KR20040007485A

KR20040007485A - 알레르기성 질환과 같은 비만세포계 질병에 대한ｎ-페닐-2-피리미딘아민의 용도

Info

Publication number: KR20040007485A
Application number: KR10-2003-7012939A
Authority: KR
Inventors: 겐이찌 고이께; 아쯔시 고미야마; 고이찌 다께우찌; 마이클 헤인리치; 모또오 나까지마
Original assignee: 노파르티스 아게; 더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 디파트먼트 오브베테랑스 어페어스; 겐이찌 고이께; 아쯔시 고미야마; 고이찌 다께우찌; 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티
Priority date: 2001-04-05
Filing date: 2002-04-05
Publication date: 2004-01-24
Also published as: NO20034414L; AU2002307140B2; PL363080A1; WO2002080925A1; NO20034414D0; RU2304436C2; GB0108606D0; IL158061A0; KR20090034998A; CA2443092A1; NZ528934A; ZA200307563B; SK12312003A3; HUP0303751A3; EP1389113A1; NO325454B1; MXPA03009058A; BR0208663A; HUP0303751A2; CN1529602A

Abstract

유리 형태 또는 제약상 허용되는 염 형태의 하기 화학식 I {식에서 기호 및 치환체는 본원에 제시된 의미를 갖는다}의 N-페닐-2-피리미딘-아민 유도체의 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 약물 알레르기 또는 음식 알레르기, 혈관부종, 두드러기, 유아 돌연사 증후군, 기관지 폐 아스페르길루스증, 다발성 경화증 또는 비만세포증의 치료용 제약 조성물의 제조에 있어서의 용도를 개시한다.

<화학식 I>

Description

알레르기성 질환과 같은 비만세포계 질병에 대한 Ｎ-페닐-2-피리미딘아민의 용도{USE OF N-PHENYL-2-PYRIMIDINEAMINE DERIVATIVES AGAINST MAST CELL-BASED DISEASES LIKE ALLERGIC DISORDERS}

본 발명은 유리 형태 또는 제약상 허용되는 염 형태의 화학식 I의 N-페닐-2-피리미딘-아민 유도체 (기호 및 치환체는 이하에 정의된 바와 같음)의 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 약물 알레르기 또는 음식 알레르기, 혈관부종, 두드러기, 유아 돌연사 증후군, 기관지 폐 아스페르길루스증 (aspergillosis), 다발성 경화증 또는 비만세포증 치료용 제약 조성물의 제조시에서의 신규한 용도 및 치료 유효량의 화학식 I의 화합물을 상기한 질병 중의 하나를 앓고 있는 온혈 동물에 투여하는, 온혈 동물, 바람직하게는 인간의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 약물 알레르기 또는 음식 알레르기, 혈관부종, 두드러기, 유아 돌연사 증후군, 기관지 폐 아스페르길루스증, 다발성 경화증 또는 비만세포증 치료용 의약의 제조를 위한 하기 화학식 I의 N-페닐-2-피리미딘-아민 유도체 또는 하나 이상의 염 형성기를 갖는 상기 화합물의 염의 용도에 관한 것이다.

상기 식에서,

R₁은 4-피라지닐; 1-메틸-1H-피롤릴; 아미노- 또는 아미노-저급 알킬 치환 페닐 (여기서 각각의 경우에 아미노기는 유리, 알킬화 또는 아실화됨); 5원 고리 탄소 원자에 결합된 1H-인돌릴 또는 1H-이미다졸릴; 또는 고리 탄소 원자에 결합되고 비치환되거나 질소 원자에서 산소로 치환된 비치환 또는 저급 알킬 치환 피리딜이고,

R₂및 R₃은 각각 서로 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이고,

라디칼 R₄, R₅, R₆, R₇및 R₈중의 하나 또는 둘은 각각 니트로, 플루오로 치환된 저급 알콕시 또는 하기 화학식 II의 라디칼이고,

-N(R₉)-C(=X)-(Y)_n-R₁₀

R₉는 수소 또는 저급 알킬이고,

X는 옥소, 티오, 이미노, N-저급 알킬-이미노, 히드록스이미노 또는 O-저급 알킬-히드록스이미노이고,

Y는 산소 또는 기 NH이고,

n은 0 또는 1이고,

R₁₀은 탄소수 5 이상의 지방족 라디칼, 또는 방향족, 방향족-지방족, 지환족, 지환족-지방족, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클릭-지방족 라디칼이고, 나머지 라디칼 R₄, R₅, R₆, R₇및 R₈은 각각 서로 독립적으로 수소, 유리 또는 알킬화 아미노, 피페라지닐, 피페리디닐, 피롤리디닐 또는 모르폴리닐에 의해 치환되거나 비치환된 저급 알킬, 또는 저급 알카노일, 트리플루오로메틸, 유리, 에테르화 또는 에스테르화 히드록시, 유리, 알킬화 또는 아실화 아미노 또는 유리 또는 에스테르화 카르복시이다.

1-메틸-1H-피롤릴은 바람직하게는 1-메틸-1H-피롤-2-일 또는 1-메틸-1H-피롤-3-일이다.

아미노- 또는 아미노-저급 알킬 치환된 페닐 R₁(여기서 각각의 경우에 아미노기는 유리, 알킬화 또는 아실화됨)은 임의의 목적하는 위치 (오르토, 메타 또는 파라)에서 치환된 페닐이고, 여기서 알킬화 아미노기는 바람직하게는 모노- 또는 디-저급 알킬아미노, 예를 들어 디메틸아미노이고, 아미노-저급 알킬의 저급 알킬 잔기는 바람직하게는 직쇄 C₁-C₃알킬, 예를 들어 특히 메틸 또는 에틸이다.

5원 고리의 탄소 원자에 결합된 1H-인돌릴은 1H-인돌-2-일 또는 1H-인돌-3-일이다.

고리 탄소 원자에 결합된 비치환 또는 저급 알킬 치환된 피리딜은 저급 알킬치환 또는 바람직하게는 비치환된 2-, 4- 또는 바람직하게는 3-피리딜, 예를 들어 3-피리딜, 2-메틸-3-피리딜 또는 4-메틸-3-피리딜이다. 질소 원자에서 산소로 치환된 피리딜은 피리딘 N-옥시드에서 유래한 라디칼, 즉 N-옥시도-피리딜이다.

플루오로 치환된 저급 알콕시는 하나 이상의, 바람직하게는 복수개의 플루오로 치환체를 포함하는 저급 알콕시, 특히 트리플루오로메톡시 또는 1,1,2,2-테트라플루오로에톡시이다.

X가 옥소, 티오, 이미노, N-저급 알킬-이미노, 히드록스이미노 또는 O-저급 알킬-히드록스이미노일 경우, 기 C=X는 상기 순서대로 각각 라디칼 C=O, C=S, C=N-H, C=N-저급 알킬, C=N-OH 또는 C=N-O-저급 알킬이다. X는 바람직하게는 옥소이다.

n은 바람직하게는 0이다. 즉, 기 Y는 존재하지 않는다.

Y는 존재할 경우 바람직하게는 기 NH이다.

본원에서 사용되는 용어 "저급"은 7 이하, 바람직하게는 4 이하의 탄소 원자를 포함하는 라디칼을 의미한다.

저급 알킬 R₁, R₂, R₃및 R₉는 바라직하게는 메틸 또는 에틸이다.

탄소수 5 이상의 지방족 라디칼 R₁₀은 바람직하게는 22 이하, 일반적으로 10 이하의 탄소 원자를 포함하고, 상기 치환되거나 바람직하게는 비치환된 지방족 탄화수소 라디칼, 즉 상기 치환되거나 바람직하게는 비치환된 알키닐, 아케닐 또는 바람직하게는 알킬 라디칼, 예를 들어 C₅-C₇알킬, 예를 들어 n-펜틸이다. 방향족라디칼 R_1O은 20 이하의 탄소 원자를 포함하고, 시아노, 비치환 또는 히드록시-, 아미노- 또는 4-메틸-피페라지닐-치환된 저급 알킬, 예를 들어 특히 메틸, 트리플루오로메틸, 유리, 에테르화 또는 에스테르화 히드록시, 유리, 알킬화 또는 아실화 아미노 및 유리 또는 에스테르화 카르복시로부터 선택되는 치환체로 치환되거나 비치환되고, 예를 들어 치환 또는 비치환된 나프틸, 예를 들어 특히 2-나프틸 또는 바람직하게는 페닐이다. 방향족-지방족 라디칼 R₁₀에서, 방향족 잔기는 상기 정의한 바와 같고, 지방족 잔기는 치환, 또는 바람직하게는 비치환된 저급 알킬, 예를 들어 특히 C₁-C₂알킬, 예를 들어 벤질이다. 지환족 라디칼 R₁₀은 특히 30 이하, 보다 특히는 20 이하, 가장 특히는 10 이하의 탄소 원자를 갖고, 모노시클릭 또는 폴리시클릭이고, 치환되거나 바람직하게는 비치환된, 예를 들어 시클로알킬 라디칼, 특히 5원 또는 6원 시클로알킬 라디칼, 예를 들어 바람직하게는 시클로헥실이다. 지환족-지방족 라디칼 R₁₀에서, 지환족 잔기는 상기 정의한 바와 같고, 지방족 잔기는 바람직하게는 저급 알킬, 예를 들어 특히 치환되거나 바람직하게는 비치환된 C₁-C₂알킬이다. 헤테로시클릭 라디칼 R₁₀은 특히 20 이하의 탄소 원자를 포함하고, 바람직하게는 질소, 산소 및 황으로부터 바람직하게 선택되는 1 내지 3개의 헤테로 원자를 갖는 5원 또는 6원 고리의 포화 또는 불포화 모노시클릭 라디칼, 특히 예를 들어 티에닐 또는 2-, 3- 또는 4-피리딜, 또는 상기 모노시클릭 라디칼에 하나 또는 두개의 벤젠 라디칼이 연결(융합)된 비시클릭 또는 트리시클릭 라디칼이다. 헤테로시클릭-지방족 라디칼 R₁₀에서, 헤테로시클릭 잔기는 상기 정의한 바와 같고, 지방족 잔기는 치환되거나 바람직하게는 비치환된 저급 알킬, 예를 들어 특히 C₁-C₂알킬이 바람직하다.

에테르화 히드록시는 바람직하게는 저급 알콕시이다. 에스테르화 히드록시는 바람직하게는 유기 카르복실산, 예를 들어 저급 알칸산, 또는 무기산, 예를 들어 할로겐화수소산, 예를 들어 저급 알카노일옥시 또는 특히 할로겐, 예를 들어 요오드, 브롬, 또는 특히 불소 또는 염소에 의해 에스테르화된 히드록시이다.

알킬화 아미노는 예를 들어 저급 알킬아미노, 예를 들어 메틸아미노, 또는 디-저급 알킬아미노, 예를 들어 디메틸아미노이다. 아실화 아미노는 예를 들어 저급 알카노일아미노 또는 벤조일아미노이다.

에스테르화 카르복시는 예를 들어 저급 알콕시카르보닐, 예를 들어 메톡시카르보닐이다.

치환된 페닐 라디칼은 5 이하의 치환체, 예를 들어 불소를 포함할 수 있으나, 특히 비교적 큰 치환체의 경우 일반적으로 단지 1 내지 3개의 치환체로 치환된다. 특별히 언급할 수 있는 치환된 페닐의 예는 4-클로로-페닐, 펜타플루오로-페닐, 2-카르복시-페닐, 2-메톡시-페닐, 4-플루오로-페닐, 4-시아노-페닐 및 4-메틸-페닐이다.

화학식 I의 화합물에서 염 형성기는 염기성 또는 산성 특성을 갖는 기 또는 라디칼이다. 하나 이상의 염기성 기 또는 하나 이상의 염기성 라디칼, 예를 들어유리 아미노기, 피라지닐 라디칼 또는 피리딜 라디칼을 갖는 화합물은 예를 들어 무기산, 예를 들어 염화수소산, 황산 또는 인산 또는 적합한 유기 카르복실산 또는 술폰산, 예를 들어 지방족 모노- 또는 디-카르복실산, 예를 들어 트리플루오로아세트산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 히드록시말레산, 말산, 타르타르산, 시트르산 또는 옥살산, 또는 아미노산, 예를 들어 아르기닌 또는 리신, 방향족 카르복실산, 예를 들어 벤조산, 2-페녹시-벤조산, 2-아세톡시-벤조산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 방향족-지방족 카르복실산, 예를 들어 만델산 또는 신남산, 헤테로방향족 카르복실산, 예를 들어 니코틴산 또는 이소니콘틴산, 지방족 술폰산, 예를 들어 메탄-, 에탄- 또는 2-히드록시에탄-술폰산, 또는 방향족 술폰산, 예를 들어 벤젠-, p-톨루엔- 또는 나프탈렌-2-술폰산을 사용하여 산 부가염을 형성할 수 있다. 복수의 염기성기가 존재할 경우, 모노- 또는 폴리-산 부가염이 형성될 수 있다.

라디칼 R₁₀에 산성기, 예를 들어 유리 카르복시기를 갖는 화학식 I의 화합물은 금속 또는 암모늄염, 예를 들어 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘 또는 칼슘염, 또는 암모니아 또는 적합한 유기 아민, 예를 들어 4급 모노아민, 예를 들어 트리에틸아민 또는 트리-(2-히드록시에틸)-아민 또는 헤테로시클릭 염기, 예를 들어 N-에틸-피페리딘 또는 N,N'-디메틸-피페라진과의 암모늄염을 형성할 수 있다.

산성 및 염기성기를 모두 갖는 화학식 I의 화합물은 내부염을 형성할 수 있다.

중간체로서 사용되는 화합물의 경우 뿐만 아니라 단리 또는 정제를 위해 제약상 허용되지 않는 염을 사용할 수도 있다. 그러나, 제약상 허용되는, 비독성의 염만이 치료 목적으로 사용되고, 따라서 상기 염이 바람직하다.

화학식 I의 화합물은 온혈동물, 바람직하게는 인간의 치료를 위해 또는 상기 치료용 의약의 제조를 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "알레르기성 비염"은 비점막의 임의의 알레르기성 반응을 의미한다. 상기 알레르기성 반응은 예를 들어 통년적으로(perennially) (예를 들어 춘계 결막염) 또는 계절적으로 (예를 들어 고초열) 발생할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "알레르기성 피부염"은 특히 아토피 피부염, 알레르기성 접촉 피부염 및 습진성 피부염을 의미하지만, 또한 예를 들어 지루성 피부염, 편평 태선, 두드러기 및 여드름을 포함한다. 본원에서 사용된 아토피 피부염은 소양증에 대한 낮은 피부 역치에 대한 유전적 소인을 갖는 개체에서 발견되는 만성 염증성 피부 질환이다. 이 질환은 극심한 가려움증과 이에 따른 긁기 및 문지르기를 통한 습진의 전형적인 병변이라는 특징을 갖는다. 본원에서 사용된 알레르기성 접촉 피부염은 알레르겐에 대한 기노출의 결과로 알레르겐에 대한 후천성 과민반응이 있는 개체의 피부에 염증 반응을 생성시키는 상이한 물질에 대한 알레르기성 민감성에 의한 피부염의 형태이다.

본원에서 사용된 용어 "약물 알레르기 또는 음식 알레르기"는 약물 또는 섭취한 항원, 예를 들어 딸기, 우유 또는 계란에 의해 발생하는 알레르기성 반응에관한 것이다.

용어 "기관지 폐 아스페르길루스증"은 폐의 아스페르길루스 (Aspergillus) 감염에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 "비만세포증"은 전신성 비만세포증, 예를 들어 비만세포종, 특히 개과(canine) 비만세포 신생물에 관한 것이다.

화학식 I의 화합물은 이하에서 본 발명의 화합물로서 집합적으로 언급된다.

비만세포는 상기한 바와 같은 알레르기성 질환에서 주요 이펙터 세포로서 중요한 기능을 수행한다. 비만세포의 항원 특이적 IgE 매개 탈과립화 (degranulation)는 화학 매개체 및 다수의 시토킨의 방출 및 류코트리엔 합성을 유도한다. 또한, 비만세포는 다발성 경화증의 발병에 관련된다.

비만세포 신생물은 인간 및 동물 모두에서 발생한다. 개에서, 비만세포 신생물은 비만세포종으로 언급되고, 상기 질병은 흔하고, 개과 종양의 7-21%를 차지한다. 대체로 일시적이거나 무통성인 인간 비만세포증과 예기치 않은 방식으로 나타나고 종종 침습성 및 전이성인 개과 비만세포 신생물의 차이를 유의하여야 한다. 예를 들어, 인간 단독 비만세포종은 본질적으로 전이되지 않지만, 개과의 비만세포종의 50%는 938마리의 개에서 46종의 출판된 종양 보고서 검토후에 호텐도르프 및 닐센 (Hottendorf & Nielsen (1969))에 의해 추정된 바와 같이 악성으로 작용한다.

애완동물의 암은 자연발생적인 질병이다. 애완동물 소유자는 동물의 수명의 질을 연장시키려는 욕구를 갖고, 종종 전국의 사립 동물병원 및 부설 동물병원의 동물 암연구자에게 특별 관리 및 치료를 받고자 한다. 동물 암 환자의 치료 양식은 수술, 화학요법, 방사선 요법 및 바이오요법을 포함하여 인간과 유사하다. 미국에서 4200만 마리의 개와 약 2000만 마리의 고양이가 존재하는 것으로 추정된다. 암 발생률의 대략적 추정치를 사용하여 매년 약 4백만 마리의 개 및 유사한 수의 고양이에 대해 암 진단이 내려지고 있다.

개의 피부 비만세포 종양은 흔한 질병이다. 대부분의 비만세포 종양은 양성이고, 간단한 절제술로 치료된다. 그러나, 재발 또는 먼 부위로 전이되는 경우, 치료 방법이 제한된다. 재발 병소에 대한 치료 방법은 외부 빔 조사 요법을 포함할 수 있다. 먼 부위 전이 또는 산재성(disseminated) 질병의 경우, 화학요법 프로토콜을 포함하여 로부스틴 (Lomustine, 등록상표) 및 빈블라스틴을 사용하면 일부 잇점이 있음이 입증되었다. 비만세포 종양의 전이 부위는 피부, 부위 림프절, 비장, 간 및 골수를 포함한다.

비만세포증의 발병에 관련되는 KIT 수용체는 KIT의 구성적 활성화를 야기하는 복수의 돌연변이가 많은 비만세포주에서 검출되었다는 관찰에 의해 제시된 것이다. 예를 들어, 포스포트랜스퍼라제 도메인 및 수용체 자기활성화시에 Asp816 대신에 Val의 치환을 야기하는 인간 c-KIT의 포인트 돌연변이는 장기 인간 비만세포 백혈병 세포주 (HMC-1) 및 2개의 설치류 비만세포주의 대응하는 코돈에서 발생한다. 또한, 상기 활성화 돌연변이는 인간 비만세포증의 일부 경우에 계내에서 확인되었다. 다른 2개의 활성화 돌연변이, 즉 인간 HMC-1 비만세포주에서의 Val560Gly 치환 및 설치류 비만세포주 FMA3에서의 7개 아미노산 결실 (Thr573-His579)이 KIT의 세포내 적스타멤브레인 (juxtamembrane) 영역에서 발견되었다.

본 발명의 화합물 또는 각각의 경우에 제약상 허용되는 그의 염이 본원에서 언급한 질병의 하나 이상의 효과적인 예방 또는 바람직하게는 치료 효과를 갖는다는 것을 확립된 시험 모델, 특히 본원에서 설명하는 시험 모델에 의해 확인할 수 있다. 당업계의 숙련인은 본원에서 언급되는 치료 효능 및 유리한 효과를 입증하기 위해 관련 시험 모델을 충분히 선택할 수 있다. 예를 들어, 약리학적 활성은 임상 연구 또는 본원에서 이하에서 설명하는 시험 방법에서 입증할 수 있다.

파트 A

실시예 1

본 실시예는 문헌[Kinoshita T, Sawai N 등, Blood, Vol. 94, pp. 496-508 (1999)]에 기재된 배양계를 이용하여 CD34⁺탯줄 혈액 세포로부터 생성된 배양된 인간 비만세포 성장의 SCF-의존성 발달에 대한 본 발명의 화합물의 시험관내 효과를 증명한다. 단리된 세포의 90% 이상이 유동 세포계 분석에 따라 CD34-양성이었다.

시약 및 항체

본 발명의 화합물을 PBS에 10^-2M의 농도로 가용화시키고 -80℃에서 보관하였다. 전체-트랜스 레티노산 (시그마사 (Sigma))을 에탄올에 10^-2M의 농도로 용해시키고 차광 바이알 내에 -80℃에서 보관하였다. 트립타제 (MAB1222)에 대한 정제된 mAB는 케미콘 인터내셔날 인크. (Chemicon International Inc.; CA))로부터 구입할 수 있다. 유동 세포계 분석을 위해, CD34 (8G12, FITC) 및 CD11b (Leu15, PE)에 대한 mAbs는 벡톤 디킨슨 이뮤노사이토메트리 시스템즈 (Becton DickinsonImmunocytometry Systems; Mountain View, CA)로부터, CD41 (SZ22, FITC)에 대한 mAb는 이뮤노테크 에스.에이. (Immunotech S.A.; Marseilles, France)로부터 구입하였다. 글리코포린 A (GPA, JC159, FITC)에 대한 mAb는 다코 (Dako; Glostrup, Denmark)로부터 입수할 수 있다. 웨스턴 블로팅과 면역침전을 위해, c-kit (NU-c-kit)에 대한 및 포스포타이로신 (4G10)에 대한 mAbs는 각각 니치레이 앤드 업스테이트 바이오테크놀로지, 인크 (Nichirei and Upstate Biotechnology, Inc; Lake Placid, NY)로부터 구입할 수 있다.

현탁 배양

혈청을 제거한 액체 배양은 24-웰 배양 플레이트 (#3047; 벡톤 디킨슨)에서 수행하였다. 2만개의 CD34⁺세포를 1% BSA 보충한 α-배지 2 mL, 300 ㎍/mL 완전 철 포화된 인간 트랜스페린 (순도 약 98%, 시그마사), 16 ㎍/mL 대두 레시틴 (시그마사), 9.6 ㎍/mL 콜레스테롤 (Nakalai Chemicals Ltd., Japan) 및 20 ng/mL의 SCF, 10 ng/mL의 GM-CSF, 2 U/mL의 EPO, 10 ng/mL의 TPO, 상이한 농도의 본 발명의 화합물을 단독으로 또는 조합하여 함유하는 각 웰에서 배양시켰다. 비만세포의 SCF-의존성 발달에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 검사하기 위해, CD34⁺탯줄 혈액 세포로부터 20 ng/mL의 SCF와 함께 성장시킨 10주 배양된 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 5-10×10⁴개의 10주 배양된 세포를 다양한 농도의 본 발명의 화합물의 존재 또는 부재 하에 20 ng/mL의 SCF를 함유하는 24-웰 배양 플레이트에서 2주 동안 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 37℃에서 5% C0₂, 5% O₂및 90% N₂의 혼합물로 플러싱시킨 가습 분위기 중에서 인큐베이팅시켰다. 4주까지 계속 배양시킬 때, 매 2주마다 배양 배지의 반을 상기 인자(들)을 함유하는 신선한 배지로 교체하였다. 생활 세포의 수는 트립판-블루 배제 시험에 의해 혈구계를 사용하여 측정하였다.

클로날 세포 배양

비만세포 콜로니 분석은 35 mm Lux 현탁 배양 디쉬 (#171099; Nunc, IL)에서 수행하였다. 배양물은 10 ng/mL의 SCF, α-배지, 0.9% 메틸셀룰로즈 (Shinetsu Chemical, Japan), 1% BSA, 300 ㎍/mL의 완전 철 포화된 인간 트랜스페린, 16 ㎍/mL의 대두 레시틴, 9.6 ㎍/mL의 콜레스테롤 및 100 ng/mL의 SCF와 함께 10^-6M의 본 발명의 화합물의 존재 또는 부재 하에 성장시킨 10주 배양된 세포 (4,000 세포/mL)로 이루어졌다. 디쉬를 37℃에서 5% CO₂, 5% 0₂및 90% N₂의 혼합물로 플러싱시킨 가습 분위기 중에서 인큐베이션하였다. 4주 후, 30개 이상의 세포로 이루어진 응집물을 비만세포 콜로니로서 기록하고, 10-29개 세포로 이루어진 응집물을 비만세포 클러스터 (clusters)로서 기록하였다. 30개의 개별 콜로니와 클러스터를 들어올려, 알칼리성 포스파타제-항-알칼리성 포스파타제 (APAAP) 기술을 이용하여 항-트립타제 mAb 또는 마우스 IgG1로 염색하였다. 거의 모든 구성 세포들이 트립타제에 대해 양성이었다.

세포화학 및 면역학적 염색

배양된 세포를 Cytospin II를 사용하여 유리 슬라이드 상에 펼쳐놓았다. 페록시다제 (POX)와의 세포화학적 반응은 전통적인 방법으로 수행하였다. 트립타제에 대한 mAb와의 반응은 APAAP 방법 (Dako APAAP Kit System, Dako Corp., CA)을 이용하여 문헌[Ma 등, Br. J. Haematol., Vol. 100, pp. 427-435 (1998)]에 기재된 바와 같이 검출하였다.

면역침전 및 웨스턴 블롯팅

면역침전 및 웨스턴 블롯팅은 문헌[Kamijo 등, Leuk. Res., Vol. 21, pp 1097-1106 (1997)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

유동 세포계 분석

배양된 세포 상의 표면 마커의 분석을 위해, 1-2×10⁵세포를 플라스틱 튜브 내에 수집하여 적절하게 희석시킨 FITC- 또는 PE-mAb와 함께 문헌[Kinoshita 등, Blood, Vol. 94, pp. 496-508 (1999)]에 기재된 바와 같이 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, 그 후 그의 표면 마커를 FACScan 유동 세포계를 사용하여 분석하였다. 생활 세포를 그들의 전방 (forward) 광 산란 특징과 측부 (side) 산란 특징에 따라 나누었다. 양성 세포의 비율은 FITC- 또는 PE-컨쥬게이트된 마우스 이소타입-매치된 Ig로 염색한 세포에 비교함으로써 측정하였다.

세포 아폽토시스 (apoptosis)의 검출

세포 아폽토시스의 분석은 프로피듐 요오다이드 (PI, 시그마사)를 사용하여 유동 세포계 분석에 의해 문헌[Sawai 등, Stem Cells, Vol. 17, pp. 45-53 (1999)]에 기재된 절차에 따라 수행하였다. 아폽토시스, 세포괴사를 겪거나 이미 죽은 세포를 감소시키기 위해, percoll 구배 원심분리를 이용할 수 있다. 10주 배양된 세포를 α-배지 중 27% Percoll (시그마사) 및 PBS 중 54% 퍼콜 (Percoll) 상에 적층시킨다. 원심분리시킨 후, 2가지 상이한 농도의 Percoll 용액의 계면으로부터 세포를 수집하여, PBS로 세척하고 1 mL의 Ortho PermeaFix (등록상표)로 40분 동안 실온에서 처리하였다. 이어서 세포를 DNase-비존재 RNase (시그마사)와 함께 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하고 PI로 15분 동안 염색하였다. 2×10⁴세포의 DNA 함량을 유동 세포계를 사용하여 모니터하였다.

SCF 또는 SCF와 본 발명의 화합물에 노출시킨 10주 배양된 세포 (2×10⁶)를 100 ㎕의 저장성 용해 완충액 [10 mM Tris (pH 7.5), 10 mM EDTA, pH 8.0, 0.5% Triton X-100] 내에서 얼음 상에서 10분 동안 용해시켰다. 14,000 g에서 10분 동안 원심분리시킨 후, 상청액을 새로운 튜브에 옮겨담고, 0.2 mg/mL RNase A (시그마사) 및 0.2 mg/mL Proteinase K (시그마사)로 처리하였다. DNA를 120 ㎕ 이소프로판올 및 20 ㎕ 5 M NaCl을 사용하여 -20℃에서 밤새 침전시켰다. 14,000 g에서 원심분리한 후, 펠렛을 건조시키고, 20 ㎕ Tris-EDTA에 용해시킨 다음, 샘플을 2% 아가로즈에서 겔 전기영동과 에티듐 브로마이드 염색에 의해 분석하였다.

히스타민, 트립타제 및 사이토카인 수준의 분석

0.5% Nonidet P-40으로 배양된 세포를 처리하여 얻은 세포 용해물 및 상등액 중의 히스타민 농도는 히스타민 방사성면역분석 (RIA) 키트 (이뮤노테크사 (Immunotech))에 의해 문헌[Kinoshita 등, Blood, Vol. 94, pp. 496-508 (1999)]에기재된 바와 같이 측정하였다.

통계학적 분석

모든 실험은 적어도 3회 수행해야 한다. 2가지 독립적인 군들 사이의 차이의 유의성을 측정하기 위해, 언페어드 (unpaired) t-테스트 또는 데이타가 정규 분포되지 않은 경우 Mann Whitney-U 테스트를 이용할 수 있다.

N-{5-[4-(4-메틸-피페라지노-메틸)-벤조일아미도]-2-메틸-페닐}-4-(3-피리딜)-2-피리미딘-아민 모노메실레이트 (STI571B)에 대해 얻어진 결과

SCF를 갖는 배양물에 STI571B를 10^-6M 또는 그 이상으로 첨가하면 자손 생성을 거의 완전히 억제하였다.

SCF + STI571B에서, 생활 세포의 수는 제2일에는 변화가 없지만 그후 시간 의존 방식으로 급감하였다. 제14일에 총세포수는 무시가능한 수준에 도달하였다. 10주 배양된 비만세포에 의해 얻어진 결과와 일관되게, STI571B는 10^-6M에서 SCF를 사용한 자극 하에 CD34⁺세포에 의한 세포 생산을 현저하게 저하시켰다. 더욱이, STI571B는 SCF를 사용한 자극 하에 성장시킨 배양된 비만세포의 프로그래밍된 (programmed) 사멸을 유발시켰다. 이배체 미만 (sub-diploid) 핵의 비율은 배양 기간에 따라 증가하였다. 이러한 관찰은 겔 전기영동 상에서 SCF + STI571B에 노출시킨 세포에서 DNA 래더링 (laddering)에 의해 확인할 수 있다. STI571B는 초기상의 비만세포 발달뿐만 아니라 후기 발현 (late-appearing) 비만세포의 성장에서 그의 억제 효과를 발휘한다.

얻어진 결과는 본 발명의 화합물, 예를 들어, STI571B에 의한 SCF-의존성 인간 비만세포 성장의 억제를 증명한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 상기 언급한 질병의 치료를 위해 사용될 수 있는 것으로 보인다.

파트 B: 비만세포증

실시예 2: 방법

시약: 노바티스 파마 (Novartis Pharma; Basel, Switzerland)에서 실험에 사용하기 위한 염 I을 제공하였다. 억제제의 신선한 10 mM 원액은 각 실험 전에 화합물을 1 mL 인산염 완충 염수 (PBS; Gibco-BRL)에 용해시켜 제조하였다.

항체: 폴리클로날 토끼 항-KIT 항체 (c-kit Ab-1)는 1:500 희석액으로 사용하였다 (c-kit Ab-1; Oncogene, Cambridge, MA). 항-포스포타이로신 항체 (PY20)는 1:1000 희석액으로 사용하였다 (PY20 Transduction Laboratories; Lexington, KY). 페록시다제 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 항체는 1:5000 희석액으로 사용하고 염소 항-토끼 항체는 1:10,000 희석액으로 사용하였다 (Pierce; Rockford, IL).

세포주: BR 및 C2 개과 비만세포종 세포주는 닥터 조지 코헤이 (Dr. George Caughey; University of California at San Francisco, San Francisco, CA)로부터 입수하였다. 두 세포주를 모두 2% 우 태아 혈청, 1 mM L-글루타민, 12.5 mM HEPES (pH 7.5), 0.25 mg/ml 히스티딘, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% 펑기존을 보충시킨 DMEM 중에 유지하였다. BR 및 C2 세포는 개과 비만세포 종양으로부터 유래되었으며, 면역결핍 마우스에서 초회 통과 후 장기간 배양으로 처음부터 확립시켰다 (DeVinney R 등, Am J Respir Cell Mol Biol 1990; 3(5): 413-420; Lazarus SC 등,Am J Physiol 1986; 251 (6 Pt 1): C935-C944). BR 세포주는 아미노산 575 (적스타멤브레인 도메인)에서 류신에서 프롤린 치환을 일으키는 점 돌연변이 (T1752C)를 가졌다. C2 세포주는 KIT 적스타멤브레인 구역의 내부 탠덤 (tandem) 복제 (ITD)를 가졌다. 상기 ITD를 번역하면 엑손 11의 3' 단부에서 아미노산 잔기의 재복제를 일으킨다 (London 등, Exp. Hemato. Vol. 27, No. 4, pp. 689-697 (1999); Ma 등, J. Invest. Dermatol., Vol. 112, No. 2, pp. 165-170 (1999)).

증식 분석: 세포를 96-웰 플레이트에 규정 배양 배지 중에 40,000 세포/웰의 밀도로 염 I의 농도를 변화시키며 첨가하였다. 증식은 XTT계 분석 (로세 몰레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals); Indianapolis, IN)을 이용하여 48-72 시간에서 측정하였다 (Heinrich 등, Blood, Vol. 96, No. 3, pp. 925-932 (2000)).

단백질 용해물: BR 및 C2 세포를 PBS 중에 2회 세척한 다음 Optimem (Gibco-BRL) 중에 37℃에서 약 18시간 동안 정지시켰다. 이어서 세포를 다양한 농도의 염 I의 존재 하에 90분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션시킨 후, 세포를 펠렛화시키고 100-250 ㎕의 단백질 용해 완충액 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.25% 데옥시콜레이트; 억제제 아프로티닌, 류펩틴, 펩스타틴, PMSF 및 나트륨 오르토바나데이트 [시그마사]를 첨가)을 사용하여 용해시켰다. 웨스턴 면역블롯 분석은 이미 기재된 바와 같이 수행하였다 (Hoatlin 등, Blood, Vol. 91, No. 4, pp. 1418-1425 (1998); Heinrich 등, Blood, Vol. 96, No. 3, pp. 925-932 (2000)).

실시예 3: 화합물 I은 개과 비만세포 종양과 연관된 구성적으로 활성화된 KIT 키나제를 억제한다

뮤턴트형의 개과 KIT의 키나제 활성을 억제시키는 화합물 I의 효능을 시험하기 위해, 2가지 상이한 구성적으로 활성화된 KIT 이소폼을 발현하는 2가지 세포주 (BR 및 C2)를 사용하였다. 이들 세포주에서 KIT 돌연변이는 둘 모두 적스타멤브레인 도메인에 위치하고 인간 위장관 기질 종양 (GISTs)에서 보이는 돌연변이에 상동성이다 (Lux 등, Am. J. Pathol., Vol. 156, No. 3, pp. 791-795 (2000); Rubin 등, Cancer Res., Vol. 61, No. 22, pp. 8118-8121 (2001)). BR 또는 C2 세포로부터 제조된 용해물을 항-P-Tyr 항체로 프로빙하고, 자동인산화를 측정함으로써 KIT 수용체 활성화를 평가하였다. 이미 보고된 바와 같이, 이들 세포에서 KIT 자동인산화는 SLF의 부재 하에 관찰되었다 (Ma 등, J. Invest. Dermatol., Vol. 112, No. 2, pp. 165-170 (1999); Ma 등, J. Invest. Dermatol., Vol. 114, No. 2, pp. 392-394 (2000)). 화합물 I에 의한 KIT 자동인산화의 억제는 용량 의존적이었으며, 10 및 1.0 μM 용량을 사용하여 완전 억제가 관찰되었다. 0.1 μM의 용량을 사용하여 거의 완전 억제가 보였다. c-kit의 제한된 자동인산화는 0.001-0.01 μM 용량의 화합물 I을 사용하여 보였다. 따라서, 화합물 I은 이들 세포에서 돌연변이된 c-kit 수용체의 자동인산화를 억제할 뿐만 아니라, 야생형 c-kit 수용체 (IC₅₀100-200 nM)보다 상기 돌연변이된 수용체의 더 강력한 억제제이다 (Heinrich 등, Blood, Vol. 96, No. 3, pp. 925-932 (2000)). 화합물 I이 KIT 단백질의 발현을 조절하였는지 결정하기 위해, 멤브레인을 벗겨내어 항-c-kit 항체로 재프로빙하였다. 화합물 I 처리 세포에서 c-kit 단백질의 발현은 변하지 않았다. 따라서, 화합물 I은 KIT 단백질의 발현을 하향 조절함에 의해서라기보다는 KIT 키나제 활성을 억제함으로써 뮤턴트 개과 KIT 폴리펩티드의 자동인산화를 감소시킨다.

실시예 4: 화합물 I은 개과 비만세포 종양의 세포주의 증식을 억제시킨다.

뮤턴트 c-kit 수용체의 키나제 활성을 억제하는 생물학적 효과를 시험하기 위해, BR 또는 C2 세포를 다양한 농도의 화합물 I의 존재 하에 48-72 시간 동안 배양하였다. 0.1-10 μM의 억제제 농도에서, 증식은 배지만으로 처리된 세포에 비해 90-95% 감소하였다. 0.001-0.01 μM 화합물 I의 용량에서 증식의 부분 억제가 보였다. 0.01-10 μM 억제제의 용량에서 보인 증식의 감소는 통계학적으로 유의하였다 (p<0.001). 따라서, 화합물 I은 BR 및 C2 세포의 증식을 수용체 자동인산화의 억제에 대해 관찰된 바와 동일한 용량 반응 범위로 억제하였다. 억제제 처리 세포의 형태학적 관찰에서 아폽토시스와 일치하는 변화를 밝혀냈다 (데이타는 제시하지 않음).

BR 세포

	평균	%	SD	%SD
세포	0.929	100%	0.030447	3%
5 μM	0.083	9%	0.001732	0%
1 μM	0.105	11%	0.002	0%
.1 μM	0.105	11%	0.002082	0%
.01 μM	0.479	52%	0.043016	5%
.001 μM	0.781	84%	0.033081	4%

C2 세포

	평균	%	SD	%SD
세포	1.236	100%	0.04417	4%
5 μM	0.032	3%	0.005686	0%
1 μM	0.037	3%	0.013868	1%
.1 μM	0.028	2%	0.003512	0%
.01 μM	0.754	61%	0.185236	15%
.001 μM	1.065	86%	0.055245	4%

표 1 및 표 2: BR 또는 C2 세포를 96-웰 플레이트에 40,000 세포/웰의 농도로 플레이팅하고 규정 성장 배지 중에서 화합물 I의 농도를 변화시키며 배양하였다. 세포 증식은 XTT계 분석계를 이용하여 72시간에서 측정하였다. 각 화합물 I 농도를 3회 분석하였다. 결과를 최대 증식의 퍼센트 (세포만, 화합물 I 없이)±1 표준 편차로서 표시하였다. 6회의 독립 실험 중 하나로부터의 대표적인 결과를 나타냈다.

애완동물 및 인간용 조성물

실시예 5: 4-[(4-메틸-1-피페라진-1-일메틸)-N-[4-메틸-3-[[4-(3-피리디닐)-2-피리미디닐]아미노]페닐]벤즈아미드 메탄술포네이트, β-결정형을 갖는 캡슐제

활성 물질로서 10.0 mg의 화합물 I (유리 염기)에 상응하는 11.95 mg의 표제 화합물 (= 염 I)을 함유하는 캡슐제를 다음 조성으로 제조하였다:

조성

염 I 11.95 mg

셀룰로즈 MK GR 9.2 mg

크로스포비돈 XL 1.5 mg

에어로실(Aerosil) 200 0.2 mg

마그네슘 스테아레이트 0.15 mg

23.0 mg

캡슐제는 성분들을 혼합하고 혼합물을 경질 젤라틴 캡슐, 사이즈 1에 충전시킴으로써 제조하였다.

실시예 6: 4-[(4-메틸-1-피페라진-1-일메틸)-N-[4-메틸-3-[[4-(3-피리디닐)-2-피리미디닐]아미노]페닐]벤즈아미드 메탄술포네이트, β-결정형을 갖는 캡슐제

활성 물질로서 10.0 mg의 표제 화합물 (= 염 I)을 함유하는 캡슐제를 다음 조성으로 제조하였다:

조성

활성 물질 10.0 mg

아비셀(Avicel) 20.0 mg

PVPPXL 1.5 mg

에어로실 0.2 mg

마그네슘 스테아레이트 0.15 mg

31.85 mg

실시예 7: 4-[(4-메틸-1-피페라진-1-일메틸)-N-[4-메틸-3-[[(4-(3-피리디닐)-2-피리미디닐]아미노]페닐]벤즈아미드 메탄술포네이트, β-결정형을 갖는 캡슐제

활성 물질로서 100 mg의 화합물 I (유리 염기)에 상응하는 119.5 mg의 표제 화합물 (= 화합물 I 메실레이트)을 함유하는 캡슐제를 다음 조성으로 제조하였다:

조성

화합물 I 메실레이트 119.5 mg

셀룰로즈 MK GR 92 mg

크로스포비돈 XL 15 mg

에어로실 200 2 mg

마그네슘 스테아레이트 1.5 mg

230 mg

실시예 8: 측정가능한 피부 비만세포 종양이 있는 애완견의 예상되는 케이스 시리즈의 예

연구 환자는 측정가능하고 조직학적으로 확정된 비만세포 종양을 가진 애완견이었다. 케이스는 생체검사가 가능한 측정가능한 병변을 갖는 애완견에 제한된다.

자격 기준:

- 조직학적으로 확정된 측정가능한 피부 비만세포 종양

- 케이스는 치료 전과 치료 동안 2 mM Keyes 펀치를 사용하는 연속 생체검사를 필요로 할 것이다

- 조직학적 등급 (II-중급 또는 III-거의 분화되지 않음)

- 수행 (Performance) 상태 0 또는 1 (Modified Karnofsky - 표 3)

- 고지에 의한 동의

배제 기준:

- 동시 세포독성 화학요법

- 프레드니존 및 비스테로이드성 소염제는 연구의 30일 이내에 개시되지 않을 수 있으며; 프레드니존 또는 비스테로이드성 소염제가 30일 초과하여 투여되었으면 계속할 수 있다.

- 비정상적 혈청 담즙산 시험 (간 기능).

수행 상태 (Modified Karnofsky)

등급	정의
0	정상 활동
1	제한된 활동; 질병전 상태로부터 감소된 활동
2	손상됨; 생명유지 활동을 위해서만 보행; 허용가능한 영역에서 일관되게 배변 및 배뇨
3	무력해짐; 강제 급식해야 함; 배뇨와 배변을 허용가능한 영역에 한정할 수 없음
4	사망

모든 케이스의 치료전 평가는 신체 검사, 완전 혈구수, 백혈구연층(buffy coat), 혈청 생화학, 뇨분석, 혈청 담즙산 (공복시 및 식후), 구역적 림프절 크기의 문서화, 복부 방사선사진 및 복부 초음파를 포함하였다. 치료법은 25 mg/kg PO QD×60일의 염 I이었다.

치료는 질병 진행이 감지되지 않으면 모든 케이스에서 60일 동안 계속하였다. 부분 반응 또는 완전 반응을 경험하는 케이스에서, 추가의 60일의 진행 치료를 고려할 수 있다. 성공적으로 치료를 완수한 케이스는 연구에 반복 참여하기에 적격이다.

치료 및 임상 평가 계획

활동	0일	7일	14일	28일	14일마다
임상 병기(staging)¹	X			X	X
신체 검사	X	X	X	X	X
종양의 양 측정²	X	X	X	X	X
염 I 25 mg/kg QD 시작	X
약물운동학³	X
절개 생체검사⁴	X			X
반복 병기				X
¹초기 병기는 신체 검사, CBC, 백혈구연층, 혈청 생화학, 간 기능 시험 (혈청 담즙산), 뇨검사, 복부 방사선사진 및 복부 초음파로 이루어진다. 재평가는 신체 검사와 종양의 양 자체만의 측정 또는 반복 임상 병기로 이루어질 수 있다.
²종양의 양은 0, 7, 14 및 28일에, 이어서 매 14일마다 측정한다. 치료 반응은 측정가능한 피부 병변(들) 및 병기 (CR, PR, SD, PD- 아래 정의함)으로 확인되는 다른 병변에 대해 정의될 것이다.
³처음 5 도입 케이스로부터의 혈장 수집은 1회 투여량의 염 I 이후 0, 0.5, 1, 2, 5, 8, 12, 16 및 24시간에서 채취한다.
⁴정의된 측정가능한 병변(들)로부터의 절개 생체검사는 모든 케이스로부터 0 및 28일에 수집될 것이다. 추가의 생체검사는 PR의 시점 및 객관적 CR 이후에 수집된다.

화합물 I의 효능은 임상 종료점을 이용하여 측정가능한 피부 비만세포 종양에 대해 평가하였다. 생물학적 종료점은 피부 종양으로부터 및 치료 과정 내내 이용가능한 혈액 샘플로부터 수집한 연속 생체검사물에서 취할 수 있다.

임상 종료점은 측정가능한 종양의 반응 속도, 측정가능한 종양에 대한 객관적인 반응 및 측정가능한 종양의 진행에 대한 시간을 포함한다. 모든 불리한 부작용이 기록될 것이다.

"객관적 종양 반응"은 아래에 정의한 바와 같이 화합물 I을 사용하는 치료 하에 관찰하며 치료법의 효능을 가르킨다.

특히, 화합물 I을 사용하는 치료에 대한 완전 반응 (CR) 및 부분 반응 (PR)을 관찰할 수 있다. 더욱이, 보다 많은 수의 치료를 받은 동물이 안정성 질환 (SD)을 보인 한편, 보다 적은 수의 처리 동물이 진행성 질환 (PD)을 보이는 것이 관찰될 수 있다. 또한, 보다 적은 수의 치료를 받은 동물이 비처리 동물에 비해 질병의 재발 (R)을 보이는 것이 관찰될 수 있다. 진행에 대한 시간 (TTP), 완화 지속기간 및 생존은 화합물 I을 사용하는 치료 하의 동물에서 증가할 수 있다.

"CR"은 암의 모든 임상 증거 및 암과 관련된 임의의 징후의 소멸로서 정의된다.

"PR"은 임의의 병변의 크기 증가나 임의의 새로운 병변의 발현 없이, 대표적인 병변에 대한 측정치의 총합의 50% 이상의 감소로서 정의된다.

"SD"는 무반응 또는 임의의 새로운 병변의 발현이나 임상 징후의 악화 없이 부분 반응 또는 진행성 질병에 대해 정의된 것보다 작은 반응으로서 정의된다.

"PD"는 임의의 측정가능한 병변의 크기에서 50% 이상의 명백한 증가 또는 새로운 병변의 발현으로서 정의된다.

"R"은 CR을 가진 개에서 새로운 병변의 발현 또는 기존 병변의 재발현으로서 정의되며; PR만을 가진 개에서, R은 최대 반응 시간에서 얻은 측정치와 비교하여 대표적인 병변의 측정치의 총합의 50% 이상의 증가로서 정의되었다.

"TTP"는 프로토콜의 제0일로부터 보고된다. TTP는 치료 개시일 (제0일)로부터 R일까지의 일수로서 정의될 것이다.

"완화 지속기간"은 객관적인 반응일 (PR 또는 CR)로부터 R일까지의 일수로서 정의된다.

"생존"은 화합물 I을 사용한 치료의 시작부터 죽음까지의 일수로서 정의된다. 사망 원인을 적을 것이지만 질병의 진전, 독성 등을 포함할 수 있다.

얻어진 결과는 본 발명의 화합물, 예를 들어 STI571B에 의한 비만세포 신생물의 억제를 증명한다.

라디칼 R₄, R₅, R₆, R₇및 R₈중의 하나 또는 둘은 각각 니트로 또는 화학식 II의 라디칼이고, R₉는 수소 또는 저급 알킬이고, X는 옥소, 티오, 이미노, N-저급 알킬-이미노, 히드록스이미노 또는 O-저급 알킬-히드록스이미노이고, Y는 산소 또는 기 NH이고, n은 0 또는 1이고, R₁₀은 탄소수 5 이상의 지방족 라디칼, 또는 방향족, 방향족-지방족, 지환족, 지환족-지방족, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클릭-지방족 라디칼이고,

나머지 라디칼 R₄, R₅, R₆, R₇및 R₈은 각각 서로 독립적으로 수소, 유리 또는 알킬화 아미노, 피페라지닐, 피페리디닐, 피롤리디닐 또는 모르폴리닐에 의해 치환 또는 비치환된 저급 알킬, 또는 저급 알카노일, 트리플루오로메틸, 유리, 에테르화 또는 에스테르화 히드록시, 유리, 알킬화 또는 아실화 아미노 또는 유리 또는 에스테르화 카르복시이고,

나머지 치환체는 상기한 바와 같은 본 발명의 화합물이 바람직하다.

R₁은 각각 탄소 원자에 결합된 피리딜 또는 N-옥시도-피리딜이고,

R₂및 R₃은 각각 수소이고,

R₄는 수소 또는 저급 알킬이고,

R₅는 수소, 저급 알킬 또는 트리플루오로메틸이고,

R₆은 수소이고,

R₇은 니트로, 플루오로-치환 저급 알콕시 또는 화학식 II의 라디칼이고, R₉는 수소이고, X는 옥소이고, n은 0이고, R₁₀은 탄소 원자에 결합된 피리딜, 또는 할로겐, 시아노, 저급 알콕시, 카르복시, 저급 알킬에 의해 또는 4-메틸-피페라지닐-메틸에 의해 치환되거나 비치환된 페닐, 또는 C₅-C₇알킬, 티에닐, 2-나프닐 또는 시클로헥실이고,

R₈은 수소인 본 발명의 화합물이 특히 바람직하다.

라디칼 R₄및 R₈중 적어도 하나가 저급 알킬이고, 나머지 치환체가 상기한 바와 같은 본 발명의 화합물이 특히 바람직하다.

상기 모든 화합물 중에서,

R₁은 탄소 원자에 결합된 피리딜이고,

R₂, R₃, R₅, R₆및 R₈는 각각 수소이며,

R₄는 저급 알킬이며,

R₇은 화학식 II의 라디칼이고, R₉는 수소이고, X는 옥소이고, n은 0이고, R₁₀은 4-메틸-피페라지닐-메틸인 본 발명의 화합물이 바람직하다.

상기 모든 화합물 중에서, CGP 57148B {N-{5-[4-(4-메틸-피페라지노-메틸)-벤조일아미도]-2-메틸페닐}-4-(3-피리딜)-2-피리미딘-아민 모노메실레이트}인 화학식 I의 본 발명의 화합물이 특히 바람직하다.

매우 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 그의 모노메실레이트 염 형태로 사용된다.

본 발명의 한 바람직한 실시태양에서, 치료되는 질병은 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 약물 알레르기 및 음식 알레르기 중에서 선택된다. 본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 치료되는 질병은 다발성 경화증이다. 본 발명의 추가의 실시태양에서, 치료되는 질병은 혈관부종, 두드러기, 유아 돌연사 증후군 및 기관지 폐 아스페르길루스증 중에서 선택된다. 또한, 본 발명의 화합물은 전신 비만세포증, 특히 비만세포종의 치료를 위해 사용될 수 있다. 비만세포종은 특히 개에 있어서 광범한 전이가 있는 악성 질병이다. 따라서, 본 발명의 화합물은 개과 비만세포 신생물을 치료하기 위한 의약의 제조에 특히 유용하다.

본 발명의 화합물은 최종 생성물, 제약 제제 및 청구항이 본원에 참고로 포함되는 유럽 특허 출원 공개 제EP 0 564 409 A1호와 국제 특허 출원 제WO 99/03854호, 특히 화합물 청구항과 실시예의 최종 생성물에 총체적이고 구체적으로 개시되어 있다. 상기 특허 출원에 개시된 대응하는 입체이성질체와 대응하는 동질이상체 (polymorphs), 예를 들어 결정 변형도 마찬가지로 포함된다.

유럽 특허 출원 공개 제EP 0 564 409 A1호에서, 본 발명의 화합물은 암, 혈전증, 건선, 섬유증, 공피증 및 죽상동맥경화증의 치료에 유용한 것으로 기술되어 있다. 본 발명에 따라, 본 발명의 화합물이 놀랍게도 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 약물 알레르기 또는 음식 알레르기, 혈관부종, 두드러기, 유아 돌연사 증후군, 기관지 폐 아스페르길루스증, 다발성 경화증 및 또한 비만세포증, 특히 개과 비만세포 신생물에 유익한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 특별한 발견에 따라, 본 발명에서는 또한 치료 유효량의 본 발명의 화합물을 본원에 언급한 질병 중 하나에 걸린 온혈 동물, 바람직하게는 인간 또는 개, 더욱 바람직하게는 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함하는 온혈 동물의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 제약상 유효량의 본 발명의 화합물 또는 제약상 허용되는 그의 염을 개에게 1일 1회, 바람직하게는 1, 2 또는 심지어 3개월을 초과하는 기간 동안 투여하는 것을 포함하는, 개과 비만세포 신생물을 갖는 개에게 본 발명의 화합물 또는 제약상 허용되는 그의 염을 투여하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 1일 투여량 약 20-200 mg, 바람직하게는 80-160 mg, 특히 125 mg의 화학식 I의 화합물의 염을 투여하는 상기 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명은 화학식 I의 4-(4-메틸피페라진-1-일메틸)-N-[4-메틸-3-(4-피리딘-3-일)피리미딘-2-일아미노)페닐]-벤즈아미드의 모노메탄술포네이트염의 1일 투여량을 개에 투여하는 용도 또는 방법에 관한 것이며, 상기 1일 투여량은 0.2 μM 이상의 혈장 수준을 유지하기에 충분한 양의 상기 모노메탄술포네이트 염을 포함한다.

또한 본원에 사용되는 용어 "치료 방법"은 특히 본원에 언급된 질병의 예방 방법, 즉, 본원에 언급된 질병의 발병을 예방하기 위해 건강한 환자에 대한 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물의 예방적 투여에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 화합물을 포함하는 본원에 언급된 적어도 하나의 질병 치료용 제약 조성물에 관한 것이다. 본원에 언급된 적어도 하나의 질병 치료용 제약 조성물은 유효량의 본 발명의 화합물을 외용, 장 투여, 예를 들어 경구 또는 직장 투여 또는 비경구 투여에 적합하고 무기 또는 유기의 고체 또는 액체일 수 있는 제약상 허용되는 담체와 함께 포함한다. 경구 투여를 위해, 특히 본 발명의 화합물을 희석제 및(또는) 윤활제, 예를 들어, 규산, 탈크, 스테아르산 또는 그의 염 및(또는) 폴리에틸렌 글리콜과 함께 포함하는 정제 또는 젤라틴 캡슐제 뿐만 아니라, 로션제, 겔제 또는 크림제가 사용된다. 정제는 결합제, 전분, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈 및(또는) 폴리비닐피롤리돈, 붕해제 및(또는) 비등 혼합물 또는 흡착제, 염료, 조미제 및 감미제를 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 비경구 투여가능한 조성물 또는 주입 용액 형태로 사용할 수 있다. 외용 투여는 예를 들어 피부에 대한 투여이다. 외용 투여의 추가의 형태는 예를 들어 봄철 결막염의 치료를 위한 눈에 대한 투여이다. 제약 조성물은 멸균처리될 수 있고(있거나) 부형제, 예를 들어, 방부제, 안정화제, 습윤제 및(또는) 유화제, 가용화제, 삼투압 조절용 염 및(또는) 완충제를 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 공지의 방식으로, 예를 들어 통상적인 혼합, 제립, 당제 (confectioning), 용해 또는 동결건조 공정에 의해 제조되며, 약 1 내지 100%, 특히 약 1% 내지 약 20%의 활성 성분(들)을 포함한다.

본 발명의 화합물은 예를 들어 WO 99/03854의 실시예 4 및 6에 개시된 바와 같이 제형화될 수 있다.

사용되는 본 발명의 화합물의 용량 범위는 온혈 동물의 종, 체중 및 나이, 투여 방식, 사용되는 특정 물질 및 치료할 질병을 포함하여 당업계의 숙련인에게 알려져 있는 요인들에 따른다. 본원에서 달리 언급하지 않으면, 본 발명의 화합물은 1일 1 내지 4회 또는 알레르기성 반응이 관찰될 때 즉시 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 화합물, 특히 N-{5-[4-(4-메틸-피페라지노-메틸)-벤조일아미도]-2-메틸페닐}-4-(3-피리딜)-2-피리미딘-아민 (STI571B)은 온혈 동물, 특히 인간에게 약 10-750 mg/day, 바람직하게는 30-600 mg/day, 더욱 바람직하게는 30-300 mg/day 범위의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

개에 있어서 종, 나이, 개별적인 상태, 투여 방식 및 의심되는 임상 상황에 따라, 유효 투여량, 예를 들어, 약 20-200 mg, 바람직하게는 80-160 mg, 특히 125 mg의 1일 투여량이 약 5 kg 체중의 온혈 동물에게 투여된다. 절제불능 및(또는) 전이성 악성 개과 비만세포 신생물을 가진 약 5 kg의 성견에 대해, 매일 125 mg의 출발 투여량이 추천될 수 있다. 매일 125 mg의 치료에 대한 반응의 평가후에 부적절한 반응이 있는 개에 대해서는, 투여량의 단계적 상승이 안전하게 고려될 수 있으며, 치료가 유익하고 제한 독성이 없는 한 개를 치료할 수 있다.

용량은 0.2 μM 이상, 바람직하게는 0.5 μM 이상, 더욱 바람직하게는 1 μM 이상의 혈장 수준을 달성하도록 적정될 수 있다. 약 1 μM의 혈장 수준을 달성 및(또는) 유지하는 것이 특히 바람직하다.

Claims

알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 약물 알레르기 또는 음식 알레르기, 혈관부종, 두드러기, 유아 돌연사 증후군, 기관지 폐 아스페르길루스증, 비만세포증 또는 다발성 경화증 치료용 의약의 제조를 위한 하기 화학식 I의 N-페닐-2-피리미딘-아민 유도체 또는 하나 이상의 염 형성기를 갖는 상기 화합물의 염의 용도.

<화학식 I>

상기 식에서,

R₁은 4-피라지닐; 1-메틸-1H-피롤릴; 아미노- 또는 아미노-저급 알킬 치환 페닐 (여기서 각각의 경우에 아미노기는 유리, 알킬화 또는 아실화됨); 5원 고리 탄소 원자에 결합된 1H-인돌릴 또는 1H-이미다졸릴; 또는 고리 탄소 원자에 결합되고 비치환되거나 질소 원자에서 산소로 치환된 비치환 또는 저급 알킬 치환 피리딜이고,

R₂및 R₃은 각각 서로 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이고,

라디칼 R₄, R₅, R₆, R₇및 R₈중의 하나 또는 둘은 각각 니트로, 플루오로 치환된 저급 알콕시 또는 하기 화학식 II의 라디칼이고,

<화학식 II>

-N(R₉)-C(=X)-(Y)_n-R₁₀

R₉는 수소 또는 저급 알킬이고,

X는 옥소, 티오, 이미노, N-저급 알킬-이미노, 히드록스이미노 또는 O-저급 알킬-히드록스이미노이고,

Y는 산소 또는 기 NH이고,

n은 0 또는 1이고,

R₁₀은 탄소수 5 이상의 지방족 라디칼, 또는 방향족, 방향족-지방족, 지환족, 지환족-지방족, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클릭-지방족 라디칼이고,

나머지 라디칼 R₄, R₅, R₆, R₇및 R₈은 각각 서로 독립적으로 수소, 유리 또는 알킬화 아미노, 피페라지닐, 피페리디닐, 피롤리디닐 또는 모르폴리닐에 의해 치환되거나 비치환된 저급 알킬, 또는 저급 알카노일, 트리플루오로메틸, 유리, 에테르화 또는 에스테르화 히드록시, 유리, 알킬화 또는 아실화 아미노 또는 유리 또는 에스테르화 카르복시이다.
제1항에 있어서,

라디칼 R₄, R₅, R₆, R₇및 R₈중의 하나 또는 둘은 각각 니트로 또는 화학식II의 라디칼이고,

R₉는 수소 또는 저급 알킬이고,

X는 옥소, 티오, 이미노, N-저급 알킬-이미노, 히드록스이미노 또는 O-저급 알킬-히드록스이미노이고,

Y는 산소 또는 기 NH이고,

n은 0 또는 1이고,

R₁₀은 탄소수 5 이상의 지방족 라디칼, 또는 방향족, 방향족-지방족, 지환족, 지환족-지방족, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클릭-지방족 라디칼이고,

나머지 라디칼 R₄, R₅, R₆, R₇및 R₈은 각각 서로 독립적으로 수소, 유리 또는 알킬화 아미노, 피페라지닐, 피페리디닐, 피롤리디닐 또는 모르폴리닐에 의해 치환되거나 비치환된 저급 알킬, 또는 저급 알카노일, 트리플루오로메틸, 유리, 에테르화 또는 에스테르화 히드록시, 유리, 알킬화 또는 아실화 아미노 또는 유리 또는 에스테르화 카르복시이고,

나머지 치환체는 제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 하나 이상의 염 형성기를 갖는 상기 화합물의 제야상 허용되는 염의 용도.
제1항에 있어서,

R₁은 탄소 원자에 결합된 피리딜이고,

R₂, R₃, R₅, R₆및 R₈는 각각 수소이며,

R₄는 저급 알킬이며,

R₇은 화학식 II의 라디칼이고,

R₉는 수소이고,

X는 옥소이고,

n은 0이고,

R₁₀은 4-메틸-피페라지닐-메틸인 화학식 I의 화합물 또는 제약상 허용되는 그의 염의 용도.
제1항에 있어서, N-{5-[4-(4-메틸-피페라지노-메틸)-벤조일아미도]-2-메틸페닐}-4-(3-피리딜)-2-피리미딘-아민인 화학식 I의 화합물 또는 제약상 허용되는 그의 염의 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 모노메실레이트염 형태로 사용되는 것인 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 개과 비만세포 신생물 치료용 의약의 제조를 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 약물 알레르기 또는 음식 알레르기, 혈관부종, 두드러기, 유아 돌연사 증후군, 기관지 폐 아스페르길루스증, 비만세포증 또는 다발성 경화증을 앓고 있는 온혈동물에게 상기 질병의 하나 이상에 대한 치료 유효량의 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 정의된, 제약상 허용되는 염 형태로 존재할 수도 있는 화학식 I의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 온혈 동물의 치료 방법.
개과 비만세포 신생물의 치료를 요하는 개에게 개과 비만세포 신생물에 효과적인 투여량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 개과 비만세포 신생물로 고통받는 개의 치료 방법.
제8항 또는 제6항에 있어서, 1일 투여량 20-200 mg의 4-(4-메틸피페라진-1-일메틸)-N-[4-메틸-3-(4-피리딘-3-일)피리미딘-2-일아미노)페닐]벤즈아미드 또는 제약상 허용되는 그의 염을 성견에게 투여하는 것인 방법 또는 용도.
제1항 또는 제7항에 있어서, 1일 투여량 30-400 mg의 4-(4-메틸피페라진-1-일메틸)-N-[4-메틸-3-(4-피리딘-3-일)피리미딘-2-일아미노)페닐]-벤즈아미드 또는 제약상 허용되는 그의 염을 인간에게 투여하는 용도 또는 방법.