KR100546819B1

KR100546819B1 - Transgenic cloned cow producing human prourokinase and method for producing the same

Info

Publication number: KR100546819B1
Application number: KR1020030056629A
Authority: KR
Inventors: 황우석; 이병천; 강성근; 정의배; 조종기; 우딘; 김순웅; 박을순; 장구; 박정수; 김성기
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2002-08-16
Filing date: 2003-08-14
Publication date: 2006-01-26
Also published as: KR20040016426A; WO2004016773A1; AU2003252563A1

Abstract

본 발명은 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 성숙한 소 유래의 체세포에 도입 및 적중시키는 단계; 및 사람 프로유로키나제를 발현하는 외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 복제 소를 생산하는 단계를 포함하는 사람 프로유로키나제를 생산하는 형질전환 복제 소의 생산 방법 및 이 방법에 의해 생산된 형질전환 복제 소에 관한 것이다. The present invention comprises the steps of introducing and targeting a gene expressing human prourokinase into somatic cells derived from mature cattle; And producing a cloned cow using a somatic cell into which foreign genes expressing human prourokinase are introduced and targeted, and a method for producing a transformed cloned cow producing human prourokinase and a transformed cloned cow produced by the method. It is about.

또한, 본 발명은 유전자 도입 및 적중 기술과 체세포 복제 기술을 접목하여 사람 프로유로키나제를 용이하게 얻는 방법에 관한 것으로 더 구체적으로, 성숙한 소에서 유래한 체세포에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키고, 이를 체세포 복제하여 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제 소를 생산함으로써 소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 수득할 수 있는 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method of easily obtaining human prourokinase by combining a gene introduction and targeting technique with a somatic cloning technique, and more specifically, to introduce and target a gene expressing human prourokinase to somatic cells derived from mature cattle. The present invention relates to a method for obtaining human prourokinase from cow's milk by somatic cloning and producing a transgenic cloned cow expressing human prourokinase in the mammary gland.

형질전환 복제소, 체세포 복제, 프로유로키나제,인간유용단백질Transformation Replication, Somatic Replication, Prourokinase, Human Useful Protein

Description

사람 프로유로키나제를 생산하는 형질전환 복제 소 및 이의 생산 방법 {TRANSGENIC CLONED COW PRODUCING HUMAN PROUROKINASE AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME} Transformed cows producing human prourokinase and methods of producing the same {TRANSGENIC CLONED COW PRODUCING HUMAN PROUROKINASE AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}

도 1은 본 발명의 체세포에 사람 프로유로키나제를 도입 및 적중시키기 위한 p베타2-프로유로키나제 플라스미드의 작제도이다.1 is a schematic of pbeta2-prourokinase plasmid for introducing and targeting human prourokinase into somatic cells of the present invention.

도 2는 본 발명의 외래 유전자가 도입 및 적중된 세포의 GFP 발현을 나타낸 사진이다.Figure 2 is a photograph showing the expression of GFP cells introduced and hit the foreign gene of the present invention.

도 3은 본 발명에서 사용되는 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 수핵난자(3)의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸 사진이다.Figure 3 is a photograph showing the process of cutting the zona pellucida of the nucleus ovary 3 with a fixing pipette (1) and a cutting pipette (2) used in the present invention.

도 4는 탈핵 과정으로 고정용 피펫과 절개용 피펫으로 수핵 난자의 제 1극체와 핵을 제거하는 과정을 나타낸 사진이다.4 is a photograph showing a process of removing a first polar body and a nucleus of a nucleus pulposus by a fixing pipette and an incision pipette as a denuclearization process.

도 5는 본 발명에서 사용되는 고정용 피펫과 이식용 피펫(4)으로 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸 사진이다.Figure 5 is a photograph showing the process of transplanting somatic cells in the denuclearized egg with a fixing pipette and the transplant pipette (4) used in the present invention.

본 발명은 유전자 도입(transfection) 및 적중(targeting) 기술과 체세포 복제 기술을 접목한 형질전환동물(transgenic animal)의 생산방법 및 이러한 방법에 의해 생산된 형질전환동물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 형질전환동물을 이용하여 인간유용단백질 또는 생물의약품을 생산하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing a transgenic animal combining a transfection and targeting technique with a somatic cloning technique, and a transgenic animal produced by the method. The present invention also relates to a method for producing a human useful protein or biopharmaceutical using such a transgenic animal.

보다 구체적으로, 본 발명은 사람 프로유로키나제(human prourokinase)를 발현하는 유전자를 성숙한(adult) 소 유래의 체세포에 도입 및 적중시키는 단계; 및 사람 프로유로키나제를 발현하는 외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 복제 소를 생산하는 단계를 포함하는 사람 프로유로키나제를 생산하는 형질전환 복제 소의 생산 방법 및 이 방법에 의해 생산된 형질전환 복제 소에 관한 것이다. More specifically, the present invention comprises the steps of introducing and targeting a gene expressing human prourokinase to the somatic cells derived from the adult bovine; And producing a cloned cow using a somatic cell into which foreign genes expressing human prourokinase are introduced and targeted, and a method for producing a transformed cloned cow producing human prourokinase and a transformed cloned cow produced by the method. It is about.

일반적으로 심장 또는 혈관 내에 혈액이 응집하여 형성된 덩어리를 혈전이라 하고, 이러한 혈전의 형성과 관련된 병리 현상을 혈전증이라 한다. 혈전증으로는 뇌경색, 심근 경색, 폐 경색 등과 같은 각종 병태가 존재한다.In general, clumps formed by aggregation of blood in the heart or blood vessels are called thrombus, and the pathology associated with the formation of such thrombi is called thrombosis. Thrombosis includes various conditions such as cerebral infarction, myocardial infarction, and lung infarction.

혈전 형성은 어떠한 원인으로 인해 혈관에 장해를 입은 경우 또는 혈관 장애 부분으로부터 혈액이 누출되는 것을 방지하기 위한 기전이다. 혈전 형성은 혈액 성분의 변화, 혈류의 이상 및 혈관벽의 성상의 변화와 밀접하게 연관되어 있다. 즉, 혈관이 어떤 이유로 손상된 경우, 혈소판이 손상 부분에 점착하여 응집되어 응집물을 형성함으로써 출혈을 방지한다. 더욱이, 혈소판은 혈소판의 응집에 의해 혈액 내에 존재하는 응고 인자를 활성화시키는 물질을 방출시켜 보다 견고한 혈전 형성을 유발하고 촉진한다. 많은 응고 인자들이 존재하는데, 이는 한 효소가 다음 효소를 활성화시키는 캐스케이드(cascade) 방식으로 반응을 진행시키는 복잡한 활성화 기전으로 구성된다 (혈액응고계). 또한, 응고 인자 중에는 상처나 손상 조직에 의해 직접적으로 활성화되는 것이 있는 등 응고는 다양한 방법으로 진행된다. Thrombus formation is a mechanism for preventing blood from leaking from a vascular disorder or from a blood vessel disorder due to any cause. Thrombus formation is closely associated with changes in blood components, abnormalities in blood flow and changes in the appearance of blood vessel walls. In other words, if the blood vessel is damaged for some reason, platelets adhere to the damaged portion and aggregate to form an aggregate to prevent bleeding. Furthermore, platelets release and release substances that activate coagulation factors present in the blood by aggregation of platelets, causing and promoting more robust thrombus formation. Many coagulation factors exist, which consist of a complex activation mechanism in which one enzyme proceeds the reaction in a cascade way to activate the next enzyme (blood coagulation system). In addition, some coagulation factors are directly activated by wounds or damaged tissues. Coagulation proceeds in various ways.

그러나, 응고의 진행을 억제 시키는 물질도 혈액 내에 많이 존재함으로써 비정상적인 응고의 진행을 억제한다. 혈액 응집은 필요에 따라 형성되지만 지혈 작용이 더 이상 필요치 않은 경우에 혈액 내 응집을 용해 시키는 효소 (선용계 효소)에 의해서 용해되어, 혈관은 원상태로 되돌아 간다 (선용계).However, many substances that inhibit the progression of coagulation also exist in the blood to suppress the progression of abnormal coagulation. Blood aggregates are formed as needed, but are dissolved by enzymes that dissolve the aggregates in the blood when the hemostatic action is no longer needed, and the blood vessels return to their original state (the lineage system).

이와 같이 혈전 형성에는 각종 인자들이 관여하지만 가장 직접적으로 혈전 형성에 포함되는 인자는 혈소판, 혈액 응고 인자, 선용해 인자 등이고, 혈전 치료를 위해 상기 언급된 혈전 형성 성분들에 영향을 주는 통상적인 약제들이 개발되었다.As such, various factors are involved in thrombus formation, but most directly involved in thrombus formation are platelets, blood coagulation factors, predissolution factors, and the like. Developed.

혈전증 치료 방법은 작용 기전에 의해서 크게 두 개의 군으로 나뉘는데, 혈전의 형성을 방지하는 항-혈전 요법 및 형성된 혈전을 용해 시키는 혈전 용해 요법 이 그것이다. 또한, 상기 전자의 항-혈전 요법은 두 가지로 분류되는데, 항-혈소판 요법 및 항-응고 요법이 그것이다. Methods of treating thrombosis are divided into two groups by mechanism of action: anti-thrombotic therapy to prevent the formation of thrombi and thrombolytic therapy to dissolve the formed thrombi. In addition, the former anti-thrombotic therapy is classified into two categories, anti-platelet therapy and anti-coagulation therapy.

항-혈소판 요법은 혈전 형성의 초기 단계에 포함되는 혈소판의 기능을 억제하는 것을 목적으로 하는데, 아스피린과 같은 약제 및 경구 투여 될 수 있는 기타 많은 약제들이 개발되었다. 한편, 항-응고 요법은 응고인자를 억제함으로써 혈전 형성을 저해하는 것을 목적으로 하며, 응고인자의 활성을 억제하는 약제 및 응고인자의 형성을 억제하는 약제로 분류된다. 전자로는 헤파린, 효소 저해제 등이 포함된다. Anti-platelet therapy aims at inhibiting the function of platelets involved in the early stages of thrombus formation. Drugs such as aspirin and many other drugs that can be administered orally have been developed. On the other hand, anti-coagulation therapy aims at inhibiting clot formation by inhibiting coagulation factors, and is classified into drugs which inhibit the activity of coagulation factors and drugs which inhibit the formation of coagulation factors. The former includes heparin, enzyme inhibitors and the like.

한편, 항-혈전 요법과는 상이한 작용 기전으로 혈전증을 치료하는 방법이 혈전 용해 요법이다. 이 요법의 목적은 혈전 형성의 기전을 억제하는 것이 아니라 혈관 내의 형성된 혈전을 용해시켜 혈관의 폐색을 제거하여 혈류를 재관통 시키는 것이다. 이 요법의 작용 기전에서, 여러 타입의 플라스미노겐 활성 인자에 의해 혈액 선용계 조절 인자의 선구체인 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키는데(Collen, D. and Lijnen, H.R. CRC Critical Reviews in oncology/hematology, 1986, Vol.4, n.3, p249), 플라스민은 혈관 내에서 혈전의 피브린을 분해하는 중요한 분해효소이다 (Rakoczi, I. Wiman, B. and Collen, D. Biochim. Biophys. Acta, 540, 1978, p295; Robbins, K.C. et al. Biol.Chem. 242, p2333, 1967; Wiman, B. Eur. J. Biochim,76,p129, 1997). On the other hand, thrombolytic therapy is a method of treating thrombosis with a mechanism of action different from anti-thrombotic therapy. The purpose of this therapy is not to inhibit the mechanism of thrombus formation but to dissolve the thrombus formed in the blood vessels to remove the blockage of the blood vessels to re-permeate the blood flow. In the mechanism of action of this therapy, several types of plasminogen activators are used to activate plasminogen, a precursor of blood-based regulatory factors, to plasmin (Collen, D. and Lijnen, HR CRC Critical Reviews in oncology / hematology , 1986, Vol. 4, n.3, p249), plasmin is an important degrading enzyme that degrades fibrin in blood clots in blood vessels (Rakoczi, I. Wiman, B. and Collen, D. Biochim. Biophys. Acta, 540, 1978, p295; Robbins, KC et al. Biol. Chem. 242, p2333, 1967; Wiman, B. Eur. J. Biochim, 76, p129, 1997).

상기 혈전 용해 요법에서 사용되는 약제로는, 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키는 플라스미노겐 활성화 인자인 조직 플라스미노겐 활성화제(tissue plasminogen activator, 이하 't-PA'라 칭함), 유로키나제(urokinase, 이하 'UK'라 칭함), 프로유로키나제(prourokinase, 이하 'proUK'라 칭함) 등과 같은 생체 내 물질, 스타필로키나제, 스트렙토키나제 등과 같은 균체 생산 물질 및 그의 유전자 재조합 제제가 알려져 있다.The medicament used in the thrombolytic therapy includes a tissue plasminogen activator (hereinafter referred to as t-PA) and a urokinase, which is a plasminogen activator that activates plasminogen to plasmin. In vivo materials such as 'UK'), prourokinase (hereinafter referred to as 'proUK'), cell production materials such as staphylokinase, streptokinase, and the like, and recombinant products thereof are known.

유로키나제 및 스트렙토키나제는 사람의 혈전 용해 치료에 일반적으로 사용되는 플라스미노겐 활성 인자이지만, 피브린에 대한 특이적 활성이 없음으로 유로키나제 및 스트렙토키나제는 순환하는 플라스미노겐 또는 피브린에 결합된 플라스미노겐을 무차별적으로 활성화시키는 문제점이 있다(Zamarron, C., Lijnen, H.R., Van Hoef, B., and Collen, D., Thromb. Haemostas. 52, p19 ,1984; Samama, M., and Kher, A.Sem. Hop. Paris. 61, 1985, n.20. p1423). 따라서, 유로키나제 및 스트렙토키나제로 치료하는 동안에 전신 지혈 장애가 종종 유발되는 문제점이 있었다(Samama, M. and Kher, A. Sem. Hop. Paris, 1985, 61, n. 20. p1423; Maizel, A.S. and Bookstein, J.J. Cardiovsac. Intervent. Radiol.,9, 1986, p236; Bell, W.R. Thromb. Haemostas.,35, 1976, p57; Acar, J., Vahanian, A., Michel, P.L., Slama, M., Cormier, B. and Roger, V., Seminars in Thromb. and Haemost., 13, 1987, n. 2, p186).Although urokinase and streptokinase are plasminogen activators commonly used in the treatment of thrombolysis in humans, urokinase and streptokinase have no specific activity for fibrin, so urokinase and streptokinase inhibit circulating plasminogen or plasminogen bound to fibrin. There is a problem of indiscriminate activation (Zamarron, C., Lijnen, HR, Van Hoef, B., and Collen, D., Thromb. Haemostas. 52, p19,1984; Samama, M., and Kher, A. Sem.Hop. Paris. 61, 1985, n.20.p1423). Thus, there has been a problem that systemic hemostatic disorders are often caused during treatment with urokinase and streptokinase (Samama, M. and Kher, A. Sem. Hop. Paris, 1985, 61, n. 20. p1423; Maizel, AS and Bookstein , JJ Cardiovsac.Intervent.Radiol., 9, 1986, p236; Bell, WR Thromb.Hemostas., 35, 1976, p57; Acar, J., Vahanian, A., Michel, PL, Slama, M., Cormier, B. and Roger, V., Seminars in Thromb. And Haemost., 13, 1987, n. 2, p186).

반면에, t-PA (Hoylaerts, M., Ryken, D.C., Lijnen, H.R. and Collen, D.J. Biol. Chem., 257, n.6, p2912, 1982) 및 proUK (Husain, S.S. et al. Arch. Biochem. Biophys. 220. p31, 1983)는 피브린에 대한 특이 활성이 있어 현재 많이 사용되고 있다. 특히, proUK는 피브린에 대한 특이 활성을 가지면서도 t-PA보다 뇌출혈 경향이 적어 뇌졸증 치료제로 많이 연구되고 있다.T-PA (Hoylaerts, M., Ryken, DC, Lijnen, HR and Collen, DJ Biol. Chem., 257, n.6, p2912, 1982) and proUK (Husain, SS et al. Arch. Biochem Biophys. 220. p31, 1983) has a specific activity against fibrin and is currently widely used. In particular, proUK has been studied as a treatment for stroke because it has a specific activity against fibrin and has a lower tendency to cerebral hemorrhage than t-PA.

이와 같이 혈전 치료제로 proUK가 각광을 받고 있는데, 이는 사람의 뇨, 혈장 및 다양한 세포주의 배양 배지에서 얻을 수 있음이 알려져 있다. 사람의 뇨, 혈장 또는 배지에서 proUK를 얻기 위해서는 반드시 정제 과정을 거쳐야 하며, 또한 수득할 수 있는 양에 한계가 있어 다량의 proUK를 경제적으로 얻을 수 있는 방법이 요구되었다.As such, proUK has been spotlighted as a thrombotic agent, and it is known that it can be obtained from culture media of human urine, plasma and various cell lines. In order to obtain proUK from human urine, plasma or medium, the purification process must be performed and there is a limit to the amount that can be obtained. Therefore, a method of economically obtaining a large amount of proUK is required.

이에 새로운 방법으로 대두된 것이 미생물을 이용한 방법으로 사람 proUK를 발현하는 유전자를 삽입한 재조합 플라스미드를 작제하여 미생물을 형질전환시킴으로써 미생물로부터 사람 proUK를 수득한 바 있었다 (PCT/EP89/01168, US 5,866,358 등). 하지만 이 방법은 미생물로부터 proUK를 얻음으로써 낮은 수율, 안전성, 관리상의 문제점, 생물학적 활성의 소실 등의 문제점이 있었다.Therefore, a new method was used to produce human proUK from microorganisms by transforming microorganisms by constructing a recombinant plasmid in which a gene expressing human proUK was inserted using a microorganism (PCT / EP89 / 01168, US 5,866,358, etc.). ). However, this method has problems of low yield, safety, management problems and loss of biological activity by obtaining proUK from microorganisms.

또 다른 방법으로 형질전환동물을 이용한 방법이 연구되었는데, 레트로바이러스 벡터를 이용한 방법, DNA 미세주입방법 및 배아 줄기 세포를 이용한 방법 등이 사용되었다. 레트로바이러스 벡터를 이용한 방법은 크기가 큰 유전자(8kb 정도)를 감당하지 못하는 단점이 있었으며, 레트로바이러스의 감염이 문제가 되었다.In another method, transgenic animals were studied. Retroviral vectors, DNA microinjection methods, and embryonic stem cells were used. The method using a retroviral vector had a disadvantage in that it could not handle a large gene (about 8 kb), and retrovirus infection became a problem.

상기의 형질전환동물을 이용한 구체적인 사례로는, 사람 t-PA를 형질전환 마우스의 젖(milk)에서 수득한 예가 있으며 (Gordon et al. Bio/Technology 5, 1987, p1183; US PAT. NO.4,873,316), 이 외에도 형질전환 마우스 (예를 들면, 미국 특허 제4,736,866 등), 형질전환 돼지 (예를 들면, Miller, K.J. et al. J. Endocrin. 120, 1989, p481 등), 형질전환 양 (예를 들면, Nancarrow, et al. Theriogenology 27, 1987, p262 등), 형질전환 토끼 (예를 들면, Hannover, S.V., et al., Deutsche Tierarztliche Wochenschrift 94, 1987, p476 등), 형질전환 소 (예를 들면, Agner, et al., Theriogenology 21, 1984, p29 등)이 사례가 있었다. Specific examples using the transgenic animals include human t-PA obtained from the milk of transgenic mice (Gordon et al. Bio / Technology 5, 1987, p1183; US PAT. NO. 4,873,316). ), In addition to transgenic mice (eg, US Pat. No. 4,736,866, etc.), transgenic pigs (eg, Miller, KJ et al. J. Endocrin. 120, 1989, p481, etc.), transgenic sheep (eg For example, Nancarrow, et al. Theriogenology 27, 1987, p262, etc., transgenic rabbits (eg, Hannover, SV, et al., Deutsche Tierarztliche Wochenschrift 94, 1987, p476, etc.), transgenic cattle (eg For example, Agner, et al., Theriogenology 21, 1984, p29, etc.).

하지만, 상기의 방법들은 형질전환동물 생산을 위한 외래 유전자의 도입 방법으로 전핵 내 미세주입법을 사용함으로써 극히 낮은 생산 효율(5% 이하) 및 모자이키즘이 나타나 원하는 단백질을 경제적으로, 그리고 원하는 성상의 단백질을 얻을 수 없다는 문제점이 있었다. 즉, 전핵 내 미세주입법은 원하는 유전자를 수정 후 약 18~24시간 내에 전핵에 삽입함으로써 이루어지는데, 이렇게 생산된 동물은 키메라(chimera)를 형성하게 되어 원하는 완전한(homologous) 형질전환 동물을 얻기 위해서는 또 다시 수정을 통하여 산자를 얻어야 한다는 비효율적인 점이 있고, 특히 소와 같은 임신 기간이 긴 동물의 경우 (200일 이상)에는 형질전환동물을 얻기까지는 너무 많은 시간이 소요된다는 문제점이 있다. 따라서 원하는 고순도의 단백질을 경제적으로 빠른 시간 내에 생산할 수 있는 요구가 여전히 있어 왔다. However, the methods described above are very low in production efficiency (5% or less) and maternalism due to the use of prokaryotic microinjection as a method of introducing foreign genes for the production of transgenic animals, thereby making it possible to economically and There was a problem that protein could not be obtained. In other words, pronuclear microinjection is performed by inserting a desired gene into the pronucleus within about 18 to 24 hours after fertilization. The animal thus produced forms a chimera to obtain a desired homologous transgenic animal. In addition, there is an inefficient point to obtain a living through fertilization, especially in animals with a long gestation period such as cattle (more than 200 days) there is a problem that it takes too much time to obtain a transgenic animal. Therefore, there is still a need to be able to produce a desired high-purity protein economically in a short time.

최근에는 양의 프라이머리(primary) 태아 섬유아세포를 네오마이신 저항 마커 유전자 및 인간 응고 인자 Ⅸ으로 형질전환시킨 뒤 탈핵된 난자에 융합시킴으로써 양의 젖(milk)에서 상기의 유전자로 인코드된 단백질을 발현하는 복제 양을 생산한 예가 있다(Angelika, E. et al. Science, Vol. 278, 1997, p2130). 또한, 마커 유전자로 인간 항트롬빈 Ⅲ 유전자를 함유한 형질전환 태아로부터 공여 핵 세포를 분리하고 이를 이용하여 탈핵된 난자에 융합시켜 유용한 단백질을 생산할 수 있는 복제 동물에 관하여 밝힌 바가 있었다(Brett C. Reggio, et al. Biology of reproduction. 65, 2001, p1528). 이 방법에서는, 복제동물의 생산을 위해 핵 공여 세포들을 태아로부터 유래된 것을 사용하였고, 특히 후자의 경우 형질전환된 태아로부터 핵 공여 세포를 분리하여 복제 동물을 생산하였다. Recently, the gene encoded by the gene in sheep's milk is transformed by transforming sheep primary fetal fibroblasts with neomycin resistance marker gene and human coagulation factor 뒤 and defused into denuclearized eggs. There is an example of producing the amount of replication to express (Angelika, E. et al. Science, Vol. 278, 1997, p2130). In addition, there have been studies on cloned animals that can isolate donor nuclear cells from transgenic embryos containing human antithrombin III genes as marker genes and fuse them to denucleated eggs to produce useful proteins (Brett C. Reggio). , et al. Biology of reproduction.65, 2001, p1528). In this method, nuclear donor cells were derived from the fetus for the production of cloned animals, and in the latter case, cloned animals were produced by separating nuclear donor cells from the transformed fetus.

위 방법들과 같이, 핵 공여 세포를 태아에서 유래되는 것을 사용하면 세포분화 정도를 고려할 때 체세포 핵 이식에 의한 복제 동물을 생산하기에 용이한 점이 있고, 기술적으로도 손쉽게 복제 동물을 생산할 수 있다는 장점을 가진다. 하지만, 고-능력을 가진 동물의 형질을 그대로 유지하는 복제 동물을 생산하고자 하는 경우에는 그 능력이 확인된 동물로부터 유전 형질을 받아야 하는 바, 태아의 경우에는 아직 그 능력을 알 수 없다는 한계점이 있고, 또한 태아에서는 유전 형질이 확인되지 않는 상태이고, 특히 암수의 성 구별이 안된 상태에서 이용하게 된다는 문제점이 있다. As with the above methods, the use of nuclear donor cells derived from the fetus is easy to produce cloned animals by somatic cell nuclear transfer in consideration of the degree of cell differentiation, and technically easy to produce cloned animals. Has However, if you want to produce a cloned animal that retains the traits of a high-capacity animal, you need to receive the genetic trait from the animal whose capacity has been identified. In addition, there is a problem that the genetic trait is not confirmed in the fetus, and in particular, it is used in a state where sex is not distinguished between male and female.

이에 본 발명자는 동물의 성체로부터 유래된 체세포를 이용하여 태아 유래의 체세포에 비하여 복제 성공의 어려움을 극복하면서도, 고-능력을 가진 성체를 확인하고 이로부터 우수한 유전형질을 이어받음과 동시에 원하는 단백질을 우유로부터 얻을 수 있도록 자성(female)으로 확인된 것을 이용함으로써 고-능력을 가진 동물로부터 원하는 단백질을 고-순도로 경제적으로 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명에 이르게 된 것이다.Therefore, the present inventors use the somatic cells derived from the adult animal to overcome the difficulty of the success of replication compared to the somatic cells derived from the fetus, while confirming the adult with high-capacity and inheriting the excellent genotype from the desired protein at the same time. The use of what has been identified as a female (female) to obtain from milk has confirmed that it is possible to obtain a desired protein from a high-capacity animal economically in high-purity, and to the present invention.

본 발명은 유전자 도입 및 적중 기술을 이용하고 체세포 복제 기술을 접목함 으로써 형질전환동물을 생산하고, 이를 이용하여 원하는 단백질을 얻을 수 있는 방법을 제공하고자 한다.The present invention is to provide a method for producing a transgenic animal by using a gene introduction and targeting technology and grafting somatic cloning technology, to obtain a desired protein using the same.

더 구체적으로, 본 발명은 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 성숙한 소 유래의 체세포에 도입 및 적중시키고, 상기 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 소의 상기 체세포를 이용하여 형질전환 복제 소를 생산하는 방법 및 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제 소를 제공하는 것을 목적으로 한다.More specifically, the present invention introduces and targets a gene expressing human prourokinase to somatic cells derived from mature cows, and transforms a transgenic cloned cow using the somatic cells of a cow to which the gene expressing human prourokinase is introduced and targeted. It is an object of the present invention to provide a method for producing and a transgenic cloned cow expressing human prourokinase.

또한, 본 발명은 소에서 유래한 체세포에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계 및 소의 난자를 탈핵하여 상기 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 탈핵된 난자로 도입하는 단계를 포함하는 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입된 형질전환 핵 이식란 및 이의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, the present invention is the step of introducing and targeting the gene expressing human prourokinase in bovine-derived somatic cells and the denuclearization of bovine eggs to introduce the somatic cells in which the gene expressing the human prourokinase and introduced into the denuclearized egg It is an object of the present invention to provide a transgenic nuclear transfer embryo in which a gene expressing human prourokinase is introduced, and a method of producing the same.

또한, 본 발명은 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 성숙한 소의 체세포에 도입 및 적중시키고, 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 상기 체세포를 이용하여 형질전환 복제소를 생산함으로써 소의 유선으로부터 사람 프로유로키나제를 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
In addition, the present invention introduces and targets a gene expressing human prourokinase into somatic cells of a mature cow, and produces a transgenic replica using the somatic cells into which the gene expressing human prourokinase is introduced and targeted, thereby producing a human clone from the bovine mammary gland. It is intended to provide a method for producing prourokinase.

본 발명은 유전자 적중 및 도입 기술과 체세포 복제 기술을 접목한 것이다. 즉, 본 발명은 체세포 단계에서 체세포에 특정 유전자를 도입 및 적중하는 단계 및 상기 특정 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 체세포 단계에서 형질전환된 형질을 그대로 보유한 형질전환동물을 생산하게 체세포 복제 기술을 적용하는 단계를 포함한다. The present invention combines gene targeting and introduction technology with somatic cell replication technology. That is, the present invention is a somatic cell cloning technology to produce a transgenic animal having the transformed transformed in the somatic cell stage using the somatic cells introduced and hit the somatic cell at the somatic stage and the somatic cells introduced and targeted It includes the step of applying.

즉, 본 발명은 성숙한 소에서 유래한 체세포에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계; 상기 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 복제 소를 생산하는 단계를 포함한다.That is, the present invention comprises the steps of introducing and targeting a gene expressing human prourokinase to somatic cells derived from mature cattle; Producing a cloned cow using the somatic cells into which the gene expressing human prourokinase is introduced and targeted.

또한, 본 발명의 형질전환 핵 이식란을 생산하는 방법은 소에서 유래한 체세포에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계; 소의 난자를 탈핵하여 상기 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 탈핵된 난자로 도입하는 단계를 포함한다. In addition, the method for producing a transgenic nuclear transfer embryo of the present invention comprises the steps of introducing and targeting a gene expressing human prourokinase to the somatic cells derived from bovine; Denuclearizing a bovine egg to introduce a somatic cell into which the gene expressing the human prourokinase is introduced and targeted to the denuclearized egg.

또한, 본 발명의 형질전환 핵 이식란 및 복제 소는 사람 프로유로키나제를 발현하는 외래 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다.In addition, the transgenic nuclear transfer embryo and the cloned cow of the present invention are characterized in that a foreign gene expressing human prourokinase is inserted.

또한, 본 발명은 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제 소로부터 사람 프로유로키나제를 용이하게 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for easily producing human prourokinase from a transgenic cloned cow expressing human prourokinase.

용어의 정의Definition of Terms

본 발명에 따른 특성상 본원 명세서에 사용되는 용어의 정의를 명백히 할 필요가 있다. 일반적으로는 본 발명에서 별도로 정의하지 아니한 모든 기술적 및 과학적인 관련 용어는 이 발명이 속한 기술 분야에서 통상적으로 통용되는 의미를 가 진다. 그러나 다음의 용어들은 통상적인 의미를 나타내지만 그 의미를 명확히 하고 또한 본 발명의 범위를 명백히 하고자 다음과 같이 정의한다.Due to the nature of the invention it is necessary to clarify the definition of the terminology used herein. In general, all technical and scientific related terms that are not defined separately in the present invention has the meaning commonly used in the technical field to which the present invention belongs. The following terms, however, represent common meanings but are defined as follows in order to clarify the meaning and to clarify the scope of the present invention.

본원 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 사람 프로유로키나제를 암호화하는 핵산의 삽입, 전달 또는 발현을 허용하는 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스, 레트로바이러스 또는 다른 담체를 말한다. As used herein, the term "vector" refers to a plasmid, cosmid, phage, virus, retrovirus or other carrier that allows insertion, delivery or expression of nucleic acids encoding human prourokinase.

본원 명세서에 사용된 용어 "프로모터"는 사람 프로유로키나제 cDNA의 전사를 조절하는 조절 DNA 서열을 말한다. As used herein, the term “promoter” refers to a regulatory DNA sequence that regulates the transcription of human prourokinase cDNA.

본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 어떤 생물이 원래는 지니고 있지 않은 외부 유전자를 염색체상에 인위적으로 삽입해서 그 생물의 유전적 형질 일부를 변화시키는 것이다. 형질전환의 방법은 여러 가지가 있으나 가장 많이 사용되는 방법으로는 수정란 미세주입법과 본원에서 사용된 체세포 복제법이 대표적이다.As used herein, the term “transformation” refers to altering some of the genetic traits of an organism by artificially inserting an external gene on a chromosome that the organism does not originally possess. There are many methods of transformation, but the most commonly used methods are fertilized egg microinjection and somatic cloning used herein.

본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환 동물(transgenic animal)"은 '유전자 이식 동물' 이라 불리우기도 하며, 동물 자신이 원래 가지고 있지 않은 외래의 유전자를 재조합하여, 이를 동물의 염색체 상에 인공적으로 삽입시킴으로써 그 형질의 일부가 변화된 동물을 말한다. 따라서, 본원에서 형질전환 동물은 인간이 필요로 하는 생리활성 물질을 생산하는 생물반응기(Bioreactor), 특정 질환을 유전적으로 나타내는 질환모델 동물, 인간의 이식용 장기 등을 생산할 수 있는 형질전환 동물 등을 의미한다.As used herein, the term “transgenic animal” is also referred to as a “transgenic animal,” by recombining foreign genes not originally possessed by the animal and artificially inserting them on the animal's chromosome. Refers to an animal in which some of its traits have changed. Accordingly, the transgenic animals herein include a bioreactor producing a bioactive substance required by a human, a disease model animal genetically representing a specific disease, a transgenic animal capable of producing an organ for human transplantation, and the like. it means.

본원 명세서에 사용된 용어 "핵 이식"은 핵이 없는 난자와 인공적으로 결합 시켜 동일한 우량형질을 갖는 여러 마리의 복제동물을 생산하기 위한 유전자 조작기술을 의미한다. 이렇게 생성된 수정란을 본 발명에서는 '핵 이식란'이라 한다.As used herein, the term "nuclear transplant" refers to a genetic engineering technique for artificially combining an egg without a nucleus to produce several clones having the same superior trait. The fertilized egg thus generated is referred to as a 'nuclear transfer egg' in the present invention.

구체적으로, 본 발명은 체세포 복제 기술을 이용하여 형질전환 동물을 생산하기 위해서 원하는 유전자를 체세포에 도입 및 적중하는 단계; 및 상기 형질전환된 체세포를 이용하여 복제 동물을 생산하는 단계를 포함한다.Specifically, the present invention comprises the steps of introducing and targeting the desired genes in somatic cells to produce a transgenic animal using somatic cloning technology; And producing a cloned animal using the transformed somatic cells.

좀 더 구체적으로, 본 발명의 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제소의 생산방법은 소에서 유래한 체세포주에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계; 및 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함한다.More specifically, the method for producing a transgenic clone expressing human prourokinase of the present invention provides a method for preparing a donor nuclear cell comprising introducing and targeting a gene expressing human prourokinase to a bovine-derived somatic cell line. step; Preparing a bovine-derived nucleated egg comprising the step of removing the oocytes of the nucleated nucleus and denucleating the egg by removing the cytoplasm including the first polar body of the nucleated nucleus; Constructing a nuclear transfer embryo by transplanting and fusing the donor nuclear cell prepared in the step into a denucleated egg; And transplanting the nuclear transfer embryo into a surrogate mother to give birth.

또한, 본 발명의 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입된 형질전환 핵 이식란의 생산방법은 소에서 유래한 체세포주에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; 및 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시키는 단계를 포함한다.In addition, the method for producing a transgenic nuclear transfer embryo in which a gene expressing a human prourokinase of the present invention is introduced is a donor nuclear cell comprising the step of introducing and targeting a gene expressing a human prourokinase to a bovine-derived somatic cell line. Preparing; Preparing a bovine-derived nucleated egg comprising the step of removing the oocytes of the nucleated nucleus and denucleating the egg by removing the cytoplasm including the first polar body of the nucleated nucleus; And implanting and fusing the donor nucleus cells prepared in the step into denucleated eggs.

또한, 본 발명의 사람 프로유로키나제를 생산하는 방법은 소의 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 수득하는 것을 포함한다. In addition, the method for producing human prourokinase of the present invention includes obtaining human prourokinase from the milk of a transgenic clone that expresses human prourokinase in bovine mammary gland.

또한, 본 발명의 형질전환 핵 이식란 및 복제소는 사람 프로유로키나제를 발현하는 외래 유전자를 포함한다. In addition, the transgenic nuclear transfer embryos and replicas of the present invention contain foreign genes that express human prourokinase.

이하에서는, 소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 얻을 수 있는 형질전환 복제소를 생산하는 방법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명한다.Hereinafter, a method for producing a transgenic clone that can obtain human prourokinase from cow's milk will be described in detail by dividing step by step.

사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 체세포에 도입 및 적중하여 체세포를 형질전환하는 단계Transforming somatic cells by introducing and targeting genes expressing human prourokinase into somatic cells

본 발명에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 체세포에 도입하는 방법으로 생화학적 방법, 물리적 방법, 바이러스 매개 형질감염방법 등을 사용할 수 있다. In the present invention, as a method of introducing a gene expressing human prourokinase into somatic cells, biochemical methods, physical methods, virus-mediated transfection methods, and the like can be used.

생화학적인 방법으로는 칼슘을 매개체로 하는 칼슘 침전법, 세포막 성분인 양이온 리피드를 매개체로 하는 리포펙션 또는 리피드는 아니지만 양전하를 지니는 폴리머를 매개체로 하는 방법 등을 사용할 수 있는데, 이는 실험의 용이성과 효율 성 및 안정성 측면에서 많이 이용되는 방법이기도 하다. 물리적인 방법으로 일렉트로포레이션, 유전자 총, 세포 내 직접 미세주입법 등을 사용할 수 있다. 바이러스 매개 방법으로는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스의 바이러스 게놈에 원하는 DNA를 클로닝하여 세포에 감염시키는 방법이 사용될 수 있다. Biochemical methods include calcium precipitation mediated by calcium, lipofections mediated by cationic lipids as cell membrane components, or mediated polymers with positive but not positive lipids. It is also widely used in terms of sex and stability. As physical methods, electroporation, gene guns, intracellular direct microinjection, etc. may be used. Virus-mediated methods can be used to infect cells by cloning the desired DNA in the viral genome of adenovirus or retrovirus.

바람직하게는, 본 발명에서는 유전자의 도입을 위한 벡터를 작제하여 생화학적인 방법으로 유전자를 도입 및 적중하는 방법을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는, 유전자의 도입을 위한 벡터를 작제하고 리피드-매개 방법(lipid-mediated method)을 이용하여 사람 프로유로키나제를 도입 및 적중할 수 있다.Preferably, in the present invention, a method for constructing a vector for introducing a gene and introducing and targeting the gene by a biochemical method may be used. More preferably, vectors for introduction of genes can be constructed and human prourokinase can be introduced and targeted using the lipid-mediated method.

제 1 단계: 사람 프로유로키나제(proUK)를 발현하는 유전자의 도입 및 적중을 위한 벡터의 작제First step: construction of a vector for the introduction and targeting of a gene expressing human prourokinase (proUK)

본 발명에 사용되는 플라스미드들은 표준 DNA 클로닝 과정과 PCR 방법에 의해 작제될 수 있다. 사람 proUK를 발현하는 유전자의 도입 및 적중에 있어서 사용되는 벡터를 작제하기 위한 pcDNA3는 상업적으로 시판되고 있는 것(Invitrogen, Groningen, Netherlands)을 사용할 수 있다 . Plasmids used in the present invention can be constructed by standard DNA cloning procedures and PCR methods. A pcDNA3 for constructing a vector used for the introduction and targeting of a gene expressing human proUK can be commercially available (Invitrogen, Groningen, Netherlands).

사람 proUK를 발현하는 유전자의 도입 및 적중을 위한 벡터는 소의 유방에서 타겟 유전자가 발현할 수 있도록 소 β-카세인 프로모터가 포함될 수 있다. 타겟 유전자로 사람 proUK 유전자가 포함될 수 있고, 또한 마커 유전자가 더 포함될 수 있다. 마커 유전자로는 녹색 형광을 발광하는 단백질인 GFP 유전자가 사용될 수 있다. Vectors for the introduction and targeting of genes expressing human proUK may include a bovine β-casein promoter for expression of the target gene in bovine breasts. The target gene may include a human proUK gene and may further include a marker gene. As the marker gene, the GFP gene, which is a protein emitting green fluorescence, may be used.

PCR 증폭으로 준비한 타겟 유전자, 소 β-카세인 프로모터 및 GFP 유전자는 TA 클로닝 방법으로 벡터 내로 삽입될 수 있다.The target gene, bovine β-casein promoter and GFP gene prepared by PCR amplification can be inserted into the vector by TA cloning method.

제 2 단계: 체세포주의 확립Step 2: establish a somatic cell line

본 발명에는 성숙한 소에서 수득한 세포를 배양한 세포주를 공여세포로 사용할 수 있다. 이때, 소의 품종이 특별히 제한되는 것은 아니나, 한우 또는 홀스타인(Holstein)종의 젖소를 사용함이 바람직하다.In the present invention, cell lines obtained by culturing cells obtained from mature cattle can be used as donor cells. At this time, the breed of the cow is not particularly limited, but it is preferable to use cows of Hanwoo or Holstein species.

소에서 수득한 세포는 소의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포, 난구세포 또는 태아섬유아세포이며, 이들을 마더(Mather)와 바네스(Barnes)의 방법 (참조: Mather & Barnes, Methods in Cell Biology, Vol.57, 1998, Animal Cell Culture Methods, Academic Press)을 응용하여 배양함으로써 세포주를 작제할 수 있다. The cells obtained from the bovine are bovine uterine perfusate, endometrium, fallopian tubes, cells isolated from the ear or muscle, cumulus cells or fetal fibroblasts, which are obtained by the methods of Mother and Barnes (see Mather & Barnes). , Cells of Methods in Cell Biology, Vol. 57, 1998, Animal Cell Culture Methods, Academic Press) can be cultured by application.

예를 들어, 자궁관류액에 P/S 항생제(페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)가 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하고, 원심분리하여 세척한 다음, 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 비필수 아미노산(NEAA, non-essential amino acid) 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium)에서 39℃ , 5% CO2의 조건으로 배양된다.For example, phosphate buffered saline (PBS) containing P / S antibiotics (penicillin 10000 IU, streptomycin 10 mg) is added to uterine perfusate, washed by centrifugation, and then fetal bovine serum (FBS). , DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium) with non-essential amino acid (NEAA) and P / S antibiotics were incubated at 39 ° C and 5% CO2.

자궁내막의 일부 또는 난관으로부터 난관상피 조직을 채취하여, 상기 PBS로 세정하고, 트립신과 EDTA가 포함된 용액에서 정치한 다음, 이를 원심세정하고, 상기한 조건에서 배양될 수 있다. Tubal epithelial tissue may be taken from a portion of the endometrium or fallopian tube, washed with PBS, allowed to stand in a solution containing trypsin and EDTA, and then centrifuged and cultured in the above conditions.

난구-난모세포 복합체를 하이알루로니다제(hyaluronidase)로 처리하여 난자를 둘러싸고 있는 난구 세포층을 분리하고, 난구 세포층에 상기 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심 세정하고, 상기한 조건에서 배양할 수 있다. 귀의 피부 조직으로부터 채취된 연골 조직, 면한 피부 내측의 조직, 근육조직 또는 태아의 동체와 사지 부위에서 연골 조직을 포함하지 않는 부위의 조직을 세정하고 세절한 다음, 상기 트립신-EDTA 용액 및 콜라게나제(collagenase type II) 용액을 첨가하여 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심세정시키고, 상기한 조건에서 배양되어 준비될 수 있다.The oocyte-oocyte complex was treated with hyaluronidase to separate the oocyte layer surrounding the oocyte, and the trypsin-EDTA solution was added to the oocyte layer in a saturated humidity incubator at 39 ° C. and 5% CO ₂ . After standing still, centrifugal washing can be carried out and cultured under the above conditions. The cartilage tissue collected from the skin tissue of the ear, the tissue inside the faced skin, the muscle tissue, or the tissues of the fetal body and limbs in the fetal body and limbs are washed and cut, and then the trypsin-EDTA solution and collagenase are removed. (collagenase type II) solution may be added to stand in a saturated humidity incubator at 39 ° C., 5% CO ₂ , followed by centrifugal washing and incubation under the above conditions.

이처럼 작제된 세포주는, 일정 시간 간격으로 세포주의 배양액을 제거하고 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 정치한 다음, 새로운 배양액으로 교체하며 배양하는 계대 배양, 윌머트(Wilmut) 등의 방법을 응용하여 배양 중인 세포주의 배양액을 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM으로 교체하여 배양하는 혈청기아배양 (참조: Wilmut et al., Nature, 385:810-813, 1997) 또는 동결보존 등의 방법을 통하여 보존되며, 보존된 세포주는 공여세포로서 제공될 수 있다. The cell line thus constructed is incubated by applying a method such as passage culture, Wilmut, which removes the cell line culture medium at regular intervals, adds trypsin-EDTA solution, and then replaces it with a new one. Conserved and preserved through methods such as serum starvation (Wilmut et al., Nature, 385: 810-813, 1997) or cryopreservation by replacing the cell line with DMEM with fetal bovine serum. Cell lines can be provided as donor cells.

제 3 단계: 외래 유전자의 체세포로의 도입Third step: introduction of foreign genes into somatic cells

본 발명에서 외래 유전자의 세포 내로의 도입은 작제된 발현 플라스미드를 체세포 내로 도입시키는 방법으로 행하는 것을 포함한다. 외래 유전자를 세포 내로 도입시키는 방법으로는 생화학적 방법, 물리적 방법, 바이러스 매개 형질감염방 법 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서는 생화학적인 방법으로 FuGene6 (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA), 리포펙타민 플러스 (LipofectAmine Plus, Life Technologies) 및 엑스진 500 (ExGen 500, MBI Fermentas)을 사용할 수 있다. In the present invention, the introduction of the foreign gene into the cell includes the step of introducing the constructed expression plasmid into the somatic cell. Biochemical methods, physical methods, virus-mediated transfection methods, etc. may be used as a method of introducing foreign genes into cells. Preferably, in the present invention, FuGene6 (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA), Lipofectamine Plus (LipofectAmine Plus, Life Technologies), and Xgene 500 (ExGen 500, MBI Fermentas) may be used as biochemical methods.

FuGene6는 다성분 지방계 시약으로서 다양한 세포 타입에서 높은 도입 효율을 가지고 세포 독성이 없으며, 혈청 첨가 여부에 관계 없이 기능을 발휘하고 최소한의 최적화 작업이 쉬운 장점을 가진다. 리포펙타민 플러스는 양전하 지질(cationic lipid)이며, 엑스진 500은 비지방 양전하 중합체로 여러 가지 세포 타입에서 높은 효율이 보고 되어 있다. FuGene6 is a multi-component aliphatic reagent that has high transduction efficiency and no cytotoxicity in various cell types. Lipofectamine plus is a cationic lipid and Xgene 500 is a nonfat positive charge polymer that has been reported to have high efficiency in various cell types.

본 발명에서는 사람 proUK 유전자의 도입 및 적중을 위하여 바람직하게는 FuGene6을 이용할 수 있다. 즉, 사람 proUK 유전자를 리포좀 형성 성분과 혼합하여 생성된 리포좀-DNA 구조 복합체를 세포 배양액에 첨가하여 일정시간 배양하고, 이 복합체의 DNA 구조가 세포 내로 도입되도록 50-70% 정도 증식한 체세포에 형질감염을 실시할 수 있다. FuGene6을 통한 효과적인 도입을 위해서는 세포마다 최적 방법을 선정하고 각 변수들을 최적화하여 유전자를 도입함으로써 사람 proUK 발현을 극대화할 수 있다.In the present invention, FuGene6 may be preferably used for introduction and targeting of the human proUK gene. That is, the liposome-DNA structure complex generated by mixing the human proUK gene with the liposome-forming component is added to the cell culture medium and cultured for a predetermined time, and the somatic cells which have grown about 50-70% so that the DNA structure of the complex is introduced into the cell are transformed. Infection can occur. For efficient introduction through FuGene6, human proUK expression can be maximized by selecting the optimal method for each cell and introducing genes by optimizing each variable.

구체적으로, 제 3 단계에서는 상기 제 2 단계에서 준비된 세포주에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시킬 수 있다. 즉, 상기 제 1 단계의 발현 플라스미드와 시약을 혼합하여 배양 배지에 함께 배양한다. 유전자의 도입 및 적중 후, 도입 및 적중된 세포를 자외선 하에서 표준 플루오레세인 이소티 오사이아네이트(FITC) 필터 셋을 이용하여 검사한다.Specifically, in the third step, a gene expressing human prourokinase may be introduced and targeted to the cell line prepared in the second step. That is, the expression plasmid of the first step and the reagent are mixed and cultured together in the culture medium. After the introduction and hit of the gene, the introduced and hit cells are examined under standard UV light using a standard fluorescein isothiocyanate (FITC) filter set.

제 4 단계: 사람 proUK를 발현하는 유전자가 도입된 세포의 선별, 증식 및 동결 보존Fourth step: selection, proliferation and cryopreservation of cells into which a gene expressing human proUK is introduced

사람 proUK 유전자가 도입된 세포의 선별은 항생제 또는 마커 유전자를 이용하여 선별할 수 있다. 사람 proUK 유전자 벡터에 이용된 양성 마커(positive marker)인 암피실린(ampicillin) 항생제에 대한 저항성 유전자는 사람 proUK 유전자가 세포에 도입되면 저항성 유전자도 발현된다. Selection of cells into which the human proUK gene has been introduced can be selected using antibiotics or marker genes. Resistant genes for ampicillin antibiotics, which are positive markers used in human proUK gene vectors, are also expressed when human proUK genes are introduced into cells.

사람 proUK 도입으로 세포 내로 유입된 DNA 구조체(construct)에 의해 적중된 세포는 항생제를 포함하여 배양하면 생존하게 되고, 그 외의 세포들은 항생제의 독성에 의해 사멸되어 일정 시간 후 배양 용기에는 유전자가 적중된 세포만 증식한다. 그러므로, 전 단계에서 도입 후 정상 배양을 통한 일정 기간의 회복기가 지난 다음 사람 proUK가 도입되지 않은 세포들은 제거하고 도입된 세포들만 선별 마커의 항생제를 사용하여 선별할 수 있다. The cells hit by the DNA construct introduced into the cells by the introduction of human proUK survive when cultured with antibiotics, and the other cells are killed by the toxicity of the antibiotics, and after a certain time, the gene is hit into the culture vessel. Only cells multiply. Therefore, after a period of recovery through normal culture after introduction at all stages, cells without introduction of human proUK can be removed and only the introduced cells can be selected using antibiotics of the selection marker.

이 같은 항생제에 의한 선별은 항생제의 적정 선별 농도를 정함으로써 효과적으로 이루어지도록 할 수 있다. 세포의 종류에 따라 차이가 있으나, 적중된 세포는 하나의 세포로부터 증식을 시작하게 되므로 다음 단계의 확인을 위해서는 일정 수 이상으로 증식시켜야 한다. 항생제를 통한 선별 과정이 이루어지면 정상 배양으로 전환하고, 세포의 신속한 증식과 배양 시 세포 사멸에 의한 불필요한 손실을 감소시키기 위해 적절한 성장인자와 세포사멸 억제제 등을 첨가하는 방법을 적 용할 수 있다.Such antibiotic selection may be effected effectively by determining the appropriate selection concentration of the antibiotic. Although there is a difference depending on the type of cells, since the target cells start to proliferate from one cell, it must be proliferated more than a predetermined number to confirm the next step. When antibiotics are screened, it is possible to switch to normal culture and add appropriate growth factors and inhibitors of apoptosis to reduce the rapid loss of cells and unnecessary loss due to cell death.

또한, 마커 유전자로 녹색 형광을 발광하는 단백질인 GFP를 코딩하는 유전자를 이용하여 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 사람 proUK 유전자의 도입으로 세포 내로 유입된 DNA 구조체로 적중된 세포는 GFP 유전자에 의해 현미경 하에서 자외선 필터를 이용하여 관찰하면 초록색을 띄는 세포만을 선별할 수 있다.In addition, transformed cells may be selected using a gene encoding GFP, a protein that emits green fluorescence as a marker gene. Cells hit by DNA constructs introduced into cells by the introduction of the human proUK gene can only select green cells when observed with a UV filter under a microscope by the GFP gene.

GFP 유전자 도입 세포의 증식 배양 및 동결 보존은 전술한 항생제 선별 및 GFP 발현유무로 선별한 형질전환 세포를 대상으로 한다. 핵 이식용 세포로 사용할 세포는 선별된 하나의 세포로부터 증식시키며, 특히 섬유아세포는 다수의 세포로 증식되기까지 상당한 시간이 소요되고 세포가 노화되어 증식이 둔화되면서 성장을 멈추기 때문에, 단 시간 내 건강한 다수의 적중된 세포를 배양해야 한다. 증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위하여 각 단계마다 동결 보존한다. 특히 소수의 세포를 동결 보존하여 융해했을 때 생존성과 핵 이식 시 핵 공여세포로서의 안정성에 적합토록 해야 한다.Proliferation culture and cryopreservation of GFP transgenic cells are for transformed cells selected with the antibiotic selection and GFP expression as described above. Cells to be used for nuclear transplantation proliferate from a single cell selected, especially fibroblasts take a considerable amount of time to multiply into a large number of cells. Many targeted cells must be cultured. Cryopreservation is performed at each step for efficient preservation of proliferation cultured cells. In particular, few cells should be cryopreserved and fused to ensure viability and stability as nuclear donor cells during nuclear transfer.

외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포의 핵 이식을 통한 형질전환 복제란 및 형질전환 복제 동물을 생산하는 단계Producing transgenic cloned eggs and transgenic cloned animals through nuclear transfer of somatic cells into which foreign genes have been introduced and targeted

본 발명에서는 형질전환 복제 소를 생산하기 위한 방법으로 동물복제 기술을 이용할 수 있다. 상기 단계의 외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포의 형질을 동물 복제 기술을 이용하여 복제되는 산자에 그대로 발현되도록 함으로써 모자이크 현상이 없는 100% 형질전환 복제 소를 효율적으로 생산할 수 있다. In the present invention, an animal cloning technique may be used as a method for producing a transgenic cloned cow. By introducing the trait of the somatic cell introduced and hit the foreign gene of the step as it is expressed in the living clones using animal cloning technology can be efficiently produced 100% transgenic clones without mosaic phenomenon.

본 발명에서의 체세포 복제 기술은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 국제특허출원 PCT/KR00/00707 "체세포 복제동물 및 그 생산 방법"(황 등, 2000.6.30)의 기술을 이용할 수 있다. 즉, 체세포 핵 이식은 탈핵 과정을 통해 미수정란으로부터 유전 물질(genetic material)을 포함한 핵을 제거하고 다른 체세포의 핵(nucleus)을 주입함으로써 이루어질 수 있다. 또한 이렇게 생산된 핵 이식란을 '재구성된 핵 이식란(reconstructed embryo)'이라고 하고, 상기 핵 이식된 재구성 핵 이식란을 체외 배양하여 발육시켜 대리모에 이식하여 체세포 복제 동물을 생산할 수 있다.The somatic cloning technique in the present invention may use the technique of the international patent application PCT / KR00 / 00707 "Somatic clone animal and its production method" (Hwang et al., 2000.6.30), which the inventor of the present invention has already filed. That is, somatic cell nuclear transfer may be performed by removing nuclei including genetic material from unfertilized eggs and injecting nucleus of other somatic cells through denuclearization. In addition, the nuclear transfer embryos thus produced are referred to as 'reconstructed embryos', and the nuclear transplanted reconstituted nuclear transfer embryos can be grown in vitro and transplanted into surrogate mothers to produce somatic cloned animals.

제 1 단계: 수핵 난자의 준비, 생체 외 성숙First step: preparation of the nucleus pulposus, in vitro maturation

본 발명에서 소의 난소에서 미성숙 난자를 채취 및 배양하여 성숙한 수핵 난자로 사용할 수 있다. 예를 들면, 헤페스 (HEPES, N-[hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]) 완충용액에 TCM199 (Tissue Culture Medium 199)가 용해된 세정용 TCM199 배지에서 채취된 미성숙 난자를 선별한 후, 5% CO2의 조건 하에 16 내지 22시간 동안 배양하여 난자를 성숙시킬 수 있다.In the present invention, immature eggs may be collected and cultured from bovine ovaries and used as mature nucleated pulmonary eggs. For example, screening immature eggs collected from TCM199 medium for washing, in which TCM199 (Tissue Culture Medium 199) is dissolved in HEPES (N- [hydroxyethyl] piperazine-N '-[2-ethanesulfonic acid]) buffer. After that, the eggs can be matured by incubating for 16-22 hours under the condition of 5% CO2.

이때, 사용되는 배양액은 TCM, 나트륨-피루브산 및 P/S 항생제가 포함된 배양용 TCM199 배양액에 에스트라디올(Estradiol, E2), 난포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone) 및 소 태아 혈청을 포함한다.In this case, the culture medium used includes estradiol (Estradiol, E2), follicle stimulating hormone (FSH) and fetal bovine serum in TCM199 culture medium containing TCM, sodium-pyruvic acid and P / S antibiotics.

제 2 단계: 수핵 난자의 탈핵Second stage: denuclearization of the nucleus pulposus

상기 제 1 단계에서 준비된 성숙한 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 수핵 난자의 투명대의 일부를 절개하고 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵된 난자를 작제할 수 있다. After removing the cumulus cells of the mature nucleated pulmonary oocytes prepared in the first step, a part of the zona pellucida of the nucleated nucleus pulposus can be cut and the cytoplasm including the first polar body can be removed to construct denuclearized eggs.

먼저, 성숙한 수핵 난자를 하이알루로니다제가 용해된 세정용 TCM199 배양액에 넣고, 난구 세포를 물리적으로 제거한 후, 세정용 TCM199 배양액으로 세정하여 준비할 수 있다. 그런 다음, 난구 세포가 제거된 난자를 사이토칼라신 B(cytochalasin B) 용액으로 옮기고, 미세작업장치(micromanipulator)를 이용하여 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 난자의 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 양의 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵할 수 있다. 이어, 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고, 배양용 TCM199 배양액에 정치시킨다. 이때 사용되는 사이토칼라신 B 용액은 사이토칼라신 B를 DMSO(dimethylsulfoxide)에 용해시키고, 이를 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 희석한 것이다. First, a mature nucleated pulmonary egg may be placed in a washing TCM199 culture solution in which hyaluronidase is dissolved, and after the oocytes are physically removed, it may be washed and prepared with a washing TCM199 culture solution. Then, the oocytes from which the oocytes were removed were transferred to cytochalasin B solution, and the incision was formed by incision of the zona pellucida using a micromanipulator to form an incision. Denucleation can be achieved by removing the cytoplasm including the first polar body in an amount corresponding to 10 to 15%. Subsequently, the denuclearized eggs are washed with a washing TCM199 culture solution and left in the culture TCM199 culture solution. The cytocalin B solution used at this time is dissolved in cytoscalin B in DMSO (dimethylsulfoxide), and diluted with a washing TCM199 culture solution added with fetal bovine serum.

자외선 하에서 Hoechst 33342 (Sigma Co.)로 염색된 세포질체를 관찰함으로써 탈핵을 확인할 수 있다.Denucleation can be confirmed by observing cytoplasm stained with Hoechst 33342 (Sigma Co.) under ultraviolet light.

제 3 단계: 공여 핵 세포의 준비Third Step: Preparation of Donor Nuclear Cells

공여 핵 세포의 준비를 위해 상기에서 형질감염된 세포를 PBS에서 세척할 수 있다. 그 후, 단일 세포 현탁을 위해 0.1% 트립신-EDTA를 사용하여 배양된 세포 들을 트립신 처리하여, 세포들을 펠릿화하고 0.5% (v/v) FBS가 포함된 200㎕ PBS에서 재현탁화시키고 핵 이식에 사용하기 전에 마이크로원심관으로 옮겨 준비할 수 있다.The transfected cells can be washed in PBS for the preparation of donor nuclear cells. Thereafter, cells cultured using 0.1% trypsin-EDTA for single cell suspension were trypsinized to pellet the cells, resuspended in 200 μl PBS with 0.5% (v / v) FBS and subjected to nuclear transfer. It can be transferred to a microcentrifuge tube for use before use.

제 4 단계: 공여핵 세포와 수핵 난자의 융합 및 활성화Fourth Step: Fusion and Activation of Donor Nucleus Cells and Nucleated Eggs

상기에서와 같이 준비된 형질감염된 공여 핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고, 이식된 핵 이식란을 전기융합을 통해 활성화시킬 수 있다.Transfected donor nuclear cells prepared as above may be transplanted into denuclearized eggs, and the transplanted nuclear transfer embryos may be activated through electrofusion.

먼저, 형질감염된 공여 핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 작제할 수 있다. 배양용 TCM199 배양액에 정치된 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고 PHA-P (phytohemagglutinin) 용액으로 이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여 핵 세포를 PHA-P 용액에 있는 난자의 투명대에 형성된 절개창으로 주입시켜서 핵 이식란을 작제할 수 있다. 이어, 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고 정치시킨다. 이때, 사용되는 PHA-P 용액은 PHA-P를 세정용 TCM199 배양액에 용해시킨 것이다.First, the transfected donor nuclear cells can be transplanted into denuclearized eggs to construct nuclear transfer eggs. The denucleated eggs left in the culture TCM199 culture are washed with the washing TCM199 culture and transferred to a PHA-P (phytohemagglutinin) solution, and then a donor pipette is used to transfer the donor nuclear cells to the zona pellucida in the PHA-P solution. Nuclear transplant embryos can be constructed by injecting into the formed incision. Subsequently, it is washed with a washing TCM199 culture solution and left to stand. At this time, the PHA-P solution used is to dissolve the PHA-P in the washing TCM199 culture.

상기 정치된 핵 이식란을 세포 조작기를 이용하여 전기융합시킬 수 있다. 먼저, 핵이식란을 세정용 TCM199 배양액이 첨가된 만니톨(mannitol) 용액에 넣고, 이를 세포 조작기에 연결시킨 2 개 전극 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣은 다음, 공여세포가 (+)전극을 향하도록 핵 이식란을 위치시킨다. 그런 다음, 전압은 0.75 내지 2.00kV/cm, 시간은 10 내지 20㎲, 횟수는 0.01 내지 10초, 바람직하게는 1초 간격으로 1 내지 5회, 바람직하게는 2회의 조건으로 직류전류를 통전하여 핵 이식 란을 전기융합시킬 수 있다. 융합된 핵 이식란을 만니톨 용액과 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고, 전기 사이토칼라신 B 용액에서 정치한 후 활성화시킬 수 있다. 이때 사용하는 만니톨 용액은 HEPES 완충용액에 MgSO₄ 또는 MgCl₂, BSA 및 만니톨이 용해된 pH 7.2 내지 7.4의 용액으로서 Ca2⁺가 포함되어 있다면 융합과 동시에 활성화되지만, Ca2⁺가 포함되어 있지 않다면 활성화시키는 과정을 수행한다. The leftover nuclear transfer embryos can be electrofused using a cell manipulator. First, the nuclear transfer embryos are placed in a mannitol solution to which the washing TCM199 culture is added, and then into a mannitol solution dispensed between two electrodes connected to a cell manipulator, and then the donor cells are directed toward the (+) electrode. Place the transplant. Then, the voltage is 0.75 to 2.00 kV / cm, the time is 10 to 20 mA, the number of times is 0.01 to 10 seconds, preferably 1 to 5 times at 1 second intervals, and preferably a DC current The nuclear transfer column can be electrofused. The fused nuclear transfer embryos can be washed with mannitol solution and a washing TCM199 culture solution and left in the cytokinecin B solution before activation. The mannitol solution used is MgSO ₄ or MgCl _2, BSA, and while mannitol is Ca2 ⁺ if included is enabled, fused at the same time as a solution of a soluble pH 7.2 to 7.4 in HEPES buffer, which activates if it is not Ca2 ⁺ include the Perform the process.

Ca2⁺가 포함되지 않은 만니톨 용액을 사용하여 세포 융합을 수행한 경우, 활성화시키는 과정은 융합된 핵 이식란을 암실에서 이오노마이신(ionomycin) 용액에 정치하여 활성화시킨 후, 소 태아 혈청 또는 BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 세척하고 정치하여 이오노마이신을 제거하여 행할 수 있다. 이때, 이오노마이신 용액은 DMSO에 이오노마이신을 용해시켜서 원액을 만들고 사용할 때, BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 희석하여 사용할 수 있다.When cell fusion was performed using mannitol solution without Ca2 ⁺ , the activating process was performed by activating the fused nuclear transfer embryos by standing in the ionomycin solution in the dark, and then adding fetal bovine serum or BSA. It can be performed by washing with the washed TCM199 culture solution and leaving it to stand to remove ionomycin. At this time, the ionomycin solution may be used by diluting with a washing TCM199 culture solution added with BSA when dissolving the ionomycin in DMSO to make a stock solution.

제 5 단계: 핵 이식란의 후활성화 및 체외 배양Step 5: Post-activation and in vitro culture of nuclear transfer eggs

활성화된 핵이식란을 후활성화시킨 후, 체외 배양한다.After the activated nuclear transfer embryos are post-activated, they are cultured in vitro.

소 태아 혈청 또는 BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액에 정치된 활성화된 핵 이식란을 사이클로헥시미드(cycloheximide) 용액 또는 디엠에이피(DMAP, 4-dimethylaminopurine) 용액에 침지하여 배양하여 후활성화시킨 다음, 체외 배양용 배지에서 5% CO₂ 배양기 또는 5% CO₂, 7% O₂, 88% N₂ 배양기를 사용하여 배양할 수 있다. Activated nuclear transfer embryos, which were left in fetal calf serum or BSA-added wash TCM199 culture, were immersed in cycloheximide or 4-dimethylaminopurine (DMAP) solution for incubation and then activated in vitro. The culture medium may be cultured using a 5% CO ₂ incubator or 5% CO ₂ , 7% O ₂ , 88% N ₂ incubator.

이때, 사이클로헥시미드 용액은 에탄올에 사이클로헥시미드를 용해시킨 용액으로서, 체외 배양용 배지에 첨가하여 사용하고, DMAP 용액은 DMAP를 체외 배양용 배지에 용해시켜 사용할 수 있다. 또한, 체외 배양용 배지는 NaCl, KCl, NaHCO₃, NaH₂PO₄, CaCl₂, Na-락테이트, 포도당, 페놀 레드, BSA, 카나마이신, 필수 아미노산, 비필수 아미노산, 글루타민 등을 포함하는 mSOF 배지(참조: 표 1)를 사용할 수 있다.In this case, the cycloheximide solution is a solution in which cycloheximide is dissolved in ethanol, and can be used after being added to an in vitro culture medium. The DMAP solution can be used by dissolving DMAP in an in vitro culture medium. In addition, the in vitro culture medium is mSOF medium containing NaCl, KCl, NaHCO ₃ , NaH ₂ PO ₄ , CaCl ₂ , Na-lactate, glucose, phenol red, BSA, kanamycin, essential amino acids, non-essential amino acids, glutamine, etc. (See Table 1) can be used.

선택적으로, 상기의 체외 배양된 핵 이식란을 동결 보존한 후, 필요한 때에 이를 융해시켜서 사용할 수도 있다. 핵 이식란을 동결할 경우, 먼저 동결할 수정란을 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 세정하고, P/S 항생제, CaCl₂, 포도당, MgCl₂, Na-피루베이트 및 PBS를 포함하는 동결액에 넣은 다음, 온도를 천천히 저하시킨 후, 액체 질소로 동결시킬 수 있다. Alternatively, the in vitro cultured nuclear transfer embryos may be cryopreserved and then melted and used when necessary. When freezing nuclear transfer eggs, the first embryos to be frozen are washed with PBS added with fetal bovine serum, and then placed in a freezing solution containing P / S antibiotic, CaCl ₂ , glucose, MgCl ₂ , Na-pyruvate and PBS. The temperature can be lowered slowly and then frozen with liquid nitrogen.

이처럼 동결된 핵 이식란을 융해시킬 때는 액체질소에서 꺼낸 핵 이식란을 상온에서 일정기간 동안 정치했다가 온수에 넣어 융해시킬 수 있다. 융해된 핵 이식란을 글리세롤, 자당, BSA 및 PBS가 포함된 융해용 배지에 넣고, 글리세롤의 양이 많은 배지에서 적은 배지로 차례대로 정치시켜서 핵 이식란 내의 동결액을 제거할 수 있다. When melting the frozen nuclear transfer embryos, the nuclear transfer embryos taken out of liquid nitrogen can be allowed to stand at room temperature for a certain period of time before being melted in warm water. The fused nuclear transfer embryos may be placed in a melting medium containing glycerol, sucrose, BSA and PBS, and then allowed to stand in turn in a medium containing a large amount of glycerol in order to remove the freezing liquid in the nuclear transfer embryos.

상기의 성숙한 홀스타인종의 소에서 유래한 형질 전환된 체세포를 공여 핵 세포로 하여 재조한 핵 이식란을 SNU-B1로 명명하여, 이를 2002년 6월 20일자로 국 제기탁기관인 생명공학연구소(KRIBB) 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 10286BP로 기탁하였다.Nuclear transfer embryos prepared using the transgenic somatic cells derived from cows of the mature Holstein species were named SNU-B1, which was established on June 20, 2002 by the Biotechnology Research Institute (KRIBB). It was deposited with KCTC 10286BP at the Gene Bank (KCTC, 52 Eun-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea).

성 분ingredient 농 도Concentration NaClNaCl 99.1∼106mM99.1 to 106 mM KClKCl 7.2mM7.2mM NaHCO₃ NaHCO ₃ 25mM25mM NaH₂PO₄ NaH ₂ PO ₄ 1.2mM1.2mM Na-락테이트Na-lactate 5mM5 mM CaCl₂·2H₂OCaCl ₂ · 2H ₂ O 1.7mM1.7mM MgCl₂·6H₂OMgCl ₂ · 6H ₂ O 0.5mM0.5mM Na-피루베이트Na-pyruvate 0.3mM0.3mM 포도당glucose 1.5mM1.5mM 페놀레드Phenol red 10㎍/ℓ10 μg / ℓ BSABSA 8㎎/㎖8mg / ml 카나마이신Kanamycin 0.75㎍/㎖0.75 µg / ml 필수아미노산Essential amino acid 2%2% 비필수아미노산Non-Essential Amino Acids 1%One% L-글루타민L-Glutamine 1mM1 mM ITSITS 0.5%0.5%

제 6 단계: 형질전환 복제소의 출산Sixth Step: Childbirth of Transgenic Clones

상기의 체외 배양된 핵 이식란을 대리모에 이식하여 송아지를 생산할 수 있다. 이때, 핵 이식란은 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적된 상태로 대리모의 자궁에 이식될 수 있다.The ex vivo cultured nuclear transfer embryos may be transplanted into surrogate mothers to produce calves. In this case, the nuclear transfer eggs may be transplanted into the uterus of the surrogate mother in a state of being deposited in PBS to which fetal bovine serum is added.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples according to the gist of the present invention.

실시예 1: 사람 프로유로키나제(proUK)를 발현하는 유전자의 도입 및 적중을 위한 벡터의 작제Example 1: Construction of a vector for the introduction and targeting of genes expressing human prourokinase (proUK)

(1) 중합효소연쇄반응(PCR)(1) polymerase chain reaction (PCR)

PCR은 사이키(Saiki) 등(1985)에 의해 처음으로 사용된 것의 변형 방법으로 수행되었다. PCR 증폭은 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM dNTP (Takara Shuzo, Japan), 50 pmol의 업스트림 및 다운스트림 프라이머 및 2.5 유니트(unit)의 TaKaRaTA Taq 폴리머라제 (Takara)를 포함하는 50㎕ 반응 혼합물 내에서 10ng의 주형(template)과 함께 33 내지 49 사이클 동안 수행되었다. PCR was performed as a modification of the first used by Saiki et al. (1985). PCR amplification was performed with 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 1 mM dNTP (Takara Shuzo, Japan), 50 pmol of upstream and downstream primers and 2.5 units of TaKaRaTA Taq polymerase. (Takara) was carried out for 33 to 49 cycles with 10 ng of template in a 50 μl reaction mixture containing (Takara).

반응 사이클은 94℃ 에서, 30초간 변성(denature), 55℃ 에서 33초간 어닐링(annealing), 72℃ 에서 90초간 연장(extension) 및 72℃ 에서 15분간 마지막 연장(final extension)시키는 과정으로 수행되었다.The reaction cycle was carried out with denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 55 ° C. for 33 seconds, extension at 72 ° C. for 90 seconds and final extension at 72 ° C. for 15 minutes. .

(2) 발현 플라스미드 작제(2) Expression Plasmid Construction

모든 플라스미드들은 표준 DNA 클로닝 과정 (Maniatis 등, 1982) 및 PCR 방법에 의해 작제되었다. 벡터를 작제하기 위한 pcDNA3는 Invitrogen (Groningen, Netherlands)로부터 구입하였다. p베타(pbeta)3.7 플라스미드를 위한 3.7 kb의 소 베타 카세인 프로모터는 주형으로 다음의 소의 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭으로 제조하였다.All plasmids were constructed by standard DNA cloning procedures (Maniatis et al., 1982) and PCR methods. PcDNA3 for constructing the vector was purchased from Invitrogen (Groningen, Netherlands). The 3.7 kb bovine beta casein promoter for the pbeta 3.7 plasmid was prepared by PCR amplification using the following bovine genomic DNA as a template.

정 방향 프라이머(서열번호 1): Forward primer (SEQ ID NO: 1):

GTCGGTACCAACATGT CGAATCCATCTCTATCAATTAATGTAATT; GTCGGTACCAACATGT CGAATCCATCTCTATCAATTAATGTAATT;

역 방향 프라이머(서열번호 2):Reverse primer (SEQ ID NO: 2):

GACGGATCCT CATTATCTCAATTCCAGGGAATGGGAAGATGAGGAGACGGATCCT CATTATCTCAATTCCAGGGAATGGGAAGATGAGGA

상기에서 작제된 소 베타 카세인 프로모터는 pcDNA3의 KpnI-BamHI 자리에 삽입되었다. 또한, p베타 2.1-proUK 플라스미드의 작제를 위한 사람 proUK 유전자(서열번호 3)는 주형으로 사람 게놈 DNA로 PCR 증폭하여 제조하여 p베타3.7 벡터의 XhoI-ApaI 자리에 삽입하였다. p베타 2-ProUK는, 주형으로 pEGFP-N1 벡터(Clontech)로 PCR 증폭하여 제작한 GFP ORF의 SmaI-BstBI 단편을 p베타2.1-proUK 플라스미드 내로 삽입함으로써 작제되었다. 모든 작제된 플라스미드는 시퀀싱 킷(U.S. Biochemical Co.)을 사용하여 DNA 시퀀싱에 의하여 확인되었다.The bovine beta casein promoter constructed above was inserted at the KpnI-BamHI site of pcDNA3. In addition, the human proUK gene (SEQ ID NO: 3) for constructing the pbeta 2.1-proUK plasmid was prepared by PCR amplification with human genomic DNA as a template and inserted into the XhoI-ApaI site of the pbeta3.7 vector. pbeta 2-ProUK was constructed by inserting the SmaI-BstBI fragment of GFP ORF prepared by PCR amplification with the pEGFP-N1 vector (Clontech) as a template into the pbeta2.1-proUK plasmid. All constructed plasmids were confirmed by DNA sequencing using the sequencing kit (U.S. Biochemical Co.).

p베타 2-ProUK의 작제도는 도 1에서와 같다. 즉, 도 1은 소 β-카세인 프로모터, 사람 프로유로키나제 유전자(5,000bp), 암피실린 저항 유전자 및 마커 유전자로 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터의 특징을 나타내 는 개략도이다. PCR 증폭으로 준비한 타겟 유전자(사람 프로유로키나제), 소 β-카세인 프로모터 및 GFP는 TA 클로닝 방법으로 P베타-2 플라스미드 벡터 내로 삽입되었다. 발현 플라스미드의 Xho I 및 Apa I 부위로 원하는 유전자 등이 올바르게 삽입되었는지를 분석하기 위해 제한 효소로 절단하여 아가로즈겔 전기영동하였다. The scheme of pbeta 2-ProUK is as in FIG. That is, FIG. 1 is a schematic diagram showing the characteristics of a vector comprising a bovine β-casein promoter, a human prourokinase gene (5,000bp), an ampicillin resistance gene and a gene encoding a green fluorescent protein (GFP) as a marker gene. Target genes prepared by PCR amplification (human prourokinase), bovine β-casein promoter and GFP were inserted into the Pbeta-2 plasmid vector by TA cloning method. Agarose gel electrophoresis was performed by digestion with restriction enzymes to analyze whether the desired genes were correctly inserted into the Xho I and Apa I sites of the expression plasmid.

(3) 뉴클레오티드 서열 분석(Nucleotide sequencing)(3) Nucleotide sequencing

뉴클레오티드 서열은 디데옥시 체인 종결 방법(dideoxy chanin termination method)에 의해 확인되었다(Sanger 등, 1997). 서열은 35S-dATP (800 Ci/mmol, Amersham)이 삽입된 시쿼나제(sequenaser)로 분석되었다. DNA는 완충-구배(buffer-gradient) 또는 전해질-구배(electrolyte-gradient) 방법을 사용하여 6% PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리되었다. 모든 서열분석 방법은 US Biochemicals에 의해 제공되는 서열분석 키트(Sequencing kit)의 안내문에 따라 수행되었다. Nucleotide sequences have been identified by the dideoxy chanin termination method (Sanger et al., 1997). The sequence was analyzed by sequencena inserted with 35S-dATP (800 Ci / mmol, Amersham). DNA was isolated by 6% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) using either buffer-gradient or electrolyte-gradient methods. All sequencing methods were performed according to the instructions of the sequencing kit provided by US Biochemicals.

실시예 2: 체세포주의 확립Example 2: Establishment of Somatic Cell Line

먼저, 소의 귀에서 채취한 피부 내측의 조직을 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco BRL, Life Technologies, USA)로 세정하고 100 메시(mesh)의 크기로 세절한 다음, 이를 상기 인산염 완충 식염수에 넣고 0.25% 트립신, 1mM EDTA 및 1mg/ml 콜라게나제(collagenase type II)를 첨가하여 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기 내에 1 시간 동안 정치시킨 후, 원심세정시킨다. 그런 다음, 10% 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 1% 비필수 아미노산 용액 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium, Gibco BRL, Life Technologies, USA) 배양액에서 부유시키고, 이를 세포 배양용 디쉬로 옮겨 39℃ , 5% CO₂의 조건 하에 포화습도 배양기 내에서 배양하여, 세포주를 수득하였다. DMEM에서 배양 중인 세포주를 0.5% 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM에서 7일간 배양한 다음, 배지를 제거하고 0.25% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 2분간 정치시켰다. 그런 다음, 1% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 재부유시켜서 세포의 수가 2000개/0.1ml가 되도록 조절하고, 이를 에펜돌프(eppendorf) 시험관에 분주하여 공여세포를 준비하였다.First, the tissue inside the skin collected from the cow's ear was washed with phosphate buffered saline (PBS, Gibco BRL, Life Technologies, USA) and cut into 100 mesh sizes, which was then placed in the phosphate buffered saline and 0.25%. Trypsin, 1 mM EDTA and 1 mg / ml collagenase type II were added and allowed to stand in a saturated humidity incubator at 39 ° C., 5% CO ₂ for 1 hour, followed by centrifugal washing. It was then suspended in Dulbecco's modified Eagles medium, Gibco BRL, Life Technologies, USA (DMEM) culture with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% non-essential amino acid solution and P / S antibiotic, It was transferred to a cell culture dish and cultured in a saturated humidity incubator under conditions of 39 ° C. and 5% CO ₂ to obtain a cell line. Cell lines incubated in DMEM were incubated for 7 days in DMEM with 0.5% fetal calf serum, and then allowed to stand for 2 minutes by removing the medium and adding 0.25% trypsin, 1 mM EDTA solution. Thereafter, the cells were resuspended in PBS added with 1% fetal bovine serum to adjust the number of cells to 2000 / 0.1 ml, and the cells were dispensed into eppendorf test tubes to prepare donor cells.

실시예 3: proUK 유전자의 도입 및 적중을 통한 체세포의 형질감염Example 3: Transfection of Somatic Cells Through Introduction and Targeting of the ProUK Gene

작제된 p베타2.1-proUK 발현 플라스미드를 FuGene6(Cat. No. 1814443; Roche Molucular Biochemicals, IN, USA)을 사용하는 리피드-매개 방법으로 공여핵 세포 내로 삽입하였다. The constructed pbeta2.1-proUK expressing plasmid was inserted into donor nucleus cells by the lipid-mediated method using FuGene6 (Cat. No. 1814443; Roche Molucular Biochemicals, IN, USA).

세포들은 형질전환 전 1일 동안 2차 배양되었다. 세포들은 35㎜ 디쉬에서 2㎖ 당 1~3 ⅹ 10⁵ 세포의 수로 플레이팅되고, 50~80%의 컨플런시(confluency)에 도달할 때까지 밤새 배양되었다. 그 후, p베타2.1-proUK 발현 플라스미드는 실험자 프로토콜에 따른 FuGene6를 사용하여 세포주 내로 삽입되었다. 간단히 말해서, p베타2.1-proUK 유전자(1㎍) + 형질전환 시약(3㎍) + DMEM(96㎕)의 혼합물을 상온에 서 15분간 배양한 후에 배양 배지상에 오버레이(overlay)하였다. Cells were secondary cultured for 1 day before transformation. Cells were plated in a number of 1-3 3 10 ⁵ cells per 2 ml in a 35 mm dish and incubated overnight until a confluency of 50-80% was reached. The pbeta2.1-proUK expression plasmid was then inserted into the cell line using FuGene6 according to the experimenter protocol. Briefly, a mixture of pbeta2.1-proUK gene (1 μg) + transformation reagent (3 μg) + DMEM (96 μl) was incubated at room temperature for 15 minutes and then overlayed on the culture medium.

실시예 4: 사람 proUK를 발현하는 유전자가 도입된 세포의 선별, 증식 및 동결 보존Example 4 Selection, Proliferation and Cryopreservation of Cells Incorporating Gene Expressing Human ProUK

사람 proUK 유전자를 도입된 세포주는 항생제 또는 GFP의 발현을 관찰함으로써 선별하였다. 유전자 적중시 DNA 구조체에 이용된 양성 마커인 암피실린 등 항생제에 대한 저항성 유전자는 세포 내에서 재조합이 정확하게 이루어지면 저항성 유전자 및 GFP 유전자가 발현된다. Cell lines into which the human proUK gene was introduced were selected by observing the expression of antibiotics or GFP. Resistance genes for antibiotics such as ampicillin, which is a positive marker used in DNA constructs during gene targeting, are expressed in resistance genes and GFP genes when recombination is correctly performed in cells.

본 발명에는 암피실린(ampicillin) 항생제를 통한 선별 과정이 이루어졌으며, 3-4일 간격으로 3주간 선별하였다. 또한, 형질감염 2일 후에 형질감염된 각 세포를 자외선 하에서 표준 플루오레세인 이소티오사이아네이트 (FITC; 여기 파장: 450-490 ㎚; B-mode filter, Nikon, Japan) 필터 셋을 사용하여 검사하여 GFP의 발현 여부를 검사하여 형질감염된 세포를 선별하였다(도 2).In the present invention, a screening process was performed using ampicillin antibiotics, and the screening was performed at 3-4 day intervals for 3 weeks. In addition, two days after transfection, each transfected cell was examined under UV using a standard fluorescein isothiocyanate (FITC; excitation wavelength: 450-490 nm; B-mode filter, Nikon, Japan) filter set. Transfected cells were selected by examining the expression of GFP (FIG. 2).

전술한 항생제 선별 또는 GFP 발현 여부로 유전자 적중이 확인된 사람 proUK 유전자가 도입된 세포는 핵 이식용 세포로 증식 배양하였다. 특히 섬유아세포는 다수의 세포로 증식되기까지 상당한 기간이 소요되고 점차 세포가 노화되어 증식이 둔화되면서 성장을 멈추기 때문에 단시간 내 건강한 다수의 적중된 세포를 배양하는 것이 관건이다. 암피실린 항생제 선별 후 세포들은 하나의 집락(colony)으로 자라게 되는데 이를 트립신으로 처리하여 96-웰의 배양용기로 옮겨 배양한 후 이들이 증식되면 이후 24-웰로 옮겨 배양하고 더 나아가서 12-웰과 6-웰까지 증식 배양 을 실시하였다. The cells into which the human proUK gene, whose gene hit was confirmed by the antibiotic selection or GFP expression, were introduced and cultured as cells for nuclear transfer. In particular, it is important to culture a large number of healthy hit cells in a short time because fibroblasts take a considerable time to proliferate into a large number of cells and gradually stop growing as the cells age and proliferate. After the selection of ampicillin antibiotics, the cells grow into a colony, which is treated with trypsin and transferred to a 96-well culture vessel, and when they multiply, they are transferred into 24-well cultures and further, 12-well and 6-well Proliferation culture was performed until.

증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위하여 각 단계마다 동결 보존하였다. 특히 소수의 세포를 동결 보존하여 융해했을 때 생존성과 핵 이식 시 핵 공여세포로서의 안정성에 적합토록 해야 한다. Cryopreservation was carried out at each step for efficient preservation of proliferation cultured cells. In particular, few cells should be cryopreserved and fused to ensure viability and stability as nuclear donor cells during nuclear transfer.

실시예 5: 수핵 난자의 준비Example 5 Preparation of Hydronuclear Cells

도축장에서 채취된 소의 난소로부터 18G 주사침(needle)이 장착된 10ml 주사기를 사용하여 직경 4mm 내외의 난포를 흡입한 다음, 1cm 간격의 격자 눈금을 그은 100mm 디쉬에 난포를 옮긴 후, 난구 세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 균질한 난자를 선별하였다. A 10 ml syringe equipped with an 18G needle was used to inhale follicles around 4 mm in diameter from a cow's ovary collected at a slaughterhouse, and then the follicle cells were sufficiently attached after transferring the follicles to a 100 mm dish with a grid scale of 1 cm intervals. Eggs were selected and homogeneous cytoplasm.

선별된 난자를 세정용 TCM199 배양액(참조: 표 2)이 2ml씩 분주된 35mm 디쉬에서 3회에 걸쳐 세정하고, 배양용 TCM199 배양액(참조: 표 3)으로 최종적으로 세정한 다음, 에스트라디올(Estradiol) 용액 (참조: 표 4) 0.5㎕, 난포자극호르몬 용액 (참조: 표 5) 12.5㎕, 배양용 TCM199 배양액 450㎕ 및 10% 소 태아 혈청이 포함된 배지에서 5% CO₂의 조건 하에 20시간 동안 배양하여 수핵 난자를 준비하였다.Selected eggs were washed three times in a 35 mm dish in which 2 ml of a washing TCM199 culture (see Table 2) was dispensed, and finally washed with a culture TCM199 culture (see Table 3), and then estradiol (Estradiol). ) Solution (see Table 4) 0.5 μl, follicle stimulating hormone solution (see Table 5) 12.5 μl, culture TCM199 culture medium 450 μl and 10% fetal bovine serum in a medium containing 5% CO ₂ for 20 hours Incubated to prepare the nucleus pulposus egg.

세정용 TCM199 배양액TCM199 medium for washing 성 분ingredient 농 도Concentration TCM 분말TCM Powder Gibco 31100-027Gibco 31100-027 HEPESHEPES 10mM10 mM NaHCO₃ NaHCO ₃ 2mM2 mM BSABSA 0.5% W/V0.5% W / V P/S항생제P / S antibiotic 1% (페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)1% (penicillin 10000IU, streptomycin 10mg)

배양용 TCM199 배양액TCM199 culture solution for culture 성 분ingredient 농 도Concentration TCM 액체TCM liquid Gibco 11150-059Gibco 11150-059 Na-피루베이트Na-pyruvate 1mM1 mM P/S항생제P / S antibiotic 1% (페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)1% (penicillin 10000IU, streptomycin 10mg)

에스트라디올 용액Estradiol solution 성 분ingredient 농 도Concentration 에스트라디올Estradiol 5mg5mg 에탄올ethanol 10ml10 ml

난포자극호르몬 용액Follicle Stimulating Hormone Solution 성 분ingredient 농 도Concentration 난포자극호르몬Follicle Stimulating Hormone 2AU2AU 배양용 TCM199배양액TCM199 culture solution for culture 10ml10 ml

실시예 6: 체세포의 핵 이식Example 6: Nuclear Transplantation of Somatic Cells

상기 실시예 5에서 준비된 수핵 난자를 세정용 TCM199 배양액에서 1회 세정 하고, 5ml의 세정용 TCM199 배양액에 하이알루로니다제(Sigma Chemical Co., USA) 0.0500g을 용해시킨 용액 111㎕과 세정용 TCM199 배양액 1ml을 혼합하여 최종 농도를 0.1%로 적정한 하이알루로니다제 용액 내에 난자를 옮긴 다음, 난구 세포를 제거하고 세정용 TCM199 배양액에서 3회 세정하고 정치시켰다. 이어, 7.5mg/ml의 농도가 되도록 DMSO에 사이토칼라신 B (Sigma Chemical Co., C-6762, USA)를 용해시킨 용액 1㎕와 10% 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 TCM199 배양액 1ml을 혼합한 사이토칼라신 B 용액으로 난자를 옮기고, 미세작업장치(Narishige, Japan)를 사용하여 정치된 수핵 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 량의 난자의 세포질을 제거함으로써 난자를 탈핵시켰다.The nucleated nucleus pulposus prepared in Example 5 was washed once in a washing TCM199 culture medium, and 111 μl and a solution for dissolving 0.0500 g of hyaluronidase (Sigma Chemical Co., USA) in a 5 ml washing TCM199 culture medium. 1 ml of TCM199 culture was mixed to transfer the eggs into a solution of hyaluronidase with a final concentration of 0.1%. The egg cells were then removed, washed three times in a washing TCM199 culture, and allowed to stand. Subsequently, 1 μl of a solution in which cytokalcin B (Sigma Chemical Co., C-6762, USA) was dissolved in DMSO to a concentration of 7.5 mg / ml, and 1 ml of washing TCM199 culture solution containing 10% fetal bovine serum were mixed. Transfer the egg to one cytokalcin B solution, and use a micro-working device (Narishige, Japan) to cut the zona pellucida of the stationary nucleus pulposus to form an incision, which is equivalent to 10-15% of the total cytoplasm. The egg was denuclearized by removing the cytoplasm of the egg.

좀 더 구체적으로 탈핵 과정을 설명하면, 작업용 디쉬를 미세작업장치의 미세작업판 위에 놓고, 미세작업장치의 왼쪽 암(arm)에는 고정용 피펫을, 오른쪽 암에는 절개용 피펫을 장착하였다. 그런 다음, 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고 절개용 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 피펫 조정기를 중립에 놓아 피펫이 상하 좌우로 자유롭게 움직일 수 있도록 조정하였다. 두 피펫을 작업용 미소적에서 상하 유동시키면서, 피펫이 디쉬의 테두리에 닿지 않도록 각도를 조정하고, 피펫 끝을 미소적의 중앙에 위치시켰다. 내경 200㎛ 이상의 세정용 마우스 피펫을 이용하여 세정용 TCM199 배양액에서 난자를 사이토칼라신 B 용액으로 이동시켰다. 이어, 미세작업장치의 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자에 먼저 초점을 맞추고, 2개의 피펫을 상하로 움직여 초점을 조정하였다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용 피펫의 12시 방향에 제 1극체가 위치하도록 하고, 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤, 유압을 걸어 난자를 고정시켰다. In more detail, the denuclearization process was performed. The working dish was placed on the microworking board of the microworking apparatus, and the left arm of the microworking apparatus was equipped with a fixing pipette, and the right arm was equipped with an incision pipette. Then, the fixing pipette was positioned at 9 o'clock and the incision pipette was placed at 3 o'clock. The pipette adjuster was placed in neutral to adjust the pipette to move freely up, down, left and right. The two pipettes were flowed up and down in the working micro drop, angled so that the pipette did not touch the rim of the dish and the pipette tip was positioned in the center of the micro drop. Using a washing mouse pipette with an inner diameter of 200 μm or more, the eggs were transferred to a cytocalacin B solution from the washing TCM199 culture solution. Then, using the coarse and fine screws of the micro-working device, the eggs were first focused, and the two pipettes were moved up and down to adjust the focus. The two pipettes were moved so that the first pole body was positioned at the 12 o'clock position of the fixing pipette, the fixing pipette was brought into close contact with the egg at the 9 o'clock position, and the oil was fixed by applying hydraulic pressure.

도 3은 고정용 피펫과 절개용 피펫으로 수핵 난자의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 절개용 피펫(2)을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 후, 세포질에 손상을 가하지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시켰다. 고정용 피펫(1)에 압력을 걸어 난자(3)를 분리하고, 절개용 피펫이 통과한 제 1극체 상단부의 투명대에 고정용 피펫을 접촉시킨 다음, 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개하였다. Figure 3 shows the process of cutting the zona pellucida of the nucleus pulposus with a fixing pipette and an incision pipette. As shown in Fig. 3, the incision pipette 2 was stabbed at 1 o'clock and passed through the zona pellucida, and then penetrated to 11 o'clock with care not to damage the cytoplasm. The oocytes 3 were separated by applying pressure to the fixing pipette 1, and the fixing pipette was contacted with the transparent zone of the upper end of the first polar body through which the cutting pipette passed, and then the two pipettes were rubbed to cut the transparent zone.

도 4는 수핵 난자의 제 1 극체와 핵을 제거하는 탈핵 과정을 나타낸다. 도 4에서 보듯이 난자(3)를 회전시켜 절개창을 수직으로 위치시키고, 고정용 피펫(1)을 난자의 밑 부위에 위치시켜 난자가 아래쪽으로 움직이지 못하도록 지지한 다음, 절개용 피펫(2)을 난자의 위에서 가볍게 눌러 난자를 탈핵시켰다. 이처럼 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 3회 세정하고, 배양용 TCM199 배양액에 정치시켰다. Figure 4 shows the denuclearization process of removing the first polar body and nucleus of the nucleus pulposus egg. As shown in FIG. 4, the incision window is vertically positioned by rotating the egg 3, and the fixing pipette 1 is positioned at the bottom of the egg to support the egg from moving downward, and then the incision pipette 2. The egg was denuclearized by pressing lightly on the egg. The denucleated eggs were washed three times with the washing TCM199 culture and left in the culture TCM199 culture.

그런 다음, 미세작업장치를 사용하여 탈핵된 수핵 난자에 준비된 공여세포를 이식하였다. 먼저, 5mg의 PHA-P를 10ml의 세정용 TCM199 배양액에 용해시킨 용액 100㎕과 400㎕의 세정용 TCM199 배양액을 혼합한 PHA-P 용액으로 작업용 디쉬 상단 중앙에 4㎕의 이식용 미소적을 만들고, 1% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 이식용 미소적 위 아래에 각각 1개씩의 4㎕의 공여세포 미소적을 만들었다. 이들 미소적을 미네랄 오일로 도포한 후, 작업용 디쉬를 미세작업판에 위치시켰다.The donor cells were then transplanted into denucleated nucleated oocytes using a microworking apparatus. First, make 4 microliters of graft microparticles at the center of the top of the working dish with a PHA-P solution containing 100 μl of a solution in which 5 mg of PHA-P was dissolved in 10 ml of a washing TCM199 medium and 400 μl of a washing TCM199 medium. PBS with 1% fetal bovine serum was used to make 4 μl of donor cell microparticles, one above and one below, for transplantation. After applying these microparticles with mineral oil, the working dish was placed on the microworking board.

미세작업장치에 장착된 절개용 피펫을 이식용 피펫으로 교체한 후, 정치된 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 3회 세정하고, 이식용 미소적으로 이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여세포를 이식용 미소적으로 이동시켰다. After replacing the incision pipette mounted in the microworking device with the transplant pipette, the settled denucleated eggs were washed three times with the washing TCM199 culture solution, and then transferred to the transplant microscopically, and then donated using the transplant pipette. The cells were transferred microscopically for transplantation.

도 5는 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸다. 도5에서 보듯이, 탈핵된 난자(3)의 절개창을 양 피펫과 1시 방향으로 놓고 고정용 피펫(1)으로 고정한 다음, 이식용 피펫(4)을 절개창으로 주입하고, 유압으로 공여세포를 주입하여 핵이식란을 작제하였다. 이처럼, 작제된 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액으로 옮겨서 3회 세정 후, 정치시켰다.5 shows a process for transplanting somatic cells into denuclearized eggs. As shown in Figure 5, the incision of the denuclearized egg (3) is placed with both pipettes in the 1 o'clock direction and fixed with a fixing pipette (1), and then the implantation pipette (4) is injected into the incision, hydraulically donor cells Nucleated egg was constructed by injecting. Thus, the constructed nuclear transfer embryos were transferred to the washing TCM199 culture solution, washed three times, and allowed to stand.

실시예 7: 세포 융합 및 활성화Example 7: Cell Fusion and Activation

BTX-세포 조작기(ECM 2001, BTX, USA)를 사용하여 핵 이식란을 전기 융합하여 활성화시켰다.Nuclear transplanted eggs were activated by electrofusion using a BTX-cell manipulator (ECM 2001, BTX, USA).

0.5mM HEPES 완충용액(pH 7.2)에 0.1mM MgSO4, 0.05% BSA 및 0.28M 만니톨을 용해시킨 만니톨 용액 15㎕을 세정용 마우스 피펫으로 핵 이식란이 있는 세정용 TCM199 배양액에 첨가하고, 1분간 정치시켰다. 그런 다음, 세정용 마우스 피펫을 이용하여 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액이 첨가된 만니톨 용액에 주입하여 다시 1분간 정치시키고, 세정용 마우스 피펫을 이용하여 핵 이식란을 만니톨 용액에 넣었다. 이어, 핵 이식란을 BTX-세포 조작기에 연결시킨 2개 전극(3.2mm chamber No. 453) 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣고, 공여세포가 (+)전극을 향하도록 핵 이식란을 위치시켰다. 전압은 1kV/cm, 시간은 15㎲, 횟수는 1초 간격으로 2회의 조건에서 직류전류를 통전하여 핵 이식란을 전기융합시켰다. 융합된 핵 이식란을 만니톨 용액을 거쳐 세정용 TCM199 배양액으로 옮긴 후, 3회 세정하였다.15 μl of mannitol solution dissolved in 0.1 mM MgSO 4, 0.05% BSA, and 0.28 M mannitol in 0.5 mM HEPES buffer (pH 7.2) was added to the washing TCM199 culture with the nuclear transfer embryos using a washing mouse pipette and allowed to stand for 1 minute. . Then, the nuclear transfer egg was injected into the mannitol solution to which the washing TCM199 culture solution was added using a washing mouse pipette, and allowed to stand for another minute, and the nuclear transfer egg was put into the mannitol solution using the washing mouse pipette. Subsequently, the nuclear transfer embryos were placed in a mannitol solution dispensed between two electrodes (3.2 mm chamber No. 453) connected to a BTX-cell manipulator, and the nuclear transfer embryos were positioned so that the donor cells face the positive electrodes. The nuclear transfer embryos were electrofused by energizing a direct current under two conditions at a voltage of 1 kV / cm, a time of 15 mA, and a frequency of 1 sec. The fused nuclear transfer embryos were transferred to rinsing TCM199 culture via mannitol solution and washed three times.

DMSO 1.34ml에 이오노마이신(Sigma Chemical Co., USA) 1mg을 용해시키고, 최종농도가 5 M이 되도록 1% BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액을 첨가하여 제조된 이오노마이신 용액에 융합된 핵 이식란을 암조건에서 4분간 정치하여 활성화시킨 후, 융합된 핵 이식란을 10% 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 배지가 분주된 35mm 디쉬 내에서 5분간 정치시켜서 이오노마이신을 제거하였다. Nucleus fused to an ionomycin solution prepared by dissolving 1 mg of ionomycin (Sigma Chemical Co., USA) in 1.34 ml of DMSO, and adding a washing TCM199 culture solution containing 1% BSA to a final concentration of 5 M. After activating the transplanted eggs for 4 minutes in the dark condition, the fused nuclear transplanted eggs were allowed to stand for 5 minutes in a 35 mm dish to which 10% fetal bovine serum was added to remove the ionomycin.

실시예 8: 융합된 핵 이식란의 후활성화 및 배양Example 8: Post-Activation and Culture of Fused Nuclear Transplanted Eggs

에탄올 100ml에 사이클로헥시미드(Sigma Chemical Co., USA) 1g을 용해시키고, 최종농도가 10㎍/㎖가 되도록 체외 배양용 배지인 mTALP (참조: 표 1)과 혼합한 사이클로헥시미드 용액 25㎕에 전기 활성화된 핵 이식란을 침지하고, 4시간 동안 배양하여 후활성화시켰다. 그런 다음, 검란하여 선별된 핵이식란을 mTALP에 넣고, 5% CO2 배양기에서 7일간 배양하였다. Cycloheximide solution 25 g of cycloheximide (Sigma Chemical Co., USA) was dissolved in 100 ml of ethanol and mixed with mTALP (see Table 1), an in vitro culture medium, to obtain a final concentration of 10 µg / ml. Electron-activated nuclear transfer eggs were soaked in [mu] l and incubated for 4 hours to post-activate. Then, the nucleated embryos selected by the enamel were placed in mTALP and incubated for 7 days in a 5% CO2 incubator.

본 발명자들은 상기 실시예에 따라 제조한 핵 이식란을 SNU-B1로 명명하여, 이를 2002년 6월 20일자로 국제기탁기관인 생명공학연구소(KRIBB) 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 10286BP로 기탁하였다.The present inventors named the nuclear transfer embryos prepared according to the above embodiment as SNU-B1, which was dated June 20, 2002, and was assigned to the KRIBB Gene Bank (KCTC, 52 Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea). Deposited with KCTC 10286BP.

실시예 9: 핵 이식란의 동결보존, 융해 및 이식Example 9: Cryopreservation, Thawing and Transplantation of Nuclear Transplanted Eggs

상기 핵 이식란을 장기간 보존하기 위하여, 동결 보존을 수행하였다. 먼저, 동결용 배지(참조: 표 6, 표 7)를 35mm 디쉬에 분주하고, 동결기를 가동하여 -5 를 유지시킨 다음, 동결할 핵 이식란을 선발하여 10% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 세정하고 동결용 배지에 넣어 20분간 정치시켰다. 이어, 0.25ml 스트로우(straw)의 양 끝단에 공기층을 2층씩 만들어, 가운데에 수정란이 포함된 동결용 배지를 흡입하여 수정란을 장착하고, 가열한 집게(forcep)를 사용하여 열 밀봉(heat sealing)하였다. 그런 다음, -5℃ 에서 동결기에 스트로우를 장착하고, 5분간 이 온도를 유지시킨 다음, 액체질소로 예냉한 집게로 스트로우의 하단을 살짝 집어주어 식빙(seeding)시켰다. 식빙한 직후, -0.3/min의 속도로 -30℃까지 온도를 하강시킨 다음, -30℃가 되면 10분간 온도를 유지시키고, 이를 액체질소 탱크에서 동결보존하였다.To preserve the nuclear transfer embryos for a long time, cryopreservation was performed. First, freezing medium (see Tables 6 and 7) was dispensed into 35 mm dishes, the freezer was run to maintain -5, and then nuclear transfer eggs to be frozen were selected and washed with PBS added with 10% fetal bovine serum. The mixture was placed in a freezing medium and allowed to stand for 20 minutes. Subsequently, two layers of air are formed at each end of the 0.25 ml straw, and the fertilized egg is mounted by sucking the freezing medium containing the fertilized egg in the middle, and heat sealing using a heated forcep. It was. The straw was then placed in the freezer at −5 ° C., held at this temperature for 5 minutes, and then seeded by slightly picking the bottom of the straw with forceps precooled with liquid nitrogen. Immediately after the ice, the temperature was lowered to −30 ° C. at a rate of −0.3 / min, and then maintained at −30 ° C. for 10 minutes, and cryopreserved in a liquid nitrogen tank.

동결용 PBSFreeze PBS 성 분ingredient 농 도Concentration PBS(1x)PBS (1x) Gibco 14190-144Gibco 14190-144 Na-피루베이트Na-pyruvate 0.033mM0.033mM 포도당glucose 0.15mM0.15mM CaCl₂·2H₂OCaCl ₂ · 2H ₂ O 0.171mM0.171mM P/S항생제P / S antibiotic 1% (페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)1% (penicillin 10000IU, streptomycin 10mg) MgCl₂·6H₂OmMgCl ₂ 6H ₂ Om 0.049mM0.049mM

동결용 배지Freezing Badge 성 분ingredient 농 도Concentration 동결용 PBS(표 8)Freezing PBS (Table 8) 2.25ml(45%)2.25 ml (45%) 소 태아 혈청Fetal bovine serum 2.25ml(45%)2.25 ml (45%) 글리세롤Glycerol 0.5ml(10%)0.5 ml (10%)

이처럼 동결 보존한 핵 이식란을 융해시키기 위하여, 먼저 20% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS와 융해용 배지를 35mm 디쉬에 3ml씩 분주하고, 각각에 글리세롤을 첨가하여 포함된 글리세롤 농도가 0%, 3% 및 6%가 되도록 제조하였다 (참조: 표 6 및 표 8). 그런 다음, 액체질소 탱크로부터 동결된 스트로우를 꺼내 공기 중에서 5초간 노출시킨 후, 직경 20cm 이상인 용기에 담겨진 30℃의 온수에 30초간 담가서 융해시켰다. 이어, 무균적으로 스트로우의 양 끝단 공기층을 절단하여, 스트로우 내의 배지를 디쉬에 밀어내고, 현미경 하에서 수정란을 확인한 다음, 차례대로 핵 이식란을 6% 글리세롤의 융해용 배지에서 5분간 정치하고, 3% 글리세롤의 융해용 배지에서 5분간 정치하며, 글리세롤이 없는 융해용 배지에서 5분간 정치시킴으로써, 핵 이식란에 함유된 동결용 배지를 제거하였다.In order to thaw the cryopreserved nuclear transfer embryos, first, 3 ml of PBS and 20% fetal medium added to a 35 mm dish were added to each of the 35 mm dishes, and glycerol concentrations were 0% and 3%. And 6% (see Tables 6 and 8). Then, the frozen straw was removed from the liquid nitrogen tank, exposed for 5 seconds in air, and then immersed in 30 ° C warm water for 30 seconds in a container having a diameter of 20 cm or more for melting. Subsequently, the air layers at both ends of the straw are aseptically cut, the medium in the straw is pushed into a dish, the fertilized eggs are checked under a microscope, and the nuclear transplanted eggs are then allowed to stand for 5 minutes in a 6% glycerol fusion medium, and 3% It was allowed to stand for 5 minutes in the glycerol fusion medium and allowed to stand for 5 minutes in the glycerol-free fusion medium to remove the freezing medium contained in the nuclear transfer embryos.

융해용 배지Melting Badge 성 분ingredient 6% 글리세롤 PBS6% Glycerol PBS 3% 글리세롤 PBS3% Glycerol PBS 0% 글리세롤 PBS0% Glycerol PBS PBSPBS (표 8)Table 8 (표 8)Table 8 (표 8)Table 8 BSABSA 0.5%0.5% 0.5%0.5% 0.5%0.5% 글리세롤Glycerol 6%6% 3%3% 0%0% 자당saccharose 0.3M0.3M 0.3M0.3M 0.3M0.3M

실시예 10: 핵 이식란의 대리모에의 이식Example 10 Transplantation of Nuclear Transfer Eggs into Surrogate Mothers

상기 핵 이식란을 20% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적시키고, 이를 스트로우에 장착한 다음, 대리모의 자궁각내 심부에 이식하였다.The nuclear transfer eggs were immersed in PBS added with 20% fetal bovine serum, mounted in straw, and then implanted into the uterine core of the surrogate mother.

실시예 11: 사람 proUK 유전자를 발현하는 복제 소의 산자 생산 및 산자의 유전자 확인Example 11: Acid production of cloned cows expressing human proUK gene and gene identification

상기의 실시예를 통해 생산된 형질전환 복제소는 육안적 방법 및 분자생물학적 방법으로 유전자 분석을 하였다. 사람 proUK 유전자가 도입된 GFP 발현 복제소는 외견 관찰 및 조직을 이용한 서던블랏, 웨스턴 블랏 및 세포배양을 통하여 GFP 발현 및 사람 proUK 유전자 도입을 분석하였다. The transgenic clones produced in the above examples were analyzed by gene method and macrobiological method. GFP expressing clones into which human proUK genes were introduced were analyzed for GFP expression and human proUK gene introduction by Southern blot, Western blot and cell culture using external observation and tissue.

육안적 관찰로 GFP의 발현 유무를 육안적으로 GFP 산자의 피부조직, 구강조직, 혀 등을 관찰하여 초록빛이 관찰되는지를 조사하였다. 분자생물학적 검사로 서던 블랏으로 산자의 게놈 DNA를 분석하였으며 웨스턴 블랏으로 산자 조직의 단백질을 분석하여 사람 proUK 발현 복제소임을 확인하였다. By visual observation, the presence of GFP was visually observed by examining the skin tissue, oral tissue, and tongue of GFP litter, to see if green light was observed. Genomic DNA of the litter was analyzed by Southern blot and molecular blot was analyzed by Western blot, and the protein of litter tissue was analyzed by Western blot.

이후 산자의 조직을 실시예 2의 방법으로 배양하여 세포주를 확립한 후 현미경의 자외선 필터을 이용하여 GFP 단백질의 발현 여부를 분석하였다. 또한 분자생물학적 방법인 서던 블랏으로 복제 소의 DNA를 분석하여 사람 proUK를 발현하는 복제 소임을 확인하였다.Thereafter, the tissues of the litter were cultured by the method of Example 2 to establish cell lines, and then analyzed for expression of GFP protein using a UV filter under a microscope. In addition, Southern blot, a molecular biological method, was used to analyze the DNA of clones to confirm that they are clones that express human proUK.

실시예 12: 공여핵 세포의 종류에 따른 형질전환 핵 이식란의 발육률 및 발현율Example 12 Development Rate and Expression Rate of Transgenic Nuclear Transfer Cells According to Type of Donor Nucleus Cells

상기의 실시예와 동일한 과정을 공여핵 세포를 달리하여 형질전환 핵 이식란의 발육률 및 발현율을 비교하였다. 3 개의 세포주로 40~50일령의 태아에서 유래한 소 태아의 섬유아세포, 성숙한 소의 귀 섬유아세포 및 성숙한 소의 난구 세포를 사용하였다. The same procedure as in the above example was compared to the growth rate and expression rate of the transgenic nuclear transfer embryos by different donor nuclear cells. Three cell lines were used: fibroblasts from fetuses derived from fetuses of 40-50 days of age, ear fibroblasts from mature cows, and cumulus cells from mature cows.

준비된 3개의 세포주에 사람 프로유로기키나제를 도입 및 적중하고, 외래 유전자가 도입 및 적중된 세포를 탈핵 난자와 융합하여 발생되는 경과를 살펴 보았다. 그 결과는 다음의 표 9 및 표 10에 나타내었다.Human prourokinase was introduced into and targeted to the three prepared cell lines, and a process generated by fusion of denuclearized eggs with foreign genes introduced and targeted was examined. The results are shown in Tables 9 and 10 below.

3 개의 다른 세포주로부터 유래한 형질전환된 핵이 이식된 핵 이식란의 발달율Development Rate of Nuclear Transplanted Embryos Transfected Nuclei from Three Different Cell Lines 공여핵 세포의 종류 Types of Donor Nucleus Cells 엠브리오의 수Embroidery Number 주입Injection 융합(%)fusion(%) 분할(%)Division(%) 배반포로의 발생(%)Occurrence of blastocysts (%) 배반포에서의 발현(%)% Expression in blastocyst 태아 섬유아세포Fetal fibroblast 363363 214(59.0)214 (59.0) 109(50.9)109 (50.9) 15(7.0)15 (7.0) 4(26.7)4 (26.7) 난구 세포Cumulus cells 426426 334(78.4)334 (78.4) 245(73.4)245 (73.4) 96(28.7)96 (28.7) 52(54.2)52 (54.2) 귀 섬유아세포Ear fibroblasts 379379 303(79.9)303 (79.9) 203(67.0)203 (67.0) 46(15.2)46 (15.2) 13(28.3)13 (28.3)

3개의 다른 세포주로부터 유래한 형질전환된 핵이 이식된 엠브리오의 임신율Pregnancy rate of Embryos implanted with transformed nuclei from three different cell lines 공여핵 세포의 종류Types of Donor Nucleus Cells 이식된 엠브리오의 수Number of Embryos Implanted 대리모의 수Number of surrogate mothers 임신된 수(%)% Pregnant 태아 섬유아세포Fetal fibroblast 33 22 00 난구 세포Cumulus cells 3131 2828 1(3.6)1 (3.6) 귀 섬유아세포Ear fibroblasts 2727 2424 2(8.3)2 (8.3)

상기의 결과로부터 태아 섬유아세포보다는 성숙한 소로부터 유래한 난구 세포 또는 귀 섬유아세포를 핵 공여세포로 한 경우에 배반포에서의 발현률이 높고, 또한 핵 이식란의 임신 성공율이 높다는 것을 알 수 있었다.From the above results, it was found that the expression rate in blastocysts was high, and the success rate of nuclear transfer embryos was high when ovarian cells or ear fibroblasts derived from mature cows were nuclear donors rather than fetal fibroblasts.

본 발명은 체세포에 외래 유전자를 도입 및 적중하는 기술 및 체세포 복제 기술을 접목함으로써 복제 동물로부터 생물의약품을 경제적이며 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 형질전환 복제 소는 소의 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현함으로써 소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 용이하게 수득하는 것을 가능하게 한다.
The present invention provides a method for economically and efficiently producing a biopharmaceutical from a cloned animal by incorporating a technique of introducing and targeting a foreign gene into somatic cells and somatic cloning technology. In particular, the transgenic cloned cows of the present invention make it possible to easily obtain human prourokinase from cow's milk by expressing human prourokinase in the bovine mammary gland.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 기술은 단지 바람직한 실시예 뿐이며, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the content of the present invention in detail, for those skilled in the art, such a technology is only a preferred embodiment, the actual scope of the present invention is the appended claims and their equivalents. It will be defined by.

<110> HWANG, WOO SUK <120> Transgenic cloned cow producing human prourokinase and method thereof <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD PRIMER <400> 1 gtcggtacca acatgtcgaa tccatctcta tcaattaatg taatt 45 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE PRIMER <400> 2 gacggatcct cattatctca attccaggga atgggaagat gagga 45 <210> 3 <211> 7070 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(7070) <223> HUMAN PROUROKINASE <400> 3 ttcaatagga agcaccaaca gtttatgccc taggactttg ttcccacaat cctgtaacat 60 catatcacga cacctaaccc aatccttatc aagccctgtc aaaaacggac tttaaaccaa 120 gctgcaaatt ttcagtaatc tggccttgcc tttccccctc tgatagcacc atcaaacaaa 180 cccccttact gccgaaagca ataagcccgg ctttgttcca tccactggtt gtgttggtga 240 tatctgggga ctgccactga acagacgcac agagggagcc cctacaggca ggggtttttc 300 tgtctgtgct tcttgggaga gtatgtctcg tacatttgtc gcgtgatgaa gacttcacag 360 ctccatccag cgaccagact cacagctcca tccagctgcg gcaagggggt ctgaggcagt 420 cttaggcaag ttggggccca gcgggagaag ttgcagaaga actgattaga ggacccagga 480 ggcttcagag ctgggctgag gtagagagtc tcctgtgcgc cttctctcct ctctgcaatt 540 cggggactcc ttgcactggg gcaggccccg gcaggtgcat gggaggaagc acggagaatt 600 tacaagcctc tcgattcctc agtccagacg ctgttgggtc ccctccgctg gagatcgcgc 660 ttcccccaaa tctttgtgag cgttgcggaa gcacgcgggg tccgggtcgc tgagcgctgc 720 aagacagggg agggagccgg gcgggagagg gaggggcggc gccggggcgg gccctgatat 780 agagcaggcg ccgcgggtcg cagcacagtc ggagaccgca gcccggagcc cgggccaggg 840 tccacctgtc cccgcagcgc cggctcgcgc cctcctgccg cagccaccgg tgagtgccgc 900 ggtcctgaga tccccgggcc ggatgcgcgg cggccccagc tcccgagcgt ctgcctgccc 960 cgccctgggc tgcccgggct ccctgggctc cccggcggct gcacggagtc aaggcgcccc 1020 gtcccgggcg tcccccgcgg gtgccgatcc aggctgcccg gagtccggag cccatagagg 1080 agagagacag ctggggagcc tggtcaccgc gggcatctcc cctgcgctgc agtcgcccgc 1140 ctggcctgcc ttcccgttcc tccgcctctt gccctgactt ctccttcctt tgcagagccg 1200 ccgtctagcg ccccgacctc gccaccatga gagccctgct ggcgcgcctg cttctctgcg 1260 tcctggtcgt gagcgactcc aaagtgagtg cgctcttgct ttgactgatg ctgcccaagg 1320 acctctgatc agcaccaggg gagaggaggg gctgctcagg gagctggggt ctccggattc 1380 catccacagc agggccagac tctccccagg aaatgggaca gggtggcagc ggaggcttga 1440 gaaccacggg ggttggcact ggctggcaag ggaggaagag ggccaccggg actgccccag 1500 cctgcgggca tctggtagat gaagcttaat ccatttctcc tggctggaaa ccatggtctt 1560 ccatttgaga actagatacg aacagggtga ggcgagaggg agagggaaga gtgggttttg 1620 ggattggggc cagtttaccc tcaccctgga tccctggagc atgggacctt tgatgaagcc 1680 tcctcccgaa tctcttccag ggcagcaatg aacttcatca agttccatgt gagtatccac 1740 ccctacaaca gttggctgca cagacaagtt gggaaggctt caggggacac tcccctccct 1800 gccctctgct gcagcgtgcg ccacccctta ccacttccac tccccctcgc ttaccccacc 1860 tttgttctct ccagcgaact gtgactgtct aaatggagga acatgtgtgt ccaacaagta 1920 cttctccaac attcactggt gcaactgccc aaagaaattc ggagggcagc actgtgaaat 1980 aggtatgggg atctccactg caactgggag agaaatttgg ggacagggag ggatgggtgg 2040 gaggcaagag caggcaggag ttaggagctg gaggtagggt gggtgacatc ttcatcccta 2100 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tgtgttgtgc caggaaccca gacaaccgga ggcgaccctg gtgctatgtg caggtgggcc 3000 taaagccgct tgtccaagag tgcatggtgc atgactgcgc agatggtgag catcactgac 3060 ctgctgatga caggtgggtg gaaggggaca aacttacatg tccccttatt ccatcacagg 3120 aggactgagg aggtgggggg tgcccgagag ggatgctttc tcctacctgc ctccctaaga 3180 catccctctg tttgtcctcc aggaaaaaag ccctcctctc ctccagaaga attaaaattt 3240 cagtgtggcc aaaagactct gaggccccgc tttaagatta ttgggggaga attcaccacc 3300 atcgagaacc agccctggtt tgcggccatc tacaggaggc accggggggg ctctgtcacc 3360 tacgtgtgtg gaggcagcct catgagccct tgctgggtga tcagcgccac acactgcttc 3420 atgtacggcc ctgggtttct cctcttcgac tcttctgccc caccccaagc acatcccttt 3480 ctccttccca gcaaagtgtt ccgcctcatt tctccctcat ctgcccctgt ccatgcgccc 3540 atggccttgg ggacaagtcg tgctttgagg cctctaggga gggaaggaag aagtggcatg 3600 atttcatggg actaagctgt ttgatgggta tcttcttcca cagtgattac ccaaagaagg 3660 aggactacat cgtctacctg ggtcgctcaa ggcttaactc caacacgcaa ggggagatga 3720 agtttgaggt ggaaaacctc atcctacaca aggactacag cgctgacacg cttgctcacc 3780 acaacgacat tggtgagggg gaacgcccgc gactactgtg gccataatgg cttggggaga 3840 gtgggaccca gggagagact ggagctgagt tgaagctgcc ggtggggcag gggtggggcg 3900 agggaccttg aagcctcgat atacatgaca aaggatggca gggaagagtt ccatgaagtc 3960 tgaggggcct ggtgctcctc tggagagacc ctgaatttcc ccaacaagta gccctcttgc 4020 gagtggaaac agccctgtgg gtatatggct tgggctggga aggccctgtt tatatgaatt 4080 agaaaaagac acaccttcct ttgtgggatg cagcctctgt ctgtgctagg atatagaact 4140 tggagaatgg agccttggga tggattccag cctaactacc tcagggggat cctctagagt 4200 gcagctggga gtttttgcag aaacgacctg tacagctgta tgcagtggct ctggccatcc 4260 aagccttttt caacacctgg aacaaagccc ttggggcatg gggcagggga ggtttccagg 4320 tgataagcga ccagcagacc tccctggatg actgacctag ggataggcat agctacttcc 4380 tcggcacttg gaggggacag atggggaccg cctaaccagt agtgatcttt ctcctctgac 4440 cctctgtcct cccccagcct tgctgaagat ccgttccaag gagggcaggt gtgcgcagcc 4500 atcccggact atacagacca tctgcctgcc ctcgatgtat aacgatcccc agtttggcac 4560 aagctgtgag atcactggct ttggaaaaga gaattctagt aagtgacaat tgcgactgac 4620 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ggcatttgaa gaggcagagg gaagaaagga aggtgtttca gttgaaagat acaaaactga 5520 gaaggaggct ggcatattcc gggtggggag gagaactagg gtctgggagt gtggatggaa 5580 tagtggcaga tgacagggct tttaaagcca agcaggggat tttccaactt cgatgtggta 5640 gaaatggggc tgcgtcaggc acagtggctc atgcctgtaa tcccagcatt gggctaggcc 5700 gtagtcgatg gatcattgag gccagagttg agaccggcct ggaccaacat ggtgaaaccc 5760 tgtgtctact aaaaaatgca aaaaaaaaaa ttagccaggt gtggtggtgc ctgcctgtaa 5820 tcccagctaa tcaggaggct gagacatgga atcgcttgag cacaggaggc aagtttgacg 5880 tgagctgaga tcacgtcatt gcacgccagc ctgggcgaca gagcgagatt ctgtcctccc 5940 gccgaaaaaa gaaagaaaat gggaagtcgc taaggacttt gactgggaaa ctcttccctc 6000 tctctggtat ggttgggtga tgggatcaga aatcccctcc tcacttctct agggctcatc 6060 ttttgtatct ttggcgtcac agggagactc agggggaccc ctcgtctgtt ccctccaagg 6120 ccgcatgact ttgactggaa ttgtgagctg gggccgtgga tgtgccctga aggacaagcc 6180 aggcgtctac acgagagtct cacacttctt accctggatc cgcagtcaca ccaaggaaga 6240 gaatggcctg gccctctgag ggtccccagg gaggaaacgg gcaccacccg ctttcttgct 6300 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about <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD PRIMER <400> 1 gtcggtacca acatgtcgaa tccatctcta tcaattaatg taatt 45 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE PRIMER <400> 2 gacggatcct cattatctca attccaggga atgggaagat gagga 45 <210> 3 <211> 7070 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene (222) (1) .. (7070) <223> HUMAN PROUROKINASE <400> 3 ttcaatagga agcaccaaca gtttatgccc taggactttg ttcccacaat cctgtaacat 60 catatcacga cacctaaccc aatccttatc aagccctgtc aaaaacggac tttaaaccaa 120 gctgcaaatt ttcagtaatc tggccttgcc tttccccctc tgatagcacc atcaaacaaa 180 cccccttact gccgaaagca ataagcccgg ctttgttcca tccactggtt gtgttggtga 240 tatctgggga ctgccactga acagacgcac agagggagcc cctacaggca ggggtttttc 300 tgtctgtgct tcttgggaga gtatgtctcg tacatttgtc gcgtgatgaa gacttcacag 360 ctccatccag cgaccagact cacagctcca tccagctgcg gcaagggggt ctgaggcagt 420 cttaggcaag ttggggccca gcgggagaag ttgcagaaga actgattaga ggacccagga 480 ggcttcagag ctgggctgag gtagagagtc tcctgtgcgc cttctctcct ctctgcaatt 540 cggggactcc ttgcactggg gcaggccccg gcaggtgcat gggaggaagc acggagaatt 600 tacaagcctc tcgattcctc agtccagacg ctgttgggtc ccctccgctg gagatcgcgc 660 ttcccccaaa tctttgtgag cgttgcggaa gcacgcgggg tccgggtcgc tgagcgctgc 720 aagacagggg agggagccgg gcgggagagg gaggggcggc gccggggcgg gccctgatat 780 agagcaggcg ccgcgggtcg cagcacagtc ggagaccgca 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cacaggaggc aagtttgacg 5880 tgagctgaga tcacgtcatt gcacgccagc ctgggcgaca gagcgagatt ctgtcctccc 5940 gccgaaaaaa gaaagaaaat gggaagtcgc taaggacttt gactgggaaa ctcttccctc 6000 tctctggtat ggttgggtga tgggatcaga aatcccctcc tcacttctct agggctcatc 6060 ttttgtatct ttggcgtcac agggagactc agggggaccc ctcgtctgtt ccctccaagg 6120 ccgcatgact ttgactggaa ttgtgagctg gggccgtgga tgtgccctga aggacaagcc 6180 aggcgtctac acgagagtct cacacttctt accctggatc cgcagtcaca ccaaggaaga 6240 gaatggcctg gccctctgag ggtccccagg gaggaaacgg gcaccacccg ctttcttgct 6300 ggttgtcatt tttgcagtag agtcatctcc atcagctgta agaagagact gggaagatag 6360 gctctgcaca gatggatttg cctgtgccac ccaccagggt gaacgacaat agctttaccc 6420 tcaggcatag gcctgggtgc tggctgccca gacccctctg gccaggatgg aggggtggtc 6480 ctgactcaac atgttactga ccagcaactt gtctttttct ggactgaagc ctgcaggagt 6540 taaaaagggc agggcatctc ctgtgcatgg gtgaagggag agccagctcc cccgacggtg 6600 ggcatttgtg aggcccatgg ttgagaaatg aataatttcc caattaggaa gtgtaacagc 6660 tgaggtctct tgagggagct tagccaatgt gggagcagcg gtttggggag cagagacact 6720 aacgacttca gggcagggct ctgatattcc atgaatgtat caggaaatat atatgtgtgt 6780 gtatgtttgc acacttgtgt gtgggctgtg agtgtaagtg tgagtaagag ctggtgtctg 6840 attgttaagt ctaaatattt ccttaaactg tgtggactgt gatgccacac agagtggtct 6900 ttctggagag gttataggtc actcctgggg cctcttgggt cccccacgtg acagtgcctg 6960 ggaatgtact tattctgcag catgacctgt gaccagcact gtctcagttt cactttcaca 7020 tagatgtccc tttcttggcc agttatccct tccttttagc ctagttcatc 7070

Claims

소의 성숙한 개체로부터 유래되고 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 체세포의 핵과 소에서 유래한 탈핵된 난자가 융합된 핵 이식란.A nuclear transfer embryo in which a nucleus of a somatic cell derived from a mature individual of a cow and expressing a human prourokinase is fused with a denuclearized egg derived from a cow.

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제1항에 있어서, 상기 핵 이식란이 SNU-B1(KCTC 10286BP)인 것을 특징으로 하는 핵 이식란.The nuclear transfer embryo according to claim 1, wherein the nuclear transfer embryo is SNU-B1 (KCTC 10286BP).

제1항의 핵이식란을 대리모에 이식하여 생산되고 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소.The transgenic cloned cow of claim 1, which is produced by transplanting a nuclear transfer embryo into a surrogate mother and expresses human prourokinase in the mammary gland.

제4항에 있어서, 상기 복제 소의 형질이 제1항 또는 제3항의 핵 이식란의 형질과 동일한 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소.The transgenic cloned cow according to claim 4, wherein the trait of the cloned cow is identical to that of the nuclear transfer embryo of claim 1 or 3.

(a) 소의 성숙한 개체로부터 유래한 체세포주에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; (a) preparing a donor nucleus cell comprising introducing and targeting a gene expressing human prourokinase into a somatic cell line derived from a bovine mature individual;

(b) 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; 및 (b) preparing a bovine-derived nucleated egg comprising removing the oocytes of the nucleated nucleus of the nucleus and denuclearizing the egg by removing the cytoplasm including the first polar body of the nucleus nucleus; And

(c) 상기 (a)단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시키는 단계를 포함하는 소의 핵 이식란 작제 방법.(C) a method for constructing a nuclear transfer embryo of cattle comprising the step of transplanting and fusing the donor nucleus cells prepared in step (a) to denucleated eggs.

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제6항에 있어서, 상기 체세포주에 사람 프로유로기키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계가 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자, 발현 프로모터, 마커 유전자를 포함하는 벡터를 작제하여 수행되는 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.The method of claim 6, wherein the step of introducing and targeting a gene expressing human prourokinase into the somatic cell line is performed by constructing a vector comprising a gene expressing human prourokinase, an expression promoter, and a marker gene. The method of constructing a nuclear transfer of cattle.

제8항에 있어서, 상기 발현 프로모터가 β-카세인 프로모터인 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.The method of claim 8, wherein the expression promoter is a β-casein promoter.

제8항에 있어서, 상기 마커 유전자가 GFP 발현 유전자 또는 암피실린 저항 유전자인 것을 특징으로 하는 소의 핵이식란 작제 방법.The method of claim 8, wherein the marker gene is a GFP expression gene or ampicillin resistance gene.

제8항에 있어서, 상기 벡터는 생화학적 방법을 사용하여 도입되는 것을 특징으로 하는 소의 핵이식란 작제 방법.The method of claim 8, wherein the vector is introduced using a biochemical method.

제11항에 있어서, 상기 생화학적 방법이 FuGene6를 사용하는 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.12. The method of claim 11, wherein the biochemical method uses FuGene6.

제6항에 있어서, 상기 체세포주가 소의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포 또는 난구 세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.The method of claim 6, wherein the somatic cell line is derived from cells or cumulus cells isolated from bovine uterine perfusate, endometrium, fallopian tube, ear or muscle.

제6항에 있어서, 상기 핵 이식란이 SNU-B1(KCTC 10286BP)인 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.The method of claim 6, wherein the nuclear transfer embryo is SNU-B1 (KCTC 10286BP).

(b) 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; (b) preparing a bovine-derived nucleated egg comprising removing the oocytes of the nucleated nucleus of the nucleus and denuclearizing the egg by removing the cytoplasm including the first polar body of the nucleus nucleus;

(c) 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계; 및 (c) constructing a nuclear transfer embryo by transplanting and fusing the donor nucleus cells prepared in the step to denucleated eggs; And

(d)상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함하는 소의 유선에서 사람 프로유로키나제를 생산하는 형질전환 복제 소의 생산방법.(d) a method for producing a transgenic cloned cow that produces human prourokinase in the mammary gland of the cow comprising the step of transplanting the nuclear transfer embryo into a surrogate mother to give birth to a living child.

제15항에 있어서, 상기 (a) 내지 (c) 단계가 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.The method of claim 15, wherein the step (a) to (c) is performed by the method of any one of claims 8 to 13.

제15항에 있어서, 상기 핵 이식란이 SNU-B1(KCTC 10286BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.16. The method of claim 15, wherein said nuclear transfer embryo is SNU-B1 (KCTC 10286BP).

제15항에 있어서, 상기 (a) 단계가 체세포주를 계대배양, 혈청기아배양 또는 동결에 의해 보존하는 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.The method of claim 15, wherein the step (a) further comprises the step of preserving the somatic cell line by subculture, serum starvation or freezing.

제15항에 있어서, 상기 (b)단계의 난자를 탈핵하는 과정은 미세작업장치를 이용하여 전처리된 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 절개창을 통하여 난자의 제 1극체를 포함한 세포질을 10 내지 15% 제거하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.The method of claim 15, wherein the denuclearization of the egg of step (b) is performed by incision of the zona pellucida of the pretreated egg using a micro-working device to form an incision, and then the cytoplasm containing the first polar body of the egg through the incision. Method for producing a transgenic cloned cow, characterized in that 10 to 15% removal.

제15항에 있어서, 상기 (b) 단계의 수핵 난자의 난구 세포는 수핵 난자를 하이알루로니다제로 처리한 다음, 물리적으로 제거되는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.16. The method of claim 15, wherein the oocytes of the nucleus pulposus of step (b) are treated with hyaluronidase and then physically removed.

제15항에 있어서, 상기 (c)단계의 공여핵 세포를 탈핵 난자에 이식하는 과정이 공여세포를 난자의 투명대에 형성된 절개창으로 주입하는 것임을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.The method for producing a transgenic cloned cow according to claim 15, wherein the step of (c) transplanting the donor nucleus cells into the denucleated eggs is injecting the donor cells into an incision formed in the zona pellucida of the egg.

제15항에 있어서, 상기 (c) 단계에 작제된 핵 이식란을 대리모에 이식하기 전에 활성화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.16. The method of claim 15, further comprising the step of activating the nuclear transfer embryo constructed in step (c) before transplanting into the surrogate mother.

제22항에 있어서, 상기 핵 이식란의 활성화가 전기 융합을 통해 이루지는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.23. The method of claim 22, wherein the nuclear transfer egg is activated through electrofusion.

제23항에 있어서, 상기 전기융합이 직류전압을 0.75 내지 2.00kV/cm, 시간을 10 내지 20㎲, 횟수를 0.01초 내지 10초 간격으로 1 내지 5회에 걸쳐 실시하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.The transformation according to claim 23, wherein the electric fusion is performed at a DC voltage of 0.75 to 2.00 kV / cm, a time of 10 to 20 mA, and a frequency of 1 to 5 times at intervals of 0.01 to 10 seconds. Production method of cloned cows.

제22항에 있어서, 상기 활성화 단계에 사이클로헥시미드 용액 또는 디엠에이피(DMAP) 용액에 핵이식란을 침지하고 배양하는 후 활성화 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.23. The method of claim 22, further comprising an activation step after immersing and culturing the nuclear transfer egg in a cycloheximide solution or DMAP solution in the activation step.

제25항에 있어서, 상기 후 활성화 단계에 활성화된 핵이식란을 mSOF 배지에 배양하는 체외배양 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.26. The method of claim 25, further comprising an in vitro culture step of culturing the activated nuclear transfer embryos in mSOF medium in the post-activation step.

소의 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제 소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 수득하는 것을 특징으로 하는 사람 프로유로키나제를 생산하는 방법.A method for producing human prourokinase, characterized by obtaining human prourokinase from milk of transgenic cloned cow expressing human prourokinase in bovine mammary gland.

제27항에 있어서, 상기 형질전환 복제 소는 상기 제15항의 형질전환 복제 소의 생산방법으로 생산된 것을 특징으로 하는 사람 프로유로키나제를 생산하는 방법.28. The method of claim 27, wherein the transgenic cloned cow is produced by the method of producing the transgenic cloned cow of claim 15.

제27항에 있어서, 상기 형질전환 복제 소가 소의 핵이식란 SNU-B1(KCTC 10286BP)로부터 생산된 것을 특징으로 하는 사람 프로유로키나제를 생산하는 방법.28. The method of claim 27, wherein said transgenic cloned cow is produced from bovine nuclear transfer egg SNU-B1 (KCTC 10286BP).