KR20040075042A - β-락탐 항생제의 제조 방법 - Google Patents

β-락탐 항생제의 제조 방법 Download PDF

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KR20040075042A
KR20040075042A KR10-2004-7010285A KR20047010285A KR20040075042A KR 20040075042 A KR20040075042 A KR 20040075042A KR 20047010285 A KR20047010285 A KR 20047010285A KR 20040075042 A KR20040075042 A KR 20040075042A
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Abstract

본 발명은 야생형 페니실린 아실라아제와 비교하여 높은 합성/가수분해 비율과 활성의 적어도 1%를 가진 변이된 페니실린 아실라아제와 관련된다. 본 발명은 또한 β-락탐 핵과 활성화된 측쇄로부터 변이된 페니실린 아실라아제의 도움으로 β-락탐 항생제의 효소적 제조 방법과 관련된다.

Description

β-락탐 항생제의 제조 방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF A β-LACTAM ANTIBIOTIC}
페니실린 아실라아제는 미생물 예를 들어, 세균에서 기원하고, 페니실린의 6-아실기 또는 세팔로스포린의 7-아실기를 역으로 가수분해하여 페니실린 또는 세팔로스포린의 링 구조를 파괴하지 않고 대응하는 유리 아민을 생성할 수 있는 하이드로라아제의 그룹이다. 반응 도표 I 은 가수분해 반응을 예시한다. 페니실린 화합물에서 측쇄 R의 소수의 예는 페닐아세틸과 펜옥시아세틸이다.
페니실린 아실라아제는 예를 들어 페니실린 아미다아제 또는 벤질 페니실린 하이드로라아제로서 다양하게 알려져 있다(효소 분류 E. C. 3.5. 1.11).
본 발명은 변이된 페니실린 아실라아제와, 변이된 페니실린 아실라아제의 존재하에 β-락탐 핵을 활성화된 측쇄의 도움으로 아실화시키는 β-락탐 항생제의 제조 방법과 관련된다.
용어 β-락탐 항생제는 식 Ⅱ 또는 Ⅲ (X=S 또는 O) 으로 제시된 바와 같이 응축된 링 시스템을 함유하는 모든 항생제를 포함한다. 가장 잘 알려진 β-락탐 항생제는 페니실린과 세팔로스포린이다.
본 출원의 본문에서, 페니실린은 식(II)에 따른 화합물로, 세팔로스포린은식(III)에 따른 화합물로 정의된다.
상기 식에서,
X = S, O, C, S (O), 또는 S02,
R1= 예를 들어 페닐아세틸, 펜옥시아세틸, 히드록시페닐글리실, 페닐글리실, 디히드로페닐글리실과 그것의 유도체 및 아세틸, 아디필, 글루타릴 및 그것의 유도체와 같은 측쇄
R2, R3= 선택적으로 하나 또는 그 이상의 O, S 또는 N 원자를 가진 Cl, 지방성 또는 방향성 기
R4= 선택적으로 하나 또는 그 이상의 O, S 또는 N 원자를 가진 OH, 지방성 또는 방향성 알코올과 그것의 유도체
본 발명의 본문에서 측쇄는 β-락탐 핵의 6-펜암 또는 7-세펨 위치에 부착하여 항생적으로 활성 화합물을 생성할 수 있는 적절한 화합물을 포함한다.
R2또는 R3에서 지방성 기는 바람직하게 1-4 C 원자를 함유하고 바람직하게메틸기이다.
페니실린 또는 세팔로스포린은 예를 들어 식(IV)에 제시된 바와 같은 6-아미노페니실란산 (6-APA) 또는 그것의 유도체의 6-아미노기 또는 식 (V)에 제시된 바와 같은 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산 (7-ADCA) 또는 그것의 유도체의 7-아미노 기를 활성화된 측쇄와 페니실린 아실라아제 효소의 도움으로 아실화하여 제조한다. 또한 7-아미노세팔로스포란산 (7-ACA)-핵은 페니실린 아실라아제의 도움으로 아실화될 수 있다. 식 (IV) 또는 (V)에 따른 화합물의 유도체는 각각 식(IV) or (V)에 따른 화합물로 이해된다(X, R2, R3, 및 R4는 각각 식(II) 과 (III)에 제시된 의미를 갖는다.
X=S
R2=CH3
R3=CH3
R4=OH
페니실린 아실라아제는 분자 구조와 기질 특이성을 근거로 분류될 수 있다.유형 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 아실라아제가 있다. 유형 Ⅱ 아실라아제는 (작은)α-서브유닛과 (큰)β-서브유닛의 헤테로다이머로 구성되어 있다. 소위 페니실린 G 아실라아제라 불리는 유형 Ⅱa는 예를 들어, 페니실린 G의 측쇄인 페닐아세틸과 같은 소수성 측쇄를 가진 기질에서 활성이다. 짧은 알킬 체인은 예를 들어, 또한 유형 Ⅱa 아실라아제에 의해 인지된다. 하지만, 유형 Ⅱa 아실라아제는 전하된 측쇄를 가진 기질과는 활성적이지 않다. 전하된 측쇄를 가진 기질에 대해서, 유형 Ⅱb 아실라아제가 적절하다. 모든 유형 Ⅱ 아실라아제는 한 집단에 속해 있다. 유형 Ⅱ 아실라아제는 아미노산 서열에서 높은 상동성을 보임이 알려져 있다.
본 출원의 관점에서, 페니실린 아실라아제는 유형II 아실라아제로 이해된다. 바람직한 구체예에서 본 발명은 유형 Ⅱa 페니실린 아실라아제와 관련된다.
변이된 페니실린 아실라아제 또는 페니실린 아실라아제 변이체는 적어도 하나의 위치에서 야생형 페니실린 아실라아제의 아미노산 서열로부터 하나의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 페니실린 아실라아제인 것으로 이해된다.
변이체는 야생형의 아미노산 서열에서 치환된 아미노산의 위치의 수로 기술된다. 숫자 앞에, 어떤 아미노산이 야생형에서 그 위치에서 발생했는지 나타나 있고, 숫자 뒤에, 어떤 아미노산이 변이체에서 발생했는지 나타나 있다.
SEQ ID No:1 은 분비 신호를 포함한E. coli페니실린 아실라아제의 아미노산 서열을 제시한다. SEQ ID No: 2 는E. coli페니실린 아실라아제의 α-서브유닛의 아미노산 서열을 제시한다. SEQ ID No: 3 은E. coli페니실린 아실라아제의 β-서브유닛의 아미노산 서열을 제시한다. SEQ ID No: 4 에서 아미노산 서열은E.coli페니실린 아실라아제의 위치 145에서 변이된 α-서브유닛으로 제시되어 있다(α-R145L).
변이된 페니실린 아실라아제를 참고한 많은 공개가 알려져 있다. W098/20120 에서 예를 들어 다음 공개: Prieto et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33 (1990) 553-559 을 참고하고 이 공개에는K. citrophila의 페니실린 아실라아제에서 위치 168에서 L-알라닌(M168A), L-발린(M168V), L-아스파라긴 (M168N) 또는 L-티로신(M168Y) 에 의한 L-메티오닌의 치환은 페니실린 G 와 페니실린 V 의 디아실화에 대한 역학적 변수에 영향을 주고, Asn375 또는 Tyr481 을 라이신 (N375K)과 히스티딘(Y481H)으로 각각 치환하면 영향을 주지 않음이 기술되어 있다. J. Martin and I. Prieto, Biochimica et Biophysica Acta 1037 (1990) 133-139 에, Met168 이 알라닌(M168A)으로 치환된 변이체가 기술되어 있다. 이로 인해 향상된 열 안정성을 초래한다.E. coli페니실린 아실라아제에서 Ser177 을 글리신 (S177G), 트레오닌 (S177T), 류신 (S177L), 또는 아르기닌 (S177R)으로 치환하면 비활성 효소를 생산하는 반면(Wang Minetal., Shiyan Shengwu Xuebao 24 (1991) 1,51, Kyeong Sooket al., Journal of Bacteriology 174 (1992) 6270 and Slade et al., Eur. J. Biochem. 197, (1991) 75 로부터 Ser290 은E. coli의 페니실린 아실라아제에서 필수 아미노산인 것이 알려져 있다. Gly359 를 L-아스파르트산 (G359D)으로 치환하면 페니실린 G 를 가수분해할 수 없지만 프탈일-류신과 프탈일-글리실-L-프롤린을 가수분해할 수 있는 변이된 효소를 생성한다. Arg 에서 Trp431의 치환으로(W431 R ; Gabriel Del Rio et al., Biotechnology and Bioengineering48 (1995) 141-148) 기초 환경에서 증가된 안정성을 갖는E. coli의 변이된 페니실린 G 아실라아제를 초래한다.
최근의 공개는 W. B. L. Alkemaet al., Protein Engineering, 13, (2000) 857- 863 이고 여기에E. coli페니실린 아실라아제의 결합 부위의 특징이 규명되어 있고, α146 에서 L-티로신을 갖는 변이체(F146Y)는 페닐아세트아미드와 6-아미노페니실란산으로부터 페니실린 G의 합성에 대해 활성이지 않고 그 위치에서 류신(F146L) 또는 알라닌 (F146A)을 갖는 변이체는 야생형보다 페니실린 G의 합성에 더 효과적임이 기술되어 있다.
페니실린 아실라아제의 많은 변이체가 기술되어 있는 특허는 유럽 특허 출원 EP-A-0453048 과 국제 특허 출원 WO 96/05318 이다.
β-락탐 항생제의 효소적 제조에 대한 경제적으로 효율적인 방법에 대해, 합성/가수분해 비율(S/H 비율)이 높은 것이 바람직하다. 바람직하게 S/H 비율이 높고 동시에 효소 활성도 또한 충분히 높다.
합성/가수분해 비율(S/H 비율)은 효소 아실화 반응동안에 정해진 조건에서 가수분해 산물에 대한 합성 산물의 몰 비율로 이해된다. 합성 산물은 β-락탐 핵과 활성화된 측쇄로부터 형성된 β-락탐 항생제인 것으로 이해된다. 가수분해 산물은 활성화된 측쇄의 대응하는 산으로 이해된다.
본 발명의 본문에서, 효소 활성은 효소 아실화 반응동안에 정해진 조건에서 용해되거나 고정화된 효소의 양 당 체적 생산성으로 정의된다. 바람직하게 효소는 고정된 형태로 응용되고 효소 활성은 고정된 효소의 양 별로 정의된다.
아실화 반응에서 체적 생산성은 반응동안에 단위 부피 당 그리고 단위 시간 당 정해진 조건에서 아실화 반응에서 형성된 β-락탐 항생제의 몰 양으로 표현된다.
S/H 비율은 다른 것들 중에서 반응물의 농도, 온도, pH 및 효소의 상관 관계이다. 따라서, 어떤 조건에서 S/H 비율이 결정되는지 나타내는 것이 중요하다.
β- 락탐 핵과 활성화된 측쇄로부터 페니실린 아실라아제 변이체의 도움으로 β-락탐 항생제의 효소적 제조 방법은 국제 특허 출원 WO 98/20120 에 알려져 있다. 이 공개는 β-락탐 항생제는, 페니실린 G 아실라아제가 존재하면 락탐 핵과 활성화된 측쇄가 서로 접촉하는 효소 아실화 반응을 수행하여 제조될 수 있음을 개시한다. β-락탐 항생제는 측쇄를 핵에 커플링하여 형성된다. 활성화된 측쇄는 대개 측쇄의 아미드 또는 에스테르이다.
국제 특허 출원 WO 98/20120 은 아실화 반응에 대한 효소 활성과 선택성은 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 페니실린 G 아실라아제 효소를 변화시켜서 변할 수 있음을 개시한다. 특히, 좋은 페니실린 G 아실라아제는 α-서브유닛에서 아미노산 위치 142 과 146 과 β-서브유닛에서 아미노산 위치 24,56 또는 177 에서 변이로부터 초래된다. 특히, 위치 β24 에서 변이로, 24 위치에 원래 존재하는 L-페닐알라닌은 L-알라닌으로 치환되며(F24A), 에스테르의 형태로 활성화된 측쇄의 도움으로 페니실린과 세팔로스포린의 합성에서 현저하게 높은 수율을 생산하는 것처럼 보인다.
아미드가 F24A 변이체와 함께 사용되면, S/H 비율은 상대적으로 높지만 효소활성은 매우 낮아서 이 변이체의 사용은 경제적으로 덜 효율적임을 발견하였다.
아미드가 화학적으로 에스테르보다 더 안정하기 때문에 활성화된 측쇄로서 아미드를 사용하는 것이 효율적임을 발견하였다. 높은 화학적 안정성은 대응하는 산을 생성하기 위한 활성화된 측쇄의 가수분해 및/또는 측쇄의 화학적 라세미화는 에스테르보다는 아미드에 대해 현저하게 낮다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 페닐글리신 아미드는 같은 온도와 pH에서 페닐글리신 메틸 에스테르보다 약 1000 배 더 안정하다.
본 발명의 목적은 β-락탐 핵과 활성화된 측쇄로서 아미드로부터 β-락탐 항생제의 효소적 제조 방법에서 사용할 때 상대적으로 높은 S/H 비율과 상대적으로 높은 활성을 초래하는 변이된 페니실린 아실라아제를 제공하는 것이다.
놀랍게도, β-락탐 항생제의 제조 방법에서 높은 S/H 비율을 획득하고, 페니실린 아실라아제가 존재하면 활성화된 측쇄의 도움으로 β-락탐 핵이 변이된 페니실린 아실라아제로서 아실화되며 이 아실라아제는E. coli에서 유래하는 페니실린 아실라아제의 α-서브유닛에서 위치 145에 대응하는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 가짐을 발견하였다. 특히, 높은 S/H 비율은 L-아르기닌이 상기 145 위치에서 L-류신(R145L), L-라이신 (R145K) 또는 L-시스테인(R145C)으로 치환되는 변이 페니실린아실라아제가 존재하면 상기 방법에서 획득된다.
다른 야생형의 페니실린 아실라아제에서 구체적인 위치에 대응하는 페니실린 아실라아제에서 위치는 예를 들어, 아미노산 서열을 정렬하여 발견될 수 있음이 알려져 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 W096/05318은 페니실린 아실라아제의 아미노산 서열이 어떻게 정렬되어 있는지를 기술하고E. coli,Alcaligenes faecalis,Kluyvera citrophila,Arthrobacter viscosis및P. rettgeri로부터 유래하는 페니실린 아실라아제에 대한 아미노산 서열을 제시한다. 예를 들어E. coli에서 어떤 아미노산 위치가A. faecalis에서 아미노산 위치와 대응하는 지를 나타낸다(W0 96/05318 의 도 2 참조).
R145L, R145K 및 R145C 변이체는, β-락탐 핵과 활성화된 측쇄로서 아미드로부터 β-락탐 항생제의 효소적 제조 방법에서 사용되면 야생형E. coli페니실린 G아실라아제가 사용될 때 발견되는 초기 S/H 비율보다 적어도 2배 높은 초기 S/H 비율을 초래하고 야생형E. coli페니실린 G 아실라아제 활성의 1 % 이상에 해당하는 효소 활성을 가진다. 본 발명은 또한 β- 락탐 핵과 활성화된 측쇄로서 아미드로부터 변이 페니실린 아실라아제의 도움으로 β-락탐 항생제의 효소적 제조 방법에서 사용되면 같은 반응 조건에서 야생형E. coli페니실린-G 아실라아제가 사용될 때 발견되고 같은 반응 조건에서 야생형E.coli페니실린 G 아실라아제 활성의 적어도 1 %에 대응하는 효소 활성을 가진 초기 S/H 비율보다 적어도 2배 높은 초기 S/H 비율을 초래하는 변이된 페니실린 아실라아제와 관련된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 변이된 페니실린 아실라아제는E. coli페니실린 아실라아제이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 변이된 페니실린 아실라아제의 도움으로 β-락탐 핵과 활성화된 측쇄로부터 β-락탐 항생제의 효소적 제조 방법과 관련된다.
바람직한 구체예에서 본 발명은 본 발명에 따른 페니실린 아실라아제의 존재하에, β-락탐 핵을 아미드의 형태의 활성화된 측쇄의 도움으로 아실화시키는 락탐 항생제의 제조 방법과 관련된다.
바람직한 구체예에서 변이된 페니실린 아실라아제는 β-락탐 핵과 활성화된 측쇄로서 아미드로부터 변이된 아실라아제의 도움으로 β-락탐 항생제의 효소적 제조 방법에서 사용될 때, 야생형E. coli페니실린 G 아실라아제가 사용될 때 발견되는 초기 S/H 비율보다 적어도 3 그리고 바람직하게 4 배 높은 초기 S/H 비율을 초래하는 아실라아제이다.
효소 활성은 야생형E. coli페니실린 G 아실라아제 활성에 대해 바람직하게 적어도 2%, 더 바람직하게 적어도 5% 이다.
국제 특허 출원 W096/05318 은 D-페닐글리신 아미드와 6-아미노페니실란산으로부터 암피실린의 합성에 대해 향상된 S/H 비율과 관련하여 페니실린 아실라아제 변이체 αM143V, βL56G 및 βL177S 를 언급한다. 하지만, 인용된 S/H 비율은 야생형E. coli페니실린 아실라아제의 S/H 비율보다 2의 인자로 높지 않지만 현저하게 낮다.
아실화 반응에서 달성되는 전환은 사용된 반응물의 몰 양 당 반응동안에 특정 순간에 아실화 반응에서 형성된 β-락탐 항생제의 몰 양으로 표현될 수 있고, 반응물은 β-락탐 핵 또는 (활성화된) 측쇄이다. 본 발명의 본문에서 전환은 사용된 β-락탐 핵의 양(몰) 당 아실화 반응에서 형성된 β-락탐 항생제의 양(몰)으로서 정의된다.
효소 아실화 반응동안에, S/H 비율은 일반적으로 감소한다. 전환은 일반적으로 처음 증가하고 후에 감소한다. S/H 비율은 다른 것들 중에서도 전환의 상관 관계이다. 다른 페니실린 아실라아제의 S/H 비율은 바람직하게 동등 전환에서 비교된다. 이들은 대부분 대개 0% 전환, 소위 초기 S/H 비율에서 비교되고, 이것은 S/H 비율의 측정값이다. 초기 S/H 비율은 0% 전환에서 S/H 비율로 이해되고, 따라서 시간 t = 0 이다. 초기 S/H 비율은 충분히 높은 전환, 적어도 30%, 바람직하게 적어도 50% 이 달성될 때까지 아실화 반응을 수행하고 전환에 대한 S/H 비율의 그래프를 그린 후 0 % 전환에 외삽하여 충분히 정확하게 결정될 수 있다. 외삽법은 초기 S/H 비율 결정의 정확성을 향상시키기 때문에 초기 S/H 비율을 외삽법을 통해서 결정하는 것이 바람직하다. 정확하게 결정하기 위해서, 충분한 데이타 지점 예를 들어, 적어도 3개의 데이타 지점을 가지는 것이 바람직하고 데이타 지점은 바람직하게 적어도 5% 의 전환에서 차이점을 대표하고 바람직하게 측정 지점의 아무것도 전환이 10% 이하인 곳에서는 위치하지 않는다.
효소 아실화 반응동안에, 체적 생산성과 효소 생산성은 일반적으로 시간에 따라 감소한다. 체적 생산성과 효소 활성은 전환의 상관 관계이다. 다른 페니실린 아실라아제의 효소 활성은 바람직하게 동등 전환에서 비교된다. 이들은 대부분 대개 0% 전환, 소위 초기 효소 활성에서 비교되고 이것은 효소 활성의 측정값이다. 초기 효소 활성은 0% 전환(시간 t = 0)에서 효소 활성으로 이해된다. 초기 효소 활성은 충분히 높은 전환, 적어도 30%, 바람직하게 적어도 50% 이 달성될 때까지 아실화 반응을 수행하고 전환에 대한 S/H 비율의 그래프를 그린 후 0 % 전환에 외삽하여 충분히 정확하게 결정될 수 있다. 외삽법은 초기 효소 활성 결정의 정확성을 향상시키기 때문에 초기 효소 활성을 외삽법을 통해서 결정하는 것이 바람직하다. 정확하게 결정하기 위해서, 충분한 데이타 지점 예를 들어, 적어도 3개의 데이타 지점을 가지는 것이 바람직하고 데이타 지점은 바람직하게 적어도 2% 의 전환에서 차이점을 대표하고 바람직하게 측정 지점의 아무것도 전환이 1% 이하인 곳에서는 위치하지 않는다.
변이된 또는 변이되지 않은 페니실린 아실라아제가 사용되는 효소 아실화 반응의 수행에 대한 적절한 반응 조건이 당업계에 능숙한 이에게 알려져 있다.
β-락탐 핵에 대한 활성화된 측쇄의 몰 비율, 즉 첨가된 β-락탐 핵의 전체 양으로 나눈 첨가된 활성화된 측쇄의 전체 양(2개 모두 몰로 표현됨)은 넓은 한계 사이에 변한다. 바람직하게 몰 비율은 0.5 과 2.0 사이, 특히 0.7 과 1.8 사이이다.
효소 아실화 반응이 수행되는 온도는 일반적으로 40℃ 보다 낮고, 바람직하게 -5 와 35 ℃ 사이이다. 효소 아실화 반응이 수행되는 pH 는 일반적으로 5.5 과 9.5 사이, 바람직하게 6.0 과 9.0 사이에 있다.
바람직하게 최대 전환이 모두 달성될 때 반응은 거의 완전하게 종결된다. 반응을 종결하기 위한 적절한 구체예는 pH를, 바람직하게 4.0 과 6.3 사이의 값, 특히 4.5 와 5.7 사이의 값으로 낮추는 것이다. 또다른 적절한 구체예는 최대 전환이 달성되자마자 반응 혼합물의 온도를 낮추는 것이다. 두 가지 구체예의 조합이 또한 가능하다.
본 발명의 본문에서, pH 에서 감소는 예를 들어 산을 첨가하여 달성될 수 있다. 적절한 산은 예를 들어 무기산, 특히 황산, 염산 용액 또는 질산 및 카르복시산, 예를 들어 아세트산, 옥살산 및 시트르산이다. pH 의 증가는 예를 들어 염기를 첨가하여 달성된다. 적절한 염기는 예를 들어 무기 염기, 특히 암모니아, 수산화 칼륨 또는 수산화 나트륨 용액 및 유기 염기, 예를 들어 트리에틸아민과 D-페닐글리신 아미드이다. 바람직하게 암모니아가 적용된다.
효소 아실화 반응은 물에서 수행될 수 있다. 원하면, 반응 혼합물은 또한 바람직하게 30 vol. % 이하의 유기 용매 또는 유기 용매의 혼합물을 함유한다. 적용되는 유기 용매의 예는 1-7 C-원자가 있는 알코올, 예를 들어 모노알코올, 특히 메탄올 또는 에탄올; 디올, 특히 에틸렌 글리콜 또는 트리올, 특히 글리세롤이다.
효소 아실화 반응은 바람직하게 배치 공정으로서 수행된다. 원하면, 또한 반응을 지속적으로 수행하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 공정에서 사용될 수 있는 β-락탐 핵의 적절한 예는 페니실린 유도체, 예를 들어 6-APA 그리고 세팔로스포린 유도체, 예를 들어 3-부위에 치환기가 있거나 없는 7-아미노세팔로스포란산 , 예를 들어 7- ACA, 7-ADCA, 7-아미노디아세틸세팔로스포란산(7-ADAC), 7-아미노-3-클로로-세프-3-엠-4-카르복시산(7-ACCA) 및 7-아미노-3-클로로-8-옥소-1-아자바이시클로[4.2.0] 옥트-2-엔에-2-카르복시산이다.
본 발명의 본문에서 측쇄는 β-락탐 핵의 6-펜암 또는 7-세펨 위치에 부착될 수 있고 항생적으로 활성인 화합물을 생성하는 적절한 화합물을 포함한다. 페닐글리신, p-히드록시페닐글리신 및 디히드로페닐글리신은 적절한 측쇄의 예이다. (효소) 아실화 반응에서 활성화된 측쇄로서, 예를 들어 상기 측쇄의 아미드 (1차, 2차, 3차) 또는 상기 측쇄의 에스테르, 예를 들어 페닐글리신의 아미드 또는 에스테르, p-히드록시페닐글리신 또는 디히드로페닐글리신, 바람직하게 아미드 또는 저급 알킬(1-4C) 에스테르, 예를 들어 메틸 에스테르를 사용한다. 활성화된 측쇄는 또한 에스테르 또는 아미드의 염을 포함한다. 바람직하게, 페닐글리신 아미드는 활성화된 측쇄로서 사용된다.
본 발명에 따른 공정에 의하여 바람직하게 제조되는 β-락탐 항생제는 아목시실린, 암피실린, 세팔렉신, 세파드록실, 세프라딘 및 세파클러이다.
알려진 페니실린 아실라아제로부터 시작하여 페니실린 아실라아제의 변이체를 만들 수 있다. 페니실린 아실라아제 효소를 획득할 수 있는 미생물은 예를 들어Acetobacter,특히Acetobacter pasteurianum, Aeromonas, Alcaligenes,특히Alcaligenes faecalis, Aphanocladium, Bacillus sp., 특히 Bacillus megaterium, Cephalosporium, Escherichia,특히Escherichia coli, Flavobacterium, Fusarium,특히Fusarium oxysporum과Fusarium solani, Kluyvera, Mycoplana, Protaminobacter, Proteus,특히Proteus rettgari, Pseudomonas와Xanthomonas,특히Xanthomonas citrii이다.
변이된 페니실린 아실라아제는 알려진 방식으로 제조할 수 있다. 적절한 방법은 예를 들어 페니실린 아실라아제를 암호화하는 DNA에서 돌연변이를 도입하는 데 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 방법이다. PCR 방법에서 합성적 올리고뉴클레오티드의 도움으로 페니실린 아실라아제를 암호화하는 DNA 서열의 원하는 부위에서 변이가 도입된다. 예를 들어 올리고뉴클레오티드
5'-TGCCAGATTATCGATTTCGCTAGTACTATCAGAGAACAAGTTTGCCAT-3'
가 사용되며 밑줄 그은 코돈은 L-류신을 암호화하며E. coli페니실린 아실라아제의 α-서브유닛의 위치 145에서 변이를 도입할 목적으로 L-아르기닌에 대한 코돈이 그 위치에서 L-류신에 대한 코돈으로 치환된다. 같은 위치에서 각각 L-시스테인 또는 L-라이신에 대한 코돈을 도입하기 위해서 밑줄 그은 코돈이 ACA 또는 CTT 로 대체된 상기 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
DNA 서열에서 변이를 도입한 후, 획득한 DNA 서열을 벡터로 클론한다. 벡터 는 후속하여 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용된다. 숙주 세포는 변이된 페니실린 아실라아제의 발현에 적절한 조건에서 배양된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라 변이된 페니실린 아실라아제를 암호화하는 핵산 서열과 숙주 세포에서 핵산 서열의 발현에 적절한 기능적으로 연결된 프로모터가 있는 본 발명에 따른 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터와 관련된다. 본 발명은 또한 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포와 변이된 페니실린 아실라아제의 생성에 적절한 조건에서 숙주 세포가 배양되는 본 발명에 따른 변이된 페니실린 아실라아제의 제조 방법에 관련된다.E. coli는 바람직하게 숙주 세포로서 사용된다.
고정된 효소는 쉽게 분리되고 재활용될 수 있기 때문에 바람직하게 페니실린 아실라아제는 고정 형태로 적용된다.
본 발명은 제한되지 않고 실시예를 근거로 설명된다.
아미노산의 명명법
아미노산 3-문자 축약 1-문자 축약
L-알라닌 Ala A
L-시스테인 Cys C
L-아스파라긴산 Asp D
L-글루탐산 Glu E
L-페닐알라닌 Phe F
L-글리신 Gly G
L-히스티딘 His H
L-이소류신 Ile I
L-라이신 Lys K
L-류신 Leu L
L-메티오닌 Met M
L-아스파라긴 Asn N
L-프롤린 Pro P
L-글루타민 GI Q
L-아르기닌 Arg R
L-세린 Ser S
L-트레오닌 Thr T
L-티로신 Tyr Y
L-발린 Val V
L-트립토판 Trp W
축약의 목록
7-ADCA: 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산
6-APA: 6-아미노페니실란산
AMPI: 암피실린
CEX : 세팔렉신
PG : D-페닐글리신
PGA : D-페닐글리신 아미드
PGM. HCL: D-페닐글리신 메틸 에스테르 HCl 염
HPGM: D-p-히드록시페닐글리신 메틸 에스테르
페니실린 아실라아제 (야생형)
AssemblaseTM은 WO-A-99/20786 와 WO-A-97/04086 에 기술된 바와 같이E. coliATCC 1105의 고정된E.coli페니실린 아실라아제이다. 아실라아제는 EP-A-222462 에 기술된 바와 같이, 젤라틴 화합물로서 젤라틴과 키토산을 사용하고 교차링커로서 글루타르알데히드를 사용하여 소구체에 고정된다.
생산된E. coli페니실린 아실라아제의 활성은 활성화된 소구체에 첨가된 효소의 양에 의해 결정되고 3 ASU/g 건조양에 해당한다. 1 ASU (Amoxicillin Synthesis Unit)은 6-APA 와 HPGM 로부터 시간 당 1 g 의 아목시실린.3H2O을 생산하는 데 필요한 효소의 양으로 정의된다(20 ℃ ; 6.5 질량 % 6-APA 와 6.5 질량%HPGM).
실시예 1
변이된 페니실린아실라아제(R145L)
변이체의 제조
중합효소 연쇄 반응(PCR)에서, DNA 단편은 열순환으로 증폭된다. 이 목적을 위해서, 증폭된 단편(템플레이트)의 2 개 말단 중 하나의 DNA(E.coli)에 상보적인 각각의 2 프라이머를 사용한다. 프라이머가 템플레이트에 결합한 후, DNA 중합효소는 프라이머 템플레이트 복합체에 결합할 수 있고 DNA를 증폭한다.
열순환동안에 다음 공정을 수행한다:
단계 1: 94 ℃ 에서 배양: 이중 가닥 템플레이트가 녹아서 단일 가닥 템플레이트 DNA 가 형성된다.
단계 2: 55 ℃ 에서 배양 : 프라이머는 템플레이트의 상보 DNA에 부착한다.
단계 3: 72 ℃ 에서 배양 : 중합효소는 프라이머 템플레이트 복합체에 결합하고 DNA를 증폭한다.
3 단계를 여러 번 반복하여 단편은 프라이머 서열에 상보적인 서열이 측면에 위치하는 템플레이트 DNA에서 증폭되었다.
상기 기술된 PCR로 αR145L 변이가 생성되었다. 305 염기쌍의 단편이 다음 반응 혼합물의 도움으로 증폭되었다:
1 ㎕ 프라이머 R145Lfw (100 ng/㎕) : 5'-GAAGTGCTTGGCAAA-3'
1 ㎕ 프라이머 R145Lrv(100 ng/㎕) :
5'-TGCCAGATTATCGATTTCGCTAGTACTATCAGAGAACAAGTTTGCCAT-3'
(밑줄 그은 코돈은 L-류신을 암호화한다)
1 ㎕ 플라스미드 DNA, pEC(~ 20 ng/㎕ 스탁 용액)
2 ㎕ dNTPs (10 mM 스탁 용액)
10 ㎕ 10XPwo버퍼
1㎕Pwo중합효소
84 ㎕ H20
다음 온도 프로그램은 반응 혼합물을 가열하는 데 사용된다:
94 ℃ 에서 1분 동안 1싸이클, 94 ℃ 에서 1분 동안 후 55 ℃ 에서 1분 후, 72 ℃ 에서 1분 동안 가열하는 것을 25 싸이클, 72 ℃ 에서 5분 동안 1 싸이클
PCR 산물과 플라스미드 pEC 는 후속하여 제한 효소 ClaI 과 EcoRV 로 자른다. 2가지 산물을 아가로스 젤에 적용하고 Quiagen으로부터 Quiaex kit의 도움으로 정제한다. 정제 후 2개의 단편을 연결한다. 이는 다음 반응 혼합물을 사용하여 수행한다.
10 ㎕ PCR 산물을 H20에서EcoRV 와ClaI로 절단한다( 전체 300 ng DNA)
1 ㎕ 플라스미드 DNA 를 H20에서EcoRV 와ClaI 로 절단한다(전체 100 ng DNA)
2 ㎕ 라이게이션 버퍼
1 ㎕ 리가아제
6 ㎕ H2O
반응은 실온에서 16 시간동안 수행한다.
후속하여 10 ㎕의 이 반응 혼합물을 CaCl2컴피턴트E coliHB101을 형질전환하는 데 사용한다. Sambrooket al,'Molecular Cloning : a Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 에 기술된 표준 방법을 통해 형질전환을 수행한다. 사용된 모든 효소와 버퍼는 Boehringer Mannheim로부터 구입한다.
시퀀싱에 의해, 획득된 변이체가 원하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것이 확증되었다.
정제 프로토콜
재조합체 효소는 다음과 같이 획득되었다. 적절한 변이가 있는 페니실린 아실라아제에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드 pEC를 가진E. coli를 17 ℃, 150 rpm 에서 0.1 mM IPTG가 있는 LB 배지에서 배양한다. 광학 밀도 600 nm (OD 600)에서 10 분 동안 5000 x g 에서 원심분리하여 세포를 수거한다. 펠릿을 원래 부피의 1/10th로 얼음 냉각 버퍼 A (20% 수크로스, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mm EDTA)에서 재현탁한다. 그 다음 세포를 5000 x g에서 10분 동안 다시 원심분리한다. 펠릿을 얼음 냉각 버퍼 B(1 mM EDTA)에서 재현탁하고 10 분동안 5000 x g 에서 원심분리한다. 상청액은 주변형질 추출물이고 여기에 포스페이트 버퍼 pH 7.0 을 최종 농도 50 mM까지 첨가한다.
(NH4)2SO4를 최종 농도 1.5 M 까지 상청액에 순차적으로 첨가하고 그 후에 추출물을 20 분동안 10,000 x g에서 원심분리한다. 상청액을 Resource Phe (Amersham-Pharmacia Biotech)에 놓고 1.5 M-0 M(NH4)2SO4의 선형 구배로 용출한다. 정제된 효소의 최종 농도는 280 nm (A280)에서 흡광도를 측정하고(셀 길이 1 cm) 소화 계수 210. 000 M-1ㆍcm-1을 사용하여 결정한다.
플라스미드 pEC 는 도 1에 제시되어 있다.
고정된 Pen-G 아실라아제 변이체 R145L
변이된 페니실린 아실라아제 (α145L) 는 변이체 R145L 가 야생형E.coliPen-G 아실라아제 대신에 사용되었고 효소 로딩이 고정된 단백질을 기초로 각각 인자 0.87 (보통 로딩) 과 1.35 (높은 로딩)더 높은 것으로 선택된 것을 제외하고 AssemblaseTM에 대해 기술된 것과 같은 방식으로 고정되었다.
참조 실험 A
고정된 Pen-G 아실라아제 변이체 βF24A
변이된 페니실린 아실라아제(βF24A) 는 변이체 βF24A 가 야생형E. coliPen-G 아실라아제 대신에 사용되었다는 것을 제외하고 AssemblaseTM에 대해 기술된 것과 같은 방식으로 고정되었다. 효소 로딩은 고정된 단백질을 근거로 같게 선택되었다.
Assemblase TM (고정된 야생형 Pen-G 아실라아제)와 PGA로 세팔렉신의 합성
175 um 가제가 있는 체 바닥을 가진 효소 반응기 (100 ㎖)를 20 g 의 nett-wet AssemblaseTM으로 채웠다. 제조 반응기(100 ㎖)를 40.0 ml 물(T = 2 ℃), 0.10 g 중아황산염 나트륨, 10.8 g 7-ADCA (49.6 mmol) 및 7.1 g PGA (46.8 mmol)으로 채웠다. 0.45 g 농축된 암모니아를 첨가하고, 그 후 현탁액을 T = 2 ℃ 에서 15분 동안 젓는다. pH 는 7.8 이었다. 후속하여 현탁액을 t = 0 에서 10.0 ml 물의 도움으로(T = 2 ℃) 효소 반응기로 전달하였다. t = 0 에서, 효소 반응기에서 혼합기가 시작하였다. 온도는 T= 2 ℃에서 유지되었다. 약 90 분 후에, 모든 7-ADCA 가 용해되고; 그 후에, 고체 AssemblaseTM외에 맑은 액이 존재하였다.
166 분 후에, pH 는 8.80으로 상승하고, [PG] = 1. 10 질량%, 전환 = 70 % w. r. t. 초기 7-ADCA 양이고 S/H = 6.6 이었다. 초기 효소 활성은 -8.2 umol CEX/ (min ㆍmg 효소)로 계산되었다. 전환의 상관 관계로서 S/H 는 도 2에 제시되었다.
참조 실험 B
고정된 Pen-G아실라아제 변이체 βF24A 와 PGA 로 세팔렉신의 합성
참조 실험 A 와 유사한 효소 반응기를 고정된 Pen-G 아실라아제 변이체 βF24A 의 25.0 g nett-wet으로 채웠다. 제조 반응기를 40 ml 물(2 ℃), 0.10 중아황산염 나트륨, 10.0 g 7-ADCA (45.9mmol) 및 7.2 g PGA (47.5mmol)으로 채웠다. 0.45 g 암모니아를 첨가하였다. 조건은 참조 실험 A 에 더 기술되었다.
280 분 후에 pH 는 7.9로 상승하고, [PG] = 0.05 질량%, 전환 = 23 % w. r.t. 초기 7-ADCA 양이고 S/H = 33 이었다. 초기 효소 활성은 ~0.13 umol CEX/ (min ㆍmg 효소)로 계산되었다. 전환의 상관 관계로서 S/H 는 도 2에 제시되어 있다.
실시예 2
고정된 Pen-G 아실라아제 변이체 R145L (보통 로딩) 와 PGA 로 세팔렉신의 합성
참조 실험 A 에서와 유사한 효소 반응기를 20.0 g nett-wet 고정된 Pen-G 아실라아제 변이체(R145L, 보통 로딩)로 채웠다. 제조 반응기를 47.0 ml 물(2 ℃), 0.16 g 중아황산염 나트륨, 15.5 g 7-ADCA(70.9mmol) 및 11.5 g PGA (76.0mmol)으로 채웠다. 조건은 참조 실험 A에 더 기술되었다.
315 분 후에, pH 는 8.58로 상승하고, [PG] = 0.66 질량 %, 전환 = 81 % w. r. t. 초기 7-ADCA 양이고 S/H = 13.8 이었다. 초기 효소 활성은 -0.71 umol CEX/ (minㆍ mg 효소)로 계산되었다. 전환의 상관 관계로서 S/H 는 도 2에 제시되어 있다.
결과(도 2)는 야생형 Pen G 아실라아제 (참조 실험 A)과 비교하여 세팔렉신 합성에서 높은 전환(83%)과 조합하여 높은 S/H 비율(13.8)이 Pen-G 아실라아제 변이체 R145L (실시예1)로 획득된다는 것을 제시한다. Pen-G 아실라아제 변이체 βF24A (참조 실험 B)로, 오직 낮은 전환 (23%)이 획득된다. 추가로, Pen-G 아실라아제 변이체 R145L 의 초기 효소 활성은 야생형 Pen G 아실라아제의 8.8%인 반면, Pen-G아실라아제 변이체 βF24A 의 초기 효소 활성은 야생형 Pen G 아실라아제의 오직 1.6% 이다.
참조 실험 C
Assemblase TM (고정된 야생형 Pen-G 아실라아제) 와 PGA 로 암피실린의 합성
175 um 가제가 있는 체 바닥을 가진 효소 반응기 (750ml)를 150 g nett-wet AssemblaseTM로 채웠다.
제조 반응기 (600 ml)를 250 ml 물 (T = 10 ℃)과 71.6 g PGA (475 mmol)로 채웠다. T = 10 ℃ 에서, 65.8 g 6-APA (300mmol)의 적은 양을 15 분 동안 냉각하며 첨가하고 6N H2SO4로 적정하여 pH 는 7.0 로 유지한다. 혼합물을 T = 10 ℃ 에서 15분 동안 혼합하고 후속하여 t = 0 에서 50.0 ㎖ 물 (T = 10 ℃)의 도움으로 효소 반응기로 전달하였다. t = 0 에서, 효소 반응기에서 혼합기가 시작하였다. 6N H2SO4로 적정하여 pH 는 7.0 로 유지한다. 온도는 10 ℃에서 유지되었다.
t = 160 분에, 암피실린의 양은 최대이고 6N H2SO4를 첨가하여 pH 는 5.6 로 낮아졌다. t = 160 분에, 전환 = 91-92 % w.r.t 초기 6-APA 양이고 S/H = 1.67 이었다. 초기 효소 활성은 ~1.4 umol AMPI/ (minㆍ mg 효소)로 계산되었다. 전환의 상관관계로서 S/H 는 도 3에 제시되었다.
참조 실험 D
고정된 Pen-G 아실라아제 변이체 βF24A 와 PGA 로 암피실린의 합성
참조 실험 C 와 유사한 효소 반응기를 95.5 g nett-wet 고정된 Pen-G 아실라아제 변이체 βF24A로 채웠다. 제조 반응기(600 ㎖)를 200 ml 물(T =10 ℃), 30.0g 6-APA (139.0 mmol) 및 22.8 g PGA (140mmol)로 채웠다. pH 는 6.7 이었다. 혼합물을 T = 10 ℃에서 15 분 동안 젓고 후속하여 50.0 ml 물 (T= 10 ℃)의 도움으로 t = 0 에서 효소 반응기로 전달하였다. t = 0 에서 효소 반응기에서 혼합기가 시작하였다. 6N H2SO4로 적정하여 pH 는 6.7 로 유지한다. 온도는 10 ℃에서 유지되었다.
t = 300 분에 전환은 오직 11.1 % 이고 S/H 비율은 19.1 이었다. 초기 효소 활성은 -0. 057 umol AMPI/(min ㆍmg 효소)로 계산되었다. 전환의 상관관계로서 S/H 는 도 3에 제시되었다.
실시예 3
고정된 Pen-G 아실라아제 변이체 R145L 와 PGA 로 암피실린의 합성
참조 실험 C 과 유사한 효소 반응기를 90 g nett- wet 고정된 Pen-G아실라아제 변이체 R145L (보통 로딩)으로 채웠다. 그 다음 59.8 g PGA, 65.8 g 6-APA (300mmol) 및 225 ㎖ 물(T =10 ℃)을 첨가하고 15 분 동안 T =10 ℃ 에서 젓는다. 그 후 59.8 g PGA (397mmol)을 첨가한다(t = 0). 10 분 후에, 1.0 g 암피실린 3 수화물을 첨가하였다. 온도는 T = 10 ℃로 유지되었고 50% 아세트산으로 적정하여 pH 는 6.9 에서 유지되었다. 전체 43 ㎖ 50% 아세트산이 필요하다. t = 390 분에, 암피실린의 양은 최대이고 50% 아세트산을 첨가하여 pH 는 5.6 으로 낮아졌다.
t = 390 분에 암피실린의 양은 최대이고 50% 아세트산(또 다른 10ml)을 첨가하여 pH 는 5.6 로 낮아졌다. 사용된 6-APA 의 양에 대해 전환은 87-88% 이고 S/H 비율은 14.5 이었다. 초기 효소 활성은 ~0. 94 umol AMPI/ (minㆍ mg 효소)로 계산되었다. 전환의 상관 관계로서 S/H 는 도 3에 제시되었다.
결과는(도 3) Pen-G 아실라아제 변이체 R145L가 암피실린 합성에서 사용될 때, 야생형 Pen G 아실라아제(참조 실험 C)과 비교하여 높은 S/H 비율(14.5)가 높은 전환에서 획득되었음(실시예 II)을 제시한다. Pen-G 아실라아제 변이체 βF24A (참조 실험 D)로 오직 낮은 전환이 획득되었다. 추가로, Pen-G아실라아제 변이체 R145L의 초기 효소 활성은 야생형 PenG 아실라아제의 67% 인 반면에, Pen-G 아실라아제 변이체 βF24A 의 초기 효소 활성은 야생형 PenG 아실라아제의 오직 4% 이다.
<110> DSM IP ASSETS B.V. <120> PROCESS FOR THE PREPARATION OF A B-LACTAM ANTIBIOTIC <150> 1019667 <151> 2001-12-27 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 846 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli <400> 1 Met Lys Asn Arg Asn Arg Met Ile Val Asn Cys Val Thr Ala Ser Leu 1 5 10 15 Met Tyr Tyr Trp Ser Leu Pro Ala Leu Ala Glu Gln Ser Ser Ser Glu 20 25 30 Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met Pro His Ile Tyr Ala Asn 35 40 45 Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Val Val Ala Gln Asp 50 55 60 Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Thr Val 65 70 75 80 Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys Phe Asp Lys Asp Ile Arg 85 90 95 Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala Gln Ile Ala Ala Leu Ser 100 105 110 Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Gly Met Asn Ala 115 120 125 Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu Thr Leu Leu Pro Lys Gln 130 135 140 Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg Trp Glu Pro Phe Asp Val 145 150 155 160 Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ser Thr 165 170 175 Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys Thr 180 185 190 Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn Gln Leu Lys Trp Leu Val 195 200 205 Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val Gln Glu Ser Asn Tyr Pro 210 215 220 Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr Ala Ala Leu Leu Pro Arg 225 230 235 240 Tyr Asp Leu Pro Ala Pro Met Leu Asp Arg Pro Ala Lys Gly Ala Asp 245 250 255 Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Ala Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Ala 260 265 270 Ala Gln Phe Ala Gln Gly Gly Ala Asn Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Thr 275 280 285 Thr Ser Asn Met Trp Val Ile Gly Lys Ser Lys Ala Gln Asp Ala Lys 290 295 300 Ala Ile Met Val Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Tyr Ala Pro Ala Tyr 305 310 315 320 Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Tyr Asp Val Thr Gly Asn 325 330 335 Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Gly Leu Val Phe Gly His Asn Gly Val Ile 340 345 350 Ser Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala 355 360 365 Glu Arg Leu Ser Ala Glu Lys Pro Gly Tyr Tyr Leu His Asn Gly Lys 370 375 380 Trp Val Lys Met Leu Ser Arg Glu Glu Thr Ile Thr Val Lys Asn Gly 385 390 395 400 Gln Ala Glu Thr Phe Thr Val Trp Arg Thr Val His Gly Asn Ile Leu 405 410 415 Gln Thr Asp Gln Thr Thr Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Ser Arg Ala Trp 420 425 430 Asp Gly Lys Glu Val Ala Ser Leu Leu Ala Trp Thr His Gln Met Lys 435 440 445 Ala Lys Asn Trp Gln Glu Trp Thr Gln Gln Ala Ala Lys Gln Ala Leu 450 455 460 Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Val Asn Gly Asn Ile Gly Tyr Val 465 470 475 480 His Tyr Gly Ala Tyr Pro Asp Arg Gln Ser Gly His Asp Pro Arg Leu 485 490 495 Pro Val Pro Gly Thr Gly Lys Trp Asp Trp Lys Gly Leu Leu Pro Phe 500 505 510 Glu Met Asn Pro Lys Val Tyr Asn Pro Gln Ser Gly Tyr Ile Ala Asn 515 520 525 Trp Asn Asn Ser Pro Gln Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Asp Leu Phe Ala 530 535 540 Phe Leu Trp Gly Gly Ala Asp Arg Val Thr Glu Ile Asp Arg Leu Leu 545 550 555 560 Glu Gln Lys Pro Arg Leu Thr Ala Asp Gln Ala Trp Asp Val Ile Arg 565 570 575 Gln Thr Ser Arg Gln Asp Leu Asn Leu Arg Leu Phe Leu Pro Thr Leu 580 585 590 Gln Ala Ala Thr Ser Gly Leu Thr Gln Ser Asp Pro Arg Arg Gln Leu 595 600 605 Val Glu Thr Leu Thr Arg Trp Asp Gly Ile Asn Leu Leu Asn Asp Asp 610 615 620 Gly Lys Thr Trp Gln Gln Pro Gly Ser Ala Ile Leu Asn Val Trp Leu 625 630 635 640 Thr Ser Met Leu Lys Arg Thr Val Val Ala Ala Val Pro Met Pro Phe 645 650 655 Asp Lys Trp Tyr Ser Ala Ser Gly Tyr Glu Thr Thr Gln Asp Gly Pro 660 665 670 Thr Gly Ser Leu Asn Ile Ser Val Gly Ala Lys Ile Leu Tyr Glu Ala 675 680 685 Val Gln Gly Asp Lys Ser Pro Ile Pro Gln Ala Val Asp Leu Phe Ala 690 695 700 Gly Lys Pro Gln Gln Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Glu Asp Thr Trp 705 710 715 720 Glu Thr Leu Ser Lys Arg Tyr Gly Asn Asn Val Ser Asn Trp Lys Thr 725 730 735 Pro Ala Met Ala Leu Thr Phe Arg Ala Asn Asn Phe Phe Gly Val Pro 740 745 750 Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Arg His Gln Ala Glu Tyr Gln Asn Arg 755 760 765 Gly Thr Glu Asn Asp Met Ile Val Phe Ser Pro Thr Thr Ser Asp Arg 770 775 780 Pro Val Leu Ala Trp Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Ile 785 790 795 800 Ala Pro Asp Gly Thr Val Asp Lys His Tyr Glu Asp Gln Leu Lys Met 805 810 815 Tyr Glu Asn Phe Gly Arg Lys Ser Leu Trp Leu Thr Lys Gln Asp Val 820 825 830 Glu Ala His Lys Glu Ser Gln Glu Val Leu His Val Gln Arg 835 840 845 <210> 2 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli <400> 2 Glu Gln Ser Ser Ser Glu Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met 1 5 10 15 Pro His Ile Tyr Ala Asn Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly 20 25 30 Tyr Val Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg 35 40 45 Ser Thr Gln Gly Thr Val Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys 50 55 60 Phe Asp Lys Asp Ile Arg Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala 65 70 75 80 Gln Ile Ala Ala Leu Ser Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr 85 90 95 Ala Asp Gly Met Asn Ala Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu 100 105 110 Thr Leu Leu Pro Lys Gln Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg 115 120 125 Trp Glu Pro Phe Asp Val Ala Met Ile 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Lys Gln Asp Val Glu 530 535 540 Ala His Lys Glu Ser Gln Glu Val Leu His Val Gln Arg 545 550 555 <210> 4 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli <400> 4 Glu Gln Ser Ser Ser Glu Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met 1 5 10 15 Pro His Ile Tyr Ala Asn Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly 20 25 30 Tyr Val Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg 35 40 45 Ser Thr Gln Gly Thr Val Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys 50 55 60 Phe Asp Lys Asp Ile Arg Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala 65 70 75 80 Gln Ile Ala Ala Leu Ser Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr 85 90 95 Ala Asp Gly Met Asn Ala Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu 100 105 110 Thr Leu Leu Pro Lys Gln Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg 115 120 125 Trp Glu Pro Phe Asp Val Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn 130 135 140 Leu Phe Ser Asp Ser Thr Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr 145 150 155 160 Ala Leu Lys Asp Lys Tyr Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn 165 170 175 Gln Leu Lys Trp Leu Val Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val 180 185 190 Gln Glu Ser Asn Tyr Pro Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr 195 200 205 Ala

Claims (12)

  1. E. coli에서 기원한 페니실린 아실라아제의 α-서브유닛에서 위치 145에 대응하는 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 가지는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 아실라아제.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 145 위치에 있는 L-아르기닌이 L-류신, L-라이신 또는 L-시스테인으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 아실라아제.
  3. β-락탐 핵과 활성화된 측쇄로서 아미드로부터 β-락탐 항생제를 변이된 페니실린 아실라아제의 도움으로 효소적으로 제조하는 공정에서 사용될 때, 야생형E. coli페니실린 G 아실라아제가 같은 반응 조건에서 사용될 때 발견되는 초기 S/H 비율보다 적어도 약 2 배 높은 초기 S/H 비율을 초래하고, 같은 반응 조건에서 야생형E. coli페니실린 G 아실라아제 활성의 적어도 1 % 에 해당하는 효소 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 아실라아제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 페니실린 아실라아제는E. coli페니실린 아실라아제인 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 아실라아제.
  5. 변이 페니실린 아실라아제가 존재하면 활성화된 측쇄의 도움으로 β-락탐 핵이 아실화되고, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서 변이 페니실린 아실라아제 효소가 사용되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 아미드가 활성화된 측쇄로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, β-락탐 항생제는 세팔로스포린인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, β-락탐 항생제는 페니실린인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 변이 페니실린 아실라아제를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  10. 숙주 세포에서 핵산 서열의 발현에 적절한 기능적으로 연결된 프로모터를 가지고 제 9 항에 정의된 바와 같은 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터.
  11. 제 10항에 있어서, 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 변이 페니실린 아실라아제의 생산에 적절한 조건에서 배양되는 것을 특징으로 하는 변이 효소의 제조 방법.
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