KR20030078945A - 보호된 디옥시아데노신 및 디옥시구아노신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 보호된 뉴클레오시드의 합성 및 정제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 용매로서 피리딘을 사용하지 않고 보호된 뉴클레오시드를 합성 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

보호된 디옥시아데노신 및 디옥시구아노신{Protected Deoxyadenosines and Deoxyguanosines}

유도화에 의해 뉴클레오시드를 합성하고 보호하는 것에 대한 논의는 참고로본 발명에 포함된 다음의 문헌을 포함하여 많은 문헌에서 찾아볼 수 있다. 뉴클레오시드를 보호하는 하나의 방법은 Ti, et al., "Trasient Protection: Efficient One-flask Syntheses of Protected Deoxynucleosides",J. Am. Chem. Soc., Vol. 104, 1316-1319 (1982)에 기술되어 있고, 실시예와 관련지어 이하에서 보다 구체적으로 논의된다. 보호된 뉴클레오시드를 합성하는 다른 방법은 Charubala, et al., "Nucleotides XXIII: Synthesis of Protected 2'-Deoxyribonucleoside-3'-phosphotriesters Containing the p-Nitrophenylethyl Phosphate Blocking Group",Synthesis, 965 (1984)에 기술되어 있다. 이러한 보호된 뉴클레오시드를 합성하는 여전히 다른 방법은 Kierzek, "The Synthesis of 5'-O-dimethoxytrityl-N-acyl-2'-deoxynucleosides, Improved 'Transient Protection' Approach",Nucleosides & Nucleotides, 4(5), 641-649 (1985)에 기술되어 있다. 이러한 모든 문헌에는 당해 분야에서 이미 알려져 있듯이, N-아실화에 의한 보호가 아데노신과 시티딘 유도체상에서 벤조일 클로라이드로 효과적이고, 구아노신 유도체상에서 이소부티르산 무수물로 효과적이라고 개시되어 있다. 그 다음 이런 화합물은 메톡시트리틸 또는 디메톡시트리틸 기의 도입에 따라 더욱 보호되는데 이 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 뉴클레오시드의 보호에 관한 예전의 논문을 발견할 수 있는데, 이는 Schaller, et al.,J. Amer. Chem. Soc., Vol. 85, 3821-3827 (1963)이다. 보호된 뉴클레오시드에 관한 또 다른 논문은 McGee, et al., "A Simple High Yield Synthesis of N²-(2-Methylpropanoyl)-2'-deoxyguanosine",Synthesis, 540 (1983)이다. 모든 보고되어진 합성에 있어서, 보호된 뉴클레오시드는 의약품 합성에 사용되기 전에 정제되어야만 한다.

보호된 디옥시뉴클레오시드의 제조에 관한 상세한 설명은 본 발명에 선행 기술로 포함시킨 Jones, "Preparation of Protected Deoxyribonucleosides", Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 23-34 (1984)에 기술되어 있다. 이 문헌에는 5'-하이드록실 기를 트리틸 에테르로, 3'-하이드록실 기를 벤조일 클로라이드 또는 레불산 무수물로 보호하는 등 이러한 뉴클레오시드를 보호하는 다양한 방법들이 기술되어 있다. 리보뉴클레오시드에 대해서는 2'-하이드록실기를 보호할 필요성이 있는데, 가장 흔히 tert-부틸디메틸시릴(TBDMS) 기에 의해 제공된다. 외향 고리의 아미노기는 위에서 설명했듯이 벤조일 부위(Bz) 또는 이소부티릴기(iB)로 아실화함으로써 보호된다. 아실 보호는 Koster, et al., "N-Acyl Protecting Groups for Deoxynucleosides", Tetrahedron, 37(2), 363-369(1981)에 기술되어 있다. Chaudhary, et al., "4-Dimethylaminopyridine: An Efficient and Selective Catalyst for the Silylation of Alcohols",Tetrahedron Letters, No. 2, 99-102 (1979)에는 TBDMS가 촉매로써 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)를 사용하여 어떠한 하이드록실기도 보호하는 것으로 개시되어 있다.

이와 같이 보고된 모든 제조방법에서는 합성 공정에서 용매로써 피리딘을 사용하고 있다. 피리딘은 뉴클레오시드, 보호된 뉴클레오시드 및 이러한 최종 산물을형성하기 위해 사용되는 다양한 반응물과 화학적으로 공존할 수 있는 것으로 알려져 있으나, 매우 독성이 강하고 뉴클레오시드를 용해시킬 수 있는 능력에 있어 한계가 있다. 용액에 뉴클레오시드를 유지하기 위해서는 반응에 다량의 피리딘이 사용되어야 하며 이와 같은 다량의 피리딘은 보호된 뉴클레오시드 산물로부터 제거되기 어렵다. 결국 피리딘 용매 공정은 매우 생산성이 낮고 공정 비용도 매우 높다. 따라서 피리딘을 용매로써 사용하지 않는 보호된 뉴클레오시드 제조 방법이 바람직하다.

상술한 Chaudhary, et al.에서 논의되었듯이, 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)은 종종 피리딘이 용매로써 사용된 공정에서 촉매로써 사용된다. 사실, DMAP는 이러한 공정에 사용되는 표준 촉매가 되었다. 그러나 DMAP는 독성이 강하고, 매우 비싸며 원하는 산물로부터 분리하기 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서, 촉매로써 DMAP를 사용하지 않는 공정을 제공하는 것이 바람직하다.

피리딘을 사용하는 또 다른 이유는 피리딘이 약염기여서 반응 혼합물에서 형성된 산을 중화시킬 수 있기 때문이다. 이러한 성질 때문에 피리딘은 "산 제거제"로써 작용한다. 보호화 공정에서 많은 화학 반응은 HCl과 같은 산 부산물을 생산한다. 예를 들어 벤조일 클로라이드 또는 이소부티릴 클로라이드가 아미노기를 아실화하는데 사용되는데, 아실화 반응에서 이러한 산 클로라이드 화합물은 아미노 기와 반응하여 부산물로써 HCl을 생산하게 된다.

트리틸화 반응에서도 디메톡시트리틸 클로라이드(DMT-Cl)이나 다른 트리틸 클로라이드가 하이드록시기와 반응하여 이반응의 부산물로써 HCl을 생성하게 된다. 이러한 산이 바람직하지 못하게 뉴클레오시드와 반응하는 것을 방지하기 위해 이러한 반응에 의해 생성된 산을 중화시킬 필요가 있는 바, 산 제거제가 이러한 공정에 필요하게 된다.

합성 유전자 뿐만 아니라 올리고뉴클레오타이드의 자동 합성은 연구 목적을 위해서는 밀리그램 단위에서 실시되어지고 있다. 최근에는 인체에서 질병을 일으키는 단백질의 합성을 막기 위한 안티-센스 약물등의 상업화 제품을 생산하기 위해 올리고뉴클레오타이드가 좀 더 많은 양으로 사용되고 있다. 이러한 유도체들의 합성시 생성되는 극성 및 비극성의 불순물과 함께 보호기들의 초민감성은 정제를 복잡하게 하고, 고비용화하며 상업적 규모로 제조하기 위해 대량화하는데 있어서 곤란함을 야기시킨다.

컬럼 크로마토그래피, 특히 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피는 소규모 내지 중간 규모로 보호된 뉴클레오시드를 정제하는데 광범위하게 사용되고 있다. 이 방법에서는 정제되는 물질의 양에 비례하여 고순도의 용매를 다량 사용해야 할 뿐만 아니라 노동 집약적이며 원하는 산물의 수율을 최대화하기 위해 적절한 시간에 분획 절단을 하기 위한 정확한 모니터링이 요구된다. 이러한 이유로 이러한 정제 방법을 대규모로 사용하는 것은 매우 비용이 많이 든다.

멀티-킬로그램 규모의 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피를 실행하기 위한 장비는 구입 및 작동시키는데 비용이 많이 든다. 예를 들어 하나의 상업적으로 가능한 생산 규모의 크로마토그래피 단위는 운전할 때 마다 약 4Kg 까지의 물질을 분리할 수 있다. 운전 시간은 분당 7 리터의 용출률에서 18-36분으로 다양하다. 기본적인 단위 투자는 매우 비싸고, 운전시마다 고가의 고순도의 용매 125 내지 250리터의 비용(그리고 이어지는 폐기 비용)으로 이어진다. 또한 몇몇 산물은 원하는 순도에 도달할때까지 여러차례 크로마토그래피로 정제할 필요가 있고, 각각의 정제시마다 상당한 수율 손실이 있게 된다. 크로마토크래피를 이용한 정제시 소요되는 고비용으로 인해 상업적 규모로 이루어질 때는 덜 사용하게 된다.

이러한 이유 때문에 용매로써 피리딘을 사용하지 않고, 촉매로써 DMAP를 사용하지 않으며, 산물을 정제하기 위해 분리 크로마토그래피를 사용하지 않는 뉴클레오시드를 보호하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명은 이러한 요건을 만족하며 다음에서 구체적으로 설명하겠지만 추가적으로 더욱 잇점을 제공한다.

외향고리의 아미노기를 보호하기 위한 아실화 방법은 당해 분야에서 널리 알려져 있고 예를 들어 Jones, "Preparation of Protected Deoxyribonucleosides", op.cit에 기술되어 있다. 이 문헌에 설명되어 있듯이, 보호된 디옥시리보뉴클레오시드를 제조하는데 가장 큰 문제점은 하이드록실기와 아미노기를 화학적으로 구분하는 것이다. dC의 경우에만 하이드록실기를 아실화하지 않고 아미노기를 선택적으로 아실화(N-아실화)하는 것이 가능하다. dA와 dG 아미노기들은 이러한 선택적 반응에 대해 너무 약한 염기인 것으로 알려졌다. 그러나, 선택적으로 디-아실화하는 것, 즉, 10 이상의 pH에서 아미드에 비해 보다 빠른 에스테르의 가수분해를 사용함으로써 구별하는 것이 가능하다. 따라서, 사용된 화학적 공정은 하이드록실기와 아미노기 둘다를 아실화하는 뉴클레오시드를 퍼-아실화한 후 에스테르를 선택적으로 가수분해하여 원하는 N-아실화 뉴클레오시드만 남겨두는 것이다. 이러한 퍼-아실화 공정은 퍼-아실화된 중간체를 분리해야 하므로 사용하기 어려운 것으로 알려져 있다. Jones 문헌에 기술된 또 다른 공정은 하이드록실기를 트리메틸시릴 에테르로서 일시적으로 보호하는 것에 기초하여 선택적으로 N-아실화하는 방법으로서 "TMS-일시적 보호"라고 불리워진다. 에스테르기와 달리 트리메틸시릴 에테르는 분리할 필요없이 용액에서 가수분해 될 수 있다. 이러한 이유 때문에 N-아실화의 TMS-일시적 보호 방법은 dA와 dG에 사용하기에 바람직한 방법이다. 그러나, Jones 문헌에 기술된 아실화 공정은 용매로서 피리딘을 사용해야 한다.

PCT 공개 출원 WO 0075154에는 아실화에 의해 보호되는 외향고리의 아미노 기와 보호되지 않은 채 남아있는 적어도 하나의 하이드록실기를 갖는 출발 디옥시리보뉴클레오시드의 외향고리의 아미노기를 선택적으로 보호하는 다음과 같은 방법이 기재되어 있다.

a)출발 디옥시리보뉴클레오시드를 실질적으로 피리딘이 없고, 다음 단계 b)에서 형성되는 보호된 산물을 위한 극성 용매에 분산시키는 단계; 및

b)상기 출발 디옥시리보뉴클레오시드의 상기 외향고리의 아미노기를 선택적으로 아실화하여 상기 하이드록실기가 보호되지 않는 보호된 산물을 형성하는 단계.

디옥시리보뉴클레오시드의 이러한 N-아실화 방법은 용매로서 피리딘, 촉매로써 DMAP를 사용하지 않고 종래 공정에서 일반적으로 요구되는 피리딘 용매 및/또는 DMAP 촉매로부터 산물을 분리하는 어려운 단계를 거칠 필요가 없도록 한다. 이러한 방법은 또한 액체-액체 추출 및/또는 선택적 흡착에 의해 정제된 다음, 산물을 불용성인 용매에 첨가함으로써 침전 또는 결정화에 의해 고형화할 수 있는 보호된 뉴클레오시드를 제공한다. 상기 PCT 공보에는 피리딘이 포함되지 않은 합성 방법이 아실화를 요구하는 3개의 디옥시리보뉴클레오시드인 dA, dC 및 dG 각각에 대해 다양하다고 기재되어 있다. 이 방법은 dA와 dG의 경우에는 TMS-일시적 보호에 의해 간접적으로 아실화되는 반면 dC는 선택적 아실화에 의해 직접 아실화될 수 있는 것을 필요로 한다.

본 출원인은 본 발명이 dA와 dG에 관한 것이므로 피리딘이 함유되지 않은 합성 방법을 개선시킴으로써 간단화시키고 보호된 dA와 dG의 합성을 위한 보호 방법의 전체적 수율을 향상시키게 된다.

본 발명은 보호된 뉴클레오시드의 합성 및 정제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 용매로서 피리딘을 사용하지 않고 보호된 뉴클레오시드를 합성 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

뉴클레오시드는 핵산의 부분적인 분해, 즉 가수분해시 얻어지고 생리학적 및 의학적 연구에서 중요하며, D-리보즈(리보뉴클레오시드를 형성하는) 또는 D-디옥시리보즈(디옥시리보뉴클레오시드를 형성하는)에 연결되는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 함유하는 화합물이다. 뉴클레오시드는 뉴클레오타이드에서 포스페이트기를 뺀 물질이다. 잘 알려진 뉴클레오시드에는 아데노신(A), 시티딘(C), 유리딘(U)및 구아노신(G)이 있고, 디옥시뉴클레오시드에는 디옥시아데노신(dA), 디옥시시티딘(dC), 디옥시구아노신(dG)및 디옥시티미딘(dT)이 있다. 티미딘은 실제로 디옥시뉴클레오시드이며 문헌에서 티미딘(T) 또는 디옥시티미딘(dT)으로 일컫어지고 있음을 주지하여야 한다.

4개의 디옥시뉴클레오시드인 dA, dC, dG 및 dT 화합물 각각에서 "디옥시" 는 퓨란 고리의 2'위치에서 일어난다. 활성 하이드록시 위치는 3'과 5'이다. 이하에서 논의되겠지만, dA, dC 및 dG 각각에는 바람직하게는 아실화에 의해 보호되는 외향고리(exocyclic) NH₂기가 있다.

뉴클레오시드는 아미노와 하이드록시의 두가지 기능성 기를 포함하는 다기능성 화합물이다. 이들은 유전자 합성 뿐만 아니라 올리고뉴클레오타이드를 생산하기 위해 자동 합성기에서 사용될 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드와 유전자는 이미 결정된 시퀀스로 하나의 뉴클레오시드의 3'-OH기와 다음의 5'-OH기 사이에서 포스페이트 에스테르 결합을 통해 뉴클레오시드를 함께 이어감으로써 형성된다.

선택적 및 효과적 합성을 위해서는 원하는 위치에서 반응을 시켜야 하고, 이를 위해 특정 기능성 기를 블럭하거나 "보호"할 필요가 있다. "보호"기는 특별히 조심스럽게 조절된 조건하에서, 일반적으로 비교적 온화하고 전형적으로 산성인 조건에서 제거되도록 설계된다. 고부가가치의 의약품 합성에서 전구체로써 유용하게 되기 위해서는 보호된 뉴클레오시드가 매우 고순도(즉, 약 99% 이상, 바람직하게는 약 99.5% 이상)일 필요가 있다. 특별히 언급하지 않는다면, 본 발명에서의 순도율은 HPLC에 의해 측정된 백분율로 표시되나 언급하는 경우에는 중량%로 표시될 수도 있다.

일반적으로 뉴클레오시드의 보호는 하이드록실 기의 보호만을 요구하는 티미딘을 제외하고는 아미노와 하이드록시의 양쪽 기능성 기의 유도화를 포함한다. 이러한 보호된 뉴클레오시드를 얻기 위해 다양한 방법이 적용되나 하이드록실 기를 보호하기에 앞서 일반적으로 N-보호된 유도체(가장 일반적으로 N-아실화)가 분리되고 정제된다. 예를 들어 dC의 2-아미노기와 dA의 6-아미노기는 벤조일 기에 의해 보호되나 dG의 2-아미노 기는 이소부티릴 기에 의해 보호된다. 하이드록실기, 일반적으로 모든 뉴클레오시드에서 5'-하이드록실기는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT)기에 의해 일반적으로 보호된다.

포스포릴화될 때, 보호된 뉴클레오시드는 3'-하이드록실 기에서 반응하게 될 것이고, 그 다음 포스포릴화 및 보호된 뉴클레오시드는 5' 위치가 DMT기의 제거로 블록화가 해제된 후 5' 위치에서 제2 뉴클레오시드와 반응하게 될 것이다. 그 다음 제 1 뉴클레오시드의 3'-하이드록실 기와 제 2 뉴클레오시드의 4'-하이드록실 기 사이에서 포스포릴화가 일어나 디뉴클레오타이드를 형성하게 된다. 포스포릴화 과정이 반복됨에 따라 합성기는 이미 결정된 뉴클레오시드의 시퀀스를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 형성할 수 있게 된다.

도1은 디옥시아데노신 유리-염기로부터 보호된 N⁶-벤조일-5'-O-(4,4-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신을 제조하는 것을 나타내는 대표적인 반응도이다.

도2는 디옥시구아노신 유리-염기로부터 보호된 5'-O-디메톡시트리틸 N²-이소부티릴-2'-디옥시구아노신을 제조하는 것을 나타내는 대표적인 반응도이다.

본 발명에 따른 방법은 보호된 디옥시리보뉴클레오시드의 제조에 적용될 수 있고, 특히 상술한 바와 같은 종래의 보호된 디옥시뉴클레오시드의 피리딘-유리 합성 공정에서 사용된 방법을 개선시킨 것에 관한 것이다. 그러한 공정에서, 디옥시뉴클레오시드 dA, dC 및 dG 각각은 외향고리에 아미노(NH₂)를 갖는데 그러한 아미노기의 아실화에 의해 1차적으로 보호된다. 이 단계는 매우 반응성이 높은 아미노기가 하이드록실기를 보호하기 위해 사용되는 화합물과 반응하기 때문에 필요하다. 상술한 바와 같이 dA와 dC의 아미노기들은 바람직하게 벤조일기에 의해 보호되는 한편, dG의 아미노기는 이소부티릴기에 의해 보호된다. 이러한 아실화 화합물은 이하 각각 Bz-dA, Bz-dC, 및 iB-dG라고 불리워진다.

외향고리의 아미노기들을 보호하기 위한 바람직한 아실화 방법은 아실화를 요구하는 3개의 디옥시리보뉴클레오시드, dA, dC 및 dG 각각에 따라 다르다. 종래 기술에서는 dC가 선택적 N-아실화에 의해 직접 아실화될 수 있는 반면, dA와 dG는 아실화될 수 없으므로 TMS-일시적 보호에 의해 간접적으로 아실화되는 것이 바람직하다고 기술되어 있다. 본 출원인은 피리딘-유리 용매 시스템에서 dA와 dG의 직접적 N-아실화를 가능하게 하고 일시적 TMS 보호의 필요성을 제거하는 공정 변형을 발견하게 되었다.

보호 아실화 반응을 위해 선택된 용매는 생산된 N-아실화 디옥시뉴클레오시드가 용해가능한 것이어야 한다. 출발 디옥시뉴클레오시드는 아실화 공정을 수행하기 위해 분산될 수 있다면 용매에 충분히 용해가능할 필요는 없다. 이하에서 더욱 설명하겠지만 바람직한 사용가능한 극성 용매는 아실화되는 특정 디옥시뉴클레오시드에 따라 다르다.

본 발명에 따른 공정은 유기 무수물 시약을 사용하여 N- 및 O-아실화를 이루게 된다. 본 발명에서 무수물을 사용하는 것은 아실화 반응시 강산의 형성을 억제하고 본 출원인이 발견한 것 처럼 원한다면 O- 및 N-의 동시적인 아실화 뿐만 아니라 dG 및 dA의 선택적 O-아실화를 위한 조건의 선택을 가능케 한다.

바람직한 무수물 시약에는 알킬 무수물와 아릴 무수물이 있고, 보다 바람직하게는 저급 알킬 무수물 및 페닐 무수물가 있다. 여기서 저급 알킬기는 1 내지 약 6의 탄소원자수를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 의미한다. 저급 알킬기를 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, n-펜틸 및 n-헥실이 있다. 바람직한 무수물에는 아세트산무수물, 이소부르산 무수물 및 벤조산 무수물이 있다.

본 발명의 방법에서는 N-아실기를 그대로 남겨되는 조건하에서 O-아실 보호기를 선택적으로 제거하는데, 선택적 제거는 비수성 극성 양성자성 용매에서 친핵성 시약을 사용함으로써 가능하다. 바람직한 친핵성 시약에는 예를 들어 메톡사이드, 에톡사이드 또는 n-프로폭사이드와 같은 저급 알킬 알콕사이드 염이 있다. 금속 염 알콕사이드가 바람직하다. 양성 극성 용매는 전형적으로 금속 알콕사이드의 선택에 대응하며 각각 메탄올, 에탄올 또는 프로판올이 바람직하다. 탈-보호 반응은 일반적으로 선택적 하이드록실 탈-보호를 제공하기 위해 저온에서 이루어진다. 바람직한 온도 범위는 -35 내지 약 0℃, 더욱 바람직하게는 -25 내지 약 -10℃, 가장 바람직하게는 -15℃이다.

N-보호기가 저급 알킬-보호기라면, N-아실화 단계는 비선택적 제 1 아실화에서 이루어지고, 이어서 아실화된 하이드록실 기의 선택적 탈-보호에 의해 이루어질 수 있다. 이 경우, 단지 하나의 무수물만이 본 발명의 실시에 사용될 필요가 있다. 이는 이하에서 보다 구체적으로 기술될 5'-디메톡시트리틸 N²-이소부티릴-2'-디옥시구아노신을 생성하는 바람직한 방법이다.

dG의 직접 아실화가 우선적으로 기술될 예정인데, 이러한 아실화 공정에서 출발 디옥시뉴클레오시드로서 dG 모노하이드레이트의 출발물질이 사용된다. dG는 피리딘-유리 극성 양성자성 용매에 분산된다. 바람직한 용매는 가능한 한 무수물이어야 하는데 그 이유는 어떠한 존재하는 물도 제거되어야 하며 그렇지 않으면 아실화에 앞서 정지되어야 한다. 적당한 용매에는 테트라하이드로퓨란(THF), 아세토니트릴, 아마이드, 예를 들어 디메틸포름아마이드(DMF), 디메틸아세타마이드 및 N-메틸피롤리딘, 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸설폰 및 헥사메틸포스페이트(HMPA)가 있다.

dG의 직접 아실화에 사용되는 바람직한 극성 비양성자성 용매는 디메틸포름아미드(DMF)와 같은 용매이다. 아실화제, 바람직하게는 무수물이 dG용액에 첨가된다. 이소부티르산 무수물이 적합하고 바람직한 아실화제이다. 무수물 대 dG의 바람직한 몰비는 약 4 내지 5이다. 반응온도는 약 70∼90℃, 가장 바람직하게는 약 75∼80℃로 유지되어야 한다. 반응은 온도가 낮을수록 느리며, 이로 인한 불완전한 반응은 산물이 미반응 출발물질로 오염될 수 있다. 반응혼합물은 출발물질의 완전한 반응 및 모든 부분 아실화된 중간체의 최종 트리-아실화 산물로의 전환을 확실시하도록 모니터된다. NMR, UV, IR 및 다양한 크로마토그래피를 포함하는 다양한 모니터 수단이 사용될 수 있다. 바람직한 모니터 수단은 고압액체 크로마토그래피(HPLC)이다.

출발물질인 디옥시리보뉴클레오시드 용액에 무수 아실화제를 첨가함으로써 뉴클레오시드와 반응시 유기산 부산물이 생성된다. 이와 같은 경우에, 산 부산물은 반드시 중화되어야 하며, 혹은 이는 뉴클레오시드의 분해를 야기할 수 있다. 따라서, 산 스캐빈져가 바람직하게 반응 혼합물에 포함된다. 바람직한 산 스캐빈져는 산과 염을 형성하는 3차 아민이며, 특히 바람직한 삼차 아민은 트리에틸아민(TEA)이다. 다른 적합한 3차 아민으로는 일반식 N(R)₃의 어떠한 트리-알킬 아민을 포함하며, 식중 R은 같거나 혹은 다른 C1 내지 C6 알킬기이다. TEA뿐만 아니라, 이와같은 트리-알킬 아민으로는 트리메틸아민, 트리프로필아민 및 디-이소프로필-모노에틸 아민(DIPEA)을 포함한다. 다른 적합한 3차 아민으로는 트리에탄올아민을 포함한다.

dA의 아실화는 아미노 자리만이 벤조일화된 상태로 남고 따라서 벤조일화된 dA(Bz-dA)을 형성하도록, 저급 알킬 무수물을 사용하여 선택적으로 O-아실화하고 그 후, N-벤조일화한 후 히드록시자리를 선택적으로 비보호(deprotection)함으로써 행하여진다. 출발물질 dA가 분산되는 용매는 비양성자성 용매이며, 바람직하게는 가능한한 무수물인 것이다. 상기 방법의 바람직한 구현에서, dA 모노하이드레이트(dA·H₂O)는 톨루엔에 트리에틸아민(TEA)의 약 x당량(equivalents)으로 용해된다. TEA의 x eq.에서, 7eq는 화학적 반응에서 생성된 아세트산을 중화하며, 3eq는 다소의 염기성 환경을 확실시 하기 위한 반응혼합물에 대한 버퍼이다. 반응을 약 15∼30℃, 바람직하게는 약 20∼25℃의 비교적 저온으로 유지하면서, 약 2-4eq.의 아세트산 무수물이 서서히 첨가된다. 상기 아세트산 무수물은 활성 OH 및 히드록시자리에 선택적으로 반응한다. 상기 반응은 모든 dA가 소비될 때까지 TLC 및/또는 HPLC로 모니터된다. 미반응된 모든 무수물을 소비하도록 반응은 소디움 비카보네이트와 같은 수성 약염기로 종결(quench)된다.

다음 단계는 미반응 외향고리(exocyclic) 아미노기를 아실화하기위한 분리없이 O-아실화 화합물을 함유하는 유기 반응혼합물을 사용하는 것이다. 전형적인 dA 보호기는 벤조일이며, 다른 무수물이 N-아실 반응에 또한 사용될 수도 있으나, N-아실 보호기가 본 발명의 방법에 바람직한 것이다. N-아실화 조건은 반응온도를 약 75∼95℃, 바람직하게는 약 80∼90℃ 그리고 가장 바람직하게는 약 83∼88℃로 유지하여야 함으로, 선행하는 O-아실화 반응에 비하여 가혹하다. 상기 반응은 온도가 낮을수록 느리며, 이로 인한 불완전한 반응은 산물이 미반응 출발물질로 오염될 수 있다. 반응완료를 확실시 하기 위해, 반응혼합물은 출발물질의 완전한 반응 및 모든 부분 아실화된 중간체의 최종 트리-아실화 산물로의 전환을 확실시하도록 모니터된다. NMR, UV, IR 및 다양한 크로마토그래피를 포함하는 다양한 모니터 수단이 사용될 수 있다. 바람직한 모니터 수단은 고압액체 크로마토그래피(HPLC)이다.

첫번째 무수물반응에서, 무수물은 dA와 반응시 벤조산과 같은 유기산 부산물이 생성된다. 이와 같은 경우에, 산 부산물은 반드시 중화되어야 하며, 혹은 이는 뉴클레오시드의 분해를 야기할 수 있다. 따라서, 산 스캐빈져가 바람직하게 반응 혼합물에 포함된다. 바람직한 산 스캐빈져는 산과 염을 형성하는 3차 아민이며, 특히 바람직한 삼차 아민은 트리에틸아민(TEA)이다. 다른 적합한 3차 아민으로는 일반식 N(R)₃의 어떠한 트리-알킬 아민을 포함하며, 식중 R은 같거나 혹은 다른 C1 내지 C6 알킬기이다. TEA뿐만 아니라, 이와같은 트리-알킬 아민으로는 트리메틸아민,트리프로필아민 및 디-이소프로필-모노에틸 아민(DIPEA)을 포함한다. 다른 적합한 3차 아민으로는 트리에탄올아민을 포함한다.

그 후, 아세틸화된 히드록시기는 비보호되고(deprotected) 가수분해에 의해 이들 본래의 히드록실 형태로 복원된다. 상기 가수분해반응은 아미노 부위는 벤조일화된 상태를 유지하면서, 히드록시 부위를 선택적으로 비보호한다. 바람직한 가수분해 방법은 먼저, 아세틸기를 제거하고 N-벤조일 dA의 소디움염을 형성하도록 상기 비보호된 dA를 메탄올 소디움 메톡사이드와 같은 알코올 알콕사이드로 처리함으로써 달성된다. 수성 버퍼 염용액, 바람직하게는 트리에틸 아민 하이드로클로라이드와 같은 3차 아민 산 부가염의 수용액으로 후속적으로 처리함으로써 dG 소디움 히드록시염이 본래의 히드록기로 전환된다. 상기 비보호된(deprotected) N-벤조일 dA는 반응 혼합물의 유기상에서 분리되며, 상기 상(phase)은 5'-O-보호된 N-벤조일 dA 를 형성하도록 후속적인 사용을 위해 분리 및 건조된다.

본 발명에 따른 아실화에 의해 보호된 외향고리 아미노기를 갖는 피리딘-이 없는 디옥시리보뉴클레오시드가 상기 피디린 무함유 공정에서 기술한 바와 같이 5'-보호된 디옥시리보뉴클레오시드의 형성에 사용될 수 있다. 상기 공정에서, 디옥시리보뉴클레오시드의 5'-히드록시기가 보호되고 보호된 산물은 정제되고 용액에서 고형분으로 분리된다. 정제 및 고형화는 보호된 뉴클레오시드 산물이 물에 불용성이며, 선택된 극성 및 비-극성 용매에는 가용성이라는 점을 이용한 액체-액체 추출단계를 포함한다.

따라서, a) 본 발명의 따라 제조된 출발물질인 디옥시리보뉴클레오시드를 출발물질인 디옥시리보뉴클레오시드, 5'-보호된 디옥시리보뉴클레오시드 및 다른 반응물에 대하여 비활성인 극성, 비양성자성 용매에 용해시키는 단계, 이 때 출발물질인 디옥시리보뉴클레오시드의 어떠한 외향고리 아미노기가 보호, 바람직하게는 아실보호되며;

b) 용액중의 출발물질인 디옥시리보뉴클레오시드와 보호 반응물 반응시켜 5'-보호된 디옥시리보뉴클레오시드 산물을 형성하는 단계;

c)혼화되지 않는 극성 및 비-극성 용매 시스템을 사용하는 하나 또는 그 이상의 액체-액체 추출로 극성 불순물을 제거하는 단계, 이때 산물은 우선적으로 비-극성 상에 분배되고 불순물은 우선적으로 극성상에 분배되며; 및

d) 비-극성 불순물은 용액중에 남고, 산물을 용액으로 부터 고형화되어 비-극성 불순물을 제거하는 단계;

를 포함하는 본질적으로 순수한 5'-보호된 디옥시리보뉴클레오시드를 제조하는 개선된 방법이 제공된다.

단계 (a)에서, 출발물질인 디옥시리보뉴클레오시드는 이미 보호된 외향고리 아미노기를 갖는 것일 수 있다. 외향고리 아미노기의 보호는 상기한 본 발명의 아실화보호공정으로 행하여질 수 있다. 보호하려는 뉴클레오시드는 극성, 비양성자성유기용매에 용해된다. 상기 단계에 사용하기 적합한 극성, 비양성자성 용매의 예로는 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드 및 N-메틸-피롤리돈과 같은 아미드 뿐만아니라, 디메틸술폭사이드(DMSO), 디메틸술폰 및 헥사메틸포스페이트(HMPA)를 포함한다. DMF가 특히 바람직한 것이다. 상기한 이유로 인하여, 피리딘은 본 발명의 방법에 용매로 사용되지 않는다.

단계 (b)에서, 디옥시리보뉴클레오시드의 5'-히드록시기를 선택적으로 보호하는 보호 반응물이 출발물질인 디옥시리보뉴클레오시드 용액에 첨가된다. 상기 보호 반응물은 3' 히드록시기에 비하여 5' 히드록시로기와 우선적으로 반응하여 5' 위치에 제거가능한 보호기를 형성한다. 상기 히드록시기를 보호하는 바람직한 방법은 "트리틸화(tritylation)"로 불리는 방법으로 트리틸 유도 화합물(trityl derivative compound)을 형성하는 것이다. 바람직한 보호기는 트리틸, 메톡시트리틸 및 디메톡시트리틸기이다. 바람직한 보호반응물은 트리틸 클로라이드 및 치환된 트리틸 클로라이드이다. 예를들어, 디메톡시트리틸 클로라이드(DMT-Cl)는 후술하는 실시예에 사용된다. 트리틸화 반응도중, 3'-히드록시기가 미반응된 상태로 유지되어야 한다. 후속적인 올리고뉴클레오티드 합성도중 5' 및 3' 위치가 선택적으로 결합되도록 하는 것이 필요하다. 상기 트리틸화 반응은 바람직하게 약 -10∼40℃, 보다 바람직하게는 약 10∼25℃ 범위의 온도에서 행해진다.

트리틸 클로라이드 혹은 치환된 트리틸 클로라이드와 같은 보호 반응물은 뉴클레오시트와 반응시 산 부산물을 생성한다. 이와 같은 경우에, 산 부산물은 반드시 중화되어야 하며, 혹은 이는 뉴클레오시드의 분해를 야기할 수 있다. 따라서, 산 스캐빈져가 바람직하게 반응 혼합물에 포함된다. 바람직하게 산 스케빈져는 트리틸화제에 대하여 약 1:1∼1:3의 몰비로 존재한다. 바람직한 산 스캐빈져는 산과 염을 형성하는 3차 아민이다. 특히 바람직한 삼차 아민은 트리에틸아민(TEA)이다. 다른 적합한 3차 아민으로는 일반식 N(R)₃의 어떠한 트리-알킬 아민을 포함하며, 식중 R은 같거나 혹은 다른 C1 내지 C6 알킬기이다. TEA뿐만 아니라, 이와같은 트리-알킬 아민으로는 트리메틸아민, 트리프로필아민 및 디-이소프로필-모노에틸 아민(DIPEA)을 포함한다. 다른 적합한 3차 아민으로는 트리에탄올아민을 포함한다. 본 발명의 방법에 피리딘이 용매로 사용되지는 않으나,소량의 피리딘이 산 스케빈져로 사용될 수 있다. 소량으로 사용되는 경우, 피리딘은 다른 불순물을 갖는 생산물로 부터 정제될 수 있다.

극성 용매 및 산 스케빈져는 이들이 노출되는 출발물질인 뉴클레오시드, 반응물 및 뉴클레오시드 산물와 화학적으로 혼화가능한 것이어야 한다. 이들은 또한, 반응물과 뉴클레오시드와의 반응을 불리하게 방해하지 않아야 한다.

트리틸화에 사용되는 DMT-Cl의 물에 대하여 반응성이 큼으로, 트리틸화에 관련되는 모든 물질은 무수물이어야 한다. 본 발명의 바람직한 아실화방법에서, Bz-dA는 TMS-일시적인 보호 아실화반응(TMS-transient protection acylation reactions)에서 물을 포착하고 따라서 탈수하여야 한다. 물이 수화물 형태로 존재할 수 있음으로, 일반적인 열건조 및 진공건조기술은 이들 물질에 함유되어 있는 물을 제거하기에는 충분하지 않다. 본 발명의 다른 견지에 있어서, Bz-dA에서 물을 제거하기에 효과적인 공비 탈수공정이 개발되었다.

본 발명의 공비탈수공정은 보호반응물을 첨가하기전에 극성 비양성자성 용매에 용해된 출발물질인 디옥시리보스뉴클레오시드 용액에 적용된다. 탈수 공정은 물및 극성 비양성자성 용매와 공비물을 형성하는 단계(a)의 용액에 탈수 용매를 첨가하는 단계 및 상기 혼합물로 부터 공비물을 증류하는 단계를 포함한다. 극성 비양성자성 용매 디메틸포름아미드(DMF)중의 디옥시리보뉴클레오시드 출발용액에 대한, 적합한 탈수 용매로는 하나 또는 그 이상의 C5 내지 C10 탄화수소를 포함하며, 이는 선형, 분지형 혹은 고리형일 수 있으며, 치환되거나 혹은 비치환된 것일 수 있다. 바람직한 탈수 용매로는 펜탄, 헥산, 톨루엔 및 헵탄, 특히 헥산을 포함한다. 또한, 공비탈수 단계도중에 아실화된 뉴클레오시드를 안정화하기 위해 소량의 TEA와 같은 3차 아민을 포함하는 것이 바람직하다.

보호 반응물은 온도 및 첨가속도의 제어된 조건하에서 출발물질인 디옥시리보뉴클레오시드 용액에 첨가된다. 반응의 진행은 HPLC 분석으로 모니터된다. 모니터 목적은 너무 많은 과-트리틸화 불순물의 발생없이 전환을 제어 및 최적화하기위한 것이다. 상기 반응은 최적 지점에 도달하는 경우, 물을 첨가하여 종결(quench)된다.

피리딘 보다 극성 비양자성 용매에 용해된 출발 디옥시리보뉴클레오시드를 트리틸화하는 부가적인 장점은 촉매의 사용이 요구되지 않는다는 것이다. 상기된 바와 같이, 일반적으로 피리딘에서의 트리틸화는 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)과 같은 촉매의 사용이 요구되며, 이는 매우 고가의 독성물질이며, 최종 산물로부터 분리하기 어렵다.

단계 (c)는 산물에서 극성 불순물을 제거하는 정제 단계이다. 상기 보호된 뉴클레오시드의 용액은 최종 뉴클레오시드 산물에서 제거되어야 하는 극성 및 비극성 불순물을 불가피하게 함유한다. 상기한 바와 같이, 최종 산물은 최소 약 98중량%, 바람직하게는 최소 약 99중량%, 보다 바람직하게는 최소 약 99.5중량% 순수해야 한다. 제거가 요구되는 극성 불순물로는 수산화기 보호제와 반응하지 않거나 두개의 아실 보호기(비스-아실화 산물로 명시됨)를 가질 수 있는 아미노-보호된 뉴클레오시드이다. 제거가 요구되는 비-극성 불순물로는 두개의 트리틸 보호기 및 DMT-Cl로 부터 유도되는 불순물을 함유하는 비스-트리틸화된 물질이다. 그 극성이 원하는 보호된 뉴클레오시드의 것과 상대적으로 유사하기 때문에 제거하기 어려운 불순물이 되는 경향이 있다.

극성 불순물은 액체-액체 추출 방법에 의해 보호된 뉴클레오시드 산물의 용액으로부터 제거되며, 이는 극성 용매 시스템에서 보호된 뉴클레오시드 및 극성 불순물 사이의 용해도가 다른 장점이 있다. 일반적으로 보호된 뉴클레오시드는 물 및 염기성 수성 염용액에서 불용성이며, 극성 불순물의 대부분이 물 혹은 이러한 용액에 가용성이다. 그러므로, 물 혹은 바람직하게 물 및 가용성 카보네이트 혹은 바이카보네이트 염과 같은 염기성 염의 수용액이 보호된 뉴클레오시드 산물로부터 극성 불순물의 추출에 사용될 수 있다. 물 혹은 염기성 수용액을 극성 비양자성 용매에 용해된 초기 산물 용액에 첨가함으로써, 상기 보호된 뉴클레오시드는 비-극성 상으로 유지되며, 극성 불순물의 대부분이 상기 극성 상에 남게된다. 바람직한 염기성 염은 소디움 및 포타슘 카보네이트 및 바이카보네이트, 특히 소디움 바이카보네이트를 포함한다. 바람직하게, 상기 염기성 수성 염용액은 약 1~10중량%, 바람직하게는 약 2~5중량%의 염을 함유한다. 또한, 클로로포름 및 1,2-디클로로에탄과 같은 다른 할로겐화된 용매가 비-극성 용매로서 사용될 수 있다. 상기 비-극성 용매에 용해된 산물 용액은 보다 높은 순도 수준을 달성하기 위하여 물 혹은 염기성 수용액과 함께 이러한 방식으로 반복적으로 추출될 수 있다. 약 1~10중량%의 NaHCO₃, 바람직하게는 약 2~5중량%, 및 약 0~40%의 DMF를 포함하는 수용액이 극성 불순물의 제거에 적합하다는 것을 발견하였다. 상기 극성 용매 시스템은 비-극성상과 혼합된 후에, 상기 혼합물이 침전되도록 하여 분리한다. 원하는 보호된 산물은 비극성 상에 남게되며, 원하지 않는 극성 불순물은 극성상으로 분리된다. 상기 방법은 극성불순물을 제거하고 원하는 산물 순도를 얻기 위하여 필요에 따라 여러번 반복될 수 있다.

이러한 극성 용매 시스템은 모든 혹은 대부분의 극성 불순물을 선택적으로 추출한다. 부가적인 극성 불순물을 제거하기 위하여, 결과 산물 용액은 임의로 활성화 탄소와 같은 적합한 흡착제와 부가처리될 수 있다. 실리카, 알루미나, 및 분자체와 같은 다른 적합한 흡착제가 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 극성 불순물이 원하는 수준 이하인 경우, 상기 흡착된 불순물을 갖는 흡착제는 여과로 쉽게 제거될 수 있다. 이는 보호된 dA 산물의 정제에서는 바람직한 단계일 수 있으나, dG의 정제에서는 불필요한 것으로 고려되었다.

단계 (d)에서, 상기 산물은 산물을 부가 정제하는 방법으로, 용액으로부터 고체화된다. 상기 산물은 결정형 산물인 경우에는 결정화로, 무정형 산물인 경우에는 침전으로, 결정형 및 무정형 고형분 모두를 형성하는 산물의 경우에는 결정화 및 침전의 혼합으로 용액을 고체화시킬 수 있다. 이에 따라, 용어 고체화는 고형분 산물이 용액에서 석출되는 결정화, 침전 및 이들의 혼합 방법을 포함하는 것으로 의도된다.

고체화는 비-극성 용매 혹은 극성 용매의 사용에 의해 영향을 받을 수 있다. 비-극성 용매 고체화에서, 용해된 산물을 함유하는 비-극성상은 산물이 비-극성 상에서 결정형 산물을 결정화하거나 혹은 무정형 산물을 침전시키는 효과정인 양으로 불용성인 혼화 가능한 용매와 혼합된다. 결정화의 경우에, 바람직하게, 산물이 불용성인 혼화가능한 용매가 산물 용액에 천천히 첨가된다. 침전의 경우에, 바람직하게, 산물 용액이 산물이 불용성인 혼화가능한 용매에 천천히 첨가된다.

고체화가 극성 용매에서 수행되는 경우, 산물은 극성 용매에서 유지, 이동 혹은 재-용해되며, 물과 혼화가능한 극성 용매를 포함한다. 존재하는 보호된 뉴클레오시드는 물에서 모두 불용성이기 때문에, 물은 극성상으로부터 산물을 고형화시키는데 사용될 수 있다. 극성상으로부터 산물을 고형화하기 위하여, 용해된 산물을 함유하는 극성상은 산물이 용액에서 고형화되기에 효과적인 적합한 물의 양과 혼합될 수 있다. 물은 극성상에 첨가될 수 있거나 혹은 극성상이 물에 첨가될 수 있다.

많은 극성 용매가 고형화 방법의 사용에 적합하다. 산물용의 물 및 용매와 혼화될 뿐만 아니라, 또한 극성 용매는 산물에 비활성이어야 한다. 바람직하게, 상기 극성 용매는 증발로 후속적인 제거가 용이한 물의 끓는 점, 100℃ 미만의 끓는점을 갖는다. 적합한 용매는 아세토니트릴, 아세톤, 및 저급(C₁-C₃) 알콜, 특히 메탄올을 포함한다.

산물이 비-극성 용매에서 고형화되는 경우, 결정화는 비-극성 불순물의 대부분을 효과적으로 제거한다. 상기 비-극성 불순물은 산물이 용액에서 결정화됨에 따라 비-극성 용매에서 용해된채 남게된다. 이러한 결정화 방법은 바람직하게 Bz-DMT-dA와 함께 사용된다. 그러나, 상기 산물이 무정형으로 침전에 의해 고형화되는 경우, 부가적인 정제가 비-극성 불순물의 제거에 필요한 것을 알게되었다. 이러한 경우에, 액체-액체 추출의 추가 단계가 비-극성 불순물의 제거에 사용된다. 이러한 방법은 무정형 고형분을 형성하는 보호된 뉴클레오시드와 함께 사용되는 것이 바람직하며, iB-DMT-dG와 함께 사용되는 경우에도 바람직하였다. 비-극성 불순물의 제거를 위한 액체-액체 추출에서, 조질 산물은 가용성인 극성 상에서 분리된다. DMF 및 물의 혼합물은 이러한 산물의 액체-액체 추출 정제에서 바람직하게 사용된다. 그 후, 상기 불순물은 비극성 용매 혹은 비-극성 용매 시스템과 함께 추출된다. 비-극성 용매는 비-극성 불순물용 용매여야 하나, 뉴클레오시드용은 아니다. 또한, 극성상 및 비-극성상 시스템은 서로 혼화되지 않아야 한다. 이는 비-극성 불순물이 비-극성 용매상에 분배를 유발하며, 극성 용매상에서 대부분의 산물이 유지된다. 그 후, 비-극성 불순물은 상분리로 제거될 수 있다. 방향족 탄화수소 및 지방족 탄화수소의 혼합물이 비-극성 용매 시스템에 적합하며, 특히 헤테로원자를 갖는 혹은 헤테로원자가 없는 약 6~12개의 탄소원자를 함유하는 것이 바람직하다. 메틸 t-부틸에테르(MTBE) 및 톨루엔의 혼합물이 바람직한 조성물이긴 하나, 큐멘 및 헥산의 혼합물이 적합하다. 바람직하게, 상기 혼합물은 약 10~90부피부의 방향족 : 약 90~10부피부의 지방족, 보다 바람직하게는, 약 1~3부피부의 방향족 : 1부피부의 지방족을 포함하며, 특히 약 1부피부의 방향족 : 1부피부의 지방족이 바람직하다.

침전 혹은 결정화로 용액에서 산물을 고형화하기 위하여, 산물이 분리되고, 극성 불순물이 제거된 상기 극성 비양자성 상은 산물이 불용성인 비혼화성 비-극성 용매와 혼합된다. 광범위한 용매가 이러한 목적을 위하여 사용될 수 있으며, 비-극성 상 및 비-극성 용매는 서로 혼화된다. 결정화 산물의 경우에, 상기 비-극성 용매는 산물을 포함하는 비-극성상에 천천히 첨가되는 것이 바람직하다. 이는 산물의 결정화를 유발하며, 비-극성 불순물은 모액에서 유지된다. 무정형 산물의 경우에, 상기 산물을 포함하는 비-극성 상은 비-극성 용매에 천천히 첨가되는 것이 바람직하다. 이는 산물의 침전을 유발하며, 상기 비-극성 불순물은 용액에서 유지된다.

고형화 방법은 고형분 형태가 무정형인 경우에 침전 및 고형분 형태가 결정인 경우에 결정화가 고려된다. 이러한 방법의 사용으로, 필요에 따라 방법이 반복되며, 필수적으로 순수한 보호된 뉴클레오시드가 크로마토그래피 사용없이 그리고 용매로서 피리딘 및 촉매로서 DMAP의 사용없이 얻어진다. 또한, 상기 방법은 어떠한 원하는 스케일로 쉽게 스케일이 증가될 수 있다. 이러한 적용의 목적을 위하여, 필수적으로 순수한 뉴클레오시드는 순도가 약 98중량% 이상, 바람직하게는 순도가 약 99중량% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 순도가 약 99.5중량% 이상인 것이다.

본 발명의 방법은 피리딘이 공정 용매로서 사용되는 종래의 방법에 비하여 많은 장점을 제공한다. 본 발명의 방법에서 사용되는 극성 비양자성 용매는 피리딘보다 뉴클레오시드용 용매로 보다 우수하며, 반응은 훨씬 높은 뉴클레오시드 농도로 실행될 수 있다. 이에 따라, 보다 높은 부피 효율성이 얻어진다. 상기된 바와 같이, 본 발명의 방법은 매우 독성 물질인 피리딘 및 DMAP의 사용을 제거하거나 혹은 최소로 감소시킨다. 추출, 흡착 및 침전/결정화를 포함하는 본 발명의 정제 방법 단계는 일반적인 조작이며, 크로마토그래피보다 효율적이며 비용이 덜든다. 본 발명의 방법의 간단함과 다른 개선으로 인해서, 산물의 총 수득율이 또한 증가된다. 나아가, 이러한 개선으로 보호된 뉴클레오시드의 처리비용이 충분히 낮아진다. 마지막으로 새로운 방법은 산업적 요구를 만족하는 어떠한 바람직한 스케일로 칭량가능하다.

반응도 1은 디옥시아데노신 유리-염기로부터 직접적인 아실화 보호와 함께 N⁶-벤조일-5'-O-(4,4-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신을 제조 방법의 바람직한 대표도이다. 디옥시아데노신 유리-염기는 아세트산 무수물과 혼합되어 일시적으로 O-보호된 dA를 형성한 다음 N-벤조일화된다. 그 후, 도 1에서와 같이 이 물질은 가수분해되어 N-벤조일 화합물을 형성하며, DMT-Cl의 첨가로 트리틸화되어 최종 보호된 산물 N⁶-벤조일-5'-O-(4,4-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신을 형성한다.

반응도 2는 디옥시구아노신으로부터 보호된 5'-O-디메톡시트리틸 N²-이소부티릴-2'-디옥시구아노신 제조방법의 바람직한 대표도를 나타낸다. 이러한 경우에,dG는 이소부티르산 무수물과 트리-아실화된 다음 선택적으로 O-탈보호가 된다. 도 2에서와 같이, 그 후, N-부티릴 dG 물질은 DMT-Cl의 첨가로 트리틸화되어 보호된 산물 5'-O-디메톡시트리틸 N²-이소부티릴-2'-디옥시구아노신을 형성한다.

다음 실시예에서, dA의 고형분 보호된 형태는 결정 구조이며, 따라서 결정화에 의해 용액으로부터 고형화된다. 반면에, dG는 무정형이며 따라서 침전으로 고형화된다. 일반적으로, 결정화 방법이 원하는 수준으로 비-극성 불순물의 수준을 성공적으로 감소시킨다. 다른 뉴클레오시드의 처리에 있어서 다른 특정한 단계가 다음 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명될 것이다.

본 발명은 N-아실 디옥시아데노신 또는 N-아실 디옥시구아닌의 N-아실 디옥시뉴클레오시드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 디옥시뉴클레오시드 상의 하이드록실기와 외향고리의 아미노기를 무수물로 아실화하여 3'-, 5'-아실, N-아실 디옥시뉴클레오시드를 형성한 다음, 하이드록실기로부터 아실기를 선택적으로 제거하여 N-아실 디옥시아데노신 또는 N-아실 디옥시구아노신을 형성하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 방법은 3'- 및 5'-하이드록실기와 외향고리의 아미노기를 포함하는 디옥시뉴클레오시드의 N-아실 유도체를 제조하는 것으로서 디옥시뉴클레오시드는 디옥시아데노신 또는 디옥시구아노신이며, 다음의 단계를 포함한다:

(1) 상기 디옥시뉴클레오시드를 상기 하이드록실기를 선택적으로 아실화하는데 효과적인 조건에서 제 1 무수물과 반응시키는 단계;

(2) 상기 (1) 단계의 3'-, 5'-O-아실화 산물을 상기 제 1차 아미노기를 아실화하기에 효과적인 조건에서 제 2 무수물과 반응시켜 N-아실화, 3'-,5'-O-아실화 디옥시뉴클레오시드를 형성하는 단계;

(3) 상기 N-아실화, O-아실화 디옥시뉴클레오시드를 상기 O-아실기를 선택적으로 제거하기에 효과적인 조건으로 하여 N-아실 디옥시뉴클레오시드를 형성하는 단계.

본 발명은 디옥시아데노신이나 디옥시구아노신에 포함된 외향고리의 아미노 기와 5'-하이드록실기의 보호를 위한 3'- 및 5'-하이드록실기의 일시적인 보호와, 상기 아미노기의 아실화, 상기 하이드록실기의 보호 및 5'-하이드록실기의 비-일시적인 보호를 포함하는 공정에서, 상기 디옥시뉴클레오시드 하이드록실기의 선택적 일시적 아실화, 외향고리의 아미노기의 아실화 및 O-아실 보호기들의 선택적 제거를 포함하는데 개선 사항이 있다.

본 발명을 실시함에 있어 종래에 기술된 방법을 이용하는 것 보다 간단한 공정과 고수율을 제공하는 종래의 피리딘-유리 뉴클레오시드 합성 방법에 있어 예측치 못한 향상점이 있다.

다음 실시예에서, 뉴클레오시드 디옥시아데노신(dA) 및 디옥시구아노신(dG)의 보호된 형태가 본 발명의 방법에 따라 제조된다.

실시예 1 - 5'-O-디메톡시트리틸 N ² -이소부티릴-2'-디옥시구아노신

단계(1a): N²-, 3'-O, 5'-O-트리-이소부티릴 디옥시구아노신

디옥시구아노신(dG) 모노하이드레이트 200g(0.70mol), 이소부티르산 무수물 480g(3.03mol, dG를 기준으로 4.33eq), TEA 353g(3.5mol, dG를 기준으로 5.0eq) 및 DMF 1.0L의 혼합물을 약 75~80℃로 가열하고 질소하에서 교반한다. 반응을 HPLC를사용하여 모니터하고 샘플을 매 30분마다 취한다. 약 4시간 후에, 추가량의 이소부티르산 무수물을 반응 혼합물에 첨가하여 dG 및 iB-dG 수준을 3%(부분(area)%) 이하로 낮춘다. 상기 혼합된 dG 및 iB-dG 수준을 3% 미만으로 낮출때, 반응을 5% NaHCO₃용액 1.5L로 종결한다. 종결된 혼합물을 약 30분간 교반하고 25℃로 냉각하고 메틸렌클로라이드(3X0.5L)로 추출한다. 메틸렌클로라이드 추출물을 합하고 5% NaHCO₃용액(3 X 1L)로 헹구고 유기상을 분리하고 공비증류로 탈수한다. 탈수된 유기상을 다음 단계에 그대로 사용한다.

단계(1b): N-이소부티릴 디옥시구아노신

소디움 메톡사이드의 냉각된 25% 메탄올계 용액(76g, 0.35mol, dG를 기준으로 0.5eq)을 메탄올 2.0L로 희석된 단계 (1a)의 탈수된 유기상의 냉각된 혼합물에 천천히 첨가한다. 혼합물의 온도를 첨가도중 및 탈보호 반응 진행도중에 -15℃이하로 유지한다. 샘플을 매 30분마다 취한다. 추가의 NaOCH₃를 사용하여 반응의 진행을 유지하고 혼합된 디- 및 트리아실화된 dG 수준을 3% 이하로 낮춘다. 반응의 완료시, 트리에틸암모늄클로라이드 100g(0.7mol, dG를 기준으로 1eq)을 혼합물에 첨가하고 -15℃에서 30분동안 교반하고 20℃로 승온시키고 추가 시간동안(20℃에서) 교반한다. DMF 2.0L를 혼합물에 첨가하고 80℃의 주위 압력에서 증류하여 메탄올, 메틸렌클로라이드, 메틸이소부티레이트, 트리에틸아민, 및 다른 저-용융 성분을 제거한다. 더 이상의 증류물이 수집되지 않을 때, 헥산 2.0L를 혼합물에 첨가하고 이를다시 공비 증류하여 어떠한 잔류 메탄올을 제거한다.

단계 (2): 5'-O-디메톡시트리틸 N²-이소부티릴-2'-디옥시구아노신

98% DMT-Cl의 메틸렌클로라이드 용액 1.5L(285g; 0.84mol, dG를 기준으로 1.20eq)을 30분에 걸쳐 트리에틸아민(141g; 1.4mol, dG를 기준으로 2.0eq) 및 단계 (1b)의 유기 잔류물의 혼합물에 첨가한다. 상기 혼합물의 온도는 첨가 도중에 약 25℃로 제어되며, 상기 혼합물을 30분동안 25℃에서 교반한다. 상기 혼합물을 HPLC로 분석하고, 추가량의 DMT-Cl(고형분으로서)을 첨가하여 잔류하는 iB-dG수준을 3% 이하로 낮춘다. 혼합물을 3% NaHCO₃용액(1X5.0L), DMF 및 3% NaHCO₃용액(1:2, 2X5.0L)의 혼합물 및 3% NaHCO₃용액(2X5.0L)로 세척한다. 각각을 추출한 후에 유기상을 HPLC로 분석하고, MTBE 및 톨루엔(7L)의 50-50 혼합물과 합하고 약 30분동안 격렬하게 교반하고, 부가적으로 30분간 교반한 다음 여과한다. 여과 케이크는 진공 흡입으로 15분동안 건조되고, 메틸렌 클로라이드 2L에서 재용해되고 50-50 MTBE/톨루엔 7L로 재-침전되고, 물질의 순도가 99.3% 이상이 될때까지 여과과정을 반복한다. 건조 손실(LOD)를 통과할 때까지 습윤 케이크를 진공 오븐에서 건조한다. 전형적인 수득율은 75%이다.

실시예 2: N⁶-벤조일-5'-O-(4,4-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신의 제조

단계 (1a):3'-O, 5'-0-디아세틸-2'-디옥시아데노신

2'-디옥시아데노신 모노하이드레이트(dA)(454g), 톨루엔(5L), 무수 트리에틸아민(TEA)(860g) 및 아세트산 무수물(686g)의 혼합물을 질소하의 20℃에서 교반하고 합쳐진 잔류 dA 및 모노-아세틸화된 dA(두개의 이성질체)가 2% 미만이 될때까지 매 30분 마다 샘플링한다. 혼합물을 15℃로 냉각한다. 5% NaHCO₃용액 3L를 온도를 25℃이하로 유지하면서 첨가한다. 혼합물을 30분동안 25℃에서 교반하여 과량의 아세트산 무수물을 가수분해한다. 혼합물을 침전시키고 하부상을 제거한다. 5% NaHCO₃용액 3L를 유기상에 첨가하고 상기 상을 혼합하고 TEA 0.2L 및 헥산 2L를 합한다. 혼합물을 70℃로 가열하고 헥산 및 잔류 물을 스트립한다. 물함량이 0.2% 보다 낮아질 때까지 Karl-Fisher 적정으로 공정을 유지한다. O-아세틸화된 산물이 다음 단계에서 그대로 사용된다.

단계(1b): N⁶-벤조일-3'-O, 5'-디아세틸-2'-디옥시아데노신

단계 (1a)에서 얻어진 건조된 유기상을 TEA(330g) 및 벤조산 무수물(Bn₂O)(570g)과 합하고 질소하의 85℃에서 교반하고 벤조일화가 완료될 때까지(잔류 2Ac-dA <2%) 시간을 기준으로 샘플화하고 45℃로 냉각한다. 5% NaHCO₃용액(4L)를 반응 혼합물에 첨가하고 온도를 45℃ 이하로 유지한다. 첨가완료에 따라, 혼합물을 45℃에서 1시간동안 교반하여 잔류성 Bn₂O를 가수분해하고 상을 분리시킨다. 유기상을 분리하고 1% NaHCO₃용액(2X5.0L)로 세척하여 모든 수-용성 성분을 제거한다.

단계(1c): N⁶-벤조일-2'-디옥시아데노신

메탄올계 NaOCH₃용액(25%; 362g)을 단계 (1b)에서 얻어진 세척된 유기상 및 메탄올(2L)의 냉각된 혼합물에 첨가하고 온도를 -13℃ 이하로 유지한다. 첨가완료시에, 혼합물을 -15℃에서 교반하고 반응이 완료될때까지 매 30분마다 샘플화하고 추가의 NaOCH₃용액을 필요에 따라 보충한다. 반응을 10% TEA-HCL 4L로 종결하고 20분동안 0℃에서 교반하고 온도를 70℃로 올린다. 모든 고형분이 용해되면, 혼합물을 침전시키고 수성상을 제거한다. 유기상을 70℃에서 1% NaHCO₃3L로 세척하고 수성상을 제거하고 유기상을 증류하여 감압하의 70℃에서 3L의 톨루엔상을 제거한다. 잔류물을 TEA(450g), DMF(3L)로 희석하고, 20℃로 냉각하고 다음 단계에 그대로 사용된다.

단계(2): N⁶-벤조일-5'-O-(4,4-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신

DMT-Cl의 메틸렌클로라이드 용액(CH₂Cl₂3L에 용해된 683g)을 단계 (1c)에서 얻어진 희석된 유기상에 첨가하고, 혼합물 온도를 25℃이하로 유지한다. 첨가 완료시, 혼합물을 25℃에서 교반하고 잔류 Bz-dA가 5%(부분) 미만이 될때까지 매 30분마다 샘플화한다. 적합한 양의 추가 DMT-Cl이 필요에 따라 혼합물에 첨가된다. 원하는 전환이 수행되면, 혼합물을 5% NaHCO₃(4L) 용액으로 종결한다. 유기상을 DMF 및 5% NaHCO₃용액(1:3, 매번 4L)으로 세척한 다음 다시 5% NaHCO₃용액(4L)로 세척한다. 세척된 유기물을 격렬한 교반과 함께 3L의 MTBE-헥산 혼합물(1:1)과 점차적으로 합한다. 첨가완료시, 혼합물을 5℃로 냉각하고 온화한 교반속도로 교반하여 핵생성을 수행한다. 혼합물이 슬러리로 변하면, 2L의 헥산을 첨가하고 결과 혼합물을 5℃에서 2시간동안 교반한다. 고형분을 여과하고, 4L의 MTBE-헥산 혼합물(1:1)로 세척하고, 잔류 용매 수준이 15%보다 낮아질 때까지 진공건조한다(GC로). 고형분을 2L의 CH₂Cl₂에 재-용해하고, 상기 산물을 7L의 MTBE-헥산 혼합물을 천천히 첨가하여 재-침전시킨다. 혼합물을 5℃로 냉각하고 고형분을 여과한다. 여과 단계를 순도가 99.0% 이상이 될때까지 반복한다. 물질을 LOD를 통과할 때까지 50℃의 진공 오븐에서 건조한다. 총 수득율은 65%이다.

Claims (14)

1. 3'-, 5'- O-아실, N-아실 디옥시뉴클레오시드를 형성하도록 무수물로 디옥시뉴클레오시드상의 히드록시기 및 외향고리 아미노기를 아실화하는 단계; 및

   N-아실 디옥시아데노신 혹은 N-아실 디옥시구아노신을 형성하도록 히드록시기로 부터 아실기를 선택적으로 제거하는 단계;

   를 포함하는 N-아실 디옥시아데노신 혹은 N-아실 디옥시구아노신인 N-아실 디옥시뉴클레오시드 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 무수물은 알킬 무수물 혹은 알킬 무수물과 아릴 무수물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 알킬 무수물은 이소부티르산 무수물 혹은 아세트산 무수물임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 디옥시뉴클레오시드는 디옥시구아노신임을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 아실기는 친핵성 반응물을 사용하는 조건하에서 제거됨을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 조건은 무수 알콕사이드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5항에 있어서, 상기 조건은 무수 소디움 메톡사이드를 포함하며, 온도는 약 -25∼-10℃범위임을 특징으로 하는 방법.
8. (1) 디옥시뉴클레오시드를 히드록시기의 선택적인 아실화에 효과적인 조건하에서 제 1 무수물과 반응시키는 단계;

   (2) 상기 단계 (1)의 3'-, 5'-O-아실화 산물을 상기 1차 아미노기의 아실화에 효과적인 조건에서 제 2 무수물과 반응시켜 N-아실화, 3'-, 5'-O-아실화 디옥시뉴클레오시드를 형성하는 단계; 및

   (3) 상기 N-아실화, O-아실화 디옥시뉴클레오시드를 상기 O-아실기를 선택적으로 제거하기에 효과적인 조건에서 처리하여 디옥시뉴클레오시드가 디옥시아데노신 혹은 디옥시구아노신인 N-아실 디옥시뉴클레오시드를 형성하는 단계;

   를 포함하는 3'- 및 5'- 히드록시기 및 외향고리 아미노기를 갖는 디옥시뉴클레오시드의 N-아실 유도체 제조방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 디옥시뉴클레오시드는 디옥시아데노신임을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 제 1 무수물은 이소브티르산 무수물 혹은 아세트산 무수물임을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 제 2 무수물은 벤조산 무수물임을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 O-아실기는 무수 친핵성 조건하에서 선택적으로 제거됨을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 조건은 약 -25℃∼-10℃의 온도 범위에서 무수 알콕사이드를 사용함을 특징으로 하는 방법.
14. 3'-, 5'-히드록시기의 일시적인 보호(transient protection), 아미노기의 아실화, 히드록시기 보호의 선택적인 제거 및 5'-히드록시기의 비-일시적인(non-transient protection)보호를 포함하는 디옥시아데노신 혹은 디옥시구아노신에 함유되어 있는 외향고리 아미노기 및 5'-히드록시기의 보호방법에 있어서, 상기 디옥시뉴클레오시드 히드록시기의 선택적인 일시적인 아실화, 외향고리 아미노기의 아실화 및 O-아실 보호기의 선택적인 제거를 포함함을 특징으로 하는 방법.