KR20040010739A - 인터루킨-1 수용체 길항물질을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 제약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 유효량의 조절 방출 중합체 및 (b)유효량의 IL-1ra 를 포함하는 융합 단백질을 함유하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 본 조성물은 염증에 대하여 치료학적 효과를 나타내며 IL-1 매개 염증 질환, 특히 관절 질환 치료에 유용하다.

Description

인터루킨-1 수용체 길항물질을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 제약학적 조성물{FUSION PROTEIN COMPRISING INTERLEUKIN-1 RECEPTOR ANTAGONIST AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF}
발명은 염증의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 염증질환을 예방하거나 치료하기 위한 인터루킨-1 수용체 길항물질(Interleukin-1 receptor antagonist, IL-1ra)을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 제약학적 조성물 및 치료방법에 관한 것이다.
염증은 기계적인 손상, 감염 또는 항원 자극에 의해 야기되는 손상에 대한 신체의 방어 반응이다. 염증 반응은, 염증이 자가항원과 같은 부적절한 자극에 의해 유발되어 확장되는 식으로 발현되거나 해로운 인자를 제거한 후에도 상당히 지속될 때 병리학적으로 나타날 수 있다.
염증의 병인학이 제대로 인지되지는 않았지만, 최근에는 분자 측면에 있어서의 염증에 관한 상당한 정보가 수집되고 있다. 이러한 연구로 인해, 염증 매개에 중요한 기능을 하는 것으로 여겨지는 특정 시토킨을 확인하였다. 시토킨은, 특히 시토킨을 합성하고 유리하는 근접 부위에 존재하는 세포의 작용을 변이시키는 세포외 단백질이다. 인터루킨 - 1 (IL - 1) 은 이제까지 밝혀진 염증성 시토킨 및 "인터루킨 - 1 매개 질환" 이라 불리는 여러 질환과 의학적 조건에 있어서 핵심적인 매개체로 여겨지는 시토킨 중 가장 강력한 것이다. 대식세포/단핵세포계의 세포에 의해 생성되는 (독점적이지는 않지만) IL - 1 은 두 형태, 즉 IL - 1 알파 (IL - 1α) 및 IL - 1 베타 (IL - 1β) 로 생성될 것이다.
자연 발생적이거나 실험적인 질환 또는 의학적 조건이 체액 또는 조직내 IL - 1 수준 상승과 관련되거나 신체에서 취한 세포나 조직의 IL - 1 수준이 상승된다면, 이 질환이나 의학적 조건은 "인터루킨 - 1 매개 질환" 으로 간주된다. 다수의 경우에 있어서, 이러한 인터루킨 - 1 매개 질환은 다음의 부가적인 두 조건에 의해 인식되기도 한다 : (1) 이러한 질환이나 의학적 조건과 관련된 병리학적 양상은 IL - 1 투여에 의해 동물에서 실험적으로 나타날 수 있다 ; (2) 이 질환이나 의학적 조건의 실험 동물 모델에서 유도된 병리학은 IL - 1 의 작용을 저해하는 약물로 치료함으로써 억제되거나 소멸될 수 있다. 대부분의 인터루킨 - 1 매개 질환은 세 조건 중 적어도 두 조건을 만족하며, 다수의 인터루킨 - 1 매개 질환은 세 조건 모두를 만족한다. 급성·만성 인터루킨 - 1 (IL - 1) - 매개 염증 질환의 비 - 배타적인 목록은 다음을 포함하지만 다음으로 제한되지는 않는다 : 급성 췌장염 ; ALS ; 알쯔하이머병 ; 악액질/식욕부진 ; 천식 ; 죽상경화증 ; 만성 피로증후군, 열병 ; 당뇨병 (예를들면, 인슐린 당뇨병) ; 사구체신염 ; 이식에 대한 숙주 거부반응 ; 출혈성쇽 ; 통각과민 ; 염증성 배변 질환 ; 골관절염 ; 건선성관절염 및 류마티스성관절염을 포함한 관절의 염증 ; 뇌허혈을 포함한 빈혈 손상 (예를들어, 각각 신경변성을 일으키는 외상, 간질, 출혈이나 발작으로 인한 뇌 손상) ; 폐질환 (예를들어, ARDS) ; 다발성골수종 ; 다발성경화증 ; 골수성 (예를들어, AML 및 CML) 및 기타 백혈병 ; 근증 (예를들어, 근육 단백질 대사, 특히 패혈증) ; 골다공증 ; 파킨슨병 ; 동통 ; 조기분만 ; 건선 ; 재관류 손상 ; 패혈쇽 ; 방사선 치료, 관자놀이의 턱 관절 질환, 종양 전이의 부작용 ; 또는 과다운동, 염좌, 연골 손상, 외상, 외과수술, 감염이나 그외의 질환으로 인한 염증.
관절의 염증은 전세계적으로 수많은 사람들을 괴롭히고 무능력하게 만드는 만성 관절 질환으로서 증상의 심각성도 다양하다. 류마티스성관절염은 관절 연결부의 질환으로서, 연골과 뼈는 활막에서 유도되는 판누스라 불리는 증식성, 침입성의 결합 조직에 의해 서서히 파괴된다. 이 질환은 피하조직, 심혈관계, 폐, 비장, 림프절, 골격근, 신경계 (중추 및 말초) 및 눈과 같은 관절외 조직 뿐만 아니라 건초와 건, 활액낭과 같은 관절주위 조직과 관계된다 [Silberberg (1985), Anderson's Pathology, Kissane(ed.), Ⅱ : 1828 참조]. 골관절염은 관절 주변의 뼈와 연골의 반응성 증식과 관절 연골의 변성 변화를 특징으로 하는 일반적인 관절 질환이다. 골관절염은 연골세포가 이화 및 동화 자극에 대해 부적절하게 반응함으로써 야기되는 세포 - 매개 활성 과정이다. 관절연골의 일부 기질 변화는 초기 골관절염에서 나타나는 것으로 보고되었다 [Theonar 등의 (1993), Rheumatic disease clinics of North America, Moskowitz (ed.),19: 635 - 657 및 shinmei 등의 (1992), Arthritis Rheum.,35: 1304 - 1308 참조].
류마티스성관절염은 면역유전적으로 민감한 숙주에 대해 관련 항원을 제시함으로써 야기되는 것으로 여겨진다. 류마티스성관절염을 일으키는 면역반응을 잠재적으로 시작하게 할 수 있는 항원은 내생성이거나 외생성일 수 있다. 생각할 수 있는 내생성 항원으로는 콜라겐, 무코다당류 및 류마티스성 인자가 포함된다. 외생성 항원에는 마이코플라스마, 마이코박테리아, 스피로키트 및 바이러스가 속한다. 면역 반응의 부산물은 활막 (즉, 프로스타글란딘과 산소기) 에 염증을 일으키며 파괴적인 관절 변화 (즉, 콜라게나제) 를 유도한다.
광범위한 질병의 고통이 있지만, 다수의 환자들이 전반적으로 서서히 진행되는 관절 침식과 기형을 수반하는 간헐적인 재발과 소강의 과정을 겪게 된다. 임상 증상에는 동통, 압통, 상해 관절의 종창 및 기능상실을 수반한 말초 관절의 대칭적 다발성관절염 ; 아침에 뻐근함 ; 및 지속적인 염증 후 연골의 상실, 골물질의 파괴와 관절의 부전탈구가 포함될 것이다. 관절외 증상에는 류마티스성소결절, 류마티스성맥관염, 흉막과 폐의 염증, 공막홍채염, 건조증후군, 펠티증후군 (비종 및 호중구감소증), 골다공증 및 체중 감소가 속한다 [Katz (1985), Am. J. Med.,79: 24 및 Krane 및 Simon (1986), Advances in Rheumatology, Synderman (ed.),70(2): 263 - 284 참조]. 임상 증상은 매우 높은 질병률을 초래하여 환자의 생활을 방해한다.
관절염에 대한 인터루킨 - 1 의 관련성은 두 개의 명확한 증거에 의해 제시되었다. 우선, 인터루킨 - 1 과 그것을 코드하는 mRNA 의 양이 활액 조직과 관절염성 관절의 체액에서 높게 관찰되었다.
예를들어, Buchan 등의 "Third Annual General Meeting of the British Society for Rheumatology ", London, England, November 19 - 21, 1988, J. Rheumatol.,25(2); Fontana 등의 (1982), Rheumatology Int., 2 : 49 - 53 ; 및 Duff 등의 (1988), Monokines and Other Non - Lymphocytic Cytokines, M. Powanda 등의 (eds), pp. 387 - 392 (앨런 알. 리스, 인코포레이티드) 를 참조하라.
둘째, 건강한 관절 조직에 인터루킨 - 1 을 투여하면 수많은 경우에 연골과 뼈가 침식되는 것으로 나타났다. 한 실험에 있어서, 토끼에게 IL - 1 을 관절내 주사하면 생체내에서 연골이 파괴되는 것으로 나타났다 [Pettipher 등의 (1986), Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A.,83: 8749 - 8753 참조]. 다른 실험에서 IL - 1 은 조직 이식시 연골과 뼈 둘다를 퇴화시키는 것으로 나타났다 [Saklatavala 등의 (1987), Development of Diseases of Cartilage and Bone Matrix, Sen 및 Thornhill (eds.), pp. 291 - 298 (앨런 알. 리스, 인코포레이티드) 및 Stashenko 등의 (1987), The American Association of Immunologists,183: 1464 - 1468 참조]. IL - 1 과 관절염 사이의 일반적인 관계를 설명하는 데 사용되는 이론중 일반적으로 용인되는 것은, IL - 1 이 섬유아세포와 연골세포와 같은 다양한 세포 유형을 자극하여 프로스타글란딘 E2및 금속단백질분해효소와 같은 전 - 염증성 또는 분해 화합물을 생산하고 분비한다는 것이다.
인터루킨 - 1 수용체 길항물질 (IL - 1ra) 은 인터루킨 - 1 의 천연 저해제로서 작용하는 인체 단백질이다. IL - 1 수용체 길항물질은 IL - 1 매개 질환의 임상 치료에 유용한 잠재 약물로 기술되어 있다 (오스트레일리아 특허 번호 제 649245 호 참조). 그러나, IL - 1ra 는 비교적 반감기가 짧다. 따라서 IL - 1 매개 질환을 치료하기 위해 조절 방출 제제형으로 투여하는 것이 바람직할 것이다.
조절 방출 제제형에 유용한 물질 중 하나는 하이알루론산이다. 하이알루로산은 가지안난 사슬의 D - 글루코론산 및 N - 아세틸 - D - 글루코사민 잔기로 이루어진 자연 발생적인 무코다당류이다. 중합체의 평균 분자량은 (5 - 6) X 106이며, 높은 생체적합성을 나타낸다. 관절 연골의 경우, 하이알루론산은 프로테오글리칸과 응집함으로써 연골 기질 구성에 중요한 역할을 한다. 또한 류마티스성관절염, 골관절염 및 감염성관절염과 같은 병리학적 조건하에서 관절내 하이알루론산의 농도와 분자량이 변하며 활액과 유사하게 변하는 것으로 보고되었다.
하이알루론산의 화학적 교차결합 및 유도체화는 특정 약물의 분해 시간을 증가시키거나 하이알루론산의 유동학적 특성을 강화시키는 데 사용되었다 [Cortivo 등의 (1991), Biomaterials, 2 : 727 - 730 ; Benedetti 등의 (1990), J. Controlled Release,13: 33 - 41 및 Hunt 등의 (1990), J. Controlled Release,12: 159 - 169 참조].
높은 분자량을 갖는 하이알루론산 유도체를 주사하면 관절연골 표면에 손상된 하이알루론산 층이 회복되고 임상 실험 및 기초 실험시 일부 관절 상태를 치료하는 데 유효하다. 관절 상태를 치료하기 위해 하이알루론산 유도체를 사용하는 것에 대하여 기술되어 있는 과학 간행물의 예에는 Nizolek & White (1981), Cornell Vet.,71: 355 - 375 ; Namiki 등의 (1982), Int. J. Chem. Pharmacol., Therapy and Toxicol.,20: 501 - 507 ; Asheim and Lindblad (1976), Acta Vet Scand,17(4) : 379 - 394 ; Svanstrom (1978), Proceedings of the 24th Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners, St Louis, Mo., p.345 - 348 ; Wigren 등의 (1975) , Upsala J Med Sci Suppl,17: 1 - 20 ; 및 Gingerich 등의 (1980), Res Vet Sci,30: 192 - 197 이 포함된다. 인체 관절에 대한 하이알루론산의 이용은 Peyron 등의 (1974), Pathologie Biologie,22(8): 731 - 736 문헌에 보고되어 있다. 말의 관절에 하이알루론산을 관절내 이용하는 것은 파마시아의 HylartilTM과 Hylartin VTM상품 및 스테리벳 (Sterivet) 의 SynacidTM상품과 함께 상업적으로 발전해 왔다. 그러나 관절 질환 치료에 있어서 동통과 뻐근함 같은 증상이 심각한 문제이지만, 하이알루론산이 이러한 증상을 직접적으로 개선시키지는 못한다.
또한, 하이알루론산은 약물 수송에도 사용되었다. 한 과학 간행물에는 여러 동물, 특히 말의 관절에 하이알루론산을 단독으로 사용하는 것과 코티존과 함께 사용하는 것에 대하여 기술되어 있다 [Rydell 등의 (1971), Clinical Orthopaedics and Related Research,80: 25 - 32 참조]. 다른 과학 간행물에는 하이알루론산 에스테르로부터 중심체 제제를 인슐린의 비측 수송에 이용하는 것에 관하여 기술되어 있다 [Illum 등의 (1994), J. Controlled Release,29: 133 - 141 참조]. 유화/용매 증발 기술에 의해 블랭크 스피어 (blank sphere) 를 제조하여 인슐린 용액에 1 시간동안 노출시킨 다음 동결건조시켰다. 양에게 가했을 경우, 피하 경로로 인슐린을 투여했을 때에 비하여 평균 생체내이용율이 11 % 인 것으로 나타났다. 이러한 시스템은 신경 성장 인자의 수송 장치로도 사용되어 왔다 [Ghezzo 등의 (1992), Int. J. Pharm.,87: 21 - 29 참조]. 그러나, 생리학적 농도(3 mg/ml) 의 분자량이 크거나 (Mr6 X 106) 분자량이 작은 (Mr 5 X 106) 하이알루론산을 방사성 알부민과 혼합하여 개의 무릎 관절에 주사할 경우, 무릎 관절에서의 알부민 분포 부피 및 정화율이 약간 초과되는데 분자량이 큰 하이알루론산의 농도(0.03 mg/ml) 또는 분자량이 작은 하이알루론산의 농도(0.3 mg/ml) 는 감소하였다고 보고되었다 [Myers 및 Brandt (1995), J. Rheumatol.,22: 1732 - 1739 참조]. 이 문헌에는 IL - 1ra 와 같은 단백질과 하이알루론산을 조합하면 하이알루론산을 단독으로 염증 질환 치료에 사용, 특히 관절내 주사를 통해 투여했을 때와 마찬가지로 유효하지 않음을 제시하고 있다.
본 발명의 목적은 IL - 1 매개 염증 질환의 치료 방법 및 조성물을 제공하는 것이다. 이러한 본 발명의 목적과 그외의 목적은 하기 상세한 설명에서 명백해질 것이다.
본 발명은 카르복시-말단에서 인체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 불변 영역 중 일부 또는 전부를 갖는 IL-1ra 를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 IL - 1 매개 염증 질환을 치료하기 위한 약제로서 조절 방출 중합체 (예를들어, 하이알루로난) 와 융합 단백질을 함유하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 본원에 언급한 치료 유형은 인체를 포함한 포유동물에 대한 것이다.
본 발명의 제약학적 조성물은 조절 방출 중합체 (예를들어, 하이알루로난) 및 단백질성 IL - 1 저해제 (예를들어, IL - 1ra 융합체) 혼합물을 함유한다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명은 IL - 1ra 수준을 비교적 지속적으로 상승시키는, 하이알루로난과 단백질성 IL - 1 저해제 (예를들어, IL - 1ra 융합체) 를 함유하는 제약학적 제제형을 투여하는 것에 관한 것이다. 콜린스에 의해 1996년 2월 9일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제 60/011,419 호 (가출원시 발명의 명칭 "염증성 당뇨병 치료용 조성물 및 치료방법", 대리인 참고번호 제 A - 365P 호), 콜린스 및 베빌락쿠아에 의해 1996년 12월 6일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제 60/032,789 호 (가출원시 발명의 명칭 "염증성 당뇨병 치료용 조성물 및 치료방법", 대리인 참고 번호 제 A - 365A - P 호) 및 콜린스 및 베빌락쿠아에 의해 1997년 1월 23 일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제 US 60/036,241 호 (가출원시 발명의 명칭 "염증성 당뇨병 치료용 조성물 및 치료방법", 대리인 참고 번호 제 A - 365B - P 호) 를 본원에서 참고문헌으로 인용한다.
인터루킨 - 1 저해제는 IL - 1에 대한 세포 수용체의 활성화를 특이하게 막을 수 있는 모든 단백질일 수 있다. 인터루킨 - 1 저해제의종류에는 다음이 포함된다 : 하기한 IL - 1ra 와 같은 인터루킨 - 1 수용체 길항물질 ; 항 - IL - 1 수용체 모노클로날 항체 (EP 623674) ; 가용성 IL - 1 수용체와 같은 IL - 1 결합 단백질 (미국 특허 번호 제 5,492,888 호, 제 5,488,032 호, 제 5,464,937 호, 제 5,319,071 호 및 제 5,180,812 호) ; 항 - IL - 1 모노클로날 항체 (WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, U.S. 4,935,343 EP 364778, EP 267611 및 EP 220063) ; 및 IL - 1 수용체 부속 단백질 (WO 96/23067), 상기 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용한다.
바람직한 IL - 1ra (글리코실화된 것과 글리코실화되지 않은 것) 및 그것의 제조방법과 이용방법에 대하여는 미국 특허 번호 제 5,075,222 호 (본원에서는 '222 특허로도 언급함) ; WO 91/08285 ; WO 91/17184 ; AU 9173636 ; WO 92/16221 및 WO 96/22793 에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용한다.
특히, IL - 1ra 의 세가지 유용한 형태 (IL - 1raα, IL - 1raβ 및 IL - 1rax) 와 그것의 변이체는 '222 특허에 기술되어 있다. IL - 1raα 는 SDS - PAGE 상에서 22 - 23 kD 분자로서 등전점이 약 4.8 이며 트리스 완충액, pH 7.6 에서 약 52 mM NaCl 로 Mono Q FPLC 컬럼에서 용리시킴을 특징으로 한다. IL - 1 raβ 는 22 - 23 kD 단백질로서 48 mM NaCl 로 Mono Q 컬럼에서 용리시킴을 특징으로 한다. IL - 1rax 는20 kD 단백질로서 48 mM NaCl 로 Mono Q 컬럼에서 용리시키며 글리코실화되지 않은 것이 특징이다. 이들 세 저해제 모두는 유사한 기능상 활성도 및 면역학적 활성도를 갖는다.
IL - 1ra 를 생산하는 방법 중 하나는 그것이 자연적으로 생산될 경우에 인체 단구세포로 분리하는 것으로 이루어져 있다. 두번째로 기술되어 있는 방법은 IL - 1ra 를 코드하는 유전자를 분리하고 적당한 벡터와 세포에서 유전자를 클로닝하여 저해제를 생산하는 유전자를 발현시킨 다음 저해제를 수집함을 포함한다. 후자가 일반적으로 DNA 재조합 방법으로서 바람직한 방법이다. DNA 재조합 방법은 그것이 비교적 다량의 단백질을 보다 높은 순도로 얻을 수 있기 때문에 어느 정도는 바람직하다. 따라서, 본 발명은 E. coli 와 같은 원핵 세포에서의 발현 산물로서 N - 말단 메티오닐기를 함유하는 IL - 1ra 도 포함한다.
위에 언급한 바와 같이, 본 발명은 IL - 1ra 의 변이체도 포함한다. 본원에 사용한 IL - 1ra 변이체는 아미노산이 IL - 1ra 의 아미노산 서열에 속하는 잔기로부터 (1) 삭제되거나 ("결실 변이체"), (2) 잔기내로 삽입되거나 ("부가 변이체") , (3) 잔기를 치환한 ("치환 변이체") 변이 폴리펩티드를 포함한다.
IL - 1ra 의 결실 변이체의 경우, 일반적으로 각 폴리펩티드는 약 1 내지 30 개의 잔기가 삭제된 아미노산 서열을 가지며, 보다 일반적으로는 약 1 내지 10 개의 잔기, 가장 일반적으로는 약 1 내지 5 개의 연속적인 잔기가 삭제된 아미노산 서열을 가질 것이다. N - 말단 삭제, C - 말단 삭제 및 서열 내부가 삭제된 것도 생각할 수 있다. IL - 1ra 아미노산 서열내 삭제는 IL - 1 군 중 다른 멤버와 서열 상동성이 낮은 부위에서 이루어질 것이다. IL - 1ra 아미노산 서열내 삭제는 IL - 1 군 중 다른 멤버의 서열과 실질적으로 상동인 영역에서도 이루어질 수 있으며, 이것은 생물학적 활성도를 상당히 변화시킬 것이다.
IL - 1ra 부가 변이체의 경우, 각 폴리펩티드는 1 내지 100 개 또는 그 이상의 잔기가 아미노 - 말단 및/또는 카르복시 - 말단에 통합된 융합체 뿐만 아니라 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기가 서열 내부에 삽입된 것도 포함할 것이다. 내부 삽입은 일반적으로 약 1 내지 10 개의 아미노산 잔기가 삽입되며, 보다 일반적으로는 약 1 내지 5 개, 가장 일반적으로는 약 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 삽입된다.
아미노 - 말단 부가 변이체는 메티오닌 부가 (예를들어, 박테리아 재조합 세포 배양액내 단백질의 직접 발현 산물) 또는 부가적인 아미노산 잔기나 서열의 부가를 포함한다. 아미노 - 말단 부가의 다른 예로서, 재조합 숙주 세포로부터의 단백질 분비를 용이하게 하기 위하여 시그날 서열 뿐만아니라 그외의 프리 - 프로 서열의 삽입도 포함된다. 각 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱, 즉 시그날 펩티다제에 의해 절단되도록 선택된 시그날 서열을 포함한다. 천연 IL - 1ra 시그날 서열을 인식하여 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 각 폴리펩티드는 예를들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제 또는 열에 안정한 엔테로톡신 Ⅱ 리더로 이루어진 군에서 선택한 원핵 시그날 서열을 포함할 것이다. 효모 세포의 경우, 각 폴리펩티드는 예를들어 효모 인베르타제, 알파 인자 또는 산 포스파타제 리더 서열 중에서 선택한 시그날 서열을 가질 것이다. 포유동물 세포 발현의 경우, 각 폴리펩티드는 IL - 1ra 의 천연 시그날 서열을 가지기는 하나 그외의 포유동물의 시그날 서열, 예를들어 IL - 1 군의 멤버 중에서 유래한 서열이 적합할 것이다.
카르복시 - 말단 부가 변이체는 키메라 단백질을 포함하는데, 여기에서 각각은 인체 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 전부 또는 일부를 갖는 IL - 1ra 융합체를 포함한다. 이러한 키메라 단백질이 바람직한데, 각각의 면역글로불린 부분은 IgG, IgA, IgM 또는 IgE (특히 IgG, 예를들어 IgG1 또는 IgG3) 와 같은 인체 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 첫번째 도메인을 제외한 모든 도메인을 포함한다. IL - 1ra가 IL - 1 수용체에 대해 길항작용을 할 수 있고 면역글로불린 부분이 그것의 특성 중 하나 또는 그 이상을 나타내기만 한다면, 각 면역글로불린 부분의 모든 아미노산이 삭제되거나 하나 또는 그 이상의 아미노산으로 치환될 수 있거나, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 부가될 수 있을 것으로 숙련자들은 인식할 것이다.
IL - 1ra 치환 변이체의 경우, 이러한 각 폴리펩티드는 IL - 1ra 의 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 제거되며 그 위치에 다른 잔기가 삽입될 것이다. 치환 변이체는 대립형질 변이체를 포함하는데, 이것은 아미노산을 치환시키거나 그렇지 않은 종 집단에서의 자연 발생적인 누클레오티드 서열 변화를 특징으로 한다. 본 분야의 숙련자들은 가능한 돌연변이 부위의 선택에 있어서 폴리펩티드의 결합 부위 또는 활성 부위에 대하여 공지된 모든 정보를 이용할 수 있다. 전형적인 치환 변이체는 WO 91/17184, WO 92/16221 및 WO 96/09323 에 나타나 있다.
단백질의 돌연변이 유발 영역 또는 아미노산 잔기를 확인하기 위한 한 방법을 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발" 이라 명명한다 [Cunningham 및 Wells (1989), Science,244: 1081 - 1085 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 이 방법으로 단백질의 표적 잔기의 아미노산 잔기 또는 기를 확인하고 (예를들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu 와 같은 하전 잔기), 세포내외의 주변 수성 환경과 아미노산이 상호작용하도록 중성 또는 음전하 아미노산 (알라닌이나 폴리알라닌이 가장 바람직함) 으로 치환한다. 이들 잔기는, 치환 부위에 부가 잔기 또는 교체 잔기를 도입함으로써 치환체에 대한 기능상 민감성이 순화됨을 나타낸다. 따라서, 아미노산 서열 변이 부위를 미리 결정하고, 주어진 부위에서의 돌연변이 능력이 최적화되도록 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발을 실시한 다음, 바람직한 활성과 활성도가 최적이 되도록 결과적인 변이 폴리펩티드를 선별한다.
치환적인 돌연변이 유발에 대하여 가장 흥미로운 부위는, IL - ra 에서 나타나는 아미노산이, 다른 다양한 종 또는 그외의 IL - 1 군 중 다른 멤버들의 IL - 1ra 아미노산과 같은 IL - 1ra - 유사 단백질과 곁사슬 크기, 전하 및/또는 소수성 면에서 실질적으로 다른 부위이다. 그외의 흥미로운 부위는 IL - 1ra 의 특정 잔기가 이러한 IL - 1ra - 유사 단백질의 특정 잔기와 동일한 부위를 포함한다. 이러한 위치는 일반적으로 단백질의 생물학적 활성도에 중요하다. 우선, 비교적 보존적인 방법으로 이들 부위를 치환시킨다. 이러한 보존적인 치환은 "바람직한 치환" 이라는 표제하에 표 1 에 나타나 있다. 만약 이러한 치환으로 생물학적 활성도가 변한다면, 보다 효과적인 치환 (전형적인 치환) 을 도입하고/하거나 그외의 부가/결실을 실시하여 그결과 생성된 폴리펩티드를 선별하였다.
IL - 1ra 의 아미노산 서열에 대한 보존적인 변이 (및 코딩 핵산 서열에 대한 상응 변이) 로 유사한 기능상·화학적 특성을 갖는 단백질을생산할 수 있을 것으로 기대된다. 그와는 대조적으로, IL - 1ra 의 기능상 및/또는 화학적 특성의 효과적인 변이는 다음을 유지시키는 효과가 상당히 달라지는 치환을 선택함으로써 이루어질 것이다 : (a) 치환 영역의 폴리펩티드 골격구조, 예를들어 쉬트 또는 나선 입체형태, (b) 표적 부위에서 단백질의 전하 또는 소수성 또는 (c) 곁사슬 크기. 자연 발생적인 잔기는 일반적인 곁사슬 특성에 따라 다음과 같이 나누어진다 :
(1) 소수성 : 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile ;
(2) 중성 친수성 : Cys, Ser, Thr ;
(3) 산성 : Asp, Glu ;
(4) 염기성 : Asn, Gln, His, Lys, Arg ;
(5) 방향성 : Trp, Tyr, Phe ; 및
(6) 사슬 배향을 좌우하는 잔기 : Gly, Pro.
비 - 보존적인 치환은 이들 군 중 한 멤버를 다른 군으로 치환하는 것에 관한 것이다. 이렇게 치환된 잔기는 그외의 IL - 1 군과 상동이거나 그렇지 않은 IL - 1ra 의 영역내로 도입될 것이다.
IL - 1ra 서열의 특정 돌연변이는 N - 말단, C - 말단 또는 N - 결합이나 O - 결합 탄화수소를 부가하여 변이시킨 단백질의 모든 부위에서 비 - 자연 아미노산을 치환하는 것을 포함할 것이다. 이러한 변이는아미노산 (예를들어, 시스테인) 부가와 같이 특별하게 사용할 수 있는데, 하기한 바와 같이 유도체를 형성시키기 위해 수용성 중합체와 결합시키는 것이 유리하다. 또한 글리코실화 부위를 가하거나 N - 결합 또는 O - 결합 글리코실화 부위를 결실시키기 위해 IL - 1ra 서열을 변이시킬 수 있다. 아스파라긴 - 결합 글리코실화 인식 부위는 트리펩티드 서열을 포함하는데, 이것은 적당한 세포내 글리코실화 효소에 의해 특이하게 인식된다. 이들 트리펩티드 서열은 Asn - Xaa - Thr 또는 Asn - Xaa - Ser 중 하나이며, 여기에서 Xaa 는 Pro 이외의 모든 아미노산일 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 변이체는 IL - 1ra 의 아미노산 (서열 2) 에 대하여 실질적으로 상동이다. 본원에 사용한 용어 "실질적으로 상동" 이란 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 더더욱 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 정도의 상동성을 의미한다. 본원에 기술한 상동성의 백분율은, 본원에서 참고문헌으로 인용한 Dayhoff 의 Atlas of Protein Sequence and Structrue, 5 : 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. 에 기술되어 있는 바와 같이 비교되는 서열의 동일 아미노산 잔기와 일직선이 되게 하여 두 서열 중 더 작은 서열에서 발견되는 아미노산 잔기의 백분율로서 계산하며, 이때 그와 같은 정렬을 돕기 위해 100 개 아미노산길이에 4 개의 갭을 도입시킬 수 있다. 실질적으로 상동인 것에는, 서열 2 의 아미노산 서열에 대한 항체와의 교차 - 반응에 의해 분리한 IL - 1ra 또는 서열 1 이나 그것의 단편의 DNA 와 혼성시킴으로써 분리한 유전자의 변이체도 포함된다.
IL - 1ra 의 변이체 산물은 아래에 더 상세히 기술되어 있다. 이러한 변이체는 IL - 1ra 의 변이체를 코드하는 DNA 내로 적당한 누클레오티드를 치환시키거나 IL - 1ra 의 바람직한 변이체의 시험관내 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다. 최종적인 IL - 1ra 변이체가 생물학적 활성도를 갖도록 결실, 삽입 및 치환을 다양하게 조합할 수 있을 것으로 본 분야의 숙련자들에게 인지될 것이다.
하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 선택하여 치환하거나 삽입하고 결실시키는 돌연변이유발 기술은 본 분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다 (예를들어 본원에서 참고문헌으로 인용한 미국 특허 번호 제 4,518,584 호를 참조하라). 각 아미노산 서열 변이체의 구성에 있어서는, 돌연변이 부위의 위치와 돌연변이체의 성질이라는 가변적인 두 개의 원칙이 존재한다. 각 변이체를 고안함에 있어서, 각 돌연변이 부위의 위치와 각 돌연변이체의 성질은 변이되는 생화학적 특성에 따라 좌우될 것이다. 각 돌연변이 부위는 개별적으로 또는 연속적으로변이시킬 수 있는데, 예를들어 (1) 우선 보존적 아미노산 선택물로 치환시킨 다음 이루고자 하는 결과에 따라 라디칼 선택물로 더 치환시키고 (2) 표적 아미노산 잔기를 결실시키거나 (3) 위치가 정해진 이 부위에 인접하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 삽입시킴으로써 변이시킬 수 있다.
화학적으로 변이시킨 IL - 1ra 유도체와 IL - 1ra 변이체는 본원에 기술된 바와 같이 본 분야의 숙련자들에 의해 제조될 수 있다. 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 IL - 1ra 또는 탈 - 글리코실화된 IL - 1ra 및 IL - 1ra 변이체를 이용하여 복합체를 제조할 수 있다. 전형적으로는, 글리코실화되지 않은 IL - 1ra 와 IL - 1ra 변이체를 사용할 것이다. IL - 1ra 및 IL - 1ra 변이체의 유도체화에 적당한 화학적 부분은 수용성 중합체를 포함한다.
수용성 중합체는 그들 각각이 부착되는 단백질이 생리학적 환경과 같은 수성 환경에서 침전되지 않기 때문에 바람직하다. 치료학적 산물이나 조성물을 제조하기 위한 중합체는 제약학적으로 용인가능한 것이 바람직하다. 본 분야의 숙련자들은 중합체/단백질 복합체를 치료학적으로 사용할 것인지, 만약 그렇다면 바람직한 투여량, 순환 시간 및 가수분해에 대한 내성과 같은 고려사항들을 고려하여 바람직한 중합체를 선택할 수 있을 것이다.
임상적으로 용인가능한, 적합한 수용성 중합체는 다음을 포함하지만 그것으로 제한되지는 않는다 : 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 모노메톡시 - 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로스 덱스트란, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리비닐 피롤리딘, 폴리 - 1, 3 - 디옥소란, 폴리 - 1, 3, 6 - 트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리 (β - 아미노산) (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 폴리 (n - 비닐 피롤리딘) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체 (PPG) 및 그외의 폴리알킬렌 산화물, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (POG) (예를들어, 글리세롤) 및 그외의 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리옥시에틸화된 소르비톨 또는 폴리옥시에틸화된 글루코스, 콜론산 또는 그외의 탄수화물 중합체, 피콜 또는 덱스트란 및 그것의 혼합물.
본원에 사용한 폴리에틸렌 글리콜은 모노 - (C1 - C10) 알콕시 - 또는 아릴록시 - 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다른 단백질을 유도하는 데 사용하는 모든 형태를 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그것의 물에 대한 안정성 때문에 제조에 유리할 것이다.
수용성 중합체 각각은 모든 분자량일 수 있으며 가지난 것이거나그렇지 않은 것일 수 있다. 수용성 중합체 각각은 일반적으로 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 의 평균 분자량을 갖는다 (용어 "약" 은 수용성 중합체의 제조시에 일부 분자가 언급된 분자량보다 더 크거나 다소 작을 수 있음을 의미한다). 각 수용성 중합체의 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 약 12 kDa 내지 약 25 kDa 이며, 약 20 kDa 이 가장 바람직하다. 일반적으로, 분자량이 크거나 가지가 많이 난 것일수록 중합체 : 단백질의 비가 커진다. 바람직한 치료 프로필 (예를들어, 지속적인 방출 기간 ; 효과, 얼마라도 존재한다면 생물학적 활성도 ; 취급의 용이성 ; 항원성 정도와 결핍 및 그외의 치료학적 단백질에 대하여 공지된 수용성 중합체의 효과) 에 따라 다른 크기를 사용할 수 있다.
각 수용성 중합체는 단백질의 기능상 · 항원성 도메인에 미치는 영향을 고려하여 단백질에 부착되어야 한다. 일반적으로 화학적 유도체화는 활성 중합체 분자와 단백질을 반응시키는 데 사용하는 모든 적당한 조건하에서 실시할 수 있다. 활성 부분에 대하여 중합체를 결합시키는 데 사용할 수 있는 활성기는 다음을 포함한다 : 술폰, 말레이미드, 설프히드릴, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지디린, 옥시란 및 5 - 피리딜.
각 수용성 중합체는 일반적으로 아미노산의 α - 또는 ε - 아미노기 또는 반응성 티올기에서 단백질에 결합하지만, 수용성 중합체는 적당한 반응 조건하에서 수용성 기에 결합되기에 충분히 반응성인 단백질의 모든 반응기에 결합할 것으로 여겨진다. 따라서, 수용성 중합체는 유리 아미노기 또는 유리 카르복시기와 같은 반응기를 통해 단백질에 공유결합할 것이다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기는 리신 잔기와 N - 말단 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 유리 카르복시기는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C - 말단 아미노산 잔기를 포함할 것이다.
수용성 중합체와 결합한 단백질의 제조방법은 일반적으로 각각 다음 단계를 포함할 것이다 : (a) 조건하에서 단백질을 수용성 중합체와 반응시킴으로써 하나 또는 그 이상의 수용성 중합체와 단백질을 결합시키는 단계 및 (b) 반응산물을 수득하는 단계. 각 복합체에 대한 반응 조건은 본 분야에 공지된 모든 조건이나 그것을 발전시킨 조건 중에서 선택할 수 있지만, 단백질을 변이시켜 불활성화되도록 하는 반응 조건, 즉 온도, 용매, pH 에 노출시키는 것은 피하거나 제한하도록 선택해야 한다. 일반적으로 반응에 알맞은 최적 반응 조건은 공지된 파라미터와 바람직한 결과를 바탕으로 경우에 따라 결정될 것이다. 예를들어, 수용성 중합체 : 단백질 복합체의 비가 커질수록, 복합체 산물의 백분율이 커진다.최적비 (반응하지 않는 단백질이나 중합체가 남지 않는 반응 효율) 는 여러 인자, 즉 원하는 유도체화의 정도 (예를들어, 모노 - , 디 -, 트리 - 등), 선택한 중합체의 분자량, 중합체가 가지난 것인지 아닌지 여부 및 사용된 반응 조건에 의하여 결정될 것이다. 단백질에 대한 수용성 중합체 (예, PEG) 의 비는 일반적으로 1 : 1 내지 100 : 1 이다. 표준 정제 기술, 특히 투석, 염석, 한외여과, 이온 - 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동을 이용하여 각 혼합물로부터 정제된 복합체 중 하나 또는 그 이상을 정제하였다.
N - 말단을 화학적으로 변이시킨 단백질이 특히 바람직하다. 분자량, 가지난 것인지의 여부, 반응 혼합물내 단백질 (또는 펩티드) 분자에 대한 수용성 중합체의 비율, 실시되는 반응 형태 및 N - 말단을 화학적으로 변이시킨 단백질을 선택하여 수득하는 방법에 따라 수용성 중합체를 선택할 것이다. N - 말단을 화학적으로 변이시킨 단백질 제제를 수득하는 방법 (필요하다면 모노 - 유도된 부분들 중에서 이 단백질 제제를 분리하는 방법) 은 화학적으로 변이시킨 단백질 분자 집단에서 N - 말단을 화학적으로 변이시킨 단백질 물질을 정제하는 것이다. 선택적인 N - 말단의 화학적 변이는 환원성 알킬화에 의해 이루어질 수 있는데, 이것은 특정 단백질의 유도체화에 이용할 수 있는 상이한 형태의 일차 아미노기 (리신 대 N - 말단) 의 차등적 반응성을 이용한 것이다. 적당한 반응 조건하에서, 카르보닐기를 수반하는 중합체와 단백질을 N - 말단에서 선택적으로 유도체화시킨다. 예를들어, 리신 잔기의 ε - 아미노기와 단백질의 N - 말단 잔기의 ε - 아미노기 사이의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH 에서 반응을 실시함으로써, 단백질의 N - 말단에 대하여 수용성 중합체를 선택적으로 결합시킬 수 있다. 이러한 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 대한 수용성 중합체의 결합을 조절한다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 주로 발생하며 다른 반응기에 대하여, 즉 리신 곁사슬 아미노기에 대하여 유의할만한 변이는 일어나지 않았다. 환원성 알킬화를 이용하여, 수용성 중합체는 상기에 언급한 형태가 될 수 있으며 단백질에 결합하는 단일 반응성 알데히드를 가질 수 있을 것이다. 단일 반응성 알데히드를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드를 사용할 수 있다.
본 발명은 특히 모노 - 또는 폴리 - (예, 2-4) PEG 부분을 포함하는, 화학적으로 유도한 단백질에 관한 것이다. 폴리에틸렌 글리콜화는 본 분야에 공지된 모든 폴리에틸렌 글리콜화 반응에 의해 실시할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질 산물의 제조방법은 일반적으로 다음 단계를 포함한다 : (a) 조건하에서 폴리에틸렌 글리콜 (즉, PEG 의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체) 과 단백질을 반응시킴으로써 하나 또는 그 이상의 PEG 기에 단백질을 결합시키는 단계 및 (b) 반응 산물을수득하는 단계. 일반적으로, 반응을 위한 최적 조건은 공지된 파라미터와 원하는 결과를 근거로 경우에 따라 결정될 것이다.
본 분야의 숙련자들이 이용할 수 있는 결합방법은 매우 많다. 예를들어, EP 0 401 384 ; Malik 등의 (1992), Exp. Hematol.,20: 1028 - 1035 ; Francis (1992), Focus on Growth Factors,3(2): 4 - 10, (영국 런던 엔20 오엘디 프리에른 바네트 레인 마운틴 코트 소재 메디스크립트에서 발행됨) ; EP 0 154 316 ; EP 0 401 384 ; WO 92/16221 ; WO 95/34326 ; 및 폴리에틸렌 글리콜화에 대하여 본원에서 언급한 간행물을 참조하라. 이들 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용한다.
특히 폴리에틸렌 글리콜화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 산물은 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 포함하는데, 여기에서 PEG 기는 아실기 또는 알킬기를 통해 결합된다. 이러한 산물은 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화되거나 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된다 (예를들어, 2 - 6 개의 PEG 기, 바람직하게는 2 - 5 개의 PEG 기를 함유한다). PEG 기는 일반적으로 아미노산의 α - 아미노기나 ε - 아미노기에서 단백질에 결합되지만, 적당한 반응 조건하에서 PEG 기에 결합할 수 있을 정도로 반응성인 단백질의 모든 아미노기에 결합할 수 있을 것으로 생각된다.
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 의 활성 에스테르 유도체와 단백질을 반응시키는 것이다. 아실화 반응의 경우, 선택된 중합체는 단일 반응성 에스테르기를 가져야 한다. 모든 공지된 반응성 PEG 분자 또는 이후에 발견된 PEG 분자를 폴리에틸렌 글리콜화 반응을 실시하는 데 사용할 수 있다. 바람직한 활성 PEG 에스테르는 N - 히드록시숙시니미드 (NHS) 에 대하여 에스테르화한 PEG이다. 본원에 사용한 "아실화"는 PEG 와 같은 수용성 중합체와 치료학적 단백질 간의 다음과 같은 결합 형태를 포함하며 이것으로 제한되지 않는다 : 아미드, 카바메이트, 우레탄 등 [Chamow (1994), Bioconjugate Chem.,5(2): 133 - 140 참조]. 반응 조건은 폴리에틸렌 글리콜화 분야에서 공지된 모든 조건이나 그 이후에 개발된 조건들 중에서 선택할 수 있으나, 단백질을 변이시켜 불활성화되도록 하는 온도, 용매 및 pH 조건은 피해야 한다.
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 생산한다. 바람직한 연결 결합은 아미드이다. 또한 실질적으로 모노-, 디- 또는 트리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 결과 산물이 > 95 % 인 것이 바람직하다. 그러나, 고도로 폴리에틸렌 글리콜화된 일부 종이, 사용한 특정 반응 조건에 따라 다량으로 형성될 수도있다. 필요하다면, 투석, 염석, 한외여과, 이온 - 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동을 특히 포함하는 표준 정제 방법을 이용하여 혼합물 (특히, 반응하지 않은 종) 로부터 보다 정제된 폴리에틸렌 글리콜화 종을 분리할 수 있다.
알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 환원제의 존재시에 PEG 의 말단 알데히드 유도체를 단백질과 반응시킴을 포함한다. 환원성 알킬화 반응의 경우, 선택한 중합체는 단일 반응성 알데히드기를 가져야 한다. 전형적인 반응성 PEG 알데히드는 물에 안정한 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드 또는 그것의 모노 C1 - C10 알콕시 아릴록시 유도체이다(미국 특허 제 5,252,714 호 참조).
알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화 역시 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 생산한다. 또한 실질적으로 단백질 (즉, 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질) 의 N - 말단의 α - 아미노기에서만 폴리에틸렌 글리콜화되도록 반응 조건을 조작할 수 있다. 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화나 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화 중 하나에 있어서, PEG 기는 - CH2-NH- 기에 의해 단백질에 결합되는 것이 바람직하다. 특히 - CH2- 기에 대하여, 이러한 형태의 결합을 본원에서는 "알킬" 결합으로 규정한다.
실질적으로 균질인 모노 - 중합체/단백질 산물을 생산하기 위한 환원성 알킬화는 일반적으로 다음 단계를 포함한다 : (a) 단백질의 아미노 말단에서 α - 아미노기를 선택적으로 변이시키기에 적절한 pH 로, 환원성 알킬화 조건하에서 반응성 PEG 분자와 단백질을 반응시키는 단계 및 (b) 반응 산물을 수득하는 단계. 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화된 산물을 생산하기 위한, 환원성 알킬화를 통한 유도체화는 N - 말단에서 리신 아미노기와 α - 아미노기 간의 pKa 차이를 이용한다 (아미노기의 50 % 는 양성자 첨가되고 50 % 는 그렇지 않은 pH 에서의 pKa).
리신 잔기의 ε- 아미노기와 단백질 N - 말단 잔기의 α - 아미노기 간의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH 에서 반응을 실시한다. 일반적으로, pH 가 더 낮으면 단백질에 대하여 중합체를 더 많이 사용하는 것이 바람직할 것이다 (즉, N - 말단 α - 아미노기의 반응성이 낮을수록 최적 조건을 이루는 데 더 많은 중합체가 필요하다). pH 가 높으면 중합체 : 단백질의 비율이 클 필요가 없다 (즉, 유효한 반응기가 많으므로 중합체 분자가 많을 필요가 없다). 본 발명을 위하여, pH 는 일반적으로 3 - 9, 바람직하게는 3 - 6 이내에 속할 것이다. 환원성 알킬화의 경우, 환원제는 수용액에서 안정해야 하며, 환원성 알킬화 반응의 초기에 형성되는 쉬프 염기만을 환원시킬 수 있어야 바람직하다.적당한 환원제는 소디움 보로하이드리드, 소디움 시아노보로하이드리드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란 및 피리딘 보란 중에서 선택할 수 있다. 특히 적합한 환원제는 소디움 시아노보로하이드리드이다. 그외의 반응 파라미터, 즉 용매, 반응 시간, 온도 및 산물의 정제 수단은 수용성 중합체와 단백질을 유도체화하는 것에 관련하여 알려진 정보를 바탕으로 경우에 따라 결정할 수 있다.
이러한 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 대한 수용성 중합체 (알데히드와 같은 반응기를 함유함) 의 결합을 조절한다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 주로 발생하며, 리신 곁사슬 아미노기와 같은 그외의 반응기에 대하여 유의할만한 변이는 일어나지 않는다. 제제는 일반적으로 반응하지 않은 관찰가능한 분자 잔류물 (즉, 중합체 부분과 결합하지 않은 단백질) 과 함께 90 % 이상이 모노중합체/단백질 복합체일 것이며, 더욱 일반적으로는 95 % 이상이 모노중합체/단백질 복합체일 것이다.
또한 적어도 하나의 반응성 히드록시기 (예를들어, 폴리에틸렌 글리콜) 를 갖는 수용성 중합체를, 반응성 카르보닐, 니트릴 또는 술폰을 갖는 시약과 반응시켜 히드록시기를 반응성 마이클 수용체로 전환시킴으로써 개선된 생물학적 - 활성 복합체를 제공하기 위해 여러 단백질을 변이시키는 데 유용한 "활성 링커"를 형성함을 통해 특이하게 폴리에틸렌 글리콜화를실시할 수 있다. "반응성 카르보닐, 니트릴 또는 술폰" 이란 두 개의 탄소기가 결합하는 카르보닐기, 니트릴기 또는 술폰기를 의미하는데, 카르보닐기, 니트릴기 또는 술폰기내에, 두번째 탄소에 특이하게 결합하는 티올에 대한 반응 부위를 갖는다 (WO 92/16221 참조).
활성화된 링커는 단기능성이거나 이기능성 또는 다기능성일 수 있다. 방법에 사용할 수 있는 반응성 술폰기를 갖는 유용한 시약은 클로로술폰, 비닐술폰 및 디비닐술폰을 포함하는 것이 유용하며 이것으로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에 있어서, 수용성 중합체는 마이클 수용체로 활성화시킨다. 그중에서도 WO 95/13312 에는, 분자와 표면에 대한 아미노 부분 대신에 티올 부분과 매우 선택적으로 결합하는 수용성 술폰 - 활성 PEG 에 대하여 기술되어 있다. 이들 PEG 유도체는 약 11 또는 그 이하 pH 의 수성 환경에서 장기간동안 가수분해에 대하여 안정하며, 역시 가수분해에 안정한 복합체를 형성하는 분자와 결합할 수 있다. PEG 와 생물학적으로 활성인 분자를 결합시키는 결합은 티올 부분에 결합하는 술폰 부분을 포함하고 PEG - SO2- CH2- CH2- S - W 구조를 가지며 (W 는 생물학적으로 활성인 부분을 나타냄), 여기에서 술폰 부분은 비닐 술폰이거나 활성 에틸 술폰이다. 특히 유용한 두 개의 호모이기능성 유도체는 PEG - 비스 - 클로로술폰 및 PEG - 비스 - 비닐술폰이다.
본원에서 참고문헌으로 인용한, 1995년 6월 7일자로 출원된 미국 특허 출원 제 08/473,809 호에는, 전환 용매로서 테트라히드로푸란 (THF) 을 사용함과 동시에 활성화된 링커를 형성시키기 위해 히드록시기를 반응성 마이클 수용체로 전환시키고 반응성 히드록시기를 갖는 화합물을 수득함으로써 술폰 - 활성 링커를 제조하는 방법에 대해 설명되어 있다. 본원에서 참고문헌으로 인용한, 1996년 3월 6일자로 출원된 미국 특허 출원 제 08/611,918 호에는, 크기와 말단기의 기능에 따라 링커를 분리하기 위하여 소수 상호작용 크로마토그래피를 이용하는 활성 링커 정제 방법에 대해 설명되어 있다.
폴리누클레오티드
본 발명은 또한 IL - 1ra 와 IL - 1ra 변이체를 코드하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 일반적인 코돈표를 사용하고 본 발명의 상세한 설명을 기초로하여, 본 분야의 숙련자들은 IL - 1ra 및 IL - 1ra 변이체의 아미노산 서열을 코드하는 모든 핵산 서열을 용이하게 결정할 수 있다.
아래에 기술한 설명에 의해 실시하는 재조합 발현 기술은 이들 폴리누클레오티드를 생산하고 코딩 단백질을 발현시킨 다음에 사용한다. 예를들어, IL - 1ra 또는 IL - 1ra 변이체를 코드하는 핵산 서열을 적당한 벡터 내로 삽입함으로써, 본 분야의 숙련자들은 원하는 누클레오티드 서열을 용이하게 다량 생산할 수 있다. 이 서열은 검출 프로브나 증폭 프라이머를 생산하는 데 사용할 수 있다. 선택적으로 IL - 1ra 나 IL - 1ra 변이체를 코드하는 폴리누클레오티드를 발현 벡터에 삽입시킬 수 있다. 적절한 숙주내로 발현 벡터를 도입시킴으로써, 원하는 단백질을 다량으로 생산할 수 있다. 본원에 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 원하는 핵산 서열의 증식 및/또는 원하는 단백질의 생산에 유효한 숙주/벡터계가 다수 존재한다. 이들은 플라스미드, 바이러스 벡터, 삽입 벡터 및 원핵 숙주와 진핵 숙주를 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 본 분야의 숙련자들은, 본 발명의 서열을 생산하거나 발현시키는 이종 DNA 를 증식시키거나 발현시킬 수 있는 숙주/벡터계를 이용할 수 있다.
또한, 도 5 에 기술되어 있는 서열을 갖는 IL - 1ra 를 코드하는 동의성 핵산 서열 및 이들 핵산 서열의 보충물에 혼성되는 (엄격한 혼성 조건하에서) 핵산 서열을 포함한다는 것은 본 명세서에 의해 본 분야의숙련자들에게 인지될 것이다 [Maniatis 등의 (1982) , Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, p387 ~ 389 참조]. 전형적인 엄격한 혼성 조건은 62 - 67 ℃ 로 4 X SSC 에서 혼성화시킨 다음 약 1 시간동안 62 - 67 ℃ 로 0.1 X SSC 에서 세척한다. 대안으로서, 전형적인 엄격한 혼성 조건은 45 - 55 % 포름아미드, 40 - 45 ℃ 의 4 X SSC 에서 혼성화시킨다. 또한, 완화된 혼성 조건하에서 서열 1 에 기술되어 있는 핵산 서열의 보충물에 혼성되는 DNA 서열 및 IL - 1ra 변이체를 코드하는 DNA 서열도 포함된다. 이러한 완화된 혼성 조건의 예는 45 - 55 ℃ 로 4 X SSC 에서의 혼성화 또는 40 - 45 ℃ 에서의 30 - 40 % 포름아미드를 이용한 혼성화이다.
본 발명은 또한 원하는 단백질을 코드하는 DNA 서열과 함께 벡터 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 구성물을 제공한다. 각 DNA 구성물에 있어서, 원하는 단백질을 코드하는 핵산 서열 (시그날 펩티드를 수반하거나 그렇지 않은) 은 복제를 조절할 수 있는 조절 서열의 적절한 발현 및/또는 선택된 숙주내에서의 원하는 단백질 발현과 관련하여 작용한다.
재조합 발현
폴리누클레오티드의 제조
IL - 1ra 또는 IL - 1ra 변이체를 암호하는 핵산 서열은 화학적 합성, cDNA 또는 게놈 라이브러리 선별법, 발현 라이브러리 선별법 및/또는 cDNA 의 PCR 증폭을 포함한 다양한 방법으로 용이하게 수득할 수 있으나, 상기 방법만으로 제한되지는 않는다. 이러한 핵산 서열을 분리하는 데 유용한 이들 방법과 그외의 방법은 본원에서 참고문헌으로 인용한 Sambrook 등의 (1989), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel 등의 (1994), eds, Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press ; 및 Berger 및 Kimmel 등의 (1987), Methods in Enzymology : Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc. San Diego, CA 에 기술되어 있다.
핵산 서열의 화학적 합성은 본 분야에서 잘 공지된 방법을 사용하여 이룰 수 있으며, 그 중 한 방법은 본 분야에서 참고문헌으로 인용한 Engels 등의 (1989), Angew. Chem. Intl. Ed.,28: 716 - 734 및 Wells 등의 (1985),Gene,34: 315 문헌에 기술되어 있다. 이들 방법은 그중에서도 포스포트리에스테르 핵산 서열 합성 방법, 포스포아미디트 방법 및 H - 포스포네이트 방법을 포함한다. 예를들어 길이가 약 100 누클레오티드 이상인 큰 핵산 서열은 몇몇 단편으로 합성할 수 있다. 이 단편을 서로 결합시켜 원하는 단백질을 코드하는 핵산 서열을 형성시킬 수 있다. 바람직한 방법은 표준 포스포아미디트 화학을 이용한 중합체 - 원조 합성이다.
선택적으로, 적당한 핵산 서열은 적당한 cDNA 라이브러리 (즉, 단백질을 발현시키는 것으로 여겨지는 조직원 중 하나 또는 그 이상으로부터 제조한 라이브러리) 또는 게놈 라이브러리 (총 게놈 DNA 로부터 제조한 라이브러리) 를 선별함으로써 수득할 수 있다. cDNA 라이브러리의 재료는 일반적으로 적당한 양의 원하는 단백질을 발현시킬 것으로 여겨지는 모든 종의 조직이다. 게놈 라이브러리의 재료는 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 갖는 모든 포유동물 또는 그외의 종으로부터의 조직일 것이다.
하나 또는 그 이상의 핵산 프로브 (클로닝되는 cDNA 또는 유전자에 대하여 용인가능할 정도의 상동성을 갖는 올리고누클레오티드, cDNA 또는 게놈 DNA 단편) 을 이용하여 원하는 단백질을 코드하는 DNA 의 존재 여부에 대해 혼성 배지를 선별할 수 있는데, 핵산 프로브는 라이브러리에 존재하는 cDNA 또는 유전자와 선택적으로 혼성될 것이다. 이러한 선별법에 일반적으로 사용되는 프로브는, 라이브러리를 제조한 종과 동일한 것이나 그것과 유사한 종의 DNA 서열 중 작은 영역을 코드한다. 선택적으로, 프로브는 본원에 기술한 바와 같이 동의성일 것이다.
일반적으로 혼성화는 프로브나 프라이머에 대하여 상당한 상동성을 갖는 클론의 결합은 허용하지만 비특이 결합은 억제하는 조건하에서 클로닝되는 올리고누클레오티드 프로브나 cDNA 를 어닐링시킴으로써 이루어진다. 전형적인 혼성화 및 세척 조건은 cDNA 또는 올리고누클레오티드 프로브의 크기 (예, 누클레오티드 길이) 및 프로브가 동의성인지의 여부에 따라 부분적으로 달라진다. 혼성화 배지 제조시에 클론을 확인할 수 있는 가능성도 고려한다 (cDNA 또는 게놈 라이브러리를 선별할 수 있는지의 여부를 고려한다).
DNA (예, cDNA) 를 프로브로 사용할 경우, 전형적인 혼성 조건은 Ausubel 등의 (1994), eds., 상기문헌에 기술되어 있는 조건을 포함한다. 혼성화 반응 후, 혼성화 배지는 프로브 크기, 기대되는 클로닝 프로브의 상동성, 선별되는 혼성화 배지, 선별되는 클론의 수 등의 여러 인자에 따라 적당한 조건에서 세척한다. 보통 이온 세기가 낮으며 비교적 높은 온도에서 사용하는 엄격한 세척 용액의 예는 다음과 같다 : 하나는 55 - 65 ℃ 의 0.015 M NaCl, 0.005 M 시트르산나트륨 및 0.1 % SDS 이고 ; 다른 하나는 약 40 - 50 ℃ 의 1 mM Na2EDTA, 40 mM NaHPO4, pH 7.2 및 1 % SDS 이며 ; 또다른 세척 용액은 약 50 - 65 ℃ 의 0.2 X SSC 및 0.1 % SDS이다.
혼성화 배지를 선별하기 위해 올리고누클레오티드 프로브를 사용하는, 엄격한 세척 조건에 대한 전형적인 프로토콜도 있다. 예를들어, 첫번째 프로토콜은 프로브의 길이에 따라 약 35 ℃ 내지 63 ℃ 의 온도에서 0.05 % 소디움 피로포스페이트를 수반하는 6 X SSC 를 이용한다. 예를들어, 14 개 염기 프로브는 35 - 40 ℃ 에서 세척하고, 17 개 염기 프로브는 45 - 50 ℃ 에서, 20 개 염기 프로브는 52 - 57 ℃ 에서, 23 개 염기 프로브는 57 - 63 ℃ 에서 세척한다. 백그라운드 비특이 결합이 높게 나타날 경우에 온도를 2 - 3 ℃ 증가시킬 수 있다. 두번째 프로토콜은 세척용으로 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC) 를 사용한다. 이러한 엄격한 세척 용액 중 하나는 3 M TMAC, 50 mM 트리스 - HCl, pH 8.0 및 0.2 % SDS 이다.
적당한 핵산 서열을 수득하는 다른 적합한 방법은 폴리메라제 연쇄 반응법 (PCR) 이다. 이 방법에서, cDNA 는 폴리(A) + RNA 또는 총 RNA 로부터 역전사효소를 이용하여 제조한다. 일반적으로, 원하는 단백질을 코드하는 cDNA (올리고누클레오티드) 의 두 분리 부위에 대하여 상보적인 두 프라이머를 Taq 폴리머라제와 같은 폴리메라제와 함께 cDNA 에 가하면, 폴리머라제는 두 프라이머 사이의 cDNA 영역을 증폭시킨다.
프로브나 프라이머로 선택한 올리고누클레오티드 서열은 선별이나 PCR 증폭 중에 발생할 수 있는 비특이 결합의 양을 최소화하기에 적당한 길이여야 하며 명확해야 한다. 프로브나 프라이머의 실질적인 서열은 보통 보존적이거나 매우 상동적인 서열 또는 영역을 기초로 한다. 선택적으로, 프로브나 프라이머는 완전히 또는 부분적으로 동의성일 수 있다. 즉 동일한 아미노산 서열을 코드하지만 다른 코돈을 사용하는 모든 프로브/프라이머 혼합물을 함유할 수 있다. 동의성 프로브를 제조하기 위해 선택할 수 있는 방법은 종에 따라 달라지는 코돈 중 일부 또는 모두에 이노신을 넣는 것이다. 올리고누클레오티드 프로브나 프라이머는 상기한 바와 같이 DNA 에 대한 화학적 합성 방법에 의해 제조할 수 있다.
벡터
부가적인 클로닝 (DNA 증폭) 이나 발현을 위한 벡터내로 원하는 단백질을 코드하는 DNA 를 삽입할 수 있다. 적당한 벡터는 상업적으로 이용할 수 있는 것이거나 특이하게 구성할 수 있다. 적당한 벡터의 선택 또는 구성은 다음에 의해 좌우될 것이다 : (1) 벡터를 DNA 증폭에 사용할 것인지 DNA 발현에 사용할 것인지 여부, (2) 벡터내로 삽입될DNA 의 크기 및 (3) 벡터로 형질전환시키고자 하는 숙주 세포.
각 벡터는, 선택된 숙주 세포가 원하는 단백질을 발현할 때 이를 지시하거나 조절하고 이를 실시할 수 있도록 하는 하기 발현 조절 서열 중 하나 또는 그 이상에 작동적으로 결합하는 단백질을 코드하는 핵산 서열을 포함한다. 각 벡터는 그것의 기능 (DNA 증폭 또는 DNA 발현) 및 숙주 세포에 대한 적합성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 또는 그 이상을 포함하지만 이것으로 제한되지는 않는다 : 시그날 서열, 복제 기원, 표식 유전자 또는 하나 또는 그 이상의 선택 유전자, 프로모터, 인핸서 성분, 전사 종결 서열 등. 이들 성분은 천연 재료에 의해 또는 공지된 방법으로 합성하여 수득할 수 있다.
적당한 원핵 클로닝 벡터의 예에는 람다 유도체나 E.coli 로부터의 플라스미드 [예를들어 pBR322, col E1, pUC, F - 인자 및 Bluescript (등록상표) 플라스미드 유도체 (미국 캘리포니아 라졸라 소재 스트라타진에서 입수)] 와 같은 박테리오파지가 포함된다. 하기한 숙주에 대하여, 본 분야에 공지된 수많은 형태의 적당한 발현 벡터 또한 이러한 목적으로 사용할 수 있다.
시그날 서열
시그날 서열을 코드하는 핵산을, 원하는 단백질을 코드하는 서열의 5 ' 에 삽입시킬 수 있다. 예를들어 그것은 벡터 성분이거나 원하는 단백질을 코드하는 핵산의 일부일 수 있다. 예를들어, IL - 1ra 의 천연 시그날 서열을 코드하는 핵산은 공지되어 있다 (미국 특허 번호 제 5,075,222 호 참조).
복제 기원
발현 벡터와 클로닝 벡터는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 선택 숙주 세포에서 벡터를 복제시킬 수 있게 하는 핵산 서열을 내포한다. 클로닝 벡터의 경우, 이 서열은 일반적으로 벡터가 독립적으로 숙주 염색체 DNA 를 복제할 수 있게 하는 것이며, 복제 기원 또는 자가복제 서열을 함유한다. 이러한 서열은 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322 의 복제 기원은 대부분의 그람 - 음성 박테리아에 적당하며, 그외의 기원 (예, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV) 은 포유동물에서의 벡터 클로닝에 유용하다. 일반적으로, 복제 기원은 포유동물 발현 벡터에는 필요하지 않다 (예를들어, SV40 기원은 단지 그것이 시발 프로모터를 함유하기 때문에 종종 사용된다).
선택 유전자
각 발현 벡터와 클로닝 벡터는 일반적으로 선택 유전자를 함유한다. 이 유전자는 선택적 배양 배지에서 성장시킬 경우에 형질전환 숙주 세포의 생존이나 성장에 필요한 "표식" 단백질을 코드한다. 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 선택 유전자를 내포하지 않을 것이므로, 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생물질 또는 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트나 테트라사이클린과 같은 그외의 독소에 대해 내성을 부여하고 ; (b) 영양요구성 결함을 보완하거나 ; (c) 배양 배지에서 이용할 수 없는 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 코드한다.
발현되는 유전자를 증폭시키기 위해 그외의 선택 유전자를 사용할 수 있다. 증폭은, 성장에 중요한 단백질 생산에 필요한 유전자를 연속 세대의 재조합 세포의 염색체 내에서 증가시키는 과정이다. 포유동물 세포에 적합하게 선택할 수 있는 표식의 예는 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 및 티미딘 키나아제를 포함한다. 벡터에 존재하는 표식에 의해 형질전환체만이 유일하게 생존하도록 맞춘 압력하에 세포 형질전환체를 둔다. 배지내 선택 약물의 농도를 계속 변화시키는 조건하에서 형질전환 세포 배양에 선택적으로 압력이 부가되도록 함으로써 원하는 단백질을 코드하는 선택 유전자와 DNA 둘다의 증폭을 유도한다.
예를들어 DHFR 선택 유전자로 형질전환시킨 세포는, 우선 DHFR 의 경쟁적인 길항물질인 메토트렉세이트를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체 모두를 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR 을 사용할 때의 적당한 숙주 세포는 DHFR 활성이 없는 차이니즈 햄스터 난소 세포이다 [Urlaub 및 Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA,77(7): 4216 - 4220, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 그런다음 메토트렉세이트의 양을 증가시켜 형질전환 세포를 노출시킨다. 이로써 DHFR 유전자의 다중 복제 합성이 유도됨과 동시에 발현 벡터내에 존재하는 다른 DNA, 즉 원하는 단백질을 코드하는 DNA 의 다중 복제 합성을 이끈다.
프로모터
각 발현 벡터와 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되는 프로모터를 함유하며 원하는 단백질을 코드하는 핵산 서열에 대하여 사용가능하게 결합한다. 프로모터는 원하는 단백질을 코드하는, 특정 핵산 서열의 전사와 번역을 조절하는 구조 유전자 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp) 의 개시 코돈에 대하여 상류 (5')에 위치하는 비번역 서열이다. 프로모터는 보통 유도가능한 프로모터 또는 본질적 프로모터의 두 부류 중 하나로 나뉘어진다. 유도가능한 프로모터는 영양원의 존재 여부나 온도 변화와 같은 배양 조건의 일부 변화에 대한 반응으로 그것의 조절하에 DNA 전사량을 증가시킨다. 여러 종류의 가능한 숙주 세포에 의해 인지되는 프로모터가 다수 공지되어 있다. 프로모터는, 제한 효소 절단에 의해 DNA 원으로부터 프로모터를 제거하여 원하는 프로모터 서열을 삽입시킴으로써 원하는 단백질을 코드하는 DNA 에 사용가능하게 결합될 것이다. 천연 IL-1ra 프로모터 서열은 원하는 단백질을 코드하는 DNA 의 증폭 및/또는 발현을 통제하는 데에 사용될 수 있다. 그러나, 천연 프로모터에 비해 발현되는 단백질의 전사량과 수득량이 더 많고 선택한 숙주 세포계에 적합하다면, 이종 프로모터가 바람직하다. 예를들어, 다른 IL-1 군의 천연 프로모터 서열 중 어느 것이든지 원하는 단백질을 코드하는 DNA 의 증폭 및/또는 발현을 조절하는 데 사용할 수 있다.
원핵 숙주에 사용하기에 적당한 프로모터는 베타-락타마제와 락토스 프로모터계 ; 알칼린 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터계 ; 박테리아 루미네센스 (luxR) 유전자계 및 tac 프로모터와 같은 혼성 프로모터를 포함한다.
그외의 공지된 박테리아 프로모터 또한 적합하다. 그것의 누클레오티드 서열은, 본 분야의 숙련자들이 필요한 모든 제한 부위를 보충할 필요가 있었으므로 링커나 어댑터를 이용하여 원하는 DNA 서열에 그것을 결합시키는 것이 가능해짐으로써 밝혀졌다.
효모 숙주와 사용하기에 적합한 프로모터 서열 또한 본 분야에 잘 알려져 있다. 포유동물 숙주 세포와 사용하기에 적합한 프로모터는 잘 알려져 있으며, 폴리오마 바이러스 (polyoma virus), 전염성 상피종 바이러스 (fowlpox virus), 아데노바이러스 (adenovirus, 아데노바이러스 2 와 같은), 소의 유두종 바이러스 (bovine papilloma virus), 닭의 육종 바이러스 (avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus), 레트로바이러스 (retrovirus), B 형 간염 바이러스 (hepatitis - B virus), 가장 바람직하게는 시미안 바이러스 40 (Simian Virus 40, SV40) 과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득한 프로모터를 포함한다. 그외의 적당한 포유동물 프로모터는 열 - 쇽 프로모터 및 액틴 프로모터와 같은 이종 포유동물 프로모터를 포함한다.
인핸서 성분
고등 진핵류의 각 발현 벡터와 클로닝 벡터는 일반적으로 원하는 단백질을 코드하는 DNA 서열에 의한 전사를 증가시키는 인핸서 서열을 내포한다. 인핸서는 보통 그 길이가 약 10 - 300 bp 이며, 그것의 전사를 증가시키는 프로모터에 작용하는 DNA 의 시스 - 액팅 성분 (cis - acting element) 이다. 인핸서는 비교적 방향과 위치가 독립적이다.인핸서는 전사 단위의 5' 과 3' 에서 발견되었다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 사용하는 것이 유리하다. 포유동물 유전자로부터 입수할 수 있는 인핸서 서열의 일부가 공지되어 있다 (예, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파 - 페토 - 단백질 및 인슐린). 부가적으로, SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 시발 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서와 같은 바이러스 인핸서는 진핵 프로모터를 활성화시키는 전형적인 인핸서 성분이다. 원하는 단백질을 코드하는 DNA 의 5' 또는 3' 위치에서 인핸서가 벡터내로 스플라이싱되기는 하지만, 프로모터의 5' 부위에 위치하는 것이 일반적이다.
전사 종결
각 진핵 숙주 세포에 사용하는 발현 벡터는 일반적으로 mRNA 를 안정하게 하고 전사를 종결시키는 데 필요한 서열을 내포한다. 이러한 서열은 진핵 DNA 또는 cDNA 의 5' 비번역 부위에서 주로 입수할 수 있으며, 경우에 따라서는 3' 비번역 부위에서도 입수할 수 있다. 이들 부위는 원하는 단백질을 코드하는 mRNA 의 비번역 부위내에 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 누클레오티드 단편을 함유한다.
벡터 구성
상기 나열한 성분 중 하나 또는 그 이상을 (원하는 단백질을 코드하는 코딩 서열과 함께) 각각 함유하는 적당한 벡터는 표준 결합 기술에 의해 구성할 수 있다. 필요한 벡터를 생성시키기 위하여, 분리된 플라스미드 또는 DNA 단편을 절단하여 원하는 대로 만들어 재결합시킨다. 서열이 제대로 구성되었는 지를 확인하기 위하여, E. coli 를 형질전환시키는 데 결합 혼합물을 사용하며 형질전환에 성공한 형질전환체를 상기한 공지 기술에 의해 선택할 수 있다. 형질전환체로부터 다량의 벡터를 취하여, 제한 핵산중간분해효소 절단에 의해 분석하고/하거나 원하는 구성물의 존재를 확인하기 위해 서열을 결정하였다.
포유동물 세포내에서 원하는 단백질을 코드하는 DNA 가 일시 발현되도록 하는 벡터를 사용할 수 있다. 일반적으로, 일시적 발현은 숙주 세포에서 효율적으로 복제될 수 있는 발현 벡터의 사용을 포함하는데, 숙주 세포는 발현 벡터의 다수 복제물을 축적하고 차례로 발현 벡터에 의해 코드되는 원하는 단백질을 고수준으로 합성한다. 적당한 발현 벡터와 숙주 세포를 포함하는 각 일시적 발현계는 클로닝된 DNA 에 의해 코드되는 단백질을 편리하고 명확하게 확인할 수 있도록 할 뿐만 아니라 이러한 단백질의 바람직한 생물학적 특성이나 생리학적 특성을 신속하게 선별, 즉 생물학적으로 활성인 IL-1ra 단백질 변이체를 확인할 수있게 한다.
숙주 세포
본 발명은 또한 원하는 단백질을 발현하는 데 이용하는 핵산 서열을 각각 함유하는, 모든 다양한 재조합 숙주 세포를 제공한다. 전형적인 원핵 및 진핵 숙주 세포는 박테리아, 포유동물, 균류, 곤충, 효모 또는 식물 세포를 포함한다.
원핵 숙주 세포는 그람 - 음성 유기체 또는 그람 - 양성 유기체와 같은 진정세균을 포함하지만 이것으로 제한되지는 않는다 [예를들어, E. coli (HB101, DH5a, DH10 및 MC1061) ; 비. 섭티리스(B. subtilis) 와 같은 바실리 (Bacilli) ; 녹농균 (P. aeruginosa) 과 같은 슈도모나스 (Pseudomonas) ; 스트렙토마이시즈 (Streptomyces) spp.; 쥐티푸스균 (Salmonella typhimurium) ; 또는 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescans)]. 특정 실시형태로서, 원하는 단백질은 E. coli 에서 발현시킬 수 있다.
원핵 숙주 세포 외에도, 사상 진균류 (filamentous fungi) 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 원하는 단백질의 발현을 위한 적당한 숙주가 될 수 있다. 일반적인 빵효모인 사카로마이시즈 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용되지만, 그외의 다수의 속, 종, 균주들도 잘 알려져 있으며 일반적으로 사용할 수 있다.
원하는 단백질은 다세포 유기체로부터 유도된 다수의 적당한 숙주 세포 중 어느것에 의해서도 글리코실화된 형태로 발현될 것이다. 이러한 숙주 세포는 복합체를 프로세싱할 수 있고 글리코실화 활성도를 갖는다. 원칙적으로, 배양주가 척추 세포인지 아니면 식물, 동물 세포를 포함한 무척추 세포인지에 따라 고등 진핵 세포 배양주를 사용할 수 있다. 특정 실시형태로서 원하는 단백질은 바쿨로바이러스 (baculovirus) 에서 발현시킬 것이다.
배양액 (조직 배양액) 내 척추 세포의 증식 과정이 널리 공지되어 있으므로, 척추 세포를 이용할 것이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주에는 SV40 으로 형질전환시킨 원숭이 신장 CV1 주 (COS - 7), 인체 배 신장주 (293 세포 또는 현탁 배양액에서 성장시키기 위해 서브클로닝시킨 293 세포), 어린 햄스터 신장 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 세포가 포함되지만 이것으로 제한되지는 않는다. 그외의 적당한 포유동물 세포주로서 HeLa, 마우스 L-929 세포, 스위스 (Swiss) 에서 유래한 3T3 주, Balb - c 또는 NIH 마우스 세포주 및 BHK 또는 HaK 햄스터 세포주가 포함되지만 이것으로 제한되지는 않는다. 특정 실시형태로서, 원하는 단백질을 COS 세포에서 발현시킬 수 있다.
핵산 서열을 발현시키는 적당한 조건하에서 원하는 핵산으로 숙주 세포를 형질감염시키거나, 바람직하게 형질전환시킬 수 있다. 적당한 숙주 세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증폭, 선별과 산물 생산 및 정제에 관한 방법은 본 분야에 널리 공지되어 있다 (Gething 및 Sambrook (1981), Nature,293: 620 - 625 또는 대안으로서, Kaufman 등의 (1985), Mol. Cell. Biol.,5(7): 1750 -1759, 또는 미국 특허 번호 제 4,419,446 호 참조, 이 문헌들은 본원에서 참고문헌으로 인용됨]. 예를들어 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 일렉트로포레이션, 미량 주사 및 그외의 공지된 기술도 사용할 수 있다.
원하는 단백질을 코드하는 DNA 를 이미 함유하는 세포내로 조절 성분을 도입시키는 재조합 생산 방법 또는 상동성 재조합으로 원하는 단백질을 생산하는 것 또한 가능하다. 상동성 재조합은 원래는 전사적으로 활성인 유전자에서 돌연변이를 유도하거나 바로잡는 표적 유전자에 대하여 개발한 기술이다 [본원에서 참고문헌으로 인용한 Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol.,36: 301 참조]. 포유동물 게놈의 특정 부위내로 특이 돌연변이를 도입시키는 방법 [Thomas 등의 (1986), Cell,44: 419 - 428 ; Thomas 및 Capecchi (1987), Cell,51: 503 - 512 및 Doetschman 등의 (1988), Proc. Natl. Acad. Sci.,85: 8583 -8587 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함] 또는 결함이 있는 유전자내로 특이 돌연변이를 실시하여 완전하게 하는 방법 [Doetchman 등의 (1987), Nature,330: 576 - 578, 본원에서 참고문헌으로 인용함] 으로 기본 기술을 발전시켰다. 전형적인 기술은 미국 특허 번호 제 5,272,071 호 ; WO 92/01069 ; WO 93/03183 ; WO 94/12650 및 WO 94/31560 에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용한다.
상동성 재조합에 의해, 게놈내로 삽입되는 DNA 서열은 그것이 표적 DNA 에 결합됨으로써 관심 유전자의 특이 부위를 조절할 수 있다. 표적 DNA 는 게놈 DNA 부위에 대하여 상보적인 (상동적인) DNA 이다. DNA 복제 과정 중에, 게놈의 특이 부위에 대하여 상보적인 표적 DNA 의 소단편을 모가닥과 접촉시킨다. 세포내로 삽입된 DNA 의 일반적인 특성이 혼성되는 것이기 때문에 이 DNA 는 공유되는 상동 부위 전체에 걸쳐 내생 DNA 의 다른 단편과 재조합된다. 상이한 DNA 서열이나 돌연변이를 함유하는 올리고누클레오티드에 이러한 상보 가닥이 결합한다면, 그것 역시 재조합 결과로서 새로 합성된 가닥 내로 결합된다. 기능 교정의 결과로서, 새로운 DNA 서열이 주형으로 작용하는 것이 가능하다. 따라서, 전이 DNA 는 게놈내로 결합된다.
원하는 단백질의 핵산 서열과 같은 특정 유전자 서열이 공지되어있다면, 발현 조절 서열 (선택적인 유전자 부위에 대하여 상보적인 DNA 단편) 은 예를들어 관심 부위가 결합하는 특정 인식 부위에서 천연 DNA 를 적당히 절단하여 수득하거나 합성할 수 있다. 이 위치는 세포내 삽입시 표적 서열로서 작용하며 그것의 게놈내 상동 부위에 혼성될 것이다. DNA 복제 중에 이러한 혼성화가 발생한다면, 이러한 DNA 단편과 거기에 결합하는 모든 다른 서열은 오카자키 단편 (Okajaki fragment) 으로 작용할 것이며 새로 합성된 DNA 딸 가닥 (daughter strand) 내로 백스티치될 것이다.
이러한 표적 DNA 단편에 결합되는 것은 원하는 단백질 발현에 영향을 미치는 DNA 부위이다. 예를들어, 프로모터/인핸서 성분, 억제 유전자 또는 외생성 전사 조절 인자는, 원하는 단백질을 코드하는 DNA 전사에 영향을 미치기에 충분한 위치와 방향으로 숙주 세포 게놈내로 삽입된다. 조절 성분은 원하는 단백질을 코드하지는 않지만 조절 DNA 부분은 숙주 세포 게놈내에 존재한다. 따라서, 원하는 단백질의 발현이 그것을 코드하는 DNA 형질감염에 의해 이루어진다기 보다는 표적 DNA (관심있는 내생 유전자와 상동인 부위를 함유함) 를 이용하여 이룰 수 있는데, 이 표적 DNA 는 원하는 단백질의 전사를 위해 인식가능한 시그날을 갖는 내생 유전자 서열을 제공하는 DNA 조절 단편에 결합된다.
숙주 세포 배양
원하는 단백질 생산을 위해 사용하는 재조합 숙주 세포 중 하나 또는 그 이상을 각각 배양하는 방법은 여러 인자와 고려해야 할 사항에 따라 달라질 것이다 ; 주어진 상황에서의 최적 생산을 위한 방법은 최소의 실험작업을 통해 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다. 이러한 재조합 숙주 세포를 적당한 배지에서 배양하고 발현 단백질을 임의적으로 수득한 다음 본 분야의 숙련자들에게 공지된 적당한 방법에 의해 배양 배지 (세포내 발현될 경우에는 세포) 로부터 분리정제한다.
특히, 원하는 단백질 생산에 사용하는 각각의 재조합 세포를 유도 프로모터에 적당한 배지에서 배양하고, 적당한 재조합 숙주 세포를 선택하거나 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 배지에는 다음과 같은 것을 필요한 만큼 보충할 수 있다 : 호르몬 및/또는 그외의 성장 인자 (예, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예, 나트륨, 염화물, 칼슘, 마그네슘 및 인산), 완충액 (예, HEPES), 누클레오시드 (예, 아데노신 및 티미딘), 항생물질 (예, 젠타마이신), 미량 원소 (보통 최종 농도의 마이크로몰농도 범위로 존재하는 무기 화합물) 및 글루코스 또는 그외의 에너지원. 다른 보충물 또한 적당한 농도로포함될 수 있으며 이는 본 분야의 숙련자들에게 인지될 것이다. 온도, pH 등과 같은 적당한 배양 조건은 숙주 세포를 선택하여 사용하는 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.
결과적으로 생성된 발현 산물은 공지된 방법에 의해 거의 균질하게 정제될 것이다. 전형적인 정제 기술은 미국 특허 번호 제 5,075,222 호 및 WO 91/08285 에 기술되어 있다. 바람직하게, 발현 산물은 실질적으로 순수한 형태로 생산된다. "실질적으로 순수한" 이란 비교적 높은 고유 활성도, 바람직하게는 약 150,000 - 500,000 수용체 단위/mg 범위내의 고유 활성도를 갖는 비변이 형태의 IL-1ra 를 의미한다 [Hannum 등의 (1990), Nature,343: 336 - 340 및 Eisenberg 등의 (1990), Nature,343: 341 - 346 참조, 두 문헌 모두 본원에서 특별하게 참고문헌으로 인용함]. 그러나 IL-1ra 변이체가 상이한 고유 활성도를 가질 수 있을 것으로 인지된다.
제약학적 조성물
일반적으로 제약학적 조성물은 최적으로, 부형제내에 IL-1ra, IL-1ra 의 변이체나 그것의 화학유도체 (총괄하여 이하 "IL-1ra 산물" 이라 언급함) 중 최소한 하나의 치료학적 유효량 및 조절 방출물질을 함유할 것이다. 부형제는 IL-1ra 산물 및 조절 방출물질과 함께 하나 또는 그 이상의 제약학적으로, 생리학적으로 용인가능한 제제형 물질을 함유하는 것이 바람직하다.
조절 방출 중합체는 부피 부식 중합체 [예를들어, 폴리(라틱-코글리콜산) (PLGA) 공중합체, PLGA 중합체 혼합물, PEG 의 블록 공중합체 및 락트산과 글리콜산, 폴리 (시아노아크릴산염)] ; 표면 부식 중합체 [예를들어, 폴리 (무수물) 및 폴리(오르토 에스테르)] ; 히드로겔 에스테르 [예를들어, 플루로닉 폴리올류, 폴리 (비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물 - 알킬 비닐 에테르 공중합체, 폴리 (2 - 히드록시에틸 메타아크릴산염) (pHEMA), 메타아크릴산 (MAA), pHEMA 와 MAA 의 혼합물, 셀룰로스 (예를들어, 카르복시메틸셀룰로스), 하이알루로난, 알긴산염, 콜라겐, 젤라틴, 알부민 및 전분과 덱스트란] 및 그것의 조성물계 ; 또는 리포좀이나 소구체 제제 중에서 선택할 수 있다. 그와 같은 조성물은 본 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정도, 생체내 방출률 및 생체내 정화율에 영향을 미칠 수 있다. 본 기술분야의 숙련자들은 투여경로 및 원하는 투여량에 따라 원하는 단백질에 대한 최적의 제약학적 제제형을 결정할 것이다. 전형적인 제약학적 조성물은 Gombotz 및 Pettit (1995), Bioconjugate chem.,6: 332 - 351 and Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, pages 1435 -1712 문헌에 기술되어 있으며, 이 문헌을 본원의 참고문헌으로 인용한다. 특이하게 조절된 방출 조성물은 다음 공급자로 부터 입수할 수 있다 : 미국 캘리포니아 샌디에고에 소재하는 데포테크 코포레이션 (DepofoamTM, 다중소포성 리포솜) 및 미국 메사츄세츠 캠브리지에 소재하는 앨커메스, 인코포레이티드 (ProLeaseTM, PLGA 소구체).
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 가용성 또는 불용성의 교차결합 형태를 갖는 하이알루로난을 기초로 하는 약물 수송계를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 하이알루로난은 하이알루로난, 하이알루론산, 그것의 염 (이를테면, 하이알루론산 나트륨), 에스테르, 에테르, 하이알루론산의 효소 유도체와 교차결합된 겔 및 화학적으로 변형된 하이알루론산 유도체 (이를테면, 하이란)를 포함하고자 한다. 비변형된 또는 변형된 하이알루론산은 계로부터 약물을 서서히 방출시키는 매개체로서의 역할을 한다.
하이알루로난은, 그러한 목적에 유용하다고 이미 인정된 임의의 유형일 수도 있다. 그것은 수탉의 볏 또는 탯줄과 같은 다양한 비 - 제한성 물질이나 A 또는 C 군의 용혈성 연쇄상구균 배양물과 같은 박테리아 배양물로 부터 추출할 수 있다. 하이알루로난의 전형적인 형태는 본원에서 참고문헌으로 인용한 다음 문헌에 기술되어 있다 : Peyron and Balazs (1974), Path. Biol.,22 (8): 731 - 736 ; Isdale 등의 (1991), J. Drug Dev.,4 (2): 93 - 99 ; Larsen 등의 (1993), Journal of Biomedical Materials Research,27: 1129 - 1134 ; Namiki, 등의 (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology,20 (11): 501 - 507 ; Meyer 등의 (1995), Journal of Controlled Release,35: 67 - 72 ; Kikuchi 등의 (1996), Osteoarthritis and Cartilage,4: 99 - 110 ; Sakakibara 등의 (1994), Clinical Orthopaedics and Related Research,299: 282 - 292 ; Meyers and Brandt (1995),22 (9): 1732 - 1739 ; Laurent 등의 (1995), Acta Orthop Scand, 66(266) : 116 - 120 ; Cascone 등의 (1995), Biomaterials,16 (7): 569 - 574 ; Yerashalmi 등의 (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics,313 (2): 267 - 273 ; Bernatchez 등의 (1993), Journal of Biomedical Materials Research,27 (5): 677 - 681 ; Tan 등의 (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4(1) : 38 - 43 ; Gombotz and Pettit (1995), Bioconjugate Chem.,6: 332 - 351 ; 미국 특허 번호 제 4,582,865 호, 제 4,605,691 호, 제 4,636,524 호, 제 4,713,448 호, 제 4,716,154 호, 제 4,716,224 호, 제 4,772,419 호, 제 4,851,521 호, 제 4,957,774호, 제 4,863,907 호, 제 5,128,326 호, 제 5,202,431 호, 제 5,336,767 호, 제 5,356,883 호 ; 유럽 특허 출원 번호 제 0 507 604 A2 호 및 제 0 718 312A2 호 ; 및 제 WO 96/05845 호.
하이알루로난은, 치료할 포유동물에 역반응이나 독성반응이 야기되는 것을 피하도록 충분히 순수해야 한다. 이것은 실질적인 면역반응이 발생되지 않도록, 하이알루로난과 자연적으로 결합된 단백질 및/또는 핵산이 충분히 낮은 수준이며 발열물질이 없어야 한다는 것을 의미한다. 적합한 정제 과정은 본원에서 참고문헌으로 인용한 다음 문헌에 기술되어 있다 : 미국 특허 번호 제 4,141,973 호, 미국 특허 번호 제 5,411,874 호, 미국 특허 번호 제 5,442,053 호, 미국 특허 번호 제 5,559,104 호, 미국 특허 번호 제 5,563,051 호 및 일본 특허 출원 번호 제 14594/1977 호, 제 67100/1979 호 및 제 74796/1980 호.
하이알루로난은 그것의 유리산 형태일 수도 있거나 어떠한 약물학적으로 용인가능한 염 형태일 수도 있다. 또한, 염으로서는 나트륨염이나 칼륨염 같은 알칼리 금속염 및 칼슘염이나 마그네슘염 같은 알칼리 토금속염을 언급할 수 있다. 하이알루로난의 바람직한 원(source) 은 적당한 미생물의 배양물이다.
광범위 이내의 분자량을 갖는 하이알루로난이 본 발명에 이용될 수 있다. 하이알루로난의 분자량은 대개 0.1 × 106내지 1 × 107이며, 0.5 ×106내지 5 × 106이 바람직하고, 1 × 106내지 5 × 106이 더 바람직하며, 1 × 106내지 4 × 106(예를들어, 1 × 106내지 2 × 106) 이 가장 바람직하다.
교차결합시킴으로써 하이알루로난의 분자량을 증가시키는 것은 많은 방법으로 수행되어 졌다. Sakuria 등의 미국 특허 번호 제 4,716,224 호는 하이알루론산이나 그것의 염을 다가 에폭시화물과 교차결합시킴으로써 제조한 교차결합된 하이알루론산 또는 그것의 염을 기술하고 있다. Sakuri 등의 미국 특허 번호 제 4,863,907 호는 글리코스아미노글리칸이나 그것의 염을 다가 에폭시화합물과 교차결합시킴으로써 제조한 교차결합된 글리코스아미노글리칸 또는 그것의 염을 기술하고 있다. Huang 등의 유럽 특허 출원 번호 제 0 507 604 A2 호는 교차결합제가 3 가의 양이온을 갖는 화합물일 경우에 이온 교차결합된 카르보닐 - 함유 다당류를 기술하고 있다. Malson 등의 미국 특허 번호 제 4,716,154 호 및 미국 특허 번호 제 4,772,419 호에는 2가 또는 다가 에폭시화물이나 그것의 상응 할로히드린, 에피할로히드린이나 할로겐화물, 및 디비닐 술폰과 하이알루론산을 교차결합시키는 것에 관해 기술되어 있다. della Valle 등의 미국 특허 번호 제 4,957,744 호에는 하이알루론산의 카르복시기를 에스테르화시킴으로써 제조한 하이알루론산의 에스테르를 폴리히드릭 알콜과 교차결합시키는 것에 관해 기술되어 있다. Balazs 등의 미국 특허 번호 제 4,582,865 호, 제 4,605,691 호 및 제 4,636,524 호에는 디비닐 술폰과 반응시킴으로써, 하이알루론산과 그것의 염, 및 다른 다당류를 교차결합시키는 것에 관해 기술되어 있다. Balazs 등의 미국 특허 번호 제 5,128,326 호 및 제 4,582,865 호에는 하이알루론산을 포름알데히드, 에폭시화물, 폴리아지리딜 화합물 및 디비닐 술폰과 교차결합시키는 것에 관해 기술되어 있다. Balazs 등의 미국 특허 번호 제 4,713,448 호는 하이알루론산을 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 글리옥살 같은 알데히드와 반응시킴으로써 화학적으로 변형시키는 것에 관해 기술하고 있으며, 교차결합이 발생된다는 가능성을 알려준다. Kuo 등의 미국 특허 번호 제 5,356,883 호는 하이알루론산을 비스카르보디이미드와 반응시킴으로써 교차결합시키는 것을 기술하고 있다. Nguyen 의 제 EP 0 718 312 A2 호는 디 - 또는 폴리무수물과 반응시킴으로써 하이알루론산이나 그것의 염, 및 다른 다당류를 교차결합시키는 것에 관해 기술하고 있다.
가용성 중합체를 기초로 한, 본 산물내 하이알루로난의 농도는 산물의 최종 이용에 좌우하여 약 0.05 중량 % 내지 5 중량 % 의 범위 및 그 이상일 수 있으며, 바람직하게 0.1 내지 4 중량 %, 더 바람직하게 1 내지 3 중량 % 일 수 있다. IL-1 저해제의 농도는 매우 넓은 범위에 걸쳐서 변할 수 있으나 바람직하게는 IL-1 저해제의 가용성, 그것의 약물학적 활성도, 최종산물의 바람직한 효과 등에 따라 선택해야 한다.
교차결합된 하이알루로난은 주사바늘을 통과하기에 충분한 점성을 갖도록 일반적으로 용매 (예를들어, 생리 식염수) 에 용해시킨다. 낮은 점성 물질은, 예를들어 진한 수성 하이알루로난 용액을 실제 크기 투여량으로 사용하게 함으로써 주사를 훨씬 촉진시킨다. 따라서, 하이알루로난의 1 % 수성 용액이 약 10 밀리리터의 주사 투여량으로 사용될 수 있는데, 그것의 점성이 37 ℃ 에서 약 200 c/s 이하일 경우 (ASTM D 445 및 D 2515 방법에 따라 캐논 - 매닝 세미 - 마이크로 비스코미터를 사용하여 측정한 바와 같음) 각기 100 밀리그람의 활성 성분을 함유한다.
본 발명에 따른 약물 수송계는 다음을 포함한다 :
1) 약물이 용해되거나 분산되어 있는 하이알루로난 용액 ;
2) 약물이 분산되어 있는 고분자 "바구니 (cage)" 를 형성하는 교차결합된 하이알루로난 겔 ;
3) 약물이 분산되어 있는 교차결합된 하이알루로난 혼합겔과 최소한 하나의 다른 친수성 중합체 ; 및
4) 하이알루론산 고분자나 그 외의 다른 중합체와 공유결합된 약물을 함유하는 교차결합된 하이알루로난 겔 또는 교차결합된 하이알루로난 혼합겔과 최소한 하나의 다른 친수성 중합체.
약물을 겔과 결합시키는 여러 방법이 존재하므로, 여러 유형의 산물을 수득할 수 있다.
상기 방법 중 하나는, 겔을 약물 용액내로 주입시킬 때 약물이 겔내로 확산되는 것을 포함한다. 확산과정은 보통 느리며 약물 농도, 용액의 온도, 겔 입자의 크기 등에 좌우한다. 이 방법으로 수득한 산물은 약물이 균일하게 분산되어 있는 겔이다.
하이알루로난 겔을 탈수시킨 다음 약물 용액에 재팽화시킴으로써 상기와 동일한 유형의 산물을 수득할 수 있다. 겔을 탈수시키기 위해서는 물에 섞일 수 있는 유기용매를 사용할 수 있거나 택일적으로, 건조시킴으로써 겔로 부터 물을 제거할 수 있다. 그러나, 낮거나 높은 온도에서 건조시킨 후 겔은 초기 팽화 정도로 재팽화될 수 없으므로, 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 달리, 용매로 탈수시킨 후 겔은 처리전 부피와 동일한 부피로 팽화한다. 바람직한 용매는 에탄올과 이소프로판올, 및 아세톤과 같은 케톤류이나, 그외 용매 역시 사용할 수 있다.
이러한 유형의 산물을 수득하기 위해 또 다른 방법을 사용할 수있다. 이 방법은 비교적 진한 하이알루로난 용액으로 미리 수행한 교차결합 반응에서 생긴 진한 하이알루론산 겔을 약물 용액에 팽화시키는 것을 포함한다.
비록 이 세가지 방법 모두 본질적으로 동일한 산물을 생산할지라도, 각 방법은 어떠한 특정 산물에 대한 다른 방법 중 어떠한 방법과 비교할 때 특정 잇점을 지니므로, 약물의 성질, 계내의 원하는 약물 농도, 수송률등과 같은 변수를 고려하여 방법을 선택해야 한다.
약물이 용해되거나 분산되어 있는 하이알루로난 용액을 수득하기 위해 어떠한 종래 방법도 사용할 수 있다. 임의의 원(source) 으로 부터 수득한 하이알루로난을 원하는 농도로 물 또는 생리 식염수에 용해시킨 다음 결과적으로 생성된 용액에 약물을 용해시키거나 분산시킬 수 있다. 택일적으로, 약물 용액이나 분산액을 하이알루로난 용액과 혼합시킬 수 있다. 중합체 농도는 산물의 최종 이용 및 하이알루로난의 분자량에 따라 선택한다. 약물 농도는 산물의 원하는 활성도에 따라 선택한다.
교차결합된 팽화 겔을 약물과 함께 확산과정을 이용하여 부하시키기 위해, 이 겔을 약물 용액내로 주입시킬 수 있다. 이 과정을 완료시키기 위한 시간은 겔 입자 크기, 겔 팽화율, 과정의 온도, 교반, 용액내 약물 농도등에 좌우된다. 이들 변수를 적당히 조합함으로써, 팽화 겔을 비교적 단기간에 약물과 함께 부하시킬 수 있다.
교차결합된 겔을 용매로 탈수시키기 위해서는 어떠한 형태 (즉, 미세 입자 또는 막으로서) 의 겔도 용매, 바람직하게 휘발성 용매 (예를들어, 이소프로판올) 내로 삽입시키기에 충분하며, 겔로 부터 물을 제거시키기에 충분한 시간동안 용매에 유지된다. 물의 제거 정도는 입자의 크기나 막 두께, 겔/용매 비율 등에 좌우된다. 원한다면, 용매 처리는 여러번 반복할 수 있다. 정상 압력하에서나 실온의 진공 상태에서 또는 상승된 온도하에서 건조시킴으로써 겔로 부터 용매를 제거할 수 있다. 이리하여, 약물 용액내로 주입시킬 때, 탈수된 겔은 초기 팽화율로 재팽화한다.
특별한 하이알루로난 조성물은 다음 공급자로 부터 입수할 수 있다 : 미국 뉴저지 리지필드에 소재하는 바이오매트릭스, 인코포레이티드 (SynviscTM, 하이란 유체와 하이란 겔의 90 : 10 혼합물) ; 이탈리아 아바노 테르메에 소재하는 피디아 에스. 피. 에이. [HyalganTM, 수탉 볏 - 유래 하이알루론산의 나트륨염 (∼ 500,000 내지 ∼ 700,000 MW)] ; 일본 도쿄에소재하는 카켄 파마슈티컬 캄파니, 리미티드 (ArtzTM, 수탉 볏 - 유래 하이알루론산의 1 % 용액, ∼ 700,000 MW) ; 스웨덴 스톡홀름 소재의 파마시아 에이비 (HealonTM, 수탉 볏 - 유래 하이알루론산, ∼ 4 × 106MW) ; 미국 메사츄세츠 캠브리지에 소재하는 진자임 코포레이션 (SurgicoatTM, 재조합 하이알루론산) ; 미국 뉴햄프셔 포츠마우스에 소재하는 프로노바 바이오폴리머, 인코포레이티드 [Hyaluronic Acid FCH, 스트렙토코커스 주에피데미커스 (Streptococcus zooepidemicus) 배양물로 부터 제조한 고분자량 (예를들어, ∼ 1.5 - 2.2 × 106MW) 하이알루론산 ; Sodium Hyaluronate MV, ∼ 1.0 - 1.6 × 106MW 및 Sodium Hyaluronate LV, ∼ 1.5 - 2.2 × 106MW] ; 스위스 라우텔핀겐에 소재하는 칼바이오켐 - 노바바이오켐 에이비 [Hyaluronic Acid,스트렙토코커스 에스피.로 부터 제조한 나트륨염 (1997 회사 카탈로그 번호 제 385908 호)]; 미국 뉴욕 퍼처스에 소재하는 인터겐 캄파니 (수탉 볏 - 유래 하이알루론산, > 1 ×106MW) ; 미국 일리노이 시카고에 소재하는 디오신스 인코포레이티드 ; 미국 뉴저지 에디슨에 소재하는 어머콜 코포레이션 및 일본 도쿄에 소재하는 키오와 하코 코기오 캄파니.
부형제내 일차 용매는 사실상 수성이거나 아니면 비수성일 수 있다.게다가, 부형제는 다음을 변형시키거나 유지시키는 그외 제약학적으로 용인가능한 부형제를 포함할 수 있다 : pH, 바람직하게 6.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 6.5 (예를들어, 시트르산염, 인산염 및 글리신 같은 아미노산과 같은 완충제) ; 동결건조된 제제형을 위한 부피 조정제 (예를들어, 만니톨 및 글리신) ; 삼투 몰농도 (예를들어, 만니톨 및 염화나트륨); 계면 활성제 (예를들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 및 플루로닉스) ; 점성도 ; 정화도 ; 색채 ; 무균성 ; 안정성 (예를들어, 수크로스 및 소르비톨) ; 항산화제 (예를들어, 아황산 나트륨 및 아황산수소 나트륨) ; 방부제 (예를들어, 벤조산 및 살리실산) ; 제제형의 향 ; 향료 및 희석제 ; 용해율 (예를들어, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 염화 나트륨 같은 가용화제) ; 방출율 ; 에멀션화제 ; 현탁제 ; 부형제 및/또는 제약학적 보조제. 원하는 단백질에 대한 최적의 제약학적 제제형은, 본 기술분야의 숙련자들이 투여경로 및 원하는 투여량에 따라 결정할 것이다 [예를들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, pages 1435 - 1712 문헌 참조, 이 문헌의 내용은 본원에서 참고로 인용됨]. 특별한 제약학적 제제형은 다음과 같다 : 물내에 함유되어 있는 10 밀리몰 시트르산 나트륨, 140 밀리몰 염화 나트륨, 0.5 밀리몰 EDTA, 0.1 % 폴리소르베이트 80 (w/w), pH 6.5 ("시트르산염 완충 제제형") ; 및 물내에 함유되어 있는 10 밀리몰 인산 나트륨, 140 밀리몰 염화나트륨, 0.1 % (wt/wt) 내지 0.01 % 폴리소르베이트 80 (w/w), 및 선택적으로, 0.5 밀리몰 EDTA, pH 6.5 ("인산염 완충 제제형").
본 발명의 바람직한 실시형태에 있어, 미세하게 분할된 입자 형태를 갖는 IL-1ra 를, 건조분말로서, 물 상태로, 또는 수성 용매로서 (예를들어, 가용성 나트륨염과 같은 생리 식염수 용액, 3 - 5 % 의 글루코스 용액 및 3 - 5 % 자일리톨 용액 및 시트르산염 또는 인산염 완충액 제제형) 0.1 - 5 % w/v 의 하이알루로난 용액이나 그의 염 용액에 용해시키거나 현탁시킨다. 하이알루로난을 함유하고 있는 하나의 주사기에서 두 번째 주사기까지 앞뒤로 IL-1ra 용액을 주입하는 것과 같은 수단을 사용하여, 또는 교반시킴으로써, 또는 미세유체화 (microfluidization) 시킴으로써 하이알루로난과 IL-1ra 를 혼합시킬 수 있다. 단백질의 붕괴나 집합없이 0 - 5 ℃ 에서 IL-1ra 혼합물을 저장할 수 있다. 하이알루로난의 농도는 0.1 - 5 % w/v 범위일 수 있으나 바람직한 농도는 2 % 이다. 또한, 제제내 최종 IL-1ra 농도는 0.1 - 200 mg/ml 일 수 있으나, 바람직한 농도는 100 mg/ml 이다. 결과적으로 생성된 용액 또는 현탁액을 pH 값이 6.0 내지 7.5 가 되도록 조정하는 것이 바람직하다.
일단 제약학적 조성물이 제형화되면, 각각을 용액, 현탁액, 겔, 유탁액, 고체 또는 탈수시키거나 동결건조한 분말로서 멸균용기에 저장할 수 있다. 그와 같은 조성물은 바로 사용할 수 있는 형태나, 아니면투여전 재구성할 필요가 있는 형태 (예를들어, 동결건조된 형태) 로 저장할 수도 있다. 그와 같은 제제형은 최소한 4 ℃ 만큼이나 낮은 온도에서, 바람직하게 -70 ℃ 에서 저장하는 것이 바람직하다. 또한 IL-1ra 를 함유하는 그와 같은 제제형은 생리학적 pH 에서, 또는 그것과 가까운 pH 에서 저장하여 투여하는 것이 바람직하다. 현재로서는 높은 pH (즉, 8 이상) 나 낮은 pH (즉, 5 이하) 에서의 저장 및 투여는 바람직하지 못한 것으로 여겨지는데, pH 6.0 내지 7.0 이 바람직하며 pH 6.5 가 더 바람직하다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 단일 - 투여량 투여 단위를 산출하는 키트를 제공한다. 이 키트는, 건조된 단백질을 갖는 제 1 용기와 수성 제제형을 갖는 제 2 용기 둘 다를 각기 함유할 수 있다. 본 발명의 범주내에 포함되는 키트는 단일 및 다 - 쳄버 예비충전 주사기 ; 전형적인 예비충전 주사기 (예를들어, 액체 주사기, 및 Lyo - Ject (등록상표), 이중 - 쳄버 예비충전 용해주사기 (lyosyringe) 같은 용해주사기이며 독일 라벤스버그에 소재하는 베테르 게엠베하에서 입수할 수 있다.
관절염 증상 (예를들어, 건선성 관절염 및 류마티스성 관절염) 을 포함하는, 상기 규정한 바와 같은, IL-1 매개 질환 치료를 위해 IL-1 저해제 (예를들어, IL-1ra 산물) 각각의 치료학적 유효량을 환자에게 투여할 수있다. 용어 "환자"는 사람 뿐만 아니라 동물 (예를들어, 고양이, 개 및 말) 도 포함한 것이다.
또한, IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 각각은 다음을 포함하나, 그것으로 국한되지 않는 국소, 소장내 또는 비경구 투여로 투여할 수 있다 : 정맥내, 근육내, 동맥내, 초내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 심실내 및 흉골내 주사 및 주입. IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 는 또한 경구투여에 의해 투여할 수 있으며 또는 전신 수송용으로 점막을 통해, 즉 비강내, 설하, 협측 또는 직장을 통해 투여할 수 있다. IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 는 관절내, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사를 통해 투여하는 것이 바람직하다. 실례로, 그러나 이것으로 제한되지 않는 하나의 특정 실시형태에 있어서, IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 는 류마티스성 관절염 및 골관절염 치료를 위해 관절내투여할 수 있다. 실례로, 그러나 이것으로 제한되지 않는 다른 특정 실시형태에 있어서, IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 는 류마티스성 관절염, 염증성 장질환, 다발성경화증, 다발성 골수종 또는 골수성 백혈병 (예를들어, AML 및 CML) 및 그외 백혈병 치료를 위해 피하또는 근육내투여할 수 있다. 실례로, 그러나 이것으로 제한되지 않는 또 다른 실시형태에 있어서, IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 는 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서 발생하는 뇌 손상 치료를 위해서나, 이식편-대-숙주 질병 치료를 위해서 정맥내투여할 수 있으며 ; 또는 외상의 결과로서 발생하는 뇌 손상 치료를 위해 심실내투여할 수 있다.
이와 같은 투여 방식에도 불구하고, IL-1-매개 질환 치료는, 유효량 즉, 관절연골의 분자 성분인 프로테오글리칸이 붕괴됨으로써 유발되는 관절의 진행성 연골파괴를 중화시키도록 이 질병 증상을 예방하거나 감소시키거나 완화시키는 데 효과적인 양으로 된 IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 투여량 또는 총 투여량 섭생이 필요하다. 하이알루로난과 IL-1ra 는 포유동물에서 자연적으로 발생하는 물질이므로, 내성 투여량에 대한 고유 상한선은 없다고 여겨진다. 그러나, 모든 의약 치료에서와 마찬가지로 원하는 효과를 획득하기 위해서는 신중히 사용하는 것이 필요하다.
특정 투여량은 환자의 대략적인 체중이나 표면적에 따라 계산한다. 고유 투여량을 결정하는 그외 인자로는, 치료하거나 예방할 질병 또는 증상, 질병의 심각성, 투여경로, 및 환자의 연령, 성별 및 의약조건이 포함된다. 또한, 치료를 위한 고유 투여량을 결정하는데 필요한 세밀한 고안은 본 분야의 숙련자들에 의해 일상적으로, 특히 본원에 기술한 투여량 정보 및 검정법에 비추어 이루어 진다. 고유 투여량-반응 데이타와 관련하여 사용되는 공지된 투여량 검정법을 이용함으로써 투여량을 결정할 수도 있다.
투여 빈도는 환자의 질병 및 조건 뿐만 아니라, 제형화에 사용되는 IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 약동력학 변수, 및 투여경로에 좌우된다. IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다)는 1 회 투여할 수 있으며, 또는 심각하고 연장된 질병의 경우에 있어 덜 빈번한 투여량으로 매일 투여하거나 초기에 환괴 투여량으로 투여한 다음 연속적인 투여량이나 지속적인 수송으로 투여할 수 있다. 또한, 연속적이거나 거의 연속적인 그외의 투여 방식도 실시할 수 있다. 예를들어, 화학 유도체화의 결과로서 지속적인 방출 형태가 생성되는데, 이 형태는 측정된 투여량 섭생을 기초로 한 예측가능한 양이 혈류내에 연속적으로 존재하는 효과를 갖는다.
류마티스성 관절염 및 건선성 관절염 같은 관절염 증상을 포함하는, IL-매개 질환을 치료하기 위해 IL-1ra 산물을 사용하는 바람직한 방식은제 AU 9173636 호에 기술되어 있다. 이 방식은 다음을 포함한다 : (1) 관절염의 재발을 예방하거나 치료하는데 필요한 바와 같이 주기적으로 제공되는 IL-1ra 의 단일 관절내 주사 및 (2) IL-1ra 산물의 주기적인 피하 주사. 비경구적으로 투여할 때, 단위 투여량은 200 mg 까지이며, 일반적으로는 150 mg 까지이고 더 일반적으로는 100 mg 까지이다. 관절강내로 투여할 때, 등장 인산염 완충 식염수에 용해되어 있는 IL-1 산물을 200 mg/ml 까지의 투여량, 일반적으로는 150 mg 까지이고 더 일반적으로는 100 mg 까지의 투여량으로 함유하는 3 내지 10 ml 주사기로 단일 주사함으로써 제약학적 조성물을 투여하는 것이 바람직하다. 이 제제는 7 내지 10 일 마다 1 회의 빈도로 관절강내에 투여한다. 상기 방식에 있어, 필요하다면 투여량을 변화시키면서 4 내지 5 회 연속적으로 투여한다.
본 발명의 제약학적 조성물은 치료되는 지시 (indication) 에 적합한 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다. IL-1 저해제 산물 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 과 하나 또는 그 이상의 부가 항-염증성 약물 중 어떠한 약물을 개별적으로 또는 공동으로 투여할 수 있다. 다음 화합물과 관련된 정보는 "더 머크 매뉴얼 오브 다이어그노우시스 앤드 세러피 (The Merk Manual of Diagnosis and Therapy)", Sixteenth Edition, Merk, Sharp & Dohme ResearchLaboratories, Merk & Co., Rahway, NJ (1992) and in "파머프로젝츠 (Pharmaprojects)", PJB Publications Ltd. 에서 찾을 수 있다.
관절염 증상 (예를들어, 류마티스성 관절염) 과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 규정한 바와 같은, 현재 IL-1 매개 질환 치료는 비 - 스테로이드성, 항 - 염증성 약물 (NSAIDs) 로 분류된, 동통 및 염증 조절을 위한 제일선 약물을 포함한다. 2 차적 치료는 코르티코스테로이드, 서서히 작용하는 항류마티스성 약물(SAARDs) 또는 질병 변형 (DM) 약을 포함한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 관절염 증상 (예를들어, 골관절염, 건선성 관절염 및/또는 류마티스성 관절염) 과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 규정한 바와 같은 IL-1 매개 질환 ; 및 이식편 대 숙주 질병 치료를 위한, 하나 또는 그 이상의 NSAIDs 중 임의의 NSAID 와 IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. NSAIDs 는 프로스타글란딘 합성 억제에 대해, 최소한 부분적으로 그것의 항-염증성 작용을 갖는다 [Goodman and Gilman in "The Pharmacological Basis of Therapeutics," MacMillan 7th Edition (1985)]. NSAIDs 는 다음 9 개 군으로 분류될 수 있다 : (1) 살리실산 유도체 ; (2) 프로피온산 유도체 ; (3) 아세트산 유도체 ; (4) 페남산 유도체 ; (5) 카르복실산 유도체 ; (6) 부탄산 ; (7) 옥시캄 ; (8)피라졸 및 (9) 피라졸론.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 살리실산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 그와 같은 살리실산 유도체, 약물전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 아세트아미노살롤, 알록시프린, 아스피린, 베노릴레이트, 브로모살리게닌, 칼슘 아세틸살리실레이트, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트 디플루시날, 에테르살레이트, 펜도살, 젠티식 에시드, 글리콜 살리실레이트, 이미다졸 살리실레이트, 리신 아세틸살리실레이트, 메살라민, 모르폴린 살리실레이트, 1 - 나프틸 살리실레이트, 올살라진, 파르살미드, 페닐 아세틸살리실레이트, 페닐 살리실레이트, 살라세타미드, 살리실아미드 0 - 아세틱 에시드, 살살레이트 및 술파살라진. 유사한 진통성 및 항 - 염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 살리실산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 프로피온산 유도체, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고더 바람직하게는 IL-1ra 이다)의 용도를 제공한다. 이 프로피온산 유도체, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 알미노프로펜, 베녹사프로펜, 부클록식 에시드, 카르프로펜, 덱신도프로펜, 페노프로펜, 플루녹사프로펜, 플루프로펜, 플루비프로펜, 푸르클로프로펜, 이부프로펜, 이부프로펜 알미늄, 이부프록삼, 인도프로펜, 이소프로펜, 케토프로펜, 록소프로펜, 미로프로펜, 나프록센, 옥사프로진, 피케토프로펜, 피메프로펜, 피르프로펜, 프라노프로펜, 프로티지닉 에시드, 피리독시프로펜, 수프로펜, 티아프로페닉 에시드 및 티옥사프로펜. 유사한 진통성 및 항 - 염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 프로피온산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 아세트산 유도체, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 아세트산 유도체, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 아세메타신, 알클로페낙, 암페낙, 부펙사막, 신메타신, 클로피락, 델메타신, 디클로페낙 소디움, 에토돌락, 펠비낙, 펜클로페낙, 펜클로락, 펜클로직 에시드, 펜티아작, 푸로페낙, 글루카메타신, 이부페낙, 인도메타신, 이소페졸락, 이소세팍, 로나졸락, 메티아지닉 에시드, 옥사메타신, 옥스피낙, 피메타신, 프로글루메타신, 술린닥, 탈메타신, 티아라미드, 티오피낙, 톨메틴, 지도메타신 및 조메피락. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 아세트산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 페나믹 에시드 유도체, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 페나믹 에시드 유도체, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 엔페나믹 에시드, 에토페나메이트, 플루페나믹 에시드, 이소닉신, 메클로페나믹 에시드, 메클로페나메이트 소디움, 메도페나믹 에시드, 메파나믹 에시드, 니플루믹 에시드, 탈니플루메이트, 테로페나메이트, 톨페나믹 에시드 및 우페나메이트. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 페나믹 에시드 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 카르복실산 유도체, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 사용될 수 있는 이 카르복실산 유도체, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 클리다낙, 디플루니살, 플루페니살, 이노리딘, 케토롤락 및 티노리딘. 유사한 진통성 및 항-진통성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 카르복실산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 부탄산 유도체, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께(예비치료, 후-치료 또는 공동 치료) IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 이 부탄산 유도체, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 부마디존, 부티부펜, 펜부펜 및 젠부신. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 부탄산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 옥시캄, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (예비치료, 후-치료 또는 공동치료) IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 옥시캄, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 드록시캄, 에놀리캄, 이소시캄, 피록시캄, 수독시캄, 테녹시캄 및 4 - 히드록실 - 1, 2 - 벤조티아진 1, 1 - 디옥시드 4 - (N - 페닐) - 카르복사미드. 유사한 진통성 및 항 - 염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 부탄산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 피라졸, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (예비치료, 후치료 또는 공동치료) IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 사용할 수 있는 이 피라졸, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 디페나미졸 및 에피리졸. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 피라졸 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 피라졸론, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께(예비치료, 후-치료 또는 공동치료) IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다.사용할 수 있는 이 피라졸론, 약물전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 아파존, 아자프로파존, 벤즈피레릴론, 페프라존, 모페부타존, 모라존, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피페부존, 프로필페나존, 라미페나존, 숙시부존 및 티아졸리노부타존. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 피라잘론 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 다음 NSAIDs 중 임의의 NSAID 와 함께 (예비치료, 후-치료, 공동치료) IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다 : ε - 아세트아미도카프로익 에시드, S - 아데노실메티오닌, 3 - 아미노 - 4 - 히드록시부티릭 에시드, 아미제트린, 아니트라자펜, 안트라페닌, 벤다작, 벤다작 리시네이트, 벤지다민, 베프로진, 브로페라몰, 부콜롬, 부페졸락, 시프로쿠아존, 클록시메이트, 다지다민, 데복사메트, 데토미딘, 디펜피라미드, 디펜피라미드, 디피살라민, 디타졸, 에모르파존, 파네티졸 메실레이트, 펜플루미졸, 플록타페닌, 플루미졸, 플루닉신, 플루프로쿠아존, 포피르톨린, 포스포살, 쿠아이메살, 쿠아이아졸렌, 이소닉신, 레페타민 HCI, 레플루노미드, 로페미졸, 로티파졸, 리신 클로닉시네이트, 메세클라존, 나부메톤, 닉틴돌, 니메술리드, 오르고테인, 오르파녹신, 옥사세프롤름, 옥사파돌, 파라닐린, 페리소잘, 페리소잘 시트레이트, 피폭심, 피프록센, 피라졸락, 피르페니돈, 프로쿠아존, 프록사졸, 티엘라빈 B, 티플라미졸, 티메가딘, 톨렉틴, 톨파돌, 트립타미드 및 회사 코드 번호, 이를 테면, 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4 - 벤조일 - 1 - 인단카르복실산), TVX2706, U60257, UR2301 및 WY41770 으로 명명되는 NSAID. 상기 NSAIDs 와 유사한 진통성 및 항 - 염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 NSAIDs 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 관절염 증상 (예를들어, 골관절염, 건선성 관절염 및/또는 류마티스성 관절염) 과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 규정한 바와 같은 IL-1 매개 질환 ; 이식편 대 숙주 질병 및 다발성경화증 치료를 위한, 하나 또는 그 이상의 코르티코스테로이드, 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (예비치료, 후치료 또는 공동치료) IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 코르티코스테로이드, 약물전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 히드로코르티손 및 히드로코르티손에서 유도된 화합물, 이를테면, 21-아세톡시프레그네놀린, 알클로메라손, 알게스톤, 암시노니드, 베클로메타손, 베타메타손, 베타메타손 발레레이트, 부데소니드, 클로로프레드니손, 클로베타솔, 클로베타솔 프로피오네이트, 클로베타손, 클로베타손 부티레이트, 클로코르톨론, 클로프레드놀, 코르티코스테론, 코르티손, 코르티바졸, 데플라자콘, 데소니드, 데속시메라손, 덱사메타손, 디플로라손, 디플루코르톨론, 디플루프레드네이트, 에녹솔론, 플루아자코르트, 플루클로로니드, 플루메타손, 플루메타손 피발레이트, 플루니솔리드, 플루시놀론 아세토니드, 플루오시노니드, 플루오로시놀론 아세토니드, 플루오코르틴 부틸, 플루오코르톨론, 플루오로코르톨론 헥사노에이트, 디플루코르톨론 발레레이트, 플루오로메톨론, 플루페롤론 아세테이트, 플루프레드니덴 아세테이트, 플루프레드니솔론, 플루란데놀리드, 포르모코르탈, 할시노니드, 할로메타손, 할로프레돈 아세테이트, 히드로코르타메이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손 부티레이트, 히드로코르티손 포스페이트, 히드로코르티손 21 - 소디움 숙시네이트, 히드로코르티손 테부테이트, 마지프레돈, 메드리손, 메프레드니손, 메틸프레드니콜론, 모메타손 푸로에이트, 파라메타손, 프레드니카르베이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 21 - 디에드리아미노아세테이트, 프레드니솔론 소디움 포스페이트, 프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 프레드니솔론 소디움 21 - m - 술포벤조에이트, 프레드니솔론 소디움 21 - 스테아로글리콜레이트, 프레드니솔론 테부테이트, 프레드니솔론 21 - 트리메틸아세테이트, 프레드니손, 프레드니발, 프레드닐리덴, 프레드닐리덴 21 - 디에틸아미노아세테이트, 틱소코르톨, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드, 트리암시놀론 베네토니드 및 트리암시놀론 헥사세토니드. 유사한 진통성 및 항 - 염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 코르티코스테로이드 역시 이군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 관절염 증상 (예를들어, 골관절염, 건선성 관절염 및/또는 류마티스성 관절염) 과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 규정한 바와 같은, IL-1 매개 질환 ; 이식편 대 숙주 질병 및 다발성 경화증 치료를 위한, 하나 또는 그 이상의 서서히 - 작용하는 항류마티스성 약물 (SAARDs) 이나 질병 변형 항류마티스성 약물 (DMARDS), 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (예비치료, 후치료 또는 공동치료)IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. SAARDs 나 DMARDS, 약물전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 알로쿠프레이드 소디움, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아우로티오글리카니드, 아자티오프린, 브레퀴나르 소디움, 부실라민, 칼슘 3 - 아우로티오 - 2 - 프로판올 - 1 - 술포네이트, 클로람부실, 클로로퀸, 클로부자리트, 쿠프록솔린, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 답손, 15 - 데옥시스페르구알린, 디아세레인, 글루코사민, 골드 솔트 (예를들어, 사이클로퀸 골드 솔트, 골드 소디움 티오말레이트, 골드 소디움 티오술페이트), 히드록시클로로퀸, 히드록시우레아, 케부존, 레바미솔, 로벤자리트, 멜리틴, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미조리빈, 마이크페놀레이트 모페틸, 미오랄, 니트로겐 무스타드, D - 페니실라민, SKNF86002 와 SB203580 같은 피리디놀 이미다졸, 라파미신, 티올, 티모포이에틴 및 빈크리스틴. 유사한 진통성 및 항 - 염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 SAARDs 나 DMARDs 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어서, 본 발명은 급성 및 만성 염증 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 COX2 저해제, 그것의 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (예비치료, 후-치료 또는 공동치료) IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. COX2 저해제, 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염의 예로는, 예를들어, 셀레콕시브를 포함한다. 유사한 진통성 및 항 - 염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 COX2 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 급성 및 만성 염증 치료를 위한, 하나 또는 그 이상의 항균물질, 약물 전구체 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (예비치료, 후-치료 또는 공동치료) IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 항균물질, 약물전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인 가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 암피실린, 아목시실린, 아우레오미신, 바시트라신, 세프타지딤, 세프트리악손, 세포탁심, 세파클로어, 세팔렉신, 세프라딘, 시프로플록사신, 클라불라닉 에시드, 클록사실린, 디클록사실린, 에리트로마이신, 플루클록사실란, 젠타마이신, 그라미시딘, 메티실란, 네오마이신, 옥사실란, 페니실린 및 반코마이신. 유사한 진통성 및 항 - 염증성 특성을 갖는, 구조적으로 관련된 항균물질 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 관절염 증상 (예를들어, 골관절염, 건선성 관절염 및/또는 류마티스성 관절염) 과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 규정한 바와 같은 IL-1 매개 질환 ; 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서 발생하는 뇌 손상 ; 및 이식편 대 숙주 질병 치료를 위한, 하나 또는 그 이상의 TNF 저해제 중 어떠한 것과 함께 (예비치료, 후치료 또는 공동치료) IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 그와 같은 TNF 저해제는 TNF 의 생체내 합성이나 세포외 유리를 차단시키는 화합물 및 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에 있어, 본 발명은 IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 와 함께 (예비치료, 후-치료 또는 공동치료) 하나 또는 그 이상의 다음 TNF 저해제 중 임의의 저해제의 용도를 제공한다 : TNF 결합 단백질 (가용성 TNF 수용체), 항-TNF 항체, 과립구 군체 자극인자 ; 탈리도미드 ; BN 50730 ; 테니답 ; E 5531 ; 티아파판트 PCA 4248 ; 니메술리드 ; 파나비르 ; 롤리프람 ; RP 73401 ; 펩티드 T, MDL 201,449A ; (1R, 3S) - 시스 - 1 - [9 - (2, 6 - 디아미노푸리닐)] - 3 - 히드록시 - 4 - 사이클로펜텐 히드로클로라이드 ; (1R, 3R) - 트란스 - 1 - [9 - (2, 6 - 디아미노) 푸린] - 3 - 아세톡시사이클로펜탄 ; (1R, 3R) - 트란스 - 1 - [9 - 아데닐) - 3 - 아지도사이클로펜탄 히드로클로라이드 및 (1R, 3R) - 트란스 - 1 - [6 - 히드록시 - 푸린 - 9 - 일) - 3 - 아지도사이클로펜탄.
TNF 결합 단백질은 다음 문헌에 기술되어 있으며, 이 문헌의 명세서를 본원에 참고로 인용한다 : 제 EP 308 378 호, 제 EP 422 339 호, 제 GB 2 218 101 호, 제 EP 393 438 호, 제 WO 90/13575 호, 제 EP 398 327 호, 제 EP 412 486 호, 제 WO 91/03553 호, 제 EP 418 014 호, 제 JP 127,800/1991 호, 제 EP 433 900 호, 미국 특허 번호 제 5,136,021 호, 제 GB 2 246 569 호, 제 EP 464 533 호, 제 WO 92/01002 호, 제 WO 92/13095 호, 제 WO 92/16221 호, 제 EP 512 528 호, 제 EP 526 905 호, 제 WO 93/07863 호, 제 EP 568 928 호, 제 WO 93/21946 호, 제 WO 93/19777 호, 제 EP 417 563 호, 가출원 전송 편지상의 발명의 명칭이 "종양괴사 인자 결합 단백질" 인 (대리인 서류번호 제 A - 415P 호), 1996 년 7월 9일자 제출된 Fisher, Edwards 및 Kieft 의미국 가특허 출원 번호 제 60/021,443 호, 가출원 전송 편지상의 발명의 명칭이 "저분자량 종양괴사 인자 결합 단백질" 인 (대리인 서류번호 제 A - 415A - P 호), 1996 년 12월 6일자 제출된 Fisher, Edwards 및 Kieft 의 미국 가특허 출원 번호 제 US 60/032,534 호, 가출원 전송 편지상의 발명의 명칭이 "저분자량 종양괴사 인자 결합 단백질" 인 (대리인 서류 번호 제 A - 415B - P 호), 1997 년 1월 23일자 제출된 Fisher, Edwards 및 Kieft 의 미국 가특허 출원 번호 제 US 60/037,737 호, 가출원 전송 편지상의 발명의 명칭이 "저분자량 종양괴사 인자 결합 단백질" 인 (대리인 서류 번호 제 A - 415C - P 호), 1997년 2월 7일자 제출된 Fisher, Edwards 및 Kieft 의 미국 가특허 출원 번호 제 US 60/039,314 호.
예를들어, 제 EP 393 438 호 및 제 EP 422 339 호는 "30 KDa TNF 저해제" (또한 p55 수용체라고도 공지) 와 " 40 KDa 저해제" (또한 p75 수용체라고도 공지) 뿐만 아니라 그것의 변형된 형태 (예를들어, 단편, 기능적인 유도체 및 변이체) 의 아미노산 및 핵산 서열을 기술하고 있다. 또한 제 EP 393 438 호 및 제 EP 422 339 호는 상기 저해제를 코딩하는 유전자를 분리하고, 이 유전자를 적합한 벡터 및 세포 유형에 클로닝시키고 상기 저해제가 생산되도록 이 유전자를 발현시키는 방법을 기술하고 있다. 부가적으로, 상기한 TNF 저해제의 다가 형태 (즉, 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 분자) 역시 기술되어 있다. 한 실시형태에 있어, 최소한 하나의 TNF 저해제와 또 다른 성분을 임상적으로 용인가능한 임의의 결합자, 예를들어 폴리에틸렌 글리콜과 화학 결합시킴으로써 (제 WO 92/16221 호 및 제 WO 95/34326 호), 펩티드 결합자 [Neve 등의 (1996), Cytokine,8(5): 365 - 370 참조) 에 의해 비오틴과 화학결합시킨 다음 애비딘과 결합시킴으로써, 최종적으로 키메라 항체 분자 (미국 특허 번호 제 5,116,964 호, 제 WO 89/09622 호, 제 WO 91/16437 호 및 제 EP 315062 호) 를 구성함으로써 다가 형태를 구성할 수 있다.
항 - TNF 항체는 MAK 195F Fab 항체[Holler 등의 (1993), 1st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147] ; CDP 571 항 - TNF 모노클로날 항체 [Rankin 등의 (1995), British Journal of Rheumatology,34: 334 - 342] ; BAY X 1351 마우스 항-종양괴사 인자 모노클로날 항체 [Kieft 등의 (1995), 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infections Diseases, 9] ; CenTNF cA2 항 - TNF 모노클로날 항체 [Elliott 등의 (1994), Lancet,344: 1125 - 1127 및 Elliott 등의 (1994), Lancet,344: 1105 - 1110] 를 포함한다.
특정 실시형태에 있어, 본 발명은 관절염 증상 (예를들어, 골관절염, 건선성 관절염 및/또는 류마티스성 관절염) 과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 규정한 바와 같은 IL-1 매개 질환 ; 및 이식편 대 숙주질병 치료를 위한, 가용성 재조합 인체 Fas 항원 또는 그것의 재조합 변형체와 함께 (예비치료, 후-치료, 공동치료) IL-1 저해제 (예를들어, 바람직하게는 IL-1ra 산물이고 더 바람직하게는 IL-1ra 이다) 의 용도를 제공한다. 가용성 재조합 인체 Fas 항원, Fas 융합 단백질과 같은 그것의 변이체, 가용성 재조합 인체 Fas 항원을 암호하는 유전자를 분리하는 방법, 이 유전자를 적합한 벡터 및 세포 유형에 클로닝시키는 방법 및 상기 저해제가 생산되도록 이 유전자를 발현시키는 방법은 공지되어 있다 (제 WO 96/20206 호 및 Mountz 등의 J. Immunology,155: 4829 - 4837, 이 문헌의 명세서는 본원에서 참고로 인용함).
상기 내용은 예로든 것으로, 본 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있거나 본 기술분야의 숙련자들이 본 명세서에 제시된 지침을 이용하여 획득할 수 있는 이들 항-관절염 화합물과 공동으로 사용하는 그외 치료를 배제하지는 않는다.
투여량의 투여 및 균일성을 용이하게 하기 위해 부가 항-염증성 화합물의 조성물을 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 이롭다. 본원에 사용한 "투여량 단위 형태" 란 치료할 포유동물 피검자를 위한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각 단위는 필수 제약학적 담체와 관련된 원하는 치료효과가 산출되도록 계산한 부가항-염증성 화합물의 예비 측정량을 포함한다. 본원에 사용한 "제약학적으로 용인가능한 담체" 는 활성 성분, 투여방식 및 본 제제형의 다른 성분과 양립가능하고 수용자에게 해롭지 않은 어떠한 용매 및 모든 용매, 분산 매개물, 피막제, 항균 및 항진균 인자, 등장제 및 흡수 연장제 등을 포함한다. 그와 같은 매개물 및 인자의 용도는 본 기술분야에 잘 공지되어 있다 [예를들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, pages 1435 - 1712 참조]. 전형적인 제약학적으로 용인가능한 담체는 인산염 완충 식염수이다. 추가 활성 성분을 조성물내에 포함시킬 수도 있다.
치료학적 경구투여를 위해, 부가 항-염증성 화합물을 부형제와 함께 혼합시킬 수 있고 섭취가능한 정제, 구강정, 구내정, 캡슐, 일릭서제, 현탁제, 시럽, 물 등의 형태로 사용할 수 있거나, 규정 음식물과 함께 직접 혼합시킬 수 있다. 또한 정제, 구내정, 환제, 캡슐 등은 다음을 포함할 수도 있다 : 트라가칸트 고무, 아카시아, 옥수수 녹말 또는 젤라틴 같은 결합제 ; 인산 디칼슘 같은 부형제 ; 옥수수 녹말, 알긴산등과 같은 붕괴제 ; 스테아르산 마그네슘 같은 윤활제 ; 수크로스, 락토스 또는 사카린 같은 감미제 ; 페퍼민트, 노루발풀 기름 또는 체리나 오렌지 향료 같은 향료. 투여량 단위 형태가 캡슐일 때에는 상기 유형의 물질 이외에 액체 담체를 함유할 수도 있다. 피복제로서, 또는 달리 투여량 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 여러 가지 다른 물질이 존재할 수도 있다. 예를들어, 정제, 환제 또는 캡슐을 쉘락, 당 또는 이 둘 다로 피복시킬 수 있다. 물론, 어떠한 단위 형태를 제조하는 데 사용되는 어떠한 물질도 제약학적으로 순수해야 하며 사용되는 양이 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 부가 항-염증성 화합물을 조절된 - 유리 제제 및 제제형내로 포함시킬 수 있다. 그와 같은 치료학적으로 유용한 조성물내 부가 항 - 염증성 화합물의 양이 적합한 투여량을 수득하게 할 것이다.
치료학적 비경구투여를 위해, 각 항-염증성 화합물을 멸균 주사용액과 함께 혼합시킬 수 있다. 하기 열거한 (필수적인) 여러 가지 다른 성분과 함께 필수양의 부가 항 - 염증성 화합물을 적당한 제약학적으로 용인가능한 담체내에 혼합시키고 이어서 멸균여과함으로써 멸균 주사용액을 제조할 수 있다. 분산의 경우에는, 기초 분산 매개물과 상기 열거한 성분 중의 다른 필수 성분을 함유하는 멸균 운반체내에 부가 항 - 염증성 화합물을 포함시킴으로써 각 분산물을 제조할 수 있다. 멸균 주사 용액의 경우에는, 최소한 하나의 부가 항 - 염증성 화합물 분말, 선택적으로 미리 멸균여과시킨 용액 중의 원하는 임의의 부가 성분을 포함시킴으로써 각 멸균 주사용액을 제조할 수 있는바, 여기서 분말은 임의의 적합한 기술 (예를들어, 진공건조 및 동결건조) 로 제조한 것이다.
부가 항 - 염증성 화합물의 특정 투여량은 환자의 개략적인 체중이나 체면적에 따라 계산한다. 고유 투여량을 결정하는 다른 인자로는 치료하거나 예방할 급성 또는 만성 염증성 질병이나 증상, 투여경로, 환자의 연령, 성별 및 의약조건이 포함된다. 상기 언급한 각 제제형과 관련된 치료를 위한 고유 투여량을 결정하는 데 필요한 계산을 세밀히 고안하는 것은 일상적으로 본 기술분야의 숙련자에 의해 이루어 진다. 또한 투여량은 고유 투여량 - 반응 데이타와 관련하여 사용되는 공지된 투여량 결정법을 이용함으로써 결정할 수 있다.
따라서, 예를들어 원하는 치료효과를 획득하고자, 특정 급성 또는 만성 염증 질병 치료를 위해 선택한 부가 항 - 염증성 화합물의 투여량을 변화시키는 것도 본 발명의 범위내이다. 부가 항 - 염증성 화합물 중 하나가 부작용을 가질 경우에는 연합요법의 교대 치료기간 중에 환자에게 제공할 수 있다. 예를들어, 만성 메토트렉세이트 치료는 위장, 간 골수 및 폐 독성과 관련된다 [Sandoval 등의 (1995), British Journal of Rheumatology,34: 49 - 56].
질병이 호전됨을 모니터하는 시험은 예를들어, 적혈구침강속도 (ESR)와 급성기 반응물질 (APR) 을 포함하는, 염증에 대한 전신반응을 결정하는 특정 시험을 포함할 수 있다. 고통받는 신체 부분은 팽화 등에 의해 관찰된다. 경직됨 및 유행성감기 (적절할 경우) 가 호전되고 환자의 고통이 감소되는 것 역시 관찰된다. 환자의 증상이 안정하다면, 매주 동일 투여량으로 재치료하고 매주 평가한다. 만일 환자의 증상이 불안정하다면, 치료를 계속할 수도 있다. 치료 6 달 후, 방사선학적 영상, 예를들어 X·선 촬영에 의해 골격의 해부학적 변화가 측정된다.
각 기간이 끝났을 때 환자를 다시 평가한다. 예비치료 및 후치료의 방사선학적 평가를 비교하면, ESR 과 APR 은 치료 효능을 나타낸다. 치료 효능 및 환자의 증상에 따라 투여량은 치료 지속기간 동안 증가될 수 있거나 일정하게 유지될 수도 있다.
바람직하게, 본 발명은 관절염 증상 (예를들어, 건선성 관절염 및 류마티스성 관절염) 과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 규정한 바와 같은 IL-1 매개 질환 및 이와 관련된 증상을 치료하거나 예방하기 위한, IL-1ra 및 택일적으로 다음 조합물 중 하나의 용도를 포함하는 방법을 제공한다 : IL-1ra 산물 (예를들어, IL-1ra) 과 메토트렉세이트 ; IL-1ra 산물 (예를들어, IL-1ra) 과 메토트렉세이트, 술파사진 및 히드록시클로로퀸 중 임의의 하나 또는 그 이상 ; IL-1ra 산물 (예를들어, IL-1ra), 메토트렉세이트 및 히드록시클로로퀸 ; IL-1ra 산물 (예를들어, IL-1ra), 메토트렉세이트 및 술파사진 ; 및 IL-1ra 산물 (예를들어, IL-1ra), 메토트렉세이트 및 TNF 저해제, 바람직하게 TNFbp.
특정 실시형태에 있어, 본 방법은 관절염 (예를들어, 골관절염, 건선성 관절염 및/또는 류마티스성 관절염) 및 이와 관련된 증상을 치료하기 위해, 선택적으로 메토트렉세이트 및/또는 TNFbp 와 함께 (예비치료, 후-치료, 공동치료) IL-1 저해제 [예를들어, 조절 방출 중합체 (예를들어, 하이알루로난) 와 함께 제형화한 IL-1ra 산물이 바람직하며 IL-1ra 가 더 바람직함] 를 투여 (예를들어, 관절내, 피하 또는 근육내) 하는 것을 포함한다.
특정 실시형태에 있어, 본 방법은 각각 신경변성을 초래할 수 있는 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서 발생하는 뇌 손상을 치료하기 위해, 선택적으로 조직 플라스미노젠 활성제 및/또는 TNFbp 와 함께 (예비치료, 후 - 치료 또는 공동 치료) IL-1 저해제 [예를들어, 조절 방출 중합체 (예를들어, 하이알루로난) 와 함께 제형화한 IL-1ra 산물이 바람직하며 IL-1ra 가 더 바람직함] 를 투여 (예를들어, 정맥내 또는 심실내) 하는 것을 포함한다.
바람직한 특정 실시형태에 있어, 본 방법은 이식편 대 숙주 질병을 치료하기 위해 선택적으로 하나 또는 그 이상의 메토트렉세이트, 코르티코스테로이드, FK-506, 사이클로스포린, 가용성 fas 단백질 및/또는 TNFbp 와 함께 (예비치료, 후-치료 또는 공동치료) IL-1 저해제 [예를들어, 조절 방출 중합체 (예를들어, 하이알루로난) 와 함께 제형화한 IL-1ra 산물이 바람직하며 IL-1ra 가 더 바람직함] 를 투여 (예를들어, 정맥내) 하는 것을 포함한다.
바람직한 특정 실시형태에 있어, 본 방법은 염증성 장질환 치료를 위해, 선택적으로 G-CSF 및/또는 TNFbp 와 함께 (예비치료, 후-치료 또는 공동치료) IL-1ra 저해제 [예를들어, 조절 방출 중합체 (예를들어, 하이알루로난) 와 함께 제형화한 IL-1ra 산물이 바람직하며 IL-1ra 가 더 바람직함] 를 투여 (예를들어, 피하 또는 근육내) 하는 것을 포함한다.
바람직한 특정 실시형태에 있어, 본 방법은 다발성 골수종이나 골수(예를들어, AML 및 CML) 및 그외 백혈병을 치료하기 위해, 선택적으로 인터페론(예를들어, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 감마 인터페론 또는 칸센서스 인터페론)과 함께(예비치료, 후-치료 또는 공동치료) IL-1 저해제[예를들어, 조절 방출 중합체(하이알루로난)와 함께 제형화한 IL-1ra 산물이 바람직하며 IL-1ra 가 더 바람직함]를 투여(예를들어, 피하 또는 근육내)하는 것을 포함한다.
바람직한 특정 실시형태에 있어, 본 방법은 알쯔하이머병 치료를 위해, 선택적으로 NSAID(예를들어, 인도메타신) 및/또는 TNFbp 와 함께(예비치료, 후-치료 또는 공동 치료) IL-1 제해제[예를들어, 조절 방출 중합체(하이알루로난)와 함께 제형화한 IL-1ra 산물이 바람직하며 IL-1ra 가 더 바람직함]를 투여(예를들어, 피하, 심실내 또는 초내) 하는 것을 포함한다.
바람직한 특정 실시형태에 있어, 본 방법은 측두하악골 관절 질환을 치료하기 위해 IL-1 저해제[예를들어, 조절 방출 중합체(하이알루로난)와 함께 제형화한 IL-1ra 산물이 바람직하며 IL-1ra 가 더 바람직함]를 투여(예를들어, 국소주사, 피하 또는 근육내)하는 것을 포함한다.
다음 실시예는 본 발명을 더 자세히 설명하기 위해 포함시킨 것이다. 발명의 범위에서 벗어나지 않고서 제시한 과정을 수정할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 다양한 양상과 이점은 도면에 의해 명백해질 것이다.
제 1 도는 시트르산 완충액(CSEP) 내 IL - 1ra 를 단독으로 또는 CSEP 내 IL - 1ra 를 하이알루론산과 혼합하여 피하 주사한 후 IL - 1ra 의 혈청 수준을 나타낸 것이다.
제 2 도는 CSEP 내 IL - 1ra 를 단독으로 또는 CSEP 내 IL - 1ra 를 하이알루론산과 혼합하여 관절내 주사한 후 기니피그 관절내에 남아있는 IL - 1ra 의 양을 나타낸다.
제 3 도는 CSEP 내 IL - 1ra 를 단독으로 또는 CSEP 내 IL - 1ra 를 하이알루론산과 혼합하여 관절내 주사한 후 보충된 토끼의 활액내 IL - 1ra 농도를 나타낸 것이다.
제 4 도는 CSEP 내 하이알루론산을 단독으로 또는 CSEP 내 하이알루론산을 IL - 1ra 와 혼합하여 관절내 주사한 후, 소의 제 Ⅱ 형 콜라겐으로 면역시킨 랫의 무릎 관절내 질환 정도를 조직학적으로 평가한 것이다.
제 5 도는 재조합 인체 IL- 1ra (rhuIL - 1ra) 를 코드하는 핵산 서열 (서열 1) 을 나타낸 것이다. 또한 개시 아미노산인 Mn(여기에서 n 은 0 또는 1 임) 과 함께 rhuIL - 1ra) 의 아미노산 서열 (서열 2) 도 나타나 있다.
제 6 도는 제 Ⅱ 형 콜라겐 관절염을 일으킨 랫의 시간 경과후 과관절 직경에 대하여, CSEP내 IL - 1ra 와 하이알루론산의 매일 1 회 주사(QD) 효과를 CSEP 내 IL - 1ra 또는 CSEP 내 하이알루론산 또는 CSEP 를 단독으로 주사한 것과 비교하여 나타낸 것이다.
제 7 도는 제 Ⅱ 형 콜라겐 관절염을 일으킨 랫의 최종 발 중량에 대하여, CSEP 내 IL - 1ra 와 하이알루론산의 매일 1 회 주사 (QD) 효과를 CSEP 내 IL- 1ra 또는 CSEP 내 하이알루론산 또는 CSEP 를 단독으로 주사한 것과 비교하여 나타낸 것이다.
제 8 도는 제 Ⅱ 형 콜라겐 관절염을 일으킨 랫의 염증, 판누스 형성 및 연골과 뼈의 손상에 대하여, CSEP 내 IL - 1ra 와 하이알루론산의 매일 1 회 주사(QD) 효과를 CSEP 내 IL - 1ra 또는 CSEP 내 하이알루론산 또는 CSEP 를 단독으로 주사한 것과 비교하여 나타낸 것이다.
제 9 도는 제 Ⅱ 형 콜라겐 관절염을 일으킨 랫의 시간 경과후 과관절 직경에 대하여, CSEP 내 IL - 1ra 를 하이알루론산과 혼합하여 매일 1 회 주사(QD), 이틀에 한번씩 주사 (Q2D) 하거나 3 일에 한번씩 주사(Q3D) 한 효과를 CSEP 내 하이알루론산으로 주사한 것 (QD) 또는 치료하지 않은 것과 비교하여 나타낸 것이다.
제 10 도는 제 Ⅱ 형 콜라겐 관절염을 일으킨 랫의 최종 발 중량에 대하여, CSEP 내 IL - 1ra 를 하이알루론산과 혼합하여 매일 1 회 주사(QD), 이틀에 한번씩 주사(Q2D) 하거나 3 일에 한번씩 주사(Q3D) 한 효과를 CSEP 내 하이알루론산으로 주사한 것(QD) 또는 치료하지 않은 것과 비교하여 나타낸 것이다.
다음 실시예에 기술되어 있는 많은 과정 또는, 적합한 선택과정에대한 표준방법은 널리 인정되고 있는 다음과 같은 분자생물학 입문서에 제공되어 있다 : 예를들어, Sambrook 등의 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1987) 및 Ausabel 등의 Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates/Wiley Interscience, New York(1990). 모든 화학약품은 분석용 품질이거나 아니면 USP 등급이다.
실시예 1
시료 제조 : 미국 특허 번호 제 5,075,222 호의 기술내용에 따라 일반적으로 제조한 E.coli - 유래 인체 재조합 IL - 1 수용체 길항물질(rhuIL - 1ra)을 10 밀리몰 시트르산 나트륨, 140 밀리몰 염화나트륨, 0.5 밀리몰 EDTA, 물내 0.1 % 폴리소르베이트(w/w), pH 6.5 (CSEP)를 가지고 제형화하였다. 제형화된 IL-1ra 를 함유하는 주사기를 콕마개 수단을 사용하여 다음 조절 방출 물질 중 하나를 함유하는 주사기에 부착시켰다 : H-10TM하이란 유체(바이오메트릭스, 인코포레이티드, 리지필드, 인코포레이티드), PBS 내 재구성된 건조 분말 또는 건조 분말로서의 교차결합된 하이알루론산(Mr ≥ 4 x 106) ;스트렙토코커스 주에피데미쿠스(카탈로그 제 H9390 호, 미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마 인코포레이티드에서 수득)배양물에서 유도된, 건조 분말로서의 PBS 내 하이알루론산(Mr ≥ 570,000) ; 건조 분말로서의 폴리비닐 피롤리돈(Mr 1.3 X 106)(카탈로그 번호 제 43,719 - 0 호, 미국 위스콘신 밀와우키에 소재하는 알드리지 케미컬 컴파니, 인코포레이티드에서 수득); 및 건조 분말로서의 카르복시메틸 셀룰로스(카탈로그 번호 제 06139 호, 미국 펜실베니아 워링톤에 소재하는 폴리사이언시즈, 인코포레이티드에서 수득). 그런 다음 rhuIL-1ra 용액을 하이알루론산 함유 주사기내로 주사하고 혼합이 확실히 되도록 그 내용물을 앞뒤로 수회 주사함으로써 IL-1ra 를 조절 방출 물질과 혼합하였다.
이에 따라서, 다음 제제형을 제조하였다 : (1) IL-1ra(100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란 ; (2) IL-1ra(100 mg/ml)/1 % 하이알루론산 ; (3) IL-1ra(100 mg/ml)/0.5 % H-10TM하이란 ; (4) IL-1ra(100 mg/ml)/2 % 하이알루론산, (5) IL-1ra(100 mg/ml)/4 % 폴리비닐 피롤리돈 및 (6) IL-1ra(100 mg/ml)/3 % 카르복시메틸 셀룰로스.
암컷 루이스 랫(200 - 250 g, 미국 미네소타 포테이지 찰스 리버에서 수득)에게 여러가지 제제형을 피하주사하였다. 이 동물의 경정맥내에 삽입시킨 카테터를 통해 주사후 여러 시간에서 혈액을 유출하였다. 혈액을 원심분리하여 혈구를 제거하고 제조자의 지침에 따라 ELISA키트(QuantikineTM인체 IL-1ra 면역검정, 미국 미네소타 미네아폴리스에 소재하는 알 & 디 시스템즈에서 구입)를 사용하여 남아 있는 혈장을 IL-1ra 에 대해 검정하였다. 이 데이터는 혈장 IL-1ra(ug/ml 혈장내 IL -1ra)대 주사후 시간으로 표시한 것으로 표 2 및 도 1 에 나타나 있다.
표 2 및 도 1 에 나타낸 바와 같이, 하이알루로난, 폴리비닐 피롤리돈 및 카르복시메틸 셀룰로스내에 IL-1ra 를 포함시킨 결과 IL-1ra 단독으로 투여한 것에 비해 IL-1ra 혈장수준의 상승이 연장된다.
실시예 2
CSEP 내 IL-1ra 를 Na[125I]로 방사표지한 다음 상기한 바와 같이 H-10TM하이란 유체내에 포함시켰다. 방사성 IL-1ra 또는 IL-1ra/H-10TM하이란 혼합물을 기니피그(미국 미시간 포테이지 찰스 리버에서 구입)의 뒤쪽 무릎에 관절내 주사하였다. 주사후 여러 시간에서, 이 동물을 희생시켜 무릎 관절을 제거하고, van Lent 등의 (1989), J. Rheumatol., 16 : 1295 - 1303 문헌에 기술된 바와 같은 감마 계수기로 계수하였다. 각 시점에서 관절에 남아 있는 IL - 1ra 의 양은 도 2 에 나타나 있다. 세 가지 다른 하이알루로난 제제형내 IL-1ra 의 관절내 반감기는 도 2 의 그래프로 부터 계산하였으며, 표 3 에 나타나 있다.
표 3 및 도 2 에 나타낸 바와 같이, 하이알루로난 내로 IL-1ra 를 포함시킨 결과 관절내 투여후 무릎 관절내 IL-1ra 의 보유시간이 연장된다. 보유정도는 제제형내 비-교차결합된(유체) 하이알루로난 대 교차결합된(겔) 하이알루로난의 비율에 의해 조절할 수 있다.
실시예 3
상기한 바와 같이, CSEP 내 IL-1ra 또는 IL-1ra(100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란 제제형을 토끼(미국 미시간 포테이지 찰스 리버에서 구입)의 뒤쪽 무릎내로 관절내주사하였다. 주사후 여러 시간에서, 이 동물을 희생시키고 PBS 로 무릎을 세정하여 활액을 회수하였다. 회수된 활액내 IL-1ra(ug/ml)의 농도는 제조자의 설명에 따라 ELISA(QuantikineTM,인체 IL-1ra 면역검정, R & D 시스템)로써 측정하였다. 이 데이타는 표 4 및 도 3 에 나타나 있다.
이 데이타는 IL-1ra 의 하이알루로난 제제형이 관절내 주사후 활액내 자연그대로의 IL-1ra 의 방출을 연장시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
암컷 루이스 랫(200 - 250 g, 미국 미시간 포테이지 찰스 리버에서 구입)을 소의 제 II 형 콜라겐(미국 미주리 오우윈스빌에 소재하는 엘라스틴 프러덕츠에서 구입)으로 0 일 및 7 일에 면역화시켰다. 12 - 13 일에 관절염이 발생하기 시작하였다. 초기 면역화 후 15 일 및 18 일에 CSEP 내 H-10TM하이란 유체(50 μl/무릎 ; 1 mg 총 하이알루로난)나 아니면 IL-1ra(100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란(50 ul/무릎 ; 5 mg/IL-1ra/1 mg 하이알루로난)으로 상기 랫(8 마리 동물/군)을 관절내주사하였다. 관절염 대조군은 주사하지 않았다. 초기 면역화후 20 일에, 랫을 희생시키고 질병의 심각성에 대한 조직학적 평가를 위해 무릎 관절을 모았다. 표 5 및 도 4 는 다음을 나타낸다 : (1) IL-1ra 치료는 연골 및 골 손상을 상당히 억제하였으며 활막염에 대한 적당한 효과를 지녔다 ; (b) 총 관절 손상은 대조에 비해 70 % 까지 감소하였다 ; 및 (c) 하이알루로난 단독 치료는 질병 대조와 비교하여 유익한 효과가 없었다.
실시예 5
암컷 루이스 랫(200 - 250 g, 미국 미시간 포테이지 찰스 리버에서 구입)의 꼬리 기저부와 등뒤 3 부위(250 ul로 나눔)에 불완전 프로인트 보조제(미국 미시간 앤 아버에 소재하는 딥코 라보라토리스, 인코포레이티드에서 구입)내 소의 제 II 형 콜라겐(미국 미주리 오우윈스빌에 소재하는 엘라스틴 프러덕츠에서 구입) 2 mg/ml 를 0 일 및 7 일째에 피내주사하였다. 12 일째에 3 mg/kg 의 내독소(LPS 형 L-3129, 시그마에서 구입)를 복강내주사하였다. 그 다음 5 일에 걸쳐 관절염이 발생하였으며 랫에 발생된 질병에 따라 상기 동물을 실험군(6-8 마리/군)으로 무작위 추출하여 초기에 치료하였다. 6 일 동안 랫을 치료한 다음[상기한 바와 같이, IL-1ra (100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란 유체를 등 부분에 피하주사]발 무게 및 조직 회수를 평가하기 위해 관절염 7 일째에 희생시켰다.
관절염 발병 전에, 무작위 추출한 그 날에, 및 관절염 7 일째에 연구를 종결할때까지 이후 각 연구일에 칼리퍼스로 과관절 폭을 측정하였다. 그런 다음 관절염 지속기간 동안 대조로 부터의 저해 백분율을 측정하고자 데이타를 곡선하 면적으로 표시하였다. 연구를 종결하고, 염증의 또 다른 측정으로서 최종 발 중량을 측정하기 위해 경족근골 관절을 내과(medial malleolus) 및 외과(lateral malleolus) 수준으로 절단하였다. 그런 다음 조직병리학적 평가를 위해 과관절을 포르말린내에 모았다.
조직병리학 : 대략 1 주일간 서지패스(Surgipath) 탈회기 I(미국 일리노이 그레이슬레이크에 소재하는 서지패스에서 구입)에 배열시키기 전에 최소한 24 시간 동안 과관절을 10 % 중성 완충 포르말린내에 모았다. 탈회가 완료되었을 때, 발가락을 다듬고 과관절을 세로면으로 절단하여 대략 똑같이 반으로 나누었다. 이것을 파라핀 포매하여 절편화한 다음 일반적인 염증 및 골 손상을 평가하기 위해 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 다음 표준에 따르는 연골변화에 관한 특별한 평가를 위해서는 톨루이딘 블루로 염색하였다 :
염증
0 = 정상
1 = 관절주위에 최소의 염증세포 침윤
2 = 가벼운 침윤
3 = 중간정도의 부종을 수반하는 중간정도의 침윤
4 = 현저한 부종을 수반하는 현저한 침윤
5 = 심각한 부종을 수반하는 심각한 침윤
연골 손상
0 = 정상
1 = 분명한 연골세포 손실이나 콜라겐 파괴가 없는 톨루이딘 블루 염색의 최소한 가벼운 손실
2 = 가벼운(표면상) 병소성 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴를 수반하는 톨루이딘 블루 염색의 가벼운 손실
3 = 중간정도의(중간구역까지의 깊이) 다병소성 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴를 수반하는 톨루이딘 블루 염색의 중간정도의 손 실
4 = 현저한(깊은구역까지의 깊이) 다병소성 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴를 수반하는 톨루이딘 블루 염색의 현저한 손실
5 = 심각한(최고점까지의 깊이) 다병소성 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴를 수반하는 톨루이딘 블루 염색의 심각하게 퍼진 손실
골흡수
0 = 정상
1 = 최소로 작은 흡수영역, 저배율로는 쉽게 보이지 않음, 드문 파골세포.
2 = 더 많은 흡수영역을 갖는 가벼운 정도, 저배율로는 쉽게 보이지 않음, 보다 많은 파골세포
3 = 피질의 완전한 두께 결함 없이 수질소주 및 피질골의 분명한 흡수를 갖는 중간정도, 일부 수질소주의 손실, 저배율상에서 분명히 나타나는 병소, 보다 많은 파골세포
4 = 종종 잔류 피질표면의 측면염좌를 수반하는, 피질골의 완전한 두께 결함을 갖는 현저한 정도, 현저한 수질 손실, 많은 파골세포.
5 = 종종 잔류 피질표면의 측면염좌를 수반하는, 피질골의 완전한 두께 결함을 갖는 심각한 정도, 말단경골 수질골의 현저한 손실, 많은 파골 세포, 흡수는 보다 작은 족근골에도 존재함.
통계학적 분석 : 발목폭에 대한 임상 데이타는 이후의 분산 분석과 함께 곡선하 면적을 측정함으로써 분석하였다. 각 군에 대한 발 중량(평균 ± SE)은 스투덴트 T 검정을 이용하여 차이에 대해 분석하였다.
100 mg/kg 투여량의 CSEP 내 IL-1ra 를 매일 단일 투여했을 때에 효능이 결여된 것과 대조적으로, IL-1ra (100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란 유체의 피하(SQ)투여량을 매일 단일(QD)투여한 결과 규정 시간 외에 발 팽화는 62 % 저해되었고 최종 발 중량은 74 % 저해되었다(도 6 및 7). 이 결과는 IL-1ra (100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란 유체 대 CSEP 내 IL-1ra 의 매일 투여가 우수한 임상효과를 나타낸다는 것을 명백히 설명하는 것이다. 게다가, 과관절 절편의 조직학적 분석 결과 CSEP 내 IL-1ra 가 아니라 IL-1ra(100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란 유체로 치료한 랫에게서 염증, 판누스 형성, 연골 및 골 손상이 현저하게 감소되었음이 드러났다(도 8).
IL-1ra(100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란 유체의 단일 매일 - 피하 투여량이 질병 진행을 조절할 수 있다는 것을 확실히 한 후, 효과의 지속기간을 측정하기 위한 연구를 착수하였다. IL-1ra(100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란 유체로 매일 치료한 랫은 시간외에 발 팽화가 53 % 저해되었고최종 발 중량이 78 % 저해되었다(도 9 및 도 10). IL-1ra(100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란 유체로 관절염 랫을 격일로 치료하였더니 규정 시간외 발 팽화는 35 % 저해되었고 최종 발 중량은 62 % 저해되었다. IL-1ra(100 mg/ml)/2 % H-10TM하이란 유체로 관절염 랫을 3 일에 한 번 치료하였더니 규정 시간외에 팽화는 27 % 저해되었고(유의수준이 아님) 발 중량은 19 % 저해되었다. 이 결과는 IL-1 이 상기 모델의 병인론에 효과적인 시간 중에 최소한 200 ng/ml 의 최소 혈액수준을 유지시키는 중요성을 다시 설명한 것이다. IL-1 수용체를 간헐적으로 차단시킨 결과 효능은 감소하였다. 3 일에 한 번 랫을 치료하는데, 관절염 1 일 및 4 일째에 투여하였다. 흥미있게, 투여후 24 시간째(2 일 및 5 일째)에 칼리퍼스 측정하였더니 관절염 진행이 억제되었다(도 9). 그러나, 랫에게 그 다음 투여량을 투여하기 전에 투여한 후 2 또는 3 일째의 측정치는 그 기간 중에 최적의 혈액 수준 이하의 결과로서, 질병의 진행을 나타낸다.
본 발명은 일반적이며 바람직한 실시형태로 기술되어 있으나, 상기 상세한 설명을 고려하여 본 기술분야의 숙련자들에 의해 그외의 변형 및 수정이 일어날 것이다.
이상과 같이 본 발명의 융합 단백질 및 이를 포함하는 제약학적 조성물은 IL-1 매개 질환의 치료에 효과적이다.

Claims (18)

  1. 카르복시-말단에 인체 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역 중 일부 또는 전부를 갖는 인터루킨-1 수용체 길항물질(IL-1ra)을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-1ra 는 서열 2 의 아미노산 서열과 적어도 약 70 % 상동인 서열을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-1ra 는 서열 2 의 아미노산 서열과 적어도 약 80 % 상동인 서열을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-1ra 는 서열 2 의 아미노산 서열과 적어도 약 90 % 상동인 서열을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-1ra 는 서열 2 의 아미노산 서열과 적어도 약 95 % 상동인 서열을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-1ra 는 서열 2 의 아미노산 서열 또는 생물학적으로 활성인 그것의 결실 변이체를 포함함을 특징으로 하는 융합단백질.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 IL-1ra 는 서열 2 의 N-말단 결실 또는 C-말단 결실을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 IL-1ra 는 서열 2 의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-1ra 는 글리코실화되지 않음을 특징으로 하는 융합 단백질.
  10. 제 1 항에 있어서, 서열 2 의 개시 아미노산이 Mn (n=1) 임을 특징으로 하는 융합 단백질.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-1ra 는 글리코실화됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-1ra 는 DNA 재조합 방법에 의해 제조함을 특징으로 하는 융합 단백질.
  13. 제 1 항의 융합 단백질 및 제약학적으로 용인가능한 담체를 함유하는, 관절의 염증질환, 다발성경화증, 백혈병, 국소빈혈 손상 및 재관류 손상 중에서 선택한 인터루킨-1 (IL-1) 매개 질환 치료용 제약학적 조성물.
  14. 치료학적 유효량의 제 1 항의 융합 단백질을 함유하는 제약학적 조성물을 환자에게 투여함을 포함하는, 인체를 제외한 환자의 관절의 염증질환, 다발성경화증, 백혈병, 국소빈혈 손상 및 재관류 손상 중에서 선택한 인터루킨-1 (IL-1) 매개 질환을 치료하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 관절의 염증 질환은 류마티스성관절염, 골관절염 및 과다 운동, 염좌, 외상, 감염, 연골 손상이나 외과수술로 인한 그외의 염증 상태로 이루어진 군에서 선택함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 제약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 관절내 또는 주입에 의해 투여함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 제약학적 조성물은 항-염증성 약물 투여전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 항-염증성 약물은 비-스테로이드성의 항-염증성 약물(NSAIDs), 코르티코스테로이드, 서서히 작용하는 항류마티스성 약물(SAARDs) 또는 질병 변형(DM) 약물 중에서 선택함을 특징으로 하는 방법.
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