KR20040101793A - Transgenic cloned cow producing human erythropoietin and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 유전자 도입(transfection) 및 적중(targeting) 기술과 체세포 복제 기술을 접목한 형질전환 동물(transgenic animal)을 생산하는 방법 및 이러한 방법에 의해 생산된 형질전환 동물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 형질전환 동물을 이용하여 인간 유용단백질 또는 생물의약품을 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a transgenic animal combining a transfection and targeting technique with a somatic cloning technique, and a transgenic animal produced by the method. The present invention also relates to a method for producing a human useful protein or biopharmaceutical using such a transgenic animal.
보다 구체적으로, 본 발명은 사람 에리트로포이에틴(human erythropoetin, hEPO)을 발현하는 유전자를 성숙한 소에서 유래한 체세포에 도입 및 적중시키고, hEPO를 발현하는 외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 형질전환 복제소를 생산하는 방법 및 이러한 방법에 의해 생산된 형질전환 복제소에 관한 것이다.More specifically, the present invention introduces and targets a gene expressing human erythropoetin (hEPO) into somatic cells derived from mature cows, and transfects using somatic cells into which foreign genes expressing hEPO are introduced and targeted. A method for producing a converting replica and a transformed replica produced by the method.
또한, 본 발명은 유전자 도입 및 적중 기술과 체세포 복제 기술을 접목하여 hEPO를 용이하게 얻는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 성숙한 소에서 유래한 체세포에 hEPO를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키고, 이를 체세포 복제하여 유선에서 hEPO를 발현하는 형질전환 복제소를 생산하여 소의 우유로부터 용이하게 hEPO를 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method of easily obtaining hEPO by combining gene introduction and targeting techniques with somatic cloning techniques. More specifically, the present invention introduces and targets genes expressing hEPO in somatic cells derived from mature cows, somatic cell replication to produce transgenic clones expressing hEPO in the mammary gland to easily obtain hEPO from cow's milk. It relates to a method for doing so.
에리트로포이에틴(Erythropoietin, EPO)은 태아 간이나 성인 신장에서 생성 분비되는 조혈 호르몬으로서, 적혈구계의 세포에 특이적으로 작용하며, 골수 중의 적아구계 전구세포(erythroid progenitor)의 분화와 증식을 조절하는 순환성 당단백질이다[Carnot et al., Compt. Rend., 143: 384, 1906]. EPO는 혈중 저산소 상태에서 생성이 증가하여 적혈구 세포의 생산을 조절한다. 사람은 정상적인 조직의 기능을 위해서 적정한 수준의 적혈구 수를 유지하고 있기 때문에 적혈구 수가 감소하면 조직의 기능 장애가 일어나 빈혈을 일으키게 된다.Erythropoietin (EPO) is a hematopoietic hormone produced by the fetal liver or adult kidney, which acts specifically on erythroid cells and controls the differentiation and proliferation of erythroid progenitors in the bone marrow. Circulating glycoproteins [Carnot et al., Compt. Rend., 143: 384, 1906]. EPO increases production in hypoxic states of the blood and regulates the production of red blood cells. Because humans maintain an adequate level of red blood cells for normal tissue function, a decrease in the number of red blood cells causes tissue dysfunction and causes anemia.
사람 EPO(hEPO) 유전자는 태아의 간 유전자 뱅크에서 최초로 분리되어 특성화되었으며, 1985년 이래 유전공학 분야에서 연구 목적으로 용이하게 입수할 수 있다[Jacobs et al., Nature 313: 806-809 (1985)]. hEPO 유전자는 5개의 엑손으로 구성된다. 엑손 I의 일부, 엑손 II, III 및 IV의 전부 및 엑손 V의 일부는 EPO 단백질을 암호화한다. 엑손 I 및 V의 나머지 일부는 각각 5’쪽 및 3’쪽의 비번역 서열을 암호화한다.The human EPO (hEPO) gene was first isolated and characterized in the fetal liver gene bank and has been readily available for research purposes in the field of genetic engineering since 1985 [Jacobs et al., Nature 313: 806-809 (1985). ]. The hEPO gene consists of five exons. Part of exon I, all of exon II, III and IV and part of exon V encode the EPO protein. The remaining portions of exons I and V encode untranslated sequences on the 5 'and 3' sides, respectively.
천연형 hEPO는 165개 또는 166개의 아미노산으로 구성된 단량체 당단백질로 전체 분자량이 34,000 내지 38,000 달톤 정도이며 단백질 부분의 분자량은 약 18,000 달톤인 것으로 알려져 있다[Wang et al., Endorinology, 116: 2286, 1985; Jacobs et al., 상기; and Dordal et al., Endocrinology 116: 2293-2299 (1985)]. hEPO 분자는 전체 분자의 약 40% 정도가 당으로 구성되어 있으며, 이 당쇄 부분은 EPO의 생체내 활성에 필수적인 역할을 수행한다. 따라서, EPO 분자내의 당 함량이 감소하면 혈액중 EPO 분자의 반감기가 현저히 감소하게 되고 생체내 활성이 소실되게 된다[Goto et al., Biotechnology, 6: 67, 1988]. 이러한 현상은 EPO 당쇄 말단의 시알산이 소실되면 갈락토오즈가 노출되고 노출된 갈락토오즈를 간에 존재하는 수용체가 인지하여 EPO를 흡수 후 분해함으로써 유발되는 것으로 보고되었다.Natural hEPO is a monomeric glycoprotein consisting of 165 or 166 amino acids and has a total molecular weight of 34,000 to 38,000 Daltons and a protein portion of about 18,000 Daltons [Wang et al., Endorinology, 116: 2286, 1985. ; Jacobs et al., Supra; and Dordal et al., Endocrinology 116: 2293-2299 (1985). About 40% of all molecules of the hEPO molecule are composed of sugars, and the sugar chain portion plays an essential role in the in vivo activity of EPO. Therefore, the decrease in the sugar content of the EPO molecule significantly reduces the half-life of the EPO molecule in the blood and the loss of activity in vivo [Goto et al., Biotechnology, 6: 67, 1988]. This phenomenon has been reported to be caused by the loss of sialic acid at the end of the EPO sugar chain and the galactose exposure.
천연형 hEPO는 1906년 조혈 조절 인자의 존재 가능성에 대한 연구를 통해 처음 보고되었고 1957년 에리트로포이에틴으로 명명되었다[Jacobson et al., Nature, 179: 633, 1957]. 이후 지속적인 연구의 결과, 인간 EPO는 1977년 재생불량성 환자의 뇨로부터 대량으로 분리 정제하는데 성공한 후[Miyake et al., J. Biol. Chem., 252: 5588, 1977], 연구가 본격화되기 시작하였다. EPO의 N 말단 서열은 문헌[Yanagawa et al., J. Biol. Chem., 295: 2707, 1984]에서 처음 보고되었으며, 2년 후 이의 전체 아미노산 서열이 보고되었다[Lai et al., J. Biol. Chem., 261: 3116, 1986].Native hEPO was first reported in 1906 through the study of the possible presence of hematopoietic regulators and was named erythropoietin in 1957 (Jacobson et al., Nature, 179: 633, 1957). Subsequent studies have shown that human EPO was successfully isolated and purified in large quantities from the urine of patients with aplasticity in 1977 [Miyake et al., J. Biol. Chem., 252: 5588, 1977], studies have begun in earnest. The N terminal sequence of EPO is described in Yanagawa et al., J. Biol. Chem., 295: 2707, 1984], and two years later its entire amino acid sequence was reported [Lai et al., J. Biol. Chem., 261: 3116, 1986].
재조합 및 뇨 EPO는 이들의 시알릴화의 정도에서 상이한 것으로 알려진 다양한 이소형(isoform)의 혼합물로서 분리된다. 이러한 EPO 이소형은 상이한 등전점을 가지며 등전 포커싱 또는 모세관 전기영동으로 분리할 수 있다[Taso et al., Biotech. Bioeng. 40: 1190-1196 (1992); Nieto et al., Anal. Commu, 33: 425-427, (1996); Tran et al., J. Chromatogr. 542: 459-471 (1991); Bietot et al., J. Chromatogr. 759: 177-184 (1997); and Watson et al., Anal. Biochem. 210: 389-393 (1993)]. 가장 많은 시알산을 갖는 이소형은 가장 높은 활성을 나타내며, 가장 적은 수의 시알산을 갖는 이소형은 가장 낮은 활성을 갖는다[Imai et al., Eur. J. Biochem. 194: 457-462 (1990); EP-A-0 428 267].Recombinant and urine EPO are isolated as a mixture of various isoforms known to differ in their degree of sialylation. These EPO isoforms have different isoelectric points and can be separated by isoelectric focusing or capillary electrophoresis [Taso et al., Biotech. Bioeng. 40: 1190-1196 (1992); Nieto et al., Anal. Commu, 33: 425-427, (1996); Tran et al., J. Chromatogr. 542: 459-471 (1991); Bietot et al., J. Chromatogr. 759: 177-184 (1997); and Watson et al., Anal. Biochem. 210: 389-393 (1993). Isoforms with the most sialic acid show the highest activity, and isoforms with the fewest sialic acid have the lowest activity [Imai et al., Eur. J. Biochem. 194: 457-462 (1990); EP-A-0 428 267].
hEPO는 정상인의 혈액 1ml 당 약 15 내지 30mU 또는 0.01mM의 양으로 유지되며[Garci, J. F., Lab. Clin. Med. 99, 624-635 (1982)], 재생불량성 빈혈 등의 질환이 있는 환자에서는 정상인 보다 높은 농도로 생성되어 이들의 혈액이나 뇨가hEPO의 생산에 이용되기도 하였다[White et al., Rec. Prog. Horm. Res. 16, 219 (1960); Espada et al., Biochem. Med. 3, 475 (1970); Fisher, Pharmacol. Rev. 24, 459 (1972)].hEPO is maintained in an amount of about 15-30mU or 0.01mM per ml of blood of normal subjects [Garci, J. F., Lab. Clin. Med. 99, 624-635 (1982)], in patients with disorders such as aplastic anemia, higher blood levels and urine have been used for the production of hEPO [White et al., Rec. Prog. Horm. Res. 16, 219 (1960); Espada et al., Biochem. Med. 3, 475 (1970); Fisher, Pharmacol. Rev. 24, 459 (1972).
EPO는 적혈구 세포 형성에 필수적이기 때문에, 이 호르몬은 적혈구 생성이 적거나 결핍됨을 특징으로 하는 혈액 질환의 치료에 사용할 수 있다. EPO는 신부전증의 치료 동안 또는 이로부터 기인하는 호르몬의 결핍 또는 생산 감소가 원인인 만성 빈혈의 치료에 뛰어한 잠재능을 나타냈다[Winearles et al., Lancet, 22: 1175, 1986]. 특히, 말기 신부전증 환자들은 생존을 위해 신장이식이나 정기적인 신장투석이 필요한데, 만성 신부전증 환자가 신장성 빈혈을 일으키는 가장 주된 원인은 EPO 생성의 결핍임이 입증된 바 있다[Eschbach et al., N. Engl. J. Med., 321: 158, 1989]. 따라서, 인간 EPO는 빈혈, 특히 신장성 빈혈 등의 임상적 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 그밖에, HIV-감염 환자의 AZT(Zidovudine) 치료와 관련된 빈혈, 화학치료중인 비-골수암 환자의 빈혈 등의 빈혈 치료에 EPO를 이용할 수 있다.Since EPO is essential for red blood cell formation, this hormone can be used for the treatment of blood diseases characterized by low or lack of red blood cell production. EPO has shown an excellent potential for the treatment of chronic anemia caused by deficiency or the production of hormones during or following the treatment of renal failure (Winearles et al., Lancet, 22: 1175, 1986). In particular, patients with end-stage renal failure require kidney transplantation or regular kidney dialysis to survive, and it has been proven that the main cause of renal anemia in patients with chronic renal failure is a deficiency of EPO production [Eschbach et al., N. Engl. . J. Med., 321: 158, 1989]. Therefore, human EPO can be usefully used for clinical treatment of anemia, especially renal anemia. In addition, EPO can be used to treat anemia such as anemia associated with AZT (Zidovudine) treatment in HIV-infected patients and anemia in non-myeloid cancer patients undergoing chemotherapy.
EPO의 또 다른 용도는 운동선수의 헤마토크리트(정상치: 40-45%)를 증가시킴으로써 운동선수의 동작을 향상시키기 위한 것이다. 이러한 헤마토크리트의 증대는 폐에서 운동하고 있는 골격 근육으로 이동된 산소의 용량을 증가시킨다. 생명공학에 의해 EPO를 합성한 이래, 혈액 도핑(doping)으로 알려진 바와 같이, 운동선수에게 EPO를 주사하는 것은 일반적으로 스포츠, 특히 사이클링에서 인기를 얻고 있다[Scheen, A.J., Rev. Med. Liege 53(8): 499-502, 1998].Another use of EPO is to improve athlete's behavior by increasing athlete's hematocrit (normal: 40-45%). This increase in hematocrit increases the dose of oxygen transferred from the lungs to skeletal muscles that are exercising. Since the synthesis of EPO by biotechnology, as known as blood doping, injection of EPO to athletes has generally become popular in sports, especially cycling [Scheen, A.J., Rev. Med. Liege 53 (8): 499-502, 1998].
본원에서 정의되는 바와 같은 EPO는 조혈 간 세포(stem cell)로부터 적혈구의 말단 분화를 자극하고 헤모글로빈이 생성을 자극하는 모든 분자를 의미할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 hEPO는 hEPO의 재조합 형태, hEPO의 생물학적 활성을 갖는 단백질, hEPO 이소형(isoform), hEPO 활성 단편 및 하이브리드 hEPO 단백질을 포함할 수 있으나, 바람직하게는, 본 발명의 hEPO는 재조합에 의해 발현시킨 천연형 hEPO 단백질이다.EPO as defined herein may mean any molecule that stimulates terminal differentiation of erythrocytes from hematopoietic stem cells and that hemoglobin stimulates production. For example, the hEPO of the present invention may include recombinant forms of hEPO, proteins with biological activity of hEPO, hEPO isoforms, hEPO active fragments and hybrid hEPO proteins, but preferably, hEPO of the present invention Is a naturally occurring hEPO protein expressed by recombination.
EPO는 건강한 사람의 혈장에서 매우 소량으로 생성되므로, 이러한 방식으로는 대량 제조가 불가능하다. 재생불량성 빈혈 환자의 뇨로부터 사람의 EPO의 채취가 공지되어져 있다[Miyake et al., J. Biol. Chem., 252: 5558-5564, 1977]. 그러나, 뇨로부터의 EPO의 정제는 어렵고, 정제된 생성물의 순도가 낮다는 단점이 있었다. 또한, GB-A-2085 887호는 EPO를 소량으로 생성시킬 수 있는 사람 임파아구 세포(lymphoblastoid cell)의 제조 방법을 기술하고 있으나, 이러한 방법으로는 경제적인 약물 제조가 불가능하다는 단점이 있었다.Since EPO is produced in very small amounts in the plasma of healthy people, mass production is not possible in this way. Collection of human EPO from the urine of aplastic anemia patients is known [Miyake et al., J. Biol. Chem., 252: 5558-5564, 1977. However, purification of EPO from urine is difficult and has the disadvantage of low purity of the purified product. In addition, GB-A-2085 887 describes a method for producing human lymphoblastoid cells capable of producing a small amount of EPO, but this method has a disadvantage in that it is impossible to manufacture drugs economically.
즉, 천연 공급원인 사람의 뇨로부터 정제된 천연형 EPO는 만족스러운 치료 효과를 얻기 위해서 상당한 정제 공정을 거쳐야 하며 많은 양을 얻기 어렵다는 단점이 있으므로, 생명공학 기술에 의해 재조합 EPO를 제조하는 연구들이 수행되어져 왔다. 이러한 몇몇 예들은 다음과 같다: 중국산 햄스터 난소 세포(CHO)내로 삽입하여 발현시킨 클로닝된 인간의 EPO 유전자로부터의 제조[Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al., Immunolobiol. 72: 213-224, 1986; EP-B-0 148 605 및 EP-B-0205 564]; 일차 사람 배 신장 세포에서 내인성 EPO 유전자를 상동성 재조합에 의해 바이러스 프로모터와 조작적으로 결합시켜 이러한 DNA를 이들 세포로부터 단리한 후, 단리된 DNA를 비사람 CHO 세포로 형질전환시켜 이들 세포에서 EPO 제조[WO 91/06667호]; 전체 EPO 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환시킨 사람 섬유아세포에서의 비교적 높은 생산율로 EPO 제조[WO 93/09222호]. 하지만, 이러한 방식으로 생산된 EPO의 품질과 경제성은 여전히 부족한 면이 있었다.That is, since natural EPO purified from human urine, which is a natural source, has to undergo a considerable purification process in order to obtain a satisfactory therapeutic effect and it is difficult to obtain a large amount, studies for preparing recombinant EPO by biotechnology techniques have been conducted. It has been. Some of these examples are as follows: Preparation from cloned human EPO genes inserted and expressed in Chinese hamster ovary cells (CHO) [Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al., Immunolobiol. 72: 213-224, 1986; EP-B-0 148 605 and EP-B-0205 564; In primary human embryonic kidney cells, endogenous EPO genes are operably linked to viral promoters by homologous recombination to isolate such DNA from these cells, and then to transform the isolated DNA into non-human CHO cells to produce EPO in these cells. WO 91/06667; EPO production with relatively high production rate in human fibroblasts transformed with the vector containing the whole EPO gene [WO 93/09222]. However, the quality and economics of EPO produced in this way still lacked.
또한, WO 94/12560 및 WO 95/31560호는 바이러스 프로모터에 의해 활성화된 내인성 EPO 유전자를 갖는 사람 세포를 통해 생성하는 방법을 기술하고 있으나, 생산된 양은 약제의 경제적 제조에는 여전히 불충분하였다.In addition, WO 94/12560 and WO 95/31560 describe methods for producing via human cells having endogenous EPO genes activated by viral promoters, but the amount produced is still insufficient for the economic manufacture of a medicament.
국내에서도, 세포를 형질전환시켜 재조합 EPO를 생산하는 방법들이 보고되어져 있으며, 이의 예들은 다음과 같다. 대한민국 특허 공고 제92-1379호의 경우, 고농도의 EPO를 생산하는 형질전환체를 확립하기 위해서 고안된 재조합 플라스미드 pDW-MO931로 BHK와 COS 세포를 형질전환시킨 후, 글리신, 하이포잔틴(hypoxathine) 및 티미딘이 결핍된 변형된 이글 BME(Modified Eagle's BME) 배지에서 성장시켜 재조합 EPO를 분리한 바 있다. 또한, 대한민국 특허 공고 제89-1011호 및 제93-5917호의 경우, 제조합 플라스미드 pdBPV-MMTneo를 BHK 및 COS 세포에 형질전환시켜 배양 상등액에서 재조합 EPO를 분리하였다. 또한, 대한민국 특허 제139168호는 재조합 플라스미드 pSVEP2neo를 COS-1 및 BHK 세포에 형질전환시켜 재조합 EPO 발현 세포주를 수득하였으며, 이러한 세포주의 배양을 통해 배양 상등액에서 재조합 EPO를 얻었다. 또한, 대한민국 특허 제162021호는 재조합 플라스미드 pEpoG-dhfr 및 pEpoC-dhfr을 CHO 세포에 형질전환시켜 재조합 EPO를 제조하였다. 또한, 대한민국특허 제369788호는 재조합 플라스미드 pDEP-521을 BHK 세포에 형질전환시켜 재조합 BHK 세포주를 수득하고, 이러한 세포주의 배양을 통해 배양 상등액에서 재조합 EPO를 얻었다. 그러나, 이러한 형질전환시킨 세포에서의 재조합 EPO 생산 방법은 안정하게 EPO를 제공하는데는 어려움이 있으며 그 수율에 있어서도 충분히 경제적이지는 못하였다.In Korea, methods for producing recombinant EPO by transforming cells have been reported, examples of which are as follows. In the case of Korean Patent Publication No. 92-1379, after transforming BHK and COS cells with recombinant plasmid pDW-MO931 designed to establish a transformant that produces a high concentration of EPO, glycine, hypoxathine and thymidine Recombinant EPO was isolated by growing in this deficient modified Eagle's BME medium. In addition, in Korean Patent Publication Nos. 89-1011 and 93-5917, recombinant EPO was isolated from the culture supernatant by transforming the plasmid pdBPV-MMTneo into BHK and COS cells. In addition, Korean Patent No. 139168 obtained the recombinant EPO expressing cell line by transforming the recombinant plasmid pSVEP2neo into COS-1 and BHK cells, and obtained recombinant EPO in the culture supernatant through the culture of this cell line. In addition, Korean Patent No. 162021 has prepared recombinant EPO by transforming the recombinant plasmids pEpoG-dhfr and pEpoC-dhfr into CHO cells. In addition, Korean Patent No. 369788 converts recombinant plasmid pDEP-521 into BHK cells to obtain a recombinant BHK cell line, and obtains recombinant EPO in the culture supernatant through the culture of such cell line. However, the recombinant EPO production method in these transformed cells is difficult to provide a stable EPO and was not sufficiently economical in yield.
상기된 이러한 단점들로 인해, hEPO를 안정하게 경제적으로 유용한 방식으로 대량으로 생산하기 위한 다양한 시도들이 있었다. 형질전환시킨 세포를 사용한 재조합 EPO를 생산하는 방법은 EPO 생산량을 개선시켜 왔지만, 만족스러울 만큼의 안정성과 대량 생산을 달성하지는 못하고 있으며, 보다 더 많은 EPO를 용이하게 생산하기 위한 방법들이 연구되고 있으며, 이러한 목적을 달성하기 위한 한 가지 수단으로써, EPO 형질전환 동물을 제조하여 이로부터 대량으로 EPO를 생산하고자 하는 시도가 현재 진행되고 있다.Because of these shortcomings described above, there have been various attempts to produce hEPO in large quantities in a stable and economically useful manner. The production of recombinant EPO using transformed cells has improved EPO production, but has not achieved satisfactory stability and mass production, and methods for easily producing more EPO have been studied. As one means to achieve this goal, attempts are currently underway to produce EPO transgenic animals and to produce EPO in large quantities therefrom.
국외에서는, 쿠바의 바이오테크놀로지사가 hEPO cDNA를 토끼에 도입하여 이의 유선 조직으로부터 hEPO를 발현하는 형질전환 동물을 생산하였다는 보고가 있으며, 핀란드의 회사(Kuopieogkr)사는 쥐에 hEPO cDNA를 도입하여 이의 유선에서 hEPO를 생산하는 형질전환 동물을 제조한 바 있다. 국내에서는, 등록특허공보 제10-0358754호에서 hEPO를 유선을 통해 생산하는 형질전환 돼지를 보고한 바 있으며, 공개특허공보 특2003-0009936호는 소변으로 hEPO를 생산하는 형질전환 돼지를 보고하였다. 이들 형질전환 돼지는 수정란에 EPO 발현을 위한 형질전환용 벡터를 미세주입하는 방법을 사용하여 생산되었다.Overseas, it is reported that Cuban biotechnology has introduced hEPO cDNA into rabbits to produce transgenic animals expressing hEPO from its mammary gland tissues, and a Finnish company (Kuopieogkr) has introduced hEPO cDNA into rats Has produced a transgenic animal that produces hEPO. In Korea, Korean Patent Publication No. 10-0358754 has reported a transgenic pig that produces hEPO via mammary gland, and Korean Patent Laid-Open Publication No. 2003-0009936 reported a transgenic pig that produces hEPO in urine. These transgenic pigs were produced using a method of microinjecting a transgenic vector for expression of EPO in fertilized eggs.
본 발명은 돼지 수유기 비유량(평균적으로, 약 6-9kg/일)에 비해 평균 2배 이상 높은 지속적인 비유량을 갖는 복제소(평균적으로, 약 13-18kg/일), 바람직하게는 비유량을 증대시킨 고-능력 복제소(약 21-23kg/일)를 사용하여 hEPO를 형질전환시켜 상기 복제소의 유선으로부터 hEPO를 안정하게 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 본원 이전까지는, hEPO를 생산하는 복제소에 대한 보고는 없었다.The present invention relates to a clone (with an average of about 13-18 kg / day), preferably having a continuous specific flow rate, which is at least two times higher than the pig lactation specific flow rate (average, about 6-9 kg / day). It relates to a method for the stable mass production of hEPO from the mammary gland of the clone by transforming the hEPO using an enhanced high-capacity replica (about 21-23 kg / day). Prior to the present application, there were no reports of clones producing hEPO.
유선을 통해 목적하는 단백질을 발현시키는 경우, 다른 조건들이 동일한 경우에 비유량이 많을수록 목적 단백질의 생산량도 증대될 수 있다는 것은 당해 분야의 통상적인 숙련자라면 용이하게 이해할 것이다.When expressing a protein of interest through the mammary gland, it will be readily understood by those of ordinary skill in the art that, in the case where other conditions are the same, the higher the specific flow rate, the higher the yield of the protein of interest can be increased.
따라서, 본 발명은 태아로부터 유래된 체세포에 비하여 복제 성공률을 증가시킬 수 있는 동물의 성체로부터 유래된 체세포를 이용함으로써 고-능력이 확인된 성체로부터 우수한 유전 형질을 이어받음과 동시에, 원하는 단백질, 본 발명에 있어서 hEPO 단백질을 우유 등으로부터 용이하게 얻을 수 있도록 암컷으로 확인된 것을 이용함으로써 목적하는 단백질 즉, hEPO를 안정하게 고-순도로 경제적으로 얻을 수 있는 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention uses the somatic cells derived from the adult of the animal that can increase the success rate of replication as compared to the somatic cells derived from the fetus, while inheriting excellent genetic traits from the adult with high-capacity confirmed, while the desired protein, In the present invention, a method for obtaining a desired protein, ie, hEPO, stably and economically with high purity is provided by using a female identified as a female so that the hEPO protein can be easily obtained from milk or the like.
이상과 같이, 본 발명은 유전자 도입 및 적중 기술을 이용하고 체세포 복제 기술을 접목함으로써 형질전환 동물을 생산하고 이를 이용하여 원하는 단백질을 경제적이며 고 순도로 얻을 수 있는 방법을 제공하고자 한다.As described above, the present invention intends to provide a method of producing a transgenic animal by using a gene introduction and targeting technology and incorporating somatic cloning technology and using the same to obtain a desired protein economically and with high purity.
한가지 관점으로서, 소에서 유래한 외래(exogenous) 유전자가 도입 및 적중된 체세포의 핵과 소 유래 탈핵 난모 세포가 융합된 핵 이식란을 제공하고자 한다.In one aspect, the present invention provides a nuclear transfer embryo in which a nucleus of a somatic cell in which an exogenous gene derived from a cow is introduced and targeted is fused with a bovine-derived denuclear oocyte.
다른 관점으로서, 소의 유선에서 사람 에리트로포이에틴(hEPO)을 발현하는 형질전환 복제소를 제공하고자 한다.In another aspect, one would like to provide a transgenic clone that expresses human erythropoietin (hEPO) in the bovine mammary gland.
또 다른 관점으로서, 소에서 유래한 체세포주에 hEPO을 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 성숙한 수핵 난자를 준비하는 단계; 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시키는 단계를 포함하는 소의 핵 이식란을 작제하는 방법을 제공하고자 한다.In another aspect, preparing a donor nucleus cell comprising the step of introducing and targeting a gene expressing hEPO to a somatic cell line derived from bovine; Preparing mature bovine nucleated oocytes from bovine cells comprising removing the oocytes of the nucleus pulmonary eggs and denucleating the oocytes by removing the cytoplasm including the first polar body of the nucleus pulmonary eggs; It is intended to provide a method for constructing a nuclear transfer embryo of a cow comprising the step of grafting and fusing the prepared donor nucleus cells into denuclearized eggs.
또 다른 관점으로서, 소에서 유래한 체세포주에 hEPO를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 성숙한 수핵 난자를 준비하는 단계; 및 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계; 및 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함하는 소의 유선에서 hEPO를 생산하는 형질전환 복제소의 생산방법을 제공하고자 한다.In another aspect, preparing a donor nucleus cell comprising the step of introducing and targeting a gene expressing hEPO in a somatic cell line derived from bovine; Preparing mature bovine nucleated oocytes from bovine cells comprising removing the oocytes of the nucleus pulposus and denucleating the oocytes by removing the cytoplasm including the first polar body of the nucleus pulposus; And constructing a nuclear transfer embryo by transplanting and fusing the prepared donor nuclear cell into a denucleated egg. And it is to provide a method of producing a transgenic clone that produces hEPO in the mammary gland of a cow comprising the step of transplanting the nuclear transfer egg to the surrogate mother to give birth.
또 다른 관점으로서, 소의 유선에서 hEPO를 발현하는 형질전환 복제소의 우유로부터 hEPO를 수득하는 것을 특징으로 하는 hEPO를 생산하는 방법을 제공하고자 한다.As another aspect, it is to provide a method for producing hEPO, characterized in that the hEPO is obtained from the milk of the transgenic clone expressing hEPO in the bovine mammary gland.
도 1은 본 발명의 체세포에 사람 에리트로포이에틴을 도입 및 적중시키기 위한 pGFP-EPO 플라스미드 작제도이다.1 is a pGFP-EPO plasmid construct for introducing and targeting human erythropoietin to somatic cells of the present invention.
도 2는 본 발명의 외래 유전자가 도입 및 적중된 세포의 GFP 발현을 나타낸 사진이다.Figure 2 is a photograph showing the expression of GFP cells introduced and hit the foreign gene of the present invention.
도 3은 본 발명에서 사용되는 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 수핵 난자(3)의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸 사진이다.Figure 3 is a photograph showing the process of cutting the zona pellucida of the nucleus pulposus egg (3) with a fixing pipette (1) and a cutting pipette (2) used in the present invention.
도 4는 탈핵 과정으로 고정용 피펫과 절개용 피펫으로 수핵 난자의 제1 극체와 핵을 제거하는 과정을 나타낸 사진이다.4 is a photograph showing a process of removing a first polar body and a nucleus of a nucleus pulposus with a fixing pipette and an incision pipette as a denuclearization process.
도 5는 본 발명에서 사용되는 고정용 피펫과 이식용 피펫(4)으로 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸 사진이다.Figure 5 is a photograph showing the process of transplanting somatic cells in the denuclearized egg with a fixing pipette and the transplant pipette (4) used in the present invention.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 유전자 적중 및 도입 기술과 체세포 복제 기술을 접목한다. 즉, 본 발명은 체세포 단계에서 체세포에 특정 유전자를 도입 및 적중하는 단계 및 상기 특정 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 체세포 수준에서 형질전환된 형질을 그대로 보유한 형질전환 동물을 생산하는 체세포 복제 기술을 적용하는 단계를 포함한다.In order to achieve the above object, the present invention combines gene targeting and introduction technology with somatic cell replication technology. That is, the present invention is a somatic cell replication technology for producing a transgenic animal having the transformed transformed at the somatic level using the somatic cells introduced and hit the somatic cells at the somatic stage and the somatic cells introduced and targeted. It includes the step of applying.
즉, 본 발명은 성숙한 소에서 유래한 체세포에 hEPO를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계; 상기 hEPO를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 복제소를 생산하는 단계를 포함한다.That is, the present invention comprises the steps of introducing and targeting a gene expressing hEPO in somatic cells derived from mature cattle; Producing a replica using the somatic cells into which the gene expressing the hEPO is introduced and targeted.
또한, 본 발명의 형질전환 엠브리오의 생산방법은 성숙한 소에서 유래한 체세포에 hEPO를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계 및 소의 난자를 탈핵하여 상기 hEPO를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 탈핵된 난자로 도입하는 단계를 포함한다.In addition, the method for producing a transformed embryo of the present invention comprises introducing and targeting a gene expressing hEPO to a somatic cell derived from a mature cow, and deriving a somatic cell into which the gene expressing the hEPO is introduced and targeted by denuclearizing a bovine egg. Introducing into the denuclearized egg.
또한, 본 발명의 형질전환 엠브리오 및 복제소는 hEPO를 발현하는 외래 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다.In addition, the transformed embryos and clones of the present invention are characterized in that a foreign gene expressing hEPO is inserted.
또한, 본 발명은 hEPO를 발현하는 형질전환 복제소로부터 hEPO를 용이하게 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of easily producing hEPO from a transgenic clone that expresses hEPO.
용어의 정의Definition of Terms
본 발명에 따른 특성상 본원 명세서에 사용되는 용어의 정의를 명백히 할 필요가 있다. 일반적으로는 본 발명에서 별도로 정의하지 아니한 모든 기술적 및 과학적인 관련 용어는 이 발명이 속한 기술 분야에서 통상적으로 통용되는 의미를 가진다. 그러나 다음의 용어들은 통상적인 의미를 나타내지만 그 의미를 명확히 하고 또한 본 발명의 범위를 명백히 하고자 다음과 같이 정의한다.Due to the nature of the invention it is necessary to clarify the definition of the terminology used herein. In general, all technical and scientific related terms that are not defined separately in the present invention has the meaning commonly used in the technical field to which the present invention belongs. The following terms, however, represent common meanings but are defined as follows in order to clarify the meaning and to clarify the scope of the present invention.
본원 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 EPO를 암호화하는 핵산의 삽입, 전달 또는 발현을 허용하는 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스, 레트로바이러스 또는 다른 담체를 말한다.As used herein, the term "vector" refers to a plasmid, cosmid, phage, virus, retrovirus or other carrier that allows insertion, delivery or expression of nucleic acids encoding EPO.
본원 명세서에 사용된 용어 "프로모터"는 EPO cDNA의 전사를 조절하는 조절 DNA 서열을 말한다.As used herein, the term "promoter" refers to a regulatory DNA sequence that regulates the transcription of EPO cDNA.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 어떤 생물이 원래는 지니고 있지 않은 외부 유전자를 염색체상에 인위적으로 삽입해서 그 생물의 유전적 형질 일부를 변화시키는 것이다. 형질전환의 방법은 여러 가지가 있으나 가장 많이 사용되는 방법으로는 수정란 미세주입법과 본원에서 사용된 체세포 복제법이 대표적이다.As used herein, the term “transformation” refers to altering some of the genetic traits of an organism by artificially inserting an external gene on a chromosome that the organism does not originally possess. There are many methods of transformation, but the most commonly used methods are fertilized egg microinjection and somatic cloning used herein.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환 동물(transgenic animal)"은 '유전자 이식 동물' 이라 불리우기도 하며 동물 자신이 원래 가지고 있지 않은 외래의 유전자를 재조합하여, 이를 동물의 염색체 상에 인공적으로 삽입시킴으로써 그 형질의 일부가 변화된 동물을 말한다. 따라서, 본원에서 형질전환 동물은 인간이 필요로 하는 생리활성 물질을 생산하는 생물반응기(Bioreator), 특정 질환을 유전적으로 나타내는 질환모델 동물, 인간의 이식용 장기 등을 생산할 수 있는 형질전환 동물등을 의미한다.As used herein, the term “transgenic animal” is also referred to as a “transgenic animal” by recombining a foreign gene not originally possessed by the animal and artificially inserting it on the animal's chromosome. Refers to an animal whose part of a trait has changed Accordingly, the transgenic animals herein include a bioreator producing a physiologically active substance required by a human, a disease model animal genetically representing a specific disease, a transgenic animal capable of producing an organ for human transplantation, and the like. it means.
본원 명세서에 사용된 용어 "핵 이식"은 핵이 없는 난자와 인공적으로 결합시켜 동일한 우량형질을 갖는 여러 마리의 복제동물을 생산하기 위한 유전자 조작기술을 의미한다.As used herein, the term "nuclear transplant" refers to a genetic engineering technique for artificially binding to an egg without a nucleus to produce several clones of the same superior trait.
구체적으로, 본 발명은 체세포 복제 기술을 이용하여 형질전환 동물을 생산하기 위해서 원하는 유전자를 체세포에 도입 및 적중하는 단계; 및 상기 형질전환된 체세포를 이용하여 복제 동물을 생산하는 단계로 이루어진다.Specifically, the present invention comprises the steps of introducing and targeting the desired genes in somatic cells to produce a transgenic animal using somatic cloning technology; And producing a cloned animal using the transformed somatic cells.
좀 더 구체적으로, 본 발명의 소에서 유래한 체세포주에서 hEPO를 발현하는 형질전환 복제소의 생산방법은 소에서 유래한 체세포주에 hEPO를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 성숙한 수핵 난자를 준비하는 단계; 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계; 및 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함한다.More specifically, a method of producing a transgenic clone expressing hEPO in a somatic cell line derived from a cow of the present invention includes a donor nuclear cell comprising introducing and targeting a gene expressing hEPO in a somatic cell line derived from a bovine. Preparing a; Preparing mature bovine nucleated oocytes from bovine cells comprising removing the oocytes of the nucleus pulposus and denucleating the oocytes by removing the cytoplasm including the first polar body of the nucleus pulposus; Constructing a nuclear transfer embryo by transplanting and fusing the donor nuclear cell prepared in the step into a denucleated egg; And transplanting the nuclear transfer embryo into a surrogate mother to give birth.
또한, 본 발명의 hEPO를 발현하는 유전자가 도입된 형질전환 핵 이식란의 생산방법은 성숙한 소에서 유래한 체세포에 hEPO를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함한다.In addition, the method for producing a transgenic nuclear transfer embryo into which a gene expressing hEPO of the present invention is introduced includes introducing and targeting a gene expressing hEPO to somatic cells derived from mature cattle.
또한, 본 발명의 hEPO를 생산하는 방법은 소의 유선에서 hEPO를 발현하는 형질전환 복제소의 우유로부터 hEPO를 수득하는 것을 포함한다.In addition, the method for producing hEPO of the present invention includes obtaining hEPO from the milk of a transgenic clone that expresses hEPO in bovine mammary gland.
또한, 본 발명의 형질전환 엠브리오 및 복제소는 hEPO를 발현하는 외래 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다.In addition, the transformed embryos and clones of the present invention are characterized in that a foreign gene expressing hEPO is inserted.
이하에서는, 소의 우유로부터 hEPO를 얻을 수 있는 형질전환 복제소를 생산하는 방법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명한다.Hereinafter, a method for producing a transgenic clone that can obtain hEPO from cow's milk will be described in detail by dividing step by step.
사람 에리트로포이에틴(hEPO)을 발현하는 유전자를 체세포에 도입 및 적중하여 체세포를 형질전환하는 단계Transforming somatic cells by introducing and targeting genes expressing human erythropoietin (hEPO) into somatic cells
본 발명에서는 EPO를 발현하는 유전자를 체세포에 도입하는 방법으로 생화학적 방법(biochemical method), 물리적 방법(physical method), 바이러스 매개 형질전환 방법(virus mediated transfection method) 등을 사용할 수 있다.In the present invention, a biochemical method, a physical method, a virus mediated transfection method, or the like may be used as a method of introducing an EPO-expressing gene into a somatic cell.
생화학적인 방법으로는 칼슘을 매개체로 하는 칼슘 침전법, 세포막 성분인 양이온 지질을 매개체로 하는 리포펙션(lipofection) 또는 지질은 아니지만 양전하를 지니는 폴리머(polymer)를 매개체로 하는 방법 등을 사용할 수 있는데, 이는 실험의 용이성과 효율성 및 안정성 측면에서 많이 이용되는 방법이기도 하다.Biochemical methods include calcium precipitation mediated via calcium, lipofection mediated through cationic lipids as cell membrane components, or mediated polymers that are not lipids but have positive charges. It is also a widely used method in terms of ease of experimentation, efficiency and stability.
물리적인 방법으로 일렉트로포레이션(electroporation), 유전자 총(gene gun), 세포 내 직접 미세주입법 등을 사용할 수 있다.As a physical method, electroporation, a gene gun, intracellular direct microinjection, etc. may be used.
바이러스 매개 방법으로는 아데노바이러스(adenovirus) 또는 레트로바이러스(retrovirus)의 바이러스 게놈(genome)에 원하는 DNA를 클로닝하여 세포에 감염시키는 방법이 사용될 수 있다.As a virus-mediated method, a method of infecting cells by cloning a desired DNA in the viral genome of adenovirus or retrovirus may be used.
바람직하게는, 본 발명에서는 유전자의 도입을 위한 벡터를 작제하고 생화학적인 방법으로 유전자를 도입 및 적중하는 방법을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는, 유전자의 도입을 위한 벡터를 작제하고 지질-매개 방법(lipid-mediated method)을 이용하여 hEPO를 도입 및 적중할 수 있다.Preferably, in the present invention, a method of constructing a vector for introducing a gene and introducing and targeting the gene by a biochemical method may be used. More preferably, vectors for introduction of genes can be constructed and hEPO can be introduced and targeted using a lipid-mediated method.
제1 단계: 사람 에리트로포이에틴(hEPO)을 발현하는 유전자의 도입 및 적중을 위한 벡터의 작제First step: construction of a vector for introduction and targeting of genes expressing human erythropoietin (hEPO)
본 발명에 사용되는 플라스미드들은 표준 DNA 클로닝 과정과 PCR 방법에 의해 작제된다. hEPO를 발현하는 유전자의 도입 및 적중에 있어서 사용되는 벡터를 작제하기 위한 pcDNA3는 상업적으로 시판(Invitrogen, Groningen, Netherlands)되고 있다.Plasmids used in the present invention are constructed by standard DNA cloning procedures and PCR methods. pcDNA3 for constructing vectors used in the introduction and targeting of genes expressing hEPO is commercially available (Invitrogen, Groningen, Netherlands).
hEPO를 발현하는 유전자의 도입 및 적중을 위한 벡터는 소의 유선에서 사람 유전자가 발현할 수 있도록 소 β-카세인 프로모터가 포함될 수 있다. 사람 유전자로 hEPO 유전자가 포함되고, 또한 마커 유전자가 추가로 포함될 수 있다. 마커 유전자로는 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자(GFP gene)가 사용될 수 있다.Vectors for the introduction and targeting of genes expressing hEPO may include a bovine β-casein promoter for expression of human genes in the bovine mammary gland. The human gene includes the hEPO gene, and may further include a marker gene. As a marker gene, a gene encoding a green fluorescent protein (GFP gene) may be used.
PCR 증폭으로 준비한 사람 유전자, 소 β-카세인 프로모터 및 GFP는 TA 클로닝 방법으로 벡터 내로 삽입된다.Human genes prepared by PCR amplification, bovine β-casein promoter and GFP are inserted into the vector by TA cloning method.
제2 단계: 체세포주의 확립Step 2: establish the somatic cell line
본 발명에서는 성숙한 소에서 수득하여 배양한 세포주를 공여세포로 준비한다. 이때, 소의 품종이 특별히 제한되는 것은 아니나, 한우 또는홀스타인종(Holstein)의 젖소를 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, a cell line obtained from a mature cow and cultured is prepared as a donor cell. At this time, although the breed of the cow is not particularly limited, it is preferable to use a cow of the Hanwoo cattle or Holstein species (Holstein).
소에서 수득한 세포는 소의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포, 난구세포 또는 태아 섬유아세포이며, 이들을 마더(Mather)와 바네스(Barnes)의 방법(참조: Mather & Barnes, Methods in Cell Biology, Vol.57, Animal Cell Culture Methods, Academic Press, 1998)을 응용하여 배양함으로써 세포주를 작제한다.The cells obtained from cattle are bovine uterine perfusate, endometrium, fallopian tubes, cells isolated from ears or muscles, cumulus cells or fetal fibroblasts, which are obtained by the methods of Mother and Barnes (see Mather & Barnes). , Cells in Methods, Cell Biology, Vol. 57, Animal Cell Culture Methods, Academic Press, 1998).
예를 들어, 자궁관류액에 P/S 항생제(페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)가 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하고, 원심분리하여 세척한 다음, 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 비필수 아미노산(NEAA, non-essential amino acid) 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium)에서 39℃, 5% CO2의 조건으로 배양한다.For example, phosphate buffered saline (PBS) containing P / S antibiotics (penicillin 10000 IU, streptomycin 10 mg) is added to uterine perfusate, washed by centrifugation, and then fetal bovine serum (FBS). Incubate at 39 ° C and 5% CO 2 in DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium) with non-essential amino acid (NEAA) and P / S antibiotics.
자궁내막의 일부 또는 난관으로부터 난관상피 조직을 채취하여, 상기 PBS로 세정하고, 트립신(trypsin)과 EDTA가 포함된 용액에서 정치한 다음, 이를 원심세정하고 상기한 조건에서 배양한다.Tubal epithelial tissue is collected from a portion of the endometrium or fallopian tube, washed with PBS, allowed to stand in a solution containing trypsin and EDTA, and then centrifuged and incubated under the above conditions.
난구-난모세포 복합체(cumulus-oocyte complexs)를 하이알루로니다제 (hyaluronidase)로 처리하여 난자를 둘러싸고 있는 난구 세포층을 분리하고, 난구 세포층에 상기 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심 세정하고 상기한 조건에서 배양한다.The cumulus-oocyte complexes were treated with hyaluronidase to separate the egg cell layer surrounding the egg, and the trypsin-EDTA solution was added to the egg cell layer at 39 ° C., 5% CO. After standing in a saturated humidity incubator of 2 , it is centrifuged and culture | cultivated on the conditions mentioned above.
귀의 피부 조직으로부터 채취된 연골 조직, 연한 피부 내측의 조직, 근육조직 또는 태아의 동체와 사지 부위에서 연골 조직을 포함하지 않는 부위의 조직을 세정하고 세절한 다음, 상기 트립신-EDTA 용액 및 콜라게나제(collagenase type II) 용액을 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심 세정시키고 상기한 조건에서 배양한다.The cartilage tissue collected from the skin tissue of the ear, the tissue inside the soft skin, the muscle tissue, or the tissues of the fetal body and limbs at the site of the cartilage and limbs are washed and trimmed, and then the trypsin-EDTA solution and collagenase are removed. (collagenase type II) solution was added and allowed to stand in a saturated humidity incubator at 39 ° C. and 5% CO 2 , followed by centrifugal washing and incubation under the above conditions.
이처럼 작제된 세포주는 일정 시간 간격으로 세포주의 배양액을 제거하고 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 정치한 다음, 새로운 배양액으로 교체하며 배양하는 계대 배양, 윌머트(Wilmut) 등의 방법을 응용하여 배양 중인 세포주의 배양액을 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM으로 교체하여 배양하는 혈청기아배양(참조: Wilmut et al., Nature, 385:810-813, 1997) 또는 동결보존 등의 방법을 통하여 보존하며, 보존된 세포주는 공여세포로서 제공된다.The cell lines thus constructed are cultured by applying a method such as passage culture, Wilmut, etc., which removes the culture of the cell line at regular intervals, adds trypsin-EDTA solution, and then replaces them with new ones. Cell cultures were preserved through serum starvation (Wilmut et al., Nature, 385: 810-813, 1997) or cryopreservation, or the like. Is provided as a donor cell.
제3 단계: 외래 유전자의 체세포로의 도입Step 3: Introduction of Foreign Genes into Somatic Cells
외래 유전자의 세포내로의 도입은 작제된 발현 플라스미드를 체세포 내로 도입시키는 방법으로 행한다. 외래 유전자를 세포 내로 도입시키는 방법으로는 생화학적 방법, 물리적 방법, 바이러스 매개 형질전환 방법 등을 사용할 수 있다.Introduction of the foreign gene into the cell is performed by introducing the constructed expression plasmid into the somatic cell. As a method of introducing foreign genes into cells, biochemical methods, physical methods, virus-mediated transformation methods, and the like can be used.
바람직하게는, 본 발명에서는 생화학적인 방법으로 FuGene6 (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA), 리포펙타민 플러스(LipofectAmine Plus, Life Technologies) 및 엑스진 500(ExGen 500, MBI Fermentas)을 사용할 수 있다.Preferably, in the present invention, FuGene6 (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA), Lipofectamine Plus (LipofectAmine Plus, Life Technologies), and Xgene 500 (ExGen 500, MBI Fermentas) may be used as biochemical methods.
FuGene6은 다성분 지방계 시약(multi-component lipid based reagent)으로서다양한 세포 유형에서 높은 도입 효율을 가지고 세포 독성이 없으며, 혈청 첨가 여부에 관계없이 기능을 발휘하고 최소한의 최적화 작업이 쉬운 장점을 가진다.FuGene6 is a multi-component lipid based reagent, which has high transduction efficiency in various cell types, no cytotoxicity, functions regardless of serum addition, and has an advantage of minimal optimization.
리포펙타민 플러스는 양전하 지질(cationic lipid)이며, 엑스진 500은 비지방 양전하 중합체(non lipid cationic polymer)로 여러가지 세포 타입에서 높은 효율이 보고되어 있다.Lipofectamine plus is a cationic lipid and Xgene 500 is a non lipid cationic polymer, which has been reported to have high efficiency in various cell types.
본 발명에서는 EPO 유전자의 도입 및 적중을 위하여 바람직하게는 FuGene6을 이용한다. 즉, EPO 유전자를 리포좀 형성 성분과 혼합하여 생성된 리포좀-DNA 작제물 복합체(liposome-DNA construct complex)를 세포 배양액에 첨가하여 일정시간 배양하고, 이 복합체(complex)의 DNA 작제물이 세포 내로 도입되도록 50-70% 정도 단층 증식(confluency)한 체세포에 형질감염을 실시한다. FuGene6을 통한 효과적인 도입을 위해서는 세포마다 최적 방법을 선정하고 각 변수(parameter)들을 최적화하여 유전자를 도입, EPO 발현을 극대화한다.In the present invention, FuGene6 is preferably used for introduction and hitting the EPO gene. In other words, the liposome-DNA construct complex generated by mixing the EPO gene with the liposome-forming component is added to the cell culture and cultured for a predetermined time, and the DNA construct of the complex is introduced into the cell. Transfect the somatic cells that are confluent by 50-70%. For effective introduction through FuGene6, the optimal method is selected for each cell and the parameters are optimized to maximize the expression of EPO.
구체적으로, 본 발명에서 제3 단계에서는 상기 제2 단계에서 준비된 세포주에 hEPO를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시킨다. 즉, 상기 제1 단계의 발현 플라스미드와 시약을 혼합하여 배양 배지에 함께 배양한다. 유전자의 도입 및 적중 후, 도입 및 적중된 세포를 자외선 하에서 표준 플루오레세인 이소티오사이아네이트 (Fluorescein Isothiocyanate, 이하 "FITC"라 한다) 필터 셋을 이용하여 검사한다.Specifically, in the third step of the present invention, a gene expressing hEPO is introduced and targeted to the cell line prepared in the second step. That is, the expression plasmid of the first step and the reagent are mixed and cultured together in the culture medium. After the introduction and hit of the gene, the introduced and hit cells are examined under standard ultraviolet light using a standard Fluorescein Isothiocyanate (hereinafter referred to as "FITC") filter set.
제4 단계: EPO를 발현하는 유전자가 도입된 세포의 선별, 증식 및 동결보존Fourth step: selection, proliferation and cryopreservation of cells into which genes expressing EPO are introduced
EPO 유전자가 도입된 세포의 선별은 항생제 또는 마커 유전자를 이용하여 선별한다. EPO 유전자 벡터에 이용된 양성 마커(positive marker)인 암피실린(ampicillin) 항생제에 대한 저항성 유전자는 EPO 유전자가 세포에 도입되면 저항성 유전자도 함께 발현된다.Selection of cells into which the EPO gene is introduced is selected using antibiotics or marker genes. The resistance gene for the ampicillin antibiotic, a positive marker used in the EPO gene vector, is also expressed when the EPO gene is introduced into the cell.
EPO 도입으로 세포 내로 유입된 DNA 작제물(construct)에 의해 적중된 세포는 항생제를 포함하는 배지에서 배양하면 생존하게 되고, 그 외의 세포들은 항생제의 독성에 의해 사멸되어 일정 시간 후 배양 용기에는 유전자가 적중된 세포만 증식한다. 그러므로, 전 단계에서 도입 후 정상 배양을 통해 일정 기간의 회복기가 지난 다음 EPO가 도입되지 않은 세포들은 제거하고 도입된 세포들만 선별 마커(selective marker)의 항생제를 사용하여 선별한다.Cells hit by DNA constructs introduced into the cells by introduction of EPO survive when cultured in a medium containing antibiotics, and other cells are killed by the toxicity of the antibiotics. Only the targeted cells multiply. Therefore, after a period of recovery period through normal culture after introduction at the previous stage, cells without introduction of EPO are removed and only the introduced cells are selected using antibiotics of a selective marker.
이 같은 항생제에 의한 선별은 항생제의 적정 선별 농도를 정함으로서 효과적으로 이루어지도록 한다. 세포의 종류에 따라 차이가 있으나, 적중된 세포는 하나의 세포로부터 증식을 시작하게 되므로 다음 단계의 확인을 위해서는 일정 수 이상으로 증식시켜야 한다. 항생제를 통한 선별 과정이 이루어지면 정상 배양으로 전환하고, 세포의 신속한 증식과 배양시 세포 사멸에 의한 불필요한 손실을 감소시키기 위해 적절한 성장인자와 세포사멸 억제제 등을 첨가하는 방법을 적용한다.Such antibiotic selection can be done effectively by setting the appropriate selection concentration of the antibiotic. Although there is a difference depending on the type of cells, since the target cells start to proliferate from one cell, it must be proliferated more than a predetermined number to confirm the next step. When antibiotics are screened, they switch to normal culture and apply appropriate growth factors and apoptosis inhibitors to reduce the unnecessary loss of cells by rapid proliferation and cell death.
또한, 마커 유전자로 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자인 GFP 유전자를 이용하여 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. EPO 유전자의 도입으로 세포 내로 유입된 DNA 작제물로 적중된 세포는 GFP 유전자에 의해 현미경 하에서 자외선 필터를 이용하여 관찰하면서 초록색을 띄는 세포만을 선별한다.In addition, transformed cells may be selected using the GFP gene, which is a gene encoding a green fluorescent protein as a marker gene. Cells hit with DNA constructs introduced into cells by the introduction of the EPO gene are selected only for cells that are green while observing with a UV filter under a microscope by the GFP gene.
GFP 유전자 도입 세포의 증식 배양 및 동결 보존은 전술한 항생제 선별 및 GFP 발현유무로 선별한 형질전환 세포를 대상으로 한다. 핵 이식용 세포로 사용할 세포는 선별된 하나의 세포로부터 증식시키며, 특히 섬유아세포는 다수의 세포로 증식되기까지 상당한 시간이 소요되고 세포가 노화되어 증식이 둔화되면서 성장을 멈추기 때문에, 단 시간 내 건강한 다수의 적중된 세포를 배양해야 한다. 증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위하여 각 단계마다 동결 보존한다. 특히 소수의 세포를 동결 보존하여 융해했을 때 생존성과 핵이식 시 핵공여 세포로서의 안정성에 적합토록 해야 한다.Proliferation culture and cryopreservation of GFP transgenic cells are for transformed cells selected with the antibiotic selection and GFP expression as described above. Cells to be used for nuclear transplantation proliferate from a single cell selected, especially fibroblasts take a considerable amount of time to multiply into a large number of cells. Many targeted cells must be cultured. Cryopreservation is performed at each step for efficient preservation of proliferation cultured cells. In particular, when a small number of cells are cryopreserved and fused, they should be suitable for viability and stability as a donor cell during nuclear transfer.
외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포의 핵 이식을 통한 형질전환 복제란 및 형질전환 복제 동물을 생산하는 단계Producing transgenic cloned eggs and transgenic cloned animals through nuclear transfer of somatic cells into which foreign genes have been introduced and targeted
본 발명에서는 형질전환 복제소를 생산하기 위한 방법으로 동물복제 기술을 이용할 수 있다. 상기 단계의 외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포의 형질을 동물 복제 기술을 이용하여 복제되는 산자에 그대로 발현되도록 함으로써 모자이크 현상(Mosaicism)이 없는 100% 형질전환 복제소를 효율적으로 생산할 수 있다.In the present invention, an animal cloning technique may be used as a method for producing a transgenic clone. The trait of the somatic cell introduced and hit by the foreign gene of the above step can be expressed as it is in the reproduced litter using animal cloning technology, thereby efficiently producing 100% transgenic clones without mosaicism.
본 발명에서의 체세포 복제 기술은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 국제특허출원 PCT/KR00/00707 "체세포 복제동물 및 그 생산 방법"(황 등, 2000.6.30)의 기술을 이용할 수 있다. 즉, 체세포 핵이식은 탈핵 과정(enucleation)을 통해 미수정란으로부터 유전 물질(genetic material)을 포함한 핵을 제거하고 다른 체세포의 핵(nucleus)을 주입함으로써 이루어진다. 또한이렇게 생산된 엠브리오(embryo)를 '재구성된 엠브리오(reconstructed embyro)'라고 하고, 이 핵이식된 재구성된 엠브리오를 체외 배양하여 발육시켜 대리모에 이식하여 체세포 복제 동물을 생산한다.The somatic cloning technique in the present invention may use the technique of the international patent application PCT / KR00 / 00707 "Somatic clone animal and its production method" (Hwang et al., 2000.6.30), which the inventor of the present invention has already filed. That is, somatic cell nuclear transfer is performed by removing nuclei including genetic material from unfertilized eggs through enucleation and injecting nucleus of other somatic cells. The embryo thus produced is called 'reconstructed embyro', and the nuclear transplanted reconstituted embryo is cultured in vitro to be transplanted into a surrogate mother to produce somatic clones.
제1 단계: 수핵 난자의 준비 및 생체 외 성숙First step: preparation and in vitro maturation of nucleated pulmonary eggs
소의 난소에서 미성숙 난자를 채취 및 배양하여 성숙한 수핵 난자를 준비한다. 헤페스(HEPES, N-[hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]) 완충용액에 TCM199 (Tissue Culture Medium 199)가 용해된 세정용 TCM199 배지에서 채취된 미성숙 난자를 선별한 후, 5% CO2의 조건 하에 16 내지 22시간 동안 배양하여 난자를 성숙시킨다.Immature oocytes are harvested from the ovaries of the ovary and cultured to prepare mature nucleated ova eggs. After screening immature eggs collected from TCM199 medium for washing with TCM199 (Tissue Culture Medium 199) dissolved in Hepes (HEPES, N- [hydroxyethyl] piperazine-N '-[2-ethanesulfonic acid]), 5 The eggs are matured by incubating for 16-22 hours under the condition of% CO 2 .
이때, 사용되는 배양액은 TCM, 나트륨-피루브산 및 P/S 항생제가 포함된 배양용 TCM199 배양액에 에스트라디올(estradiol, E2), 난포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone) 및 소 태아 혈청을 포함한다.At this time, the culture medium used includes estradiol (E2), follicle stimulating hormone (FSH, follicle stimulating hormone) and fetal bovine serum in TCM199 culture medium containing TCM, sodium-pyruvic acid and P / S antibiotics.
제2 단계: 수핵 난자의 탈핵Second stage: denucleation of the nucleus pulposus
상기 제1 단계에서 준비된 성숙한 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 수핵 난자의 투명대의 일부를 절개하고 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵된 난자를 작제한다.After removing the cumulus cells of the mature nucleated pulmonary oocytes prepared in the first step, a portion of the zona pellucida of the nucleated nucleus pulposus is cut and the cytoplasm including the first polar body is removed to construct denucleated eggs.
먼저, 성숙한 수핵 난자를 하이알루로니다제가 용해된 세정용 TCM199 배양액에 넣고 난구 세포를 물리적으로 제거한 후, 세정용 TCM199 배양액으로 세정한다. 그런 다음, 난구 세포가 제거된 난자를 사이토칼라신 B(cytochalasin B) 용액으로 옮기고, 미세작업장치(micromanipulator)를 이용하여 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 난자의 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 양의 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵시킨다. 이어, 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고 배양용 TCM199 배양액에 정치시킨다. 이때 사용되는 사이토칼라신 B 용액은 사이토칼라신 B를 DMSO(dimethylsulfoxide)에 용해시키고 이를 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 희석한 것이다.First, the mature nucleated pulmonary egg is placed in a washing TCM199 culture solution in which hyaluronidase is dissolved, and the egg cells are physically removed, followed by washing with the washing TCM199 culture solution. Then, the oocytes from which the oocytes were removed were transferred to cytochalasin B solution, and the incision was formed by incision of the zona pellucida using a micromanipulator to form an incision. The cytoplasm containing the first polar body in an amount corresponding to 10 to 15% is removed and denuclearized. Subsequently, the denucleated eggs are washed with the washing TCM199 culture and left in the culture TCM199 culture. The cytocalin B solution used at this time is dissolved in cytoscalin B in DMSO (dimethylsulfoxide) and diluted with a washing TCM199 culture solution added with fetal bovine serum.
자외선 하에서 Hoechst 33342(Sigma Co.)로 염색된 세포질체를 관찰함으로써 탈핵을 확인할 수 있다.Denucleation can be confirmed by observing cytoplasm stained with Hoechst 33342 (Sigma Co.) under ultraviolet light.
제3 단계: 공여핵 세포의 준비Step 3: Preparation of Donor Nucleus Cells
공여핵 세포의 준비를 위해 상기에서 형질전환된 세포를 PBS에서 세척한다. 그 후, 단일 세포 현탁을 위해 0.1% 트립신-EDTA를 사용하여 배양된 세포들을 트립신 처리한다. 세포들을 펠릿화하고 0.5% (v/v) FBS가 포함된 200㎕ PBS에서 재현탁화시키고 핵 이식에 사용하기 전에 마이크로원심관으로 옮긴다.The cells transformed above are washed in PBS for preparation of donor nucleus cells. The cells incubated with 0.1% trypsin-EDTA for single cell suspension are then trypsinized. Cells are pelleted and resuspended in 200 μl PBS with 0.5% (v / v) FBS and transferred to microcentrifuge prior to use for nuclear transfer.
제4 단계: 공여핵 세포와 수핵 난자의 융합 및 활성화Step 4: Fusion and Activation of Donor Nucleus Cells and Nucleated Eggs
상기에서와 같이 준비된 형질전환된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고, 이식된 핵 이식란을 전기융합을 통해 활성화시킨다.The transformed donor nucleus cells prepared as above are transplanted into denuclearized eggs, and the transplanted nuclear transfer embryos are activated through electrofusion.
먼저, 형질전환된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 작제한다. 배양용 TCM199 배양액에 정치된 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고 PHA-P(phytohemagglutinin) 용액으로 이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여핵 세포를 PHA-P 용액에 있는 난자의 투명대에 형성된 절개창으로 주입시켜서 핵 이식란을 작제한다. 이어, 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고 정치시킨다. 이때, 사용되는 PHA-P 용액은 PHA-P를 세정용 TCM199 배양액에 용해시킨 것이다.First, nuclear donor cells are constructed by transplanting transformed donor nuclear cells into denuclearized eggs. The denucleated eggs left in the culture TCM199 culture are washed with the washing TCM199 culture and transferred to a PHA-P (phytohemagglutinin) solution, and then a donor pipette is used to transfer the donor nucleus cells to the zona pellucida in the PHA-P solution. Nuclear transplant embryos are constructed by injecting them into the formed incision. Subsequently, it is washed with a washing TCM199 culture solution and left to stand. At this time, the PHA-P solution used is to dissolve the PHA-P in the washing TCM199 culture.
상기 정치된 핵 이식란을 세포 조작기를 이용하여 전기융합시킨다. 먼저, 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액이 첨가된 만니톨(mannitol) 용액에 넣고 이를 세포 조작기에 연결시킨 2개 전극 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣은 다음, 공여세포가 (+)전극을 향하도록 핵 이식란을 위치시킨다. 그런 다음, 전압은 0.75 내지 2.00kV/cm, 시간은 10㎲ 내지 20㎲, 횟수는 0.01 내지 10초 간격으로 1회 내지 5회의 조건으로 직류전류를 통전하여 핵 이식란을 전기융합시킨다. 융합된 핵 이식란을 만니톨 용액과 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고, 전기 사이토칼라신 B 용액에서 정치한 후 활성화시킨다. 이때, 사용하는 만니톨 용액은 HEPES 완충용액에 MgSO4또는 MgCl2, BSA 및 만니톨이 용해된 pH 7.2 내지 7.4의 용액으로서 Ca2+가 포함되어 있다면 융합과 동시에 활성화되지만, Ca2+가 포함되어 있지 않다면 활성화시키는 과정을 수행한다.The standing nuclear transfer embryos are electrofused using a cell manipulator. First, the nuclear transfer embryos are placed in a mannitol solution to which the washing TCM199 culture solution is added, and then in a mannitol solution divided between two electrodes connected to a cell manipulator, and the nuclear transfer eggs are directed to the (+) electrode. Locate it. Then, the voltage is 0.75-2.00 kV / cm, the time is 10 kV to 20 kV, and the number of times is 1 to 5 times in the condition of 0.01 to 10 seconds, the current flows through the DC current to fusion the nuclear transfer egg. The fused nuclear transfer eggs are rinsed with mannitol solution and washing TCM199 culture solution and left in the cytokinecin B solution before activation. At this time, the mannitol solution used is a solution of pH 7.2 to 7.4 in which MgSO 4 or MgCl 2 , BSA, and mannitol are dissolved in HEPES buffer, and Ca 2+ is activated at the same time as fusion, but does not contain Ca 2+ . If not, perform the activation process.
Ca2+가 포함되지 않은 만니톨 용액을 사용하여 세포 융합을 수행한 경우, 활성화시키는 과정은 융합된 핵 이식란을 암실에서 이오노마이신(ionomycin) 용액에 정치하여 활성화시킨 후, 소 태아 혈청 또는 BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 세척하고 정치하여 이오노마이신을 제거한다. 이때, 이오노마이신 용액은 DMSO에 이오노마이신을 용해시켜서 원액을 만들고 사용할 때, BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 희석하여 사용한다.When cell fusion was performed using a mannitol solution containing no Ca 2+ , the activating process involves activating the fused nuclear transfer embryos by placing them in an ionomycin solution in the dark, and then applying fetal bovine serum or BSA. Washed with the added washing TCM199 culture and left to remove ionomycin. At this time, the ionomycin solution is used by diluting with the washing TCM199 culture solution added with BSA when dissolving ionomycin in DMSO to make a stock solution.
제5 단계: 핵 이식란의 후 활성화 및 체외 배양Stage 5: Post-activation and in vitro culture of nuclear transfer eggs
성화된 핵 이식란을 후 활성화시킨 후 체외 배양한다. 소 태아 혈청 또는 BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액에 정치된 활성화된 핵 이식란을 사이클로헥시미드(cycloheximide) 용액 또는 디엠에이피(DMAP, 4-dimethylaminopurine) 용액에 침지하여 배양하여 후 활성화시킨 다음, 체외 배양용 배지에서 5% CO2배양기 또는 5% CO2, 7% O2, 88% N2배양기를 사용하여 배양한다.The activated nuclear transplanted eggs are then activated and cultured in vitro. Activated nuclear transfer embryos, which were left in fetal calf serum or BSA-containing washable TCM199 culture, were immersed in cycloheximide solution or DMP (4-dimethylaminopurine) solution for cultivation, and then activated in vitro. Incubate in a culture medium using a 5% CO 2 incubator or 5% CO 2 , 7% O 2 , 88% N 2 incubator.
이때, 사이클로헥시미드 용액은 에탄올에 사이클로헥시미드를 용해시킨 용액으로서 체외 배양용 배지에 첨가하여 사용하고, DMAP 용액은 DMAP를 체외배양용 배지에 용해시켜 사용한다. 또한, 체외 배양용 배지는 NaCl, KCl, NaHCO3, NaH2PO4, CaCl2, Na-락테이트, 포도당, 페놀 레드, BSA, 카나마이신(kanamycin), 필수 아미노산(EAA, essential amino acid), 비필수 아미노산(NEAA, non-essential aminoacid), 글루타민 등을 포함하는 mSOF 배지(참조: 표 1)를 사용한다.At this time, the cycloheximide solution is a solution in which cycloheximide is dissolved in ethanol and added to the in vitro culture medium, and the DMAP solution is used by dissolving DMAP in the in vitro culture medium. In addition, in vitro culture medium is NaCl, KCl, NaHCO 3 , NaH 2 PO 4 , CaCl 2 , Na-lactate, glucose, phenol red, BSA, kanamycin, essential amino acid (EAA), essential MSOF medium (see Table 1) containing essential amino acids (NEAA, non-essential aminoacid), glutamine and the like is used.
선택적으로, 상기의 체외 배양된 핵 이식란을 동결 보존한 후, 필요한 때에 이를 융해시켜서 사용할 수도 있다. 핵 이식란을 동결할 경우, 먼저 동결할 수정란을 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 세정하고, P/S 항생제, CaCl2, 포도당, MgCl2, Na-피루베이트 및 PBS를 포함하는 동결액에 넣은 다음, 온도를 천천히 저하시킨 후, 액체 질소로 동결시킨다.Alternatively, the in vitro cultured nuclear transfer embryos may be cryopreserved and then melted and used when necessary. When freezing nuclear transfer eggs, the first embryos to be frozen are washed with PBS added with fetal bovine serum, and then placed in a freezing solution containing P / S antibiotic, CaCl 2 , glucose, MgCl 2 , Na-pyruvate and PBS. The temperature is slowly lowered and then frozen with liquid nitrogen.
이처럼 동결된 핵 이식란을 융해시킬 때는 액체질소에서 꺼낸 핵 이식란을 상온에서 일정기간 동안 정치했다가 온수에 넣어 융해시킨다. 융해된 핵 이식란을 글리세롤, 자당, BSA 및 PBS가 포함된 융해용 배지에 넣고, 글리세롤의 양이 많은 배지에서 적은 배지로 차례대로 정치시켜서 핵 이식란 내의 동결액을 제거한다.When the frozen nuclear transplanted eggs are fused, the nuclear transplanted eggs taken out of liquid nitrogen are allowed to stand at room temperature for a certain period of time before being melted in hot water. The fused nuclear transfer embryos are placed in a melting medium containing glycerol, sucrose, BSA, and PBS, and then, in a medium containing a large amount of glycerol, are allowed to settle in a small medium in order to remove the freezing liquid in the nuclear transfer embryos.
상기의 방식으로, 성숙한 홀스타인종의 소에서 유래한, hEPO가 형질전환된 체세포를 공여핵 세포로 하여 제조한 핵 이식란을 SNU-B4로 명명하여, 이를 2003년 3월 26일자로 국제기탁기관인 생명공학연구소(KRIBB) 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 10450BP로 기탁하였다.In this way, a nuclear transfer embryo prepared from a donor nuclear cell with hEPO-transformed somatic cells derived from a cow of mature Holstein species was named SNU-B4, which was established on March 26, 2003, as an international depository institution. It was deposited with KCTC 10450BP at the KRIBB Gene Bank (KCTC, 52 Eun-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea).
제6 단계: 형질전환 복제소의 출산Step 6: Childbirth of Transgenic Clones
상기의 체외 배양된 핵 이식란을 대리모에 이식하여 송아지를 생산할 수 잇다. 이때, 핵 이식란은 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적된 상태로 대리모의 자궁에 이식된다.The ex vivo cultured nuclear transfer embryos may be transplanted into surrogate mothers to produce calves. At this time, the nuclear transfer egg is implanted in the surrogate mother's womb in a state of being deposited in PBS to which fetal bovine serum is added.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples according to the gist of the present invention.
<실시예 1><Example 1>
사람 에리트로포이에틴(hEPO)을 발현하는 유전자의 도입 및 적중을 위한 벡터의 작제Construction of a vector for the introduction and targeting of genes expressing human erythropoietin (hEPO)
중합효소 연쇄반응(PCR)Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR은 사이키(Saiki) 등(1985)에 의해 처음으로 사용된 것의 변형 방법으로 수행되었다. PCR 증폭은 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM dNTP(Takara Shuzo, Japan), 50 pmol의 업스트림 및 다운스트림 프라이머 및 2.5 유니트(unit)의 TaKaRaTA Taq 폴리머라제(Takara)를 포함하는 50㎕ 반응 혼합물 내에서 10ng의 주형(template)과 함께 33 내지 49 사이클(cycle) 동안 수행되었다.PCR was performed as a modification of the first used by Saiki et al. (1985). PCR amplification was performed with 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 1 mM dNTP (Takara Shuzo, Japan), 50 pmol of upstream and downstream primers and 2.5 units of TaKaRaTA Taq polymerase. (Takara) was performed for 33 to 49 cycles with 10 ng of template in 50 μl reaction mixture.
반응 사이클은 94℃에서, 30초간 변성(denature), 55℃에서 33초간 어닐링(annealing), 72℃에서 90초간 연장(extension) 및 72℃에서 15분간 마지막 연장(final extension)시키는 과정으로 수행되었다.The reaction cycle was carried out with denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 55 ° C. for 33 seconds, extension at 72 ° C. for 90 seconds and final extension at 72 ° C. for 15 minutes. .
발현 플라스미드 작제Expression Plasmid Construction
모든 플라스미드들은 표준 DNA 클로닝 과정(Maniatis 등, 1982) 및 PCR 방법에 의해 작제되었다. 벡터를 작제하기 위한 pcDNA3는 Invitorgen(Groningen,Netherlands)으로부터 구입하였다. p베타(pbeta)3.7 플라스미드를 위한 3.7kb의 소 베타 카세인 프로모터는 주형으로 다음의 소의 게놈(genomic) DNA를 사용하여 PCR 증폭으로 제조하였다.All plasmids were constructed by standard DNA cloning procedures (Maniatis et al., 1982) and PCR methods. PcDNA3 for constructing the vector was purchased from Invitorgen (Groningen, Netherlands). The 3.7 kb bovine beta casein promoter for the pbeta 3.7 plasmid was prepared by PCR amplification using the following bovine genomic DNA as a template.
정방향 프라이머(서열번호 1):Forward primer (SEQ ID NO: 1):
GTCGGTACCAACATGT CGAATCCATCTCTATCAATTAATGTAATTGTCGGTACCAACATGT CGAATCCATCTCTATCAATTAATGTAATT
역방향 프라이머(서열번호 2):Reverse primer (SEQ ID NO: 2):
GACGGATCCT CATTATCTCAATTCCAGGGAATGGGAAGATGAGGAGACGGATCCT CATTATCTCAATTCCAGGGAATGGGAAGATGAGGA
상기에서 제조된 소 베타 카세인 프로모터는 pcDNA3의 kpnI-BamHI 부위에 삽입되었다. 또한, pGFP-EPO 플라스미드의 작제를 위한 hEPO 유전자(서열번호 3)는 주형으로 사람 게놈 DNA로 PCR 증폭 제조하여 p베타 3.7벡터의 XhoI-ApaI 부위에 삽입하였다. 또한, 주형으로 pEGFP-N1 벡터(Clontech)로 PCR 증폭하여 제작한 GFP ORF의 SmaI-BstBI 단편을 삽입하여 pGFP-EPO를 작제하였다. 모든 작제된 플라스미드는 시퀀싱 키트(U.S. Biochemical Co.)를 사용하여 DNA 시퀀싱에 의하여 확인하였다.The bovine beta casein promoter prepared above was inserted into the kpnI-BamHI site of pcDNA3. In addition, the hEPO gene (SEQ ID NO: 3) for constructing the pGFP-EPO plasmid was PCR amplified by human genomic DNA as a template, and inserted into the XhoI-ApaI site of the pbeta 3.7 vector. In addition, pGFP-EPO was constructed by inserting a SmaI-BstBI fragment of GFP ORF prepared by PCR amplification with a pEGFP-N1 vector (Clontech) as a template. All constructed plasmids were confirmed by DNA sequencing using the sequencing kit (U.S. Biochemical Co.).
pGFP-EPO의 작제도는 도 1에서와 같다. 즉, 도 1은 소 β-카세인 프로모터, hEPO 유전자(1471bp), 암피실린 저항 유전자 및 마커 유전자로 녹색 형광 단백질 암호화 유전자(green fluorescent protein encoding gene, 이하 "GFP" 유전자라 한다)를 포함하는 벡터의 특징을 나타내는 개략도이다. PCR 증폭으로 준비한 사람 유전자(hEPO), 소 β-카세인 프로모터 및 GFP는 TA 클로닝 방법으로 pGFP 플라스미드 벡터 내로 삽입되었다. 발현 플라스미드의 XhoI 및 ApaI 부위로 원하는 유전자 등이 올바르게 삽입되었는지를 분석하기 위해 제한효소로 절단하여 아가로즈 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)하였다.The construction of pGFP-EPO is as in FIG. That is, Figure 1 is a characteristic of a vector comprising a green fluorescent protein encoding gene (hereinafter referred to as a "GFP" gene) as a bovine β-casein promoter, hEPO gene (1471bp), ampicillin resistance gene and marker gene It is a schematic diagram showing. The human gene (hEPO), bovine β-casein promoter and GFP prepared by PCR amplification were inserted into the pGFP plasmid vector by TA cloning method. Agarose gel electrophoresis was cut with restriction enzymes to analyze whether the desired genes were correctly inserted into the XhoI and ApaI sites of the expression plasmid.
뉴클레오티드 서열 분석(Nucleotide sequencing)Nucleotide sequencing
뉴클레오티드 서열은 디데옥시 체인 종결 방법(dideoxy chanin termination method)에 의해 확인되었다(Sanger 등, 1997). 서열은 35S-dATP (800 Ci/mmol, Amersham)을 삽입하여 시쿼나제(sequenase)로 분석되었다. DNA는 완충-구배(buffer-gradient) 또는 전해질-구배(electrolyte-gradient) 방법을 사용하여 6% PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리되었다. 모든 서열분석 방법은 제조원(US Biochemicals)에 의해 제공되는 서열분석 키트(Sequencing kit)의 안내문에 따라 수행되었다.Nucleotide sequences have been identified by the dideoxy chanin termination method (Sanger et al., 1997). The sequence was analyzed by sequenceinase by inserting 35S-dATP (800 Ci / mmol, Amersham). DNA was isolated by 6% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) using either buffer-gradient or electrolyte-gradient methods. All sequencing methods were performed according to the instructions of the sequencing kit provided by US Biochemicals.
<실시예 2><Example 2>
체세포주의 확립Establishment of somatic cells
먼저, 소의 귀에서 채취한 피부 내측의 조직을 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco BRL, Life Technologies, USA)로 세정하고 100 메시(mesh)의 크기로 세절한 다음, 이를 상기 인산염 완충 식염수에 넣고 0.25% 트립신, 1mM EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) 및 1mg/㎖ 콜라게나제(collagenase type II)를 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에 1시간 동안 정치시킨 후, 원심 세정시킨다. 그런 다음, 10% 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 1% 비필수 아미노산 용액 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium, Gibco BRL, Life Technologies, USA) 배양액에서 부유시키고, 이를 세포 배양용 디쉬로 옮겨 39℃, 5% CO2의 조건하에 포화습도 배양기 내에서 배양하여, 세포주를 수득하였다. DMEM에서 배양 중인 세포주를 0.5% 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM에서 7일간 배양한 다음, 배지를 제거하고 0.25% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 2분간 정치시켰다. 그런 다음, 1% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 재부유시켜서 세포의 수가 2000개/0.1㎖가 되도록 조절하고, 이를 에펜돌프(eppendorf) 시험관에 분주하여 공여 세포를 준비하였다.First, the tissue inside the skin collected from the cow's ear was washed with phosphate buffered saline (PBS, Gibco BRL, Life Technologies, USA) and cut into 100 mesh sizes, which was then placed in the phosphate buffered saline and 0.25%. Trypsin, 1 mM EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) and 1 mg / ml collagenase type II were added to stand for 1 hour in a 39 ° C., 5% CO 2 saturated humidity incubator and then centrifuged. It was then suspended in Dulbecco's modified Eagles medium, Gibco BRL, Life Technologies, USA (DMEM) culture with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% non-essential amino acid solution and P / S antibiotic, It was transferred to a cell culture dish and cultured in a saturated humidity incubator under conditions of 39 ° C. and 5% CO 2 to obtain a cell line. Cell lines incubated in DMEM were incubated for 7 days in DMEM with 0.5% fetal calf serum, and then allowed to stand for 2 minutes by removing the medium and adding 0.25% trypsin, 1 mM EDTA solution. Then, the cells were resuspended in PBS added with 1% fetal bovine serum to adjust the number of cells to 2000 / 0.1 ml, which were dispensed into eppendorf test tubes to prepare donor cells.
<실시예 3><Example 3>
사람 에리트로포이에틴(hEPO) 유전자의 도입 및 적중을 통한 체세포의 형질전환Somatic cell transformation through introduction and targeting of human erythropoietin (hEPO) gene
작제된 pGFP-EPO 발현 플라스미드를 FuGene6(Cat. No. 1814443; Roche Molucular Biochemicals, IN, USA)을 사용하는 지질-매개 방법(lipid-mediated method)으로 공여핵 세포 내로 삽입하였다.The constructed pGFP-EPO expressing plasmids were inserted into donor nucleus cells by a lipid-mediated method using FuGene6 (Cat. No. 1814443; Roche Molucular Biochemicals, IN, USA).
세포들은 형질전환 전 1일 동안 2차 배양되었다. 세포들은 35㎜ 디쉬에서 2㎖당 1~3 ⅹ 105세포의 수로 플레이팅(plating)하고, 50~80%의 컨플런시(confluency)에 도달할 때까지 밤새 배양되었다. 그 후, pGFP-EPO 발현 플라스미드는 실험자 프로토콜에 따른 FuGene6을 사용하여 세포주 내로 삽입되었다. 간단히 말해서, pGFP-EPO 유전자 (1㎍) + 형질전환 시약(3㎍) + DMEM(96㎕)의 혼합물을 상온에서 15분간 배양한 후에 배양 배지 상에 오버레이(overlay)하였다.Cells were secondary cultured for 1 day before transformation. Cells were plated in a number of 1-3 3 10 5 cells per 2 ml in a 35 mm dish and incubated overnight until a confluency of 50-80% was reached. The pGFP-EPO expressing plasmids were then inserted into the cell line using FuGene6 according to the experimenter protocol. In brief, a mixture of pGFP-EPO gene (1 μg) + transformation reagent (3 μg) + DMEM (96 μl) was incubated at room temperature for 15 minutes and then overlayed on the culture medium.
<실시예 4><Example 4>
사람 에리트로포이에틴(hEPO)을 발현하는 유전자가 도입된 세포의 선별, 증식 및 동결보존Selection, proliferation and cryopreservation of cells into which genes expressing human erythropoietin (hEPO) have been introduced
사람 EPO 유전자를 도입시킨 세포주는 항생제 또는 GFP의 발현을 관찰함으로써 선별하였다. 유전자 적중시 DNA 작제물(DNA construct)에 이용된 양성 마커인 암피실린 등 항생제에 대한 저항성 유전자는 세포 내에서 재조합이 정확하게 이루어지면 저항성 유전자 및 GFP 유전자가 발현된다.Cell lines into which the human EPO gene was introduced were selected by observing the expression of antibiotics or GFP. Genes that are resistant to antibiotics, such as ampicillin, a positive marker used in DNA constructs, are expressed in the gene when resistance and GFP genes are expressed correctly.
본 발명에는 암피실린(ampicillin) 항생제를 통한 선별 과정이 이루어졌으며 3-4일 간격으로 3주간 선별하였다. 또한, 형질전환 2일 후에 형질전환된 각 세포를 자외선 하에서 표준 플루오레세인 이소티오사이아네이트(FITC; 여기 파장: 450-490 ㎚; B-mode filter, Nikon, Japan) 필터 셋을 사용하여 검사하여 GFP의 발현 여부를 검사하여 형질전환된 세포를 선별하였다(도 2).In the present invention, a screening process was performed using ampicillin antibiotics and screening was performed for 3 weeks at 3-4 day intervals. In addition, each cell transformed 2 days after the transformation was tested using a standard fluorescein isothiocyanate (FITC; excitation wavelength: 450-490 nm; B-mode filter, Nikon, Japan) filter set under ultraviolet light. Transformed cells were selected by examining the expression of GFP (FIG. 2).
전술한 항생제 선별 또는 GFP 발현 여부로 유전자 적중이 확인된 사람 EPO 유전자가 도입된 세포는 핵 이식용 세포로 증식 배양하였다. 특히, 섬유아세포는 다수의 세포로 증식되기까지 상당한 기간이 소요되고 점차 세포가 노화되어 증식이둔화되면서 성장을 멈추기 때문에 단시간 내 건강한 다수의 적중된 세포를 배양하는 것이 관건이다. 암피실린 항생제 선별 후 세포들은 하나의 집락(colony)으로 자라게 되는데 이를 트립신으로 처리하여 96-웰(96-well)의 배양용기로 옮겨 배양 한 후 이들이 증식되면 이후 24-웰로 옮겨 배양하고 더 나아가서 12-웰과 6-웰까지 증식 배양을 실시하였다.The cells into which the human EPO gene was identified, which had been identified by the antibiotic selection or GFP expression, were grown and cultured as cells for nuclear transfer. In particular, it is important to cultivate a large number of healthy hit cells in a short time because fibroblasts take a considerable time to multiply to a large number of cells and gradually stop growing as the cells age and proliferate. After the selection of ampicillin antibiotics, the cells grow into a colony, which is treated with trypsin and transferred to a 96-well culture vessel, and when they multiply, they are transferred to 24-well culture and further 12- Proliferation cultures were performed to wells and 6-wells.
증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위하여 각 단계마다 동결 보존하였다. 특히 소수의 세포를 동결 보존하여 융해했을 때 생존성과 핵이식시 핵 공여 세포로서의 안정성에 적합하도록 해야 한다.Cryopreservation was carried out at each step for efficient preservation of proliferation cultured cells. In particular, a small number of cells should be cryopreserved to be compatible with viability and stability as nuclear donor cells during nuclear transfer.
<실시예 5>Example 5
수핵 난자의 준비Preparation of nucleus ganglia
도축장에서 채취된 소의 난소로부터 18G 주사침(needle)이 장착된 10㎖ 주사기를 사용하여 직경 4mm 내외의 난포를 흡입한 다음, 1cm 간격의 격자 눈금을 그은 100mm 디쉬에 난포를 옮긴 후, 난구 세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 균질한 난자를 선별하였다.A 10 ml syringe equipped with an 18G needle was used to inhale follicles around 4 mm in diameter from a cow's ovary collected at a slaughterhouse, and then the follicle cells were transferred to a 100 mm dish with a grid scale of 1 cm. Oocytes attached and homogeneous cytoplasm were selected.
선별된 난자를 세정용 TCM199 배양액(참조: 표 2)이 2㎖씩 분주된 35mm 디쉬에서 3회에 걸쳐 세정하고, 배양용 TCM199 배양액(참조: 표 3)으로 최종적으로 세정한 다음, 에스트라디올(estradiol) 용액(참조: 표 4) 0.5㎕, 난포자극호르몬 용액(참조: 표 5) 12.5㎕, 배양용 TCM199 배양액 450㎕ 및 10% 소 태아 혈청이 포함된 배지에서 5% CO2의 조건하에 20시간 동안 배양하여 수핵 난자를 준비하였다.Selected eggs were washed three times in a 35 mm dish in which 2 ml of a washing TCM199 culture (see Table 2) was dispensed, and finally washed with a culture TCM199 culture (see Table 3), and then estradiol ( estradiol) solution (see Table 4) 0.5 μl, follicle stimulating hormone solution (see Table 5) 20 μl in medium containing 5 μl CO 2 in medium containing 450 μl of TCM199 culture medium and 10% fetal bovine serum The nucleus pulmonary egg was prepared by incubating for a time.
<실시예 6><Example 6>
체세포의 핵 이식Nuclear Transplantation of Somatic Cells
상기 실시예 5에서 준비된 수핵 난자를 세정용 TCM199 배양액에서 1회 세정하고, 5㎖의 세정용 TCM199 배양액에 하이알루로니다제(hyaluronidase, Sigma Chemical Co., USA) 0.0500g을 용해시킨 용액 111㎕과 세정용 TCM199 배양액 1㎖을 혼합하여 최종 농도를 0.1%로 적정한 하이알루로니다제 용액 내에 난자를 옮긴 다음, 난구 세포를 제거하고 세정용 TCM199 배양액에서 3회 세정하고 정치시켰다. 이어, 7.5mg/㎖의 농도가 되도록 DMSO에 사이토칼라신 B(cytochalasin B, Sigma Chemical Co., C-6762, USA)를 용해시킨 용액 1㎕와 10% 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 TCM199 배양액 1㎖을 혼합한 사이토칼라신 B 용액으로 난자를 옮기고, 미세작업장치(micromanipulator, Narishige, Japan)를 사용하여 정치된 수핵 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 량의 난자의 세포질을 제거함으로써 난자를 탈핵시켰다.111 μl of a nucleated nucleus prepared in Example 5 was washed once in a washing TCM199 culture solution and 0.0500 g of hyaluronidase (hyaluronidase, Sigma Chemical Co., USA) was dissolved in a 5 ml washing TCM199 culture solution. The oocytes were transferred into a hyaluronidase solution with a final concentration of 0.1% by mixing 1 ml of the washed TCM199 culture solution, and then the oocytes were removed, washed three times in the washed TCM199 culture medium, and allowed to stand. Then, a washing TCM199 culture solution containing 1 μl of a solution in which cytocarcin B (cytochalasin B, Sigma Chemical Co., C-6762, USA) was dissolved in DMSO and 10% fetal bovine serum was added to a concentration of 7.5 mg / ml. Transfer the egg to 1 ml of mixed cytoscalin B solution, incision by using a micromanipulator (Narishige, Japan) to cut the zona pellucida of the nucleated nucleus of the nucleus pulposus to form an incision, through which 10 to 10 of the whole cytoplasm The egg was denuclearized by removing the cytoplasm of the egg corresponding to 15%.
좀 더 구체적으로 탈핵과정을 설명하면, 작업용 디쉬를 미세작업장치의 미세작업판(micromanipulator plate) 위에 놓고, 미세작업장치의 왼쪽 암(arm)에는 고정용 피펫을, 오른쪽 암에는 절개용 피펫을 장착하였다. 그런 다음, 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고 절개용 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 피펫 조정기를 중립에 놓아 피펫이 상하 좌우로 자유롭게 움직일 수 있도록 조정하였다. 두 피펫을 작업용 미소적에서 상하 유동시키면서, 피펫이 디쉬의 테두리에 닿지 않도록 각도를 조정하고, 피펫 끝을 미소적의 중앙에 위치시켰다. 내경 200㎛ 이상의 세정용 마우스 피펫을 이용하여 세정용 TCM199 배양액에서 난자를 사이토칼라신 B 용액으로 이동시켰다. 이어, 미세작업장치의 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자에 먼저 초점을 맞추고, 2개의 피펫을 상하로 움직여 초점을 조정하였다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용 피펫의 12시 방향에 제1 극체(the first polar body)가 위치하도록 하고, 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤, 유압을 걸어 난자를 고정시켰다.In more detail, the denuclearization process is performed by placing a working dish on a micromanipulator plate of a microworking machine, a fixing pipette on the left arm of the microworking device, and an incision pipette on the right arm. It was. Then, the fixing pipette was positioned at 9 o'clock and the incision pipette was placed at 3 o'clock. The pipette adjuster was placed in neutral to adjust the pipette to move freely up, down, left and right. The two pipettes were flowed up and down in the working micro drop, angled so that the pipette did not touch the rim of the dish and the pipette tip was positioned in the center of the micro drop. Using a washing mouse pipette with an inner diameter of 200 μm or more, the eggs were transferred to a cytocalacin B solution from the washing TCM199 culture solution. Then, using the coarse and fine screws of the micro-working device, the eggs were first focused, and the two pipettes were moved up and down to adjust the focus. Two pipettes were moved to position the first polar body at the 12 o'clock position of the fixing pipette, and the fixing pipette was brought into close contact with the o'clock position at 9 o'clock.
도 3은 고정용 피펫과 절개용 피펫으로 수핵 난자의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 절개용 피펫(2)을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 후, 세포질에 손상을 가하지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시켰다. 고정용 피펫(1)에 압력을 걸어 난자(3)를 분리하고, 절개용 피펫이 통과한 제1 극체 상단부의 투명대에 고정용 피펫을 접촉시킨 다음, 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개하였다.Figure 3 shows the process of cutting the zona pellucida of the nucleus pulposus with a fixing pipette and an incision pipette. As shown in Fig. 3, the incision pipette 2 was stabbed at 1 o'clock and passed through the zona pellucida, and then penetrated to 11 o'clock with care not to damage the cytoplasm. The oocyte 3 was separated by applying a pressure to the fixing pipette 1, and the fixing pipette was contacted with the transparent zone of the upper end of the first polar body through which the cutting pipette passed, and then the two pipettes were rubbed to cut the transparent zone.
도 4는 수핵 난자의 제1 극체와 핵을 제거하는 탈핵 과정을 나타낸다. 도 4에서 보듯이 난자(3)를 회전시켜 절개창을 수직으로 위치시키고, 고정용 피펫(1)을 난자의 밑 부위에 위치시켜 난자가 아래쪽으로 움직이지 못하도록 지지한 다음, 절개용 피펫(2)을 난자의 위에서 가볍게 눌러 난자를 탈핵시켰다. 이처럼 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 3회 세정하고, 배양용 TCM199 배양액에 정치시켰다.4 shows the denuclearization process of removing the first polar body and nucleus of the nucleus pulposus egg. As shown in FIG. 4, the incision window is vertically positioned by rotating the egg 3, and the fixing pipette 1 is positioned at the bottom of the egg to support the egg from moving downward, and then the incision pipette 2. The egg was denuclearized by pressing lightly on the egg. The denucleated eggs were washed three times with the washing TCM199 culture and left in the culture TCM199 culture.
그런 다음, 미세작업장치를 사용하여 탈핵된 수핵 난자에 준비된 공여 세포를 이식하였다. 먼저, 5mg의 PHA-P(phytohemagglutinin)를 10㎖의 세정용 TCM199배양액에 용해시킨 용액 100㎕과 400㎕의 세정용 TCM199 배양액을 혼합한 PHA-P 용액으로 작업용 디쉬 상단 중앙에 4㎕의 이식용 미소적을 만들고, 1% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 이식용 미소적 위 아래에 각각 1개씩의 4㎕의 공여세포 미소적을 만들었다. 이들 미소적을 미네랄 오일로 도포한 후, 작업용 디쉬를 미세작업판에 위치시켰다.The donor cells were then transplanted into denucleated nucleated ovules using a microworking instrument. First, 4 μl of PHA-P (Phytohemagglutinin) dissolved in 10 ml of wash TCM199 culture solution and 100 μl of PHA-P solution mixed with 400 μl of wash TCM199 culture solution was used. Microparticles were made and 4 μl of donor cell microparticles, one each above and below the microfibers for transplantation, were made with PBS with 1% fetal bovine serum. After applying these microparticles with mineral oil, the working dish was placed on the microworking board.
미세작업장치에 장착된 절개용 피펫을 이식용 피펫으로 교체한 후, 정치된 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 3회 세정하고, 이식용 미소적으로 이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여세포를 이식용 미소적으로 이동시켰다.After replacing the incision pipette mounted in the microworking device with the transplant pipette, the settled denucleated eggs were washed three times with the washing TCM199 culture solution, and then transferred to the transplant microscopically, and then donated using the transplant pipette. The cells were transferred microscopically for transplantation.
도 5는 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 탈핵된 난자(3)의 절개창을 양 피펫과 1시 방향으로 놓고 고정용 피펫(1)으로 고정한 다음, 이식용 피펫(4)을 절개창으로 주입하고, 유압으로 공여세포를 주입하여 핵 이식란을 작제하였다. 이처럼, 작제된 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액으로 옮겨서 3회 세정 후, 정치시켰다.5 shows a process for transplanting somatic cells into denuclearized eggs. As shown in Figure 5, the incision of the denuclearized egg (3) with the two pipettes in the 1 o'clock direction and fixed with a fixing pipette (1), and then implanted pipette (4) into the incision, hydraulically donor cells The nuclear transfer embryos were constructed by injection. Thus, the constructed nuclear transfer embryos were transferred to the washing TCM199 culture solution, washed three times, and allowed to stand.
<실시예 7><Example 7>
세포 융합 및 활성화Cell fusion and activation
BTX-세포 조작기(electro cell manipulator, ECM 2001, BTX, USA)를 사용하여 핵 이식란을 전기 융합하여 활성화시켰다.Nuclear transplanted eggs were activated by electrofusion using a BTX-cell manipulator (electro cell manipulator, ECM 2001, BTX, USA).
0.5mM HEPES 완충용액(pH 7.2)에 0.1mM MgSO4, 0.05% BSA 및 0.28M만니톨(mannitol)을 용해시킨 만니톨 용액 15㎕을 세정용 마우스 피펫으로 핵 이식란이 있는 세정용 TCM199 배양액에 첨가하고, 1분간 정치시켰다. 그런 다음, 세정용 마우스 피펫을 이용하여 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액이 첨가된 만니톨 용액에 주입하여 다시 1분간 정치시키고, 세정용 마우스 피펫을 이용하여 핵 이식란을 만니톨 용액에 넣었다. 이어, 핵 이식란을 BTX-세포 조작기에 연결시킨 2개 전극(3.2mm chamber No. 453) 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣고, 공여 세포가 (+) 전극을 향하도록 핵 이식란을 위치시켰다. 전압은 0.75kV/cm 내지 2.00kV/cm, 시간은 10㎲ 내지 20㎲, 횟수는 0.01초~10초 간격으로 1~5회의 조건에서 직류전류를 통전하여 핵 이식란을 전기융합시켰다. 융합된 핵 이식란을 만니톨 용액을 거쳐 세정용 TCM199 배양액으로 옮긴 후, 3회 세정하였다.15 μl of mannitol solution dissolved in 0.1 mM MgSO 4 , 0.05% BSA, and 0.28 M mannitol in 0.5 mM HEPES buffer (pH 7.2) was added to a washing TCM199 culture with nuclear transfer eggs using a washing mouse pipette, Let stand for 1 minute. Then, the nuclear transfer egg was injected into the mannitol solution to which the washing TCM199 culture solution was added using a washing mouse pipette, and allowed to stand for another minute, and the nuclear transfer egg was put into the mannitol solution using the washing mouse pipette. The nuclear transfer eggs were then placed in a mannitol solution dispensed between two electrodes (3.2 mm chamber No. 453) connected to a BTX-cell manipulator, and the nuclear transfer eggs were placed so that the donor cells face the positive electrodes. The nuclear transfer embryos were electrofused by applying a DC current at a voltage of 0.75 kV / cm to 2.00 kV / cm, a time of 10 kV to 20 kV, and a frequency of 1 to 5 times at 0.01 to 10 second intervals. The fused nuclear transfer embryos were transferred to rinsing TCM199 culture via mannitol solution and washed three times.
DMSO 1.34㎖에 이오노마이신(ionomycin, Sigma Chemical Co., USA) 1mg을 용해시키고, 최종 농도가 5M이 되도록 1% BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액을 첨가하여 제조된 이오노마이신 용액에 융합된 핵 이식란을 암 조건에서 4분간 정치하여 활성화시킨 후, 융합된 핵 이식란을 10% 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 배지가 분주된 35mm 디쉬 내에서 5분간 정치시켜서 이오노마이신을 제거하였다.Ionomycin (ionomycin, Sigma Chemical Co., USA) in 1.34 ml of DMSO After dissolving 1 mg, the nuclear transfer embryos fused to an ionomycin solution prepared by adding a washing TCM199 culture solution containing 1% BSA to a final concentration of 5M were activated for 4 minutes under dark conditions, and then fused nuclei. The transplanted eggs were allowed to stand for 5 minutes in a 35 mm dish dispensed with 10% fetal bovine serum and the wash medium to remove ionomycin.
<실시예 8><Example 8>
융합된 핵 이식란의 후 활성화 및 배양Post-Activation and Culture of Fusion Nuclear Transplanted Eggs
에탄올 100㎖에 사이클로헥시미드(cycloheximide, Sigma Chemical Co., USA) 1g을 용해시키고, 최종 농도가 10㎍/㎖가 되도록 체외배양용 배지인 mTALP(참조:표 1)와 혼합한 사이클로헥시미드 용액 25㎕에 전기 활성화된 핵 이식란을 침지하고, 4시간 동안 배양하여 후 활성화시켰다. 그런 다음, 검란하여 선별된 핵 이식란을 mTALP에 넣고, 5% CO2배양기에서 7일간 배양하였다.1 g of cycloheximide (Sigma Chemical Co., USA) was dissolved in 100 ml of ethanol, and cyclohexim was mixed with mTALP (see Table 1), an in vitro culture medium, to obtain a final concentration of 10 µg / ml. 25 μl of the mid solution was immersed in the electroactivated nuclear transfer eggs, incubated for 4 hours and then activated. Then, the nuclear transfer embryos, which were screened for selection, were placed in mTALP and incubated for 7 days in a 5% CO 2 incubator.
본 발명자들은 상기 실시예에 따라 제조한 핵 이식란을 SNU-B4로 명명하여, 이를 2003년 3월 26일자로 국제기탁기관인 생명공학연구소(KRIBB) 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 10450BP로 기탁하였다.The present inventors named the nuclear transfer embryos prepared according to the above example as SNU-B4, and as of March 26, 2003, KRIBB Gene Bank (KCTC, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon Metropolitan City, Korea) as of March 26, 2003 Deposited with KCTC 10450BP.
<실시예 9>Example 9
핵 이식란의 동결보존, 융해 및 이식Cryopreservation, Thawing and Transplantation of Nuclear Transplanted Eggs
상기 핵 이식란을 장기간 보존하기 위하여, 동결 보존을 수행하였다. 먼저, 동결용 배지(참조: 표 6 및 표 7)를 35mm 디쉬에 분주하고, 동결기를 가동하여 -5℃를 유지시킨 다음, 동결할 핵 이식란을 선발하여 10% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 세정하고 동결용 배지에 넣어 20분간 정치시켰다. 이어, 0.25㎖ 스트로우(straw)의 양 끝단에 공기층을 2층씩 만들어 가운데에 수정란이 포함된 동결용 배지를 흡입하여 수정란을 장착하고, 가열한 집게(forcep)를 사용하여 열 밀봉(heat sealing)하였다. 그런 다음, -5℃에서 동결기에 스트로우를 장착하고, 5분간 이 온도를 유지시킨 다음 액체질소로 예냉한 집게로 스트로우의 하단을 살짝 집어주어 식빙(seeding)시켰다. 식빙한 직후, -0.3℃/min의 속도로 -30℃까지 온도를 하강시킨 다음 -30℃가 되면 10분간 온도를 유지시키고, 이를 액체질소 탱크에서 동결 보존하였다.To preserve the nuclear transfer embryos for a long time, cryopreservation was performed. First, freezing medium (see Tables 6 and 7) was dispensed into 35 mm dishes, the freezer was run to maintain -5 ° C, and then nuclear transfer eggs to be frozen were selected and added to PBS with 10% fetal bovine serum. It was washed and placed in a freezing medium and allowed to stand for 20 minutes. Subsequently, two layers of air were formed at each end of a 0.25 ml straw, and a fertilized egg was mounted by inhaling a medium for fertilization containing a fertilized egg in the middle, and heat sealed using a heated forcep. . The straw was then placed in the freezer at -5 ° C, held at this temperature for 5 minutes, and then seeded by slightly picking the bottom of the straw with forceps precooled with liquid nitrogen. Immediately after the ice, the temperature was lowered to −30 ° C. at a rate of −0.3 ° C./min, and then maintained at −30 ° C. for 10 minutes, which was cryopreserved in a liquid nitrogen tank.
이처럼 동결보존한 핵 이식란을 융해시키기 위하여, 먼저 20% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS와 융해용 배지를 35mm 디쉬에 3㎖씩 분주하고, 각각에 글리세롤을 첨가하여 포함된 글리세롤 농도가 0%, 3% 및 6%가 되도록 제조하였다(참조: 표 6 및 표 8). 그런 다음, 액체질소 탱크로부터 동결된 스트로우를 꺼내 공기 중에서 5초간 노출시킨 후, 직경 20cm 이상인 용기에 담겨진 30℃의 온수에 30초간 담가서 융해시켰다. 이어, 무균적으로 스트로우의 양 끝단 공기층을 절단하여, 스트로우내의 배지를 디쉬에 밀어내고, 현미경하에서 수정란을 확인한 다음, 차례대로 핵 이식란을 6% 글리세롤의 융해용 배지에서 5분간 정치하고, 3% 글리세롤의 융해용 배지에서 5분간 정치하며, 글리세롤이 없는 융해용 배지에서 5분간 정치시킴으로써, 핵 이식란에 함유된 동결용 배지를 제거하였다.In order to thaw the cryopreserved nuclear transfer embryos, first, 3 ml of PBS with 20% fetal bovine serum and a fusion medium were added to a 35 mm dish, and glycerol was added to each of the glycerol concentrations of 0% and 3, respectively. Prepared to be% and 6% (see Tables 6 and 8). Then, the frozen straw was removed from the liquid nitrogen tank, exposed for 5 seconds in air, and then immersed in 30 ° C warm water for 30 seconds in a container having a diameter of 20 cm or more for melting. Subsequently, the air layers at both ends of the straw are aseptically cut, the medium in the straw is pushed into a dish, the fertilized eggs are identified under a microscope, and the nuclear transfer eggs are in turn allowed to stand for 5 minutes in a 6% glycerol melting medium, and 3% The freezing medium contained in the nuclear transfer embryos was removed by standing still for 5 minutes in the glycerol melting medium and 5 minutes in the glycerol free melting medium.
<실시예 10><Example 10>
핵 이식란의 대리모에의 이식Transplantation into surrogate mother of nuclear transfer egg
상기 핵 이식란을 20% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적시키고, 이를 스트로우에 장착한 다음, 대리모의 자궁각내 심부에 이식하였다.The nuclear transfer eggs were immersed in PBS added with 20% fetal bovine serum, mounted in straw, and then implanted into the uterine core of the surrogate mother.
<실시예 11><Example 11>
사람 에리트로포이에틴(hEPO) 유전자를 발현하는 복제소의 산자 생산 및 산자의 유전자 확인Sanitary Production and Gene Identification of Clones Expressing Human Erythropoietin (hEPO) Gene
상기의 실시예를 통해 생산된 형질전환 복제소는 육안적 방법 및 분자생물학적 방법으로 유전자 분석을 하였다. hEPO 유전자가 도입된 GFP 발현 복제소는 외견관찰 및 조직을 이용한 서던 블랏(Southern blot), 웨스턴 블랏(Western Blot) 및 세포배양을 통하여 GFP 발현 및 hEPO 유전자 도입을 분석하였다.The transgenic clones produced in the above examples were analyzed by gene method and macrobiological method. GFP expressing clones into which the hEPO gene was introduced were analyzed for GFP expression and hEPO gene introduction by Southern blot, Western blot and cell culture using observing and tissue.
육안적 관찰로 GFP의 발현 유무를 육안적으로 GFP 산자의 피부조직, 구강조직, 혀 등을 관찰하여 초록빛이 관찰되는지를 조사하였다. 분자생물학적 검사로 서던 블랏으로 산자의 게놈 DNA를 분석하였으며 웨스턴 블랏으로 산자 조직의 단백질을 분석하여 사람 EPO를 발현하는 복제소임을 확인하였다.By visual observation, the presence of GFP was visually observed by examining the skin tissue, oral tissue, and tongue of GFP litter, to see if green light was observed. Genomic DNA of the litter was analyzed by Southern blot and molecular blot was analyzed by Western blot, and the protein of the litter tissue was analyzed by Western blot.
이후, 산자의 조직을 실시예 2의 방법으로 배양하여 세포주를 확립한 후 현미경의 자외선 필터를 이용하여 GFP 단백질의 발현 여부를 분석하였다. 또한, 분자생물학적 방법인 서던 블랏으로 복제소의 DNA를 분석하여 hEPO를 발현하는 복제소임을 확인하였다.Subsequently, the tissues of the litter were cultured by the method of Example 2 to establish a cell line, and then analyzed for expression of GFP protein using a UV filter under a microscope. In addition, the DNA of the clone was analyzed by Southern blot, a molecular biological method, to confirm that the clone expresses hEPO.
<실시예 12><Example 12>
공여핵 세포의 종류에 따른 형질전환 핵 이식란의 발육률 및 발현율Development and Expression Rate of Transgenic Nuclear Transfer Cells According to the Type of Donor Nucleus Cells
상기의 실시예와 동일한 과정을 공여핵 세포를 달리하여 형질전환 이식란의 발육률 및 발현율을 비교하였다. 3개의 세포주로 40~50일령의 태아에서 유래한 소 태아의 섬유아세포, 성숙한 소의 귀 섬유아세포 및 성숙한 소의 난구 세포를 사용하였다.In the same procedure as in the above example, the growth rate and expression rate of the transgenic embryos were compared using different donor nuclear cells. Three cell lines were used: fibroblasts from fetuses from 40 to 50-day-old fetus, ear fibroblasts from mature cows, and cumulus cells from mature cows.
준비된 3개의 세포주에 hEPO를 도입 및 적중하고, 외래 유전자가 도입 및 적중된 세포를 탈핵 난자와 융합하여 발생되는 경과를 살펴보았다. 그 결과는 다음의 표 9 및 표 10에 나타내었다.HEPO was introduced into and targeted to the three prepared cell lines, and a process generated by fusion of denuclear eggs with foreign genes introduced and targeted was examined. The results are shown in Tables 9 and 10 below.
상기의 결과로부터 태아 섬유아세포보다는 성숙한 소로부터 유래한 난구 세포 또는 귀 섬유아세포를 핵 공여세포로 한 경우에 배반포에서의 발현율이 높고, 또한 엠브리오의 임신 성공률이 높다는 것을 알 수 있었다.From the above results, it was found that the expression rate in blastocysts and the pregnancy success rate of Embryos were high when ovarian cells or ear fibroblasts derived from mature cows were nuclear donors rather than fetal fibroblasts.
본 발명은 체세포에 외래 유전자를 도입 및 적중하는 기술 및 체세포 복제 기술을 접목함으로써 복제 동물로부터 생물의약품을 경제적이며 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for economically and efficiently producing a biopharmaceutical from a cloned animal by incorporating a technique of introducing and targeting a foreign gene into somatic cells and somatic cloning technology.
<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Transgenic cloned cow producing human erythropoietin and method for producing the same <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 1 gtcggtacca acatgtcgaa tccatctcta tcaattaatg taatt 45 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 2 gacggatcct cattatctca attccaggga atgggaagat gagga 45 <210> 3 <211> 1471 <212> DNA <213> Homo sapiens, synthetic sequence <220> <223> Human erythropoietin genomic DNA sequence <400> 3 gtcctggaga ggtacctctt ggaggccaag gaggccgaga atatcacggt gagacccctt 60 ccccagcaca ttccacagaa ctcacgctca gggcttcagg gaactcctcc cagatccagg 120 aacctggcac ttggtttggg gtggagttgg gaagctagac actgcccccc tacataagaa 180 taagtctggt ggccccaaac catacctgga aactaggcaa ggagcaaagc cagcagatcc 240 tacggcctgt gggccagggc cagagccttc agggaccctt gactccccgg gctgtgtgca 300 tttcagacgg gctgtgctga acactgcagc ttgaatgaga atatcactgt cccagacacc 360 aaagttaatt tctatgcctg gaagaggatg gaggtgagtt cctttttttt tttttttcct 420 ttcttttgga gaatctcatt tgcgagcctg attttggatg aaagggagaa tgatcggggg 480 aaaggtaaaa tggagcagca gagatgaggc tgcctgggcg cagaggctca cgtctataat 540 cccaggctga gatggccgag atgggagaat tgcttgagcc ctggagtttc agaccaacct 600 aggcagcata gtgagatccc ccatctctac aaacatttaa aaaaattagt caggtgaagt 660 ggtgcatggt ggtagtccca gatatttgga aggctgaggc gggaggatcg cttgagccca 720 ggaatttgag gctgcagtga gctgtgatca caccactgca ctccagcctc agtgacagag 780 tgaggccctg tctcaaaaaa gaaaagaaaa aagaaaaata atgagggctg tatggaatac 840 attcattatt cattcactca ctcactcact cattcattca ttcattcatt caacaagtct 900 tattgcatac cttctgtttg ctcagcttgg tgcttggggc tgctgagggg caggagggag 960 agggtgacat gggtcagctg actcccagag tccactccct gtaggtcggg cagcaggccg 1020 tagaagtctg gcagggcctg gccctgctgt cggaagctgt cctgcggggc caggccctgt 1080 tggtcaactc ttcccagccg tgggagcccc tgcagctgca tgtggataaa gccgtcagtg 1140 gccttcgcag cctcaccact ctgcttcggg ctctgggagc ccaggtgagt aggagcggac 1200 acttctgctt gccctttctg taagaagggg agaagggtct tgctaaggag tacaggaact 1260 gtccgtattc cttccctttc tgtggcactg cagcgacctc ctgttttctc cttggcagaa 1320 ggaagccatc tcccctccag atgcggcctc agctgctcca ctccgaacaa tcactgctga 1380 cactttccgc aaactcttcc gagtctactc caatttcctc cggggaaagc tgaagctgta 1440 cacaggggag gcctgcagga caggggacag a 1471<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Transgenic cloned cow producing human erythropoietin and method for producing the same <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 1 gtcggtacca acatgtcgaa tccatctcta tcaattaatg taatt 45 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 2 gacggatcct cattatctca attccaggga atgggaagat gagga 45 <210> 3 <211> 1471 <212> DNA Homo sapiens, synthetic sequence <220> <223> human erythropoietin genomic DNA sequence <400> 3 gtcctggaga ggtacctctt ggaggccaag gaggccgaga atatcacggt gagacccctt 60 ccccagcaca ttccacagaa ctcacgctca gggcttcagg gaactcctcc cagatccagg 120 aacctggcac ttggtttggg gtggagttgg gaagctagac actgcccccc tacataagaa 180 taagtctggt ggccccaaac catacctgga aactaggcaa ggagcaaagc cagcagatcc 240 tacggcctgt gggccagggc cagagccttc agggaccctt gactccccgg gctgtgtgca 300 tttcagacgg gctgtgctga acactgcagc ttgaatgaga atatcactgt cccagacacc 360 aaagttaatt tctatgcctg gaagaggatg gaggtgagtt cctttttttt tttttttcct 420 ttcttttgga gaatctcatt tgcgagcctg attttggatg aaagggagaa tgatcggggg 480 aaaggtaaaa tggagcagca gagatgaggc tgcctgggcg cagaggctca cgtctataat 540 cccaggctga gatggccgag atgggagaat tgcttgagcc ctggagtttc agaccaacct 600 aggcagcata gtgagatccc ccatctctac aaacatttaa aaaaattagt caggtgaagt 660 ggtgcatggt ggtagtccca gatatttgga aggctgaggc gggaggatcg cttgagccca 720 ggaatttgag gctgcagtga gctgtgatca caccactgca ctccagcctc agtgacagag 780 tgaggccctg tctcaaaaaa gaaaagaaaa aagaaaaata atgagggctg tatggaatac 840 attcattatt cattcactca ctcactcact cattcattca ttcattcatt caacaagtct 900 tattgcatac cttctgtttg ctcagcttgg tgcttggggc tgctgagggg caggagggag 960 agggtgacat gggtcagctg actcccagag tccactccct gtaggtcggg cagcaggccg 1020 tagaagtctg gcagggcctg gccctgctgt cggaagctgt cctgcggggc caggccctgt 1080 tggtcaactc ttcccagccg tgggagcccc tgcagctgca tgtggataaa gccgtcagtg 1140 gccttcgcag cctcaccact ctgcttcggg ctctgggagc ccaggtgagt aggagcggac 1200 acttctgctt gccctttctg taagaagggg agaagggtct tgctaaggag tacaggaact 1260 gtccgtattc cttccctttc tgtggcactg cagcgacctc ctgttttctc cttggcagaa 1320 ggaagccatc tcccctccag atgcggcctc agctgctcca ctccgaacaa tcactgctga 1380 cactttccgc aaactcttcc gagtctactc caatttcctc cggggaaagc tgaagctgta 1440 cacaggggag gcctgcagga caggggacag a 1471
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Withdrawal due to no request for examination |