KR20030096158A - 단백질 침전물 현탁액 - Google Patents

Abstract

폴리아크릴아미드류, 감자전분 또는 변성 셀룰로오즈와 같은 음이온성 폴리머들을 사용하여 가용성 및 불용성 성분들을 포함하는 단백질 현탁액을 응집체의 형태를 거쳐 정제한다. 이러한 방법은 고체/액체 분리의 효율을 개선하고 대규모의 생물공학적 공정들에서 원심분리 및/또는 여과의 필요성을 최소화하거나 또는 제거할 수 있다.

Description

단백질 침전물 현탁액{PROTEIN PRECIPITATE SUSPENSIONS}

본 발명은 일반적으로 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 단백질들의 정제에 관한 것이다. 보다 특이적으로는, 가용성 및 불용성 성분들을 포함하는 단백질 현탁액들을 음이온성 폴리머들을 사용하여 응집체 형태를 거쳐 청징화시키는 것에 관한 것이다.

응집제의 사용은 생물공학 산업을 포함하여, 몇몇 산업적 환경에서 개시되어왔다. 예로서, 미국특허 제 5,047,511호에서는 가용성의 고분자량 불순물 단백질들을 포함하는 단백질 용액으로부터의 재조합 소마토트로핀 단백질의 회수에서 양이온성 응집제의 사용을 개시하고 있다.

성장 호르몬으로도 알려진 소마토트로핀들은 뇌하수체 세포들에 의해 생산 및 분비되는 폴리펩타이드들이다. 이 단백질들은 고기용 소 및 돼지의 성숙 전 골격성장 및 고기 생성을 촉진하는데 효과적인 것으로 알려져 있다. 또한, 이들은 유즙촉진, 먹이를 고기 또는 우유로 전환시키는 효율의 개선, 지방-결집(lipid-mobilizing) 효과 등을 포함한 다양한 대사과정들에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

재조합 DNA 기술은 박테리아 숙주세포들에서 목적하는 이종(heterologous) 단백질들의 대규모 생산 수단을 제공한다. 성장 호르몬인 소마토트로핀의 경우, 이 단백질은 숙주세포들의 세포질 내에 존재하는 봉입체들 내로 격리되어진다. 봉입체들이 유리되도록 세포들을 파괴시킨 후, 분획 원심분리에 의해 고체 펠렛으로서 봉입체들을 수집하여 봉입체들을 숙주세포 배양체로부터 회수할 수 있다. 상기 봉입체들은 알카리 pH에서 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드와 같은 적절한 카오트로픽(chaotropic) 물질의 수용액 내에 용해되고, 이어서 온화한 정도의 산화제와 반응하므로써 분자내 디설파이드 결합을 형성하고, 단백질은 이의 생물학적 활성형인 천연구조로 다시 리폴딩(refolding)되어 재생된다(naturized).E. coli에 의해 생산된 소마토트로핀 단백질의 가용화 및 재생 방법은 미국특허 제 4,511,502호 및 미국특허 제 4,652,630호에 설명되어 있으며, 이들은 각각 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

재생 단계(예로서 미국특허 제 4,511,502호 및 제 4,652,630호에 설명된 바와 같이)로부터 얻은 소마토트로핀의 리폴딩 용액은 소마토트로핀의 모노머들, 다이머들 및 보다 높은 분자량의 올리고머들과 숙주세포들의 잔류물과 다른 잔해물들을 포함한다. 이들 중 소마토트로핀 모노머가 바람직한 생물학적 유효물질이다. 여기에 참고문헌으로 포함된 미국특허 제 5,182,369호는 pH 조절된 소마토트로핀 리폴드 용액에서, 바람직한 소마토트로핀 모노머는 현탁액의 일차 가용성 성분으로서 남는 반면, 잔류 숙주세포 단백질들 및 다른 불순물질들과 소마토트로핀의 다이머 및 보다 높은 분자량의 올리고머들의 선택적인 침전을 설명한다.

일단 소마토트로핀 올리고머들과 다른 불순물질들이 이러한 방법을 사용하여 선택적으로 침전되면, 원하는 순도의 소마토트로핀을 얻기 위하여 현탁액으로부터 침전된 단백질들과 다른 불용성 불순물질들을 제거하는 것이 필요하다. 이러한 정제 단계에 요구되는 이러한 액체/고체 분리방법들은 대부분의 산업적 생물공학 공정에 사용되며, 이는 종종 원심분리 및/또는 여과 단계들을 통하여 이루어진다.

단백질 현탁액에 존재하는 고체들을 응집시키고, 따라서 고체들의 입자크기를 증가시켜 액체/고체 분리를 개선하기 위하여 응집제들이 사용된다(Halverson과 Panzer, 1980 참조). 입자크기의 증가는 입자의 침전속도가 입자 반지름의 제곱에 비례하는 원심분리 및 침전 방법들에서 특히 유리하다. 보다 증가된 입자크기들로 인해 증가된 침전속도는 입자 침전 속도가 한 인자(factor)가 되는 어떤 유형의 액체/고체 분리에서의 생산성을 개선시킬 수 있다.

본 발명은 광범위하게는 응집을 통하여 단백질을 불용성 불순물들로부터 분리하는 것에 관한 것이다. 보다 특이적으로는, 음이온 폴리머성 응집제들을 소마토트로핀 단백질들의 분리 및 회수에 사용하는 것에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 한 측면에 따라, 불용성 불순물들의 응집을 일으킬 수 있는 양과 조건으로 음이온성 폴리머를 가용성 소마토트로핀 모노머와 불용성 불순물들의 수성 단백질 현탁액에 첨가하므로써 이들을 분리하는 방법을 제공한다. 응집된 불용성 물질은 가용성 소마토트로핀 모노머로부터 용이하게 분리되어 가용성 소마토트로핀 모노머의 청징화된 상등액을 회수할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, pH가 약 7보다 큰 수용액내의 소마토트로핀 모노머와 소마토트로핀 올리고머를 포함하는 소마토트로핀 단백질들의 혼합물을 얻는 단계; 상기 용액의 pH를 약 6.5보다 낮게 감소시키므로써 용액 내의 소마토트로핀 모노머의 대부분은 유지하는 반면, 용액으로부터 소마토트로핀 올리고머의 대부분을 침전시켜 가용성 소마토트로핀 모노머를 포함하는 단백질 현탁액을 생성하는 단계; 상기 침전된 단백질들의 응집을 일으킬 수 있는 양과 조건으로 음이온성 폴리머를 가용성 소마토트로핀 모노머를 포함하는 단백질 현탁액에 첨가하는 단계; 및 상기 소마토트로핀 모노머 용액으로부터 응집된 물질을 분리하는 단계를 포함하는 소마토트로핀 모노머의 회수방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 측면에 따르면, 소마토트로핀 모노머들, 소마토트로핀 올리고머들(여기에서 사용된 올리고머라는 단어는 단백질의 다른 다중합체 형태 뿐만 아니라 다이머들도 의미함) 및 음이온성 폴리머를 포함하는 수성 단백질 현탁액을 제공한다.

본 발명의 방법에 따라 사용되는 적합한 음이온성 폴리머들은 이에 제한되지는 않지만, 특히 약 1~20% 범위의 전하밀도를 갖는, 폴리아크릴아미드류 및 전분과 같은 다당류이다.

본 발명은 소마토트로핀 모노머를 재조합 단백질의 회수동안 모노머로부터 선택적으로 침전되어 나오는 불용성 불순물로부터 분리해내는 개선된 방법들을 제공한다.

도 1은 응집성능에 대한 폴리머 전하 밀도의 영향을 예시한다.

도 2는 약 pH 4.0~약 pH 6.0에서의 응집성능에 대한 pH의 영향을 예시한다.

도 3은 약 pH 4.0~약 pH 4.8에서의 응집성능에 대한 pH의 영향을 예시한다.

본 발명은 단백질 현탁액에서 불용성 불순물들의 입자크기를 증가시키므로써 액체/고체 분리의 효율을 개선시키기 위한 음이온 폴리머성 응집제들을 제공한다.

여기에서 사용된 "단백질 현탁액"이라는 용어는 가용성 및 불용성 성분들을 포함하는, 바람직하게는 산성 pH(즉, 약 7 이하)의 수성 현탁액을 의미한다. 반드시 그렇지는 않으나 전형적으로, 가용성 성분은 바람직한 단백질 물질(예로서, 가용성 소마토트로핀 모노머)을 포함하는 반면 불용성 성분들은 바람직하지 못한 불순물들(예로서, 소마토트로핀 올리고머들 및 박테리아 세포 잔여물)을 포함한다.

"소마토트로핀" 또는 "ST"라는 용어는 동물의 뇌하수체 선에서 생산된 소마토트로핀의 생물학적 활성 및/또는 화학구조와 유사한 활성 및 구조를 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 소마토트로핀들은 뇌하수체 소마토트로핀 생성 세포에서 생산된 천연 소마토트로핀들 또는 선택적으로, 유전적으로 형질전환된 원핵 또는 진핵 세포들, 예로서 (E. coli와 같은)박테리아, 효모 또는 조류에 의해 소마토트로핀 또는 이로부터 유도된 변형체들이 발현되는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 소마토트로핀들을 포함한다.

"리폴드(refold) 용액"은 예로서 미국특허 제 4,511,502호 및 4,652,630호에서 설명된 소마토트로핀 재생 단계에서의 접힘(folding) 및 산화의 결과로써 얻은저장(stock)용액을 의미한다. 그 후, 상기 리폴드 용액의 약 6.5이하, 바람직하게는 약 4.0~약 6.0으로의 pH 조정은 실질적으로 영향을 받지 않는 가용성 소마토트로핀 모노머는 남기는 반면 불용성 불순물들을 선택적으로 침전시킨다.

"ST 단백질 현탁액"은 미국특허 제 5,182,369호에 따라 제조된 수성 현탁액을 의미하며, 이는 약 4.0~약 6.5의 pH를 가지고, 주로 가용성 소마토트로핀 모노머 및 불용성 불순물들을 포함한다. pH 침전 전에, 용액은 일반적으로 약 1~약 30 g/l의 소마토트로핀, 소마토트로핀 응집체 및 E. coli 단백질들을 포함하는 총 단백질을 포함한다. 약 40~60%의 총 단백질은 전형적으로 pH 조절 단계에서 침전되어 산화 소마토트로핀 모노머 순도는 액체 분획분에서 약 90% 이상이 된다.

"응집"은 적합한 응집제를 단백질 현탁액에 첨가하므로써 일어나는 불용성 입자들의 응집을 의미한다. 상기 현탁액에 존재하는 불용성 성분들의 입자크기를 증가시키므로써, 여과 또는 원심분리에 의한 것과 같은 고체/액체 분리의 효율이 개선된다.

"청징화"는 단백질 현탁액으로부터 불용성 불순물들을 제거하여 예로서, 700nm에서 현탁액의 분광광도계 흡광도 값에서의 감소가 측정되는 것과 같이 현탁액의 청징도/순도를 향상시키는 것을 의미한다.

"분리"는 ST 단백질 현탁액의 응집 후에 불용성 입자들로부터 가용성 소마토트로핀 모노머들을 포함하는 수상을 제거하는 것을 의미한다. 이러한 제거는 침전 및 여과와 같은 일반적인 산업적 방법들을 포함하는 본 발명에 적절한 어떤 수단에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 분리로써 불용성 불순물들이 본질적으로 없는 소마토트로핀 모노머들의 용액을 회수할 수 있다.

"침강"은 응집되어 침전된 불순물들이 원심분리 또는 중력에 의해 가라앉는 것을 의미한다.

다음의 기술은 여기 설명된 것들의 예시적인 단계들 또는 다른 상세한 보충설명을 제공하는 범위로, 특별히 본 명세서에 참고문헌으로서 포함된다.

Garcia, F.A.P., "단백질 침전": Recovery of Biological Materials, John Wiley & Sons, 1993.

Gates 등, :"액체에 고체를 현탁시키기 위한 교반 시스템의 선택", Chemical Engineering, 5월 24, 1976.

Halverson, F., Panzer, H.P., "응집제": Encyclopedia of Chemical Technology, Volume 10, 3판, John Wiley & Sons, 1980, pp489~523.

Muhle, K. 및 Domasch, K. "폴리머들을 사용한 응집에서 입자 응집체들의 안정성",Chemical Engineering Progress 29(1991).

Wurzburg O.B., "변성 전분들: 성질 및 용도", CRC Press, Inc., pp.4~98.

본 발명의 한 측면에서, 가용성의 단백질성 물질 및 불용성 불순물들을 포함하는 수상 ST 단백질 현탁액의 개선된 액체/고체 분리방법들이 제공된다. 상기 방법은 음이온성 폴리머들을 포함하는 침전된 불순물들의 응집에 의한 단백질 현탁액의 청징화를 포함한다. 적합한 응집제는 불용성 단백질들과 현탁액내에 존재하는 다른 불순물들의 응집을 일으킬 수 있는 조건하에서 단백질 현탁액 내에 분산되는 반면 가용성 물질은 실질적으로 영향받지 않고 존재하게 된다. 여기 설명된 응집방법에 의해 많은 장점들이 제공된다. 먼저, 입자크기의 증가에 따라 고체들의 침강속도가 증가되는 현상으로 인해 고체들의 분리효율이 개선된다. 이는 고체/액체 분리에서 원심분리의 필요성을 효과적으로 최소화하거나 또는 제거할 수 있어, 이 공정과 관련된 비용을 감축할 수 있다. 또한, 상기 방법은 필터들에서 종종 관찰되는 압력강하 현상을 감소시키므로써 여과 공정들을 향상시킬 수 있다. 유체역학적 성질에서의 이러한 변화는 여과 공정들에서 보다 높은 유속 및/또는 보다 적은 규조토(즉, 여과 보조물)의 사용을 가능하게 한다.

본 발명에서 사용되는 응집물들은 단백질 현탁액 내에 존재하는 불용성 물질의 응집을 일으키는데 효과적인 음이온성 전하 특성들을 갖는 폴리머들을 포함한다. 음이온성 전하 특성의 한 척도는 전하 밀도이다. 전하밀도는 음이온성 화학기를 갖는 어떤 폴리머에 존재하는 모노머의 백분율로서 나타내어진다. 전하밀도는 균일 또는 불균일할 수 있다. 폴리머들에 기초한 어떤 아크릴아미드의 경우, 하전된 기는 온전한(integrated) 아크릴레이트 분자들(즉, 비양성자화된 상태의 아크릴산)과 연결된 카르복실기이다. 아크릴레이트 모노머는 거의 아크릴아미드 모노머와 동일한 분자량 및 활성을 갖는다. 따라서, 이러한 분자들을 사용한 공중합은 카르복실기들의 분포가 거의 균일한 폴리머를 형성한다. 상기 아크릴레이트 모노머 대 (아크릴레이트와 아크릴아미드의) 총 몰의 몰비는(백분율로 나타냄) 그 폴리머의 전하밀도이다. 따라서 10% 전하 밀도를 갖는 폴리머는 10%의 아크릴레이트 성분을 갖는다.

공중합 반응에 의해 제조된 아크릴아미드 폴리머 음이온성 특성(즉, 전하밀도)의 평가는 두가지 방식으로 보고될 수 있다. 보다 일반적인 첫번째 방법은 아크릴아미드-아크릴레이트 공중합 반응 공급에서 아크릴레이트(음이온성 전하기를 포함하는)의 몰 백분율을 기록하는 것이다. 상기 백분율은 "이론적인" 음이온성 또는 "이론적인" 전하밀도로서 간주된다. 이러한 방법은 공중합 반응물들로부터의 전하밀도 기여(contributions) 뿐만 아니라 중합반응동안 일어나는 아미드기의 가수분해로 인한 음이온성을 포함한다. 가수분해 반응은 상당수의 아미드기들을 카르복실기들로 전환시킬 수 있어, 낮은 전하밀도 폴리머들의 경우는 7% 정도이다(Floerger AN 905 PWG 폴리머의 경우에서와 같이). 본 발명자들의 경험상, 어떤 폴리머가 이러한 공정 적용에서 얼마나 잘 수행되는지를 나타내는 것은 총 음이온성이다. 본 명세서에서의 "폴리머 전하밀도" 또는 "폴리머 음이온성"은 총 전하밀도로서 정의되며, 총 전하밀도는 공중합 반응(즉, 이론적인 전하밀도)과 가수분해로부터 발생되는 전하 기여들로 인한 전하를 포함한다.

폴리머성 응집제들의 음이온 성질들은 폴리머상에 존재하는 어떤 적절한 화학 구성성분들에 의해 부과될 수 있다. 예로서, 카르복실, 카르복시메틸, 포스페이트 및 설페이트 작용기들을 포함하는 음이온성 폴리머들이 특히 본 발명에 적합하다. 본 발명에 따른 바람직한 응집제들의 예들은 음이온성 폴리아크릴아미드들 및 음이온성 다당류들을 포함한다.

카르복실기들을 가진 폴리아크릴아미드들은 본 발명에 사용되는 바람직한 군의 응집제들을 대표한다. 약 1~30%, 보다 바람직하게는 약 1~20%, 그리고 가장 바람직하게는 약 5~ 12%의 폴리머 전하밀도를 갖는 것들이 가장 적합한 것으로 밝혀졌다.

불용성 불순물들의 바람직한 응집에 좋지않은 영향을 미치지 않는다면, 본 발명에 사용된 응집제는 본질적으로 어떤 분자량일 수도 있다. 보다 높은 분자량은 향상된 응집성능을 제공할 수 있다. 전형적으로, 평균 분자량은 약 100,000~50,000,000 이상의 범위일 것이다. 바람직한 응집 반응에 좋지않은 영향을 미치지 않는다면, 바람직하게는 약 100,000 보다 크고, 보다 바람직하게는 약 1000,000 보다 크며, 가장 바람직하게는 10,000,000 보다 크다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, ST 단백질 현탁액은 상기 방법에 의해 청징화될 수 있다. 여기에서 참고문헌으로서 포함된 미국특허 제 5,182,369호는 리폴드 용액으로부터 고순도로 정제된 소마토트로핀 모노머의 회수를 위한 수단으로서, 소마토트로핀 올리고머들과 다른 불순물들의 선택적인 침전을 개시하고 있다. 이는 리폴드 용액의 pH를 재생 단계에서 사용된 높은 수준에서(대개 pH 10이 넘음) 일반적으로 약 4.0~약 6.5의 범위인 최적 pH 종말점 값까지 감소시키므로써 이루어질 수 있다.

침전단계에서 생성된 입자들은 일반적으로 작으며 쉽게 가라앉는다. 중력조건 하에서, 고체들의 상당량은 액체/고체 계면이 시각적으로 관찰되지 않는 한정되지 않은 기간동안 부유된 상태이다. 이러한 현탁액의 특징적인 느린 침강속도는 원심분리를 사용한 청징화를 어렵게 한다. 심층(depth) 여과 또한 이러한 공정류를 청징화하기 위해 사용되어 왔으나, 추가적인 원료들의 소비 및 폐기처리와 같은 분리 유형과 관련된 단점들이 있다.

예로서 크로마토크래피 또는 다른 방법들에 의한 추가의 정제 단계들이 바람직할 수 있으나, 본 발명에 따라 회수된 ST 모노머는 실질적으로 잔류 박테리아 단백질 및 다른 불순물들이 없으며, 더 이상의 정제 없이 주사 또는 이식에 의해 목적하는 동물에 투여되기에 적합하다. 정제된 물질은 바람직하게는 약 10% 이하, 보다 바람직하게는 약 5% 이하의 소마토트로핀 올리고머들을 포함한다. 이러한 올리고머들은 생물학적으로 비활성이며 목적하는 동물에게 투여되었을 경우 어떤 좋지않은 반응을 일으키지 않는다.

상기 응집 공정에 사용된 혼합 조건들은 당 기술분야에서 알려진 몇몇 변수들에 영향을 줄 수 있다. 이러한 변수들은 응집물의 침강속도 및 상등액의 청징도를 포함한다. 혼합과 관련된 바람직한 변수들은 종종 개개의 변수들의 서로 상반되는 요구조건들에도 불구하고 가능한한 최적 응집 조건들을 제공하기 위하여 설계된 절충안을 나타낸다. 예로서, 상등액 청징도의 증가는 전형적으로 응집물들의 침강속도의 감소에 의해 이루어진다.

폴리머 용액의 공정 풀(pool) 내로의 혼합은 혼합기의 크기, 유형, 위치, 배향 및 회전속도 뿐만 아니라 폴리머 용액이 전달되는 속도에 따라서도 달라질 수 있다. 특정 크기의 추진기(impeller)에서, 조작될 수 있는 두개의 변수들은 혼합기의 회전속도 및 폴리머 용액 첨가속도를 포함한다. 본 기술분야의 숙련자는 특정 물질과 원심분리 공정에 대한 최적 조건들을 용이하게 결정할 수 있다.

교반강도와 전단속도간의 균형이 달성되어야만 한다. 본 발명에 따라 사용된 혼합 시스템의 설계는 이러한 균형을 달성하는 것을 도울 수 있다. 높은 펌핑능력과 낮은 전단속도를 갖는 혼합 추진기 설계는 이러한 적용에 매우 적합하다. 예로서, Chemineer HE-3 고효율 추진기(Chemineer - Dayton, OH) 또는 Lightnin A-310 고효율 혼합 추진기(Lightnin Mixers - Rochester, NY)들은 이러한 유형의 작동에 적합하게 선택될 수 있는 것들이다.

또한 상기 혼합기는 작동동안에 현탁된 응집체들을 유지할 수 있어야만 한다. 응집 시스템 내에서 필요한 최소수준의 교반은 형성된 응집체들이 "부유된 상태 자체"로 유지되는데 요구되는 유체속도로 제한되어, 고체들이 탱크의 바닥에 가라앉지 않도록 한다(Gates 등, 1976).

상기에서 언급된 것과 같이, 여기에서 설명된 응집 시스템의 두개의 바람직한 특성들은 적절한 혼합 및 낮은 전단이다. 탱크 설계로서 어느정도까지는 이러한 두개의 조건들이 고려될 수 있다. 낮은 전단속도는 유체 운동의 생성 또는 표면 입자 상호작용에 의한 전단속도를 일으키는 표면들의 수를 최소화하므로써 이루어질 수 있다. 적절한 탱크 구조 및 응집물 공급 위치는 응집물의 공정 유체내로의 균일한 혼합을 보장하는 것을 도울 것이다.

다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 예시하기 위하여 여기 포함되었다. 다음의 실시예들에 개시된 기술들은 본 발명의 실시가 잘 수행되도록 본 발명의 발명자들에 의해 발견된 것이며, 따라서 본 발명의 실시에 있어서 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 본 기술분야의 당업자들은 이해해야만 한다. 그러나, 본 기술분야의 당업자들은 본 개시의 견지에서, 개시된 특이적인 구체예들에 많은 다른 변화들이 만들어질 수 있으며, 또한 본 발명의 기술사상및 범주에서 벗어나지 않고도 유사하거나 비슷한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다.

[실시예]

실시예 1

여기 개시된 실험들의 목적은 가용성 및 불용성 성분들을 포함한 수상 현탁액으로부터 현탁된 입자들을 응집시킬 수 있는 응집제들을 조사하고 확인하기 위한 것이다. 본 실시예에서는, 응집제의 수용액들을 제조하여 ST 단백질 현탁액에 첨가하였다. 상기 응집제들은 실험실-규모 응집절차(Lab-Scale Flocculation Procedure) #1에 개시된 것과 같은 오버헤드(over-head) 혼합기를 사용하여 상기 침전물 현탁액내로 혼합되어졌다. 응집제 첨가가 완료되면, 상기 혼합기를 멈추고 응집된 고체들이 가라앉도록 한다. 침전속도 및 상등액 청징화는 아래 설명된 것과 같이 측정되었다:

실험실-규모 응집절차 #1

4리터 유리 비이커, 6.35㎝ 지름의 A-310 고효율 혼합 추진기를 가진 Lightnin®LabMaster™혼합기, Ismatec 연동 펌프(mv-ge 모델) 및 폴리머 용액을 위한 용기를 사용하여 실험실-규모 응집 설비를 조립하였다. 상기 시스템내에서 수직 혼합을 개선시키기 위하여 4리터 유리 비이커를 배플(baffle)시켰다. 상기 4리터 유리 비이커는 비이커의 바닥에서부터 1㎝로부터 비이커의 입 바로 밑까지 이어진 유리상의 오목한 홈(indention)을 가지도록 설계되었다. 펌프 연결관의 크기는 요구되는 폴리머 용액에 대한 공급 유속에 근거하여 선택하여, 1/8"의 하강(dip)스텐레스 스틸관을 폴리머 용액의 공급에 사용하였다. 이 관의 배출구는 추진기 주변의 바로 밑 바로 바깥쪽에 위치되어 폴리머의 공정 풀 내로의 능률적인 혼합이 보장되도록 하였다. 원하는 폴리머 공급 유속을 얻기 위하여 상기 Ismatec 펌프의 눈금을 보정하였다. 그 위에 고체-액체 계면의 높이를 측정하기 위한 수단을 제공하기 위하여, 1㎝ 단위로 증가되어 표시된 테이프 스트립(strip)을 4리터 비이커의 측면에 수직으로 적용하였다. 상기 추진기는 4리터 비이커의 바닥으로부터 약 3~4㎝ 위에 위치되었다. 한 세트의 실험들을 통하여 혼합기 척(chuck)을 상기 추진기 샤프트상에 있는 표시에 맞춰 정렬시키므로써 추진기의 위치를 고정시켰다.

2리터의 ST 단백질 현탁액을 4리터 비이커로 옮긴 후, 혼합기를 169rpm의 회전 속도 세팅으로 가동시켰다. 1리터의 폴리머 용액을 30분의 시간 범위에 걸쳐 일정속도로 공정 풀내로 펌프하였다. 상기 용액의 공정 풀 내로의 이송 후, 혼합기를 추가의 60초동안 가동하여 내용물을 혼합시켰으며, 그 후 혼합기를 멈추었다. 그런 다음, 응집된 입자들의 침강속도 및 상등액의 흡광도를 측정하였다. 다양한 응집제들의 결과들을 표 1에 나타내었다.

측정:

침강속도:폴리머 용액을 침전용액에 첨가하는 것이 완료되면, 혼합기를 멈추고 응집된 고체들이 가라앉도록 두었다. 유체의 초기 운동력이 감소된 후, 응집물들은 가라앉기 시작하고 시각적으로 구별되는 고체-액체 계면이 형성되었다. 침강속도는 고체-액체 계면수준의 변화를 시간에 따라 측정하므로써 이루어졌다. 혼합기가 멈춘 직후 시간측정을 개시하였으며, 유리용기 내에서 지정된 고체-액체 계면수준에서 시간측정을 멈추었다. 계면에서의 속도는 가장 느리게 움직이는 입자들을 나타내며, 이들은 눈에 보일 수 있는 정도로 충분한 농도를 갖는다. 가장 느리게 움직이는 입자들은 주기 시간과 관련하여 속도 제한적이어서, 응집 공정을 특징화하는 면에서 가장 관심의 대상이 된다. 본 측정기술의 정확성은 식별가능한 고체-액체 계면의 형성 및 침강속도에 따라 달라진다. 큰 입자들의 형성으로 침강속도가 빠른경우 및 고체들이 용기의 바닥에 가라앉을 때까지 식별가능한 고체-액체 계면이 형성되지 않는 경우가 생긴다. 이러한 경우, 침강속도의 측정이 어려우며, 보다 큰 한계오차를 가질 수 있다.

*700nm에서의 흡광도: 700nm(A700)에서의 흡광도 측정은 정해진 처리 또는 공정으로부터 수행되어진 상등액 청징화를 정량적으로 평가하는 수단이다. Hewlett Packard UV-VIS 분광광도계(8453 모델)와 1㎝의 통과길이를 갖는 큐벳(cuvette)을 사용하여 처리 후에 상등액 샘플 1㎖의 흡광도를 측정하였다. 상기 방법을 사용하여 얻은 흡광도 값은 식 14에 따라 투과도 값으로 전환될 수 있다:

%T = 100×exp(-A_700nm)

직관적으로도, 투과도는 청징도와 직접적으로 관련되기 때문에 투과도는 상등액의 청징도와 관련짓기가 용이한 반면, 흡수도는 청징도에 대해서 역의 관계이다. 본 발명의 청징화 공정은 A₇₀₀이 0.5 이하, 바람직하게는 0.1 이하인 용액을제조한다.

"+" = 맑은 상등액(%투과도≥70%), 느린 침강(속도<500㎝/시간)

"++" = 맑은 상등액(%투과도≥95%), 빠른 침강(속도≥500㎝/시간); "NT"=실험되지 않음

"-" = 가시적인 고체-액체 계면의 형성이 이루어지지 않음; "M" = 백만; "K" = 천; MW = 분자량

이러한 결과들은 응집된 고체의 침강속도 및 수상(상등액)의 청징도(%투과도로서 나타남)에 의해 나타나듯이, 음이온성 응집제들만이 응집의 탐지가능한 표시를 생성하였다는 것을 나타낸다. 500㎝/시간 이상의 침강속도를 나타내는 응집물들 및 95% 이상의 % 투과도를 가지는 상등액을 생성하는 응집제들에 "++" 등급을 부여하였다. 500㎝/시간 미만의 침강속도를 나타내는 응집물들 및 70%보다 큰 % 투과도를 가지는 상등액들을 생성하는 응집제들에는 "+" 등급을 주었다. 액체-고체 형성의 부족에 의해 나타나는 것과 같이, 가시적인 응집의 표시가 생성되지 않은 응집제들에는 "-" 등급을 부여하였다. 개개의 응집제들에 대한 보고된 전하밀도들은 이론적인 전하밀도이지, 총 전하밀도를 나타내는 것이 아니라는 것에 주의해야 한다.

실시예 2

응집제 농도의 일정 범위를 실험실-규모 응집 절차 #2를 사용하여 평가하였다. 음이온성 특성을 가진 고분자량(약 1600만 달튼) 아크릴아미드 폴리머를 본 평가에 사용하였다. 이들 실험들에서 대상이 된 세개의 주요 측정치들은 상등액 흡광도, 총단백질 농도 및 bST 농도였다. 표 2는 이러한 방법을 사용하여 얻은 데이타를 나타낸 것이다. 여기서 언급된 최종 폴리머 농도는 모든 폴리머 용액이 ST 단백질 현탁액에 첨가된 후의 총 폴리머 농도를 의미한다.

실험실-규모 응집 절차 #2

1. 응집 실험 1시간 전에 상온에서 원하는 농도(즉, 200ppm)로 응집물 용액을 제조한다.

2. 3개의 원뿔형 바닥을 가진 폴리카보네이트 시험관들(w/나사 캡)에 라벨을 붙인다. 각 폴리머 농도를 3회 반복하여 측정한다.

3. 피펫을 사용하여 ST 단백질 현탁액을 각 시험관 내로 첨가한다. 피펫을 사용하여 해당 부피의 폴리머 용액을 ST 단백질 현탁액 내로 첨가하고, 그 후 즉시 상기 시험관의 뚜껑을 닫고 20회 거꾸로 흔든다.

4. 시험관들을 버킷(buket) 유형의 원심분리기 내에 넣고 상온에서 1000rpm으로 5분동안 돌린다(원심분리 유형: Sorvall RC5C, 로터(roter) 크기: SS34, RCF~119).

5. 원심분리 후, 부드럽게 뚜껑을 제거하고 이동 피펫을 사용하여 상등액의 상부 6㎖(총 10㎖)를 뽑아낸다. 부유하는 고체들을 피하면서 액체/공기 계면 가까이에 있는 액체를 뽑아낸다. 상등액을 라벨을 붙인 시험관으로 옮긴다.

6. 700nm에서 상등액의 흡광도를 측정한다. 상등액 1㎖를 1%의 아세트산 5㎖에 희석시킨다. 280nm에서의 흡광도를 측정하고, bST 농도를 결정하기 위하여 상등액을 HPLC 분석용으로 사용한다.

일정범위의 폴리머 농도들에 대해 상기 단계 2~6을 반복한다.

측정:

총 단백질 농도: 희석된 상등액 시료에 대하여 278nm 파장에서 측정한 흡광도로부터 총 단백질 농도를 계산하였다. bST 용액들은 0.651의 흡광계수(흡광계수,ε또는 분자 흡수율은 비어(Beer)의 법칙에 비례하는 상수로서 정의된다: A = εbc, 여기에서 A는 흡광도, b는 통과길이이며, c는 흡수종의 몰농도)를 갖는다. 1.5g/리터에 가까운 총 단백질 농도를 얻기 위하여 상등액 시료를 1% 아세트산 내에 희석하였다. 희석 버퍼로서 아세트산의 사용은 처리시 제거되지 않은 어떤 현탁된 고체들을 용해하는 역할을 한다. (처리시 제거되지 않은 현탁된 고체들은 상등액의 일부로서 간주된다. 이러한 고체들은 278nm에서의 흡광도 측정을 방해하지 않도록 용해되어야만 한다.) 이 측정의 경우, 1% 아세트산 용액이 0점 기준으로서 사용되었다.

bST 농도: 총 단백질 농도 측정으로부터 희석된 시료의 일부를 바이알에 넣고 역상 HPLC를 사용하여 측정하였다.

표 2의 첫번째 열은 0.2미크론 주입기 필터를 통하여 여과된 ST 단백질 용액의 시료에 관한 데이타이다. 주입기 필터 시료들은 응집제와 가용성 ST 단백질의 상호작용이 있는 경우 이들을 평가하는 수단으로서의 역할을 한다. 표 2의 두번째 열은 "대조군"에 관련된 데이타이다. 대조군은 응집제가 첨가되지 않은 ST 단백질현탁액 시료이다.

* 주: 단백질 및 bST 농도를 희석하여 보정함(즉, 이들은 희석되기 전의 값들을 반영한다).

상기 데이타는 최종 응집제 농도가 1ppm 보다 큰 경우 응집제의 첨가에 따라 상등액 흡광도가 감소되고, 이에 따라 총 단백질 농도가 대조군에 비해 감소된다는 것을 나타내는 반면, 가용성 ST 농도는 500ppm 보다 적은 최종 응집제 농도로 처리된 시료들의 경우에서 상대적으로 일정하게 유지되었다. 이러한 데이타들로부터 다음을 결론지을 수 있다: 1) 응집제는 가용성 ST 단백질과의 현저한 상호작용을 나타내지 않았고, 그 결과 최종 응집제 농도가 500ppm 이하인 용액으로부터 가용성 단백질을 제거할 수 있었다. 2) 상등액 흡광도의 감소 및 총 단백질 농도의 감소는, 응집제를 가용성 ST 단백질과 침전된 불순물들을 포함한 용액에 첨가하므로써 상기 시스템 내에서 고체들의 침전 성질들을 개선시켰다는 것을 나타낸다. 침강 성능의 증가는 본 시스템 내에서 입자들의 크기와 직접적으로 관련되며, 이는 응집제의 응집 활성때문일 수 있다. 총 단백질 농도를 모니터링하므로써 측정된 응집은 1ppm 정도로 낮은 농도의 응집제의 경우 일어나는 것으로 관찰되었다. 50ppm이 넘는 응집제 농도는 95% 또는 그 이상의 순도를 산출하였으나, 이 과정에 의해 약 100ppm이 넘는 응집제 농도의 경우에는 bST 농도는 감소되기 시작하였다. 따라서, 이러한 실험들에 근거한 폴리머 농도의 바람직한 범위는 약 5~100ppm 사이이나, 본 발명은 1000ppm 또는 그 이상의 폴리머 농도에서까지 적용될 수 있다. 500ppm 이상의 큰 폴리머 농도에서, 관찰되는 bST 농도에서의 감소는 응집제가 bST와 상호작용하여 이를 다른 고체들과 함께 침강시킨다는 표시일 수 있다.

실시예 3

Chemtall Inc.(Riceboro, GA)에 의해 제조된 폴리아크릴아미드 응집제들을 평가하였다. 본 실시예에서 시험된 Chemtall 응집제에 대한 상표명은 Floerger AN 905 GR이다. 6개의 실험실-규모 응집 실험들을 ST 단백질 현탁액 2리터와 응집 용액 1리터를 각각 사용하여 가동하였다. 응집 용액을 혼합 ST 단백질 현탁액에 약 30~40분동안에 걸쳐 일정한 유속으로 첨가하였다. 응집 성능에 대한 폴리머 농도의 효과를 평가할 수 있도록 혼합 조건을 이러한 실험들의 세트에서 일정하게 유지하였다. 오버헤드 혼합기의 작동을 멈춘 후, 액체/고체 계면이 유리 비이커에 고정된 높이에 도달되는데 걸리는 시간을 측정하므로써 침강속도를 어림잡아 평가하였다. 상등액 흡광도를 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 표 3은 Floerger An PWG 응집제 농도 범위에 대한 응집성능 데이타를 나타내는 것이다.

표 3은 5~35ppm의 범위의 최종 폴리머 농도를 얻기 위하여 평균 분자량이 약 1600만 달튼이고 전하밀도가 10%인 폴리머성 아크릴아미드 응집제(Floerger AN 905 GR[로트번호 8S36839])가 ST 단백질 현탁액에 첨가되었을 때의 결과를 나타낸다. 배플된 용기내에서 중앙 혼합시, 혼합기 속도는 169rpm, 탱크 지름은 15.9㎝, 온도는 약 20℃, 혼합기 추진기 펌프용량은 24리터/분, 추진기 지름은 6.35㎝이고, 추진기 팁(tip) 속도는 56㎝/초 였다.

상기 데이타는 상등액 투과도는 최종 폴리머 농도에 따라 감소한 반면, 최종 폴리머 농도의 증가에 따라 침강속도가 증가하였다는 것을 나타낸다. 침강속도의 증가는 보다 많은 폴리머가 보다 큰 응집체들의 형성을 가능하게 한다는 점에서 예측되었던 결과이다. 보다 큰 응집체들은 보다 큰 크기로 인하여, 더 빠르게 가라앉을 것이다.

고체들은 가동시 혼합후의 단계 동안에는 부유되지 않았기 때문에, 침강속도 데이타 포인트는 평균 또는 표준편차에 포함되지 않았다. 응집된 내용물들은 폴리머 첨가 완료 후 1분동안 혼합되었다.

실시예 4

응집 성능에 대한 폴리머 전하밀도의 효과에 관련된 데이타를 표 4에 열거하였다. 두개의 최종 농도들(15ppm 및 30ppm)을 Chemtall 응집 폴리머들을 사용하여 평가하였다. 이 세트의 실험에서 사용된 폴리머들은 0~20% 범위에 걸친 이론적인 전하밀도들을 가졌다. 상기 반응 조건들은 다음과 같다: ST 단백질 현탁액 부피 = 2리터, 혼합기 크기, 용량 및 속도는 실시예 3에서와 동일, 탱크 지름 = 15.9㎝, 1/8" 하강관, 첨가된 폴리머의 부피 = 1리터, 그 결과 부피가 50% 증가.

표 4의 데이타는 Chemtall 응집제들을 사용하여 만들어졌다. 이러한 데이타들은 실험실-규모 응집 절차 #1을 사용하여 얻었다. 침강속도 및 상등액 투과도 데이타를 총 폴리머 음이온성(제조자에 의해 측정됨)에 대하여 도 1에 도시하였다. 표 4는 실제 측정된 폴리머 음이온성과 함께 응집 성능 변수들의 데이타를 열거하고 있다. 아크릴레이트와 아크릴아미드 중합을 사용하여 제조된 음이온성 폴리머들만이 표 4의 데이타를 만드는데 사용되었다(가수분해에 의해 제조된 음이온성 폴리머들을 사용하는 것과 반대로). 공중합 반응에 사용된 아크릴레이트 양으로써 이론적인 음이온성을 계산하였다. 총 음이온성은 이론적인 음이온성 및 가수분해로 인한 음이온성을 포함한다.

표 4의 데이타는 가시적인 고체-액체 계면이 형성되지 않는 것에 의해 증명되는 바와 같이, 1% 또는 보다 낮은 음이온성을 가지는 폴리머성 응집제들이 응집의 탐지가능한 표시를 나타내지 않았다는 것을 나타낸다. 1% 음이온성에 해당하는 데이타 포인트들은 비이온성 폴리머로서 제조된 폴리머, 즉 카르복실기들이 없는 폴리머의 성능을 나타낸다. 이러한 폴리머의 1% 음이온성 특성은 제조공정동안에 발생된 산 가수분해의 결과이다. 카르복실기들을 포함하는 폴리머의 음이온성 특성은 낮은 pH에서 현저하게 감소된다. 이러한 사실은 중성 pH(pH~7.0)에서 1% 음이온성의 전하가 본질적으로 pH 4.5에서 중성화(즉, 전하밀도가 약 0)된다는 것을 의미한다. 이러한 논의의 목적을 위하여, 1% 음이온성 데이타 포인트들과 연결된 폴리머는 비이온성 특성을 갖는 것으로 간주된다. 고체-액체 계면의 형성은 정적인 조건에서는 일어나지 않았으며, 이는 폴리머가 현탁액 내의 침전 입자들의 크기에 심각하게 영향을 미치지 않는다는 것을 암시한다. 액체로부터의 고체들의 분리가 일어나지 않았기 때문에, 이 용액의 청징도의 측정은 희석된 현탁액을 측정하였으며, 이로써 표 4에 나타낸 낮은 투과도 값을 설명할 수 있다.

전하밀도가 1%보다 높은 폴리머들을 사용하여 수행된 응집들은 식별가능한 고체-액체 계면을 나타내었다. 데이타는 이 시스템내에서 고체들의 응집에 대한 최적 음이온성이 존재한다는 것을 명백하게 보여준다. 10% 음이온성 폴리머가 가장 빠른 침강속도를 나타냈으며, 이는 최적 음이온성이 10%에 가깝다는 것을 나타낸다. 10% 음이온성 폴리머보다 작거나 또는 더 큰 전하밀도를 가진 폴리머들을 사용하여 얻은 침강속도는 10% 음이온성 폴리머를 사용한 경우에 얻은 속도보다 더 느렸던 반면, 상등액 청징도는 음이온성 특성을 가진 폴리머들을 사용하여 수행된 모든 응집들에 대해 상대적으로 일정한 것으로 나타났다.

최적 전하밀도(즉, 6% 음이온성 폴리머)보다 더 낮은 전하밀도를 가진 폴리머성 응집제는 10% 음이온성 폴리머를 사용한 경우 달성된 속도보다 낮은 침강속도를 나타내었다. 상기 데이타는 최적 전하밀도보다 낮은 전하는 보다 덜 효율적인 고체들의 응집을 일으킨다는 것을 나타낸다.

실시예 5

pH-조정된 ST 단백질 현탁액의 pH의 응집 능력에 대한 영향을 평가하였다. 리폴드 농축물의 총 단백질 농도는 정제수를 사용하여 약 20g/리터로 조정하였다. 희석된 리폴드 용액의 pH는 5% 아세트산을 사용하여 4개의 다른 pH 종말점들로 조정되었다. 각 pH에서 결과의 현탁액의 시료 2리터를 취하여 진탕 바(bar)와 진탕플레이트를 사용하여 최소 1시간동안 더 혼합하였다. 실험실 규모 응집 절차 #1을 사용하여 Floerger AN 905 PWG 응집제(Chemtall Inc., 10% 음이온성)의 75ppm 용액의 1리터 분취액으로 각 현탁액 시료들을 응집시켰다. 하강관 지름은 1/8", 혼합기 회전 속도는 169rpm였다. pH 조정 및 응집은 상온(약 23℃)에서 수행되었다. pH 데이타 및 응집 성능 데이타를 아래의 표 5와 표 6에 열거하였다. 이러한 데이타는 Floerger AN 905 PWG 폴리아크릴아미드 응집제(F905)의 경우, pH 조절된 ST 단백질 현탁액의 바람직한 pH는 약 4~5이며, 보다 바람직하게는 약 4.2~4.6이다.

표 5와 표 6의 데이타는 침강속도에 의해 측정된 응집 성능이 용액의 pH에 강하게 의존한다는 것을 나타낸다. 이들 데이타는 도 2와 도 3에서 그래프의 형태로 나타내었다. 침강속도는 pH가 4.8에서 4.3으로 감소함에 따라 현저하게 증가하였다. % 투과도로서 측정된, 이 pH 범위에서 상등액의 청징도는 비교적 일정하였다. 표 5와 표 6의 데이타는 또한 약 10%의 측정된 전하밀도를 가진 약 16,000,000의 고분자량 폴리머의 경우, 침강속도로서 측정된 응집 성능은 약 pH 4.40 가까이에서 최적이라는 것을 나타낸다.

실시예 6

응집제들로서 전분과 셀룰로오즈 폴리머들을 평가하기 위하여 실험실 규모 응집 절차 #2의 변형된 형태가 사용되었다. 공정 부피, 비이커 크기 및 폴리머 추가시간을 제외하고 상기와 같은 동일한 절차를 사용하였다. 본 실험에서 1리터의 폴리머를 1리터의 ST 단백질 현탁액에 1시간~2시간 동안에 걸쳐 첨가하였다.

전분 폴리머들은 A.E. Staley 제조사(Decatur, IL)에 의해 제공받았다. 한 감자전분(Sta Jel 140, 예비젤화된(prejelatenized) 감자전분)을 시험하였다. 상기 감자전분은 실험조건하에서 시각적인 입자 응집의 표시를 나타내었다.

Sta Jel 140은 예비젤화된 감자전분으로, 주로 아밀로오즈와 아밀로펙틴 폴리머들로 이루어진 전분이다. 아밀로오즈는 선형 폴리머인 반면 아밀로펙틴은 고도로 분지된 폴리머이다. 대부분의 전분들은 18~28%의 아밀로오즈를 포함하며, 감자전분은 이 범위내에서 보다 낮은 함량의 아밀로오즈 함량을 나타낸다(Wurzburg). 감자전분은 약 20%의 아밀로오즈 및 80%의 아밀로펙틴을 포함하며, 약 150만 달튼의 평균 분자량을 갖는다. 아밀로오즈 대 아밀로펙틴의 비율은 감자전분이 고도로 분지된 폴리머라는 것을 암시한다. 변형되지 않은 감자전분은 천연적으로 0.08%의 인을 함유하며, 이는 전분에 음이온성 성질을 부여한다.

0.01%(중량/중량) 및 0.1%(중량/중량)의 최종 전분 폴리머 농도를 얻기 위하여 0.02%(중량/중량) 및 0.2%(중량/중량)의 감자전분 공급 농도들을 시험하였다. 두 경우 모두에서 Sta Jel 140 감자전분은 시각적인 응집 현상을 나타내었다. 고체들은 매우 맑은 상등액을 남기고 중력 조건에서 가라앉았다. 형성된 응집체들은 Floerger AN 905 PWG 폴리머를 사용하여 형성된 응집체들보다 더 작았으며, 이는 고체의 침강이 더 느려지도록 한다. 총 가용성 단백질의 측정은 ST 단백질 현탁액을 감자전분으로 처리함에 따른 가용성 단백질에서의 어떤 탐지가능한 손실도 없었다는 것을 나타낸다. 이는 감자전분이 가용성 bST 단백질과 어떤 상호작용도 하지 않는다는 증거이다.

여기 개시되고 주장된 모든 조성물들 및 방법들은 본 발명의 개시의 견지에서 과도한 실험 없이도 제조되고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구체예로써 개시되었으나, 본 발명의 개념, 사상 및 범위에서 벗어나지 않으면서 여기 개시된 단계들 또는 방법의 단계 순서들에 변화들이 적용될 수 있다는 것은 본 기술분야의 당업자들에게는 명백할 것이다. 보다 특이적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련된 어떤 물질들이 동일하거나 유사한 결과들을 달성할 수 있는 한 여기 설명된 물질들에 치환될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 본 기술분야의 당업자들에게 명백한 이러한 모든 유사 치환체들 및 변형들은 첨부된 청구의 범위에 의해 규정되는 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.

본 발명은 소마토트로핀 모노머들, 소마토트로핀 올리고머들 및 음이온성 폴리머를 포함하는 수성 단백질 현탁액을 제공한다.

Claims (17)

1. 소마토트로핀 모노머들, 소마토트로핀 올리고머들 및 음이온성 폴리머를 포함하며, 총단백질의 농도가 1리터당 1g~30g의 범위이고, 상기 음이온성 폴리머는 1ppm~1000ppm의 범위로 존재하는 수성 ST 단백질 현탁액.
2. 제 1항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 폴리아크릴아미드인 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
3. 제 2항에 있어서, 상기 폴리아크릴아미드는 5%~12%의 폴리머 전하밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
4. 제 2항에 있어서, 상기 폴리아크릴아미드는 8%~11%의 폴리머 전하밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
5. 제 1항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 다당류인 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
6. 제 5항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 전분 또는 변성 셀룰로오즈인 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
7. 제 5항에 있어서, 상기 다당류는 감자전분인 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
8. 제 1항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 현탁액 내에 1~1000ppm의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
9. 제 1항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 현탁액 내에 10~100ppm의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
10. 제 1항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 현탁액 내에 20~30ppm의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
11. 제 1항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 평균 분자량이 100,000보다 큰 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
12. 제 1항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 평균 분자량이 1,000,000보다 큰 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
13. 제 1항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 평균 분자량이 10,000,000보다 큰것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
14. 제 1항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 폴리머 전하밀도가 5%~12%이며, 평균 분자량이 10,000,000보다 큰 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
15. 재 1항에 있어서, 상기 소마토트로핀은 소의 소마토트로핀인 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
16. 제 1항에 있어서, 상기 음이온성 폴리머는 1~100ppm의 양으로 존재하며, 폴리머 전하밀도가 5%~12%이고, 평균 분자량이 1,000,000보다 큰 폴리아크릴아미드인 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.
17. 제 1항에 있어서, 상기 단백질 현탁액의 pH는 4.5이며, 상기 음이온성 폴리머는 25ppm의 양으로 존재하며, 전하밀도가 10%이고, 평균 분자량이 16,000,000인 폴리아크릴아미드인 것을 특징으로 하는 ST 단백질 현탁액.