 위치시키게 하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 관찰 표면은 기포가 상기 관찰 표면에서 부유(浮遊) 하도록 하는 수치의 각도로 둔 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 이미지 획득 단계는 CCD 카메라를 사용하여 상기 생물학적 표본의 디지탈 이미지를 포착하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 분석 단계는 상기 디지탈 이미지를 처리하기 위해 하나 이상의 알고리즘을 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 알고리즘은 시그날 대 노이즈 비를 감소하는데 사용되며, 상기 시그날은 양성적으로 표지된 상기 목표 집단의 구성원에 상응하는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 알고리즘은 시그날을 검출 및 계산하는데 사용되며, 상기 시그날은 양성적으로 표지된 상기 목표 집단의 구성원의 존재를 나타내는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 에피-방사, 직접 방사, 사선 방사 및 수직 명시야 방사로 구성된 군에서 선택된 방법으로 방사되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방사원은 LED, 레이저, 수은 아크 램프, 및 석영-할로겐 램프로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 이미지는 전체 생물학적 표본의 알려진 부분을 대표하도록 하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 부분 이미지의 분석에는 상기 목표 집단의 구성원을 계산하고, 상기 알려진 부분의 결과를 외삽법으로 추정하여 전체 생물학적 표본을 대표하도록 하는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 표본에 존재하는 비목표 집단 실체(entity)에 결합할 수 있는 미세구슬을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 미세구슬은 CD14 항원에 특이적인 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 목표 집단의 구성원에 특이적인 유리된 바이오특이적 리간드를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 유리된 바이오특이적 리간드는 항체인 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항체는 CD4 항원에 특이적인 것인 방법.
  25. a) 방사 수단; b) 이미지 획득 수단; c) 생물학적 표본을 함유하는 시료 챔버를 수용할 수 있는 자기 배열(상기 자기 배열은 추가로 상기 시료 챔버가 방사 및 이미지화 되도록 할 수 있음); d) 상기 이미지상에 하나 이상의 분석 알고리즘을 수행하기 위한 프로세서; 및 e) 결과를 디스플레이하는 출력 수단을 포함하는생물학적 표본내 목표 집단의 검출 및 계산 장치.
  26. 제25항에 있어서, 상기 방사 수단이 하나 이상의 발광 다이오드인 것인 장치.
  27. 제26항에 있어서, 상기 발광 다이오드가 470 nm의 중앙 파장에서 방출되는 것인 장치.
  28. 제25항에 있어서, 상기 이미지 획득 수단이 디지탈 카메라 및 CCD 카메라로 구성되는 군에서 선택된 것인 장치.
  29. 제25항에 있어서, 상기 시료 챔버가 투명 관찰 표면을 가지는 것인 장치.
  30. 제29항에 있어서, 상기 자기 배열이 상기 시료 챔버를 재현 가능하고 정확한 위치에 위치시킬 수 있는 것인 장치.
  31. 제29항에 있어서, 상기 자기 배열이 상기 목표 집단의 자기적으로 반응하는 구성원을 상기 관찰 표면으로 이동하는 것인 장치.
  32. 제29항에 있어서, 상기 시료 챔버가 기포가 상기 관찰 표면에서 부유하도록하는 수치의 각도로 둔 것인 장치.
  33. a) 자기 입자; b) 비특이적 형광 염료; c) 시료 챔버; 및 d) 하나 이상의 적절한 생물학적 완충액을 포함하는 생물학적 표본내 목표 집단의 검출 및 계산용 키트.
  34. 제33항에 있어서, 상기 자기 입자가 콜로이드 나노입자, 페로유체, 자기미소구체, 및 페로자기 조밀 입자로 구성된 군에서 선택된 것인 키트.
  35. 제33항에 있어서, 상기 자기 입자는 상기 목표 집단의 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 키트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 자기 입자가 CD4 항원에 특이적인 것인 키트.
  37. 제33항에 있어서, 하나 이상의 시약이 동결건조된 형태인 것인 키트.
  38. 제37항에 있어서, 상기 동결건조된 시약이 상기 시료 챔버내에 함유된 것인 키트.
  39. 제33항에 있어서, 하나 이상의 시약이 정제 형태인 것인 키트.
  40. 제33항에 있어서, 상기 시료 챔버가 투명 관찰 표면을 가지는 것인 키트.
  41. 제33항에 있어서, 상기 시료 챔버가 상기 생물학적 표본의 회수 장치로 사용되는 것인 키트.
  42. 제33항에 있어서, 상기 비특이적 형광 염료가 아크리딘 오렌지, 훼이스트 33258, 및 훼이스트 33342으로 구성된 군에서 선택된 것인 키트.
  43. 제33항에 있어서, 상기 생물학적 표본내에 존재하는 비목표 집단 실체에 결합할 수 있는 미세구슬을 추가로 포함하는 키트.
  44. 제43항에 있어서, 상기 미세구슬이 CD14 항원에 특이적인 것인 키트.
  45. 제33항에 있어서, 상기 목표 집단의 구성원에 특이적인 유리된 바이오특이적 리간드를 추가로 포함하는 키트.
  46. 제45항에 있어서, 상기 유리된 바이오특이적 리간드가 항체인 것인 키트.
  47. 제46항에 있어서, 상기 항체가 CD4 항원에 특이적인 것인 키트.
  48. 제33항에 있어서, 알려진 양의 형광 구슬을 함유하는 정상 시료 챔버를 포함하는 교정 챔버를 추가로 포함하는 키트.
  49. 제48항에 있어서, 상기 구슬이 중합체 매트릭스에 내장된 것인 키트.
  50. a) 방사 수단; b) 이미지 획득 수단; c) 생물학적 표본을 함유하는 시료 챔버를 수용할 수 있는 자기 배열(상기 자기 배열은 추가로 상기 시료 챔버가 방사 및 이미지화 되도록 할 수 있음); d) 상기 이미지상에 하나 이상의 분석 알고리즘을 수행하기 위한 프로세서; e) 결과를 디스플레이하는 출력 수단; 및 f) 재충전 가능한 전지를 포함하는 저비용, 원격 세포 분석 수행을 위한 휴대용 장치.
  51. a) 디지탈 이미지를 획득하는 단계;
    b) 상기 디지탈 이미지의 하나 이상의 부위에 템플레이트 매칭 단계를 수행하는 단계로, 상기 템플레이트 매칭 단계는 i) 상기 디지탈 이미지의 상기 부위를 패턴으로 전환하는 단계; ii) 상기 디지탈 이미지의 한 부위의 패턴을 알려진 대상의 템플레이트와 비교하는 단계(상기 알려진 대상은 상기 목표 실체와 유사하도록 선택됨); 및 iii) 상기 부위 패턴이 상기 알려진 대상 템플레이트와 매칭되는 역(threshold) 이내인 사건의 수를 계수하는 단계를 포함하는 것인 단계;
    c) 인접한 사건이 동일한 목표 실체 유래인지의 여부를 결정하는 단계; 및
    d) 목표 실체의 수를 보고하는 단계를 포함하는 목표 실체의 이미지 분석용 알고리즘.
  52. 제51항에 있어서, 단계 c)가 a) 상기 사건들 간의 거리를 측정하는 단계; 및 b) 이 거리를 역에 대해 비교하는 단계(상기 역은 목표 실체의 전형적인 크기보다 작음)를 포함하는 것인 알고리즘.
  53. 제51항에 있어서, 단계 b) 이전에, 상기 디지탈 이미지가 시그날 대 노이즈 비를 증가시키기 위해 예비 필터되는 것인 알고리즘.
  54. 제51항에 있어서, 상기 목표 실체가 형광 표지된 세포 및 형광 표지된 구슬로 구성된 군에서 선택된 것인 알고리즘.
  55. a) 환자에게서 채취한 혈액을 시료 챔버에 도입하는 단계;
    b) 상기 혈액 시료내 세포를 형광 세포 염료로 비특이적으로 표지하는 단계;
    c) 상기 혈액 시료내 존재하는 CD4+ 백혈구를 면역자기적으로 표지하는 단계;
    d) 상기 면역자기적으로 표지된 CD4+ 세포를 상기 시료 챔버의 관찰 표면 방향으로 자기적으로 조작하는 단계;
    e) 상기 혈액 시료의 이미지를 획득하는 단계; 및
    f) 상기 이미지를 분석하여 상기 CD4+ 세포 집단을 검출 및 계산하는 단계를 포함하는 HIV 양성 환자에게서 채취한 혈액 시료의 분석 방법.
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