KR20040039444A - 인간 응고 인자 ⅶ 폴리펩티드 - Google Patents
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
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Abstract
본 발명은 폴리뉴클레오티드, 약제 성분, 치료제의 사용 및 방법을 포함하는 폴리펩티드, 벡터 및 숙주 세포를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구조물과 응고 활성을 가지는 신규 인간 응고 인자 Vlla 폴리펩티드에 관련된다.
Description
혈액 응고는 피브린 응고가 되게 하는 다양한 혈액 성분(또는 인자)의 복잡한 상호 작용으로 구성된 과정이다. 일반적으로, 응고 "연속단계"로 언급되는 것에 참여하는 혈액 성분은 활성제(자체 활성화된 응고 인자)의 활성에 의해 단백질 분해 효소로 전환되는 효소적으로 비활성 단백질(효소전구체 또는 지모겐)이다. 그러한 변환을 겪은 응고 인자는 "활성 인자"으로 일반적으로 언급되고, 응고 인자의 이름(인자Vlla)에 철자 "a"를 추가하여 지정된다.
지혈 과정의 개시는 관 벽의 손상의 결과로 노출된, 조직 인자 사이의 복합체의 형성으로 중재된다. 이 복합물은 인자 IX와 Ⅹ를 활성 형태로 전환한다. 인자 Xa는 조직 인자를 가진 세포에서 제한된 양의 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환한다. 트롬빈은 혈소판을 활성화하고 인자 V와 Vll을 인자Va와 인자Vllla로 활성화하며 이 두 인자는 다음 공정에서 충분하게 트롬빈이 파열된다. 이 과정은 인자 IXa에 의한 인자Xa의 생성(인자Vllla와 복합물에서)을 포함하고 활성화된 혈소판의표면에서 발생한다. 트롬빈은 최종적으로 피브리노겐을 피브린으로 전환하여 피브린 응고물을 형성한다. 최근에 인자VII와 조직 인자는 혈액 응고의 주요한 개시자로 발견되었다.
인자VII는 단일 체인 지모겐으로서 혈액내에서 순환하는 미량 플라스마 당단백질이다. 지모겐은 촉매적으로 비활성이다. 단일 체인 인자VII는 인자Xa, 인자Xlla, 인자IXa, 인자Vlla 또는 시험관 내 트롬빈에 의해 두 개의 사슬 인자Vlla로 전환된다. 인자Xa는 인자VII의 주요 생리적 활성제인 것으로 알려졌다. 지혈에 관련된 여러 다른 플라스마 단백질같이, 인자VII은 단백질의 아미노 말단에 인접하여 모인 다중 글루타민산 잔기의 감마 카르복시화에 요구되는 활성을 위해 비타민K에 의존한다. 이 감마-카르복시화한 글루타민산은 인자VII와 인지질과의 금속 이온-유도된 상호작용을 위해 요구된다. 내부 Arg152-lle153펩티드 결합의 절단에 의해 지모겐 인자VII가 활성화된 2 사슬 분자로 전환된다. 조직 인자, 인지질, 칼슘 이온이 있을 때, 두 개의 사슬 인자 Vlla는 제한된 단백질 분해에 의하여 인자Ⅹ 또는 인자IX을 활성화한다.
시험체에서 응고 연속단계를 자극하거나 개량하는 것이 바람직하다. 인자Vlla는 응고 인자 결핍(예를들면, 혈우병 A 와 B 또는 응고 인자 XI 또는 VII의 결핍) 또는 응고 인자 억제제와 같은 여러 원인이 있는 출혈 질병을 조절하기 위하여 이용되어 왔다. 인자 Vlla은 또한 정상적으로 작용하는 혈액 응고 일련반응이 있는 시험체에서 발생하는 과다 출혈을 조절하기 위하여 이용되어 왔다 (어떤응고 인자에 대한 인자 결핍 또는 억제제가 없는). 그런 출혈은 예를 들어, 불완전한 혈소판 기능, 혈소판 감소증 또는 von Willebrand's 질병에 의해 유도될 수 있다. 출혈은 조직 손상의 수술 그리고 다른 형태와 관련하여 또는 중요한 문제 이다.
유럽 특허 No 200,421 (Zymo Genetics)은 인간 요소Vll을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 포유동물 세포에서 인자Vll의 재조합체 발현에 관련된다.
Dickinson 등(Proc.Natl.Acad. Sci. USA (1996)93, 14379-14384)은 Leu305이 Ala(FVII(Ala305)에 의해 치환된 인자 Ⅶ 변이체와 관련된다.
Iwanaga. (Thromb. Haemost. (supplement August 1999), 466, abstract 1474)는 잔기 316-320가 삭제되거나 잔기 311-322가 트립신 유래의 해당 잔기로 치환하는 인자Vlla 변이체와 관련된다.
응고 활성을 가진 인자 Vlla의 낮은 투약량으로 투입될 수 있는 높은 활성을 가진 변이체와 각각 기존의 치료와 관련되는 응고 시스템과 출혈의 조직적인 활성화와 같은 바람직하지 않는 부작용을 가져오지 않는 변이체에 대한 필요가 있다.
본 발명은 응고 활성을 가지는 신규 인간 응고 인자 Vlla 폴리펩티드, 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구조물, 벡터, 폴리펩티드를 포함하고 발현하는 숙주 세포, 약제 조성물, 사용 및 치료 방법과 관련된다.
아미노산 Leu305와 Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296, Met298로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인간 응고 인자 Vlla 폴리펩티드 변이체가 야생형 인간 응고 인자Vlla와 비교해 응고 활성을 증가시켰음이 발견되었다.
여기에 사용한 용어 "다른 아미노산"은 그 위치에 자연적으로 존재하는 아미노산과 다른 아미노산을 의미한다. 이것은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화 될 수 있는 아미노산을 포함하지만 제한하지 않는다. 바람직하게 다른 아미노산은 자연적인 L-형태이고 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화 될 수 있다. 특이적 실시예는 L-시스테인(Cys)이다.
여기에 사용되는 용어 "활성"은 그것의 기질 인자X를 활성적 인자Xa로 전환하는 인자VII폴리펩티드의 능력을 의미한다. 인자Vll폴리펩티드의 활성은 "시험관 내 단백질 분해 검정" 에서 측정한다(실시예 6 참조).
용어 "고유한 활성"은 또한 조직 인자가 없을 때 활성화된 혈소판의 표면에서 트롬빈을 생성하는 능력을 포함한다.
Leu305은 활성에 중요하다고 여겨지는 인자Vlla의 조직 인자-복합된 형태에서 발견되는 α-나선의 말단에 위치한다. 자유로운 인자 Vlla (조직 인자에 결합하지 않는 인자Vlla)에서 나선은 뒤틀리고 불안정하다. 본 발명에 따르면 폴리펩티드 변이체는 조직 인자에 의해 정상적으로 유도되어야 하는 활성적 입체구조를 달성한다. 야생형 유형 인자 Vlla와 비교하여 폴리펩티드 변이체의 증가한 활성은 α-나선의 안정화, 나선의 재배치 또는 입체구조에서 약간 다른 변화 때문이다. Leu305의 치환은 나선의 재배치 및/또는 안정화를 유도한다.
Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296, Met298을 포함하는 아미노산은 프로테아제 도메인의 아미노 말단의 삽입에 영향을 주고 Ile153의 아미노 말단과 Asp343의 곁사슬과의 염다리에 의존하는 인자Vlla의 촉매적으로 활성적인 입체구조의 형성에 영향을 미친다. 치환은 전기안정적 반발력을 제거하고, 수소결합을 첨가하거나 아미노 말단의 삽입을 촉진한다.
본래 FVlla와 비교하여 기술된 인자Vlla 폴리펩티드 변이체의 더 높은 고유한 활성 때문에, 적은 투여량은 활동의 부위에서 기능적으로 충분한 농도를 얻기에 적합하고 출혈 에피소드가 있거나 정상적인 지혈 시스템의 증진을 필요로 하는 시험체에서 낮은 투약량을 투여하는 것이 가능하다.
위치 157에서 Lys, 위치 337에서 Lys, 위치 158에서 Val, 위치 296에서 Glu, 위치 298에서 Met, 위치 334에서 Asp, 위치 336에서 Ser 중 하나 또는 그 이상과 조합하여 아미노산 Leu305을 치환해서, 인자 Vlla은 자발적으로 조직 인자에 의해 정상적으로 유도되어야 하는 더 활성적인 구조를 달성한다. 그러한 인자 Vlla 폴리펩티드 변이체는 예를 들면, NovoSeven ®이 과다 투여될 때와 같이 응고 활성이 조직 인자(혈소판 표면에서 인자Xa의 생성)와 독립적인 상황에서 치료적으로 유용한 고유한 활성을 나타낸다.
추가적 구체예에서, 프로테아제 도메인에서 아미노산을 추가적으로 치환하면
분자의 활성적 입체구조의 형성을 더 촉진한다. 하지만, 상기 언급된 돌연변이가 이러한 후자 7개 아미노산의 영역(후속 또는 3차원)에서 실행될 때 가장 뚜렷한 효과가 나타난다고 믿어진다.
본 발명은 인자 Vlla의 N-말단 Gla 도메인에 있는 소수의 아미노산을 (SEQ ID NO:1의 1-37에 해당하는 위치에 있는 아미노산)치환하면 혈소판의 조직 인자 함유 세포의 막 인지질과 같은 막 인지질에 대한 실질적으로 높은 친화성을 단백질에 제공할 수 있고 향상된 응고 효과를 가진 인자VII폴리펩티드 변이체를 생성한다.
따라서, 위치 157, 158, 296, 298, 334, 336, 337 에서 치환과 조합하여 위치 305에서 이미 수행된 아미노산 치환과 프로테아제 도메인의 다른 곳에서 선택적인 아미노산 치환에 추가로 상기 언급된 인자 Vlla 폴리펩티드 변이체는 N말단 Gla 도메인에서 치환된 적어도 하나의 단백질을 가지고, 본래 인자 Vll와 비교하여 막인지질에 대한 증가된 친화도와 증가된 활성을 가지는 단백질을 획득할 수 있다. 바람직하게 인자VII의 위치 10과 32(SEQ ID NO:1을 참고)에 있는 아미노산은 다른 아미노산으로 치환된다. 상기 언급된 위치에 통합된 바람직한 아미노산의 예는 다음과 같다: 위치 10의 Pro 아미노산은 Gln, Arg, His, Gln, Asn 또는 Lys에 의해 치환된다; 그리고/또는 위치32에서 아미노산 Lys은 Glu, Gln 또는 Asn에 의해 치환된다. 비타민K에 의존하는 플라스마 단백질의 다른 인지질 친화력을 근거로, Gla 도메인에서 다른 아미노산은 치환을 위해 고려된다.
용어 "N말단 Gla-도메인"은 인자 VII의 아미노산 서열 1-37을 의미한다.
세 문자 지시 "GLA"는 4-카르복시 글루탐산(γ-카르복시 글루탐산)을 의미한다.
용어 "프로테아제 도메인"은 인자 VII(인자Vlla의 중쇄)의 아미노산 서열 153-406을 의미한다.
여기에 사용된 바와 같이 용어 "인자 VII 폴리펩티드"는 본래 인간 요소VII(SEQ ID NO:1) 또는 변이체의 아미노산 서열 1-406을 함유하는 어떤 단백질을 의미한다. 이는 인간 인자VII, 인간 요소 Vlla 및 변이체를 포함하지만 제한하지 않는다.
여기에 사용된 바와 같이 용어 "인자VII"는 활성화된 두 개의 체인 인자Vll 분자(인자Vlla)뿐만 아니라 비활성 한 개의 체인 지모겐 인자 Vll 분자를 포함한다. 이는 본래 인간 인자 Vll 또는 인자 Vlla의 아미노산 서열 1-406을 가지는 단백질을 포함한다. 이는 또한 단백질이 실질적으로 인자Vlla의 활성을 유지하는 한 약간 변경된 아미노산 서열을 가지는 단백질, 예를 들어 N-말단 아미노산 삭제 또는 첨가를 포함한 변경된 N-말단을 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이 용어 "인자Vlla" 또는 "FVlla"는 활성화된 형태(인자Vlla)로 구성된 산물을 의미한다. 상기 정의 내의 "인자Vll" 또는 "인자Vlla" 는 개인마다 존재하고 발생하는 자연적 대립 형질 변이를 포함한다. 또한 글리코실레이션의 정도와 위치 또는 다른 번역후 변경은 선택된 숙주 세포와 선택된 숙주 세포 환경의 성질에 따라 변경된다.
여기에 사용된 것과 같이 용어 "변이체" 또는 "변이체들"은 SEQ ID NO:1의 서열을 가진 서열을 가진 인자 FVII을 지정하고 여기서, 부모 단백질의 하나 또는 그 이상의 다른 아미노산으로 치환하고/또는 부모 단백질의 하나 또는 그 이상의 다른 아미노산이 삭제되고/또는 하나 또는 그 이상의 다른 아미노산이 단백질에 삽입되고/또는 하나 또는 그 이상의 다른 아미노산이 부모 단백질에 첨가된다. 그러한 첨가는 부모 단백질의 N-말단과 C-말단 또는 양쪽에서 발생할 수 있다. 이 정의 내의 "변이체" 또는 "변이체들"은 활성화된 형태로 FVII활성을 가진다. 한 구체예에서 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 70 % 동일하다. 한 구체예에서 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 80 % 동일하다. 다른 구체예에서 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 90 % 동일하다. 진보된 구체예에서 변이체는 SEQ ID NO의 서열과 95 % 동일하다:
첫번째 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO :1의 아미노산 서열에 대해 적어도 두 개의 치환을 포함하는 인자 Vlla 폴리펩티드와 관련되고, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환하고; (ⅱ) K157, K337, D334, S336, V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다.
두번째 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO :1의 아미노산 서열에 대해 두개가 치환된 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드와 관련되고, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환하고; (ⅱ) K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 한 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다.
세번째 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 세 개가 치환된 인자Vlla 폴리펩티드와 관련되고, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환하고; (ⅱ) K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 두 개의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다.
추가 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 네개가 치환된 인자Vlla 폴리펩티드와 관련되고, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환하고; (ⅱ) K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 세 개의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다.
추가 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 다섯 개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드와 관련되고, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys305를 다른 아미노산으로 치환하고; (ⅱ) K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 네 개의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다.
추가 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 여섯 개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드와 관련되고, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환하고; (ⅱ) K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 다섯 개의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다.
추가 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 일곱 개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드와 관련되고, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환하고; (ⅱ) K157, K337, D334, S336, V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 여섯 개의 아미노산을 하나 또는 그 이상의 아미노산으로 치환한다.
추가 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 여덟 개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드와 관련되고, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환하고; (ⅱ) K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다.
추가 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 적어도 두 개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드를 암호화하는 인자Vlla 폴리펩티드와 관련되고, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환하고; (ⅱ) K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다.
용어"구조물"은 해당 폴리펩티드를 암호화하는 완전한 또는 부분적인 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 서열에 근거한 폴리뉴클레오티드 단편를 지적한것을 예정했다. 구조물은 선택으로 다른폴리뉴클레오티드 단편을 나타낸다. 구조물은 선택적으로 다른 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 유사한 방식으로, 폴리뉴클레오티드 구조물에 의해 암호화 될 수 있는 폴리뉴클레오티드 구조물은 상기 언급된 폴리뉴클레오티드 구조물에 의해 암호화될 수 있는 즉 Ala, Val,Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp, Gln와 같은 아미노산을 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명은 인자 VII폴리펩티드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드 구조물을 함유하는 재조합체 벡터를 제공한다. 여기에 사용되는 것과 같이 용어"벡터"는 숙주 세포에서 증폭할 수 있는 핵산 실재물을 의미한다. 따라서, 벡터는, 플라스미드와 같이 복제가 염색체 복제와 독립적인 염색체 외부 실재물로 존재하는 자치적으로 복제하는 벡터이다. 대안적으로, 숙주 세포로 도입되었을 때, 벡터는 숙주 세포 게놈으로 통합되고 통합된 염색체와 함께 복제하는 것이다. 벡터의 선택은 도입된 숙주 세포에 종종 의존한다. 벡터는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 또는 코스미드벡터를 포함하지만 제한하지 않는다. 벡터는 대개 복제 원점과 적어도 하나의 선택가능한 유전자, 즉, 쉽게 검출가능하거나 이것의 존재가 세포 성장에 필수적인 산물을 암호화는 유전자를 함유한다.
추가 양상에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드구조물 또는 벡터를 함유하는 재조합체 숙주 세포를 제공한다. 한 구체예에서 재조합체 숙주 세포는 진핵 세포이다. 다른 구체예에서 재조합체 숙주 세포는 포유동물 기원이다. 추가 구체예에서 재조합체 숙주 세포는 CHO세포, HEK세포 및 BHK세포로 구성된 군에서 선택된다.
여기에서 사용된 바와 같이 용어 "숙주 세포"는 이종DNA가 발현될 수 있는 하이브리드 세포를 포함한 어떤 세포를 나타낸다. 전형적인 숙주 세포는 BHK, CHO, HEK, 및 COS세포와 같은 인간 세포를 포함한 곤충 세포, 효모 세포, 포유동물 세포를 포함하지만 제한하지 않는다. 본 발명을 실행할 때, 배양되는 숙주 세포는 제한없이, CHO(예를들면, ATCC CCL61), COS-1(예를들면, ATCC CRL1650), 어린 햄스터 신장(BHK) 및 HEK293(예를들면, ATCC CRL1573; Graham et al.,J.Gen. Virol. 36: 59-72,1977)세포주를 포함한 바람직하게 포유동물 세포, 더 바람직하게 설정된 포유동물 세포주이다. 바람직한 BHK세포주는 BHK570 세포로 언급되는 tk-ts 13BHK세포주이다 (Waechter and Basera,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110,1982). BHK 570 세포주는 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852에서 ATCC accession number CRL 10314로 구입가능하다. tk-ts13 BHK 세포주는 ATCC 로부터 accession number CRL 1632 로 구입가능하다. 다른 적절한 세포주는 제한없이 Rat Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600), RatHepII (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 인간 폐(ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), DUKX 세포 (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220,1980)를 포함한다. 3T3 세포, Namalwa 세포, 골수종과 다른 세포와 골수종의 융합도 유용하다.
추가 양상에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 구조물을 함유하고 발현하는 유전자도입 동물을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 구조물을 함유하고 발현하는 유전자 도입 식물을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 발명의 인자 Vll 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법 즉 폴리뉴클레오티드 구조물의 발현을 허용하고 형성된 폴리펩티드를 배양 매체에서 회수하는 조건에서 적절한 성장 배지에서 폴리뉴클레오티드 구조물을 함유하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법과 관련된다.
여기에서 사용된 바와 같이 용어 "적절한 성장 배지"는 세포의 성장과 본 발명의 인자VII폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 서열 발현에 요구되는 양분과 다른 성분을 함유하는 배지를 의미한다.
추가 양상에서, 본 발명은 인자Vll 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법, 즉 유전자도입 동물에 의해 생성되는 우유로부터 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 방법과 관련된다.
추가 양상에서, 본 발명은 인자Vll 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법, 즉 유전자도입 식물의 세포를 배양하고 형성된 식물로부터 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 방법과 관련된다.
추가 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 적어도 두개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드를 포함하는 약학적 성분과 관련되고 여기서, 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환; (ⅱ) K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산으로 치환이다.
추가 양상에서, 본 발명은 약제를 제조하기 위해 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 적어도 두개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드의 사용과 관련되고 여기서, 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환; (ⅱ) K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다. 한 구체예에서 약물은 출혈 질환, 출혈 에피소드의 치료 또는 정상적인 지혈 시스템의 향상을 위한 것이다. 한 구체예에서 사용은 혈우병 A 또는 B의 치료를 위힌 것이다.
본문에서, 용어 "치료"는 출혈을 방지 또는 최소화하기 위한 목적으로 수술과 같은 예측된 출혈의 예방과 외상과 같은 이미 발생한 출혈을 조절하는 것을 모두 포함하는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면 인자Vlla 폴리펩티드의 예방 투여는 용어 "치료" 내에 포함된다.
용어"출혈 에피소드"는 억제되지 않는 과량 출혈을 의미한다. 출혈 에피소드는 수술과 조직 손상의 다른 형태와 관련한 중요한 문제이다. 억제되지 않는 과량 출혈은 정상적인 응고 시스템이 있는 시험체와 응고 또는 출혈 질환을 가진 시험체에서 발생한다. 여기에서 사용된 바와 같이 용어 "출혈 질환"은 출혈에서 명백한 세포 또는 분자 기원의 선천적, 획득되거나 유도된 결점을 반영한다. 예는 응고 인자 결핍(예를들면 혈우병 A와B 또는 응고 인자 XI 또는 VII의 부족), 응고 인자 억제제, 불완전한 혈소판 기능, 혈소판 감소증 또는 von Willebrand질병이다.
과다출혈은 정상적으로 기능하는 혈액 응고 일련반응(응고 인자 어느 것에대한 응고 인자 결핍 또는 억제제)을 가진 시험체에서 생기거나 불완전한 혈소판 기능, 혈소판 감소증 또는 Willebrand 질병에 의해 야기된다. 그러한 경우에, 혈우병에서처럼, 지혈 시스템은 비정상적 필수 응고 "화합물" (혈소판 또는 von Willebrand인자 단백질과 같은)이 없거나 가지기 때문에 출혈은 혈우병에 의해 야기된 출혈과 같은 것이다. 수술 또는 심한 외상과 관련하여 심한 조직 손상을 경험하는 시험체에서, 정상적인 지혈 메카니즘은 즉시 지혈이 되어야 하고 정상적인 지혈 메카니즘에도 불구하고 출혈이 발생할 것이다. 혈관의 생리적 수축 및 응고 또는 외과적 수단에 의한 지혈이 매우 필요하여도 그들은 정상적인 지혈 메카니즘에도 불구하고 출혈이 진전될 수 있다. 외과적인 지혈에 대한 제한된 가능성이 있는 두뇌, 내이 지역 및 눈과 같은 기관에서 출혈이 생길 때 만족스러운 지혈을 달성하는 것은 문제이다. 복강경 수술 뿐만 아니라 각종 기관(간, 폐, 종양 조직, 위장 지역)에서 생검을 얻는 과정에서 같은 문제가 발생할 것이다. 출혈이 심한 경우(출혈성 위염과 심한 자궁 출혈) 수술 기법(봉합, 클립 등)으로 지혈을 제공하는 어려움은 모든 상황에서 공통적이다. 급성과 심한 출혈 또는 항응고 치료에서 손상된 지혈이 주어진 치료법에 의해 유도되는 시험체에서 발생한다. 그러한 시험체는 항응고 효과가 빨리 중화되는 경우에 수술적 시술이 필요하다. 만족스럽지 못한 지혈의 경우에 문제를 야기하는 다른 상황은 정상적 지혈 메카니즘을 가진 시험체가 혈전 색전증을 방지하기 위한 항응고 치료를 받을 때이다. 그러한 치료는 아스피린과 다른 혈소판 응고 억제제뿐만 아니라 헤파린, 프로테오글리칸의 다른 형태, 와파린 또는 K-길항제의 다른 형태를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 출혈은 혈우병과 관련된다. 다른 구체예에서, 출혈은 획득된 억제제를 가진 혈우병과 관련된다. 다른 구체예에서, 출혈은 혈소판 감소증과 관련된다. 다른 구체예에서, 출혈은 von Willebrand질병과 관련된다. 다른 구체예에서, 출혈은 가혹한 조직 손상과 관련된다. 다른 구체예에서, 출혈은 가혹한 외상과 관련된다. 다른 구체예에서, 출혈은 수술과 관련된다.
다른 구체예에서, 출혈은 복강경수술과 관련된다. 다른 구체예에서, 출혈은 출혈성 위염과 관련된다. 다른 구체예에서, 출혈은 심한 자궁 출혈이다. 다른 구체예에서, 출혈은 기계적인 지혈에 대한 제한된 가능성을 가진 기관에서 발생한다. 다른 구체예에서, 출혈은 뇌, 내이 지역 또는 눈에서 생긴다. 다른 구체예에서, 출혈은 생검을 획득하는 과정과 관련된다. 다른 구체예에서, 출혈은 항응고약 치료와 관련된다.
여기서 사용된 용어 "시험체"는 동물, 인간과 같은 특히 포유동물을 의미하고 적절하게 용어"환자"와 상호교환적으로 사용된다.
용어" 정상적인 지혈 시스템의 향상"은 트롬빈을 생성하는 능력의 향상을 의미한다.
추가 양상에서, 본 발명은 시험체에서 출혈 질환 또는 출혈 에피소드의 치료 또는 정상적 지혈 시스템의 향상을 위한 방법, 즉 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 적어도 두개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드의 치료적 또는 예방적으로 효과적인 양을 필요로 하는 시험체에 투여하는 것을 포함하는 방법과 관련되고 여기서, 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305를 다른 아미노산으로 치환; (ⅱ) K157,K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된다.
추가 양상에서, 본 발명은 약물로서 사용하기 위한 발명의 인자VII폴리펩티드와 관련된다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 L305이 다른 아미노산과 치환하고 K337이 어떤 다른 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 L305이 어떤 다른 아미노산에 치환하고 K337이 어떤 다른 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 L305이 어떤 다른 아미노산에 치환하고 D334가 어떤 다른 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 L305이 어떤 다른 아미노산에 치환하고 S336이 어떤 다른 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 L305이 어떤 다른 아미노산에 치환하고 V158이 어떤 다른 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII폴리펩티드는 L305이 어떤 다른 아미노산에 치환하고 E296이 어떤 다른 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII폴리펩티드는 L305이 어떤 다른 아미노산에 치환하고 M298이 어떤 다른 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII폴리펩티드는 프로테아제 도메인의 남아있는 부위에서 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII폴리펩티드는 프로테아제 도메인의 남아있는 부위에서 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 프로테아제 도메인의 남아있는 부위에서 최대한 20개 추가 아미노산이 다른 아미노산으로 치환하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1의 159-170에서 선택된 위치에서 아미노산에 대응하는 적어도 한 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1의 290-304에서 선택된 위치에서 아미노산에 대응하는 적어도 한 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 R304가 Tyr, Phe, Leu, Met로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1의 306-312에서 선택된 위치에서 아미노산에 대응하는 적어도 한 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 M306이 Asp와 Asn으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 D309가 Ser과 Thr로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1의 330-339에서 선택된 위치에서 아미노산에 대응하는 적어도 한 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 A274가 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 A274가 Met,Leu,Lys,Arg로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 K157이 Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 상기 K337이 Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 상기 D334가 Gly와 Glu로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 상기 S336이 Gly와 Glu로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 상기 V158이 Ser, Thr,Asn, Gln, Asp, Glu로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 상기 E296이 Arg, Lys,Val로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 상기 EM298이 Lys, Arg, Gin, Asn로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 상기 L305가 Val, Tyr, Ile로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 상기 L305가 Val로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 아미노산이 폴리뉴클레오티드 구조물에 의해 암호화될 수 있는 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 인간 인자 VII인 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 인간 인자 Vlla인 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 폴리펩티드이고 "시험관 내 가수분해 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자VII폴리펩티드의 활성과 SEQ ID NO:1에 제시된 본래 인자Vlla 폴리펩티드의 활성 사이의 비율은 적어도 약 1.25이다. 한 구체예에서 "시험관 내 가수분해 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자VII폴리펩티드의 활성과 SEQ ID NO:1에 제시된 본래 인자Vlla 폴리펩티드의 활성 사이의비율은 적어도 약 2.0이다. 추가 구체예에서 "시험관 내 가수분해 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자 VII폴리펩티드의 활성과 SEQ ID NO:1에 제시된 본래 인자 Vlla 폴리펩티드의 활성 사이의 비율은 적어도 약 4.0이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII폴리펩티드는 폴리펩티드이고 "시험관 내 단백질 분해 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자VII폴리펩티드의 활성과 SEQ ID NO:1에 제시된 본래 인자Vlla 폴리펩티드의 활성 사이의 비율은 적어도 약 1.25이다. 한 구체예에서 "시험관 내 단백질 분해 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자VII폴리펩티드의 활성과 SEQ ID NO:1에 제시된 본래 인자Vlla 폴리펩티드의 활성 사이의 비율은 적어도 약 2.0이다. 추가 구체예에서 "시험관 내 단백질분해 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자VII폴리펩티드의 활성과 SEQ ID NO:1에 제시된 본래 인자Vlla 폴리펩티드의 활성 사이의 비율은 적어도 약 4.0이다. 추가 구체예에서 "시험관 내 단백질분해 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자VII폴리펩티드의 활성과 SEQ ID NO:1에 제시된 본래 인자Vlla 폴리펩티드의 활성 사이의 비율은 적어도 약 8.0이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 적어도 두개의 치환을 포함하는 인간 FVII로, 상기 치환은 (ⅰ) L305V이고 ; (ⅱ) K157X1, K337A,D334X2, S336X3,V158X4, E296V, M298Q로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이고 X1은 Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp, 또는 Glu;X2는 Gly 또는 Glu;X3는 Gly 또는 Glu ;X4는 Thr 또는 Asp이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 L305V/K337FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Vll 폴리펩티드는 L305V/V158D FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Ⅶ폴리펩티드는 L305V/E296FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Vll 폴리펩티드는 L305V/M298FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자Vll 폴리펩티드는 L305V/V158T- FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자Vll 폴리펩티드는 L305V/K337A/V158T-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 L305V/K337A/M298Q-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Ⅶ폴리펩티드는 L305V/K337A/E296V-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는L305V/K337AN1 58D-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자Vll 폴리펩티드는 L305V/V158D/M298Q-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 L305VN158D/E296V-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Vll 폴리펩티드는 L305VN1 58T/M298Q-FVI1이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Vll 폴리펩티드는 L305VN1 58T/E296V-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Ⅶ폴리펩티드는 L305V/E296V/M298Q-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자Vll 폴리펩티드는 L305VN158D/E296V/M298Q-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 L305V/V158T/E296V/M298Q
-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는L305VN1 58T/K337A/M298Q
-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Vll 폴리펩티드는L305VN158T/E296V/K337A-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Ⅶ폴리펩티드는L305VN158D/K337A/M298Q
-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Vll 폴리펩티드는L305V/E296V/M298Q/K337A
-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자 Ⅶ폴리펩티드는 L305VN158D/E296V/K337A-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자VII 폴리펩티드는 L305VN158D/E296V/M298Q/
K337A-FVII이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 인자Vll폴리펩티드는 L305VN158T/E296V/M298Q/
K337A-FVII이다.
추가 양상에서, 본 발명은 본래 인간 응고인자 Vlla와 비교하여 조직 인자 독립적인 활성을 증가시킨 인간 응고인자 Vlla 폴리펩티드를 제공한다. 다른 양상에서, 증가된 활성은 기질 특이성에서 변화를 수반하지 않는다. 본 발명의 다른 양상에서, 조직 인자에 폴리펩티드 변이체의 결합은 손상되지 않아야 하고 폴리펩티드 변이체는 조직 인자에 결합할 때 적어도 야생형 인자Vlla의 활성을 가져야 한다.
이 기술서에서 이용되는 아미노산 치환에 대한 용어는 다음과 같다. 첫번째 문자는 SEQ ID NO:1의 위치에 존재하는 아미노산을 나타낸다. 다음 수는 SEQ ID NO:1에서 위치를 나타낸다. 두번째 문자는 자연적인 아미노산을 다른 아미노산으로 치환된 것을 나타낸다. 예는 발린에 의해 SEQ ID NO:1의 위치 305에 있는 루신 L305V/K337A-FVII이 발린으로 치환하고 SEQ ID NO:1의 위치 337에 있는 리신은 알라닌으로 치환하고, 같은 인자 VII폴리펩티드 변이체에서 양쪽 변이등이다.
본문에서, 아미노산의 3 문자 또는 1 문자 표시는 표 1에서 제시된 것과 같이 통상적인 의미로 사용되었다. 명백하게 지시되지 않는 한, 여기서 언급된 아미노산은 L-아미노산이다. 그리고, 펩티드의 아미노산 서열의 왼쪽과 오른쪽 말단은 특별한 다른 규정이 없는한 각각, N-과 C-말단이다.
인자VII 폴리펩티드 변이체의 제조
본 발명은 또는 상기 언급된 바와 같이 인간 인자VII 폴리펩티드 변이체를 제조하는 방법과 관련된다. 여기에서 언급된 인간 인자VII 폴리펩티드 변이체는 재조합체 핵산 기술을 수단으로 형성된다. 일반적으로, 클론된 야생형 인자VII 핵산 서열은 원하는 단백질을 암호화하기 위해 변경된다. 이 변경된 서열은 그 다음 발현 벡터로 삽입되고 이것은 숙주 세포로 형질전환 또는 전달감염된다. 고등 진핵 세포, 특히 배양된 포유류 세포는 숙주 세포로 바람직하다. 인간인자II에 대한 완전한 뉴클레오티드와 아미노산 서열이 알려져 있다( U. S. 4,784, 950, 재조합체인간 인자 Vll의 클로닝과 발현이 기술됨). 소 인자 Vll 서열은 (Takeya et al., J.Biol. Chem. 263: 14868-14872 (1988))에 기술되어 있다.
아미노산 서열 변경은 다양한 기술을 수반하여 수행된다. 핵산 서열의 변경은 부위특이적 변이유발에 의해 수행된다. 부위특이적 변이유발에 대한 기술이 당업계에 잘 알려져 있고 예를 들어, Zoller and Smith (DNA 3: 479-488,1984) 또는 "Splicing by extension overlap", Horton et al., Gene 77,1989, pp. 61-68에 기술되어 있다. 따라서, 인자VII의 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 이용하여 선택한 변경을 도입한다. 이와 같이, 특이적 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 DNA구조물을 제조하는 과정은 당업계에 능숙한 이들에게 잘 알려져 있다 (cf. PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA).
본 발명의 인자Vll 폴리펩티드변이체를 암호화하는 핵산 구조물은 예를 들어
게놈 또는 cDNA library를 준비하고 표준 기술에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 혼성화에 의하여 폴리펩티드의 모두 또는 일부를 암호화하는 DNA 서열을 스크린하여 획득한 적절하게 게놈 또는 cDNA 기원이다(cf.Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
인자 VII 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 핵산 구조물은 설정된 표준 방법으로 합성적으로 즉, Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22(1981), 1859-1869, or Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805 에 의해 기술된 포스포아이다이트 방법으로 제조한다. 포스포아이다이트 방법에 의하면, 올리고뉴클레오티드는 즉 자동화 DNA 합성기에서, 정제, 아닐링, 적절한 벡터에서 연결하고 클론하여 합성한다.
인간 인자Vll 폴리펩티드변이체를 암호화하는 DNA 서열은 특이적 프라이머를이용한 중합효소 연쇄 반응으로 예를 들어, US 4,683, 202, Saiki et al., Science 239(1988), 487-491, or Sambrook et al., supra.에 기술된 바와 같이 조제한다.
그리고, 핵산구조물은 혼합된 합성적, 게놈, 혼합된 합성적, cDNA 또는 혼합된 게놈과 합성적, 게놈 또는 cDNA 기원(적절하게)의 단편과 전체 핵산 구조물의 다양한 부분에 대응하는 단편을 연결하여 표준 방법에 따라 제조한 cDNA 기원 핵산구조물은 바람직하게 DNA 구조물이다. 본 발명에 따라 인자 Ⅶ폴리펩티드변이체를 생산하는데 사용하기 위한 DNA 서열은 적절한 후번역 가공(즉 글루탐산 잔기의 감마-카복실레이션)과 숙주 세포로부터 분비를 획득하기 위하여 전형적으로 인자VII의 아미노 말단에서 프레-프로 폴리펩티드를 암호화한다. 프레-프로 폴리펩티드는 인자VII 또는 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C 또는 단백질 S와 같은 다른 비타민 K 의존적 플라스마 단백질이다.
당업계에서 능숙한 이들이 평가한 바와 같이, 변경은 응고제로서 기능하는 단백질의 능력을 상당히 손상시키지 않을 때 인자Vll 폴리펩티드변이체의 아미노산 서열 변경에서 추가 변경이 될 수 있다. 예를 들어, 여기 참고 문헌으로 통합된 U. S. 5,288, 629 에 일반적으로 기술된 바와 같이 지모겐인자 Vll를 활성화된 2-체인 형태로 전환하는 것을 방지하기 위해 인자 VII 폴리펩티드변이체는 또는 활성화 절단 부위에서 변경될 수 있다.
인간 인자VII 폴리펩티드변이체를 암호하는 DNA 서열은 대개 편리하게 재조합체 DNA 과정을 거치고, 벡터의 선택은 도입되는 숙주 세포에 의존하는 재조합체 벡터로 삽입된다. 따라서, 벡터는 즉 외부 염색체 존재물로 존재하는 벡터로 자동적으로 복제하는 벡터이고 벡터의 복제는 예를 들면 플라스미드와 같이 염색체복제에 독립적이다. 대안적으로, 숙주세포에 도입되었을 때, 벡터는 숙주 세포 게놈으로 통합되고 통합된 염색체와 함께 복제되는 것이다.
벡터는 바람직하게 인간 인자VII 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 DNA 서열이 DNA의 전사에 필요한 추가적 단편에 작동가능하게 연결된 발현 벡터이다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나 두 개의 요소를 포함한다. 용어, "작동가능하게 연결된"은 의도된 목적을 위해 즉 전사가 프로모토에서 시작하고 폴리펩티드를 암호화하는 DNA서열을 통해 진행하도록 조화하여 기능하도록 단편이 배열된 것을 말한다.
인자 Vlla 폴리펩티드변이체를 발현하는데 사용되는 발현 벡터는 클론된 유전자 또는 cDNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 프로모터는 선택된 숙주세포에서 전사 활성을 보이고 숙주 세포에 동종 또는 이종인 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유도된 DNA 서열이다.
포유동물 세포에서 인간 인자Vll 폴리펩티드변이체를 암호화하는 DNA의 전사를 지시하기에 적절한 프로모터의 실시예는 SV40 프로모터(Subramani et al., Mol. 세포 Biol. 1 (1981), 854-864), MT-1(met allothionein gene) 프로모터(Palmiter et al., Science 222(1983), 809-814), CMV 프로모터(Boshart et al., 세포 41 : 521-530,1985) 또는 아데노바이러스 2 주 후 프로모터(Kaufman 와 Sharp, Mol. 세포. Biol, 2: 1304-1319, 1982)이다.
곤충 세포에서 사용하기에 적절한 프로모터의 실시예는 폴리히드린프로모터(US 4,745, 051; Vasuvedan et al., FEBS Lett.311, (1992) 7-11), P10 프로모터(J. M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776), Autographacalifomica polyhedros는 바이러스 염기성 단백질 프로모터(EP 397 485), baculovirus 초기 유전자 1 프로모터(US 5,155, 037; US 5,162, 222), 또는 baculovirus 39K 연기된-초기 유전자 프로모터(US 5,155, 037;US 5,162, 222)이다.
효모 숙주 세포에서 사용하기에 적절한 프로모터의 실시예는 효모 당분해 유전자 유래의 프로모터를 포함한다(Hitzeman et al., J.Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) 또는 alcohol dehydrogenase gene (Young et al., in genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds. ), Plenum Press, New York, 1982), or the TP11 (US 4,599, 311) or ADH2-4c(Russell et al., Nature 304 (1983), 652-654) promoters.
사상 진균 숙주 세포에서 사용하기에 적절한 프로모터의 실시예는 예를 들어,ADH3 프로모터(McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) 또는 thetpiA 프로모터를 포함한다. 다른 유용한 프로모터의 실시예는 A.oryzae TAKA 아밀라아제, Rhizomucor miehei 아스파틱 프로테아제, A. niger neutral α-아밀라아제, A.nigeracid 안정한 α-아밀라아제, A.niger 또는 A. awamori 글루코아밀라아제(gluA), Rhizomucor miehei 리파아제, A. oryzae 알카라인 포스파타아제, A. oryzae 트리오스 포스페이트 이소머라아제 또는 A. nidulans 아세트아미다아제를 암호화하는 유전자로부터 유래한 것이다. TAKα-아밀라아제와 gluA 프로모터가 바람직하다. 적절한 프로모터가 EP 238 023 와 EP 383 779에 언급되어 있다.
인간 인자Vll 폴리펩티드변이체를 암호화하는 DNA 서열은 필요하면, 인간 성장 호르몬 터미네이터(Palmiter et al., Science 222,1983, pp. 809-814) 또는 TPI 1 (Alber 와 Kawasaki, J. Mol.Appl. Gen.1, 1982, pp. 419-434) 또는 ADH3(McKnight et al., The EMBO J. 4,1985, pp. 2093-2099) 터미네이터와 같은 적절한 터미네이터에 연결된다. 발현 벡터 또는 프로모터로부터 하류와 인자 Ⅶ서열에 대한 삽입 위치로부터 상류에 위치한 한 세트의 RNA 스플라이스 부위를 포함한다.
바람직한 RNA 스플라이스 부위를 아데노바이러스 및/또는 이뮤노클로불린 유전자로부터 획득한다. 또는 삽입 부위의 하류에 위치한 폴리아데닐레이션 신호는 발현 벡터에 포함되어 있다. 특별히 바람직한 폴리아데닐레이션 신호는 SV40 (Kaufman 와 Sharp, ibid. )에서 유래한 초기 또는 후기 폴리아데닐레이션 신호, 아데노바이러스 5Elb 지역에서 유래한 폴리아데닐레이션 신호, 인간 성장 호르몬 유전자 터미네이터 (DeNoto et al.Nucl. Acids Res. 9: 3719-3730,1981) 또는 인간 인자 VII 유전자 또는 소 인자 VII 유전자에서 유래한 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다.
발현 벡터는 또는 아데노바이러스 2 세부분 리더와 같은, 프로모터와 RNA 스플라이스 부위 사이에 위치한 비암호화 바이러스 리더 서열과 SV40 인핸서와 같은 인핸서 서열을 포함한다.
본 발명의 인간 인자VII 폴리펩티드변이체를 숙주 세포의 분비 경로로 지시하기 위해서, 분비 신호 서열 (또는 리더 서열, 프레프로 서열 또는 프레서열로 알려진)이 재조합체 벡터에 제공된다. 분비 신호 서열은 정확한 판독 구조에서 인간 인자VI I 폴리펩티드변이체를 암호화하는 DNA 서열에 연결된다.
분비 신호 서열은 보편적으로 펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5'에 위치한다. 분비 신호 서열은 보통 단백질과 관련되거나 다른 분비된 단백질을 암호화하는 유전자에서 유래한다.
효모 세포로부터 분비하기 위해, 분비 신호 서열은 발현된 인간 인자 Ⅶ폴리펩티드변이체를 세포의 분비 경로로 효율적으로 지시하는 신호 펩티드를 암호화한다. 신호 펩티드는 자연적으로 발생하는 신호 펩티드, 또는 기능적 부분, 또는 합성적 펩티드이다. 적절한 신호 펩티드는 α-인자 신호 펩티드 (cf. US 4,870, 008), 쥐 침 아밀라아제의 신호 펩티드(cf. O.Hagenbuchle et al., Nature 289,1981, pp. 643-646), 변경된 카르복시펩티다아제 신호 펩티드 (cf. L. A. Valls et al., 세포 48, 1987, pp.887-897), 효모 BAR1 신호 펩티드 (cf. WO 87/02670), 또는 효모 아스파틱 프로테아제 3 (YAP3) 신호 펩티드 (cf. M. Egel-Mitani et al., 효모 6, 1990, pp. 127-137)인 것으로 발견되었다.
효모에서 효율적인 분비를 위해서, 리더 펩티드를 암호화하는 서열도 또는 신호 서열의 하류와 인간 인자 Ⅶ폴리펩티드변이체를 암호화하는 DNA 서열의 상류로 삽입된다. 리더 펩티드의 기능은 발현된 펩티드를 소포체에서 골지체로 이동하고 배양 배지로 분비하기 위한 분비 소포로 더 이동하도록 하는 것인다(즉 인간 인자 Vll 폴리펩티드변이체를 세포 벽을 가로질러 이송 또는 적어도 세포막을 통해
효모 세포의 원형질막 주위 공간으로 이송). 리더펩티드는 효모 알파-인자 리더 ( 즉 US 4,546, 082, US 4,870,008, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544, EP 163 529 에 사용이 기술됨). 대안적으로, 리더펩티드는 합성적 리더 펩티드, 자연에서 발견되지 않는 리더 펩티드이다. 합성적 리더 펩티드는, 예를 들어, WO 89/02463 또는 WO 92/11378에 기술된 바와 같이 만들어진다.
사상 진균에서 사용하기 위해, 신호 펩티드는 편리하게 Aspergillus sp. 아밀라아제 또는 글루코아밀라아제를 암호화하는 유전자, Rhizomucor miehei 리파아제 또는 프로테아제 또는 Humicola lanuginosa 리파아제를 암호화하는 유전자로부터 유래한다. 신호 펩티드는 바람직하게 A. oryzae TAKA 아밀라아제, A. niger neutralα-아밀라아제, A. niger 산에 안정한 아밀라아제, 또는 A. niger 글루코아밀라아제를 암호화하는 유전자로부터 유래한다. 적절한 신호 펩티드는 EP 238 023와 EP 215 594에 개시되어 있다.
곤충 세포에서 사용하기 위해서, 신호 펩티드는 편리하게, lepidopteran Manducasexta adipokinetic 호르몬 전구체 신호 펩티드 (cf. US 5,023, 328)와 같은 곤충 유전자(cf. WO 90/05783)로부터 유래한다.
인간 인자 VII 폴리펩티드변이체, 프로모터와 선택적으로 터미네이터및/또는 분비 신호 서열 각각을 암호화하는 DNA 서열을 연결하고 이들을 복제에 필요한 정보를 함유한 적절한 벡터로 삽입하는데 사용되는 과정은 당업계에서 능숙한 이들에게 잘 공지되어 있다 (cf., Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
포유동물 세포를 전달감염하고 세포에 도입된 DNA 서열을 발현하는 방법은 Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621;Southern 와 Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7(1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; and Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845에 기술되어 있다.
클론된 DNA 서열은 배양된 포유동물세포로 도입된다. 예를 들어, 인산 칼슘-중재된 전달 감염 (Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603-616,1981 ; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) or electroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845,1982).
외래 DNA를 발현하는 세포를 확인하고 선택하기 위해서, 선택가능한 표현형을 주는 유전자(선택가능한 마커)는 해당 유전자 또는 cDNA와 함께 일반적으로 세포로 도입된다. 바람직한 선택가능한 마커는 neomycin, hygromycin, 와 methotrexate과 같은 약물에 저항성을 주는 유전자를 포함한다. 선택가능한 마커는 증폭가능한 선택가능한 마커이다. 바람직한 증폭가능한 선택가능한 마커는 디하이드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 서열이다. 선택가능한 마커는 Thilly (참고문헌으로 통합된 Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA)에 의해 검토된다. 당업계에서 능숙한 사람은 쉽게 적절한 선택가능한 마커를 선택할 수 있다.
선택가능한 마커는 해당 유전자와 같은 시간에 분리된 플라스미드에서 세포로 도입되거나 또는 같은 플라스미드에서 도입된다. 같은 플라스미드에서, 선택가능한 마커와 해당 유전자는 다른 프로모터 또는 같은 프로모터의 조정하에 있고, 후 배열은 디시스트로닉 메시지를 생성한다. 이 유형의 구조물은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Levinson and Simonsen,U. S. 4,713, 339). 또는 "담체DNA"로 알려진 추가적 DNA를 세포로 도입되는 혼합물에 첨가하는 것이 이롭다.
세포가 DNA를 흡수한 후, 이들은 해당 유전자의 발현을 시작하기 위해서 적절한 성장 배지에서 전형적으로 1-2일 동안 자란다. 여기에서 사용된 바와 같이 용어 "적절한 성장 배지"는 세포의 성장과 해당 인간 인자 VII 폴리펩티드변이체의 발현에 요구되는 양분과 다른 구성분을 포함하는 배지를 의미한다. 배지는 일반적으로 탄소 출처, 질소 출처, 필수 아미노산, 필수 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질, 성장 인자를 포함한다. 감마-카르복시화한 단백질을 생산하기 위해서, 배지는 바람직하게 약 0.1llg/ml 내지 약 5Lg/ml의 농도에서 비타민 K를 포함한다. 적절한 방식으로 선택가능한 마커를 발현하는 세포의 성장에 대해 선택하기 위해 약물을 선택한다. 증폭가능한 선택가능한 마커로 전달감염된 세포에 대해서, 클론된 서열의 증가된 카피수를 선택하기 위해서 약물 농도는 증가하여, 발현 수준을 증가시킨다. 안정하게 전달감염된 세포의 클론은 해당 인간 인자 VII 폴리펩티드변이체의 발현에 대해 스크린된다.
인간 인자VII 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 DNA 서열이 도입되는 숙주 세포는 번역후 변경된 인간 인자Vll 폴리펩티드변이체를 생산할 수 있는 어떠한 세포이고 효모, 곰팡이, 고등 진핵 세포를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 포유동물세포주의 실시예는 COS-1 (ATCC CRL 1650), baby hamster kidney (BHK) 와 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J.Gen. Virol. 36: 59-72,1977) 세포주이다. 바람직한 BHK 세포주는 tk-ts13 BHK 세포 주(여기에 참고문헌으로 통합된 Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110,1982)이고 이후에 BHK 570 세포로 언급된다. BHK 570 세포주는 American Type 배양 Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852,에 ATCC accession number CRL 10314으로 기탁된다. tk-ts13 BHK 세포주는 또는 ATCC로부터 accession number CRL 1632로 구입가능한다. 추가로, RatHep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600), RatHep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 인간폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61), DUKX 세포 (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220,1980)을 포함한 많은 다른 세포 주가 본 발명의 내에서 사용된다.
적절한 효모 세포의 실시예는 Saccharomyces spp. 또는 Schizosa charomyces spp. , 특별히 Saccharomyces cerevisiae 또는 Saccharomyces kluyveri 계통의 세포를 포함한다. 효모 세포를 이종 DNA로 형질전환하고 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법은 US 4,599, 311, US 4,931,373, US 4,870,008, 5,037, 743, US 4,845, 075에 기술되어 있고 모두 여기에 참고문헌으로 통합되어 있다. 형질전화된 세포는 선택가능한 마커, 보편적인 약물 저항성 또는 특정 양분 즉 류신이 없어도 자랄 수 있는 능력에 의해 결정된 표현형에 의해 선택된다. 효모에서 사용하기에 바람직한 벡터는 US 4,931, 373에 개시된 POT1 벡터이다. 인간 인자 VII 폴리펩티드변이체를 암호화하는 DNA 서열은 신호 서열에 선행하고 상기 기술된 바와 같이 선택적으로 리더 서열이다. 적절한 효모 세포의 추가 실시예는 K lactis, Hansenula, e.g. H. polymorpha, 또는 Pichia, 즉 P. pastoris 와 같은 Kluyveromyces의 계통이다. ( Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132,1986, pp. 3459-3465; US 4,882, 279 참조). 다른 진균 세포의 실시예는 사상 진균의 세포 즉 Aspergillus spp. ,Neurospora spp. , Fusarium spp. 또는 Trichoderma spp. , 특별히 A. oryzae, A. nidulans 또는 A. niger의 계통이다. 단백질의 발현에 Aspergillus spp.를 사용하는 것은 EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438에 기술되어 있다. F. oxysporum 의 형질전환은, 예를 들어, Malardier et al., 1989, 유전자 78: 147-156에 기술된 바와 같이 수행된다. Trichoderma spp.의 형질전환은 예를 들어 EP 244 234 에 기술된 바와 같이 수행된다. 사상 진균이 숙주 세포로 사용될 때, 재조합체 숙주 세포를 획득하기 위해서 숙주 염색체에 DNA 구조물을 편리학게 통합하여 이것은 본 발명의 DNA 구조물로 형질전환된다. DNA 서열이 세포에서 안정되게 유지되기 때문에 이 통합은 일반적으로 유익한 것으로 간주된다. DNA 구조물을 숙주 염색체로 통합하는 것은 통상적인 방법 즉 동종 또는이종 재조합에 따라 수행된다.
곤충 세포의 형질전환과 이종 폴리펩티드의 생산은 US 4,745, 051; US 4,879, 236; US 5,155, 037; 5, 162,222 ; EP 397,485에 기술된 바와 같이 수행되고 모두 여기에 참고문헌으로 통합되어 있다. 숙주로 사용되는 곤충 세포주는 적절하게, Spodoptera frugiperda 세포 또는 Trichoplusia ni 세포와 같은 Lepidoptera 세포 주이다( US 5, 077,214 참조). 배양 조건은 적절하게 예를 들어, WO 89/01029 또는 WO 89/01028 또는 상기 언급된 참고문헌에 기술된 바와 같다.
상기 기술된 형질전환된 또는 전달감염된 숙주 세포는 그다음 적절한 영양 배지에서 인간 인자Vll 폴리펩티드변이체의 발현을 허용하는 조건에서 배양된 후, 형성된 펩티드의 모두 또는 일부는 배양물로부터 회수된다. 세포를 배양하기 위해 사용되는 배지는 적절한 첨가물을 포함한 최소 또는 복합 배지와 같은 숙주 세포를 성장시키기위해 적절한 통상적인 배지이다. 적절한 배지는 상업적 공급자로부터 구입가능하거나 출판된 방법에 따라 제조한다(즉 the American Type Culture Collection의 범주안에서 ). 세포에 의해 생산된 인간 인자Vll 폴리펩티드변이체는 원심분리 또는 여과로 배지로부터 숙주 세포를 분리, 염, 즉 황산 암모늄을 수단으로 상청액 또는 여과물의 단백질성 성분의 침전, 해당 폴리펩티드의 유형에 의존적인 즉 이온 교환 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 그 유사물과 같은 다양한 크로마토그래피 과정으로 정제를 포함한 통상적인 과정에 의해 배양 배지로부터 회수된다.
본 발명의 인자 VII 폴리펩티드변이체를 생산하기 위해 유전자 이식 동물 기술이 사용된다. 숙주 암컷 포유동물의 포유동물 선 내에서 단백질을 생산하는 것이 바람직하다. 포유동물 선에서의 발현과 해당 단백질을 우유로 후속하여 분비하는 것은 다른 출처로부터 단백질을 분리하는데 직면하는 많은 어려움을 극복한다.우유는 쉽게 모을 수 있고, 많은 양으로 유용하며 생화학적으로 잘 특성화되어 있다. 게다가, 주된 우유 단백질이 높은 농도에서 우유에 존재한다(전형적으로 약 1 내지 15g/I).
상업적인 측면에서, 우유 생산량이 많은 종을 숙주로 사용하는 것이 분명히 바람직하다. 생쥐와 쥐와 같은 작은 동물이 사용될 수 있으며 (주 단계에서 바람직한), 제한하지 않고 돼지, 염소, 양, 소을 포함한 가축 포유류를 사용하는 것이 바람직하다. 이 종에서 생성전환의 이전 역사, 우유 생산, 양 우유를 수집하기 위한 설비의 비용과 유용성과 같은 요소 때문에 특별히 바람직하다( 예를 들어,숙주 종의 선택에 영향을 주는 인자의 비교를 위해 WO 88/00239 참조). 일반적으로 East Friesl와 sheep 과 같은 낙농업에서 번식된 숙주 동물의 번식을 선택하거나 후기에 이식유전자 주의 번식에 의해 낙농 가축을 도입하는 것이 바람직하다. 어느 경우에서도, 알려진, 좋은 건강 상태를 가진 동물이 사용되어야 한다.
포유동물선에서 발현을 획득하기 위해서, 우유 단백질 유전자에서 유래한 전사 프로모터가 사용된다. 우유 단백질 유전자는 카세인(see U. S.5,304, 489), 베타-락토글로불린, α-락트알부민, 유장 산성 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 베타-락토글로불린 (BLG) 프로모터는 바람직하다. 양 베타-락토글로불린 유전자의 경우에, 5'측면 프로모터와 베타-락토글로불린 유전자의 비암호 일부를 포함하는 α-4. 25 kbp DNA 단편과 같은 약 5 kbp 까지 5'측면 서열의 큰 일부가 바람직하지만 유전자의 5'측면 서열의 적어도 인접 406 bp 지역이 일반적으로 사용된다(Whitelaw et al., Biochem. J. 286: 31-39 (1992)참조). 다른 종에서 유래한프로모터DNA의 유사한 단편도 또는 적절하다.
유전자의 게놈 지역이 발현되기 때문에, 베타-락토글로불린 유전자의 다른 지역도 또는 구조물에 통합된다. 인트론이 없는 구조물은 예를 들어, 그러한 DNA 서열을 함유하는 것과 비교하여 잘 발현하지 못한다는 것이 당업계에서 일반적으로 용인된다(see Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836-840 (1988);Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1: 3-13 (1991); WO 89/01343; 와 WO 91/02318, 각각은 여기에 참조문헌으로 통합됨: 참조). 이 관점에서, 가능하면 해당 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 본래 인트론의 모두 또는 일부를 함유하는 게놈 서열을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 베타-락토글로불린 유전자로부터 적어도 일부 인트론을 포함하는 것이 바람직하다. 그러한 지역은 양 베타-락토글로불린 유전자의 3'비암호화 지역으로부터 인트론 스플라이싱과 RNA 폴리아데닐레이션을 제공하는 DNA 단편이다. 유전자의 자연적 3'non-coding 서열을 대체할 때, 이 양 베타-락토글로불린 단편은 해당 단백질 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 향상시키고 안정화시킬 수 있다. 다른 실시예내에서, 변이체 인자 VII 서열의 개시 ATG를 둘러싸는 지역은 우유 특이적 단백질 유전자로부터 대응하는 서열로 대체된다. 그러한 치환은 발현을 향상시키기 위한 잠정적 조직-특이적 개시 환경을 제공한다. 적은 지역이 대체되어도 전체 변이체 인자 Ⅶ프레-프로 와 5'non-coding 서열을, 예를 들어, BLG 유전자의 서열로 대체하는 것이 편리하다.
유전자이식 동물에서 인자VII 폴리펩티드변이체의 발현을 위해서, 변이체 인자VII을 암호화하는 DNA 단편은 발현 유닛을 생성하기 위해 발현에 필요한 추가 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 그러한 추가단편은 mRNA의 전사와 폴리아데닐레이션의 종결을 제공하는 서열과 상기 언급된 프로모터를 포함한다. 발현 유닛은 변경된 인자VII을 암호화하는 단편에 작동가능하게연결된 분비 신호 서열을 암호화하는 DNA 단편을 추가로 포함한다. 분비 신호 서열은 본래 인자VII 분비 신호 서열 또는 우유 단백질과 같은 또다른 단백질의 분비 신호 서열이다 (예를 들어, 여기에 참고문헌으로 통합된 von Heijne,Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986); 와 Meade et al., U. S. 4,873, 316, 참조).
발현 단위는 연결의 어느 서열에 의해서도 제조될 수 있어도 유전자 이식 동물에서 사용하기 위한 발현 유닛의 제조는 편리하게 변이체 인자VII 서열을 플라스미드 또는 추가DNA 단편을 함유하는 파지 벡터로 삽입하여 수행된다. 우유 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 함유하는 벡터를 제공하고 우유 단백질에 대한 암호화 서열을 인자 Ⅶ변이체의 암호화 서열로 대체하여 우유 단백질 유전자의 조절 서열의 발현을 포함하는 유전자 융합을 형성하는 것이 특별히 편리하다; 어떠한 경우에서도, 플라스미드 또는 다른벡터에서 발현 유닛의 클로닝은 변이체 인자VII 서열의 증폭을 촉진한다. 증폭은 세균 (즉 E. coli) 숙주 세포에서 편리하게 수행되어, 벡터는 전형적으로 세균 숙주 세포에서 기능적인 복제원점과 선택가능한 마커를 포함한다. 발현 단위는 그다음 선택된 숙주 종의 수정된 난(초기-단계 배)으로 도입된다. 이종 DNA 의 도입은 미세 주입 (즉 U. S. Patent No. 4,873, 191), 레트로바이러스 감염 (Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988) ) 또는 배 줄기(ES) 세포를 이용한 부위-특이적 통합 (reviewed by Bradley et al., Bio/Technology 10: 534-539 (1992) )를 포함한 여러 경로 중 하나에 의해 달성된다. 난은 그 다음 의사임신한 여자의 난관 또는 uteri로 이식되고 종결로 발달한다. 세균주에 도입된 DNA를 가지는 자손은 DNA를 정상적, Mendelian 방식으로 전달하여 이식 유전자 집단이 발생하게 한다.
이식 유전자 동물을 생산하기 위한 일반적 과정이 당업계에 공지되어 있다 ( Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183 (1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler et al., Bio/Technology 8: 140-143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113-120 (1992); U. S. 4, 873, 191; U. S.4, 873,316 ; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; and GB 87/00458 참조). 포유동물과 세균 세포로 외부 DNA 서열을 도입하기 위한 기술은 원래 생쥐에서 발전하였다( 즉 , Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon 와 Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter and Brinster, Cell 41: 343-345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 82: 4438-4442 (1985); 와 Hogan et al. (ibid. )참조 ). 이러한 기술은 후속하여 가축종을 포함한 큰 동물로 사용하기 위해서 변경되었다(즉 , WO <RTI 88/00239, WO 90/05188, 와 WO 92/11757; 와 Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183(1988)참조). 유전자 이식 쥐 또는 가축의 생성에서 오늘날까지 사용되는 가장 효율적인 경로에서, 설정된 기술에 따라 해당 DNA의 수백가지 선형 분자를 수정된 난의 pro-nuclei중 하나에 삽입하였다. 접합체의 세포질로 DNA의 삽입도 또는 사용되었다. 유전자도입 식물에서 생산도 또는 사용되었다. 발현이 생성 또는 융기와 같은 특정 기관으로 지시되었다 ( Hiatt, Nature 344: 469-479 (1990); Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12: 449-453 (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8: 217-221 (1990); 와 EP 0 255 378 참조).
본 발명의 인자Vll 폴리펩티드변이체는 세포 배양 배지 또는 우유로부터 회수되었다. 본 발명의 인자Vll 폴리펩티드변이체는 크로마토그래피(즉, 이온 교환, 친화, 소수성, 크로마토포커싱, 크기 배제 ), 전기영동 과정을 포함한 당업계에 공지된 다양한 과정에 의해 정제된다 (즉 , 준비적 등전위 포커싱 (IEF), 차별적 용해성 (즉, 암모늄 설페이트 침전), 또는 추출 (즉, Protein 정제, J. -C. Janson 와 Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조). 바람직하게, 항-인자 Vll 항체 칼럼에서 친화 크로마토그래피에 의해 정제된다. Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097-11108, (1986) 와 Thim et al., Biochemistry 27: 7785-7793, (1988)에 기술된 바와 같이 칼슘 의존적 단일클론항체를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 통상적인 화학적 정제 수단으로 추가 정제한다. 구연산 바륨 침전을 포함하는 다른 정제 방법이 당업계에 공지되어 있고, 여기에 기술된 신규 인자VII 폴리펩티드변이체의 정제에 적용된다(예를 들어, Scopes,R. , Protein purification, Springer-Verlag, N. Y. , 1982 참조).
치료 목적으로 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드변이체가 실질적으로 순수한 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서 본 발명의 인자VII 폴리펩티드변이체는 적어도약 90 내지 95% 동질성, 바람직하게 적어도약 98% 동질성까지 정제된다. 순도는 젤 전기영동과 아미노 말단 아미노산 시퀀싱으로 평가된다. 2개의 체인 형태로 전환하기 위해서 인자VII 변이체는 활성화 부위에서 절단된다.
활성화는 Osterud, et al., Biochemistry 11: 2853-2857 (1972); Thomas, U. S. Patent No. 4, 456,591 ;Hedner 와 Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841 (1983); 또는 Kisiel and Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42 (1983)의해 개시된 것과 같이 당업계에 공지된 과정에 따라 수행된다. 대안적으로, Bjoern et al에 의해 개시된 바와 같이 (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565), MonoQE (Pharmacia fine Chemicals) 또는 유사물과 같은 이온-교환 크로마토그래피칼럼을 통해 통과시켜 인자VII는 활성화된다. 형성된 활성화된 인자 Ⅶ변이체를 제제하고 하기와 같이 투여한다.
검정
본 발명은 또는 본 발명에 따른 바람직한 인자 Vlla 변이체를 선택하기 위해 적절한 검정을 제공한다. 이러한 검정은 단순한 예비 시험관 내 시험으로서 수행될 수 있다.
따라서, 여기서 실시예 5는 본 발명의 인자 Vlla 변이체의 활성에 대한 단순 시험("시험관 내 가수분해 검정")을 개시한다. 이에 근거하여, 특별한 관심의 대상인 인자 Vlla 변이체는 "시험관 내 가수분해 검정"에서 시험하였을 때 도1에 제시된 변이체의 활성과 본래인자 VII의 활성의 비율이 1.0 이상 즉 적어도 약 1.25, 바람직하게 적어도약 2.0, 적어도약 3.0 또는, 더 바람직하게, 적어도약 4.0 인 변이체이다.
변이체의 활성은 또는 인자 X("시험관 내 단백질 분해 검정")와 같은 생리적 기질을 사용하여 적절한 발색성 기질(즉 S-2765)을 첨가한 후 생성된 Xa 를 측정하는 적절하게 100-1000 nM 농도에서 측정될 수 있다( 실시예 6 참조). 추가로, 활성 검정은 생리적 온도에서 실시한다.
트롬빈을 생성하는 인자 Vlla 변이체의 능력은 생리적 농도에서 모든 적절한 응고 인자와 엑제제와 활성화된 혈소판(여기에 참고문헌으로 통합된 p. 543 in Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99,542-547에 기술된 바와 같이)을 포함하는 검정에서 측정할 수 있다( 혈우병 A 조건을 모방할 때 마이너스 인자VIII).
투여와 약학적 성분
본 발명에 따른 인자 Vll 폴리펩티드변이체는 응고 인자 결핍증 (즉 혈우병 A 와 B 또는 응고 인자 XI 또는 VII의 결핍증)또는 응고 인자 억제제와 같은 여러가지 원인을 가진 출혈 질병을 조절하기 위해 사용되거나 정상적으로 기능하는 혈액 응고 일련반응 (응고 인자에 대해 응고 인자 결핍증 또는 억제제가 없는)을 가진 시험체에서 발생하는 과다 출혈을 제어하기 위해 사용된다. 출혈은 결손된 혈소판 기능, 저혈소판증 또는 von Willebrand's 질병에 의해 야기된다. 이들은 또는 다양한 자극에 의해 증가된 피브린분해 활성이 유도되는 시험체에서 또는 관찰된다.
수술 또는 심한 외상과 관련된 심한 조직 손상을 겪은 시험체에서, 지혈 메카니즘은 즉각적 지혈이 매우 필요하고 보통 지혈 메카니즘에도 불구하고 출혈이 발생한다. 뇌, 내이 지역, 귀와 같은 기관에서 출혈이 발생할 때 만족스런 지혈을 달성하는 것은 또는 문제이고 출처를 확인하기 힘들 때 확산된 출혈(출혈성 위염과 심한 자궁 출혈)의 경우에도 또는 문제이다. 같은 문제가 in복강경 수술과 다양한 기관(간, 폐, 종양조직, 위장 경로)에서 생검을 취하는 과정에서 발생한다. 이러한 상황은 수술 기법(봉합, 클립 등)으로 지혈을 제공하는 어려움을 공유한다.
급성과 심한 출혈은 또는 항응고 치료에서 손상된 지혈이 주어진 치료법에 의해 유도되는 시험체에서 발생한다. 그러한 시험체는 항응고 효과가 빨리 중화되는 경우에 수술적 시술이 필요하다.
만족스럽지 못한 지혈의 경우에 문제를 야기하는 다른 상황은 정상적 지혈 메카니즘을 가진 시험체가 혈전 색전증을 방지하기 위한 항응고 치료를 받을 때이다. 그러한 치료는 아스피린과 다른 혈소판 응고 억제제뿐만 아니라 헤파린, 프로테오글리칸의 다른 형태, 와파린 또는 K-길항제의 다른 형태를 포함한다. 응고 일련반응의 조직적인 활성화는 산재성 혈관내 응고(DIC)가 되도록 한다. 하지만, 혈관벽 손상의 부위에 노출된 인자 Vlla 와 TF사이의 복합체 혈성에 의해 야기된 종류의 국부화된 지혈 과정 때문에 그러한 합병증은 재조합체인자 Vlla 높은 양으로 치료된 시험체에서 관찰되지 않았다. 본 발명에 따른 인자Vll 폴리펩티드변이체는또는 정상적 지혈 메카니즘과 관련된 과도한 출혈을 조절하기 위한 활성화된 형태로 사용된다.
계획적으로 시술과 관련한 치료를 위해서, 본 발명의 인자 Vll 폴리펩티드변이체는 전형적으로 시술을 수행하기 전 약 24 시간 내, 7일 동안 또는 그 이상동안에 투여된다. 응고제로서 투여는 여기에 기술된 바와 같이 다양한 경로로 수행될 수 있다. 인자VII 폴리펩티드변이체의 투여량은 로딩과 유지 투여량으로 시험체의 체중과 조건의 혹독함에 따라서 70 kg 시험체에 대해 약 0.05 mg 내지 500 mg/day, 바람직하게 약 1 mg 내지 200 mg/day, 더 바람직하게 약 10 mg 내지 약 175 mg/day 범위이다.
약학적 성분은 일차적으로 예방적 및/또는 치료요법을 위한 비경구 투여로 의도된다. 바람직하게, 약학적성분은 비경구로 즉, 정맥내, 피하, 또는 근육내로 투여되거나 지속적 또는 박동성 주입으로 투여된다. 비경구 투입의 성분은 바람직하게 용해되어 약학적으로 수용가능한 담체, 바람직하게 수용성 담체와 조합하여 본 발명의 인자 Ⅶ변이체를 포함한다. 물, 버퍼된 물, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신과 그 유사물과 같은 다양한 수용성 담체가 사용된다. 본 발명의 인자 Ⅶ폴리펩티드변이체는 또는 상처 부위로 전달 또는 표적하기 위한 리포좀 제조물로 제제될 수 있다. 리포좀 제조물은 일반적으로 즉 , U. S. 4,837, 028, U. S.4,501, 728, U. S. 4,975, 282에 기술되어 있다. 성분은 통상적, 잘 알려진 멸균 기법으로 멸균된다. 형성된 수용성 용액은 무균 조건에서 사용을 위해 포장 또는 여과되고 동결건조된 제조물은 투여 전에 멸균된 수용성 용액과 조합된다.
성분은 pH 조정제와 버퍼제, 탄력성 조정제와 그 유사물, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 유산염 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘등과 같은 약 생리적 조건에 필요한 약학적으로 수용가능한 보조 시약을 포함한다. 이러한 제조물에서 인자VII 변이체의 농도는 즉, 중량으로 약 0.5% 이하, 대개는 중량으로 적어도 약 1 % 부터 중량으로 15 또는 20% 까지 널리 변경될 수 있고 선택된 투여의 특별한 방식에 따라서 용액 부피, 점성등에 의해 일차적으로 선택된다.
따라서, 정맥내 주입의 전형적인 약학적 성분은 sterile Ringer's solution의 250ml과 인자VII 변이체의 10 mg을 포함하도록 제조될 수 있다. 비경구 투여가능한 성분을 제조하는 실제 방법은 공지되어 있거나 당업계에 능숙한 이들에게 명백하고 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. , Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)에 자세히 기술되어 있다.
본 발명의 인자Vll 폴리펩티드변이체를 함유하는 성분은 예방적 및/또는 치료제로 투여될 수 있다. 치료적 응용에서, 성분은 상기 기술된 바와 같이 질병과 합병증을 치료, 완화 또는 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 이미 질병을 겪은 시험체에게 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료적으로 효과적인 양 "으로 정의된다. 당업계에서 능숙한 이들이 이해하는 것과 같이 이 목적에 효과적인 양은 시험체의 체중과 일반적인 상태 뿐만 아니라 질병 또는 상처의 심각성에 의존한다. 하지만, 일반적으로, 효과적인 양은 70 kg 시험체에서 더 보편적으로 사용되는 인자 VII 변이체의 하루당 약 1.0 mg 내지 약 200 mg의 투여량과 함께 하루당 인자 Vll 변이체의 약 0.05 mg 내지 약 500 mg 범위이다. 본 발명의 FVlla폴리펩티드는 일반적으로 심각한 질병 또는 상처 상태 즉 생명을 위협하거나 잠재적으로 생명을 위협하는 상황에서 사용된다. 그러한 경우에, 인간에서 외부 물질의 최소화와 인간 인자Vll 폴리펩티드 변이체의 면역성의 일반적 감소의 관점에서, 치료하는 외과의사는 이러한 변이체 인자VII 성분의 실질적으로 과도량을 투여하는 것이 바람직하다고 생각한다.
예방적 응용에서, 본 발명의 인자 Ⅶ변이체를 함유하는 성분은 시험체의 응고 능력을 향상시키기 위해 질병 상태 또는 상처에 민감하거나 위험에 있는 시험체에게 투여된다. 그러한 양은 "예방적으로 효과적인 양"으로 정의된다. 예방적 응용에서, 정확한 양은 다시 시험체의 건강과 체중에 의존하지만 70 kg 시험체에서 일반적으로 하루당 약 0.05 mg 내지 약 500 mg, 더 보편적으로 70 kg 시험체에서 하루당 약 1.0 mg 내지 약 200 mg이다.
성분의 단일 또는 복합 투여는 치료 외과의사가 투여 수준과 패턴을 선택하여 수행될 수 있다. 하루 유지 수준이 필요한 걸을 수 있는 시험체에서, 인자 Ⅶ폴리펩티드변이체는 이동가능한 펌프 시스템을 사용하여 지속적 주입으로 투여된다.
예를 들어, 국부적 응용과 같은 본 발명의 인자 Vll 변이체의 국부적 전달은 풍선 카테터을 코트하는데 사용되는 맥관 이식 또는 스텐트, 수소성젤로 통합된 즉, 스프레이, 관류, 이중 풍선 카테테르, 스텐트를 수단으로 또는 다른 잘 설정된 방법으로 수행된다. 어떠한 경우에도, 약학적 성분은 시험체를 효과적으로 치료하는데 충분한 인자 Ⅶ변이체의 양을 제공해야 한다.
본 발명은 보호의 범위를 제한하도록 해석되지 않는 다음 실시예로 더 예시한다. 이전 기술문과 다음 실시예에 개시된 특징은 개별적으로 그리고 어떠한 조합으로 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 재료이다.
도의 간단한 설명
도 1은 본래(야생형) 인간 응고 인자VII 의 완전한 아미노산 서열을 제시한다(SEQ ID NO:1).
다음 실시예에서 사용되는 아미노산 치환에 대한 용어는 다음과 같다. 첫번째 문자는 SEQ ID NO :1의 위치에 자연적으로 존재하는 아미노산을 나타낸다. 후속하는 수는 SEQ ID NO :1에서의 위치를 나타낸다. 두번째 문자는 자연적인 아미노산에 대해 다른 아미노산 치환을 나타낸다. 실시예는 SEQ ID NO :1의 위치 305에 있는 류신을 발린으로 치환하고 SEQ ID NO :1의 위치 337에 있는 라이신을 알라닌으로 치환한 같은 인자 Vll 변이체에서 변이가 생긴 L305V/K337A-FVII이다.
실시예 1
L305V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305VN1 58D/E296V/M298Q/K337A-FVII을 암호화하는 DNA
초나선형, 해당 인서트가 있는 이중 가닥 DNA 벡터와 원하는 변이를 함유하는 2개의 합성 프라이머를 사용하여 site-directed muta유전자is로 L305V/K337A-FVII, L305VN158D/E296V/M298Q-FVII, 와L305 VN158D/E296V/M298Q/K337A-FVII을 암호화하는 DNA 구조물을 제조한다. 다음 프라이머가 사용되었다:
L305V-FVII :
5'-CGT GCC CCG GGT GAT GAC CCA GGA C-3' (SEQ ID NO : 2)
5'-GTC CTG GGT CAT CAC CCG GGG CAC G-3' (SEQ ID NO : 3)
K337A-FVII :
5'-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3' (SEQ ID NO : 4)
5'-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3' (SEQ ID NO : 5)
V1 58D-FVII :
5'-GTG GGG GGCAAG GAC TGC CCCAAA GGG G-3' (SEQ ID NO : 6)
5'-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3' (SEQ ID NO : 7)
E296V/M298Q-FVII :
5'-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTCAAC GTG CCC-3' (SEQ ID NO : 8)
5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3' (SEQ ID NO : 9)
벡터의 반대 가닥에 각각 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 Pfu DNA 중합효소를 사용하여 온도 싸이클동안 확장하였다. 프라이머를 결합하면, 엇갈린 닉을 함유하는 변이 플라스미드가 생성된다. 온도 싸이클 후에, 산물을 메틸화된 그리고 메틸화되지 않은 DNA에 특이적인 Dpnl으로 처리한다.
특이적 프라이머를 사용한 중합효소 연속 반응을 사용하여 DNA 제조물을 제조하는 과정은 당업계에서 능숙한 이들에게 잘 알려져 있다(cf. PCR Protocols,1990, Academic Press, San Diego, California, USA).
실시예 2
L305V/K337A-FVII의 제조
변이체 L305V/K337A-FVII의 발현을 획득하기 위해 BHK 세포를 이전에 기술된 바와 같이 전달감염시킨다(Thim et al. (1988) Biochemistry 27,7785-7793 ; Persson 와 Nielsen (1996) FEBS Lett. 385,241-243). 인자 Vll 변이체는 다음과 같이 정제되었다:
5 mM EDTA, 0.1% TritonX-100 와 10 mM Tris을 첨가, pH를 8.0 으로 조정, 물을 첨가하여 수행성을 10-11으로 조정한 후 조정된 배지를 Q Sepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech)의 25-ml 칼럼에 로딩하였다.
단백질의 용출은 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% TritonX-100, pH 8.0 부터 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM Cars, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 로 단계를 거쳐 수행한다.
L305V/K337A-FVII을 함유하는 부분은 집단을 이루고 CNBr- 활성화된 Sepharose 4B (Pharmacia Biotech)과 연결된 단일클론 항체 F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)을 함유하는 25-ml 칼럼에 적용하였다.
칼럼을 10 mM CaCl2,100 mM NaCl, 0.02% TritonX-100 을 포함하는 50 mM Hepes, pH 7.5으로 균형을 유지하였다.
평형 버퍼와 2M NaCl 평형 버퍼를 함유하는 평형 버퍼로 씻은 후, 결합한 물질을 CaCl2대신에 10 mM EDTA를 함유하는 평형 버퍼로 용출하였다. 사용 또는 저장하기 전에, EDTA 에 대한 과량의 CaCl2을 첨가하거나 L305V/K337A-FVII을 Ca2+-포함 버퍼에 전달하였다. 각 단계의 수율은 인자 VIIELISA 측정에 후속하고 정제된 단백질은 SDS-PAGE로 분석한다.
실시예 3
L305VN158D/E296V/M298Q-FVII의 제조
BHK 세포를 변이체L305VN158D/E296V/M298Q-FVII의 발현을 획득하기 위해서 실질적으로 이전에 기술된 바와 같이 전달감염시킨다(Thim et al. (1988) Biochemistry 27,7785-7793 ; Persson 와 Nielsen (1996) FEBS Lett.385, 241-243). 인자 VII 변이체는 다음과 같이 정제되었다:
5 mM EDTA, 0. 1% Triton X-100 와 10 mM Tris을 첨가, pH 를 8.0 으로 조정, 물을 첨가하여 반응성을 10-11 mS/cm 으로 조정한 후 조정된 배지를 Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech)의 25-ml 칼럼에 로드하였다. 10 mM Tris, 50 mMNaCl, 0.1% TritonX-100, pH 8.0 에서 10 mM Tris, 50 mMNaCl, 25 mMCaca2, 0.1% TritonX-100, pH 8.0로 단계를 거쳐 단백질을 용출한다.
L305VN158D/E296V/M298Q-FVII을 포함하는 단편을 혼주하고 CNBr-활성화된 Sepharose 4B (Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체F1A2 (Novo Nordisk,Bagsvaerd, Denmark)을 포함하는 25ml 칼럼에 적용한다.
칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl,0.02% TritonX-100을 포함하는 50 mMHepes, pH 7.5으로 평형을 유지한다. 평형 버퍼와 2 M NaCl을 포함하는 평형 버퍼로 씻은 후, 결합된 물질을 CaCl2대신에 10 mM EDTA를 포함하는 평형 버퍼로 용출한다. 사용 또는 저장하기 전에, EDTA 에 대한 과량의 CaC12를 첨가하거나 또는 L305VN158D/E296V/M298Q-FVII를 Ca2+포함하는 버퍼로 전달한다. 인자 Vll ELISA 측정으로 각 단계의 수율을 측정하고 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한다.
실시예 4
L305VN158D/E296V/M298Q/K337A-FVII의 제조
변이체L305VN1 58D/E296V/M298Q/K337A-FVII의 발현을 획득하기 위해서 이전에 기술된 바와 같이 BHK 세포를 전달감염한다(Thim et al. (1988) Biochemistry 27,7785-7793 ; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385,241-243). 인자VII 변이체는 다음과 같이 정제된다:
5 mM EDTA, 0. 1% Triton X-100 와 10 mM Tris을 첨가, pH 를 8.0 으로 조정, 물을 첨가하여 반응성을 10-11 mS/cm 으로 조정한 후 조정된 배지를 Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech)의 25-ml 칼럼에 로드하였다. 10 mM Tris, 50 mMNaCl, 0.1% TritonX-100, pH 8.0 에서 10 mM Tris, 50 mMNaCl, 25 mMCaca2, 0.1% TritonX-100, pH 8.0로 단계를 거쳐 단백질을 용출한다. L305VN158D/E296V/M298Q/K337A-FVII을 포함하는 단편을 혼주하고 CNBr-활성화된 Sepharose 4B (Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체 F1A2(Novo Nordisk,Bagsvaerd, Denmark)을 포함하는 25ml 칼럼에 적용한다.
칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl,0.02% TritonX-100을 포함하는 50 mM Hepes, pH 7.5으로 평형을 유지한다. 평형 버퍼와 2 M NaCl을 포함하는 평형 버퍼로 씻은 후, 결합된 물질을 CaCl2대신에 10 mM EDTA를 포함하는 평형 버퍼로 용출한다. 사용 또는 저장하기 전에, EDTA 에 대한 과량의 CaC12를 첨가하거나 또는 L305VN158D/E296V/M298Q-FVII를 Ca2+포함하는 버퍼로 전달한다. 인자 Vll ELISA 측정으로 각 단계의 수율을 측정하고 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한다.
실시예 5
시험관 내 가수분해 검정
본래(야생형) 인자 Vlla 와 인자 Vlla 변이체 (둘 다 "인자Vlla"로 언급됨) 는 특이 활성을 직접 비교하기 위해서 동시에 검정한다. 검정은 미세적정 플레이트에서 수행한다(MaxiSorp, Nunc, Denmark). 발색성 기질 D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide (S-2288, Chromogenix, Sweden), 최종 농도 1 mM, 을 0.1M NaCl, 5 mM CaCl2, 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 포함하는 50 mM Hepes, pH 7.4에서 인자Vlla (최종 농도 100 nM)에 첨가한다. 405 nm에서 흡광도는 SpectraMax 340 plate reader (Molecular Devices, USA)에서 지속적으로 측정하였다. 20분 배양하는 동안에 발달한 흡광도는, 효소를 포함하지 않는 블랭크 웰에서 흡광도를 뺀 후 변이체와 야생형 인자 Vlla 의 활성사이의 비율을 계산하는데 사용한다:
비율 =(A405nm 인자Vlla 변이체)/ (A405nm 인자Vlla 야생형).
실시예 6
시험관 내 단백질 분해 검정
본래(야생형) 인자 Vlla 와 인자 Vlla 변이체 (둘 다 "인자Vlla"로 언급됨) 는 특이 활성을 직접 비교하기 위해서 동시에 검정한다. 검정은 미세적정 플레이트에서 수행한다(MaxiSorp, Nunc, Denmark). 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2와 1mg/ml 소 혈청알부민을 포함하는 100 microL 50 mM Hepes, pH 7.4에서 인자 Vlla (10 nM) 와 인자 X (0.8microM)를 15분간 배양한다. 0.1M NaCl, 20 mM EDTA 와 1 mg/ml 소 혈청알부민을 포함하는 50 microL 50 mM Hepes, pH 7.4을 첨가하면 인자 X 절단은 중단된다. 생성된 인자 Xa의 양은 발색성 기질 Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide (S-2765, Chromogenix, Sweden), 최종 농도 0.5 mM을 첨가하여 측정한다. 405 nm에서 흡광도는 SpectraMax 340 plate reader (Molecular Devices, USA)에서 지속적으로 측정한다. FVlla을 포함하지 않는 블랭크 웰에서 흡광도를 뺀 후 10분동안에 발생한 흡광도는 변이체와 야생형 인자 Vlla 의 단백질 분해 활성사이의 비율을 계산하는데 사용한다:
비율 =(A405nm 인자 VI la 변이체)/ (A405nm 인자 VI la 야생형).
실시예 7
Claims (63)
- SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 적어도 두개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드로, 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305의 다른 아미노산으로의 치환과; (ⅱ) K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 인자Vlla 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, L305는 다른 아미노산으로 치환되고 K157은 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, L305는 다른 아미노산으로 치환되고 K337은 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, L305는 다른 아미노산으로 치환되고 D334는 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, L305는 다른 아미노산으로 치환되고 S336은 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, L305는 다른 아미노산으로 치환되고 V158를 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, L305는 다른 아미노산으로 치환되고 E296은 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, L305는 다른 아미노산으로 치환되고 M298을 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 도메인의 남아있는 위치에서 적어도 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 9 항에 있어서, 프로테아제 도메인의 남아있는 위치에서 최대 20개 추가아미노산을 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:1의 159-170 에서 선택된 위치에 있는 아미노산에 대응하는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO :1의 290-304 에서 선택된 위치에 있는 아미노산에 대응하는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 12 항에 있어서, R304은 Tyr, Phe, Leu, Met로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO :1의 306-312 에서 선택된 위치에 있는 아미노산에 대응하는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 14 항에 있어서, M306을 Asp와 Asn로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 14 항에 있어서, D309를 Ser와 Thr로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 9 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:1의 330-339 에서 선택된 위치에 있는 아미노산에 대응하는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, A274는 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 18 항에 있어서, A274는 Met, Leu, Lys, Arg으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- SEQ ID NO :1의 아미노산 서열에 대해 2개가 치환된 인자 VII 폴리펩티드, 상기 치환은 (i) L305의 다른 아미노산의 치환과 (ii) K157, K337, D334, S336, V158, E296, M298로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- SEQ ID NO :1의 아미노산 서열에 대해 3개가 치환된 인자 VII 폴리펩티드로, 상기 치환은 (i) L305의 다른 아미노산으로의 치환과; (ii) K157, K337, D334,S336, V158, E296, M298로 구성된 군에서 선택된 2개의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 4 개가 치환된 인자Vlla 폴리펩티드로, 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305의 다른 아미노산으로의 치환과; (ⅱ) K157, K337, D334, S336, V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 세 개의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 다섯 개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드로, 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305의 다른 아미노산의 치환과; (ⅱ) K157, K337, D334, S336, V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 네 개의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 여섯 개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드로, 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305의 다른 아미노산으로의 치환과; (ⅱ) K157, K337, D334, S336, V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 다섯 개의 아미노산의 다른 아미노산으로 치환인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 일곱 개의 치환을 포함하는 인자Vlla폴리펩티드로, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305의 다른 아미노산의 치환과; (ⅱ) K157, K337, D334, S336, V158, E296, M298 로 구성된 군에서 선택된 여섯 개의 아미노산의 다른 아미노산으로 치환인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- SEQ ID NO :1 의 아미노산 서열에 대해 여덟 개의 치환을 포함하는 인자Vlla 폴리펩티드와 관련되고, 여기서 상기 치환은 (ⅰ) Lys 305의 다른 아미노산으로의 치환과; (ⅱ) 아미노산 K157, K337, D334, S336,V158, E296, M298의 다른 아미노산의 치환인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항, 제2항, 20항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K157은 Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항, 제 3 항, 20항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K337 은 Ala, Gly, Val, Ser, Thr,Asn, Gin, Asp, Glu로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항, 제 4 항, 20항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D334은 Gly와 Glu로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항, 제 5 항, 20항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S336은 Gly와 Glu로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항, 제 6 항, 20항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 V158은 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항, 제 7 항, 20항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E296은 Arg, Lys, Val로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항, 제 8 항, 20항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 M298은 Lys, Arg, Gin, Asn으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항, 제 8 항, 20항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L305은 Val, Tyr,Ile으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 34 항에 있어서, 상기 L305는 Val로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 12항, 제 14 항, 제 17항 또는 제 18 항, 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산은 폴리뉴클레오티드 구조물에 의해 암호화될 수 있는 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 VII 폴리펩티드는 인간 인자 VII인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 VII 폴리펩티드는 인간 인자 Vlla인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 1항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 VII 폴리펩티드의 활성과 SEQ ID NO :1에 제시된 본래 인자 Vlla 폴리펩티드의 활성사이의 비율이 적어도 약 1.25인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 39 항에 있어서, 상기 비율은 적어도 약 2.0, 바람직하게 적어도 약 4.0인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
- 제 20항에 있어서, L305V/K337A-FVII인 것을 특징으로 하는 인자VII 폴리펩티드.
- 제 20항에 있어서, L305VN158D/E296V/M298Q-FVII인 것을 특징으로 하는 인자VII 폴리펩티드.
- 제 23항에 있어서, L305VN158D/E296V/M298Q/K337A-FVII인 것을 특징으로 하는 인자VII 폴리펩티드.
- 제 1항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 VII 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구조물.
- 제 44 항에 있어서, 벡터인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 구조물.
- 제 44항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 구조물을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제 46 항에 있어서, 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제 47 항에 있어서, 포유동물 기원인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제 48 항에 있어서, 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제 44 항에 정의된 것과 같은 폴리뉴클레오티드 구조물을 함유하고 발현하는 유전자 도입 동물.
- 제 44 항에 정의된 것과 같은 폴리뉴클레오티드 구조물을 함유하고 발현하는 유전자 도입 식물.
- 제 1항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에서 정의된 인자 VII 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 제 46항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 세포를 적절한 성장 배지에서 폴리뉴클레오티드 구조물을 발현하는 조건에서 배양하고 형성된 폴리펩티드를 배양 매체로부터 회수하는 것을 포함하는 방법.
- 제 1항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에서 정의된 인자 VII 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 제 50항에서 정의된 유전자 도입 동물에 의해 생산된 우유로부터 인자 VII 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 방법.
- 제 1항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에서 정의된 인자 VII 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 제 51항에서 정의된 유전자 도입 식물의 세포를 배양하고 식물로부터 인자 VII 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 방법.
- SEQ ID NO :1의 아미노산 서열에 대해 적어도 두 개의 치환을 포함하는 인자Vll 폴리펩티드 및 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 치환은 (i) L305의 다른 아미노산의 치환과, (ii) K157, K337, D334, S336, V158, E296, M298로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 1항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 인자 VII 폴리펩티드와 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- SEQ ID NO :1의 아미노산 서열에 대해 적어도 두 개의 치환을 포함하는 인자Vll 폴리펩티드를 포함하는 약물을 제조하기 위한 인자Vll 폴리펩티드의 사용으로, 상기 치환은 (i) L305의 다른 아미노산으로의 치환과, (ii) K157, K337, D334, S336, V158, E296, M298로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로 치환인 것을 특징으로 하는 인자Vll 폴리펩티드의 사용.
- 제 57 항에 있어서, 약물은 출혈 질환 또는 출혈 에피소드의 치료 또는 정상적 지혈 시스템의 향상을 위한 것임을 특징으로 하는 인자Vll 폴리펩티드의 사용.
- 출혈 질환 또는 출혈 에피소드의 치료 또는 정상적 지혈 시스템의 향상을 위한 약물의 제조를 위한 제 1항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 인자 Vll 폴리펩티드의 사용.
- 제 57항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈우병 A 또는 B의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
- 시험체에서 출혈 질환 또는 출혈 에피소드의 치료 또는 정상적 지혈 시스템의 향상을 위한 방법으로서, 상기 방법은 SEQ ID NO :1의 아미노산 서열에 대해 적어도 2개의 치환을 포함하는 인자 Ⅶ폴리펩티드의 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양을 필요한 시험체에 투여하는 것을 포함하는 방법으로, 상기 치환은 (i) L305의 다른 아미노산으로의 치환과, (ii) K157, K337, D334, S336, V158, E296, M298로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로 의 치환인 것을 특징으로 하는 방법.
- 시험체에서 출혈 질환 또는 출혈 에피소드의 치료 또는 정상적 지혈 시스템의 향상을 위한 방법으로, 상기 방법은 제 1항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에서정의된 것과 같은 인자 Vll 폴리펩티드의 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양을 필요로 하는 시험체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 약제로서 사용하기 위한 제 1항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 인자VII 폴리펩티드.
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| US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
| EP1646398A2 (en) * | 2003-06-13 | 2006-04-19 | Novo Nordisk Health Care AG | Formulations comprising factor viia and a factor vii related polypeptide |
| CN1839203B (zh) | 2003-06-19 | 2011-11-16 | 拜耳医药保健有限公司 | 因子VII或VIIa的GLA结构域变体 |
| ATE547519T1 (de) | 2003-09-09 | 2012-03-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Gerinnungsfaktor-vii-polypeptide |
| JP2007509843A (ja) | 2003-10-07 | 2007-04-19 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子活性を有するハイブリッド分子 |
| PL1711513T3 (pl) | 2003-12-01 | 2014-12-31 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Nanofiltracja roztworów czynnika vii w celu usunięcia wirusów |
| US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
| JP2007522805A (ja) * | 2004-02-03 | 2007-08-16 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 新規化合物 |
| US20060019893A1 (en) * | 2004-07-02 | 2006-01-26 | Genentech, Inc. | Factor VIIa variants |
| ES2395544T3 (es) | 2004-12-23 | 2013-02-13 | Novo Nordisk Health Care Ag | Reducción del contenido de contaminantes proteínicos en composiciones que comprenden una proteína dependiente de la vitamina K de interés |
| EP2975135A1 (en) | 2005-05-25 | 2016-01-20 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
| EP2360170A3 (en) | 2005-06-17 | 2012-03-28 | Novo Nordisk Health Care AG | Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprinsing at least one non-native cysteine |
| US7696318B2 (en) | 2005-07-13 | 2010-04-13 | Novo Nordisk Health Care Ag | Host cell protein knock-out cells for production of therapeutic proteins |
| EP1924689B1 (en) | 2005-09-01 | 2014-08-13 | Novo Nordisk Health Care AG | Hydrophobic interaction chromatography purification of factor vii polypeptides |
| EP2316930A1 (en) | 2005-09-14 | 2011-05-04 | Novo Nordisk Health Care AG | Human coagulation factor VII polypeptides |
| DE602007009956D1 (de) * | 2006-04-07 | 2010-12-02 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Kovalenter faktor vii-gewebefaktor-komplex |
| WO2008025856A2 (en) | 2006-09-01 | 2008-03-06 | Novo Nordisk Health Care Ag | Modified glycoproteins |
| EP1952822A1 (en) * | 2007-01-26 | 2008-08-06 | Novo Nordisk A/S | Factor VII polypeptides with increased affinity to platelets |
| PL2147096T3 (pl) | 2007-04-13 | 2015-08-31 | Catalyst Biosciences Inc | Zmodyfikowane polipeptydy czynnika VII i ich zastosowania |
| WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
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| TWI538916B (zh) | 2008-04-11 | 2016-06-21 | 介控生化科技公司 | 經修飾的因子vii多肽和其用途 |
| US9260518B2 (en) | 2010-06-30 | 2016-02-16 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that are capable of specifically binding tissue factor pathway inhibitor |
| CN103429256B (zh) | 2011-03-02 | 2022-09-13 | 诺和诺德保健股份有限公司 | 凝血因子向活化的血小板上的tlt-1的靶向 |
| PL2717898T3 (pl) | 2011-06-10 | 2019-06-28 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Związki o działaniu prokoagulacyjnym i sposoby ich stosowania |
| WO2014057068A1 (en) | 2012-10-10 | 2014-04-17 | Novo Nordisk Health Care Ag | Liquid pharmaceutical composition of factor vii polypeptide |
| CN109385443B (zh) * | 2017-08-07 | 2022-08-02 | 北京睿诚海汇健康科技有限公司 | 生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用 |
| EP3833381B1 (en) | 2019-08-15 | 2022-08-03 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration |
Family Cites Families (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4203570A (en) | 1978-08-23 | 1980-05-20 | The Western States Machine Company | Power-operated loading gate for centrifugal machines incorporating an auxiliary drive device |
| US4873191A (en) | 1981-06-12 | 1989-10-10 | Ohio University | Genetic transformation of zygotes |
| US4456591A (en) | 1981-06-25 | 1984-06-26 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Therapeutic method for activating factor VII |
| US4546082A (en) | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
| US4599311A (en) | 1982-08-13 | 1986-07-08 | Kawasaki Glenn H | Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor |
| US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
| US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
| JPS60501140A (ja) | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
| NZ207926A (en) | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
| US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| US4870008A (en) | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
| DK58285D0 (da) | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| GR860984B (en) | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
| US4975282A (en) | 1985-06-26 | 1990-12-04 | The Liposome Company, Inc. | Multilamellar liposomes having improved trapping efficiencies |
| EP0625577A1 (en) | 1985-08-29 | 1994-11-23 | Genencor International, Inc. | Heterologous polypeptides expressed in filamentous fungi, processes for their preparation, and vectors for their preparation |
| AU6543286A (en) | 1985-10-25 | 1987-05-19 | Zymogenetics Inc. | Method of using bar1 for secreting foreign proteins |
| DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
| GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
| GB8615942D0 (en) | 1986-06-30 | 1986-08-06 | Animal & Food Research Council | Peptide production |
| NZ221259A (en) | 1986-07-31 | 1990-05-28 | Calgene Inc | Seed specific transcriptional regulation |
| DK323587D0 (da) * | 1987-06-25 | 1987-06-25 | Novo Industri As | Protein |
| US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
| GB8700458D0 (en) | 1987-01-09 | 1987-02-11 | Unvala Ltd | Communications systems |
| EP0832981A1 (en) | 1987-02-17 | 1998-04-01 | Pharming B.V. | DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
| US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
| JP2703598B2 (ja) | 1987-09-04 | 1998-01-26 | ノボ―ノルディスク アクティーゼルスカブ | アスペルギルス菌中でのタンパク質生産物の生産方法およびアスペルギルス菌中で使用するためのプロモーター |
| DK463887D0 (da) | 1987-09-07 | 1987-09-07 | Novo Industri As | Gaerleader |
| GB8826446D0 (en) | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Agricultural & Food Res | Peptide production |
| AU4647889A (en) | 1988-11-18 | 1990-06-12 | Cetus Corporation | Insect signal peptide mediated secretion of recombinant proteins |
| GB8910962D0 (en) | 1989-05-12 | 1989-06-28 | Natural Environment Res | Novel baculovirus expression vectors and use thereof in the expression of foreign proteins in insects or insect cells |
| US5162222A (en) | 1989-07-07 | 1992-11-10 | Guarino Linda A | Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses |
| US5155037A (en) | 1989-08-04 | 1992-10-13 | The Texas A&M University System | Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems |
| US5023328A (en) | 1989-08-04 | 1991-06-11 | The Texas A&M University System | Lepidopteran AKH signal sequence |
| ATE180834T1 (de) | 1990-01-29 | 1999-06-15 | Zymogenetics Inc | Antikoagulierende proteine |
| DK300090D0 (da) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser |
| CA2099562C (en) | 1991-01-11 | 2010-04-20 | William N. Drohan | Expression of active human protein c in mammary tissue of transgenic animals |
| JP4451514B2 (ja) * | 1999-08-24 | 2010-04-14 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 血液凝固第ｖｉｉ因子改変体 |
| RU2278123C2 (ru) * | 2000-02-11 | 2006-06-20 | Максиджен Холдингз Лтд. | Молекулы, подобные фактору vii или viia |
| AU2001254624A1 (en) * | 2000-05-03 | 2001-11-12 | Novo-Nordisk A/S | Human coagulation factor vii variants |
| EP1359935A1 (en) * | 2001-02-05 | 2003-11-12 | Novo Nordisk Health Care AG | Combined use of factor vii polypeptides and factor ix polypeptides |
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