KR20040077889A - 전립선 특이적 막 항원 (ｐｓｍａ)에 대한 인간모노클로날 항체 - Google Patents

전립선 특이적 막 항원 (ｐｓｍａ)에 대한 인간모노클로날 항체 Download PDF

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야쉬완트 엠. 데오
로버트 그라치아노
데브라 허드슨
에릭 에이치. 홈스
윌리엄 티. 티노
아멜리아 블랙
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메다렉스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 PSMA에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체, 및 관련된 항체-기재 조성물 및 분자들을 개시한다. 상기 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소형 전환을 통해 인간 모노클로날 항체의 다수의 이소형을 생산할 수 있는 비인간 트랜스제닉 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스에서 생성할 수 있다. 또한, 상기 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 비인간 트랜스제닉 동물 및 상기 인간 항체를 생산하는 하이브리도마, 및 상기 인간 항체를 사용한 치료 및 진단 방법도 개시한다.

Description

전립선 특이적 막 항원 (ＰＳＭＡ)에 대한 인간 모노클로날 항체 {HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN (PSMA)}
관련 출원
본 출원은 1999년 7월 29일자로 출원한 미국 가출원 제60/146,285호, 1999년 10월 12일자로 출원한 미국 가출원 제60/158,759호 및 2000년 3월 9일자로 출원한 미국 가출원 제60/188,087호를 우선권 주장하는, 2000년 7월 26일자로 출원한 PCT 국제 출원 PCT/US00/20247의 일부 계속 출원인 2002년 1월 28일자로 출원한 미국 실용신안 제10/059,989호를 우선권 주장한다. 상기 출원은 전문이 본원에 참고 문헌으로 인용된다.
전립선암은 남성의 질병 및 사망의 주된 원인이다. 전립선암의 치료법에는 외과 수술, 호르몬 요법, 방사선 조사 및 화학요법이 포함된다. 전이성 전립선암에는 유효한 치료법이 거의 없다. 따라서, 요법을 위한 표적 뿐만 아니라 진단 및 예후의 마커를 나타내는 유전자 및(또는) 유전자 산물을 동정하는 것이 중요하다. 전립선 특이적 항원 (PSA)은 전립선암의 임상적 진단 및 시기결정에 유용한 상기 암 마커 중 하나이다. 그러나, PSA는 4 내지 10 ng/㎖ 범위 내에서 양성 전립선 증식증 (BPH)과 전립선염 또는 전립선암을 구분할 수 없으므로, 적절한 진단인지확인하기 위해서는 세포학적 및(또는) 조직학적 평가가 필요하다 [Barren, R.J.et al.(1998) Prostate 36:181-188].
전립선 특이적 막 항원 (PSMA)은 750개의 아미노산을 갖는, 트랜스페린 수용체와 54％ 상동인 약 110 kD의 타입 II 막통과성 당단백질이다. PSMA는 19개의 아미노산을 갖는 세포내 도메인, 24개의 아미노산을 갖는 막통과성 도메인 및 707개의 아미노산을 갖는 세포외 도메인을 포함하는 3개의 구조 도메인을 갖는다. PSMA 단백질은 뉴로카르복시펩티다제 및 엽산 가수분해효소 활성을 가지며, 전립선의 성장 및 분화를 신경내분비적으로 조절하는데 관련이 있다고 보고되었다 [Heston, W.D. (1996) Urologe-Ausgabe A. 35:400-407]. PSM'은 세포질 내에 모여 있는, PSMA가 다르게 스플라이싱 (splicing)된 형태이다.
PSMA는 전립선 상피 세포에서 현저하게 발현된다. PSMA의 발현은 전립선암, 특히 제대로 분화되지 않고 전이성이고 호르몬에 불응성인 암종에서 증가한다 [Gregorakis, A.K. et al.(1998) Seminars in Urologic Oncology 16:2-12; Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85]. 전립선외 조직, 예컨대 소장, 침샘, 십이지장 점막, 근위 세뇨관 및 뇌에서는 낮은 수준의 PSMA 발현이 관찰된다 [Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85]. PSMA는 또한 신장 세포 암종 및 결장 암종을 포함하는 특정한 암의 종양주위 및 종양내 영역의 모세혈관의 내피 세포에서 발현되지만, 정상 조직의 혈관에서는 발현되지 않는다. 추가로, PSMA는 종양 혈관형성과 관련이 있다고 보고되었다 [Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85].
따라서, PSMA는 전립선암 및 PSMA 발현을 특징으로 하는 다른 다양한 질환의 치료를 위한 가치 있는 표적이다.
발명의 요약
본 발명은 인간 전립선 특이적 막 항원 (PSMA)에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체, 면역접합체, 이중특이적 분자, 및 이러한 항체를 단독으로 또는 추가적인 치료제와의 조합으로서 함유하는 치료용 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 인간 항체는 인간 PSMA 상의 천연 단백질 에피토프 (예를 들어 인간 PSMA의 세포외 도메인에 위치한 에피토프)에 결합하고, 인간 이펙터 세포 (예를 들어, 다형핵 세포, 단핵구, 대식세포 및 수상돌기 세포)의 존재하에서 PSMA-발현 세포의 성장을 저해하고(거나) 세포 사멸을 매개한다 (예를 들어, 용해 또는 식세포작용을 통해). 따라서, 상기 항체는 PSMA 발현과 관련된 질환, 특히 PSMA-발현 종양 및 암, 예컨대 전립선암, 결장암 및 신장 암종을 진단, 치료 및(또는) 예방하는 다양한 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 단리된 인간 항체에는 다양한 항체 이소형, 예를 들어 IgG1, (예컨대, IgG1k), IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE가 포함된다. 항체들은 전장 항체 (예컨대, IgG1 또는 IgG3)이거나 또는 항원-결합 부위 (예컨대, Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv 단편)만을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정한 치료용 항체에는 인간 모노클로날 항체 (HuMAb) 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, 16F9 및 기능적으로 등가인 항체, 예를 들어, (a) 가변 영역이 서열 1, 3, 5, 7 또는 9 및 서열 2, 4, 6, 8 또는 10에 각각 명시된 뉴클레오티드서열 및 그의 보존적 변형을 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 핵산에 의해 코딩되는 항체 및(또는) (b) 서열 11, 12, 13, 14 또는 15 및 서열 16, 17, 18, 19 또는 20에 각각 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 포함된다.
본 발명의 또다른 특정한 인간 항체에는 인간 중쇄 및 경쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 및 경쇄 CDR2 영역 및 인간 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역을 갖는 CDR 도메인이 포함되고, 이 때,
(a) 인간 중쇄 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 도 19 (서열 21 내지 35)에 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열 및 그의 보존적 서열 변형으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고,
(b) 인간 경쇄 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 도 22 및 도 23 (서열 36 내지 50)에 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열 및 그의 보존적 서열 변형으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산을 포함한다.
본 발명의 다른 특정한 항체에는 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9에 의해 정의되는 에피토프에 결합하고(거나), PSMA와의 결합에 대해 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9와 경쟁하거나, 또는 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9에 의해 나타나는 다른 기능적 결합 특성을 갖는 인간 모노클로날 항체가 포함된다. 이러한 항체에는, 예를 들어, PSMA와 결합할 때 해리 상수 (KD)가 10-7M 이하, 예컨대 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하, 또는 그보다 낮은 (예를 들어,10-11M 이하) 것들이 포함된다. 이러한 항체들에는 또한 뮤린 항-PSMA 항체 3C6 (ATCC 기탁 번호 HB 12491)과 교차 반응하지만, 뮤린 항-PSMA 항체 4D4 (ATCC 기탁 번호 HB 12493) 또는 1G9 (ATCC 기탁 번호 HB 12495)와는 교차 반응성을 나타내지 않는 것들이 포함된다.
본 발명의 또다른 면에서, 인간 항-PSMA 항체는 유도체화되거나, 또다른 기능 분자, 예를 들어 또다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, Fab' 단편)에 연결되거나 또는 그와 함께 공발현된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위는 하나 이상의 다른 분자체, 예를 들어 또다른 항체 (예를 들어, 이중특이적 또는 다중특이적 항체), 세포독소, 세포 리간드 또는 항원과 기능적으로 연결될 수 있다 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 기타에 의해). 따라서, 본 발명은 매우 다양한 항체 접합체, 이중 또는 다중특이적 분자 및 융합 단백질을 포함하고, 이들 모두는 PSMA 발현 세포에 결합하고 다른 분자를 세포에 표적화하거나, 또는 PSMA 및 다른 분자 또는 세포에 결합한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에는 PSMA에 대한 하나 이상의 결합 특이성을 가지며 (인간 항-PSMA 항체 (또는 그의 단편 또는 유사체)임), Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI 또는 인간 Fcα 수용체, 또는 항원 제시 세포 (APC) 상의 또다른 항원에 대한 제2의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 분자가 포함된다. 제2 결합 특이성은 또한 항체 또는 그의 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv), 예를 들어 인간 항체 또는 그의 일부, 또는 "키메릭" 또는 "인간화" 항체 또는 그의 일부 (예컨대, 비인간 항체 (예컨대, 뮤린)로부터 유도된 가변 영역, 또는 적어도 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖고, 나머지 부분은 인간에서 유도됨)일 수도 있다.
따라서, 본 발명에는 인간 PSMA 및 Fc 수용체, 예를 들어 인간 IgG 수용체, 예를 들어 Fc-감마 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16) 둘다에 결합하는 이중특이적 및 다중특이적 분자가 포함된다. 다른 Fc 수용체, 예를 들어 인간 IgA 수용체 (예를 들어, FcαRI)도 또한 표적화할 수 있다. Fc 수용체는 바람직하게는 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, 대식세포 또는 활성 다형핵 세포의 표면 상에 위치한다. 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 Fc 수용체의 이뮤노글로불린 Fc (예를 들어, IgG 또는 IgA) 결합 부위와는 다른 부위에서 Fc 수용체에 결합한다. 따라서, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 결합은 이뮤노글로불린의 생리적 수준에 의해 차단되지 않는다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 치료제, 예를 들어 세포독성제, 효소활성이 있는 독소 또는 그의 단편, 방사성동위원소, 또는 소형 분자 항암제에 접합된 온전한 인간 항-PSMA 항체를 포함하는 면역접합체, 예를 들어 면역독소를 제공한다.
별법으로, 본 발명의 인간 항체는 이러한 치료제 및 세포독성제에 결합되지 않은 상태로 이들과 함께 투여될 수 있다. 이들은 이러한 작용제와 동시에 투여될 수 있거나 (예를 들어 단일 조성물로서 또는 별도로) 또는 이러한 작용제를 투여하기 전 또는 후에 투여될 수 있다. 이러한 작용제에는 화학치료제, 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실 및 시클로포스파미드 히드록시우레아 및 그의 조합이 포함될 수 있다. 본 발명의 인간 항체는 또한 방사선 요법제와 접합시켜 투여할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 제약상 허용가능한 담체 및 하나 이상의 인간 항-PSMA 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 및 진단 조성물/키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 조합을 포함하되, 바람직하게는 이들 각각이 서로 다른 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 이펙터 세포의 존재하에서 표적 세포의 매우 효과적인 사멸을 매개하는 인간 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물은 PSMA 발현 세포의 성장을 저해하는 또다른 인간 모노클로날 항체와 조합될 수 있다. 따라서, 상기 조합은 최대의 치료적 이익을 제공하도록 적합화된 다수의 요법을 제공한다. 하나 이상의 인간 항-PSMA 항체 또는 그의 항원-결합 부위, 및 본 발명의 하나 이상의 이중특이적 또는 다중특이적 분자의 조합을 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물도 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 세포들을 본 발명의 하나 이상의 인간 항체 및(또는) 상기 항체를 함유하는 관련된 치료용 조성물, 유도체 등과 접촉시켜 (예를 들어, 대상체에 투여하여) PSMA 발현 세포의 증식 및(또는) 성장을 저해하고(거나) PSMA 발현 세포의 사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 상기 방법은 인간 이펙터 세포의 존재하에서 PSMA 발현 세포를 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 인간 항-PSMA 항체 하나 또는 그의 조합과 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 배양액 (예를 들어, PSMA 발현 세포와 이펙터 세포를 포함하는 배양액) 중에서 예를 들어 시험관내 또는 생체외 사용될 수 있다. 예를 들어, PSMA 발현 세포 및 이펙터 세포를 함유하는 샘플을 시험관내 배양하고, 본 발명의 항체와 조합할 수 있다. 별법으로, 상기 방법은 대상체내에서, 예를 들어 생체내 프로토콜 (예를 들어, 치료 또는 예방 프로토콜)의 일부로서 실시될 수 있다.
PSMA 매개성 질환의 생체내 치료 및 예방에 사용하기 위해서는, 본 발명의 인간 항체를 환자 (예를 들어, 인간 대상체)에게 치료적 유효 투여량 (예를 들어, PSMA 발현 세포의 성장을 저해, 제거 또는 방지하는)으로 당업계에 널리 공지된, 항체-기재 임상용 제품에 적합한 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입을 사용하여 투여한다.
따라서, 본 발명의 인간 항체는 PSMA의 발현을 특징으로 하는 다양한 질환을앓는 환자에게 적합한 투여량 (또는 일련의 투여량들)의 항체를 투여함으로써 상기 질환을 치료 및(또는) 예방하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료 (예를 들어, 개선) 또는 예방할 수 있는 질환의 예로는 암, 예를 들어 전립선암, 결장암 및 신장 암종이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정한 실시양태에서는, 환자를 화학치료제, 방사선 조사, 또는 Fc 수용체, 예를 들어 Fcα 수용체 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절, 예를 들어 증강시키는 작용제, 예를 들어 시토카인으로 추가로 치료할 수 있다. 치료 중에 투여되는 전형적인 시토카인에는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자(TNF) 등이 포함된다. 전형적인 치료제에는 무엇보다도 항-신생물제, 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실 및 시클로포스파미드 히드록시우레아가 포함된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PSMA-관련 질환의 진단을 위해서 PSMA 또는 PSMA 발현 세포의 존재 여부를 시험관내 또는 생체내 검출하는 방법을 제공한다. 이것은 예를 들어, 시험할 샘플을 경우에 따라서는 대조군 샘플과 함께 본 발명의 인간 모노클로날 항체 (또는 그의 항원 결합 부분)와, 상기 항체와 PSMA 사이에 복합체가 형성되도록 하는 조건하에서 접촉시켜 달성할 수 있다. 이어서, 복합체 형성을 검출한다 (예를 들어 ELISA를 이용함). 대조군 샘플을 시험 샘플과 함께 사용하는 경우에는 이들 샘플 둘다에서 복합체를 검출하며, 이들 샘플간 복합체 형성과 관련한 임의의 통계적으로 유의한 차이가 시험 샘플 내 PSMA 존재에 대한 지표이다.
또다른 면에서, 본 발명은 PSMA에 결합하는 온전한 인간 모노클로날 항체를 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스 ("HuMAb 마우스"라고도 함)를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 트랜스제닉 비인간 동물은 본 발명의 항-PSMA 항체의 전부 또는 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스이다. 인간 항-PSMA 항체를 생성하기 위해, 트랜스제닉 비인간 동물을 정제되거나 또는 보강된, PSMA 항원 및(또는) PSMA 발현 세포 시료로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소형 전환을통해 PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체의 많은 이소형 (예를 들어 IgG, IgA 및(또는) IgM)을 생산할 수 있다. 이소형 전환은 예를 들어 고전적 이소형 전환 또는 비-고전적 이소형 전환에 의해 일어날 수 있다.
따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기한 바와 같이 인간 항-PSMA 항체를 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 단리한 B-세포를 제공한다. 이어서, 상기 단리된 B-세포를 불멸화 세포와의 융합으로 불멸화시켜 인간 항-PSMA 항체의 공급원 (예컨대 하이브리도마)을 제공할 수 있다. 이러한 하이브리도마 (즉, 인간 항-PSMA 항체를 생산함)도 또한 본 발명의 범위에 속한다.
본원에서 예시한 바와 같이, 인간 항-PSMA 항체는 상기 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 수득하거나 또는 클로닝하여 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마 (예컨대 불멸화된 CHO 세포 또는 림프구 세포로 구성된 트랜스펙토마)에서 재조합적으로 발현시킬 수도 있다. 따라서, 본 발명은 인간 PSMA에 결합하는 인간 모노클로날 항체의 생산 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스 (예를 들어 항-PSMA 항체의 전체 또는 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유함)를 정제 또는 보강된 인간 PSMA 항원 및(또는) 인간 PSMA-발현 세포 시료로 면역화시키는 단계를 포함한다. 이어서, 상기 동물의 B 세포 (예컨대 비장 B 세포)를 수득하여 골수종 세포와 융합시킴으로써 PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸 하이브리도마 세포를 형성한다.
또다른 면에서, 본 발명은 인간 모노클로날 항-PSMA 항체의 전부 또는 일부를 코딩하는 (예를 들어, 항체의 하나 이상의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는) 핵산 분자 뿐만 아니라, 이러한 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 이러한 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 방법도 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명에 의해 제공되는 특정한 핵산에는 서열 1, 3, 5, 7 또는 9 및 서열 2, 4, 6, 8 또는 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열이 포함되고, 이들은 각각 인간 항-PSMA 항체 (HuMAb) 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9의 중쇄 및 경쇄를 코딩한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기의 상세한 설명 및 실시예로부터 명백할 것이지만, 이들에 제한되지 않는다. 본원 전반에 걸쳐 인용하는 모든 참고문헌, 특허 및 간행된 특허 명세서의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.
도 1은 전장 PSMA 및 아미노산 1 내지 173, 134 내지 437, 및 438 내지 750에 상응하는 PSMA 단편을 함유하는 세균에서 발현된 융합 단백질에 대한 HuMab 11C10의 반응성 (고상 ELISA)을 나타내는 막대 그래프이다. 뮤린 7E11 항체를 대조군으로 사용하여 분석하였다.
도 2는 인간 전립선 선암종 LNCaP 및 PC3 세포에서 얻은 막 분획물에 대한 인간 항-PSMA 모노클로날 항체의 반응성 (고상 ELISA)을 나타내는 그래프이다.
도 3은 항체 결합에 대한 단리된 PSMA의 열 변성의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 열 변성된 및 열 변성되지 않은 정제된 PSMA를 96-웰 플레이트에 코팅하고 표시된 항체로 처리하였다. 결합된 항체를 ELISA로 검출하였다.
도 4는 HuMAb을 사용하여 LNCaP 세포의 계면활성제 용해물로부터 PSMA을 면역침전시킨 것을 나타낸다. 면역침전된 단백질을 SDS 겔 전기영동으로 분리하고, PVDF 막 상에 블로팅하고, 뮤린 항-PSMA 4D8 항체 (2열 내지 7열)로 프로빙하였다. 1열은 전체 LNCaP 세포 용해물을 나타낸다. 2열 내지 7열은 각각 무관한 인간 IgG1, 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9 항체에 의한 면역침전을 나타낸다. PSMA 및 PSM'의 위치를 화살표로 표시하였다.
도 5는 LNCaP 세포 표적, 및 각각 E:T 비가 100:1인 PBMC의 두 공여자 (패널 A 및 B)를 사용하여 HuMAb 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9의 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 반응을 측정한 것을 나타내는 그래프이다.
도 6은 CD89 (FcαR) 및 PSMA에 결합하는 온전한 인간 이중특이적 분자 14A8×8C12를 나타낸다. 이 분자는 항-PSMA Fab' 항체 단편 (인간 모노클로날 항-PSMA 항체, 8C12로부터 유도됨)에 황 결합으로 화학 결합된 항-CD89 Fab' 항체 단편 (인간 모노클로날 항-CD89 항체, 14A8로부터 유도됨)을 함유한다.
도 7A는 도 6에 나타낸 14A8×8C12 이중특이적 분자를 통한 PSMA-발현 세포의 단핵구-매개성 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 이중특이적 분자 농도의 함수로 나타낸 그래프이다. 결과를 저해제 무첨가물, 50 ㎍/㎖ 유리 항-FcRαR (14A8) F(ab')2 및 50 ㎍/㎖ 유리 항-FcγRI (H22) F(ab')2를 사용하여 특이적 세포 용해의 퍼센트로서 측정하였다. 도 7B는 이펙터:표적의 비가 100:1일 때 이중특이적 분자 14A8×8C12 및 모노클로날 항체 8C12를 통한 LNCaP 세포의 단핵구-매개성 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 나타낸 그래프이다. 도 7C는 이펙터:표적의 비가 100:1일 때, 저해제의 부재하에서 또는 과량의 14A8 F(ab')2 또는 H22 F(ab')2의 존재하에서 이중특이적 분자 14A8×8C12를 통한 LNCaP 세포의 단핵구-매개성 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 나타낸 그래프이다.
도 8A는 도 6에 나타낸 14A8×8C12 이중특이적 분자를 통한 PSMA-발현 세포의 호중구-매개성 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 이중특이적 분자 농도의 함수로 나타낸 그래프이다. 결과를 저해제 무첨가물, 25 ㎍/㎖ 유리 항-FcRαR (14A8) F(ab')2 및 25 ㎍/㎖ 유리 항-FcγRI (H22) F(ab')2를 사용하여 특이적 세포 용해의 퍼센트로서 측정하였다. 도 8B는 이펙터:표적의 비가 200:1일 때, 저해제의 부재하에서 또는 과량의 14A8 F(ab')2 또는 H22 F(ab')2의 존재하에서 이중특이적 분자 14A8×8C12를 통한 LNCaP 세포의 호중구-매개성 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 나타낸 그래프이다.
도 9A는 도 6에 나타낸 14A8×8C12 이중특이적 분자를 통한 PSMA-발현 세포의 혈액-매개성 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 이중특이적 분자 농도의 함수로 나타낸 그래프이다. 결과를 저해제 무첨가물, 25 ㎍/㎖ 유리 항-FcRαR (14A8) F(ab')2 및 25 ㎍/㎖ 유리 항-FcγRI (H22) F(ab')2를 사용하여 특이적 세포 용해의 퍼센트로서 측정하였다. 도 9B는 저해제의 부재하에서 또는 과량의 14A8 F(ab')2 또는 H22 F(ab')2의 존재하에서 14A8×8C12 이중특이적 분자를 통한 LNCaP 세포의 전혈-매개성 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 단핵구-유래 대식세포 (MDM) (원)에 의한 PSMA 발현 (LNCaP) 세포의이중특이적 분자 (14A8×8C12)-매개성 식세포작용을 나타낸 그래프이다. 결과는 저해제로서 과량의 14A8 항체(정사각형) 및 대조군으로서 H22 항체 (마름모)의 존재 및 부재하에서 식세포작용의 퍼센트로서 측정하였다.
도 11은 단핵구-유래 대식세포 (MDM)에 의한 LNCaP 종양 세포의 이중특이적 분자 (14A8×8C12)-매개성 식세포작용 및 항체 (8C12)-매개성 식세포작용을 나타낸 그래프이다.
도 12는 단핵구-유래 대식세포 (MDM) (원)에 의한 LNCaP 종양 세포의 이중특이적 분자 (14A8×8C12)-매개성 식세포작용을 나타낸 그래프이다. 삽입된 그래프는 과량의 14A8 F(ab')2 또는 H22 F(ab')2의 존재하에서 14A8×8C12 이중특이적 분자 (1 ㎍/㎖)에 의해 매개된 식세포작용을 나타낸다.
도 13은 LNCaP 종양 세포를 갖는 누드 마우스에서125I-4A3의 생체분포를 나타낸 막대 그래프이다. 동물의 꼬리 정맥을 통해125I-4A3 100 ㎍을 주사하고, 주사 후 0.25 및 24 시간째에 희생시켰다. 각 조직의 방사능의 양을 측정하였다. 데이타는 각 시점에서 복제 동물로부터 얻은 결과를 나타낸다.
도 14는 배양액 중의 LNCaP 세포에 의한125I-표지된 HuMAb의 내재화 및 프로세싱을 나타내는 그래프이다. LNCaP 세포를 요오드화 항체로 표지하고, 잘 세척하고, 세포 표면에 결합된 표지가 내재화되고 TCA 가용 생성물로 전환되는 양을 표시된 시점에 측정하였다. 요오드화 후에 항원 결합 특성을 보유한 3종의 HuMAb에 대한 결과를, 무관한 인간 IgG1을 음성 대조군으로 하여 나타냈다.
도 15는 특정한 항-PSMA HuMAb의 항원 결합력에 대한125I 요오드화의 효과를 나타낸 그래프이다. 결과는 고정된 천연 정제 LNCaP PSMA에 결합된125I-표지된 HuMAb의 양을 항체의 희석 인자의 함수로 나타낸다.
도 16은 특정한 항-PSMA HuMAb의 항원 결합력에 대한 DOTA-표지의 효과를 나타낸 그래프이다. 결과는 ELISA에 의해 측정된, PSMA에 결합된 DOTA-표지된 HuMAb 또는 비접합 항체의 양을 항체 양의 적정 (㎍/㎖ 단위)의 함수로 나타낸다.
도 17A 및 B는 HuMAb 4A3, 7F12, 8C12, 8A11 및 16F9 각각의 VH- 및 VL-영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 18은 HuMAb 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, 16F9의 뉴클레오티드 서열의 중쇄 V 영역과 배선 뉴클레오티드 서열의 상응하는 쇄 V 영역을 정렬 비교한 것이다.
도 19는 HuMAb 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, 16F9의 아미노산 서열의 중쇄 V 영역과 배선 아미노산 서열의 상응하는 쇄 V 영역을 정렬 비교한 것이다.
도 20은 HuMAb 4A3, 7F12, 8C12의 뉴클레오티드 서열의 경 (카파)쇄 V 영역과 배선 뉴클레오티드 서열의 상응하는 쇄 V 영역을 정렬 비교한 것이다.
도 21은 HuMAb 8A11, 16F9의 뉴클레오티드 서열의 경 (카파)쇄 V 영역과 배선 뉴클레오티드 서열의 상응하는 쇄 V 영역을 정렬 비교한 것이다.
도 22는 HuMAb 4A3, 7F12, 8C12의 아미노산 서열의 경 (카파)쇄 V 영역과 배선 아미노산 서열의 상응하는 쇄 V 영역을 정렬 비교한 것이다.
도 23은 HuMAb 8A11, 16F9의 아미노산 서열의 경 (카파)쇄 V 영역과 배선 아미노산 서열의 상응하는 쇄 V 영역을 정렬 비교한 것이다.
본 발명은 전립선 특이적 막 항원 (본원에서 "PSMA"로 지칭함)의 발현을 특징으로 하는 질환의 치료 및 진단을 위한 신규 항체-기재 요법을 제공한다. 본 발명의 요법에서는 PSMA 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 및(또는) 이 항체를 함유하는 관련 조성물을 이용한다. 본원에 예시된 특정한 실시양태에서는, 인간 항체를 V-D-J 재조합 및 이소형 전환을 통해 PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체의 다수의 이소형 (예컨대 IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있는 비인간 트랜스제닉 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스에서 생산한다. 따라서, 본 발명의 측면에는 항체, 항체 단편 및 이의 제약 조성물 뿐만이 아니라, 상기 모노클로날 항체를 생산하는 비인간 트랜스제닉 동물, B-세포 및 하이브리도마까지 포함된다. 본 발명의 항체를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 PSMA-발현 세포를 검출하거나, 또는 PSMA-발현 세포의 성장, 분화 및(또는) 운동성을 저해하는 방법 역시 본 발명에 포함된다.
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해, 특정한 용어들을 우선 정의하였다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에서 명시되었다.
용어 "전립선 특이적 막 항원", "PSMA" 및 "PSMA 항원"은 본원에서 혼용되며, 인간 PSMA의 변체, 이소형 및 종 동족체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 인간항체는, 특정한 경우, 비인간 종의 PSMA, 또는 인간 PSMA와 구조적으로 관련된 다른 단백질 (예를 들어, 인간 PSMA 동족체)과 교차-반응할 수 있다. 다른 경우, 이 항체들은 인간 PSMA에 완전히 특이적이고 종 또는 다른 유형의 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "성장 억제" (예를 들어 세포의 성장 억제를 지칭함)는 항-PSMA 항체와 접촉시킨 세포의 성장이 항-PSMA 항체와 접촉시키지 않은 동일 세포의 성장에 비해 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어 약 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 99％ 이상 또는 100％ 억제를 나타내는 것을 포함한다.
본원에 지칭하는 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분") 또는 단일쇄를 포함한다. "항체"는 황 결합에 의해 상호결합된 2개 이상의 중쇄 (H) 및 2개 이상의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH 1, CH 2및 CH 3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH및 VL영역은 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 불리는 초가변 영역으로 더 나누어질 수 있는데, 상기 초가변 영역 사이에는 프레임워크 영역 (Framework Region; FR)이라고 불리는,보존성이 보다 높은 영역이 존재한다. 각각의 VH및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (Clq) 등을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항원 결합 부분" (또는 간단하게 "항체 일부")이라는 용어는 항원 (예컨대 PSMA)에 대한 결합력을 보유하는 하나 이상의 항체 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀진 바 있다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL및 CH 1도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 황 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2단편; (iii) VH및 CH 1도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔 (arm)의 VL및 VH도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH도메인으로 구성된 dAb 단편 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546] 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 있다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법으로 VL및 VH영역이 쌍형성 (pairing)되어 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지되어 있음; 예를 들어 문헌 [Bird et al., (1998) Science242:423-426] 및 [Huston et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성한 단일 단백질 쇄가 되도록 할 수 있는 합성 링커를 통해 이들 2개 도메인을 연결시킬 수 있다. 이러한 단일쇄 항체도 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득하며, 상기 단편을 무손상 항체의 경우와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정자를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같이 분자의 화학적 활성 표면기로 구성되고, 통상적으로는 특이적인 3차원 구조 특성 뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다. 입체구조 에피토프와 비-입체구조 에피토프는, 입체구조 에피토프와의 결합은 변성 용매의 존재하에 소실되지만, 비-입체구조 에피토프와의 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
"천연 입체구조 에피토프" 또는 "천연 단백질 에피토프"는 본원에서 혼용되며, PSMA 분자의 선형 서열에서 상이한 위치에 있는 아미노산이 3차원 공간에서는 근접한 위치에 올 때 발생하는 PSMA 분자의 입체적 폴딩 (folding)에 의해 만들어진 단백질 에피토프를 포함한다. 이러한 입체구조 에피토프는 세포막의 세포 외면 상에 분포한다.
용어 "이중특이적 분자"는 2종의 상이한 결합 특이성 부위를 보유하는 임의의 작용제, 예를 들어 단백질, 펩티드, 단백질 복합체 또는 펩티드 복합체를 포함한다. 예를 들어 상기 분자는 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포의 표면상의Fc 수용체에 결합하거나 그와 상호작용할 수 있다. 용어 "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"는 2종 초과의 상이한 결합 특이성 부위를 보유하는 임의의 작용제, 예를 들어 단백질, 펩티드, 단백질 복합체 또는 펩티드 복합체를 포함한다. 예를 들어 상기 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체 및 (c) 하나 이상의 다른 성분에 결합하거나 그와 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 PSMA와 같은 세포 표면 항원, 및 이펙터 세포 상의 Fc 수용체와 같은 다른 표적에 대해 지시된 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 기타 다중특이적 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "이중특이적 항체"는 디아보디 (diabody)를 추가로 포함한다. 디아보디는 VH및 VL도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에서 발현된 2가의 이중특이적 항체이지만, 동일 쇄에 존재하는 상기 2개 도메인 사이에 쌍형성이 일어나기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 상기 도메인들이 또다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 함으로써 2개의 항원 결합 부위가 생성된다 (예를 들어 문헌 [Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448], [Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).
용어 "인간 항체 유도체"는 항체의 임의의 변형된 형태, 예를 들어, 항체와 또다른 작용제 또는 항체가 접합된 것을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 인간 이뮤노글로불린 서열을 사용하여, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스를 면역화시키거나 또는인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝하여 어떤 시스템으로부터 인간 항체를 수득한다면 이 항체는 특정 배선 서열로부터 "유도된" 것이다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 "유도된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열과 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열을 비교하여 확인할 수 있다. 선택된 인간 항체의 아미노산 서열은 전형적으로 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 90％ 이상 동일하며, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예컨대, 뮤린 배선 서열)과 비교했을 때 인간 항체를 인간의 것으로 확인되도록 하는 아미노산 잔기를 갖는다. 특정한 경우, 인간 항체의 아미노산 서열은 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 95％ 이상, 또는 심지어 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 배선 서열로부터 유도된 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 서열 차이를 나타낼 것이다. 특정한 경우, 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1 개 이하의 아미노산 서열 차이를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종항체"는 2종 이상의 항체, 항체 결합 단편 (예컨대 Fab), 그의 유도체 또는 서로 연결된 항원 결합 영역 (이들 중 2종 이상은 상이한 특이성을 가짐)을 지칭한다. 이들 상이한 특이성에는 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이성 부위 및 종양 세포 등과 같은 표적 세포 상의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성 부위가 포함된다. 본원에서 사용된 바와같이, 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 보유하는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발이나 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"에는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 배선으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식되어 있는 항체는 포함되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일한 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 보유하는 단일한 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득한 B 세포를 불멸화 세포에 융합시켜 제조한 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자 또는 그로부터 제조한 하이브리도마 (하기 단락 I에서 추가로 기재함)에 대한 트랜스제닉 동물 (예컨대 트랜스제닉 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를발현하도록 형질전환시킨 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합의 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 보유한다. 그러나, 특정 실시양태에서는 이러한 재조합 인간 항체를 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 사용된 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발)시킬 수 있으며, 이로써 수득한 재조합 항체의 VH및 VL영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH및 VL서열로부터 유래하며 그와 관련되어 있지만 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 (repertoire)에는 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종유래 항체"는 이러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 비인간 유기체와 관련하여 정의된다. 상기 용어는 트랜스제닉 비인간 동물로 구성된 것이 아니라 일반적으로 트랜스제닉 비인간 동물 종이 아닌 종으로부터 유도된 유기체에 존재하는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 보유하는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종하이브리드 항체"는 여러 유기체 기원의 경쇄 및 중쇄를 보유하는 항체를 지칭한다. 예를 들어 뮤린 경쇄와 결합된 인간 중쇄를 보유하는 항체는 이종하이브리드 항체이다. 이종하이브리드 항체의예로는 전술한 키메라 항체 및 인간화 항체 등이 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 항체"는 여러가지 항원 특이성을 보유하는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 지칭한다 (예를 들어 PSMA에 결합하는 단리된 항체에는 PSMA가 아닌 항원과 결합하는 항체는 실질적으로 존재하지 않음). 그러나, 인간 PSMA의 에피토프, 이소형 또는 변체에 결합하는 단리된 항체는 다른 종 (예컨대 PSMA 종 동족체)으로부터의 다른 관련 항원에 교차 반응성을 가질 수 있다. 추가로, 단리된 항체는 다른 세포내 물질 및(또는) 화학물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상이한 특이성을 보유하는 "단리된" 모노클로날 항체들의 배합물은 잘 규정되어 있는 조성물 중에서 배합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 소정의 항원에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 약 1 ×10-7M 이하의 해리 상수 (KD)로 결합하고, 소정의 항원에 대한 결합 KD가 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원이 아닌 비특이적 항원 (예컨대 BSA, 카제인)에 대한 결합 KD보다 2배 이상 더 낮다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 혼용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 "고친화도"라는 용어는 약 10-8M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10-9M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10-10M 이하의KD를 갖는 항체를 지칭한다. 약 107M-1이상, 바람직하게는 109M-1이상, 더욱 바람직하게는 1010M-1, 1011M-1, 1012M-1이상, 예를 들어 1013M-1초과까지의 결합 친화도를 지칭한다. 그러나, 다른 항체 이소형에서는 "고친화도" 결합이 달라질 수 있다. 예를 들어 IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 약 1 ×10-7M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10-8M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 상수를 지칭하는 반면, 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "KD"는 Ka에 대한 Kd의 비 (즉, Kd/Ka)로부터 얻어지는 해리 상수를 지칭하고 몰 농도 (M) 단위로 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예컨대 IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이소형 전환"은 항체의 클래스 또는 이소형이 어떤 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스로 변화되는 현상을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전환되지 않은 이소형"은 이소형 전환이 일어나지 않은 경우에 생산되는 중쇄의 이소형 클래스를 지칭하는데, 전환되지 않은 이소형을 코딩하는 CH 유전자는 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자의 바로 아래에 위치하는 제1 CH 유전자인 것이 통상적이다. 이소형 전환은 고전적 이소형 전환 또는 비-고전적 이소형 전환으로 분류된다. 고전적 이소형 전환은 트랜스진 내 하나 이상의 전환 서열 영역이 관여하는 재조합 사건에 의해 일어난다. 비-고전적 이소형 전환은 예를 들어 인간 σμ과 인간 Σμ(δ-관련 결실) 사이의 상동성 재조합에 의해 일어날 수 있다. 무엇보다도 트랜스진 사이의 재조합 및(또는) 염색체 사이의 재조합과 같은 별법의 비-고전적 전환 메카니즘이 일어나 이소형 전환을 수행할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전환 서열"은 전환 재조합을 담당하는 DNA 서열을 지칭한다. 전형적인 μ전환 영역인 "전환 공여자" 서열은 전환 재조합 동안 결실될 구조물 영역의 5' (즉, 상류)일 것이다. "전환 수용자" 영역은 결실될 구조물 영역과 대체 불변 영역 (예컨대 γ, ε등) 사이에 위치할 것이다. 언제나 재조합이 일어나는 특정한 부위는 없기 때문에, 구조물로부터 최종 유전자 서열을 예측할 수 없는 것이 통상적이다.
본원에 사용된 "글리코실화 패턴"은 단백질, 더욱 구체적으로 이뮤노글로불린 단백질에 공유 결합된 탄수화물 단위의 패턴으로 정의된다. 이종유래 항체의 글리코실화 패턴이 트랜스진의 CH 유전자가 유도된 종보다 비인간 트랜스제닉 동물의 종에서의 글리코실화 패턴과 더 유사하다는 것을 당업자가 인식할 경우, 상기 이종유래 항체의 글리코실화 패턴은 비인간 트랜스제닉 동물 종에 의해 생산되는 항체에서의 자연 발생 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사하다는 것을 특징으로 할수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어떤 대상물에 적용되는 "자연 발생"이라는 용어는 상기 대상체가 자연계에 존재할 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연계의 공급원으로부터 단리할 수 있고 인간이 실험을 통해 고의로 변형시키지 않은 유기체 (바이러스를 포함함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재배열된"은 V 절편이 본질적으로 완전한 VH또는 VL도메인 각각을 코딩하는 입체형태로 D-J 또는 J 절편과 바로 인접하여 위치하는 중쇄 또는 경쇄 이뮤노글로불린 좌위의 형태를 지칭한다. 재배열된 이뮤노글로불린 유전자 좌위는 배선 DNA와 비교하여 확인할 수 있고, 재배열된 좌위에는 하나 이상의 재조합 7량체/9량체 상동성 요소가 있을 것이다.
본원에서 V 절편에 대해 사용된 바와 같이, 용어 "재배열되지 않은" 또는 "배선 형태"라는 용어는 V 절편이 D 또는 J 절편에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 형태를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 이중 가닥 DNA인 것이 바람직하다.
PSMA에 결합하는 항체 또는 항체 일부 (예컨대 VH, VL, CDR3)를 코딩하는 핵산에 대해 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 핵산 분자"는, 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 PSMA가 아닌 항원과 결합하는 항체 또는 항체 일부를 코딩하며 인간 게놈 DNA에서는 이 핵산을 자연적으로 플랭킹 (flanking)할 수 있는 다른 뉴클레오티드 서열이 존재하지 않는 핵산 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 항-PSMA 항체 또는 그의 일부는 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 및 각각 서열 1, 3, 5, 7 또는 9 및 2, 4, 6, 8 또는 10을 보유하는 중쇄 (VH) 가변 영역과 경쇄 (VL) 가변 영역을 포함한다.
본원에 개시되고 청구된 바와 같이, 서열 1 내지 서열 58에 기재된 서열은 "보존적 서열 변형", 즉, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 상기 특성을 유의하게 변경시키지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 포함한다. 이러한 보존적 서열 변형은 뉴클레오티드 및 아미노산의 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지정 돌연변이유발법 및 PCR-매개된 돌연변이유발법 등과 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 서열 1 내지 서열 58에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기의 군은 당업계에 정의되어 있다. 이들 군은 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 아스파르트산, 글루탐산), 비대전된 극성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 세스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 인간 항-PSMA 항체에서 비필수라고 예측되는 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 군으로부터의 또다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이 바람직하다.
별법으로, 또다른 실시양태에서는 예를 들어 포화 돌연변이유발법에 의해 항-PSMA 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부에 돌연변이가 무작위로 도입될 수 있고, 이로써 생성되는 변형된 항-PSMA 항체를 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고(되거나) 또는 본원에 개시된 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 아미노산 서열 (즉, 서열 1 내지 서열 50)을 함유하는 항체는 보존적 변형된 유사 서열에 의해 코딩되거나 그를 함유하는 실질적으로 유사한 항체를 포함한다. 이처럼 실질적으로 유사한 항체를 본원에 서열 1 내지 서열 50으로서 개시된 부분 (즉, 중쇄 및 경쇄 가변 영역)의 서열에 기초하여 생성할 수 있는 방법에 대한 추가 논의는 하기에 제공된다.
핵산의 경우에 있어서, 용어 "실질적인 상동성"은 뉴클레오티드가 적당하게 삽입 또는 결실되어 있는 2개 핵산 또는 그의 특정 서열을 최적으로 정렬하여 비교할 때 뉴클레오티드의 약 80％ 이상, 통상적으로는 약 90 내지 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 98 내지 99.5％ 이상이 동일함을 나타낸다. 별법으로, 실질적인 상동성은 절편이 선택적인 혼성화 조건하에 상기 가닥의 상보체와 혼성화할 때 존재한다.
2개 서열 사이의 동일성 (％)은 갭 (gap)의 수 및 각 갭의 길이를 고려하면서 2개 서열을 최적으로 정렬할 때 도입할 필요가 있는 서열이 공유하는 동일 위치의 수에 대한 함수이다 (즉, 상동성 (％) = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 ×100). 서열의 비교 및 2개 서열 사이의 동일성 (％) 측정은 하기하는 비제한적 실시예에 기재된 바와 같이 수학적인 알고리즘을 이용하여 수행할 수 있다.
2개 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 (％)은 GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램으로 NWSgapdna.CMP 메트릭스, 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여 측정할 수 있다. 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 (％)은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 도입된 이. 메이어스 (E. Meyers) 및 더블유. 밀러 (W. Miller)의 알고리즘 [Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)]으로 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여 측정할 수도 있다. 또한, 2개 아미노산 서열 사이의 동일성 (％)은 GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램에 도입된 니들만 (Needleman) 및 웬치 (Wunsch)의 알고리즘 [J Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]으로 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열을 "의문 서열"로서 추가로 사용하여공공 데이타베이스를 검색함으로써 예를 들어 관련된 서열을 확인할 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다. NBLAST 프로그램 (점수 = 100, 단어길이 = 12)으로 BLAST 뉴클레오티드를 검색하여 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. XBLAST 프로그램 (점수 = 50, 단어길이 = 3)으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교하기 위한 갭 정렬을 얻기 위해서는 갭 BLAST를 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각 프로그램 (예컨대 XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
핵산은 온전한 세포, 세포 용해물, 또는 부분 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩 (banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 공지된 기타 기술을 비롯한 표준 기술에 의해 다른 세포내 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포내 핵산 또는 단백질로부터 분리되어 정제된 경우 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한" 형태가 된다 [F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)].
cDNA, 게놈 또는 그의 혼합물로부터의 본 발명의 핵산 조성물은 종종 천연 서열로 존재하지만 (변형된 제한 부위 등은 제외함), 표준 기술에 따라 이를 돌연변이시킨 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이러한 돌연변이는 아미노산 서열에 원하는 바에 따라 영향을 미칠 수 있다. 특히, 천연 V, D, J 서열, 불변 서열 및 전환 서열 및 본원에 기재된 이러한 기타 서열과 실질적으로 상동성이 있거나 이들로부터 유도된 DNA 서열도 고려된다 (여기서, "유도된"은 한 서열이 또다른 서열과 동일하거나 그로부터 변형된 것임을 의미함).
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계를 갖도록 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 준다면 이들은 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 전사 조절 서열의 경우, 작동가능하게 연결되어 있다는 것은 연결된 DNA 서열이 인접해 있고, 필요한 경우에는 2개의 단백질 코딩 영역이 인접하여 리딩 프레임으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 전환 서열의 경우, 작동가능하게 연결되어 있다는 것은 상기 서열이 전환 재조합을 수행할 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 또다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 유형 중 하나는 추가 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또다른 벡터 유형은 바이러스 벡터인데, 이 벡터에서는 추가 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제될 수 있다 (예컨대 박테리아 복제 기원을 보유하는 박테리아 벡터 및 에피솜형 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예컨대 비-에피솜형 포유동물 벡터)도 숙주 세포로의 도입시에 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 추가로, 몇몇 벡터는 이들과 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다. 본원에서는 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게 "발현 벡터")라고 지칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 혼용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터 (예컨대 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같이 동등한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 이후 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 사실상 이러한 자손은 모(母) 세포와 동일하지 않을 수 있지만 본원에 사용된 "숙주 세포"라는 용어의 범위에 여전히 포함된다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어 CHO 세포 및 림프구 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
용어 "트랜스제닉 비인간 동물"은 하나 이상의 인간 중쇄 및(또는) 경쇄 트랜스진 또는 트랜스염색체 (transchromosome) (동물의 천연 게놈 DNA에 통합되거나통합되지 않음)를 포함하며 인간 항체를 완전히 발현할 수 있는 게놈을 보유하는 비인간 동물을 지칭한다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스는 인간 경쇄 트랜스진 및 인간 중쇄 트랜스진이나 인간 중쇄 트랜스염색체를 보유할 수 있어서, 상기 마우스는 PSMA 항원 및(또는) PSMA-발현 세포로 면역화되는 경우에 인간 항-PSMA 항체를 생성한다. 인간 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉, 예를 들어 HuMAb 마우스의 경우에서와 같이 마우스의 염색체 DNA로 통합될 수도 있고 인간 중쇄 트랜스진은 WO02/43478에 기재된 바와 같이 트랜스염색체 (예컨대 KM) 마우스의 경우에서와 같이 염색체외에서 유지될 수도 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스염색체 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소형 전환을 수행함으로써 PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체의 여러 이소형 (예컨대 IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생성할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면을 하기 단락에 더욱 상세하게 기재하였다.
I. PSMA 에 대한 인간 항체의 생산
본 발명의 인간 모노클로날 항체 (MAb)는 통상적인 모노클로날 항체 생산기술, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술 등을 비롯한 다양한 기술로 생산할 수 있다. 체세포 혼성화 방법이 바람직하지만, 원칙적으로는 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 또는 종양유전자 형질전환을 이용할 수도 있다.
하이브리도마의 제조에 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 제조는 매우 잘 확립된 방법이다. 융합을 위한 면역화 비장세포를 단리하는 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너(예컨대 뮤린 골수종 세포) 및 융합 방법도 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, PSMA에 대한하는 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템이 아니라 인간 면역계의 일부를 수반하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 이용하여 생성시킬 수 있다. 본원에서 트랜스제닉 마우스 및 트랜스염색체 마우스에는 HuMAb 마우스 및 KM 마우스가 각각 포함되고, 이들을 통틀어 "트랜스제닉 마우스"라 지칭한다.
HuMAb 마우스는 내인성 μ쇄 및 κ쇄 좌위를 불활성화시키는 표적 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니좌위 (miniloci)를 함유한다 [Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474):856-859]. 따라서, 상기 마우스는 마우스의 IgM 또는 κ의 발현이 감소된 것으로 나타나고, 면역화에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나 고친화도의 인간 IgGκ모노클로날 항체가 생산된다 ([Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌 ([Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]에서 검토됨)], [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93] 및 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546]). HuMAb 마우스의 제조는 하기 단락 II 및 문헌 ([Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295], [Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5:647-656], [Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724], [Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123], [Chen, J. etal. (1993) EMBO J. 12:821-830], [Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920], [Lonberg et al., (1994) Nature 368 (6474):856-859], [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101], [Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591], [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93], [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546], [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851])에 상세하게 기재되어 있고, 상기 모든 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고 문헌으로 인용된다. 또한, 론버그 (Lonberg) 및 카이 (Kay) 및 젠팜 인터내셔날 (GenPharm International)의 미국 특허 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 제5,789,650호, 동 제5,877,397호, 동 제5,661,016호, 동 제5,814,318호, 동 제5,874,299호 및 동 제5,770,429호; 수라니 (Surani) 등의 국 특허 제5,545,807호; 1998년 6월 11일자로 공개된 WO98/24884; 1994년 11월 10일자로 공개된 WO94/25585; 1993년 6월 24일자로 공개된 WO93/1227; 1992년 12월 23일자로 공개된 WO92/22645; 1992년 3월 19일자로 공개된 WO92/03918도 참조할 수 있는데, 상기 모든 문헌의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고 문헌으로 인용된다. 별법으로, 실시예 2에 기재된 HCO12 트랜스제닉 마우스를 이용하여 인간 항-PSMA 항체를 생성할 수 있다.
면역화
문헌 [Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474); 856-859], [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851] 및 WO98/24884)에 기재된 바와 같이, PSMA에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해 HuMAb 마우스를 PSMA 항원 및 PSMA-발현 세포가 정제되어 있거나 풍부한 제제로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 제1 주입시에 6 내지 16주령일 것이다. 예를 들어, PSMA 항원이 정제되어 있거나 풍부한 제제 (5 내지 20 ㎍) (예를 들어 PSMA-발현 LNCaP 세포로부터 정제됨)를 사용하여 HuMAb 마우스를 복강내 면역화시킬 수 있다. PSMA 항원이 정제되어 있거나 풍부한 제제를 사용한 면역화가 항체를 생성시키지 않을 경우에는 마우스를 PSMA-발현 세포, 예를 들어 종양 세포주로 면역화시켜 면역 반응을 촉진할 수도 있다.
다양한 항원을 사용하여 누적된 경험에서 HuMAb 트랜스제닉 마우스는 전형적으로, 이를 처음에는 프로인트 (Freund's) 완전 아쥬반트 중의 항원으로 복강내 (IP) 면역화시킨 후에, 프로인트 불완전 아쥬반트 중의 항원으로 (총 6회까지) 격주로 복강내 면역화시키고, 이어서 프로인트 불완전 아쥬반트 중의 항원으로 (총 10회까지) 격주로 IP/SC 면역화하는 경우에 가장 잘 반응하는 것으로 밝혀진 바 있다. 면역 반응은 안와후 채혈로 수득한 혈장 샘플을 사용한 면역화 프로토콜 과정에 걸쳐 모니터링할 수 있다. 혈장을 ELISA (하기에 기재함)에 의해 스크리닝할 수 있고, 항-PSMA 인간 이뮤노글로불린의 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 마우스를 희생시켜 비장을 적출하기 3일 전에 마우스를 항원으로 정맥내 부스팅 (boosting)시킬 수 있다. 각 항원에 대해 2 내지 3회의 융합을 수행할 필요가 있을 수 있음이 예측된다. 각 항원에 대해 여러 마리의 마우스를 면역화시킬 것이다. 예를 들어, HC07 및 HCO12 종의 HuMAb 마우스 총 12마리를 면역화시킬 수있다.
PSMA 에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스에서 얻은 비장세포 및 림프절 세포를 단리하여 적절한 불멸 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다. 이어서, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 50％ PEG를 사용하여 1/6 수의 P3X63-Ag8.653 비-분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)와 융합시킬 수 있다. 대략 2 ×105개의 세포를 평판 바닥 미량역가 플레이트에 플레이팅한 후, 20％ 태아 클론 혈청, 18％ "653" 조건화 배지, 5％ 오리겐 (이겐 (IGEN) 제품), 4 mM L-글루타민, 1 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 유닛/㎖ 페니실린, 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신, 50 ㎎/㎖ 젠타마이신 및 1 ×HAT (시그마 (Sigma) 제품; HAT는 융합시킨 후 24시간 뒤에 첨가함)이 함유된 선별 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 약 2주 후에는 HAT를 HT로 교체한 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, ELISA로 개개의 세포를 인간 항-PSMA 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상적으로 10 내지 14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 다시 플레이팅하여 다시 스크리닝하고, 인간 IgG, 항-PSMA 모노클로날 항체에 대해 여전히 양성이면 제한 희석법으로 2회 이상서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 조직 배양 배지 중에서 시험관내 배양하여 소량의 항체를 생산하고, 이를 사용하여 특징을 규명한다.
PSMA 에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
또한, 예를 들어 당업계에 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술과 유전자 형질감염 방법을 병행하여, 본 발명의 인간 항체를 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생성할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]).
예를 들어 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해서, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어 PCR 증폭법, 부위-지정 돌연변이유발법)로 수득할 수 있고 발현 벡터에 삽입하여 상기 유전자를 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결시킬 수 있다. 본원에서, 용어 "작동가능하게 연결"은 항체 유전자를 벡터에 라이게이션시켜 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 수행하는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용가능한 것으로 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터에 삽입할 수도 있고, 더욱 통상적으로는 상기 2개 유전자 모두를 동일 발현 벡터에 삽입한다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터에 존재하는 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 라이게이션)을 이용하여 발현 벡터에 삽입한다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, 이들을 원하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하고 있는 발현 벡터에 삽입하여 VH절편이 벡터 내에서 CH절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VL절편이 벡터 내에서 CL절편에 작동가능하게 연결되도록 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자 생성에 사용될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 벡터에 클로닝되어 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 프레임내 (in-flame) 연결될 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 항체 쇄 유전자 뿐 아니라 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 함유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예컨대 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 이러한 조절 서열은 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, Sand Diego, CA (1990)] 등에 기재되어 있다. 당업자라면, 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 고안이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 포유동물 숙주 세포에서의 발현에 바람직한 조절 서열은 사이토메갈로바이러스 (CMV), 시미안 바이러스 40 (Simian Virus 40; SV40), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유도된 프로모터 및(또는) 인핸서등과 같이 포유동물 세포에서 단백질이 높은 수준으로 발현되도록 하는 바이러스 요소를 포함한다. 별법으로, 비-바이러스 조절 서열, 예를 들어 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터를 사용할 수도 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 항체 쇄 유전자 및 조절 서열 뿐 아니라 숙주 세포에서의 벡터 복제를 조절하는 서열 (예를 들어 복제 기점) 및 선별가능한 마커 유전자 등의 추가 서열을 함유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어 액셀 (Axel) 등의 미국 특허 제4,399,216호, 동 4,634,665호 및 동 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별가능한 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선별을 위함)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)은 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 도입하는데 통상적으로 이용되는 광범위하게 다양한 기술, 예를 들어 전기천공법, 칼슘-인산염 침전법, DEAE-덱스트란 형질감염법 등을 포함한다. 이론적으로는 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시킬 수 있지만, 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적절하게 폴딩된 면역학적적 활성 항체를 조립하고 분비하기 더 쉽기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 발현은 고수율의 활성 항체 생산에 효과적이지 못하다고 보고된 바 있다 [Boss, M.A. and Wood, C.R.(1985) Immunology Today 6:12-13].
본 발명의 재조합 항체 발현에 바람직한 포유동물 숙주 세포로는 예를 들어 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선별가능한 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 차이니스 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포 (dhfr-CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포 등이 있다. 특히, NSO 골수종 세포에 사용하기 위한 또다른 바람직한 발현 시스템은 WO87/04462, WO89/01036 및 EP338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 경우, 항체는 숙주 세포를 숙주 세포에서 항체가 발현될 만큼 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 중으로 항체가 분비될 만큼 충분한 시간 동안 배양함으로써 생산된다. 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
무손상 항체 발현을 위한 부분 항체 서열의 사용
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, 개개의 항체들 사이에서 CDR 내의 아미노산 서열이 CDR 외의 서열에 비해 더욱 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 성질의 여러가지 항체로부터의 프레임워크 서열에 특이적 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 이식한 발현 벡터를 제작함으로써 특이적 천연 발생 항체의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332 323-327], [Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525] 및 [Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033] 참조). 이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이타베이스로부터 얻을 수 있다. 이들 배선 서열은 B 세포 성숙 동안 V(D)J 연결에 의해 형성되어 완전 조립된 가변 유전자를 포함하지 않기 때문에 성숙 항체 유전자 서열과는 상이할 것이다. 또한, 배선 유전자 서열은 개개의 가변 영역에 전반에 걸쳐 고친화도의 2차 레퍼토리 항체의 서열과 상이할 것이다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역의 아미노-말단 부분에서는 비교적 드물다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역 1의 아미노-말단 부분 및 프레임워크 영역 4의 카르복시-말단 부분에서 비교적 드물다. 추가로, 다수의 체세포 돌연변이가 항체의 결합 성질을 유의하게 변경시키지 않는다. 이러한 이유 때문에, 원래의 항체와 결합 성질이 유사한 무손상 재조합 항체를 재생성하기 위해 특정 항체의 전체 DNA 서열을 얻을 필요가 없다 (1999년 3월 12일자로 출원한 PCT/US99/05535 참조, 상기 문헌은 본원에 모든 목적으로 참고 문헌으로 인용됨). 전형적으로, 이러한 목적에는 CDR 영역을스패닝 (spanning)하는 부분 중쇄 및 경쇄 서열로 충분하다. 부분 서열을 사용하여, 어떠한 배선 가변 및 연결 유전자 절편이 재조합된 항체 가변 유전자에 기여하는지를 결정한다. 이어서, 배선 서열을 사용하여 가변 영역의 손실된 부분을 채운다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 동안 절단되어, 최종 항체의 성질에는 기여하지 않는다. 이러한 이유로, 발현 구조물에는 상응하는 배선 리더 서열을 사용할 필요가 있다. 손실된 서열을 부가하기 위해, 클로닝된 cDNA 서열을 라이게이션 또는 PCR 증폭에 의해 합성 올리고뉴클레오티드와 조합할 수 있다. 별법으로, 전체 가변 영역을 짧은 중첩 올리고뉴클레오티드 세트로서 합성하여 PCR 증폭에 의해 조합하면, 전체의 합성 가변 영역 클론을 생성할 수 있다. 이 방법은 특정 제한 부위를 제거 또는 포함시키거나, 또는 특정 코돈을 최적화시키는 등의 몇가지 이점을 갖는다.
하이브리도마로부터 얻은 중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드의 중첩 세트를 고안하여, 천연 서열과 동일한 아미노산 코딩능을 보유하는 합성 V 서열을 생성한다. 합성 중쇄 및 카파 쇄 서열은, 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 용이하게 하기 위한 일련의 반복된 뉴클레오티드 염기가 삽입되어 있고, 코작 규칙 (Kozak's rule)에 따른 최적 번역 개시 부위가 혼입되어 있으며 [Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870], HindIII 부위가 번역 개시 부위의 상류에 유전자조작되어 있다는 세가지 측면에서 천연 서열과 상이할 수 있다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘다에서, 최적화된 코딩 및 상응하는 비-코딩 가닥서열은 상응하는 비-코딩 올리고뉴클레오티드의 대략 중간지점에서 30 내지 50 뉴클레오티드에서 분해된다. 따라서, 각각의 쇄에서 올리고뉴클레오티드는 150 내지 400개 뉴클레오티드의 절편을 스패닝하는 중첩 이중 가닥 세트로 조립될 수 있다. 이어서, 풀 (pool)을 주형으로서 사용하여 150 내지 400개 뉴클레오티드의 PCR 증폭 생성물을 생성한다. 전형적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 세트를 따로 증폭시켜 2개의 중첩 PCV 생성물이 생성된 2개의 풀로 분리한다. 이어서, 이들 중첩 생성물을 PCT 증폭으로 조합하여 완전한 가변 영역을 형성한다. 또한, PCR 증폭물에 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 중첩 단편 (카파 경쇄의 BbsI 부위 또는 감마 중쇄의 AgeI 부위를 포함함)을 포함시켜 발현 벡터 구조물로 쉽게 클로닝될 수 있는 단편을 생성하는 것이 바람직할 수도 있다.
이어서, 재구성된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝된 프로모터, 해독 개시, 불변 영역, 3' 비해독, 폴리아데닐화 및 전사 종결 서열과 조합하여 발현 벡터 구조물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구조물을 단일 벡터에 조합하여 숙주 세포에 동시 형질감염시키거나, 순차적으로 형질감염시키거나 따로 형질감염시키면, 두 쇄 모두가 융합된 형태로 발현되는 숙주 세포가 형성된다.
인간 IgGκ를 위한 발현 벡터 제작에 사용하기 위한 플라스미드를 하기에 기재한다. PCR 증폭된 V 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열을 사용하여 완전 중쇄 및 경쇄 미니유전자 (minigene)를 재구성할 수 있도록 플라스미드를 제작하였다. 이들 플라스미드를 사용하여 인간 또는 키메라 IgG1κ 또는 IgG4κ 항체를 완전히 발현시킬 수 있다. 다른 중쇄 이소형의 발현 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위한 유사한 플라스미드를 제작할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면에서는 본 발명의 인간 항-PSMA 항체, 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 구조적 특징을 이용하여 PSMA에 대한 결합성과 같이 본 발명에 따른 항체의 기능적 성질을 하나 이상 보유하는 구조적으로 관련있는 인간 항-PSMA 항체를 생성한다. 더욱 구체적으로, 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 하나 이상의 CDR을 공지된 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합적으로 조합하여 본 발명에 따라 재조합으로 유전자조작된 추가의 인간 항-PSMA 항체를 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또다른 실시양태에서 (1) 인간 중쇄 프레임워크 영역, 및 하나 이상이 도 19에 나타낸 CDR의 아미노산 서열 (서열 21 내지 서열 35)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 CDR, 및 (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역, 및 하나 이상이 도 22 및 도 23에 나타낸 CDR의 아미노산 서열 (서열 36 내지 서열 50)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 CDR을 포함하며 PSMA에 대한 결합력을 보유하는 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 항-PSMA 항체의 제조 방법을 제공한다. 항체의 PSMA 결합력은 실시예에 기재한 바와 같은 표준 결합 분석법 (예컨대 ELISA)을 이용하여 측정할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도에 있어 특히 중요한 역할을 한다는 것이 당업계에 공지되어 있기 때문에, 상기와 같이 제조된 본 발명의 재조합 항체는 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 중쇄 및경쇄 CDR3을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 항체는 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 CDR2를 추가로 포함할 수 있다. 항체는 또한 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 CDR1을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 (1) 인간 중쇄 프레임워크 영역, 인간 중쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 CDR2 영역, 및 도 19에 나타낸 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 CDR3 (서열 23, 26, 29, 32 또는 35)으로부터 선택된 인간 중쇄 CDR3 영역, 및 (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역, 인간 경쇄 CDR1 영역, 인간 경쇄 CDR2 영역, 및 도 22 및 도 23에 나타낸 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 CDR3 (서열 38, 41, 44, 47 또는 50)에서 선택된 인간 경쇄 CDR3 영역을 포함하며 PSMA에 결합하는 항-PSMA 항체를 또한 제공한다. 상기 항체는 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 중쇄 CDR2 및(또는) 경쇄 CDR2를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체는 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 중쇄 CDR1 및(또는) 경쇄 CDR1을 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기에 기재된 바와 같이 유전자조작된 항체의 CDR1, CDR2 및(또는) CDR3 영역은 본원에 개시된 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 상기 영역들과 정확하게 동일한 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 당업자는 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 정확한 CDR 서열과 약간 차이가 있어도 항체의 효과적인 PSMA 결합력을 여전히 보유할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 또다른 실시양태에서, 상기 유전자조작된 항체는 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 또는 16F9의 하나 이상의 CDR과 예를 들어 90％, 95％, 98％ 또는 99.5％ 동일한 하나 이상의 CDR로 구성될 수 있다.
단순히 PSMA에 결합하는 것 외에, 상기에 기재된 바와 같이 유전자조작된 항체는, 예를 들어
(1) 인간 PSMA를 발현하는 살아있는 세포에 대한 결합;
(2) 해리 상수 (KD) 10-8M이하 (예컨대, 10-9M 또는 10-10M 이하)로 인간 PSMA에 결합;
(3) PSMA 상의 독특한 에피토프에 결합 (상보적인 활성을 갖는 모노클로날 항체가 조합하여 사용됐을 때 동일한 에피토프에 결합하려고 경합할 가능성을 제거하기 위해);
(4) 생체내에서 PSMA를 발현하는 종양 세포의 성장을 저해 및(또는)
(5) 인간 이펙터 세포의 존재하에서 (예컨대 ADCC 분석에서) PSMA를 발현하는 세포의 식세포작용 및(또는) 사멸과 같은, 본 발명에 따른 항체의 다른 기능적 성질을 보유하는지 여부에 따라 선택할 수 있다.
PSMA 에 대한 인간 모노클로날 항체 결합의 특징규명
본 발명의 인간 모노클로날 항체의 PSMA에 대한 결합을, 예를 들어 표준 ELISA로 시험할 수 있다. 간단히 말해, 미량역가 플레이트를 PBS 중 0.25 ㎍/㎖의 정제된 PSMA으로 코팅한 후, PBS 중 5％ 소 혈청 알부민으로 차단한다. PSMA-면역화된 마우스로부터의 혈장 희석액을 각각의 웰에 가하고 1 내지 2시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후에 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약과 함께 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질 (1 ㎎/㎖)로 발색시켜 405 내지 650의 OD에서 분석한다. 최고 역가를 나타낸 마우스를 융합에 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기한 바와 같은 ELISA 분석법을 이용하여 PSMA 면역원과의 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝할 수도 있다. PSMA에 높은 화학력 (avidity)으로 결합하는 하이브리도마를 서브클로닝하여 추가로 특징규명한다. 모 세포의 반응성 (ELISA에 의해 측정함)을 보유하는 각 하이브리도마로부터 하나의 클론을 선택하여 5 내지 10개의 바이알 세포 뱅크를 제조하여 -140 ℃에 저장하고 항체를 정제할 수 있다.
인간 항-PSMA 항체를 정제하기 위해서, 선별된 하이브리도마를 2 ℓ 스피너 (spinner)-플라스크에서 성장시켜 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 상등액을 여과하고 농축한 후에 단백질 A-세파로스를 사용한 친화성 크로마토그래피 (미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 (Pharmacia) 제품)를 수행할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하여 순도를 확인할 수 있다. 완충 용액은 PBS로 교환할 수 있으며, 1.43 흡광 계수를 사용한 OD280으로 농도를 측정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 -80 ℃에 저장할 수 있다.
선택된 인간 항-PSMA 모노클로날 항체가 특정한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 시판 시약 (미국 일리노이주 록포드 소재 피어스 (Pierce))을 사용하여 각 항체를 비오티닐화시킬 수 있다. 상기한 바와 같이 PSMA으로 코팅한 ELISA 플레이트를 사용하여, 표지되지 않은 모노클로날 항체 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구를 수행할 수 있다. 비오티닐화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 알칼리성 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다.
정제된 항체의 이소형을 결정하기 위해, 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 미량역가 플레이트의 웰을 10 ㎍/㎖ 항-인간 Ig로 4 ℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 5％ BSA로 차단한 후, 상기 플레이트를 10 ㎍/㎖ 모노클로날 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 상기 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제에 접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 상기한 바와 같이 발색시켜 분석한다.
PSMA을 발현하는 살아있는 세포에 대한 모노클로날 항체의 결합을 입증하기 위해서는 유식세포측정법을 이용할 수 있다. 유식세포측정 프로토콜의 전형적인 예에서 (이에 제한되지는 않음), PSMA-발현 세포주 (표준 성장 조건하에 성장시킴)를 0.1％ Tween 80 및 20％ 마우스 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 모노클로날 항체와 혼합하고, 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 세포를 1차 항체 염색시와 동일한 조건하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 샘플을 단일 세포에 대한 광산란 및 측산란 성질을 이용하는 FACScan 기기로 분석할 수 있다. 형광 현미경을 사용하는 별법의 분석법을 유식세포측정법과 병행하거나 유식세포측정법 대신에 이용할 수 있다. 상기한 바와 정확하게 동일한 방식으로 세포를 염색하여 형광 현미경으로 조사할 수 있다. 이 방법은 개개의 세포를 가시화할 수 있지만, 항원의 밀도에 따라 민감성이 감소될 수 있다.
웨스턴 블로팅을 이용하여, 항-PSMA 인간 IgG를 PSMA 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험할 수 있다. 간략히, PSMA-발현 세포로부터의 세포 추출물을 제조하여 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킬 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고 20％ 마우스 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙 (probing)한다. 인간 IgG 결합을 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제 (미국 미주리주 세인트루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴파니 (Sigma Chem. Co.) 제품)로 발색시킬 수 있다.
PSMA 에 대한 인간 모노클로날 항체의 식세포작용 및 세포 사멸 활성
인간 모노클로날 항-PSMA 항체는 PSMA에 대한 특이적 결합 뿐 아니라 PSMA-발현 세포의 식세포작용 및 사멸 매개력에 대해 시험할 수도 있다. 모노클로날 항체 활성의 시험관내 시험은 생체내 모델을 시험하기 전의 초기 스크리닝을 제공할 것이다. 요약하자면, 건강한 공여자의 다형핵 세포 (PMN) 또는 다른 이펙터 세포를 피콜 하이파크 (Ficoll Hypaque) 밀도 원심분리한 후에 오염물질인 적혈구를 용해시켜 정제할 수 있다. 세척된 PMN은 10％ 열-불활성화 태아 송아지 혈청으로 보충된 RPMI에 현탁시키고 이펙터 세포 대 종양 세포 (이펙터 세포:종양 세포)의 다양한 비율로51Cr 표지된 PSMA-발현 세포와 혼합할 수 있다. 이어서, 정제된 인간 항-PSMA IgG를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 관계없는 인간 IgG를 음성 대조군으로서 사용할 수 있다. 분석은 37 ℃에서 0 내지 120분 동안 수행할 수 있다. 배양 상등액으로의51Cr 방출량을 측정함으로써 샘플을 세포용해에 관해 분석할 수 있다. 또한, 항-PSMA 모노클로날을 서로 배합하여 시험함으로써 여러 모노클로날 항체를 사용하면 세포용해가 향상되는지 여부를 결정할 수도 있다.
또한, PSMA에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생체내 모델 (예컨대 마우스)에서 시험하여, PSMA-발현 세포, 예를 들어 종양 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개하는 데 있어서의 그의 효능을 결정할 수도 있다. 이들 항체는 예를 들어 하기하는 비-제한적 기준을 기초로 선별할 수 있다:
1) 살아있는 PSMA-발현 세포에의 결합;
2) PSMA에의 높은 결합 친화도;
3) PSMA상의 독특한 에피토프에의 결합 (조합하여 사용될 경우 상보적 활성을 보유하는 모노클로날 항체가 동일한 에피토프에의 결합에 대하여 경쟁할 가능성은 제외함);
4) PSMA-발현 세포의 옵소닌화;
5) 인간 이펙터 세포의 존재하에 PSMA-발현 세포의 성장 억제, 식세포작용 및(또는) 사멸의 매개.
본 발명의 바람직한 인간 모노클로날 항체는 상기 기준 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 충족시킨다. 특정 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 예를 들어 2종 이상의 항-PSMA 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물로서 배합하여 사용된다. 예를 들면, 단일 요법에서 상이하지만 상보적인 활성을 보유하는 인간 항-PSMA 모노클로날 항체를 배합하여 원하는 치료 또는 진단 효과를 달성할 수 있다. 이의 일례는 이펙터 세포의 존재하에 표적 세포의 고도로 효과적인 사멸을 매개하는 항-PSMA 인간 모노클로날 항체를 함유하고 PSMA-발현 세포의 성장을 억제하는 또다른 인간 항-PSMA 모노클로날 항체와 배합된 조성물일 것이다.
II . 인간 모노클로날 항- PSMA 항체를 생성하는 트랜스제닉 비인간 동물의 생산
다른 측면에서, 본 발명은 PSMA에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현시킬 수 있는 트랜스제닉 및 트랜스염색체 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 중쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 제공하며, 상기 마우스는 PSMA 항원 및(또는) PSMA-발현 세포로 면역화되는 경우에 인간 항-PSMA 항체를 생성한다. 인간 중쇄 트랜스진은 본원에 상세하게 기재하고 예시한 바와 같은 트랜스제닉 (예컨대 HuMAb) 마우스의 경우와 같이, 마우스의 염색체 DNA로 통합될 수 있다. 별법으로, 인간 중쇄 트랜스진은 WO02/43478에 기재된 바와 같이 트랜스염색체 (예컨대 KM) 마우스의 경우에서와 같이, 염색체외에서 유지될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스염색체 동물은 V-D-J 재조합 및 이소형 전환을 수행함으로써 PSMA에 대한 다수의 인간 모노클로날 항체의 여러 이소형 (예컨대 IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있다. 이소형 전환은 예를 들어 고전적이거나 비-고전적인 이소형 전환에 의해 발생할 수 있다.
이종유래 항체 레퍼토리를 보유하는 외래 항원 자극에 대해 반응하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 비인간 동물을 고안하기 위해서는, 트랜스제닉 동물 내에 함유된 이종 이뮤노글로불린 트랜스진이 B-세포 발생 경로에 걸쳐 올바르게 작동할 것이 요구된다. 예를 들면, 이는 이종 중쇄 트랜스진의 이소형 전환을 포함한다. 따라서, 트랜스진은 이소형 전환을 수행하고, 하기 중 하나 이상을 나타내는 항체를 생성하도록 제작된다: (1) 고수준의 세포-유형 특이적 발현, (2) 기능적 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배재의 활성화 및 이에 대한 반응, (4) 충분한 1차 레퍼토리의 발현, (5) 신호 전달, (6) 체세포 과다변이 및 (7) 면역 반응 동안의 트랜스진 항체 좌위의 우성화.
상기 기준 모두를 충족시킬 필요는 없다. 예를 들면, 트랜스제닉 동물의 내인성 이뮤노글로불린 좌위의 기능이 손상된 이러한 실시양태에서, 트랜스진은 대립유전자 배재를 활성화할 필요가 없다. 추가로, 트랜스진이 기능적으로 재배열된 중쇄 및(또는) 경쇄 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 이러한 실시양태에서, 기능적 유전자 재배열의 두번째 기준은 적어도 트랜스진이 이미 재배열된 경우에는 불필요하다. 분자 면역학의 배경 기술에 관해서는, 본원에 참고 문헌으로 인용된 문헌 [Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.]를 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 생성에 사용되는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 비인간 동물은 트랜스제닉 동물의 배선 내에 재배열된 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 재배열되지 않은 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진 또는 이들의 조합을 함유한다. 각각의 중쇄 트랜스진은하나 이상의 CH유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 B-세포에서 다수의 CH유전자를 코딩하는 이종 트랜스진의 이소형 전환을 지지할 수 있는 기능적 이소형 전환 서열을 함유할 수 있다. 이러한 전환 서열은 트랜스진 CH유전자의 공급원 역할을 하는 종 유래의 배선 이뮤노글로불린 좌위에서 자연적으로 발생하는 것일 수 있거나 또는 이러한 전환 서열은 트랜스진 구조물을 수용하게 될 종 (트랜스제닉 동물)에서 발생하는 것들로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 트랜스제닉 마우스 생성에 사용되는 인간 트랜스진 구조물은 이 구조물이 마우스 중쇄 좌위에서 자연적으로 발생하는 것과 유사한 전환 서열을 혼입하는 경우, 아마도 마우스 전환 서열은 마우스 전환 재조합효소 시스템과 함께 작동하도록 최적화되어 있지만 인간 전환 서열의 경우에는 그렇지 못할 것이기 때문에, 이소형 전환 사건을 더 높은 빈도로 수행할 수 있다. 전환 서열은 통상의 클로닝 방법에 의해 단리 및 클로닝되거나 또는 이뮤노글로불린 전환 영역 서열에 대한 공개된 서열 정보를 바탕으로 고안된 합성 올리고뉴클레오티드를 중첩시켜 새로 합성할 수 있다 (본원에 참고 문헌으로 인용된 문헌 [Mills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991)], [Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989)]). 상기 트랜스제닉 동물 각각의 경우, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 B-세포의 유의한 비율 (10％ 이상)로 발견된다.
본 발명의 트랜스제닉 동물 발생에 사용되는 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 절편, 하나의 다양성 (diversity) 유전자 절편, 하나의 연결 유전자 절편및 하나 이상의 불변 영역 유전자 절편을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 트랜스진을 포함한다. 이뮤노글로불린 경쇄 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 절편, 하나의 연결 유전자 절편 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 절편을 코딩하는 DNA를 포함한다. 경쇄 및 중쇄 유전자 절편을 코딩하는 유전자 절편은 트랜스제닉 비인간 동물로 구성되지 않은 종으로부터 얻은 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 절편을 코딩하는 DNA로부터 유래되거나 또는 이 DNA와 상응한다는 점에서 비인간 트랜스제닉 동물에 대해서 이종성이다. 본 발명의 한 측면에서, 트랜스진은 개별 유전자 절편이 재배열되지 않도록, 즉, 기능적 이뮤노글로불린의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않게 제작한다. 재배열되지 않은 이러한 트랜스진은 V, D 및 J 유전자 절편의 재조합 (기능적 재배열)을 지지하며, 바람직하게는 PSMA 항원에 노출되는 경우 트랜스제닉 동물에서 생성된 재배열된 이뮤노글로불린 중쇄 내의 D 영역 유전자 절편의 전부 또는 일부의 혼입을 지지한다.
별법의 실시양태에서, 트랜스진은 재배열되지 않은 "미니좌위"를 포함한다. 이러한 트랜스진은 전형적으로 C, D 및 J 절편의 실질적인 부분 뿐 아니라 V 유전자 절편의 하위군을 포함한다. 이러한 트랜스진 구조물에서, 다양한 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 클래스 전환 영역, RNA 프로세싱에 대한 스플라이스 공여자 및 스플라이스-수용자 서열 및 재조합 신호 등은 이종 DNA로부터 유도된 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열은 본 발명에 사용된 비인간 동물과 동일한 종 또는 그와 관련된 종으로부터 얻은 트랜스진 내에 혼입될 수 있다. 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 유전자 절편은 트랜스제닉 마우스에서 사용하기 위한 설치류 이뮤노글로불린 인핸서 서열을 보유하는 트랜스진 내에서 조합될 수 있다. 별법으로, 합성 조절 서열이 포유동물의 게놈에서 자연 발생한다고 공지된 기능적 DNA 서열과 상동성이 없는 경우, 이러한 합성 조절 서열은 트랜스진에 혼입될 수 있다. 합성 조절 서열은 예를 들어 스플라이스-수용자 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용되는 서열을 특정화하는 것과 같은 컨센서스 (consensus) 규칙에 따라 고안된다. 예를 들어 미니좌위는 자연 발생 배선 Ig 좌위에 비해 비필수적인 DNA 일부 (예컨대 개입 서열; 인트론 또는 그의 일부)의 내부 (즉, 그 일부의 말단부는 아님) 결실을 하나 이상 보유하는 게놈 이뮤노글로불린 좌위의 일부를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, PSMA에 대한 인간 항체 생성에 사용되는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 동물은 WO98/24884의 실시예 12에 기재된 트랜스진 (예컨대 pHC1 또는 pHC2)을 1개 카피 이상, 전형적으로 2 내지 10개 카피, 때로는 25 내지 50개 카피 이상 함유하며, 상기 동물을 WO98/24884의 실시예 5, 6, 8 또는 14에 기재된 경쇄 트랜스진의 단일 카피를 함유하는 동물과 교배하고, 그 자손은 WO98/24884의 실시예 10에 기재된 JH결실 동물과 교배하며, 상기 내용은 명백히 본원에 참고 문헌으로 인용된다. 동물을 교배하여 이 세가지 특질 각각에 대한 동형접합체를 만들어 낸다. 이들 동물은 다음의 유전자형을 보유한다: 재배열되지 않은 인간 중쇄 미니좌위의 단일 카피 (염색체 반수체 세트 당) (WO98/24884의 실시예 12에 기재됨), 재배열된 인간 κ경쇄 구조물의 단일 카피 (염색체 반수체 세트당) (WO98/24884의 실시예 14에 기재됨) 및 기능적 JH절편의 전부가 제거된, 내인성 마우스 중쇄 좌위 각각에서의 결실 (WO98/24884의 실시예 10에 기재됨). 이러한 동물을 JH절편의 결실에 대하여 동형접합인 마우스 (WO98/24884의 실시예 10)와 교배하여 JH결실에 대하여 동형접합이고 인간 중쇄 및 경쇄 구조물에 대하여는 반접합인 자손을 생산하였다. 생산된 동물에 항원을 주사하고, 이를 사용하여 상기 항원에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산한다.
이러한 동물로부터 단리된 B 세포는 이들이 각 유전자의 단일 카피만을 함유하고 있기 때문에 인간 중쇄 및 경쇄에 대하여 단일특이적이다. 또한, 이들은 내인성 마우스 중쇄 유전자 카피 두개 모두가 WO98/24884의 실시예 9 및 12에 기재된 바와 같이 도입된 JH영역에 걸친 결실에 의해 비기능적으로 되기 때문에 인간 또는 마우스 중쇄에 대하여 단일특이적일 것이다. 또한, 재배열된 인간 κ경쇄 유전자의 단일 카피의 발현은 유의한 B 세포의 분획에서 내인성 마우스 κ및 람다 쇄 유전자의 재배열을 대립유전자적 및 이소형적으로 배제할 것이기 때문에, 실질적인 B 세포의 분획은 인간 또는 마우스 경쇄에 대하여 단일특이적일 것이다.
바람직한 트랜스제닉 및 트랜스염색체 비인간 동물, 예를 들어 마우스는 천연 마우스의 이뮤노글로불린과 이상적으로는 실질적으로 유사한 유의한 레퍼토리를 보유하는 이뮤노글로불린을 생산할 것이다. 따라서, 예를 들어 내인성 Ig 유전자를 불활성화시킨 실시양태에서, 총 이뮤노글로불린 수준은 혈청의 약 0.1 내지 10 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎎/㎖, 이상적으로는 약 1.0 ㎎/㎖ 이상의 범위일것이다. IgM으로부터 IgG로의 전환을 수행할 수 있는 트랜스진이 트랜스제닉 마우스에 도입된 경우, 성숙 마우스의 혈청내 IgG 대 IgM의 비율은 바람직하게는 약 10:1이다. IgG 대 IgM 비율은 미성숙 마우스에서는 훨씬 더 낮을 것이다. 일반적으로, 비장 및 림프절 B 세포의 약 10％ 초과, 바람직하게는 40 내지 80％는 인간 IgG 단백질을 독점적으로 발현시킨다.
레퍼토리는 이상적으로는 천연 마우스에서 나타난 것과 비슷하고, 일반적으로는 약 10％ 이상, 바람직하게는 25 내지 50％ 이상일 것이다. 일반적으로, 약 1,000가지 이상의 상이한 이뮤노글로불린 (이상적으로는 IgG), 바람직하게는 104내지 106가지 이상의 상이한 이뮤노글로불린이 주로 마우스 게놈 내에 도입된 상이한 V, J 및 D 영역의 수에 따라 생산될 것이다. 이러한 이뮤노글로불린은 전형적으로 고도로 항원성인 단백질, 예를 들어 포도상구균 (Staphylococcus) 단백질 A의 약 절반 이상을 인식할 것이다. 전형적으로, 이뮤노글로불린은 미리 선택된 항원에 대하여 약 107M-1이상, 바람직하게는 109M-1이상, 더욱 바람직하게는 1010M-1, 1011M-1, 1012M-1또는 그 이상, 예를 들어 1013M-1까지 또는 그 이상의 친화도를 발휘할 것이다.
몇몇 실시양태에서, 소정의 항원 유형에 대한 항체 반응에서 나타나는 V 유전자의 선택을 제한하기 위해서는 소정의 레퍼토리를 보유하는 비인간 동물을 발생시키는 것이 바람직할 수 있다. 소정의 레퍼토리를 보유하는 중쇄 트랜스진은 예를 들어 인간에서 소정의 항원 유형에 대한 항체 반응에 주로 사용되는 인간 VH유전자를 포함할 수 있다. 별법으로, 몇몇 VH유전자는 여러가지 이유로 (예를 들어 소정의 항원에 대한 고친화도 V 영역을 코딩할 가능성이 낮기 때문에; 체세포 돌연변이 및 친화도 증대를 수행할 성향이 낮기 때문에; 또는 일부 인간에 대하여 면역원성이기 때문에) 정의된 레퍼토리로부터 배제시킬 수 있다. 따라서, 다양한 중쇄 또는 경쇄 유전자 절편을 함유하는 트랜스진의 재배열에 앞서, 예를 들어 혼성화 또는 DNA 서열분석함으로써 트랜스제닉 동물이 아닌 생물 종으로부터 유도된 상기 유전자 절편을 쉽게 확인할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 트랜스제닉 및 트랜스염색체 비인간 동물, 예를 들어 비인간 마우스는 예를 들어 종래에 기재된 바와 같이 PSMA 항원 및(또는) PSMA-발현 세포의 정제된 또는 재조합적 생산으로 면역화할 수 있다. 별법으로, 트랜스제닉 동물은 인간 PSMA을 코딩하는 DNA로 면역화할 수 있다. 그 후, 동물은 트랜스진내 전환 재조합 (시스-전환)을 통해 클래스-전환을 경험하여 PSMA에 반응성인 이뮤노글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 이뮤노글로불린은 인간 항체 (또한 "인간 서열 항체"로도 언급됨)일 수 있으며, 여기서 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 체세포 돌연변이에 의해 유도되는 서열 및 V 영역 재조합 연결부 뿐만 아니라 배선-코딩된 서열을 포함할 수 있는 인간 트랜스진 서열에 의해 코딩되며, 이러한 인간 항체는, 체세포 돌연변이 및 특이한 V-J 및 V-D-J 재조합 연결의 결과로서 다른 비-배선 서열이 존재할 수 있을지라도, 인간 VL또는 VH유전자 절편 및 인간 JL또는 JH절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 것으로 언급될 수 있다. 각 항체 쇄의 가변 영역은 인간 배선 V, J 및 중쇄의 경우 D 유전자 절편에 의해 전형적으로 80％ 이상 코딩되고, 종종 가변 영역의 85％ 이상이 트랜스진 상에 존재하는 인간 배선 서열에 의해 코딩되며, 흔히 가변 영역 서열의 90 또는 95％ 이상이 트랜스진 상에 존재하는 인간 배선 서열에 의해 코딩된다. 그러나, 비-배선 서열은 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 연결에 의해 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 흔히, 마우스의 배선 내의 인간 트랜스진(들)에 존재하는 인간 V, D 또는 J 유전자 절편에 의해 코딩되지 않는 몇몇 가변 영역 서열 (및 보다 덜 흔하게는 불변 영역 서열)을 보유할 것이다. 전형적으로, 이러한 비-배선 서열 (또는 각각의 뉴클레오티드 위치)은 CDR 내 또는 그 근처, 또는 체세포 돌연변이가 클러스터되어 있는 것으로 공지된 영역 내에 클러스터될 것이다.
소정의 항원에 결합하는 인간 항체는, 인간 서열 γ쇄 (예컨대 γ1, γ2a, γ2B 또는 γ3) 및 인간 서열 경쇄 (예컨대 κ)를 포함하는 인간 항체가 생산되도록, 이소형 전환으로부터 생성될 수 있다. 이러한 이소형-전환된 인간 항체는 종종, 특히 2차 (또는 후속) 항원 투여 후 항원에 의한 B 세포의 친화도 성숙 및 선택의 결과로서, 전형적으로는 가변 영역내에, 흔히 CDR의 잔기 약 10개 또는 그 이내에서 하나 이상의 체세포 돌연변이(들)을 함유한다. 이러한 고친화도 인간 서열 항체의 KD는 10-7M이하, 예를 들어 10-8M 이하, 10-9M 이하 또는 10-10M 이하이거나 그보다 더 낮을 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 본원에 기재한 바와 같은 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 비인간 동물로부터 유도된 B 세포에 관한 것이다. B 세포는 인간 PSMA에 고친화도 (예컨대, KD가 10-7M 이하)로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마 생성에 사용할 수 있다. 따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 KD가 10-7M 이하, 예를 들어 10-8M 이하, 10-9M 이하 또는 10-10M 이하이거나 그보다 더 낮은 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공하며, 여기서 항체는
(1) 인간 VL유전자 절편 및 인간 JL절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 경쇄 가변 영역 및 (2) 인간 CL유전자 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 경쇄 불변 영역으로 구성된 인간 경쇄 서열 및
(1) 인간 VH유전자 절편, 임의로 D 영역 및 인간 JH절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 중쇄 가변 영역 및 (2) 인간 CH유전자 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 불변 영역으로 구성된 인간 중쇄 서열
을 포함한다.
PSMA에 대한 고친화도 인간 모노클로날 항체의 개발은 통합된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 비인간 동물에서 인간 가변 영역 유전자 절편의 레퍼토리를 확장하는 방법에 의해 용이해질 수 있으며, 이 방법은 상기 통합된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진에 존재하지 않는 V 영역 유전자 절편을 포함하는 V 유전자 트랜스진을 게놈 내로 도입하는 것을 포함한다. V 영역 트랜스진은 V 유전자 절편이 손상되거나 결실되어 있을 수 있는 인간 VH또는 VL(VK) 유전자 절편 배열물의 일부를 포함하는 효모 인공 염색체 (Yeast Artificial Chromosome; YAC)인 경우가 종종 있으며, 이는 인간 게놈에서 자연적으로 발생하거나 또는 재조합 방법에 의해 별도로 스플라이싱될 수 있기 때문이다. YAC 상에는 종종 5개 이상의 기능성 V 유전자 절편이 함유되어 있다. 이러한 변형법에서는 V 레퍼토리 확장 방법에 의해 생산되며 V 영역 트랜스진 상에 존재하는 V 영역 유전자 절편에 의해 코딩된 가변 영역 서열 및 인간 Ig 트랜스진 상에서 코딩된 C 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 쇄를 발현하는 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있다. V 레퍼토리 확장 방법에 의해, 5개 이상의 별개의 V 유전자를 보유하는 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있으며, 약 24개 이상의 V 유전자를 함유하는 동물도 생성할 수 있다. 몇몇 V 유전자 절편은 비-기능적일 수 있으며 (예컨대 슈도진 (pseudogene) 등), 이러한 절편은 유지시킬 수도 있고 또는 원한다면 당업자에게 이용가능한 재조합 방법을 통해 선택적으로 결실시킬 수도 있다.
마우스 배선을, J 및 C 유전자 절편을 함유하는 인간 Ig 트랜스진에는 실질적으로 존재하지 않는 확장된 V 절편 레퍼토리를 보유하는 기능적 YAC를 함유하도록 유전자조작한다면, 상기 형질 (trait)은 확장된 V 절편 레퍼토리를 보유하는 기능적 YAC가 상이한 인간 Ig 트랜스진을 보유하는 마우스 동물 배선 내로 혼입된 경우의 백그라운드 (background)를 비롯한 다른 유전자 백그라운드로 전달되어 혼입될 수 있다. 확장된 V 절편 레퍼토리를 보유하는 다수의 기능적 YAC는 배선 내로 혼입되어 인간 Ig 트랜스진 (또는 다수의 인간 Ig 트랜스진)과 함께 작동할 수 있다. 본원에서는 YAC 트랜스진이라고 지칭하지만, 이러한 트랜스진이 게놈 내로 통합되는 경우에는 효모에서의 자율 복제에 필요한 서열 등의 효모 서열이 실질적으로 결실되어 있을 수 있으며, 이러한 서열은 효모에서의 복제가 더 이상 필요하지 않게 된 후 (즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 전접합체로의 도입 이점)에 유전자 조작 (예컨대 제한 소화 및 펄스-필드 (pulsed-field) 겔 전기영동 또는 다른 적합한 방법)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 서열 발현의 형질을 전달하는 방법은 인간 Ig 트랜스진(들) 및 임의로는 확장된 V 절편 레퍼토리를 보유하는 기능적 YAC까지 보유하는 트랜스제닉 동물을 사육하는 것을 포함한다. YAC상에는 VH및 VL유전자 절편이 둘다 존재할 수 있다. 이 트랜스제닉 동물을, 인간 Ig 트랜스진 및(또는) 인간의 다른 림프구 단백질을 코딩하는 트랜스진을 비롯한 인간의 다른 트랜스진을 보유하는 백그라운드 등을 비롯하여 당업자가 원하는 임의의 백그라운드로 혼입시킬 수 있다. 본 발명은 또한 확장된 V 영역 레퍼토리 YAC 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 마우스에 의해 생산되는 고친화도 인간 서열 이뮤노글로불린을 제공한다. 상기에는 본 발명의 트랜스제닉 동물의 바람직한 실시양태를 기재하였으나, 본 발명에서는 하기의 4가지 카테고리로 분류된 다른 실시양태도 고려한다:
I. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물,
II. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물,
III. 재배열된 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물 및
IV. 재배열된 중쇄 및 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물.
이러한 트랜스제닉 동물의 카테고리 중에서, 바람직한 우선 순서는 II > I > III > IV (여기서, 내인성 경쇄 유전자 (또는 적어도 K 유전자)는 상동성 재조합 (또는 다른 방법)에 의해 넉아웃 (knock out)됨) 및 I > II > III > IV (여기서, 내인성 경쇄 유전자는 넉아웃되지 않았으며, 대립유전자 배제에 의해 우성화되어야 함)이다.
III. PSMA 에 결합하는 이중특이적 / 다중특이적 분자
본 발명의 또다른 실시양태에서, PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 유도체화시키거나 또는 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질 (예컨대 Fab' 단편)에 연결하여 다수의 결합 부위 또는 표적 에피토프에 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 생성시킬 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분은 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어 또다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 결합될 수 있다 (예를 들어 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 또는 다른 방식으로 결합될 수 있음).
따라서, 본 발명은 PSMA에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성 부위 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성 부위를 포함하는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI (PSMA) 또는 인간 Fcα 수용체 (CD89)이다. 따라서, 본 발명은 FcγR, FcαR 또는 FcεR 발현 이펙터 세포 (예컨대 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포 (PMN)) 및 PSMA을 발현하는 표적 세포 둘다에 결합할 수 있는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 및 다중특이적 분자는 PSMA-발현 세포를 이펙터 세포에 표적화하며, 본 발명의 인간 모노클로날 항체처럼 PSMA-발현 세포의 식세포작용, 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC), 사이토카인 방출 또는 수퍼옥사이드 음이온 생성 등과 같은 Fc 수용체로 매개되는 이펙터 세포 활성을 촉발시킨다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 부위 또는 항-PSMA 결합 특이성 부위 뿐 아니라 제3의 결합 특이성 부위를 추가로 포함할 수도 있다. 한 실시양태에서, 제3의 결합 특이성 부위는 항-상승인자 (anti-Enhancement Factor; EF) 부분, 예를 들어 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질과 결합함으로써 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자이다. "항-상승인자 (EF) 부분"은 소정의 분자, 예를 들어 항원 또는 수용체와 결합함으로써 Fc 수용체, 표적 세포 항원에 대한 결합 결정자의 효과를 상승시키는 항체, 기능적 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-상승 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원과 결합할 수 있다. 별법으로, 항-상승 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이성 부위가 결합하는 실체와는 상이한 실체에 결합할 수 있다. 예를 들어 항-상승 인자 부분은 (예를 들어 표적 세포에 대한 면역 반응의 증가를 일으키는 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 다른 면역 세포를 통해) 세포독성 T-세포와 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 결합 특이성 부위로서, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv를 비롯하여, 하나 이상의 항체 또는 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 1990년 8월 7일자로 허여된 래드너 (Ladner) 등의 미국 특허 제4,946,778호에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체 또는 Fv 또는 단일쇄 구조물과 같은 그의 임의의 최소 단편일 수도 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 이펙터 세포 표면 상에 존재하는 FcγR 또는 FcαR에 대한 결합 특이성 부위 및 표적 세포 항원, 예를 들어 PSMA에 대한 제2의 결합 특이성 부위를 포함한다.
한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성 부위는 인간 모노클로날 항체에 의해 제공되고, 이 항체의 결합은 인간 이뮤노글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "IgG 수용체"는 1번 염색체상에위치하는 8개의 γ-쇄 유전자들 중 임의의 것을 의미한다. 이 유전자들은 3가지 Fcγ수용체 클래스, 즉, FcγRI (PSMA), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)로 분류되는 총 12가지의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소형을 코딩한다. 바람직한 한 실시양태에서, Fcγ수용체는 인간의 고친화도 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 단량체성 IgG에 대해 고친화도 (108M-1내지 109M-1)을 나타내는 72 kDa의 분자이다.
상기 바람직한 모노클로날 항체의 생산 및 특징은 팡거 (Fanger) 등의 PCT 출원 WO88/00052호 및 미국 특허 제4,954,617호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 교시 내용은 그 전문이 본원에 참고 문헌으로 인용된다. 이들 항체는 수용체의 Fcγ결합 부위와는 다른 부위에서 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII의 에피토프에 결합하며, 따라서 이들의 결합은 생리적 수준의 IgG에 의해서 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특정 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 HB9469)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 이용가능하다. 다른 실시양태에서, 항-Fcγ수용체 항체는 모노클로날 항체 22 (H22)의 인간화 형태이다. H22 항체의 생산 및 특징은 문헌 [Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10):4996-5002] 및 PCT/US93/10384에 기재되어 있다. H22 항체를 생산하는 세포주는 1992년 11월 4일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 HA022CL1 명칭으로 기탁되어 기탁번호 CRL 11177을 배정받았다.
또다른 바람직한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성 부위는 인간IgA 수용체, 예를 들어 Fc-알파 수용체 (FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되고, 이 항체의 결합은 인간 이뮤노글로불린 A (IgA)에 의해 차단되지 않는 것이 바람직하다. 용어 "IgA 수용체"는 19번 염색체 상에 위치하는 1개의 α-유전자 (FcαRI)의 유전자 생성물을 포함하는 의미이다. 이 유전자는 달리 스플라이싱된, 55 내지 110 kDa의 여러 막횡단 이소형을 코딩한다고 공지되어 있다. FcαRI (CD89)은 단핵구/대식세포, 호산구 및 호중구 과립구에서는 기본적으로 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단에서는 발현되지 않는다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2 둘다에 대하여 친화도가 중간 정도 (약 5 ×107M-1)이며, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF 등의 사이토카인에 노출되는 경우에 증가한다 [Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]. IgA 리간드 결합 도메인 이외의 부위에서 FcαRI과 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 확인된 4가지 FcαRI-특이적 모노클로날 항체는 문헌 [Monteiro, R. C. et al., 1992, J. Immunol. 148:1764]에 기재되어 있다.
FcαRI 및 FcγRI은 (1) 주로 면역 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, PMN, 대식세포 및 수상 세포 상에서 발현되고; (2) 고수준으로 발현되고 (예컨대 세포 당 5,000 내지 100,000); (3) 세포독성 활성 (예컨대 ADCC, 식세포작용)의 매개자이고; (4) 그들에 표적화되는 자가-항원을 비롯한 항원의 항원 제시 증대를 매개하기 때문에, 본 발명에 사용하기에 바람직한 촉발 수용체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 표적 세포항원, 예를 들어 PSMA을 인식하여 예를 들어 그에 결합하는 결합 특이성 부위를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 결합 특이성 부위는 본 발명의 인간 모노클로날 항체에 의해 제공된다.
본원에서 언급된 바와 같은 "이펙터 세포 특이적 항체"는 이펙터 세포의 Fc 수용체와 결합하는 항체 또는 기능성 항체 단편을 의미한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 항체는 내인성 이뮤노글로불린에 의해 결합되지 않는 부위에서 이펙터 세포의 Fc 수용체와 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "이펙터 세포"는 면역 반응의 인식 및 활성화 단계와 대립되는, 면역 반응의 이펙터 단계에 관여하는 면역 세포를 의미한다. 예시적인 면역 세포에는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예컨대 세포용해 T 세포 (CTL)를 비롯한 B 세포 및 T 세포), 킬러 (killer) 세포, 천연 킬러 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만 세포 및 호염기구가 포함된다. 몇몇 이펙터 세포는 특정 Fc 수용체를 발현하며, 특정 면역 기능을 수행한다. 바람직한 실시양태에서, 이펙터 세포는 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있는데, 예를 들어 호중구는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어 FcR을 발현하는 단핵구, 대식세포는 표적 세포의 특이적 사멸 및 면역계의 다른 성분에게의 항원 제시 또는 항원 제시 세포와의 결합에 관여한다. 다른 실시양태에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포 또는 미생물을 식세포작용할 수 있다. 이펙터 세포 상의 특정 FcR의 발현은 사이토카인 등의 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어 FcγRI의 발현은 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 상승된 발현은 표적에 대한 FcγRI-보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 식세포작용하거나 용해시킬 수 있다.
"표적 세포"는 대상체 (예컨대 인간 또는 동물)에서 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자)에 의해 표적화될 수 있는, 임의의 바람직하지 않은 세포를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 세포는 PSMA을 발현하거나 과발현하는 세포이다. PSMA-발현 세포는 전형적으로 종양 세포, 예를 들어 방광, 유방, 결장, 신장, 난소, 전립선, 신세포, 편평 세포, 폐 (소세포가 아님) 및 머리 및 목 종양 세포를 포함한다. 다른 표적 세포는 활액 섬유아세포를 포함한다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자에 이용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화된 모노클로날 항체이다.
키메라 마우스-인간 모노클로날 항체 (즉, 키메라 항체)는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어 뮤린 (또는 다른 종) 모노클로날 항체 분자의 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자를 제한 효소로 소화시켜 뮤린 Fc를 코딩하는 영역을 제거하고, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자의 동일한 부분을 치환한다 (로빈슨 (Robinson) 등의 국제 특허 출원 제PCT/US86/02269호; 아키라 (Akira) 등의 유럽 특허 출원 제184,187호; 타니구치, 엠 (Taniguchi, M.)의 유럽 특허 출원 제171,496호; 모리슨 (Morrison) 등의 유럽 특허 출원 제173,494호; 뉴버거 (Neuberger) 등의 국제 특허 공개 제WO86/01533호; 캐빌리 (Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호; 캐빌리 등의 유럽 특허 출원 제125,023호; 문헌 [Better et al. (1988 Science 240:1041-1043)]; [Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443]; [Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526]; [Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218]; [Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005]; [Wood et al. (1985) Nature 314:446-449] 및 [Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559] 참조).
키메라 항체는 항원 결합에 직접 관여하지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역의 동일한 서열로 대체하여 추가로 인간화할 수 있다. 인간화 키메라 항체에 대한 일반적인 검토를 위해서는 문헌 ([Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207] 및 [Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214])을 참조한다. 이들 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나의 이뮤노글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열을 단리, 조작 및 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 핵산의 공급원은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 7E3, 항-GPIIbIIIa항체 생산 하이브리도마로부터 수득할 수 있다. 그 후, 키메라 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 재조합 DNA를 적합한 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 별법으로, 적합한 인간화 항체는 CDR 치환에 의해 생산할 수 있다 (미국 특허 제5,225,539호; 문헌 [Jones et al. 1986 Nature 321:552-525]; [Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534] 및 [Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060]).
특정 인간 항체의 모든 CDR을 비인간 CDR의 적어도 일부로 대체하거나, CDR의 일부만을 비인간 CDR로 대체할 수 있다. CDR을 인간화 항체와 Fc 수용체의 결합에 요구되는 수만큼 대체하는 것만이 필요하다.
인간 항체의 CDR의 적어도 일부를 비인간 항체로부터 유도된 CDR로 대체할 수 있는 임의의 방법에 의해, 항체를 인간화할 수 있다. 윈터 (Winter)는 본 발명의 인간화 항체 생산에 사용될 수 있는 방법을 1987년 3월 26일자로 출원된 영국 특허 출원 제GB 2188638A호에 개시하고 있는데, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로서 명백히 도입된다. 국제 특허 공개 제WO94/10332호 (발명의 영문 명칭: Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 인간 CDR을 비인간 CDR로 대체할 수 있다.
또한, 특정 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 키메라 및 인간화 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 특히, 바람직한 인간화 항체는 프레임워크 영역 내에 항원에 대한 결합을 개선시키는 아미노산 치환부를 보유한다. 예를 들어 마우스 CDR을 보유하는 인간화 항체에서 인간 프레임워크 영역 내에 위치하는 아미노산을 마우스 항체의 상응하는 부위에 위치하는 아미노산으로 대체할 수 있다. 이러한 치환은 몇몇 경우에 인간화 항체와 항원의 결합을 개선시킨다고 공지되어 있다. 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 항체를 본원에서는 변형된 항체 또는 변경된 항체라 언급한다.
또한, 변형된 항체라는 용어는, 예를 들어 항체의 일부를 결실, 부가 또는치환하여 변형시킨 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체 등과 같은 항체를 포함하는 의미이다. 예를 들어 불변 영역을 결실시키고, 그를 항체의 반감기, 예를 들어 혈청 반감기, 안정성 또는 친화도를 증가시키도록 의도된 불변 영역으로 대체하여 항체를 변형시킬 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자가 FcγR에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 영역을 보유하며 하나 이상의 이펙터 기능을 촉발시키는 한, 어떠한 변형도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화학적 기술 (예컨대 문헌 [D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807] 참조), "폴리도마 (polydoma)" 기술 (리딩 (Reading)의 미국 특허 제4,474,893호 참조) 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산할 수 있다.
특히, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 당업계에 공지되어 있으며 본원에서 제공된 실시예에 기재되어 있는 방법을 이용하여 성분 결합 특이성 부위들, 예를 들어 항-FcR 및 항-PSMA 결합 특이성 부위를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각각의 결합 특이성 부위를 별도로 생성시킨 다음, 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이성 부위가 단백질 또는 펩티드인 경우, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제를 사용할 수 있다. 가교제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)가 포함된다 (예를 들어문헌 [Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686], [Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법으로는 문헌 ([Paulus, Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132], [Brennan et al., Science (1985) 229:81-83] 및 [Glennie et al., J. Immunol. (1987) 139:2367-2375])에 기재된 방법이 포함된다. 바람직한 접합제는 미국 일리노이주 록포드에 소재하는 피어스 케미칼 캄파니 (Pierce Chemical Co.)로부터 입수할 수 있는 SATA 및 술포-SMCC이다.
결합 특이성 부위가 항체 (예컨대 2개의 인간화 항체)인 경우, 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 이들을 접합시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역이 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 포함하도록 변형시킨 다음, 접합시킨다.
별법으로, 두개의 결합 특이성 부위 모두 동일한 벡터내에 코딩시키고, 동일한 숙주 세포내에서 발현시켜 조립할 수 있다. 이 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 mAb ×mAb, mAb ×Fab, Fab ×F(ab')2또는 리간드 ×Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자, 예를 들어 이중특이적 분자는 단일쇄 분자, 예를 들어 단일쇄 이중특이적 항체, 하나의 단일쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자 또는 2개의 결합 결정자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 단일쇄 분자이거나, 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호, 동제5,455,030호, 동 제4,881,175호, 동 제5,132,405호, 동 제5,091,513호, 동 제5,476,786호, 동 제5,013,653호, 동 제5,258,498호 및 동 제5,482,858호에 기재되어 있다.
이중특이적 및 다중특이적 분자와 그의 특이적 표적의 결합은 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성면역분석 (RIA), FACS 분석, 생물분석 (예컨대 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인할 수 있다. 이러한 각각의 분석은 일반적으로 특정한 해당 단백질-항체 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예컨대 항체)을 사용하여 상기 해당 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예를 들어 항체-FcR 복합체를 인식하여 특이적으로 결합하는 효소-결합된 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 별법으로, 상기 복합체는 임의의 다양한 다른 면역분석을 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사성 물질로 표지하여 방사성면역분석 (RIA)에 이용할 수 있다 (예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). 방사성동위원소는 γ 계수기 또는 섬광계수기를 사용하는 방법 또는 자가방사기록법으로 검출할 수 있다.
IV . 항체 접합체 /면역독소
다른 측면에서, 본 발명은 치료 잔기, 예를 들어 세포독소, 약물 또는 방사성독소에 접합된 인간 항-PSMA 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 세포독소에 접합된 항체 접합체들을 "면역독소"라고 지칭한다. 세포독소 또는 세포독성제로는 세포에 해로운 (예컨대 세포를 사멸시키는) 임의의 작용제가 포함된다. 이들의 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 또한 치료제로는 항-대사물질 (예컨대 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예컨대 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신이라 함) 및 독소루비신), 항생제류 (예컨대 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신이라 함), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)) 및 항-유사분열제 (예컨대 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함된다. 본 발명의 항체와 접합될 수 있는 치료용 세포독성제의 다른 예로는 칼리케아미신 및 듀오카르마이신이 포함된다.
본 발명의 인간 항체는 또한 방사성동위원소, 예를 들어 방사성 요오드에 접합시켜, PSMA 관련 장애 (예컨대, 종양)를 치료 또는 진단하기 위한 세포독성 또는 비-세포독성 방사성 약제를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 항체 접합체를 사용하여 주어진 생물학적 반응을 변형시킬 수 있으며, 약물 잔기가 고전적인 화학 치료제로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 예를 들어, 약물 잔기는 바람직한 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로는 예를 들어 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF") 또는 다른 성장 인자가 포함될 수 있다.
이러한 치료 잔기를 항체에 접합시키는 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)], [Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)], [Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)], ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)] 및 [Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)]을 참조한다.
V. 제약 조성물
또다른 측면으로, 본 발명은 제약상 허용가능한 담체와 함께 제제화된, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분(들) 중 하나 또는 이들의 배합물을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 발명의 (예컨대 2개 이상의) 상이한 인간 항체 중 하나 또는 이들의 조합을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 인간 PSMA 상의 상이한 에피토프에 결합하고 상보적 활성을 갖는 인간 항-PSMA 항체의 조합물, 예를 들어 제약 조성물을 포함하는 치료용 조성물을 제공한다. 예를 들어, 이펙터 세포의 존재하에서 매우 효과적인 표적 세포 사멸을 매개하는 인간 모노클로날 항체를 PSMA 발현 세포의 성장을 저해하는 또다른 인간 모노클로날 항체와 조합할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 치료용 조성물은 본 발명의 면역접합체 또는 이중특이적 (또는 다중특이적) 분자를 단독으로 또는 조합물로서 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 병행 요법으로, 즉 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 병행 요법은 본 발명의 조성물과 1종 이상의 항-종양제 또는 다른 통상적인 요법을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용가능한 담체"로는 생리적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제, 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제 등이 포함된다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구,척수 또는 표피 투여 (예컨대 주사 또는 주입)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자를 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.
"제약상 허용가능한 염"은 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하며 임의의 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다 (예를 들어 문헌 [Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염으로는 무독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 및 인산 등으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 무독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유도된 것들이 포함된다. 염기 부가염으로는 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 등으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 무독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민 및 프로카인 등으로부터 유도된 것들이 포함된다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있다. 당업자라면 투여 경로 및(또는) 방식이 원하는 결과에 따라 달라질 것임을 잘 알 것이다. 활성 화합물은 급속한 방출에 대하여 화합물을 보호하는 담체를 사용하여 임플란트, 경피 패취 및 마이크로캡슐화 전달계를 비롯한 조절 방출형 제제로서 제조될 수 있다. 생분해성 및 생적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트,다중 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 작용제를 제조하는 다수의 방법은 특허되었거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조).
본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해, 화합물의 불활성화를 방지하는 물질로 화합물을 코팅하거나, 이러한 물질과 화합물을 공동 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 적절한 담체, 예를 들어 리포좀 또는 희석제 중에 넣어 대상체에게 투여할 수 있다. 제약상 허용가능한 희석제로는 염수 및 수성 완충액이 포함된다. 리포좀은 수중유중수 CGF 에멀젼뿐 아니라 통상적인 리포좀을 포함한다 (문헌 [Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27]).
제약상 허용가능한 담체로는 무균 주사용 용액제 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 무균 수용액 또는 분산액 및 무균 분말이 포함된다. 제약상 활성인 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 상용성인 한, 상기 매질 또는 작용제를 본 발명의 제약 조성물에 사용하는 것이 고려된다. 보충 활성 화합물 또한 조성물에 포함될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 무균성이어야 하며 제조 및 저장 조건하에 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 대해 적합한 다른 정돈된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 이용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입도를 유지함으로써, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 다수의 경우에서, 조성물 중에 등장성제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 주사가능한 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
필요량의 활성 화합물을 상기 언급한 성분들 중 하나 또는 이들의 배합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입한 다음, 무균 미세여과하여 무균 주사용 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 염기성 분산 매질 및 상기 언급한 것들 중 필요한 다른 성분을 포함하는 무균 비히클 중에 활성 화합물을 혼입시켜 분산액을 제조한다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 무균 여과한 용액으로부터의 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조법 및 동결 건조법 (동결건조)이다.
투여법을 조절하여 최적의 바람직한 반응 (예컨대 치료 반응)을 제공한다. 예를 들어, 치료 상황의 요건에 따라 지시되는 바와 같이, 단일 농축괴를 투여하거나 또는 여러 번으로 나누어 시간에 따라 투여하거나 투여량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여를 용이하게 하고 투여량을 일정하게 하기 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대하여 단위 투여량으로 적합하도록 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 미리 정해진 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과 및 (b) 개체에서 감응성 치료를 위해 이러한 활성 조합물을 배합하는 기술에 있어서의 고유한 제한에 의해 설명되며, 이들에 의해 직접적으로 좌우된다.
제약상 허용가능한 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨 및 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트 및 알파-토코페롤 등 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산 및 인산 등이 포함된다.
치료 조성물의 경우, 본 발명의 제제로는 경구, 비강, 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질내 및(또는) 비경구 투여에 적합한 것들이 포함된다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 제약 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합할 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 상기 양은 100％ 중 활성 성분 약 0.01％ 내지 약 99％, 바람직하게는 약 0.1％ 내지 약 70％, 가장 바람직하게는 약 1％ 내지 약 30％의 범위이다.
또한, 질내 투여에 적합한 본 발명의 제제로는 당업계에 적절한 것으로 알려진 담체를 포함하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 분무 제제가 포함된다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여용 투여 형태로는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패취 및 흡입제가 포함된다. 무균 조건하에 활성 화합물을 제약상 허용가능한 담체 및 필요에 따라 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 함께 혼합할 수 있다.
본원에서 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"이라는 구절은 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 보통 주사를 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉강내 주사 및 주입을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제약 조성물 중에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성유, 예를 들어 올리브유 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 포함된다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입도를 유지함으로써, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 아쥬반트, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를포함할 수도 있다. 상기 무균화 방법 및 다양한 항-박테리아제 및 항-진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등을 포함시키는 방법 둘다에 의해 미생물 존재의 방지를 보장할 수 있다. 등장성제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 주사가능한 약제 제형의 흡수를 지연시킬 수 있다.
본 발명의 화합물을 인간 및 동물에게 약제로서 투여하는 경우, 화합물을 단독으로 투여하거나, 예를 들어 활성 성분 0.01 내지 99.5％ (더욱 바람직하게는, 0.1 내지 90％) 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물로서 투여할 수 있다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및(또는) 본 발명의 제약 조성물을 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용가능한 투여 형태로 제제화한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준을 변화시켜, 환자에게 무독성이면서 특정 환자의 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양, 조성 및 투여 방식을 결정할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시기, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 기타 약물, 사용된 특정 조성물과 함께 사용된 화합물 및(또는) 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전체적인 건강 및 기존의 병력 및 의료분야에 잘 알려진 인자 등을 비롯하여다양한 약물동력학적 인자에 따라 달라질 것이다.
당업계의 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사라면 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 화합물의 투여량을, 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 양보다 더 낮은 수준에서 출발하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 제공하는 데 효과적인 가장 낮은 투여량에 해당하는 화합물의 양일 것이다. 이러한 효과적인 투여량은 일반적으로 상기 설명한 인자에 따라 달라질 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하, 바람직하게는 표적 부위 근처에 투여하는 것이 바람직하다. 원하다면, 치료 조성물의 효과적인 일일 투여량을 임의로 단위 투여 형태로 하루 동안 2회, 3회, 4회, 5회, 6회에 걸쳐 투여하거나, 적절한 간격으로 보다 여러 회에 걸쳐 분할 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여할 수 있지만, 화합물을 제약 제제 (조성물) 형태로 투여하는 것이 바람직하다.
치료 조성물을 당업계에 공지된 의료 디바이스 (device)를 이용하여 투여할 수 있다. 예를 들어 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물을 바늘이 없는 피하 주사 디바이스, 예를 들어 문헌 미국 특허 제5,399,163호, 동 제5,383,851호, 동 제5,312,335호, 동 제5,064,413호, 동 제4,941,880호, 동 제4,790,824호 또는 동 제4,596,556호에 개시된 디바이스를 이용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예로는 조절된 속도로 약물을 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약물을 투여하는 치료 디바이스를 개시하는 미국 특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,447,233호; 지속적인 약물 전달을 위한 가변 유동성의 이식가능한 주입 디바이스를 개시하는 미국 특허 제4,447,224호; 멀티-챔버 구획을 보유하는 삼투성 약물 전달계를 개시하는 미국 특허 제4,439,196호 및 삼투성 약물 전달계를 개시하는 미국 특허 제4,475,196호가 포함된다. 이들 특허의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 다른 여러 임플란트, 전달계 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내에서 적절히 분포되도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 화합물을 차단한다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 통과하는 것을 보장하기 위해, (원한다면) 이들 화합물을 예를 들어 리포좀내에 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대하여는, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호, 동 제5,374,548호 및 동 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특이적 세포 또는 기관내로 선택적으로 운반되는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있으며, 따라서 표적화된 약물 전달을 증가시킨다 (예를 들어 문헌 [V. V. Ranade (1989) J Clin. Pharmacol. 29: 685] 참조). 표적화 잔기의 예에는 엽산 또는 비오틴 (예를 들어 로우 (Low) 등에게 허여된 미국 특허 제5,416,016호 참조); 만노시드 (문헌 [Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]); 항체 (문헌 [P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140], [M. Owais et al. (1995) Antimicrob. AgentsChemother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (문헌 [Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233:134]) (그의 여러 종은 본 발명의 제제 뿐만 아니라 본 발명의 분자 성분을 포함할 수 있음); p120 (문헌 [Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090])이 포함되며, 또한, 문헌 [K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123], [J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273]을 참조한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 화합물을 리포좀내에 제제화하고, 더욱 바람직한 실시양태에서, 리포좀은 표적화 잔기를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 리포좀내 치료 화합물을 농축괴 주사에 의해 종양 또는 감염 부위 근처에 전달한다. 조성물은 주사 투여가 용이할 정도로 유동성이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다.
"치료 유효량"은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 비처리된 대상체에 비해 약 20％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 40％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 60％ 이상, 가장 바람직하게는 약 80％ 이상까지 억제한다. 암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서의 효능을 예상할 수 있는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 별법으로, 조성물의 이러한 특성은 예를 들어 당업자에게 공지되어 있는 시험관내 분석에 의해 화합물의 억제 능력을 조사함으로써 평가할 수 있다. 치료 유효량의 치료 화합물은 대상체에서 종양 크기를 감소시킬 수 있거나, 달리 말하면 증상을 경감시킬 수 있다. 당업자라면 대상체의 크기, 대상체 증상의 중증도 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자를 기준으로 하여 치료 유효량 결정할 수 있을 것이다.
조성물은 무균성이어야 하며, 주사기로 조성물을 전달할 수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 물 이외에도, 담체는 등장성 완충 염수 용액, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입도를 유지함으로써, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 다수의 경우, 등장성제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨 및 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 주사가능한 조성물의 장기간에 걸친 흡수가 일어나도록 할 수 있다.
활성 화합물이 적합하게는 상기와 기재된 바와 같이 보호되는 경우, 화합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있다.
VI. 본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 인간 모노클로날 항-PSMA 항체 및 관련된 유도체/접합체 및 조성물은 다양한 시험관내 및 생체내 진단 및 치료에 유용하다. 예를 들어, 이들 분자는 예를 들어 시험관내 또는 생체외 배양 중인 세포에 투여할 수 있다. 별법으로, 이들을 생체내로 대상체에 투여하여 다양한 PSMA-관련 장애를 치료, 예방 및 진단할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"라는 용어는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 바람직한 대상체로는 PSMA의 발현, 전형적으로는 PSMA의 이상발현 (예컨대, 과다발현)이 특징인 장애를 나타내는 인간 환자가 포함된다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은, 예를 들어, 전립선암, 결장암 및 신장 암종을 포함하는, PSMA를 발현하는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 종양형성성 장애를 가진 대상체를 치료하는데 사용할 수 있다. 본 발명에서 용어 "비인간 동물"에는 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비포유류, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등이 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-PSMA 항체 중 하나를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선암을 치료하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 항-PSMA 항체는 항체가 예를 들어 방사성 작용제 또는 세포독성 약물에 연결된 접합체로서 투여된다. 또다른 실시양태에서, 항-PSMA 항체는 예를 들어 항-FcγRI 또는 항-Fcα에 연결된 이중특이적 분자로서 투여된다.
본 발명의 인간 항체는 초기에 시험관 내에서 치료 또는 진단 용도와 관련된 결합 활성을 시험할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 하기 실시예에 기재된 ELISA 및 유식세포측정법을 사용하여 시험할 수 있다. 또한, 이 분자들이 PSMA 발현 세포의 세포용해를 포함하는, 하나 이상의 이펙터-매개성 이펙터 세포 작용을 격발하는 활성을 분석할 수 있다. 이펙터 세포-매개성 식세포작용을 분석하는 프로토콜을 하기 실시예에 기재하였다.
본 발명의 인간 항체는 또한 PSMA-관련 질병의 치료 및 진단에 추가적인 용도가 있다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자들은, 예를 들어, 하기 생물학적 활성 중 하나 이상을 생체내 또는 시험관내에서 유도할 수 있다: PSMA를 발현하는 세포의 옵소닌화; 인간 이펙터 세포의 존재하에서 PSMA를 발현하는 세포의 식세포작용 또는 세포용해의 매개; 또는 PSMA를 발현하는 세포의 성장의 저해.
본 발명의 항체 및 조성물을 투여하는 적합한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 적합한 투여량도 또한 당업계의 숙련자에 의해 결정될 수 있고, 대상체의 연령 및 체중 및 사용된 특정 약물에 따라 달라진다.
본 발명의 인간 항-PSMA 항체는 또한 다른 치료제, 예를 들어 화학 치료제와 병용 투여하거나, 또는 다른 공지된 요법, 예를 들어 방사선 조사와 같은 항암 요법과 병행할 수 있다. 이러한 다른 치료제에는 특히 항신생물제, 예컨대 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실 및 시클로포스파미드 시드록시우레아가 포함되고, 이들은 그 자체로서 환자에게 유독성이거나 준-유독성인 수준에서만 유효하다. 시스플라틴은 4주에 1회 100 ㎎/㎡의 투여량으로 정맥내 투여되고, 아드리아마이신은 21일마다 1회 60 내지 75 ㎎/㎡의 투여량으로 정맥내 투여된다. 본 발명의 인간 항-PSMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 화학치료제의 병용 투여는 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 나타내는 상이한 기전을 통해 작용하는 2가지 항암제를 제공한다. 이러한 병용 투여에 의해 약물에 대한 내성의 발달 또는 종양이 항체에 반응하지 않게 만드는 항원성의 변화로 인한 문제들을 해결할 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 및이중특이적 분자에 결합된 이펙터 세포 또한 치료제로 사용할 수 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 인간 백혈구, 예를 들어 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 다른 세포로는 호산구, 천연 킬러 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포가 포함된다. 원하다면, 이펙터 세포를 치료될 대상체로부터 얻을 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는 생리적으로 허용되는 용액 중의 세포 현탁액으로서 투여할 수 있다. 투여될 세포의 수는 약 108내지 109개일 수 있지만, 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 상기 양은 표적 세포, 예를 들어 PSMA-발현 종양 세포로의 국소화를 달성하고, 예를 들어 식세포작용에 의해 세포 사멸을 이루기에 충분한 양일 것이다. 투여 경로 또한 달라질 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포를 사용한 요법은 표적화된 세포의 제거를 위한 다른 기술과 함께 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및(또는) 이들 조성물과 결합된 이펙터 세포를 사용하는 항-종양 요법을 화학요법과 함께 이용할 수 있다. 또한, 병행 면역요법을 이용하여 종양 세포 거부에 대한 2가지 별개의 세포독성 이펙터 집단을 유도할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마RI 또는 항-CD3에 결합된 항-PSMA 항체를 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자를 사용하여, 예를 들어 이펙터 세포 표면 상의 수용체를 캡핑하고 제거함으로써 이펙터 세포 상의 FcγR 또는 FcαR 수준을 조정할 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물 또한 이러한 목적을 위해 사용할 수 있다.
보체 결합 부위, 예를 들어 보체와 결합하는 IgG1, IgG2 또는 IgG3 또는 IgM으로부터의 부위를 갖는 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 또한 보체의 존재하에 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 본 발명의 결합제 및 적절한 이펙터 세포로 생체외 처리하는 것은 보체 또는 보체 함유 혈청의 첨가에 의해 보충될 수 있다. 보체 단백질을 결합시켜 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 식세포작용을 개선할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포를 보체에 의해 용해시킬 수도 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 보체와 함께 투여할 수도 있다. 따라서, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 가까운 근처에 위치한다는 점에서 유리하다. 별법으로, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 보체 또는 혈청을 별도로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및 사용 지침서를 포함하는 키트 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 키트는 하나 이상의 추가의 시약, 예컨대 보체 또는 본 발명의 1종 이상의 다른 인간 항체 (예컨대 제1 인간 항체와는 별개인 PSMA 상의 에피토프에 결합하는 보체 활성을 보유하는 인간 항체)를 또한 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 대상체는 Fcγ또는 Fcα수용체의 발현 또는 활성을 조정하는, 예를 들어 증강시키거나 억제하는 작용제, 예를 들어 시토카인을 사용하여 추가로 치료할 수 있다. 다중특이적 분자로 치료하는 동안 투여하는 바람직한 시토카인으로는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF-α)가 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 사용하여, 예를 들어 FcγR 또는 PSMA를 발현하는 세포를 표적화, 예를 들어 이러한 세포를 표지할 수 있다. 이러한 용도의 경우, 결합제를 검출될 수 있는 분자에 결합시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 FcγR와 같은 Fc 수용체 또는 PSMA를 발현하는 세포를 생체외 또는 시험관내에서 국소화하는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는 예를 들어 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 항체와 PSMA 사이의 복합체 형성을 가능하게 하는 조건하에 상기 인간 모노클로날 항체를 샘플 (예를 들어, 대조 샘플과 함께)과 접촉시켜, 샘플 중 PSMA 항원의 존재를 검출하거나 PSMA 항원의 양을 측정하는데 사용될 수 있다. 복합체의 형성을 검출했을 때, 샘플과 대조 샘플 사이의 복합체 형성의 차이가 샘플 중의 PSMA 항원의 존재에 대한 지표이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 생체내 또는 시험관내에서 Fc-발현 세포의존재를 검출하거나, 그의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 검출가능한 마커에 접합된 본 발명의 조성물 (예컨대 다중특이적 또는 이중특이적 분자) 또는 그의 단편을 대상체에게 투여하는 단계, 및 (ii) 상기 검출가능한 마커를 검출하는 수단에 상기 대상체를 노출시켜 Fc-발현 세포를 함유하는 부위를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되나, 이로 한정되는 것으로 간주되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 도면 및 참고 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원은 본원에 명백히 참고 문헌으로 인용된 것이다.
재료 및 방법
PSMA -특이적 모노클로날 항체의 스크리닝 분석: 고상 ELISA-기재 분석을 사용하여 PSMA-HuMAb를 검출하였다. LNCaP 세포로부터 면역친화도 정제한 PSMA, 또는 PSMA 유래 단편을 함유하는 세균에서 발현된 융합 단백질을 맥시-소르프 (Maxi-Sorp (미국 뉴욕주 로체스터 소재 넌크 (Nunc)) 96-웰 플레이트 상에 코팅하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-0.2％ Tween-20으로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 5％ BSA로 차단하였다. 하이브리도마 배양액의 상청액 50 ㎕를 PSMA 코딩된 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하고, 각 웰에 1:1000으로 희석한 토끼-항-인간 IgG H＆L 쇄 (미국 캘리포니아주 코스타 메사 소재 ICN) 50 ㎕를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 플레이트를 상기와 같이 세척하고,각 웰에 1:2000으로 희석한 HRP-접합된 단백질 A (미국 미주리주 세인트루이스 소재 시그마) 50 ㎕를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 플레이트를 상기와 같이 세척하고, 각 웰에 ABTS (0.1 M 시트르산 500 ㎖ 중의 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산 150 ㎎, pH 4.35)/H2O2 (30％ H2O2 10 ㎕/ABTS 용액 10 ㎖) 크로마겐/기질 용액 100 ㎕를 첨가하였다. 5분 동안 인큐베이션한 후에, 중단 용액 (SDS/디메틸포름아미드) 100 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시키고, 마이크로플레이트 판독기로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. A405값이 높은 상청액을 생산하는 하이브리도마 세포를 희석을 제한하여 클로닝하고 추가적인 분석에 사용하였다.
항체 단백질의 단리: 모노클로날 항체를 1 내지 5％ 페탈클론 (Fetalclone, 미국 유타주 로간 소재 하이클론 (Hyclone))을 함유하는 RPMI-1640 배지를 사용하여 셀맥스 (Cellmax, 미국 캘리포니아주 라구나 힐스 소재 셀코 (Cellco)) 생반응기로부터 단리하였다. 모노클로날 항체를 사용설명서 (미국 메릴랜드주 가이더스버그 소재 KPL)에 따라 단백질 A-아가로스 컬럼 상의 크로마토그래피로 정제하였다.
LNCaP 세포막의 제조: LNCaP 세포를 플라스틱 접시에서 긁어내어 PBS로 철저히 세척하고, 10배 부피의 탈이온수에 재현탁하고, 다운스 (Dounce) 균질화기를 3회 가동하여 균질화시켰다. 막 파편을 45분 동안 15,000 ×g로 원심분리하여 단리하고, 펠렛을 PBS에 재현탁하였다. 막 펠렛의 단백질 농도를 피어스 (미국 일리노이주 록포드 소재) BCA 키트를 사용하여 측정하였다.
열 변성 실험: LNCaP 세포로부터 면역친화도 정제한 PSMA의 분취물 (PBS 중 40 ㎎/㎖)을 10분 동안 끓여서 열 변성시키고, 얼음 상에서 냉각시켰다. 이것과 열 변성시키지 않은 동일한 분취물을 PBS 중에 1:4로 희석하고, 50 ㎕를 맥시-소르프 (넌크) 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅한 후에, 모든 플레이트를 PBS 중의 5％ BSA로 1시간 동안 차단하고, PBS로 세척하고, 상기와 같이 표시된 1차 항체를 사용하여 표준 샌드위치 ELISA하였다.
웨스턴 블롯 분석: 분획물을 함유하는 PSMA의 SDS-PAGE에 이어서 웨스턴 블롯 분석을 실시하고 PVDF 막으로 옮겼다. 블롯을 5％ 무지방 우유를 함유하는 TBS 중에서 밤새 차단하고, TBS 중에 5 ㎕/㎖ 농도로 존재하는 정제 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯을 0.5％ Tween-20 (TBS-T)을 함유하는 TBS로 5회 세척하고, 블롯을 루미글로 (LumiGLO) 화학발광 기질 키트 (미국 메릴랜드주 가이더스버그 소재 KPL)를 사용하여 전개시키고, 엑스레이 필름에 노출시켜 가시화하였다.
면역침전 연구: LNCaP 세포에 1％ NP-40을 함유하는 PBS를 첨가하여 LNCaP 세포의 세제 용해물을 제조하고, 1시간 동안 인큐베이션하고, 원심분리하여 미립자 물질을 제거하였다. 용해물 1 ㎖ 당 무관한 인간 IgG1150 ㎍을 첨가하여 미리 맑게 하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 용해물 1 ㎖ 당 팩킹된 단백질 G-세파로스 비드 150 ㎕를 첨가하였다. 원심분리하여 비드를 제거한 후에, 상청액분획물을 사용하였다. 미리 맑게 한 용해물의 분취물 각 100 ㎕를 항체 단백질 5 ㎍과 혼합하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이 기간이 끝날 때쯤, 팩킹된 단백질 G-세파로스 비드 20 ㎕를 각 튜브에 첨가하고, 튜브들을 4 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 용해 완충액으로 철저히 세척한 후에, 래믈리 (Laemmli) 샘플 완충액 (바이오-래드 (Bio-Rad)) 50 ㎕를 각 샘플에 첨가하고, 튜브를 95 ℃에서 10분 동안 가열하였다. 튜브들을 2분 동안 원심분리하고 각 샘플 25 ㎕를 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하여 175 볼트에서 60분 동안 전기영동하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 전기영동한 샘플을 뮤린 항-PSMA 항체 4D8 (5 ㎍/㎖)를 사용하여 PVDF 막 상에 전기블로팅하고 상기와 같이 전개하였다.
유식세포측정: 조직 배양 플라스크로부터 LNCaP 및 PC-3 세포를 새로 수확하고, 단일한 세포 현탁액을 제조하였다. LNCaP 현탁액을 직접 1차 항체로 또는 PBS 중의 1％ 파라포름알데히드로 고정한 후에 염색하였다. 약 백만개의 세포를 0.5％ BSA 및 1차 항체 50 내지 200 ㎍/㎖를 함유하는 PBS에 재현탁하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포들을 0.1％ BSA, 0.01％ NaN3를 함유하는 PBS로 2회 세척하고, 1:100으로 희석한 FITC-접합된 염소-항-인간 IgG (미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재 잭슨 이뮤노리서치 (Jackson ImmunoResearch)) 100 ㎕ 중에 재현탁하고, 얼음 상에서 30분 동안 더 인큐베이션하였다. 세포들을 다시 2회 세척하고, 세척 완충액 0.5 ㎖ 중에 재현탁하고, 셀퀘스트 (CellQuest) 포착 소프트웨어로 FACSCalibur 세포측정기 (미국 캘리포니아주 산 호세 소재 벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson)) 상에서 형광 염색 분석하였다.
모노클로날 항체의 FITC 표지: 먼저 정제 모노클로날 항체를 0.3 M 탄산나트륨 완충액, pH 9.5에 대항하여 철저히 투석하였다. DMSO 1 ㎖ 중에 고체 FITC 1 ㎎을 용해시켜 스톡 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 용액을 제조하였다. 항체 단백질 1 ㎎ 당 FITC가 50 ㎍이 되도록 하는 양으로, 일정하게 혼합하면서 스톡 FITC를 적가하였다. 첨가한 후에, 용액을 실온의 암소에서 1 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. FITC-표지된 항체를 PBS 중에서 평형을 이룬 세파덱스 G-I0 컬럼 상에서 겔 여과하여 단리하였다.
4A3 및 7F12의 DOTA 표지: 4A3 및 7F12 항체 단백질 5 ㎎을 항체 단백질의 아미노기에 DOTA의 4개의 카르복실산 중 하나를 직접 커플링시켜 DOTA 표지하였다. DOTA (테트라아자시클로도데칸테트라아시드산)은 방사성핵종의 착물화에 사용될 수 있는 통상적인 킬레이트제이다. 먼저 PBS 약 1.5 ㎖ 중의 상기 단백질을 원심분리 농축기에서 Mr25,000 컷-오프로 1％ DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산), pH 5.0 5 ×4 ㎖를 사용하여 24시간에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 동일한 절차를 사용하여 항체 완충액을 0.1 M 인산 완충액, pH 7.0으로 변경하였다. 물 0.4 ㎖ 중에 DOTA 30 ㎎ (0.072 mmol)을 용해시켜 DOTA의 활성 에스테르를 제조하고, NaOH로 pH 7.3이 되도록 조정하였다. 이어서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 10 ㎎을 첨가하고, 혼합물을 얼음 상에서 1시간 동안 냉각시키고, 항체 용액에 첨가하고, 4 ℃에서 밤새 교반하였다. 0.3 M NH4Oac에 의한 세척 및 원심분리 농축을반복하여 생성된 DOTA-항체 접합체를 과량의 DOTA 및 다른 시약으로부터 분리하였다.
항체 저해 연구: 먼저 약 백만개의 LNCaP 세포를 PBS 중의 정제된 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, 16F9, 또는 무관한 인간 IgG1항체 200 ㎍/㎖로 얼음 상에서 1시간 동안 처리하였다. 세척한 후에, 세포들을 FITC 접합된 인간 또는 뮤린 항-PSMA 모노클로날 항체 50 ㎍/㎖와 함께 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후에, 세포들을 요오드화프로피듐 10 ㎍/㎖로 염색하고, 셀퀘스트 소프트웨어로 FACsCalibur 상에서 유식세포측정에 의해 분석하였다.
LNCaP 세포 종양을 보유하는 누드 마우스에서 125 I- 표지된 HuMAb 의 생체분포: 누드 마우스에 50％ 마트리겔 (Matrigel, 벡톤-디킨슨, 총 부피 150 ㎕) 중의 LNCaP 세포 2 ×106개를 피하 주사하였다. 종양의 직경이 약 0.5 cm이 되었을 때, 동물들의 꼬리 정맥을 통해 항체 100 ㎍ (125I를 5 내지 35 μCi 함유)을 정맥내 투여하여125I-표지된 항체로 생체내 표지하였다. 여러 시점 후에, 동물을 희생시키고 개별적인 정상 기관 및 조직 뿐만 아니라 종양 조직에 존재하는125I의 수준을 측정하였다.
사용설명서에 따라 요오도비드 (피어스)를 사용하여 항체 단백질 1 ㎎을125I 1 내지 1.5 mCi로 요오드화하였다.
125 I- 표지된 HuMAb 의 내재화: LNCaP 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 거의 합류시켰다. 이어서 배지를 제거하고, 웰을 PBS로 세척하여 미부착 세포를 제거하였다. 이어서, 세포를 신선한 배양 배지 총 부피 1.5 ㎖ 중에 10 ㎍/㎖의 농도로 존재하는125I-표지된 HuMAb 또는 이소형 매칭된 무관한 인간 IgG로 표지하고, 37 ℃ 인큐베이터에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이 기간이 끝날 때쯤 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 철저히 세척하여 비결합된 표지된 항체를 제거하고, 배양 배지 1.5 ㎖를 첨가하고, 플레이트를 37 ℃ 인큐베이터에 도로 넣고 원하는 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시작 후 0 (배양 배지를 첨가하고 즉시), 4, 18 및 28 시간째에 배양 배지를 제거하고, 원심분리하여 미부착 세포를 제거하였다. 상청액 분획물을 얼음 상에서 냉각시키고, 최종 TCA 농도가 10％가 되도록 100％ TCA를 첨가하여 TCA 침전시켰다. 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션한 후에, 분획물을 1000 ×g에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 제거하였다. TCA 가용 및 불용 분획물 중에 존재하는 방사능의 양은 감마 계수기로 측정하였다. TCA 침전을 위한 배지를 제거한 후에 웰에 존재하는 부착 세포들을 트립신을 사용하여 분리시키고 튜브에 넣어 0.1 N NaOH 1 ㎖로 세척하면서 계수하였다. 세포에 결합된 방사능도 또한 감마 계수기로 측정하였다. 시간에 따라 원래 세포에 결합되어 있던 방사능이 TCA 가용 분획물내에 내재화되고, 프로세싱되고, 분포되는 비율을 플롯팅하였다.
정제된 항체 단백질 0.5 ㎎을 상기와 같이125I 1 mCi로 요오드화하였다. 각항체의 표지는 0.4 내지 1.6 μCi/㎍ 항체 단백질이었다.
HuMAb 의 ADCC 및 CDC 스크리닝: LNCaP 세포를 표적 세포로 하여 4시간 동안51Cr 유리 분석하여 ADCC 및 CDC 시험을 실시하였다. 이펙터와 표적 세포의 비 (E:T 비)를 100:1로 하고 웰 당 2500 표적 세포를 넣은 3개의 96-웰 플레이트에서 분석을 실시하였다. 이펙터 세포는 하나의 수컷 및 하나의 암컷 공여자에게서 단리한 PBMC였다. CDC 분석을 위해, 최종 농도가 1:200인 신선한 인간 혈장을 보체 급원으로 사용하였다.
IHC 에 의한 HuMAb 의 조직 교차 반응성 스크리닝: 먼저 냉동절단 후 10분 동안 아세톤으로 처리하거나 또는 염색 직전에 10초 동안 10％ 중성-완충된 포르말린으로 처리하여 고정한 냉동 조직 절편 상에 고정된 농도의 정제된 비접합 인간 모노클로날 항체 (5 ㎍/㎖) 및 다양한 농도의 비오티닐화 염소-항-인간 IgG1 2차 항체를 사용하여 IHC 교차 반응성 스크리닝을 위한 조건을 최적화하였다. 이 조건에 기초하여, 최적화된 2차 항체 농도와 다양한 농도의 HuMAb 1차 항체로 제2의 시험을 실시하였다.
상기 결과에 기초하여, 냉동절단 후 10분 동안 아세톤 중에 둔 후에, 염색 직전에 10초 동안 10％ 중성-완충된 포르말린에 넣어 고정한 인간 냉동 조직 절편 상에서 조직 스크리닝을 실시하였다. 과량의 1.5 ㎎/㎖ 캐리어 IgG를 함유하는 5 ㎍/㎖ 농도의 1차 항체에 이어서 과량의 1.5 ㎎/㎖의 캐리어 IgG를 함유하는 7.5 ㎍/㎖ 농도의 비오티닐화 염소-항-인간 IgG 2차 항체를 사용하여 염색하였다. 상기 절편의 단백질 블록에는 열 응집된 토끼 IgG (1 ㎎/㎖), 5％ 정상 염소 혈청 및 1％ BSA가 포함되었다.
실시예 1: 항- PSMA 인간 항체의 제조를 위한 Cmu 표적화된 마우스의 생성
CMD 표적화 벡터의 제작: 플라스미드 pICEmu는 Balb/C 게놈 람다 파지 라이브러리로부터 수득되며, mu 유전자를 스패닝하는 뮤린 Ig 중쇄 좌위의 EcoRI/XhoI 단편을 함유한다 [Marcu et al. Cell 22:187, 1980]. 이 게놈 단편을 플라스미드 pICEMI9H의 XhoI/EcoRI 부위 [Marsh et al; Gene 32, 481-485, 1984]에 서브클로닝하였다. pICEmu에 포함되어 있는 중쇄 서열은 mu 인트론 인핸서의 3'에 근접하여 위치한 EcoRI 부위의 하류에서부터 mu 유전자의 마지막 막횡단 엑손의 대략 1 kb 하류에 위치한 XhoI 부위까지 연장되어 있으나, mu 전환 반복부 영역의 대부분은 대장균 (E. coli) 내에서의 계대배양에 의해 결실되었다.
표적화 벡터를 하기와 같이 제작하였다. pICEmu로부터 1.3 kb HindIII/SmaI 단편을 절단하여 HindIII/SmaI로 소화시킨 pBluescript (미국 캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 스타라타젠 (Stratagene) 제품)에 서브클로닝하였다. 이 pICEmu 단편은 Cmu1의 5'로부터 대략 1 kb에 위치한 HindIII 부위에서부터 Cmu1 내에 위치한 SmaI 부위까지 연장되어 있다. 이로써 생성된 플라스미드를 SmaI/SpeI로 소화시키고, pICEmu 내에서 Cmu1 3'내의 SmaI 부위에서부터 마지막 Cmu 엑손의 하류에 근접하여 위치한 XbaI 부위까지 연장되어 있는 대략 4 kb SmaI/XbaI 단편을 삽입하였다. 이로써 생성된 플라스미드 pTAR1을 SmaI 부위에서 선형화하고, neo 발현 카세트를 삽입하였다. 이 카세트는 마우스 포스포글리세레이트 키나제 (pgk) 프로모터(XbaI/TaqI 단편; [Adra et al. (1987) Gene 60:65-74])의 전사 제어를 받으며 pgk 폴리아데닐화 부위 (PvuII/HindIII 단편; [Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28:299-308])를 함유하는 neo 유전자로 구성되어 있다. 상기한 neo 카세트는 플라스미드 pKJ1 (문헌 [Tybulewicz et al. (1991) Cell 65:1153-1163]에 기재되어 있음)를 EcoRI/HindIII 단편으로서 절단하여 수득한 것이며, 이것을 EcoRI/HindIII로 소화시킨 pGEM-7Zf(+)에 서브클로닝하여 pGEM-7(KJ1)을 생성하였다. neo 카세트를 EcoRI/SalI 소화에 의해 pGEM-7(KJ1)로부터 절단하여 평활 말단으로 만들고, 플라스미드 pTAR1의 SmaI 부위에 게놈 Cmu 서열의 반대 방향으로 서브클로닝하였다. 문헌 [Mansour et al. (1988) Nature 336:348-352]에 기재된 바와 같이, 이로써 생성된 플라스미드를 NotI으로 선형화시키고 헤르페스 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 카세트를 삽입하여, 상동성 재조합된 ES 클론이 풍부해지도록 하였다. 문헌 [Tybulewicz et al. (1991) Cell 65:1153-1163]에 기재된 바와 같이, 이 카세트는 마우스 pgk 프로모터가 일괄하는 (bracket) tk 유전자 코딩 서열 및 폴리아데닐화 부위로 구성되어 있다. 이로써 생성된 CMD 표적화 벡터는 대략 총 5.3 kb의 중쇄 좌위 상동체를 함유하고, 제1 Cmu 엑손의 유일한 SmaI 부위 내에 neo 발현 카세트가 삽입된 돌연변이 mu 유전자를 생성하도록 고안된 것이다. 플라스미드 서열을 절단하는 PvuI을 사용하여 표적화 벡터를 선형화한 후에 ES 세포에 전기천공하였다.
표적화된 ES 세포의 생성 및 분석: 문헌 [Robertson, E.J. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E.J.Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 71-112]에 기재되어 있는 바와 본질적으로 동일한 방식으로, AB-1 ES 세포 [McMahon, A.P. and Bradley, A., (1990) Cell 62:1073-1085]를 유사분열 불활성인 SNL76/7 세포 공급자 층 (동일 문헌)에서 성장시켰다. 하스티 (Hasty) 등이 문헌 [Hasty, P.R. et al. (1991) Nature 350:243-246]에 기재한 방법에 따라, 상기 선형화된 CMD 표적화 벡터를 AB-1 세포에 전기천공하였다. 전기천공된 세포를 100 mm 디쉬에 1 ×106내지 2 ×106개 세포/디쉬의 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 후, 배지에 G418 (활성 성분 1 ㎖ 당 200 ㎍) 및 FIAU (5 ×10-7M)를 첨가하고, 8 내지 9일 동안 약물 내성 클론이 생성되도록 했다. 클론을 골라내어 트립신처리하고, 둘로 나누어 더욱 증식시켰다. 이어서, 각각의 클론으로부터 유도된 세포에서 절반은 동결시키고 나머지 절반은 벡터와 표적 서열 사이의 상동성 재조합에 대해 분석하였다.
DNA 분석은 써던 블롯 혼성화로 수행하였다. 라이드 (Laird) 등의 문헌 [Laird, P.W. et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4293]에 기재된 바와 같이, 상기 클론으로부터 DNA를 단리하였다. 단리된 게놈 DNA를 SpeI으로 소화시키고 mu 인트론 인핸서와 mu 전환 영역 사이의 서열에 혼성화하는 915 bp SacI 단편인 프로브 A로 프로빙했다 (도 1 참조). 프로브 A는 야생형 좌위로부터의 9.9 kb SpeI 단편을 검출하고, CMD 표적화 벡터와 상동성 재조합된 mu 좌위로부터 특징적인 7.6 kb 밴드를 검출한다 (neo 발현 카세트는 SpeI 부위를 함유함). 써던 블롯 분석으로 스크리닝한 1132 G418 및 FIAU 내성 클론 중 3개는 mu 좌위에서의 상동성 재조합을 지시하는 7.6 kb SpeI 밴드를 나타내었다. 벡터가 mu 유전자 내로 상동성 통합되었음을 입증하기 위해, 이들 3개의 클론을 효소 BglI, BstXI 및 EcoRI으로 추가 소화시켰다. 프로브 A로 혼성화하는 경우, 야생형 DNA의 써던 블롯을 BglI, BstXI 또는 EcoRI으로 소화시키면 각각 15.7 kb, 7.3 kb 및 12.5 kb 단편이 생성되지만, 표적화된 mu 대립유전자가 존재하면 각각 7.7 kb, 6.6 kb 및 14.3 kb 단편으로 나타난다. SpeI 소화에 의해 검출된 3개의 양성 클론 모두가 Cmu1 엑손 내로의 neo 카세트 삽입에 특징적이라고 예상되는 BglI, BstXI 및 EcoRI 제한 단편을 나타내었다.
돌연변이된 mu 유전자를 가지는 마우스의 생성: 브래들리 (Bradley)의 문헌 [Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E.J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113-151]에 기재된 바와 같이, 번호 264, 272 및 408로 표시한 표적화된 ES의 3가지 클론을 해동시켜서 C57BL/6J 배반포 (blastcyst)로 주입하였다. 주입한 배반포를 가임신 암컷의 자궁에 전달하여, 투입 ES 세포 및 숙주 배반포로부터 유도된 세포들이 혼합된 키메라 마우스를 생성시켰다. ES 세포가 키메라에 기여하는 정도는 흑색의 C57BL/6J 백그라운드 상에 ES 세포주로부터 유도된 아구티 (agouti) 코트가 착색된 양에 의해 가시적으로 평가할 수 있다. 클론 272 및 클론 408은 키메라를 낮은 비율(즉, 아구티 착색 비율이 낮음)로만 생성하였으나, 클론 264는 수컷 키메라를 높은 비율로 생성하였다. 이들 키메라를 C57BL/6J 암컷과 교배시켜 아구티 후손을 생성하였으며, 이는 ES 세포 게놈의 배선 전달에 대한 지표이다. 표적화된 mu 유전자에 대한스크리닝은 꼬리 생검으로 BglI 소화시킨 DNA의 써던 블롯 분석에 의해 수행하였다 (ES 세포 DNA 분석에 대해 상기한 바와 같음). 대략 50％의 아구티 후손은 15.7 kb 야생형 밴드 뿐만 아니라 7.7 kb의 혼성화 BglI 밴드까지 나타내었는데, 이는 표적화된 mu 유전자의 배선 전달을 입증하는 것이다.
mu 유전자의 기능적 불활성화에 대한 트랜스제닉 마우스의 분석: neo 카세트의 Cmu1 내로의 삽입이 Ig 중쇄 유전자를 불활성화시켰는지의 여부를 결정하기 위해, 클론 264 키메라를 JH 유전자 절편이 결실되어 중쇄 발현이 불활성화된 JHD 돌연변이 동형접합 마우스와 교배시켰다 [Chen et al, (1993) Immunol. 5:647-656]. 4 마리의 아구티 후손이 생성되었다. 이들 동물이 1개월령이 되었을 때 혈청을 채취하여 뮤린 IgM 존재에 대한 ELISA 분석을 수행하였다. 4 마리 후손 중 2 마리는 IgM이 완전히 결손된 것이었다 (표 1 참조). BglI 소화에 의한 꼬리 생검을 통한 DNA의 써던 블롯 분석과 프로브 A와의 혼성화 (도 1 참조) 및 StuI 소화와 475 bp EcoRI/StuI 단편과의 혼성화 (동일 문헌)에 의한 상기 4 마리 동물의 유전자형 분석은, 혈청 IgM을 발현하지 못하는 상기 동물들이 중쇄 좌위의 대립유전자 중 하나에서는 JHD 돌연변이가 일어났고 다른 하나의 대립유전자에서는 Cmu1 돌연변이가 일어난 동물임을 입증하였다. JHD 돌연변이에 대한 이형접합 마우스는 혈청 Ig를 야생형 수준으로 나타내었다. 이들 데이타는 Cmu1 돌연변이가 mu 유전자의 발현을 불활성시킴을 입증한다.
마우스 혈청 IgM(㎍/㎖) Ig H 쇄 유전자형
42 <0.002 CMD/JHD
43 196 +/JHD
44 <0.002 CMD/JHD
45 174 +/JHD
129 ×BL6 F1 153 +/+
JHD <0.002 JHD/JHD
표 1은 CMD 및 JHD 돌연변이가 둘다 일어난 마우스 (CMD/JHD), JHD 돌연변이에 대한 이형접합 마우스 (+/JHD), 야생형 (129Sv ×C57BL/6J) F1 마우스 (+/+) 및 JHD 돌연변이에 대한 동형접합인 B 세포 결핍 마우스 (JHD/JHD)에 대해 ELISA로 검출한 혈청 IgM 수준을 나타낸다.
실시예 2: 항- PSMA 인간 항체의 제조를 위한 HCO 12 트랜스제닉 마우스의 생성
HCO 12 인간 중쇄 트랜스진: pHC2의 80 kb 인서트 [Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6:579-591]와 pVx6의 25 kb 인서트를 공동 주입하여 HCO12 트랜스진을 생성하였다. 플라스미드 pVx6은 하기와 같이 제작하였다.
대략 2.5 kb의 5' 플랭킹 게놈 서열과 대략 5 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 함께 보유하는 배선 인간 VH 1-18 (DP-14) 유전자를 포함하는 8.5 kb HindIII/SalI DNA 단편을 플라스미드 벡터 pSP72 (미국 위스콘신주 메디슨 소재 프로메가 (Promega))에 서브클로닝하여 플라스미드 p343.7.16을 생성하였다. 대략 5 kb의 5' 플랭킹 게놈 서열과 대략 1 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 함께 보유하는 배선 인간 VH 5-51 (DP-73) 유전자를 포함하는 7 kb BamHI/HindIII DNA 단편을 pBR322 기재의 플라스미드 클로닝 벡터 pGP1f [Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Res.20:6287-6295]에 클로닝하여 플라스미드 p251f를 생성하였다. pGP1f로부터 유래한 새로운 클로닝 벡터인 pGP1k를 EcoRV/BamHI으로 소화시켜서, 대략 4 kb의 5' 플랭킹 게놈 서열과 대략 5 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 함께 보유하는 배선 인간 VH 3-23 (DP-47) 유전자를 포함하는 10 kb EcoRV/BamHI DNA 단편과 라이게이션시켰다. 이로써 생성된 플라스미드 pl12.2RR.7을 BamHI/SalI으로 소화시키고, p251f의 정제된 7 kb BamHI/SalI 인서트와 라이게이션시켰다. 이로써 생성된 플라스미드 pVx4를 XhoI으로 소화시키고, p343.7.16의 8.5 kb XhoI/SalI 인서트와 라이게이션시켰다.
다른 2개의 V 유전자와 동일한 방향의 VH 1-18 유전자를 보유하는 클론을 수득하였다. 이어서, 호간 (Hogan) 등의 문헌 [B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2ndedition, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY]에 기재된 바와 같이, pVx6로 명명한 상기 클론을 NotI으로 소화시키고, 정제된 26 kb 인서트를 (pHC2의 정제된 80 kb NotI 인서트와 함께 1:1 몰비로) 반나절이 된 (C57BL/6J ×DBA/2J)F2 배아의 전핵에 공동 주입하였다. 주사한 배아로부터 발생된 마우스로부터 Vx6 및 HC2 둘다의 서열을 포함하는 트랜스제닉 마우스의 3가지 독립 세포주를 수립하였다. 이들 세포주를 (HCO12)14881, (HCO12)15083 및 (HCO12)15087로 명명하였다. 이어서, 상기 3가지 세포주 각각을 실시예 1에 기재된 CMD 돌연변이, JKD 돌연변이 [Chen et al. 1993, EMBO J. 12:811-820] 및 (KCo5)9272 트랜스진 [Fishwild et al. 1996, NatureBiotechnology 14:845-851]을 함유하는 마우스와 교배시켰다. 이로써 생성된 마우스는 내인성 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 좌위의 파괴에 동형접합인 백그라운드의 인간 이뮤노글로빈 중쇄 및 카파 경쇄 트랜스진을 발현한다.
실시예 3: PSMA 에 대항하는 인간 모노클로날 항체 및 이중특이적 물질의 제조
항원: 항원 (노스웨스트 바이오테라퓨틱스 (Northwest Biotherapeutics))은 (1) 세포막 및 (2) LNCaP 세포 (Cat#CRL-1740; 미국 메릴랜드주 록빌 소재 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection))로부터 단리한 정제 단백질 (PSMA)의 2가지 형태로 제공되었다. 정제된 항원 (1.05 ㎎/㎖)으로 1회의 면역화 및 최종으로 꼬리 정맥 부스트를 실시하였다. 모노클로날 항체 7Ell.C5는 시토젠 인크 (Cytogen, Inc, 미국 뉴저지주 프린스턴 소재)에서 입수하였다.
가용성 PSMA 및 LNCaP 세포에서 얻은 막을 완전 또는 불완전 프로인트 (Freund) 아쥬반트 (CFA 및 IFA)와 혼합하였다. 마우스의 복강내에 준비된 항원 0.2 cc를 주사하였다. 최종적으로 멸균 PBS 중의 가용성 PSMA로 꼬리 정맥의 면역화를 실시하였다.
트랜스제닉 마우스: 마우스를 여과 케이지에서 사육하며, 양호한 건강 상태에서 면역화 날짜, 채혈 및 융합일에 대한 데이타를 평가하였다. (CMD)++; (HCo12) 15087+; (JKD)++; (KCo5) 9272+ 유전자형인 수컷 마우스 식별번호 제17018호로 하이브리도마 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9를 제조하였다. 괄호 내는 개별 트랜스진의 명칭이고, 이어서 무작위 삽입된 트랜스진의 선 번호를 표기하였다. 기호 ++ 및 +는 동종접합성 또는 반접합성을 가리킨다; 그러나, 마우스는 통상적으로 무작위 삽입된 인간 Ig 트랜스진에 대해 동종접합성 및 반접합성을 구분하지 못하는 PCR-기재 분석을 사용하여 스크리닝하기 때문에 마우스에게 주어진 + 명칭은 실질적으로 이 요소에 대하여 동종접합성을 의미한다.
면역화 절차: 면역화 일정을 표 2에 나타내었다. HCo7 및 HCol2 유전자형인 한 코호트의 마우스 10 마리에 포함된 마우스 제17018호를 제112일에 융합시켰다. 면역화시킬 때 모두 복강내에 주사하였다. 융합 3일전 및 2일전에 IV 부스트를 실시하였다.
실험 날짜 면역화: 아쥬반트 , 항원 채혈 및 역가 *
제1일 CFA, 막
제13일 IFA, PSMA (~ 50 ㎍)
제27일 IFA, 막
제38일 역가
제40일 IFA, PSMA (~ 50 ㎍)
제48일 역가
제55일 IFA, PSMA (50 ㎍)
제62일 역가
제70일 IFA, 막
제80일 역가
제84일 IFA, 막
제94일 역가
융합 3일전 및 2일전에 IV 부스트. 제112일에 융합 실시
*역가는 표 3 참조.
하이브리도마의 제조: P3 X63 ag8.653 골수종 세포주 (ATCC CRL 1580, 제품번호 F-15183)를 융합에 사용하였다. ATCC에서 얻은 바이알을 해동시키고 배양하여 증식시켰다. 이러한 증식물로부터 접종용 스톡 바이알을 제조하여 동결시켰다. 세포를 3 내지 6개월 동안 계속 배양하고, 1주에 2회씩 계대배양하였다. P388D1 (ATCC TIB-63 FL)을 200 ㎖에 현탁하여 모두 사용하였다. 상등액을 원심분리하고여과하여 하이브리도마에 배지 첨가물로서 사용하였다. 상기 세포주를 3 내지 6개월 동안 계대배양한 후에 새로운 바이알을 해동시켰다.
하이 글루코스 DMEM (High Glucose DMEM): 10％ FBS을 함유하는 하이 글루코스 DMEM (메디아텍, 셀그로 제1001233호) 및 페니실린-스트렙토마이신 (깁코 (Gibco) 제11K1763호)을 골수종 세포 및 P388D1 세포 배양에 사용하였다. 하이브리도마 성장 배지에 추가의 배지 보충물을 첨가하였다.
마우스 제17018호에서 얻은 비장은 크기가 정상이었고 1.78 ×108개의 생육가능한 세포를 얻었다. 비장세포를 융합시켰다.
융합 후에 인간 IgG,κ항체에 대한 초기 ELISA 스크리닝을 7 내지 10일 동안 실시하였다. 이어서, 인간 IgG,κ양성 웰을 가용성 PSMA 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 스크리닝하였다. 이어서, 항체 양성 하이브리도마를 24 웰 플레이트에 옮긴 후에, 조직 배양 플라스크에 옮겼다. 모노클로날성을 보증하기 위해 희석을 제한하여 PSMA 특이적 하이브리도마를 서브클로닝하였다. 항원 양성 하이브리도마를 여러 발달 단계에서 DMEM, 50％ FBS와 10％ DMSO (시그마, D2650) 중에 냉동시켜 보존하였다.
마우스 제17018호의 역가를 하기 표에 나타냈다. 이 역가들은 Hu-항원 특이적-γ였다. 반복적인 면역화 후 항원에 대한 반응은 강건한 반응 수준을 나타냈고, 융합을 위해 마우스를 준비하였다.
날짜 역가
제38일 100
제48일 50
제62일 50
제80일 1600
제94일 3200
융합에 의해 38Hu-γ,κ 하이브리도마가 생성되었고 항원에 대해 재스크리닝하였다. 항원에 대한 재스크리닝 (ELISA 기재)에 이어서, 5개의 항원 특이적 하이브리도마를 동정하였다. 이들을 항원 상에서 재시험하고, 모든 5가지 클론이 표적 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9에 양성임을 확인하였다. 이 5가지 하이브리도마의 상청액을 추가로 평가하였다. 이 5가지 클론에서 얻은 항체는 LNCaP 세포에서 발현된 천연 형태의 PSMA와 결합하였다. 5가지 항체 모두 γ1,κ이소형이었다.
14A8로 지칭되는, 인간 항-CD89 항체 14A8 또는 14A8 항체의 서브클론으로부터의 Fab'2단편, 및 인간 항-PSMA 항체 8C12를 표준 가교 절차를 사용한 황 결합으로 화학 접합시켜 14A8×8C12라고 지칭되는 이중특이적 분자를 제조하였다 (도 6).
실시예 4: 인간 항- PSMA 항체의 결합 특성
고상 ELISA 연구: 전장 PSMA, 및 PSMA 단백질의 일부를 함유하는 세균 발현된 융합 단백질에 대한 항-PSMA 특이적 항체의 반응성을 비교하여 (고상 ELISA) 항-PSMA 특이적 항체의 결합 특성을 연구하였다. HuMAb 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9는 정제된 PSMA와는 반응하였지만 PSMA 서열의 일부를 함유하는 융합 단백질에는 반응하지 않았다 (결과는 나타내지 않음). 이와 대조적으로, HuMAb 11C10은 전장 PSMA 및 PSMA 아미노산 서열 1 내지 173을 함유하는 융합 단백질 둘다에 강하게 반응하였다 (도 1). 또한 11C10 항체는 아미노산 서열 134 내지 437 PSMA 단편에대해 더 낮은 수준의 결합을 나타냈다.
또한, 인간 항-PSMA 특이적 항체의 결합 특성을 LNCaP 및 PC3 세포 둘다에서 유도된 세포막 분획물을 사용한 고상 ELISA로 연구하였다. 막 분획물을 96-웰 플레이트에 순서대로 희석하고 공기 건조시켰다. 플레이트를 5％ BSA로 차단하고, PBS 중의 항체 5 ㎍/㎖로 처리하고, 한 시간 후에 표준 ELISA 절차를 사용하여 검출하였다.
도 2에 나타낸 HuMAb 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9에 대한 결과는 항원 농도 범위에 걸친 LNCaP 세포막에 대한 높은 특이성을 입증하는 것이다. 상기 배경에서 PC3 세포막에 대한 항체 결합이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. 이중특이적 분자 14A8×8C12에 대해서도 또한 유사한 분석을 사용하여 PSMA-발현 LNCaP 세포 및 CD89-발현 U937 세포에 대한 결합력을 시험하였다. 이중특이적 분자는 투여량-의존적으로 LNCaP 및 U937 세포 둘다에 결합하였다.
천연 PSMA 및 세균 발현 PSMA 융합 단백질 단편에 대한 ELISA 결과는 11C10을 제외한 모든 HuMAb이 천연 입체구조로 존재할 때는 PSMA에 특이적임을 나타낸다. 이러한 관찰을 확인하기 위해, 천연 및 열 변성 PSMA에 대한 항체의 결합을 시험하여 결합 특이성에 대한 단백질 입체구조의 중요성을 측정하였다. 도 3에는 천연 및 열 변성 PSMA에 대한 고상 ELISA의 결과를 나타냈다. 단백질 N-말단으로부터의 최초 6개의 아미노산으로 구성된 에피토프에 특이적인 뮤린 항-PSMA 모노클로날 항체 7E11을 양성 대조군으로 사용하였다. 이 결과는 열 변성이 7E11의 결합에 영향을 주지 않으며, 선형 서열 에피토프를 인식한다는 것과 일치함을 나타냈다. 이 결과와 대조적으로, 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9는 모두 천연 정제 PSMA에 강하게 결합하였다. 그러나, PSMA를 열 변성시키자 항체가 결합하지 않았으므로 항체 결합을 위해서 천연 단백질 입체구조가 요구됨을 나타냈다. 이 결과와 일치하게, 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9로는 웨스턴 블롯 분석에서 PSMA를 검출할 수 없었다 (결과는 나타내지 않음).
따라서, HuMAb 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9는 선형 아미노산 서열 에피토프를 인식하지 않고, 대신 단백질 입체구조 에피토프, 즉, PSMA 분자의 입체적 폴딩에 의해 선형 서열에서는 상이한 위치에 있던 아미노산이 3차원 공간에서는 근접한 위치에 모임으로써 발생하는 천연 단백질 에피토프에 결합하였다. 이러한 입체구조 에피토프는 세포막의 바깥쪽 면에 분포되어 있다.
LNCaP 세포로부터의 PSMA 의 면역침전: 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9의 결합 특이성을 LNCaP 세포의 1％ NP-40 세제 용해물에서 유도된 단백질을 면역침전시켜 연구하였다. 용해물을 항체로 처리한 후에, 단백질 G-세파로스 비드를 첨가하였다. 비드를 철저히 세척하고, 결합된 면역 복합체를 SDS 겔 전기영동하고, 뮤린 선형 PSMA 서열 에피토프 특이적 항체 4D8로 웨스턴 블로팅하였다. 그 결과를 도 4에 나타냈다. 제1열은 LNCaP 세포 용해물에 존재하는 PSMA 및 PSM' (N-말단으로부터 최초 57 아미노산이 결실된 별법의 스플라이싱 변체)의 웨스턴 블롯 반응성을 나타낸다. 제2열은 이소형 매칭된 (IgG1) 무관한 인간 항체와의 면역침전으로 얻은 결과를 나타낸다. 제3열 내지 제7열은 각각 항체 4A3, 7F12, 8A11,8C12 및 16F9로 면역침전시킨 결과를 나타낸다. 각각의 경우, PSMA 및 PSM' 둘다에 상응하는 진한 밴드가 관찰된 것은 이 항체들이 단백질의 세포외 도메인내에 존재하는 단백질 에피토프에 결합함을 나타낸다.
생 LNCaP 세포 상에서 발현된 PSMA 에 대한 HuMAb 의 결합: 무관한 인간 IgG1항체를 대조군으로 사용하는 유식세포측정법으로 생 및 비-생 (고정된) LNCaP 세포에 대한 항체 결합을 연구하였다. 생 세포는 요오드화프로피듐 음성 세포 집단이다. 고정된 세포들은 1차 항체 처리 전에 PBS 중의 1％ 파라포름알데히드로 처리하였다. 생 및 고정된 LNCaP 세포 둘다에서 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9의 강한 결합이 관찰되었다. PC3 세포에서, 또는 LNCaP 세포에 이소형 매칭된 무관한 인간 항체를 사용했을 때는 음성 염색이 관찰되었다.
비교하자면, 동일한 생 세포 및 고정된 세포 및 무관한 뮤린 항체 대조군 시료를 사용하여 시험한 뮤린 선형 에피토프-특이적 항체의 항체 결합 결과는 생 세포에 대해 유의하게 낮은 결합을 보였다. 고정된 세포에 대한 결합은 더 높았으나, 선형 에피토프 항체는 모든 조건에서 무관한 인간 IgG1 항체를 대조군으로 사용하여 발견한 입체구조 HuMAb에서 관찰된 결합에 미치지 못했다. PSMA 음성 PC3 세포를 사용한 실험에서는 뮤린 및 인간 입체구조 또는 선형 에피토프 항체의 결합이 둘다 검출되지 않았다 (결과는 나타내지 않음).
따라서, HuMAb는 생 LNCaP 세포에 강한 항체 결합을 나타내고, 뮤린 입체구조 항체 3C6에 의해 결합된 것과 관련된 에피토프에 결합한다.
항체 결합 경쟁에 대한 FACS 분석: 각각의 항체가 PSMA 상의 유사한 에피토프에 결합하는지 또는 상이한 에피토프에 결합하는지를 밝히기 위해 항체 결합 경쟁 실험을 실시하였다. 이 실험에서는, 먼저 LNCaP 세포를 무관한 인간 IgG1또는 또는 PSMA-특이적 HuMAb로 처리하고, 철저히 세척하고, FITC-표지된 개별 HuMAb로 표지한 후에 유식세포측정으로 분석하였다. 비표지된 HuMAb가 FITC-표지된 HuMAb의 결합을 차단하는 능력을 시험하였다. 무관한 인간 IgG1으로 미리 처리한 세포에서는 각각의 경우 FITC-표지된 항체가 강하게 결합하는 것이 발견되었다. 이와 대조적으로, 항-PSMA 특이적 HuMAb로 미리 처리하면, 각각의 경우에 FITC-표지된 항체의 결합이 실질적으로 저해되었다. 이 데이타를 종합해 볼 때, 7F12 및 16F9와 다른 HuMAb의 경쟁적 결합 거동이 가장 유사하였다. 상이한 항체 짝에서는 결합 저해 정도에 미미한 차이가 있었다. 예를 들어, 8C12는 4A3, 8A11 및 8C12의 결합을 효과적으로 저해했지만 7F12에는 효과가 훨씬 적었다. 이 항체들은 미미한 차이는 있지만 전체적으로 근접하게 분포된 입체구조 에피토프를 인식하였다.
뮤린 PSMA 입체구조 항체와 HuMAb 의 결합 경쟁: 1G9, 3C6 및 4D4로 명명된 뮤린 PSMA-특이적 항체는 또한 단백질 입체구조 에피토프를 표적화하도록 개발되었다. 유식세포측정법으로 측정하는 항체 경쟁 연구를 항체 1G9, 3C6 및 4D4에 대해 실시하여 HuMAb가 뮤린 항체와 공유하는 에피토프를 인식하는지 측정하였다. FITC-표지된 1G9, 3C6 및 4D4의 결합에 대한 비표지 HuMAb의 차단능을 시험하였다. LNCaP 세포를 HuMAb로 미리 처리한 후에, FITC-뮤린 4D4 및 1G9로 표지한 결과, 거의 또는 전혀 저해가 일어나지 않는 유사한 결과를 나타냈다. 이와 대조적으로, HuMAb 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9에 의해서는 FITC-3C6의 유의한 저해가 관찰되어 각각이 3C6에 의해 인식되는 것과 유사한 또는 근접 분포한 에피토프에 결합됨을 나타냈다.
LNCaP 세포 상에서 PSMA에 대한 입체구조 HuMAb의 결합 친화도: PSMA HuMAb는 PSMA의 천연 입체구조에 매우 민감하다. 정제 PSMA를 사용하여 친화도 상수를 측정하려는 다수의 실험들이 신뢰할만한 또는 재현가능한 결과를 제공하는데 실패하였다. 생 LNCaP 세포에서 발현되는 천연 PSMA로부터 얼마간의 친화도 결합 정보를 수득하기 위해 실험을 실시하였다. 천연 PSMA에 대한 각 항체의 결합 친화도를 시험하기 위해, 고정된 수의 LNCaP 세포 (1 ×106) 및 과량의 FITC-표지된 2차 항체에 대해 1차 항체의 농도를 변화시키는 유식세포측정법을 사용하여 분석하였다. 표 4의 데이타는 세포 표지 강도에서 ½최대 이동에 필요한 항체 농도로서 표현한 결과를 나타낸다. 이 결과는 항체 4A3, 7F12 및 16F9에서 최고 결합 친화도가 나타남을 입증하는 것이다. 고 친화도 항체에 비해 항체 8C12의 결합 친화도는 약 ⅓이고, 이어서 항체 8A11의 결합 친화도는 약 1/20이었다.
항체 ½최대 이동에 필요한 항체 농도 (μ/㎖)
7F12 7
4A3 9
16F9 10
8C12 28
8A11 195
실시예 5: 인간 항- PSMA 항체 및 이중특이적 물질의 ADCC 및 CDC 활성
I.인간 항- PSMA 항체의 항체 의존성 세포 매개 세포독성 ( ADCC ) 활성: 항-PSMA HuMAb가 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 매개하는 능력을 상기 실험의 실시예에 기재된 각각의 입체구조 항체에 대하여 두 공여자로부터 얻은 PBMC를 사용하여 시험하였다. 도 5A 및 B에 나타낸 결과는 각각의 HuMAb에 대해 강한 ADCC를 나타냈다. 각각의 HuMAb는 유사한 역가를 가졌고, 양성 대조군인 헤르셉틴 (Herceptin)에 대해 유사한 반응성을 가졌다 (도 5B). 모든 HuMAb에서 CDC 활성이 관찰되지 않았다 (데이타는 나타내지 않음).
II . 인간 항- PSMA 이중특이적 항체의 항체 의존성 세포 매개 세포독성 ( ADCC ) 활성: 이중특이적 분자 14A8×8C12 (도 6 참조) 및 모노클로날 항체 8C12를 표지된 PSMA-발현 종양 세포의 다형핵 세포-매개성 ADCC 사멸에 대해 시험하였다.
특히, 건강한 공여자로부터 전혈 뿐 아니라 단핵 세포 (단핵구 및 호중구)를 단리하여 이중특이적 분자 14A8×8C12의 존재하에서51Cr 표지된 PSMA 발현 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다. 약 4시간 후에, 웰에서 배양 상청액을 수확하고 감마 계수기로51Cr의 유리를 측정하였다. 하기 공식에 따라 ％특이적 용해를 측정하였다: (실험 CPM - 표적 유출 CPM)/(세제 용해 CPM - 표적 유출 CPM)×100％. 도 7A, 8A 및 9A에 나타낸 결과는, 대조군 항체와 비교했을 때, 14A8×8C12가 단핵구 및 호중구 및 전혈 각각에 의한 투여량 의존성 종양 세포 용해를 매개함을 입증하는 것이다.
또한, 단핵 세포 및 전혈을 이중특이적 분자 14A8×8C12 또는 모노클로날 항체 8C12의 존재하에서51Cr 표지된 LNCaP 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다 (도 7B, 7C, 8B 및 9B). LNCaP 세포를 37 ℃에서 1시간 동안 (5％ CO2)51Cr 100 μCi로 표지한 후에 단핵 세포 및 전혈, 및 다양한 농도의 이중특이적 및 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션하였다. 16시간 동안 인큐베이션한 후에, 상청액을 수확하고, 상기와 같이 방사능을 분석하였다.
단핵구 유도성 ADCC: 도 7A에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14A8×8C12는 투여량 의존적인 방식으로 단핵구에 의한 PSMA-발현 종양세포의 세포 사멸을 매개하였다. 14A8 Fab'250 ㎍/㎖의 첨가에 의해 이중특이적 분자 14A8×8C12 1 ㎍/㎖에 의한 종양 세포의 ADCC가 완전히 차단된 것은 표적 세포의 사멸이 이펙터 세포 상의 CD89에 의해 배타적으로 매개됨을 입증하는 것이다. 도 7B에 나타냈듯이, 이중특이적 분자 14A8×8C12 및 모노클로날 항체 8C12도 또한 LNCaP 종양 세포의 단핵구에 의한 투여량 의존성 용해를 매개하였다. 또한, 과량의 14A8 F(ab)'2를 첨가했을 때 H22 F(ab)'2(인간화 항-FcγRI)에 비해 이중특이적 분자 14A8×8C12에 의한 종양 세포의 ADCC가 완전히 저해된 것은 표적 세포 사멸이 CD89를 통해 매개됨을 나타내는 것이다 (도 7C 참조).
호중구 유도성 ADCC: 도 8A에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14A8 ×8C12는 투여량 의존적인 방식으로 호중구에 의한 PSMA-발현 종양세포의 세포 사멸을 매개하였다. 14A8 Fab'225 ㎍/㎖의 첨가에 의해 이중특이적 분자에 의한 종양 세포의 ADCC가 유의하게 차단된 것은 표적 세포의 사멸이 이펙터 세포에 대한 CD89의 결합에 의해 특이적으로 매개됨을 입증하는 것이다. 도 8B에 나타냈듯이, 이중특이적 분자 14A8×8C12는 또한 LNCaP 종양 세포의 호중구에 의한 투여량 의존성 용해를 매개하였다. 과량의 14A8 F(ab)'2를 첨가했을 때 H22 F(ab)2(인간화 항-FcγRI)에 비해 14A8×8C12에 의한 종양 세포의 ADCC가 완전히 저해된 것은 표적 세포 사멸이 CD89를 통해 매개됨을 나타내는 것이다.
전혈 유도성 ADCC: 도 9A에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14A8 ×8C12는 투여량 의존적인 방식으로 전혈에 의한 PSMA-발현 종양세포의 세포 사멸을 매개하였다. 14A8 Fab'225 ㎍/㎖의 첨가에 의해 이중특이적 분자에 의한 종양 세포의 ADCC가 완전히 차단된 것은 다시 표적 세포의 사멸이 이펙터 세포에 대한 CD89의 결합에 의해 특이적으로 매개됨을 입증하는 것이다. 유사하게, 도 9B에 나타냈듯이, 이중특이적 분자 14A8×8C12는 또한 LNCaP 종양 세포의 전혈에 의한 투여량 의존성 용해를 매개하였다. 과량의 14A8 F(ab)'2를 첨가했을 때 H22 F(ab)'2(인간화 항-FcγRI)에 비해 분자 14A8×8C12에 의한 종양 세포의 ADCC가 완전히 저해된 것은 표적 세포 사멸이 CD89를 통해 매개됨을 나타내는 것이다.
III. 인간 항- PSMA 항체 및 이중특이적 항체는 인간 이펙터 세포의 존재하에서 PSMA-발현 종양 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개한다: 이중특이적 분자 14A8×8C12 및 모노클로날 항체 8C12를, 표지된 PSMA-발현 종양 세포 (LNCaP 세포) 단독의 식세포작용을 매개하는 능력, 및 대조군으로서 과량의 14A8 (인간 항-FcαR) Fab'2항체 또는 과량의 H22 (인간화 항--FcγRI) Fab'2항체의 존재하에서 상기 식세포작용을 매개하는 능력에 대해 시험하였다.
간략히, 단핵구-유도 대식세포 (MDM)에 의한 LNCaP 세포의 이중특이적 물질-매개성 식세포작용을 문헌 [Munn et al. (1990) J. Exp. Med. 172: 231-237]에 기재된 방법을 변형하여 조사하였다. 정상 성인 소스 류코팩스 (ABI)로부터 정제한 단핵구를 24-웰 플레이트 (1 ×106/㎖)내의 10％ FBS 및 M-CSF 10 ng/㎖로 보충된 대식세포 무-혈청 배지 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재 깁코) 중에서 7 내지 12일 동안 분화시켰다. LNCaP 세포를 친유성 적색 형광 염료인 PKH 26 (미국 미주리주 세인트루이스 소재 시그마)로 표지하였다. 표지된 LNCaP 세포를 이중특이적 항체 (또는 대조군 항체)의 부재 또는 존재하에서 MDM을 함유하는 웰에 첨가하고, 37 ℃에서 5 내지 24 시간 동안 인큐베이션하였다 (5％ CO2). MDM 및 비-식세포작용된 LNCaP 세포를 트립신으로 회수하고, FITC-표지된 항-CD33 mAb(251) 및 항-CD14 mAb (AML-2-23)로 얼음 상에서 (4 ℃) 1시간 동안 염색하였다. 세포를 세척하고, FACScan을 사용하여 2색 형광을 분석하였다. ％식세포작용을 이중-양성 표적 세포 (MDM에 의해 소화됨)의 수를 총 표적 세포수로 나누고 100％를 곱하여 계산하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14A8×8C12는 투여량 의존적인 방식으로 점점 증가되는 종양 세포에 특이적인 식세포작용을 매개하였다. 14A8Fab'2의 첨가에 의해 이중특이적 분자에 의한 종양 세포의 식세포작용이 유의하게 차단된 것은, 다시 표적화된 식세포작용이 이펙터 세포에 대한 CD89의 결합에 의해 특이적으로 매개되었음을 입증하는 것이다. 유사하게, 도 11에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14A8×8C12 및 모노클로날 항체 8C12는 또한 투여량 의존적인 방식으로 LNCaP 세포의 식세포작용을 매개하였다. 도 12는 과량의 14A8 F(ab)'2를 첨가했을 때 H22 F(ab)'2(인간화 항-FcγRI)에 비해 LNCaP 종양 세포의 14A8×8C12 매개성 식세포작용이 저해되었으므로, LNCaP 종양 세포의 14A8×8C12 매개성 식세포작용이 CD89를 통해 매개됨을 나타내는 것이다 (삽입된 도 12 참조).
상기 실시예들은 PSMA에 고 친화도로 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체 및 이중특이적 물질의 생성을 예시한다. 이 항체 및 이중특이적 물질들은 선형 아미노산 서열에 의해 정의되는 에피토프보다는, 분자의 세포외 도메인에 존재하는 천연 입체구조 단백질 에피토프를 인식한다. 추가로, 인간 항-PSMA 항체 및 그의 이중특이적 분자는 이펙터 세포의 존재하에서 높은 수준의 PSMA를 발현하는 인간 종양 세포에 대항한 세포 사멸 및 식세포작용을 매개한다.
실시예 6: 누드 마우스에서 LNCaP 세포 종양에 대한 125 I- 표지된 인간 항- PSMA 항체의 생체분포
LNCaP 세포 종양을 갖는 누드 마우스에서125I-표지된 HuMAb의 생체분포를 하기 정상 및 종양 조직으로의 표지된 항체의 시간-의존성 섭취에 의해 시험하였다.2종의 HuMAb인 4A3 및 7F12에 대해 결과를 얻었다. 초기에는 결합 친화도 연구 및 충분한 항체 단백질의 입수가능성에 기초하여 항체 7F12를 사용하였다. 그러나, 이어진 실험은 7F12가 요오드화에 의해 실질적으로 항원에 대한 결합력을 상실함을 나타냈다. 따라서, 유용한 데이타는 4A3에서만 얻어졌다. 도 13에 나타낸 4A3에 대한 결과는 표지된 항체가 초기에 혈액 및 고도로 혈관이 발달된 조직에서 현저함을 나타냈다. 이것은 종양 섭취가 일어남에 따라 감소하고 정상 조직에 비해 종양 표지는 24시간 후에 최대가 되었다 (정상 조직에 비해 2배 이상이 표지됨). 따라서, 종양 조직에 대한 유의한 생체분포가 일어난다. 섭취 후 시간에 따른 종양 표지의 양은, 부분적으로는, 순환하는 항체의 감소된 수준, 및 결합된 항체의 항체 내재화와 그로 인한 표지된 항체 단백질 단편의 세포로부터의 유리의 함수일 수 있다.
실시예 7: LNCaP 세포에 의한 125 I- 표지된 인간 항- PSMA 항체의 내재화 분석
125I-표지된 HuMAb 단백질의 내재화를, TCA 가용성125I 계수의 배양 상청액으로의 시간-의존성 유리 분석에 의해 모니터링하였다. 요오드화 항체로 표면이 표지된 LNCaP 세포를 37 ℃에서 인큐베이션하고, 배양 상청액을 제거하고, TCA를 침전시키고, 상청액 분획물 중에 존재하는125I의 양을 도 14에 나타낸 시간에 측정하였다. 결과는 요오드화 항체 4A3, 16F9 및 8A11이 제0시에 LNCaP 세포를 유효하게 표지했으며, 효율적으로 세포내에 내재화되고, 분해되고, 단백질 단편이 배양 상청액내로 유리되었음을 나타냈다. 각각의 항체에서 18시간 동안 인큐베이션한 후에TCA 가용성 분획물 중에서 원래 결합된 항체의 약 50％를 회수하였다.
요오드화 HuMAb 7F12 및 8C12에 대해 상이한 세포 결합 및 내재화 결과를 얻었다. 특히, 요오드화 7F12 및 8C12 항체를 사용했을 때 전체 LNCaP 세포 표지가 유의하게 낮은 것은 요오드화가 표지된 항체의 항원 결합력에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 이 가설을 시험하기 위해, 고정된 천연 정제 LNCaP 세포 PSMA 및 요오드화 HuMAb를 사용하여 고상 결합 분석을 실시하였다. 도 15에 나타낸 결과는 양성 대조군인 요오드화 4A3 항체와 PSMA의 결합을 확인하는 것이며, 또한 요오드화에 의해 7F12 및 8C12의 항원 결합력이 둘다 손실되었음을 나타낸다. 따라서, 항체 7F12 및 8C12의 내재화 속도는125I-표지된 7F12 및 8C12 항체를 사용하여 평가할 수 없다.
실시예 8: HuMAb 4A3 및 7F12와 PSMA 의 결합에 대한 DOTA 표지의 효과
항체들을 DOTA-표지하고 항체와 항원의 결합에 대한 표지의 효과를 ELISA에 의해 시험하였다. DOTA (테트라아자시클로도데칸테트라아시드산)은 방사성핵종의 착물화에 사용되는 통상적인 킬레이트제이다. 도 16의 결과는 DOTA-표지된 항체가 높은 항원 결합력을 유지하므로 이 항체들이 방사성금속 착화합물의 형성에 유용함을 나타낸다.
실시예 9: 면역조직화학에 의한 정상 및 암성 인간 조직에 대한 인간 항- PSMA 항체 결합의 조직 반응성
PSMA에 존재하는 입체구조 에피토프에 특이적인 5종의 HuMAb의 결합의 면역조직화학적 분석에 의해 정상 및 암성 인간 조직의 냉동 절편에서 교차 반응성을 스크리닝하였다. 각각의 조직형의 단일 시료로부터의 결과는 전립선외 암 또는 정상 조직의 전립선 상피 및 종양 혈관 내피에 대한 강한 결합을 나타냈다. 전립선암내에서 혈관 내피의 염색은 관찰되지 않았다. 비-신생물성 조직으로부터의 선 상피의 다양한 반응성, 뇌 조직에서의 잠재적인 교차 반응성, 및 공장의 림프구 및 간의 쿱퍼 (Kuppfer) 세포의 염색을 포함하는 보다 약한 다른 반응성이 관찰되었다. 이러한 "정상" 조직이 동일한 공여자로부터 수득되었다면 종양 인접 부위 또는 부근에서의 강한 종양 혈관 염색을 보인 비-전립선 염색 결과에 관해서는 의문점이 있다. 림프구의 염색은 1차 종양으로부터의 항원 섭취로 인한 것일 수 있다. 다른 조직 및 요소들은 이 항체들에 대해 음성이었다. 시험된 5종의 HuMAb 사이에서 IHC를 통한 조직 반응성에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 10: 결합 친화도
LNCaP 세포를 넣은 일련의 튜브에 HuMAb를 희석하고 유식세포측정법을 사용하여 항-PSMA HuMAb의 결합 친화도를 측정하였다. 결합된 항체의 양을 포화량으로 존재하는 FITC-표지된 2차 항체를 사용하여 검출하였다. ½최대 이동 (포화 HuMAb와 함께 나타남)에 필요한 항체 단백질의 양으로서 분석한 데이타는 하기와 같다.
항체 ½최대 이동에 필요한 항체 ( μ /㎖)
7F12 7
4A3 9
16F9 10
8C12 28
8A11 195
HuMAb 4A3 및 7F12에 대한 추가적인 친화도 연구는 방사능표지된 항체 (111In-DOTA-표지된 항체) 및 고정된 수의 LNCaP 세포에 대한 결합을 이용하였다. 상기에서 얻은 항체 결합 데이타로 스캣차드 (Scatchard) 분석을 실시하였다. 항체 4A3 및 7F12에 대한 결과는 둘다 KD= 0.5 ±0.1 nM 또는 10-10M의 유사한 친화도 상수를 나타냈다.
실시예 11: V 영역의 클로닝
폴리A+mRNA 및 최초 가닥 cDNA를 mRNA 단리 및 cDNA 합성 키트 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재 인비트로젠 (Invitrogen))를 이용하여 항-PSMA 하이브리도마로부터 제조하였다. 4A3, 7F12 및 8C12 V 영역은 인간 VH및 VL(또는 VK) 신호 서열에 상응하는 5' 프라이머의 패널을 이용하여 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)에 의해 증폭하였다. 8A11 및 16F9 V 영역은 프레임워크 1의 성숙한 V 영역 서열의 5' 말단에 결합하는 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 3' VH및 VKPCR 프라이머는 각각 하기 서열을 함유하였다:(서열 57) 및(서열 58). 잠재적으로 PCR에 의해 서열 내에 도입될 수 있는 변화를 모니터링하기 위해 PCR, 클로닝 및 시퀀싱을 이중으로 실시하였다.
결론
상기 실시예들은 인간 PSMA 상의 입체구조 에피토프에 특이적인 5종의 온전한 인간 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 이 항체들을 함유하는 이중특이적 치료제의 제조를 예시한 것이다. 5종의 항체는 모두 천연의, 변성되지 않은 PSMA에 대해 높은 항원 특이성 및 반응성을 가졌다. 항체들은 효율적으로 PSMA 발현 세포내로 내재화되고, 강한 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 활성을 갖고, 동물 모델에서 PSMA 발현 종양에 생체분포했고, 인간 조직의 면역-조직화학적 연구에서 유사한 활성을 나타냈으므로, 인간의 치료에서 치료 및 진단하는데 있어서 효용이 있음을 뒷받침한다.
균등물
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태의 많은 균등물을 인지하거나 단지 통상적인 실험만으로 확인할 수 있을 것이다. 상기 균등물은 하기 청구항에 포함된다.
참고문헌 인용
본원에서 인용한 특허 문헌, 계류 중인 특허 출원 및 기타 간행물 모두가 그 전문이 본원에 참고 문헌으로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Medarex, Inc. et al. <120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN (PSMA) <130> MXI-163CPPC <150> 10/059989 <151> 2002-01-28 <150> PCT/US00/20247 <151> 2000-07-26 <150> 60/146285 <151> 1999-07-29 <150> 60/158759 <151> 1999-10-12 <150> 60/188087 <151> 2000-03-09 <160> 58 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggtgcagt tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagttttacc agctactgga tcggctgggc gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgttc ggccgctaat 300 tcttctcact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357 <210> 2 <211> 325 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag 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180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggctcatgta cacttttggc 300 caggggacca agctggagat caaac 325 <210> 5 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaacgc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gctctggata cacctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcccggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccttc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga acagcctgaa gacctcggac accgccatgt attactgtgc gaccgctaac 300 ccctcttatt ggtatttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357 <210> 6 <211> 325 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcgact ggctcatgta cacttttggc 300 caggggacca agctggagat caaac 325 <210> 7 <211> 341 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agtctggagc agaggtgaaa acgcccgggg agtctctgaa gatctcctgt aagggctctg 60 gatacacctt taccaactac tggatcggct gggtgcgcca gatgcccggg aaaggcccgg 120 agtggatggg gatcatctat cctggtgact ctgataccag atacagcccg tccttccaag 180 gccaggtcac cttctcagcc gacaagtcca tcagcaccgc ctacctgcag tggagcagcc 240 tgaagacctc ggacaccgcc atgtattact gtgcgaccgc taacccctct tattggtatt 300 tcgatctctg gggccgtggc accctggtca ctgtctcctc a 341 <210> 8 <211> 302 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagcgtcacc atcacttgcc gggtgagtca 60 gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca gggaaagttc ctaagctcct 120 gatctatagt gcatccaatt tgcaacctgg agtcccatct cggttcagtg gcagtggatc 180 tgggacagat ttcactctca ctatcaacag cctgcagcct gaagatgttg caacttatta 240 cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct gggaccaaag tggatatcaa 300 ac 302 <210> 9 <211> 341 <212> DNA <213> Homo 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20 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 1 5 10 15 Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys 20 25 30 Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 85 90 95 Val Asp Ile Lys 100 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ala Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ser Phe Trp Ile Gly 1 5 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ala Asn Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asn Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asn Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ala Asn Ser Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met Tyr Thr 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met Tyr Thr 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gln Gln Arg Ser Asp Trp Leu Met Tyr Thr 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr 1 5 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr 1 5 <210> 51 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 52 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp 85 90 <210> 53 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe 85 90 95 Thr Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 <210> 54 <211> 343 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gatactggta 300 cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc tca 343 <210> 55 <211> 283 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggc 283 <210> 56 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggtgagtca gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca 120 gggaaagttc ctaagctcct gatctatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct 180 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct 240 gaagatgttg caacttatta cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa ac 322 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 tgccaggggg aagaccgatg g 21 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 cgggaagatg aagacagatg 20

Claims (36)

  1. FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 및 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체이고, 이 때,
    (a) 인간 중쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열 23, 26, 29, 32 및 35, 및 그의 보존적 변형으로 구성되는 군에서 선택되고;
    (b) 인간 경쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열 38, 41, 44, 47 및 50, 및 그의 보존적 변형으로 구성되는 군에서 선택되고;
    (c) 상기 인간 항체와 인간 PSMA가 결합할 때의 해리 상수 (KD)는 10-8M 이하이고;
    (d) 상기 인간 항체는 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 분석에서 PSMA+종양 세포의 용해를 매개하는, 단리된 인간 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열 22, 25, 28, 31 및 34, 및 그의 보존적 변형으로 구성되는 군에서 선택되고; 인간 경쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열 37, 40, 43, 46 및 49, 및 그의 보존적 변형으로 구성되는 군에서 선택되는 단리된 인간 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열 21, 24, 27, 30 및 33, 및 그의 보존적 변형으로 구성되는 군에서 선택되고; 인간 경쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열 36, 39, 42, 45 및 48, 및 그의 보존적 변형으로 구성되는 군에서 선택되는 단리된 인간 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 PSMA와 결합할 때의 KD가 10-9M 이하인 단리된 인간 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열이 인간 중쇄 VH5-51배선 서열로부터 유도되는 것인 단리된 인간 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 경쇄 가변 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열이 인간 경쇄 L6 또는 04/014 배선 서열로부터 유도되는 것인 단리된 인간 항체.
  7. 인간 중쇄 가변 영역 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체이고, 이 때,
    (a) 인간 중쇄 가변 영역이 서열 11, 12, 13, 14, 15로 구성되는 군에서 선택된 아미노산 서열 및 서열 11, 12, 13, 14, 15와 80％ 이상 상동인 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) 인간 경쇄 가변 영역이 서열 16, 17, 18, 19, 20으로 구성되는 군에서 선택된 아미노산 서열 및 서열 16, 17, 18, 19, 20과 80％ 이상 상동인 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) 상기 인간 항체와 인간 PSMA가 결합할 때의 KD는 10-8M 이하이고;
    (d) 상기 인간 항체는 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 분석에서 PSMA+종양 세포의 용해를 매개하는, 단리된 인간 모노클로날 항체.
  8. 제7항에 있어서, 인간 PSMA와 결합할 때의 KD가 10-9M 이하인 단리된 인간 항체.
  9. 인간 중쇄 VH5-51배선 서열 (서열 54)로부터 유도된 인간 중쇄 가변 영역 및 인간 경쇄 L6 (서열 55) 또는 04/014 (서열 56) 배선 서열로부터 유도된 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체이고, 이 때,
    (a) 인간 중쇄 가변 영역은 서열 12의 아미노산 서열 또는 서열 12와 80％ 이상 상동인 서열을 포함하고;
    (b) 인간 경쇄 가변 영역은 서열 17의 아미노산 서열 또는 서열 17와 80％이상 상동인 서열을 포함하고;
    (c) 상기 인간 항체와 인간 PSMA가 결합할 때의 KD는 10-9M 이하이고;
    (d) 상기 인간 항체는 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 분석에서 PSMA+종양 세포의 용해를 매개하는, 단리된 인간 모노클로날 항체.
  10. 서열 11 및 서열 16의 아미노산 서열을 각각 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  11. 서열 12 및 서열 17의 아미노산 서열을 각각 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  12. 서열 13 및 서열 18의 아미노산 서열을 각각 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  13. 서열 14 및 서열 19의 아미노산 서열을 각각 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  14. 서열 15 및 서열 20의 아미노산 서열을 각각 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  15. PSMA와의 결합에 대해 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날 항체와 경쟁하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 또는 트랜스염색체 (transchromosome) 및 인간 경쇄 트랜스진 또는 트랜스염색체를 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 비인간 동물로부터 수득한 B 세포를 불멸화 세포에 융합시켜 제조한 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 인간 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 방광, 유방, 결장, 신장, 난소, 전립선, 신세포, 편평 세포, 폐 (소세포가 아님) 및 머리 및 목 종양 세포로 구성되는 군에서 선택되는 종양 세포에 결합하는 인간 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄를 포함하는 인간 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 또는 IgG3 중쇄를 포함하는 인간 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 인간 항체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  21. 치료제에 결합된 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 인간 항체를 포함하는 면역접합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 치료제가 세포독소인 면역접합체.
  23. 제21항에 있어서, 상기 치료제가 방사성동위원소인 면역접합체.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 면역접합체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  25. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 인간 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  26. 제25항에 있어서, 발현 벡터에 혼입된 단리된 핵산 분자.
  27. 제25항 또는 제26항의 단리된 핵산을 포함하는 트랜스펙토마 (transfectoma).
  28. 인간 중쇄 트랜스진 또는 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스진 또는 트랜스염색체를 포함하는 게놈을 보유하고 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 인간 항체를 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물.
  29. PSMA-발현 세포를 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체의 유효량과 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제하는 것을 포함하는, PSMA-발현 세포의 성장 억제 방법.
  30. PSMA-발현 종양 세포의 성장을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방에 유효한 양의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 인간 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, PSMA-발현 종양 세포의 성장을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방 방법.
  31. 제30항에 있어서, 질환이 암인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 암이 전립선암, 결장암 및 신장 암종으로 구성되는 군에서 선택되는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 암이 전립선암인 방법.
  34. 제29항에 있어서, 인간 항체가 치료제에 접합된 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 치료제가 세포독소인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 치료제가 방사성동위원소인 방법.
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Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7105159B1 (en) 1992-11-05 2006-09-12 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antibodies to prostate-specific membrane antigen
US6569432B1 (en) 1995-02-24 2003-05-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US6962981B1 (en) 1996-03-25 2005-11-08 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen
US7381407B1 (en) 1996-03-25 2008-06-03 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen
AU2002356844C1 (en) 2001-10-23 2010-03-04 Amgen Fremont Inc. PSMA antibodies and protein multimers
US20050215472A1 (en) 2001-10-23 2005-09-29 Psma Development Company, Llc PSMA formulations and uses thereof
PL1691837T3 (pl) * 2003-12-10 2012-11-30 Squibb & Sons Llc IP-10 przeciwciała i ich zastosowanie
ES2533492T3 (es) * 2004-02-06 2015-04-10 University Of Massachusetts Anticuerpos contra toxinas de Clostridium difficile y usos de los mismos
ES2387809T3 (es) * 2004-03-19 2012-10-02 Imclone Llc Anticuerpo frente al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
PL2287195T3 (pl) 2004-07-01 2019-10-31 Novo Nordisk As Przeciwciała pan-kir2dl receptora nk i ich zastosowanie w diagnostyce i terapii
CN104829720B (zh) 2005-01-06 2019-01-01 诺和诺德公司 Kir结合剂和使用其的方法
AU2006214031A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to prostate specific membrane antigen (PSMA)
MX2007009935A (es) * 2005-02-18 2007-10-10 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales que carecen de residuos fucosilo contra antigeno membranal especifico de prostata (psma).
LT2439273T (lt) * 2005-05-09 2019-05-10 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Žmogaus monokloniniai antikūnai prieš programuotos mirties 1(pd-1) baltymą, ir vėžio gydymo būdai, naudojant vien tik anti-pd-1 antikūnus arba derinyje su kitais imunoterapiniais vaistais
EP1726650A1 (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Universitätsklinikum Freiburg Monoclonal antibodies and single chain antibody fragments against cell-surface prostate specific membrane antigen
US7696185B2 (en) * 2006-03-14 2010-04-13 Cancer Targered Technology LLC Peptidomimetic inhibitors of PSMA, compounds comprising them, and methods of use
US8852630B2 (en) 2008-05-13 2014-10-07 Yale University Chimeric small molecules for the recruitment of antibodies to cancer cells
EP2727606A3 (en) 2008-09-08 2015-09-23 Psma Development Company, L.L.C. Compounds for killing psma-expressing, taxane-resistant cancer cells
DK2356153T3 (en) * 2008-10-01 2016-07-04 Amgen Res (Munich) Gmbh Bispecific single CHAIN ​​PSMAXCD3 ANTIBODY THAT ARE SPECIFICALLY TO ALL SPECIES
CN101891818B (zh) * 2009-01-16 2012-07-25 中国人民解放军第四军医大学 抗人***特异性膜抗原胞外区单链抗体及其应用
WO2010118522A1 (en) * 2009-04-14 2010-10-21 Proscan Rx Pharma Inc. Antibodies against prostate specific membrane antigen
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
SG194510A1 (en) 2011-04-22 2013-12-30 Emergent Product Dev Seattle Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositionsand methods
HUE045435T2 (hu) 2012-10-12 2019-12-30 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinek és konjugátumaik
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
CN103333249A (zh) * 2013-06-14 2013-10-02 广州康合生物科技有限公司 一种抗***特异性膜抗原（psma）的单克隆抗体及其应用
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10100126B2 (en) * 2015-03-10 2018-10-16 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind PSMA
IL293719B2 (en) 2015-05-21 2023-07-01 Harpoon Therapeutics Inc Trispecific binding proteins and methods of use
EP3352760A4 (en) 2015-09-21 2019-03-06 Aptevo Research and Development LLC CD3 BINDING POLYPEPTIDES
KR101704379B1 (ko) * 2015-10-27 2017-02-08 (주)알테오젠 항체-약물 접합체 및 그 제조방법
AU2017237543B2 (en) * 2016-03-23 2020-02-06 Institut Pasteur Korea Antibody that binds to envelope glycoprotein of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, and use for same
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
AU2017267793B2 (en) 2016-05-20 2024-01-25 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
CN109862919A (zh) 2016-10-11 2019-06-07 免疫医疗有限公司 抗体-药物缀合物联合免疫介导的治疗剂
MX2019006043A (es) 2016-11-23 2019-09-26 Harpoon Therapeutics Inc Proteína de unión de antígeno prostático específico de membrana.
BR112019010602A2 (pt) * 2016-11-23 2019-12-17 Harpoon Therapeutics Inc proteínas trispecíficas para psma e métodos de uso
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
JP7209936B2 (ja) 2017-05-12 2023-01-23 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｍｓｌｎ標的三重特異性タンパク質及びその使用方法
KR102376863B1 (ko) 2017-05-12 2022-03-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. 메소텔린 결합 단백질
KR102569133B1 (ko) 2017-10-13 2023-08-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. 삼중특이적 단백질 및 사용 방법
CR20200195A (es) 2017-10-13 2020-08-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión a antigenos de maduraciòn de celulas b
JP2021524449A (ja) 2018-05-23 2021-09-13 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム 分子アジュバント
JP7425049B2 (ja) 2018-09-25 2024-01-30 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｄｌｌ３結合タンパク質および使用方法
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
TW202132353A (zh) * 2020-02-18 2021-09-01 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 一種分離的結合抗原ｐｓｍａ的蛋白及其用途
AU2021224851A1 (en) 2020-02-21 2022-09-15 Harpoon Therapeutics, Inc. FLT3 binding proteins and methods of use
US20230372528A1 (en) 2020-10-16 2023-11-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoconjugates
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
WO2023088966A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Adc Therapeutics Sa Anti-psma conjugates

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2162878A1 (en) * 1993-06-09 1994-12-22 Leon Gerardus Joseph Frenken Process for producing fusion proteins comprising scfv fragments by a transformed mould
US7563874B2 (en) * 1998-08-31 2009-07-21 The Regents Of The University Of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
KR100733933B1 (ko) * 1999-07-29 2007-07-03 메다렉스, 인코포레이티드 전립선 특이적 막 항원에 대한 인간 모노클로날 항체
GB0001448D0 (en) * 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
PT2275449T (pt) * 2000-06-16 2016-12-27 Human Genome Sciences Inc Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys
AU2002356844C1 (en) * 2001-10-23 2010-03-04 Amgen Fremont Inc. PSMA antibodies and protein multimers
WO2004020588A2 (en) * 2002-08-30 2004-03-11 Biorexis Pharmaceutical Corporation Transferrin fusion protein libraries
AU2003298799A1 (en) * 2002-12-02 2004-06-23 Abgenix, Inc. Antibodies directed to phospholipase a2 and uses thereof

Also Published As

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