KR20030074588A - 글리코실화 ｖｅｇｆ-ｂ 및 가용성 ｖｅｇｆ-ｂ 의 양을증가시키는 방법 - Google Patents

글리코실화 ｖｅｇｆ-ｂ 및 가용성 ｖｅｇｆ-ｂ 의 양을증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

N-글리코실화 VEGF-B 단백질, 이러한 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 이들을 함유하는 약학적 조성물 및 가용성 VEGF-B 단백질의 양을 증가시키는 방법. VEGF-B 단백질은 혈관신생을 자극하고 유지하는데 유용하다.

Description

글리코실화 ＶＥＧＦ-Ｂ 및 가용성 ＶＥＧＦ-Ｂ 의 양을 증가시키는 방법 {GLYCOSYLATED VEGF-B AND METHOD FOR INCREASING THE AMOUNT OF SOLUBLE VEGF-B}
본 발명은 VEGF-B의 N-글리코실화가 가용성 단백질의 증가를 유발시킨다는 발견에 관한 것이다.
포유류 혈관계의 2가지 주요 성분은 내피 및 평활근 세포이다. 내피세포는 포유류에 있는 모든 혈관 및 림프관의 내부 표면의 내막을 형성한다. 새로운 혈관의 형성은 2개의 상이한 과정인 혈관형성(vasculogenesis) 또는 혈관신생(ang-iogenesis)에 의해 발생할 수 있다(Risau W. Nature 386:671-674, 1997 참조). 혈관형성은, 초기 배아에서 일차 혈관총의 형성시 발생하는 것과 같이, 내피세포 전구체의 성숙한 내피세포로의 제자리 분화 및 맥관을 형성하기 위한 이들 세포의 회합을 특징으로 한다. 반대로, 이미 존재하고 있는 맥관의 성장 및 분기에 의한 혈관의 형성인 혈관신생은 나중의 배발생(embryogenesis)시 중요하며, 성인에서 발생하는 대부분의 혈관 성장의 원인이다. 혈관신생은 내피세포의 증식, 세포외 매트릭스의 퇴화, 맥관의 분기, 및 이어지는 세포 유착 사건을 포함하는 생리학적으로 복잡한 과정이다. 성인에서 혈관신생은 엄격하게 제어되며, 정상 환경하에서 여성 생식계에 제한된다. 그러나, 혈관신생은 조직 손상에 반응하여 스위치온될 수 있다. 또한, 고상 종양은 주변 조직에서 혈관신생을 유도할 수 있으며, 이로써 종양성장이 지속되고 전이(metastase)의 형성을 용이하게 한다(Folman J. Nature Med. 1:27-31, 1995). 복잡한 혈관신생 과정의 근원적인 분자 메카니즘은 조금도 이해되지 않고 있다.
또한, 혈관신생은 다수의 병리학적 상태에 연루되며, 이 경우 그것은 질환의 상이한 후유증에 어떤 역할을 하거나 또는 직접적으로 연루된다. 일부 예들은 다양한 간질환에 관련된 신혈관화, 당뇨병의 신혈관 후유증, 고혈압의 신혈관 후유증, 외상후 신혈관화, 두부외상으로 인한 신혈관화, 만성 간감염(예를 들어, 만성 간염)의 신혈관화, 화상 또는 동상으로 인한 신혈관화, 호르몬 과잉에 관련된 기능장애, 혈관종 생성, 및 혈관형성술후 재협착을 포함한다. 관절염에서, 새로운 모세혈관은 관절을 침투하여 연골을 파괴한다. 당뇨병에서, 망막의 신모세혈관은 유리체액에 침투하여 출혈과 소경을 유도한다(Folkman, J. and Shing, Y., J. Biol. Chem. 267: 10931-10934(1992)). 여러가지 질환에서 혈관신생 인자의 역할이 분명하게 확립되지 않았다.
너무나 많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 혈관신생의 결정적인 역할 때문에, 혈관신생의 제어에 연루된 인자들이 집중적으로 조사되었다. 다수의 성장인자가 혈관신생의 조절에 연루된다고 알려졌으며, 이것들은 섬유아세포 성장인자(FGF) , 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자 α(TGFα), 및 간세포 성장인자(HGF)를 포함한다. 예를 들어, 개관을 위해 Folkman 등, J. Biol. Chem., 267:10931-10934, 1992 참조.
내피세포-특이적 성장인자의 특정 패밀리인 혈관 내피 성장인자(VEGF), 및그것들의 상응하는 수용체가 내피세포 성장 및 분화의 자극 및 분화된 세포의 어떤 기능에 대한 일차적 원인이라는 것이 제안되었다. 이들 인자는 PDGF/VEGF 패밀리의 멤버이며, 내피 수용체 티로신 키나제(RTK)에 의하여 일차적으로 작용하는 것 같다. 성장인자의 PDGF/VEGF 패밀리는 성장인자의 시스틴-노트(knot) 수퍼패밀리에 속하며, 또한 이것은 뉴로트로핀 및 형질전환 성장인자-β를 포함한다.
8개의 상이한 단백질이 PDGF/VEGF 패밀리에서 확인되었는데, 즉 2개의 PDGF (A 및 B), VEGF, 및 VEGF에 밀접하게 관련된 5개 멤버이다. VEGF에 밀접하게 관련된 5개 멤버는 국제특허출원번호 WO 96/26736 및 루드빅 암연구소 및 헬싱키 대학에 의한 미국특허 5,840,693 및 5,607,918에 설명된 VEGF-B; Joukov 등 EMBO J., 15:290-298, 1996, Lee 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1988-1992, 1996, 및 휴먼 게놈 사이언스사에 의한 미국특허 5,932,540 및 5,935,540에 설명된 VEGF-C 또는 VEGF2; 국제특허출원 번호 PCT/US97/14696(WO 98/07832) 및 Achen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:548-553, 1998에 설명된 VEGF-D; Maglione 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9267-9271, 1991에 설명된 태반 성장인자(PlGF); 및 휴먼 게놈 사이언스사에 의한 국제특허출원 번호 PCT/US95/07283(WO 96/39421)에 설명된 VEGF3이다. 각 VEGF 패밀리 멤버는 그들의 VEGF 상동성 도메인(VHD)에서 VEGF 와 30% 내지 45% 아미노산 서열 동일성을 가진다. 이 VEGF 상동성 도메인은 시스테인-노트 모티프를 형성하는 8개의 보존성 시스테인 잔기를 함유한다. 그들의 활성, 생리적 상태에서 단백질은 단백질은 다이머이다. VEGF 패밀리의 기능적 특징은 내피세포 및 관련된 세포형태에 대한 분열촉진성 정도의 다양화, 혈관 투과성의 유도, 및 림프관형성 성질을 포함한다.
혈관 내피 성장인자(VEGF)는 몇몇 공급원으로부터 분리된 호모다이머 당단백질이다. VEGF는 내피세포에 대해 매우 특이적인 분열촉진 활성을 보인다. VEGF는 배혈관형성 동안 새로운 혈관의 형성에 있어서, 그리고 성인의 일생 동안 혈관신생에서 중요한 조절 기능을 가진다(Carmeliet 등, Nature, 380:435-439,(1996); Ferrara 등, Nature, 380:439-442,(1996); Ferrara 및 Davis-Smyth, Endocrine Rev., 18:4-25, (1997)에 개관됨). VEGF에 의해 수행되는 역할의 의의는 단일 VEGF 대립유전자의 비활성화가 맥관구조의 발생의 실패로 인해 배아 치사를 초래한다는 것을 나타낸 연구에서 증명되었다(Carmeliet 등 Nature 380:435-439,(1996); Ferrara 등 Nature, 380:439-442, (1996)). VEGF의 분리 및 특성이 검토되었다. Ferrara 등, J. Cellular Bioch em., 47:211-218, (1991) 및 Connolly, J. Cellular Biochem., 47:219-223, (1991) 참조.
게다가, VEGF는 단구를 향한 강한 화학유인성 활성을 가지며, 내피세포에서 플라스미노겐 활성인자 및 플라스미노겐 활성인자 저해인자를 유도할 수 있고, 또한 미세혈관 투과성을 유도할 수 있다. 후자의 활성 때문에, 그것은 때로 혈관투과인자(VPF)로 언급된다. 또한, VEGF는 어떤 조혈세포에 대해 주화성이다. 최근의 문헌은 VEGF가 수지상세포의 성숙을 차단함으로써 종양에 대한 면역반응의 유효성을 감소시킨다는 것을 나타낸다(많은 종양이 VEGF 를 분비한다)((Gabrilovich 등, Blood 92:4150-4166,(1998); Ga-brilovich 등, Clinical Cancer Research 5:2963-2970, (1999)).
혈관 내피 성장인자 B(VEGF-B)는 VEGF 와 유사한 혈관신생 특성 및 다른 특성을 가지지만, VEGF 와는 상이한 조직에 분포되어 발현된다. 특히, VEGF-B 는 심장에서 매우 강하게 발현되고, 폐에서 약하게만 발현되는 반면에, VEGF 의 경우는 그 반대이다(Olofsson, B. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2576-2581 (1996)). RT-PCR 분석은 흑색증, 정상 피부, 및 근육에서 VEGF-B mRNA 의 존재를 증명하였다. 이것은 VEGF 및 VEGF-B 가 많은 조직에서 함께 발현된다는 사실에도 불구하고, 기능상의 차이를 가질 수 있다는 것을 시사한다. 성장 인자의 PDGF/VEGF 패밀리의 비교는 VEGF-B 의 167 개의 아미노산 동형이 어떤 글리코실화도 완전하게 결여된 유일한 패밀리 멤버라는 것을 나타낸다. 유전자 타게팅 연구는 VEGF-B 결핍은 온화한 심장 표현형, 및 손상된 관상 혈관을 초래한다는 것을 증명하였다(Bellomo 등, Circ. Res. 86: E29-35 (2000)).
사람 VEGF-B 는 세포 레피노산 결합 단백질형 I(CRABP-I)과 상호작용할 수 있는 세포 단백질의 스크리닝에 의한 이스트 공동-혼성화 상호작용 트랩을 사용하여 분리했다. 사람 및 마우스 VEGF-B 양자에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 포함하는 분리 및 특징은 국제출원번호 WO 96/26736, 루드빅 암염구소 및 헬싱키 대학에 의한 미국특허 5,840,693 및 5,607,918 및 Olofsson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2576-2581 (1996)에 상세하게 기재된다. 사람 VEGF-B 에 대한 뉴클레오티드 서열은 또한 GenBank 수탁번호 U48801 에서 발견된다. WO 96/26736, US 5,840,693 및 US 5,607,918 의 전 개시가 본원에 참고문헌으로 수록된다. VEGF-B 에 대한 마우스 및 사람 유전자는 거의 동일하고, 모두 약 4kb 의 DNA 에 이른다. 유전자는 VEGF 및 PIGF 유전자의 그것과 유사한 7개의 엑손과 그들의 엑손-인트론 구성으로 이루어진다(Grimmond 등, Genome Res. 6: 124-131 (1996); Olofsson 등, J. Biol. Chem. 271: 19310-19317 (1996); Townson 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 220: 922-928 (1996)).
VEGF-C 는 PC-3 전립선 선암종 셀라인(CRL1435)의 조정 배지로부터 내피 세포-특이적 수용체 티로신 키나제 VEGFR-3(Flt4)의 티로신 인산화를 유도하는 배지의 능력을 스크리닝함에 의해, VEGFR-3 를 발현하도록 트랜스펙션된 세포를 사용하여 분리되었다. VEGF-C 는 재조합 VEGFR-3 를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었고, PC-3 cDNA 라이브러리로부터 클론되었다. 그것의 분리 및 특징은 Joukov 등., EMBO J., 15: 290-298, (1996)에 상세히 설명된다.
VEGF-D 는 혼성화 프로브인 "Soares Breast 3NbHBst"로 지정된 사람 cDNA 라이브러리로부터 얻어진 발현된 서열 태그를 사용한 스크리닝에 의해, 클론테크로부터 상업적으로 입수가능한 사람 유방 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다(Achen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548-553, (1998)). 그것의 분리 및 특징은 국제특허출원번호 W098/07832 및 U. S. 특허번호 6,235, 713에 상세히 설명된다. 이러한 문헌은 또한 VEGF-D 아미노산 잔지 93 내지 201 을 이루는 VEGF-D 의 생물학적 활성 단편의 분리를 또한 개시한다. VEGF-D 유전자는 성인 사람에게서 광범위하게 발현되지만, 물론 어디에서나 발현되지는 않는다. VEGF-D 는 심장, 폐 및 골격근에서 강하게 발현된다. 비장, 난소, 소장 및 결장에서는 VEGF-D 가 중간 수준으로 발현되고, 신장, 췌장, 흉선, 전립선 및 고환에서는 더 낮은 수준으로 발현된다.VEGF-D mRNA 는 뇌, 태반, 간 또는 말초혈 백혈구로부터의 RNA 에서는 검출되지 않았다.
P1GF 는 만기 태반 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. 그것의 분리 및 특징은 Maglione 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9267-9271, (1991)에 상세히 설명된다. 그것의 생물학적 기능은 현재 잘 이해되지 않고 있다.
VEGF3 는 결장 조직으로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. VEGF3 는 VEGF 와 36% 동일성 및 66% 유사성을 가진다고 한다. VEGF3를 코딩하는 유전자의 분리방법은 명백하지 않으며, 생물학적 활성의 특성은 국제특허출원번호 PCT/US95/07283(WO 96/39421)에 개시되지 않고 있다.
2개의 단백질간의 유사성은 아미노산 서열과 단백질 중 1개의 아미노산의 보존성 아미노산 치환을 제2의 단백질의 서열과 비교함에 의해 결정되는 반면에, 동일성은 보존성 아미노산 치환을 포함시키지 않고 결정된다.
상기 주지된 바와 같이, PDGF/VEGF 패밀리 멤버는 수용체 티로신 키나제와의 결합에 이해 주로 작용한다. 일반적으로, 수용체 티로신 키나제는 당단백질이며, 특이적 성장 인자(들)과 결합할 수 있는 세포외 도메인, 통상 단백질의 α-나선 부분인 트랜스멤브레인 도메인, 예를 들어 단백질 인산화에 의해서 수용체가 조절될 수 있는 경우의 근접 멤브레인, 수용체의 효소 성분인 티로신 키나제 도메인, 및 많은 수용체에서 티로신에 대한 기질의 인식 및 결합에 연루된 카르복시-말단 꼬리로 구성된다.
2개의 구별되는 아강에 속하는, 5개의 내피 세포-특이적 수용체 티로신 키나제가 확인되었다: 3개의 혈관 내피세포 성장 인자 수용체, VEGFR-1(Flt-1), VEGFR-2(KDR/Flk-1), VEGFR-3(Flt4), 및 Tie 패밀리의 2개의 수용체, Tie 및 Tie-2(Tek). 이들 수용체는 그것들의 특이성 및 친화성에 차이가 있다. 이들 모두는 시그널 트랜스덕션에 필요한 내인성 티로신 키나제 활성을 가진다.
VEGF 와 결합하는 것으로 알려진 유일한 수용체 티로신 키나제는 VEGFR-1, VEGFR-2 및 VEGFR-3 이다. VEGFR-1 및 VEGFR-2 는 높은 친화성으로 VEGF 와 결합하고, VEGFR-1 은 또한 P1GF 와 결합한다. VEGF-B 는 높은 친화성으로 VEGFR-1 와 결합하지만, VEGFR-2 또는-3 와는 결합하지 않는다(Olofsson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 11709-11714 (1998)). VEGF-C 는 VEGFR-3 에 대한 리간드로 밝혀졌고, 또한 VEGFR-2 를 활성화시킨다(Joukov 등, The EMBO Journal 15: 290-298 (1996)). VEGF-D 는 VEGFR-2 및 VEGFR-3 모두와 결합한다(Achen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 548-553 (1998)). Tek/Tie-2 에 대한 리간드는 리제너론 파마슈티칼스사가 출원한, 국제 특허출원번호 PCT/US95/12935(WO 96/11269)에 설명되었다. Tie 에 대한 리간드는 아직 확인되지 않았다.
신규한 130-135kDa VEGF 동형 특이적 수용체가 또한 정제되어 클론되었다(Soker 등, Cell 92: 735-745 (1998)). VEGF 수용체는 엑손 7개의 코딩된 서열에 의하여 VEGF165동형과 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 이것은 헤파린에 대한 약한 친화성을 나타낸다(Soker 등, Cell 92: 735-745 (1998)). 놀랍게도, 이 수용체는 초기 단계 신경형태형성에 관여하는 수용체인, 사람 뉴로필린-1(NP-1)에 동일한 것으로 밝혀졌다. 또한 P1GF-2 는 NP-1 과 상호작용하는 것으로 보인다(Migdal 등, J. Biol. Chem. 273: 22272-22278 (1998)).
VEGFR-1, VEGFR-2 및 VEGFR-3 는 내피 세포에 의해서 상이하게 발현된다. 일반적으로 VEGFR-1 및 VEGFR-2 모두 혈관 내피에서 발현되고(Oelrichs 등, Oncogene 8: 11-18 (1992); Kaipainen 등, J. Exp. Med. 178: 2077-2088 (1993); Dumont 등, Dev. Dyn. 203: 80-92 (1995); Fong 등, Dev. Dyn. 207: 1-10 (1996)), VEGFR-3 는 대개 성인 조직의 림프 내피에서 발현된다(Kaipainen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9: 3566-3570 (1995)). VEGFR-3 는 또한 종양을 둘러싼 혈관 구조에서도 발현된다.
VEGFR-1 은 발생동안 주로 내피 세포에서 발현되지만, 또한 배발생 초기 단계동안 조혈 전구체 세포에서도 발견될 수 있다(Fong 등, Nature 376: 66-70 (1995)). 성인에서는 또한 단구 및 마크로파지가 이 수용체를 발현한다(Barleon 등, Blood 87: 3336-3343 (1995)). 배아에서, VEGFR-1 은 전부는 아니지만 대부분의 혈관에서 발현된다(Breier 등, Dev. Dyn. 204: 228-239 (1995); Fong 등, Dev. Dyn. 207: 1-10 (1996)).
VEGF 의 동정 및 특징 때문에, 많은 중요한 발견이 혈관신생 인자의 활성 및 새로운 인자의 해명에 대한 관심에 기울여졌다. 초기의 발견은 혈관신생이 통상의 발생 및 생리학에 요구된다는 것을 보여주었다. 배아발생, 상처 치료, 황체 형성과 같은 과정은 모두 혈관형성 및 혈관형성 인자를 포함한다. 예를 들어, 상처 치료 동안 VEGF 의 발현과 치료 과정간에 직접적인 상관관계를 제시하면서, VEGF mRNA수준이 증가한다. 또한, VEGF 조절의 결함은 상처 치료 장애와 관련이 있을 것이다(Frank, S., 등, J. Biol. Chem. 2705: 12607-12613 (1995)).
또 다른 중요한 발견은 혈관신생 및 종양 발생간의 연관성을 포함한다. 종양 성장 및 전이는 모두 혈관신행-의존성 과정이다(Folkman, J. 및 Shing, Y., J. Biol. Chem. 267: 10931-10934 (1992)). 예를 들어, 종양 세포가 동물에 도입된 경우에, VEGF mRNA 의 발현 패턴은 괴사성 종양 성장 영역 주변 세포에서 가장 높은 수준으로의 발현을 나타낸다. 많은 혈관이 이들 영역내에서 확인되었다. 이러한 영역에서 VEGF 의 발현은 산소화 부족 상태인 저산소증이 괴사성 종양에서 VEGF 의 발현과 방출을 촉진시킨다는 것을 제안한다. VEGF-B 의 발현은 또한 종양성장과 직접적으로 연관되어있다(미국특허번호 5,840,693참조). VEGF-B 발현은 종양 관련 마크로파지 및 또한 난소 내피 종양에서 특히 상향조절된다(Sowter 등, Lab Invest. 77: 607-14, (1997)). VEGF-B mRNA 는 선암종, 유방암, 림프종, 편병상피암종, 흑색종, 섬유육종 및 슈반종을 포함하는 종양 셀라인에서 VEGF-B mRNA 가 검출될 수 있다(Salven 등, Am J Pathol. 153: 103-8 (1998)).
VEGF/PDGF 패밀리의 멤버는 변이체 전사체를 생성한다는 것이 밝혀졌다. VEGF 는 선택적 스플라이싱때문에 상이한 전사체를 전개하는 것으로 밝혀졌다. 사람 VEGF 유전자는 5개의 상이한 mRNA 종을 가져서(Neufeld 등, FASEB J. 13: 9-22 (1999)), 결과적으로 분자량 및 생물학적 성질에서 상이한 단백질을 초래한다(Carmeliet, P., Nat. Med. 6: 389-395 (2000)). 뉴로필린-1 수용체에 대한 친화성을 가질 뿐만 아니라 VEGFR1 및 VEGFR2 에 대한 결합성을 가진 폴리펩티드를 유발하는, hVEGF-A165동형은 대부분의 사람 조직에서 우세한 전사체이다. hVEGF121및 hVEGF189동형은 통상의 조직에서 더욱 낮은 수준으로 발현된다. hVEGF206동형은 배아 조직에서 주로 발현되는 반면에(Houck 등, Mol Endocrinol. 5: 1806-14 (1991)), hVEGF145는 종양 셀라인에서만 발견될 수 있다(Poltorak 등, J Biol Chem. 272: 7151-8 (1997)). 더욱이, VEGF는 병리학적 상태하에서 동형-특이적인 방식으로 조절된다. 폐 및 결장 암종에서, hVEGF165및 hVEGF12l은 상향 조절되는 반면에, hVEGF189는 변화하지 않음으로써, 악성종양에서 VEGF 의 동형-특이적인 역할을 제안한다(Cheung 등, Hum Pathol. 29: 910-4 (1998)). 뮤린 VEGF-B 로의 실험을 표적화하는 동형 특이적인 VEGF 는 mVEGF164및 mVEGF188이 생후 성장 및 심혈관계의 정상 기능의 유지에 더욱 중요한 반면에, mVEGF120이 혈관형성을 개시 및 촉진한다는 것이 밝혀졌다(Carmeliet 등, Nat Med. 5: 495-502 (1999)).
태반 성장 인자(PIGF)는 3개의 상이한 동형을 가지고, 이것은 조직 및 발생 특이적인 방식으로 발현된다(Maglione 등, Oncogene 8: 925-31 (1993); Cao 등, Biochem Biophys Res Commun. 235: 493-8 (1997)).
mRAN 의 선택적 스플라이싱에 의해서 발생된, VEGF-B 의 2개의 동형이 인지되었다(Grimmond 등, Genome Res. 6: 124131 (1996); Olofsson 등, J. Biol. Chem. 271: 19310-19317 (1996); Townson 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 220: 922-928 (1996)). 이들은 167 개의 아미노산 잔기의 세포 결합 형태(VEGF-B167) 및 186개의 아미노산 잔기의 분비 형태(VEGF-B186)이다. 동형은 신호 서열을 제외하고는, 115 아미노산 잔기의 동일한 N-말단 도메인을 가진다. 공통의 N-말단 도메인은 엑손 1-5 에 의해서 코딩된다. 잔존하는 엑손 6A, 6B 및 7의 상이한 사용은 2개의 스플라이스 동형을 유발한다. 엑손 6에서의 선택적 스플라이스-수용체 부위의 사용에 의해서, 101 bp 의 삽입은 플레임-쉬프트 및 VEGF-B167cDNA 의 코딩 영역의 정지를 도입한다. 따라서, 2개의 VEGF-B 동형은 상이한 C-말단 도메인을 가진다.
VEGF-B 의 2개의 스플라이스 동형의 상이한 C-말단 도메인은 그들의 생화학적 및 세포 생물학적 성질에 영향을 미친다. VEGF-B167의 C-말단 도메인은 몇 개의 보존성 시스테인 잔기 및 일련의 염기성 아미노산 잔기를 가지며, VEGF 의 대응하는 영역에 구조적으로 관련된다. 따라서, 이 도메인은 매우 친수성이고 염기성이며, 따라서, VEGF-B167은 생성 세포가 헤파린 또는 고염농축물로 처리되지 않는 한, 분비에 대하여 세포-회합되어 남을 것이다. 세포 회합 분자 결합 VEGF-B167은 세포 표면 또는 세포주위 헤파린 술페이트 프로테오글리칸일 것으로 추정된다. 동형의 세포-회합은 그것의 독특한 염기성 C-말단 영역에 의해서 이루어진다는 것이 추정된다.
VEGF-B186의 C-말단 도메인은 데이타베이스에서 공지된 아미노산 서열과의 유의한 유사성을 가지지 않는다. VEGF-B186의 C-말단 도메인의 소수성 특징은 VEGF-B167의 친수성이고 염기성인 C-말단 도메인의 성질과 대조된다. 이것은 VEGF-B186은 그것의 분비에서 세포-회합되어 유지되지 않는다는 관찰에 의하여 증명된다. 최근의 증거는 단백질의 생물학적 성질을 조절하는 동형이 단백질가수분해효소에 의해 프로세싱된다는 것을 나타낸다(Olofsson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 11709-11714 (1998)).
더 이상의 차이가 VEGF-B 동형의 글리코실화에서 발견된다. VEGF-B167은 전혀 글리코실화되지 않는 반면에, VEGF-B186은 O-글리코실화되지만 N-글리코실화되지는 않는다.
VEGF-B 의 양 동형은 또한 PDGF-유사 단백질의 분자내 및 분자간 이황화 결합에 포함된 8개의 시스테인 잔기의 보존과 일치하는, VEGF 를 가진 헤테로다이머를 형성한다. 더욱이, 많은 조직에서 VEGF-B 및 VEGF 의 공발현은 VEGF-B-VEGF 헤테로다이머가 천연에서 발생한다는 것을 제안한다. VEGF-B167-VEGF 의 헤테로다이머는 세포-회합되어 남아있다. 대조적으로, VEGF-B186및 VEGF 의 헤테로다이머는 배지에서 세포로부터 대량으로 분비된다. VEGF 는 또한 PIGF와 함께 헤테로다이머를 형성한다(DiSalvo, 등, J. Biol. Chem. 270: 77177723 (1995)). 성장 인자의 패밀리의 멤버간에 헤테로다이머 복합체의 생성은 혈관신생 또는 조절 분자의 다양한 배열에 대한 기초를 제공한다.
분비된 VEGF-B167은 세포-회합되어 남아있기 때문에, 유의한 양의 가용성 VEGF-B167을 얻는 것이 본질적으로 어엽다. 따라서, 가용성 VEGF-B167의 양을 증가시키는 방법을 개발시킬 필요가 있다.
(발명의 개요)
본 발명은 N-글리코실화 VEGF-B 및 가용성 VEGF-B 단백질의 양을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
제1의 양태에서, 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 삽입된, SEQ ID NO: 1(VEGF-B167을 코딩하는 서열), SEQ ID NO : 3(VEGF-B186을 코딩하는 서열) 및 SEQ ID NO : 5(VEGF-B186을 코딩하는 서열)로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 정제되고 분리된 핵산 분자를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 분자는 나(裸)형 및/또는 벡터 또는 리포좀내일 수 있다. 추정상의 N-글리코실화 부위는 -NXT-, -NXS- 또는 -NXC- 이고, 여기서 N 은 아미노산 아스파라긴을 나타내고, X 는 어떤 아미노산일 수도 있고, T, S 및 C 는 각각 아미노산 트레오닌, 세린 및 시스테인을 나타낸다. 따라서, N-글리코실화 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 -nnn1- 이 tga, tar 또는 cnn이 아니고, -nnn2-는 바람직하게는 ccn이 아니라는 것을 전제로, aay-nnnl-(wgy/wcn)-nnn2를 포함할 수 있고, 여기서 w 는 아데닌 또는 티민/우라실을 나타내고, g 는 구아닌을 나타내고, y 는 시스테인 또는 티민/우라실을 나타내고, c 는 시스테인을 나타내고, n 은 아데닌, 시스테인, 구아닌 또는 티민/우라실을 나타내고; t 는 티민/우라실을 나타내고, a 는 아데닌을 나타내고, r은 구아닌또는 아데닌을 나타낸다(N-글리코실화에 대한 규칙은 http://www. expasy.ch/cgi-bin/nicedoc.pl?PDOC00001에 개시된다). 바람직하게는 뉴클레오티드 서열은 aay-nnnl-(agy/wcn)-nnn2를 포함한다.
본 발명은 상기에 기재된 핵산 분자뿐만 아니라 긴축조건하에서 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 비코딩 서열에 충분한 유사성을 가지고, VEGF-B 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:5 에 적어도 90% 서열 동일성을 나타내고, VEGFR-1 과 결합하는 그것의 단편 또는 유사체를 코딩할 수 있는 이들 폴리뉴클레오티드의 단편, 및 이들 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 따라서, 그안에 삽입된 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 이들 폴리뉴클레오티드 단편 및 변이체가 본 발명의 양태로 의도된다. 대표적인 긴축 조건은 다음과 같다: 42℃, 5X SSC 에서 혼성화, 20mM NaPO4, pH 6.8, 50% 포름아미드; 및 42℃, 0.2X SSC 에서 세척. 당업자는 혼성화되는 서열의 길이 및 GC 뉴클레오티드 염기 함량에 실험적으로 기초하고, 이들 변이체가 존재하는지를 검출하는 잘 맞는 식에 기초하여 이들 조건을 다양화하는 것이 바람직하다는 것을 이해할 것이다. Sambrook 등,"분자 클로닝: 실험실 매뉴얼", 제2판, 9.47-9.51 페이지, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)를 참조하시오.
더욱이, 다른, 비사람, 포유동물 VEGF-B 형태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 그 안에 삽입된 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 코딩하는뉴클레오티드 서열을 가지는 정제되고 분리된 핵산 분자, 그것에 의해서 코딩되는 폴리펩티드가 본 발명의 양태이다.
본 발명의 제2의 양태는 SEQ ID NO:2(VEGF-B167), SEQ ID NO:4(VEGF-B186) 및 SEQ ID NO:6(VEGF-BEXl~5)로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, 그 안에 삽입된 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 가지는 단백질의 정제 및 분리를 포함한다. 정제되고 분리된 단백질은 바람직하게는 본 발명의 핵산 분자의 발현에 의해서 생성된다. 상기에 언급된 대로, 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위는 -NXT-,-NXS- 또는 NXC 이고, 여기서 N은 아미노산 아스파라긴을 나타내고, X 는 어떤 아미노산일 수도 있고, T, S 및 C 는 각각 아미노산 트레오닌, 세린 및 시스테인을 나타낸다. 바람직하게는, N-글리코실화 부위는 -NXT- 또는 -NXS-이고, 특히 바람직하게는 -NXT-이다. 이것은 또한 X 및 T 또는 S 다음의 아미노산이 프롤린이 아닌것이 바람직하다.
본원에 사용될 때, 용어 "VEGF-B"는 총체적으로 공지된 VEGF-B167및 VEGF-B186폴리펩티드 동형뿐만 아니라 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 5에 적어도 90% 서열 상동성을 나타내고, VEGFR-1 에 결합하고 및/또는 VEGF-B 의 혈관형성 자극 활성을 가지는 그것의 단편 또는 유사체를 말한다. 활성 물질은 바람직하게는 VEGF-B 에 특징적인, 아미노산 서열 Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(Xaa는 어떤 아미노산일 수 있다)를 포함할 것이다.
보존성 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 여전히 VEGF-B 의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드는 명백하게 본 발명의 범주내로 이해될 것이다. 당업자는 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이유발, 또는 특이적 효소 절단 및 라이게이션의 사용과 같은, 이러한 폴리펩티드를 생성하는데 용이하게 사용될 수 있는 방법을 잘인지하고 있을 것이다. 당업자는 또한 펩티도미메틱 화합물 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비자연 발생 아미노산 또는 아미노산 유도체로 치환된 화합물이 VEGF-B 의 생물학적 활성에 요구되는 양태를 보유할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이러한 화합물은 용이하게 제조되고 당업계에 공지된 방법으로 시험될 수 있으며, 도한 본 발명의 범주내이다.
게다가, VEGF 및 VEGF-B 를 사용하여 발생한다고 알려진 대로, 선택적 스플라이싱으로부터 생길 수 있는 VEGF-B 폴리펩티드의 가능한 변이체 형태, 및 VEGF-B 를 코딩하는 핵산 서열의 천연-발생 대립유전자 변이체가 본 발명의 범위 내이다. 대립유전자 변이체는 당업계에 잘 알려지고, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가를 포함하지만, 코딩된 폴리펩티드의 어떤 실질적인 기능상의 변형을 초래하지 않는 핵산 서열을 나타낸다.
VEGF-B의 그러한 변이체 형태는 변형에 비필수적인 VEGF-B 폴리펩티드의 영역을 표적화함에 의해 제조될 수 있다. 이들 비필수적인 영역은 성장 인자의 VEGF/PDGF 패밀리의 강하게 보존된 영역의 외부에 있을 것으로 예상된다. 특히, VEGF-B를 포함하여 VEGF 패밀리의 성장인자는 다이머이며, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, PlGF, PDGF-A 및 PDGF-B는 N-말단 도메인, 즉 PDGF/VEGF-상동성 도메인에 있는 8개 시스테인 잔기의 완전한 보존을 나타낸다(Olofsson 등, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1996 93 2576-2581; Jou-kov 등, EMBO J. 1996 15 290-298). 이들 시스테인은 분자내 및 분자간 이황화 결합에 연루된다고 생각된다. 게다가, 완전하지는 않지만 더 강하게 보존된 시스테인 잔기가 C-말단 도메인에 있다. 분자내 이황화 결합에 의해 형성된 각 서브유닛의 루프 1, 2 및 3은 PDGF/VEGF 패밀리의 성장인자의 수용체와의 결합에 연루된다(Andersson 등, Growth Factors, 1995 12 159-164).
따라서, 하나 이상의 시스테인이 보존되지 않은, 수용체-결합 VEGF-B 유사체가 알려져 있기 때문에 많은 예외가 있지만, 당업자는 대부분 이러한 시스테인 잔기가 어느 제안된 변이체 형태에서 보존되어야만 한다는 것을 인식하고 있다. 유사하게, 당업자는 루프 1, 2, 및 3 에 존재하는 활성 부위가 또한 보존되어야만 한다는 것을 인식할 것이다. 그러나, 분자의 다른 영역은 생물학적 기능에 덜 중요한 것으로 예상되며, 따라서 변형에 대한 적합한 표적을 제공할 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 내피 세포 증식 분석과 같은 일반적인 활성 분석 과정에 의해 VEGF-B 의 생물학적 활성을 발휘하는 그들의 능력에 대하여 용이하게 시험될 수 있다.
바람직하게 아미노산 치환기가 사용된 경우에, 치환은, 아미노산은 하나의 유사한 크기에 의해서 치환되고, 유사한 전하 성질을 가지는, 보존성 치환이다. 본원에 사용될 때, 용어 "보존성 치환"은 생물학적으로 유사한 다른 잔기, 즉 유사한 성질을 가지는 잔기에 의한 아미노산 잔기의 대체를 의미한다. 보존성 치환의 예는 이소루신, 발린, 루신, 알라닌, 시스테인, 글리신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 노르루신 또는 메티오닌과 같은 한 소수성 잔기의 다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 한 극성잔기의 다른 극성 잔기로의 치환, 예를 들어 알기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환등을 포함한다. 서로 치환될 수 있는 중성 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 용어 "보존성 치환"은 또한 치환되지 않은 모 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용을 포함한다. 대표적인 보존성 치환은 다음 표 1 에 제시된다.
보존성 치환 I
측쇄 특징 아미노산
지방족 비극성 G A P
I L V
지방족 극성-비하전지방족 극성 하전 C S T M
N Q
D E
K R
방향족기타 H F W Y
N Q D E
대안으로, 보존성 아미노산은 다음의 표 2에 제시된 Lehninger, [Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY: NY (1975), pp. 71-77] 에 설명된 대로 분류될 수 있다.
보존성 치환 II
측쇄 특징 아미노산
비극성(소수성)
지방족 A L I V P
방향족 F W
황-함유 M
불명확 G
비하전-극성
히드록실 S T Y
아미드 N Q
술프히드릴 C
불명확 G
양으로 하전(염기성) K R H
음으로 하전(산성) D E
전형적인 보존성 치환이 다음 표 3에 제시된다.
보존성 치환 II
본래의 잔기 치환의 예
Ala(A) Val, Leu, Ile
Arg(R) Lys, Gln, Asn
Asn(N) Gln, His, Lys, Arg
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
His(H) Asn, Gln, Lys, Arg
Ile(I) Leu, Val, Met, Ala, Phe
Leu(L) Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys(K) Arg, Gln, Asn
Met(M) Leu, Phe, Ile
Phe(F) Leu, Val, Ile, Ala
Pro(P) Gly
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr, Phe
Tyr(Y) Trp, Phe, Thr, Ser
Val(V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala
원한다면, 본 발명의 VEGF-B 단백질은 예를 들어, 아미드화, 카르복실화, 또는 인산화에 의해서, 또는 산부가염, 아미드, 에스테르, 특히 C-말단 에스테르, 및 본 발명의 펩티드의 N-아실 유도체의 생성에 의해서 변형될 수 있다. 단백질은 또한 다른 부분을 가진 공유 또는 비공유 복합체를 형성함으로써 펩티드 유도체를 생성하도록 변형될 수 있다. 공유 결합된 복합체는 화학 부분을 펩티드를 포함하는아미노산의 측쇄상의 관능기에, 또는 N- 또는 C-말단에 연결함으로써 제조될 수 있다.
특히, VEGF-B 단백질은 방사선표지, 형광 표지, 효소(예를 들어, 비색 또는 형광 반응을 촉매하는 효소), 기질, 고형 매트릭스, 또는 담체(예를 들어, 비오틴 또는 아비딘)를 제한없이 포함하는 수용체기에 연결될 수 있다. 폴리펩티드는 친화성 정제를 돕기위해서 FLAG옥타펩티드(Sigma, St. Louis, MO) 또는 히스티딘과 같은 에피토프 태그에 연결될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 폴리펩티드는 영상화를 위해 적합한 초자성, 상자성, 고전자 밀도, 생태성(ecogenic) 또는 방사성 제제와 공유적으로 또는 비공유적으로 커필링될 수 있다. 진단 분석에의 사용을 위해서, 방사성 또는 비방사선 표지가 사용될 수 있다. 방사선 표지의 예는125I 또는32P 와 같은 방사선 원자 또는 기를 포함한다. 비방사선 표지의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소 표지, 또는 플루오레세인-5-이소티오시아네이트(FITC)와 같은 형광 표지를 포함한다. 표지는 직접적 또는 간접적, 공유적 또는 비공유적일 수 있다.
변형된 폴리펩티드는 섬유아세포 증식 분석과 같은 통상의 활성 분석 과정으로 VEGF-B 의 생물학적 활성을 발휘하는 그들의 능력에 대하여 용이하게 시험될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 폴리펩티드가 합성 수단 또는 재조합 수단에 의해서 제조될 수 있거나, 천연 공급원으로부터 정제될 수 있다는 것이 분명하게 이해될 것이다.
본원에 사용될 때, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 제한은 없는"을 의미한다. 상응하는 의미가 용어 "포함한다"에도 적용된다.
본 발명의 제3의 양태는 본 발명의 제1의 양태의 핵산 분자, 및 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 포함하는 벡터를 제공한다. 이것은 진핵 또는 원핵 기원일 수 있다. 이들 세포는 특히 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 적합하고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수가능하고, 재조합 배큘로바이러스로 감염된 Sf9 또는 HF 세포와 같은 곤충 세포, 및 적합한 발현 플라스미드로 트랜스펙션된 사람 배아 신장 배양 셀라인 293-EBNA 를 포함한다. 본 발명의 바람직한 벡터는 본 발명에 따른 핵산이 하나 이상의 적절한 프로모토 및/또는 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결되어서, 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 적절한 숙주 세포가 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터이다. 다른 바람직한 벡터는 포유동물 세포의 트랜스펙션, 또는 아데노바이러스-, 백시니아(vaccinia)- 또는 레트로바이러스-기제 벡터 또는 리포좀가 같은 유전자 요법에 적합한 것이다. 다양한 이러한 벡터가 당업계에 공지된다.
본 발명은 또한 상기에 개시된 바와 같이, 하나 이상의 적절한 프로모터 및/또는 다른 조절 서열에 제1의 양태의 핵산 분자를 작동가능하게 연결시키는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 핵산에 의해서 코딩된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 또는 벡터를 발현시키는 단계, 및숙주 세포 또는 숙주 세포의 성장 배지로부터 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 적합한 약제학적 담체와 조합하여 사용될 수 있다. 결과의 조성물은 글리코실화 VEGF-B 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 비독성염, 및 약제학적으로 허용가능한 고체 또는 액체 담체 또는 보조제를 포함한다. 이러한 담체 또는 보조제의 예는 제한은 없지만, 식염수, 완충 식염수, 링거 액, 미네랄 오일, 활석, 콘스타치, 젤라틴, 락토스, 수크로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 인산이칼슘, 염화 나트륨, 알긴산, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 비후제, 안정제, 현탁제 및 그것의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 크림, 고약, 엘리시르, 시럽, 와퍼(wafer), 연고, 또는 다른 종래의 형태일 수 있다. 제제는 물론 투여 방식에 맞춰지도록 공지된 원리에 따라서 적합하게 될 수 있다. 조성물은 글리코실화 VEGF-B 를 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 PDGF-A, PDGF-B, VEGF, 비글리코실화 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, P1GF 및/또는 헤파린을 더 포함한다. 글리코실화 VEGF-B 를 포함하는 조성물은 약 0.1중량% 내지 90중량%의 활성 화합물, 및 가장 일반적으로 약 10중량% 내지 30중량%의 활성 화합물을 포함한다.
근육내 제제물의 경우에, 무균 제제, 바람직하게는 염소산염과 같은 글리코실화 VEGF-B 의 적합한 가용성 염 형태가 무피로겐 물(증류수), 생리 식염수 또는 5% 글루코스 용액과 같은 약제학적 희석제에서 용해되어 투여될 수 있다. 화합물의 적합한 불용성 형태는 예를 들어, 에틸 올레이트와 같은 긴사슬 지방산의 에스테르와 같은 수용성 기제 또는 약제학적으로 허용가능한 오일 기제에서 현택액으로 제조 및 투여될 수 있다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 숙주 세포로부터 가용성 VEGF-B167을 제조하는 방법 및 숙주세포로부터 가용성 VEGF-B167, VEGF-B186또는 VEGF-BEX1-5단백질의 양을 증가시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 VEGF-B167, VEGF-B186또는 VEGF-BEXl-5를 코딩하는 뉴클레오티드 서열내로 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 삽입하는 단계; 삽입된 N-글리코실화 부위를 가지는 상기 뉴클레오티드 서열을 숙주세포내로 형질전환 또는 트랜스펙션시키는 단계; 삽입된 N-글리코실화 부위를 가진 상기 뉴클레오티드 서열이 발현되도록 성장 배지에서 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포가 배양된 성장 배지로부터 발현된 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 또한 상기 폴리펩티드가 발현된 후에 배양된 트랜스펙션된 숙주 세포를 헤파린에 노출시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 첨부되는 도면에 참조하여 하기에 더욱 상세하게 기재될 것이다.
도1은 VEGF-B 와 함께 VEGF-A 및 PIGF 의 VEGF 상동성 도메인(VHD)의 아미노산 서열의 배열이다.
도2는 그 안에 통합된 N-글리코실화 부위를 가지는 VEGF-B186을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pSecTagA-hVEGF-Bl86-H6-NXT 의 도해이다.
도3은 그 안에 통합된 N-글리코실화 부위를 가지는 VEG-B167을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pSecTagA-hVEGF-Bl67-H6-NXT 의 도해이다.
도4는 그 안에 통합된 N-글리코실화 부위를 가지는 VEGF-B 의 엑손 1-5 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pSecTagA-hVEGF-B-엑손l-5-H6-NXT 의 도해이다.
도5는 유효한 글리코실화 부위(NXT)의 존재 및 부재시의 hVEGF-B167의 발현을 도시한다.
도6은 유효한 글리코실화 부위(NXT)의 존재 및 부재시의 hVEGF-B167및 hVEGF-B186의 발현을 도시한다.
도7은 유효한 글리코실화 부위(NXT)의 존재 및 부재시의 hVEGFB167및 hVEGF-B186의 발현 및 수용체 결합을 도시한다.
도8은 유효한 글리코실화 부위(NXT)의 존재 및 부재시의 hVEGF-B 의 엑손 1-5 에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현 및 수용체 결합을 도시한다.
(실시예 1): 글리코실화 부위의 도입
상기에 언급한대로, VEGF-B 는 어떤 N-글리코실화를 완전히 차단하는 PDGF/VEGF 패밀리 멤버이다. VEGF-B 에 대한 N-글리코실화의 효과를 분석하기 위해서, N-글리코실화 부위를 VEGF-B 에 도입했다. VEGF-B 의 N-글리코실화를 유도할수 있는 돌연변이를 도입하기 위해 가장 적절한 부위를 결정하기 위해서, 각각 VEGF-A, PLGF 및 BEGF-B 의 첫번째 99 개의 아미노산의 아미노산 서열을 배열했다(도1 참조). 도 1에서 VEGF-A 및 PIGF 의 N-글리코실화 부위인 아미노산 65-67 은 이탤릭체로 표시된다. 추정상의 N-글리코실화 부위(NXT)를 코딩하는 뉴클레오티드는 hVEGF-B(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 286-294에 해당하는 위치에서 삽입된다. 위치 286-294 에서 통상 발견되는 치환된 뉴클레오티드는 아미노산 잔기 QVR 을 코딩하고 이들 아미노산 잔기는 도1에서 굵은 활자로 표시된다.
(실시예 2) 재조합 벡터의 제조
VEGF-B 의 2개의 천연 발생 동형(즉, VEGF-B167및 VEGF-B186) 및 (단지 엑손 1 내지 5 만을 포함하는) 인공 스플라이스 변이체에 대한 6개의 포유동물 발현 벡터를 추정상의 N-글리코실화 부위의 존재 및 부재로 제작하였다.
PCR 을 사용하여, 히스티딘 태그를 코딩하는 뉴클레오티드를 hVEGF-B186을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 C-말단에 첨가하였다. 그 다음, 표준 클로닝 절차를 사용하여, hVEGF-B186-H6를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 pSecTagA(Invitrogen, Carlsbad, California)에 삽입하여 pSecTagA-hVEGF-B186-H6를 제작하였다. pSecTagA-hVEGF-B186-H6의 전서열은 SEQ ID NO: 7 으로 나타낸다.
pSecTagA-hVEGF-B186-H6-NXT 를 제작하기 위해서, 3'프라이머: 5'- TCGGTACC GGATCATGAGGATCTGCATGGTGACGTTGTGCTGCCCAGTGGCCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 사용하여 뉴클레오티드 위치 289-297 에 N-글리코실화 부위가 도입된, Genebank 수탁번호 U48801 의 뉴클레오티드 1-325 를 포함하는 PCR 생성물을 제조했다. 그 다음, 이 PCR 생성물을 전장 hVEGF-B186을 가지는 플라스미드내로 클론하고, hVEGF-B186-NXT를 제조하기 위해서 대응하는 서열을 대체하기 위해서 사용된다. 그 다음, 표준 클로닝 과정을 사용하여 hVEGF-B186-H6의 C-말단 부분과 함께 hVEGF-B186-NXT 의 N-말단 부분을 클로닝함에 의해 히스티딘 태그를 첨가하여 hVEGF-B186-H6-NXT 를 제조하였다. 그 다음, 표준 클로닝 과정을 사용하여 hVEGF-B186-H6-NXT 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 pSecTagA(Invitrogen)에 삽입시켜서 pSecTagA-hVEGF-B186-H6-NXT 를 제작하였다. pSecTagA-hVEGF-B186-H6-NXT 의 전 서열은 SEQ ID NO:9 로 나타나고, 플라스미드는 도2에 도시된다.
pSecTagA-hVEGF-B167-H6를 제작하기 위해서, 5' 프라이머:5'-CCTGACGATGGCCT GGAGTGT-3'(SEQ ID NO:10) 및 3'프라이머: 5'-GAGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGAT GCCTTCGCAGCTTCCGGCAC-3'(SEQ ID NO:11) 및 주형으로 hVEGF-B167을 사용하여, Genebank 수탁번호 U48801에서 얻은 뉴클레오티드 250-567, 히스티딘 태그를 코딩하는 뉴클레오티드, 정지 코돈,NotI 제한효소 부위 및 말단 클램프 뉴클레오티드를 포함하는 349bp PCR 생성물을 제조하였다. 349 bp PCR 산물을 KpnI 및 NotI 으로 절단하였고, 표준 클로닝 과정을 사용하여 이 벡터로부터 제거된 KpnI-NotI 단편을 치환하기 위하여 pSecTagA-hVEGF-B186-H6내에 KpnI-NotI 단편을 삽입하였다. pSecTagAhVEGF-B167-H6의 전 서열은 SEQ ID NO:12 로 나타낸다.
유사하게, 이 벡터로부터 제거된 KpnI-NotI 단편을 대체하기 위하여 pSecTagA-hVEGF-B167-H6-NXT 내에 KpnI-NotI 단편이 삽입된다는 점을 제외하고는 상기와 동일하게 pSecTagAhVEGF-B186-H6-NXT 를 제조하였다. pSecTagA-hVEGF-B167-H6-NXT 의 전서열은 SEQ ID NO:13 으로 나타내고, 플라스미드는 도3에 도시된다.
pSecTagA-hVEGF-BExl-5-H6를 제작하기 위해서, 5'프라이머: 5'-CACCATGAGCCC TCTGCTCC-3'(SEQ ID NO:14) 및 3' 프라이머: 5'-GAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGATGATGG TCTGGCTTCACAGCACTG-3'(SEQ ID NO:15) 및 주형으로 hVEGF-B167을 사용하여, Genebank 수탁번호 U48801에서 얻은 뉴클레오티드 1-411, 히스티딘 태그를 코딩하는 뉴클레오티드, 정지 코돈,NotI 제한효소 부위 및 말단 클램프 뉴클레오티드를 포함하는 443bp PCR 생성물을 얻었다. 표준 클로닝 과정을 사용하여 PCR 생성물을KpnI 및NotI 으로 절단하였고, 벡터로부터 제거된KpnI-NotI 을 대체하기 위하여 pSecTagA-hVEGF-B186-H6-NXT 내에 얻어진 결과의 320bp 단편을 삽입하였다. pSecTagA-hVEGF-BEXl-5-H6의 전서열은 SEQ ID NO:16 으로 나타난다.
pSecTagA-hVEGF-BExl-5-H6-NXT 를 제작하기 위하여, 벡터로부터 제거된 KpnI-NotI 단편을 대체하기 위하여 pSecTagA-hVEGF-B186-H6-NXT 내로 KpnI-NotI 단편이 삽입된다는 것을 제외하고는 상기와 동일한 과정을 사용하였다. pSecTagA-hVEGFBEX1-5-H6-NXT 의 전서열은 SEQ ID NO:17로 나타나고, 플라스미드는 도4에 도시된다.
다음 표4는 유효한 글리코실화 부위(NXT)의 존재 및 부재로 제작된, VEGF-B 의 천연 발생 186 및 167 아미노산 동형 및 (단지 엑손 1내지 5만 포함하는) 인공 스플라이스 변이체에 대한 발현 벡터를 열거한다.
구조체명 단백질
pSecTagA-hVEGF-B186-H6 히스티딘 태그 VEGF-B186
pSecTagA-hVEGF-B186-H6-NXT 히스티딘 태그 및 N-글리코실화 VEGF-B186
pSecTagA-hVEGF-Bl67-H6 히스티딘 태그 VEGF-B167
pSecTagA-hVEGF-B167-H6-NXT 히스티딘 태그 및 N-글리코실화 VEGF-B167
pSecTagA-hVEGF-B-엑손l-5-H6 히스티딘 태그 VEGF-B 엑손 1 내지 5만
pSecTagA-hVEGF-B-엑손l-5-H6-NXT 히스티딘 태그 및 N-글리코실화 VEGF-B 엑손 1내지 5만
(실시예 3)
트랜스펙션 및 재조합 단백질의 발현
각각, 히스티딘-태그 VEGF(양성 대조표준), VEGF-C 의 히스티딘-태그 VHD(음성 대조표준) 및 히스티딘 태그 혼성화 84-11(양성 대조표준)을 함유하는 발현 벡터와 함께 상기에 설명된 사람 VEGF-B 의 6개의 포유동물 발현 벡터를 Sambrook, J. 등., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), 16.33-16.36 (1989)에 설명된 과정에 따른 CaPO4-매개 트랜스펙션을 사용하여 293T 세포내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간 후에, 세포를 12 내지 24 시간동안 S35메티오닌 및 S35시스테인(Promix, Amersham)으로대사적으로 표지하였다. 조정 상청액을 사람 VEGF-B(874)에 특이적인 항혈청 및 펜타히스티딘(H5mAb, Qiagen)에 특이적인 단일클론 항체로 면역침전시켰다.
도 5 내지 도 8 에 도시된 대로, 삽입된 추정상의 N-글리코실화 부위가 글리코실화된 3개의 구조체가 제조되었다.
도 5-7 에 도시된 대로, 세포 결합된 단백질을 방출시키기 위해서 헤파린을 사용한, 상청액과 세포용해물과이 비교는 VEGF-B167은 세포 표면 또는 세포내에 거의 완전하게 보유된다는 것을 나타낸다. 글리코실화된 상청액에서 VEGF-B167의 약 50 배 증가가 검출될 수 있다(도5). 도6 및 도7에서 도시된 대로, VEGF-B167은 수거 2시간 전에 100㎍/㎖ 헤파린으로 처리함으로써 성청액내로 방출된다. 수거전 2시간동안 200㎍/㎖ 헤파린으로 처리된 글리코실화되지 않은 VEGF-B167과 비교할 때 헤파린으로 처리되지 않은 293T 세포의 상청액에서 약 2배 더 글리코실화된 VEGF-B167이 검출될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 게다가, 헤파린 처리하지 않은 글리코실화 VEGF-B167에 비교할 때, 수거 2시간전에 200㎍/㎖ 헤파린으로 처리함으로써 상청액에서 검출된 글리코실화 VEGF-B167의 양은 약 3배의 증가가 있었고, 동일한 헤파린 처리와 함께 상청액에서 검출된 글리코실화되지 않은 VEGF-B167의 양에 비교할 때, 수거 2시간전 200㎍/㎖ 헤파린으로 처리함으로써 상청액에서 검출된 글리코실화 VEGF-B167의 양은 약 6 배의 증가가 있었다.
도6 및 7은 VEGF-B186은 또한 부분적으로 세포 표면 및 세포내에 보유된다는 것을 도시한다. VEGF-B167에 대조적으로, 거의 모든 VEGF-B186은 글리코실화 및 헤파린 처리하자마자 상청액내로 방출된다(도6 및 도7). 헤파린-처리 및 비처리 293T 세포간의 상청액내에 발견된 VEGF-B186의 양에서 유의한 차이점이 없는 것으로 보인다. 그러므로, 상청액(더욱 글리코실화된 VEGF-B186 의 약 3배)에서 VEGF-B186및 N-글리코실화 VEGF-B186단백질 수준의 차이점은 주로 증강된 분비 및/또는 생성에 기인하고, 세포 표면 결합 단백질의 방출 때문은 아닌것으로 보인다.
도 8 은 VEGF-B엑손1-5이 N-글리코실화된다면 이것이 배지내로 유효하게 방출된다는 것을 보여준다(가용성 단백질에서 50 배 이상의 증가). 세포 표면에서 VEGF-B 를 보유하는 신호는 엑손 6 및 7 코딩 도메인에 위치하는 것으로 여겨지기 때문에 기대되지 않는다(도 8). 헤파린으로의 처리가 같은 이유에 때문에 결정되지 않았다.
(실시예 4) 재조합 단백질에 결합하는 VEGF 수용체 1
VEGF 수용체 1(VEGFR-1)과 재조합 VEGF-B 의 결합능을 VEGFR-1 의 세포외 도메인 및 사람 IgG1(VEGFR-1-Fc)의 Fc 부분으로 이루어지는 가용성 융합 단백질을 사용하여 분석했다. 실시예 3에서 같은 방식으로 트랜스펙션된 293T 세포로부터 유래된 생합성으로 표지된 조정배지를 VEGFR-1-Ig 와 결합된 단백질 A 세파로스(PAS)로 면역침전시켰다. PBS 로 비드를 3번 세척하였고, 결합된 단백질을 환원성 SDS-PAGE(15%)로 용출 및 용해시켰다. 건조된 겔을 12-24 시간동안 포스포이메이져 플레이트에 노출시켰다. 추가적으로, 세포 용해물을 H5mAb 로 면역침전시켰다.
VEGF-B 의 유의한 양이 상청액으로 존재할때, VEGFR-1 과의 결합이 관찰될 수 있다. 수거 2 시간전에 100㎍/ml 헤파린으로의 처리후에 VEGF-B186-H6와 함께, VEGF-B186-NXT-H6및 VEGF-B 엑손 1-5-NXT-H6가 관찰되었다(도 7 및 8).
(실시예 5) BaF3 VEGFR-OlEC/EpoR 세포 생존의 자극
VEGF-B 내에 N-글리코실화 부위를 도입하는 효과는 VEGF-B167및 VEGF-B167-NXT 및/또는 VEGF-B186및 VEGF-B186-NXT 로 트랜스펙션된 세포로부터 BaF3 VEGF-01EC/EpoR 세포의 생존을 자극하는 조정배지의 능력을 평가함에 의해서 분석될 수 있다. 분석을 위해서, VEGF 수용체 1 의 세포외 도메인 및 에리스로포이에틴 수용체의 세포내 도메인으로 구성되는 키메라 수용체로 안정하게 트랜스펙션된 BaF3 세포를 사용하였다. 생존을 위해서, 이들 세포는 인터루킨-3 또는 예를 들어, VEGF-A, VEGF-B 또는 PIGF 와 같은 VEGFR-1 과 결합할 수 있는 어떤 성장 인자를 필요로 한다. 세포는 20,000/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 도말되고, VEGF-B167및 VEGF-B167-NXT, VEGF-B186및 VEGF-B186-NXT, 또는 양자로 트랜스펙션된 293T 세포에 의해서 상이한 양의 조정배지의 존재하에서 배양된다. 모의(즉, 텅빔) 벡터로 트랜스펙션된 293T 세포로부터의 조정 배지가 대조표준으로 사용될 수 있다. 분석 전에, 적절한 항체를 사용하는 면역침전에 의해서 유효하게 단백질을 방해하는 조정배지가 제거되어야만 한다. 예를 들어, VEGF-A 는 R&D 시스템, 미네아폴리스, 미네소타로부터 상업적으로 입수가능한, 단일클론 및 다클론 항-hVEGF 항체의 혼합물을 사용하여 분석전에 조정배지로부터 제거될 수 있다. (존재한다 할지라도) COS 세포에 의해서 발현된 양이 무시해도 좋을 정도이고 그것의 효과가 베이스라인 노이즈에서 식별가능하지 않을 때, PIGF 의 배지를 미리제거할 필요는 없다. 48시간후에, MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5 디페닐-테트라졸륨 브로마이드 티아졸 블루) 비색 분석이 수행될 수 있고, 마이크로티터플레이트 해독기를 사용하여 540nm 에서 데이타를 수집하였다.
트랜스멤브레인 도메인의 바로 앞에 위치한 사람 VEGFR-1 의 코딩 서열에서 Bg1II 부위를 만들기 위해서, 내인성 Bg1I 부위를 포함하는 프라이머 5'-CCTCAGTGATCACACAGTGG-3', 및 Bg1II 부위를 포함하는 프라이머 5'-CAGAGATCTATTAGACTTGTCC-3'으로 VEGFR-1 의 염기쌍 1998-2268 을 PCR 증폭시켰고, PCR 생성물을 pBlueScript SKII+(Stratagene) 벡터에 의해서 VEGFR-1 의 Bc1I-BglII 부위내에 클로닝하였다. 사람 에리스로포이에틴 수용체의 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인을 EpoR x B+B/pcDNAI 로 절개했고, BglII/NotI 단편으로 결과의 플라스미드내에 서브클론되었다. EpoRx B+B 는 RTK 세포외 도메인의 인플레임 라이게이션을 위한 추정되는 트랜스멤브레인(TM)/세포외(EC) 도메인 접합부에 첨가되는 내부 Bg1II 을 가지는 EpoR 의 클론이다. 벡터 골격은 pCDNA1-amp 이다(~5.4 kb, KpnI 을 사용하여 원래의 1.75 kb EpoR 클론을 pCDNA1-amp 에 서브클론하였고, 이 서열은 로디쉬 실험실, MIT 에 의해서 보고되었다). EpoR 의 TM 및 EpoR 의 세포질도메인을 포함하는 ~1kb 단편을 Bg1II(5') - NotI(3') 분해를 사용하여 클론으로부터 삭제시켰다.
VEGFR-1/EpoR 구조체는 최종적으로 KpnI/NotI 단편으로 pEF-BOS 벡터내에 서브클론된다(Mizushima 등., Nucleic Acids Research, 18 (17): 5322 Sept. 11,1990). 결과의 플라스미드를 BaF3 세포내에 일렉트로포레이션하였고, 250㎍/㎖ 제오신으로의 분별에 의해서 안정한 세포 저장소를 생성하였다.
앞서 말한 설명과 실시예들은 오직 발명을 예시하기 위하여 제시되었으며 제한하려는 의도는 아니다. 발명의 정신 및 실질을 구체화시키는 개시된 구체예들의 변형이 당업자에게 발생할 수 있으므로, 본 발명은 첨부된 청구항 및 그 동등물의 범위 내에 있는 모든 변형을 포함하도록 광범위하게 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. SEO ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 긴축 조건하에서 상기 서열의 적어도 하나와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    그 안에 삽입된 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  2. SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6 로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그 안에 삽입된 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위는 NXT 의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  4. 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:5 의 뉴클레오티드 286-294 에 삽입되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  5. 제 1 항의 핵산 분자의 발현에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  6. 제 2 항에 있어서, 혈관 내피 성장 인자 수용체-1와 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  7. 제 1 항의 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제 7 항에 따른 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  9. 제 2 항의 폴리펩티드의 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 헤파린을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열내에 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 삽입시키는 단계;
    삽입된 N-글리코실화 부위를 가지는 상기 뉴클레오티드 서열을 숙주세포내로형질전환 또는 트랜스펙션시키는 단계;
    삽입된 N-글리코실화 부위를 가진 상기 뉴클레오티드 서열이 발현되도록 성장 배지에서 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 숙주 세포가 배양된 성장 배지로부터 발현된 폴레펩티드를 분리하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포로부터 가용성 VEGF-B167을 제조하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 발현된 다음에 헤파린에 배양된 트랜스펙션된 숙주 세포를 헤파린에 노출시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위는 NXT 의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 286-294 에 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:5 의 뉴클레오티드 서열의 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열내에 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 삽입하는 단계;
    삽입된 N-글리코실화 부위를 가진 상기 뉴클레오티드 서열을 숙주세포내로 형질 전환 또는 트랜스펙션시키는 단계;
    삽입된 N-글리코실화 부위를 가진 상기 뉴클레오티드 서열이 발현되도록 성장 배지에서 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 숙주 세포가 배양된 성장 배지로부터 발현된 폴리펩티드를 분리하는 단계로 구성되는 숙주 세포로부터 가용성 VEGF-B167, VEGF-B186또는 VEGF-BEX1-5의 양을 증가시키는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 발현된 다음에 배양된 트랜스펙션된 숙주 세포를 헤파린에 노출시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위는 NXT 의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 적어도 하나의 추정상의 N-글리코실화 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:5 의 뉴클레오티드 286-294 에 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
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