KR20030029928A - 표면처리층이 형성된 고체 지지체 - Google Patents

Abstract

DNA 또는 단백질 등의 생체물질 샘플을 기판에 공유결합하여 강고하게 고정화함으로써, 종래 유전자 해석을 위한 처리를 실시할 때(예를 들면, 합성 시) 스폿이 떨어졌던 문제점을 해결하는 것을 목적으로 한다. 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 단편을 표면에 담지가능한 고체지지체에 있어서, 탄화 하프늄, 탄화 니오브, 탄화규소, 탄화 탄탈, 탄화 토륨, 탄화 티탄, 탄화 우라늄, 탄화 텅스텐, 또는 탄화 지르코늄 등의 표면처리층이 형성되어 있는 고체지지체이고, 또한, 표면처리층의 피막상에, 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 단편을 담지시킨 고체지지체 및 고체지지체의 표면에 유전자를 담지시켜 유전자를 해석하는 방법이다.

Description

표면처리층이 형성된 고체 지지체{SOLID SUPPORTS HAVING SURFACE-TREATED LAYER FORMED THEREON}

종래, 유전자 해석용 등에 이용되는 고체 지지체로서, 유리칩(glass chip)의 고체 지지체로서, 표면에 1만 이상의 DNA단편(DNA 프로브(probe)) 등의 유전자를 싣도록 가공이 이루어진 것이 널리 이용되고 있다.

상기와 같은 칩을 이용하여, 예를 들면, 어떤 DNA 샘플의 염기배열을 알고 싶은 경우에는, 그 고체 지지체상에, 미리 염기배열이 해명되어 있고, 서로 다른 염기배열을 가지는 수만개의 DNA 단편을, 위치를 알 수 있게 결합시켜둔 것을 준비하고, 이것에 형광 표식된 DNA 샘플을 흘리면, DNA 단편은, 그 고체 지지체상에 부착한 DNA 단편(프로브) 중 상보적인 배열을 가지는 프로브와 합성(hybridize)된다. 합성 부분은, 고체 지지체를 형광 측정함으로써 스폿(spot)으로 식별할 수 있고, DNA 샘플 중 DNA 단편의 배열을 해명할 수 있다.

이와 같이, 유전자 해석용 고체 지지체는, 어떤 DNA의 염기배열을 간단하게특정할 수 있는 것이기 때문에, 생체 게놈(biological genome)의 해석, 유전자 발현의 모니터링(monitoring), 게놈 불일치(genome mismatching) 등의 유전자 해석 등에 이용되는 것 외에, 종양 유전자(oncogene)의 돌연변이의 검출 등 유전자 진단이나 의약품의 개발 등에 응용되고 있다.

상기 유전자 해석용 고체 지지체를 이용하여 형광표식한 DNA 샘플을 합성하여, 고체 지지체에 형광조사(螢光照射)하는 것에 의한 스폿의 해석에 의해 판단된다.

그러나, 종래의 유전자 해석용 고체 지지체는, 상기 스폿의 해석을 함에 있어서, 유리의 세정 등의 전처리를 행하기 위해, 스폿된 DNA 단편이 씻겨지기 쉽고, 스폿이 명료하게 검출될 수 없는 경우가 많았다.

본 발명은, 이러한 종래의 유전자 해석용 고체 지지체가 가지는 형광검출의 불명료라는 문제점을 해결하는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명은 유전자 해석, 진단, 치료 등에 사용되는 유전자 또는 단백질 등의 생체물질 해석용 등에 이용되는 고체 지지체 및 그 고체 지지체를 이용하여 유전자 또는 단백질 등의 생체물질 등을 해석하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 고체 지지체 상에 브로브를 고정화하는 경우의 개략 설명도이다.

본 발명에 있어서, 이용하는 기판은 유리, 플라스틱, 실리콘 등의 고체 지지체에 표면처리층을 형성하고, 또한, 화학수식(化學修飾, chemically modified)을 실시함으로써, 고체 지지체를 세정해도 스폿된 DNA 단편이 씻겨나가지 않고 강고하게 고정화되어 있고, 형광조사했을 때, 형광 스폿이 명료하게 되는 것을 알았다. 본 발명은 이러한 지견(知見)에 기초한 것이다.

본 발명의 고체 지지체는, 표면에, 탄화 하프늄(hafnium carbide), 탄화 니오브(niob carbide), 탄화규소(silicone carbide), 탄화 탄탈(tantalum carbide),탄화 토륨(thorium carbide), 탄화 티탄(titanium carbide), 탄화 우라늄(uranium carbide), 탄화 텅스텐(tungsten carbide), 탄화 지르코늄(zirconium carbide), 탄화 몰리브덴(molybdenum carbide), 탄화 크롬(chromium carbide), 또는 탄화 바나듐(vanadium carbide)으로 이루어진 표면처리층이 형성되어 있는 것을 특징으로 한다.

상기 표면처리층의 피막의 두께는, 1nm∼1000nm인 것이 바람직하다.

또한, 상기 표면처리층의 피막 상에는, 화학수식을 실시하고, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 단편을 담지시킨 것이 바람직하다.

또한, 이러한 본 발명의 고체 지지체는, 청구항 4에 기재된 바와 같이, 고체 지지체의 표면에 유전자를 담지시켜 유전자 또는 단백질 등의 생체물질을 해석하는 방법에 이용할 수 있다.

본 발명의 고체지지체는, 유리, 플라스틱, 실리콘 등의 고체지지체의 최표면상에 적당한 표면처리층이 형성된 것을 이용하고, 고체지지체의 위에 DNA 샘플을 부착하여 다양한 해석에 이용하는 경우는, 유전자 또는 단백질 등의 생체물질과의 친화성 등이 강고해지는 것이 바람직하다.

고체지지체로서의 플라스틱은, 공지의 플라스틱이 사용된다. 예를 들면, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌 테레프탈레이트 등의 폴리에스테르 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리스틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, ABS 수지, 나일론, 아크릴 수지, 불소(fluorine) 수지, 폴리카보네이트 수지, 폴리우레탄 수지, 메틸펜텐 수지, 페놀 수지, 멜라민 수지, 에폭시 수지, 염화비닐 수지 등의 열경화성 또는 열가소성 수지가 적용될 수 있다.

또한, 표면처리로서는, 탄화 하프늄, 탄화 니오브, 탄화규소, 탄화 탄탈, 탄화 토륨, 탄화 티탄, 탄화 우라늄, 탄화 텅스텐, 탄화 지르코늄, 탄화 몰리브덴, 탄화 크롬, 또는 탄화 바나듐 등의 탄화물을 피복한 것이 바람직하다.

또한, 상기 탄화물과 다른 물질과의 혼합체, 예를 들면, 금속이나 세라믹스 등과의 혼합체, 적층체도 바람직하다.

즉, 탄화는 화학적 안정성이 우수하고, 그후의 화학수식이나 DNA 프로브 등을 부착할 때의 반응 등에 견딜 수 있다.

그 이유는, 탄화물 상에 화학수식을 실시하고, 프로브를 고정화했을 때, 탄화물의 탄소에 대해 프로브가 도 1에 도시된 바와 같은 결합형태를 나타내고, DNA 프로브를 고체 지지체에 강고하게 고정화시킬 수 있기 때문이라고 생각된다.

또한, 고정화된 프로브는, 도 1에 도시된 바와 같이 고체지지체 상에 수직으로 빽빽하게 들어차게 할 수 있기 때문에, 단위면적당의 고정화 밀도를 올릴 수 있다.

본 발명의 탄화물의 표면처리층의 두께는, 특별히 한정하는 것은 아니지만, 1nm∼1000nm의 두께이면 좋다. 1nm 미만에서는, 너무 얇아서 표면처리층의 두께가 균일해지지 않고, 하지(下地, underlininig)의 고체 지지체가 노출되는 부분이 존재하기 때문에 바람직하지 않다. 한편, 1000nm을 초과하는 피복은 형성중에 표면처리층 중에 응력이 발생하고, 박리가 발생하기 쉬워지기 때문에 바람직하지 않다. 공업상의 생산성으로 하면, 표면처리층의 두께는, 10nm∼500nm이다. 더욱 바람직하게는, 30nm∼200nm이다.

고체 지지체로의 탄화물의 표면처리층의 형성방법은 공지의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 고주파 스퍼터법(high frequency sputtering), 직류 스퍼터법(direct current sputtering), 아크이온도금법(arc ion plating), 및 열CVD법(thermal Chemical Vaper Deposit) 등을 들 수 있다.

본 발명의 고체 지지체는, DNA 프로브 등의 유전자 또는 단백질 등의 생산물질을 다수 부착할 수 있는 것이다. 따라서, 고체 지지체의 표면상에 복수의 미소 구분이 형성되고, 하나의 구분에 다수의 올리고뉴클레오티드 단편을 담지가능하게 되어 있는 것도 바람직하게 채용된다. 미소 구분의 각각에 있어서, DNA 프로브 등의 종류를 바꾸는 것에 대해서는 특별히 제한은 없고, 용도에 따라 적절하게 변화시킬 수 있다.

고체 지지체의 형상은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 필름 또는 시트와 같은 평판형상인 것이어도 좋고, 또한 원반형상 등이어도 좋다. 또한, 고체 지지체의 두께, 크기 등에도 특별히 제한은 없고, 통상용인 것과 동일한 범위로 할 수 있다.

고체 지지체의 기체가 되는 유리의 특성에 대해서도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 기체 표면에 대한 반응성 물질과의 친화성 등의 다양한 특성을 고려하여적절하게 선택할 수 있다.

또한, 이러한 기체의 표면, 또는, 표면에 반사층으로서 Ti, Au, Pt, Nb, WC 등의 단층 또는 이들 복합막을 만들어도 좋다. 반사층의 두께는 전체에 균일하게 피복되어야만 하기 때문에, 100nm 이상이 바람직하다. 또한, 바람직하게는, 1000nm 이상이 좋다.

또한, 하지(下地, underlining)의 고체 지지체의 표면은 의도적으로 조면화(粗面化, rough surface)되어 있는 것도 바람직하다. 이러한 조면화 표면은 기체의 표면적이 늘어나 다량의 DNA 프로브 등을 밀도를 높여 고정시키기에 바람직하기 때문이다.

기체 표면에는, DNA나 단백질을 고정하기 위해, 화학수식을 더 실시한다. 화학수식의 일례로서는, 탄화수소기의 말단에 활성화 에스테르기가 결합한 기를, 지지체 표면에 아미드결합을 통해 고정화하는 것을 말한다. 이러한 화학수식에 의해, DNA, 단백질, 펩타이드 결합(peptide bond) 등의 생체물질을 기체표면에 고정화하기 쉬워진다. 그 화학수식은, 말단에 극성기(polar group), 예를 들면, 수산기, 카르복시기(carboxyl group), 아미노기, 티올기(thiol group), 및 이소시아네이트기(isocyanate group) 등을 가지는 탄화수소기로 고체 지지체를 치환하게 된다.

상기 탄화수소기로서는, 탄소수가 1∼12인 것, 그 중에서도 1∼6인 것이 바람직하다. 예를 들면, 포름산(formic acid), 아세트산(acetic acid), 및 프로피온산(propionic acid) 등의 모노카르복시산(monocarboxylic acid); 옥살산(oxalicacid), 말론산(malonic acid), 숙신산(succinic acid), 말레산(maleic acid), 및 푸마르산(fumaric acid) 등의 디카르복시산(dicarboxylic acid); 및 트리멜리트산(trimellitic acid) 등의 폴리카르복시산(polycarboxylic acid)을 들 수 있다. 그 중에서도, 옥살산(oxalic acid) 및 숙신산(succine acid)이 바람직하다.

화학수식 방법으로서는, 예를 들면, 염소가스중에서 지지체에 자외선 조사하여 표면을 염소화하고, 이어서, 암모니아 가스중에서 자외선 조사하여 아미노화한 후, 적당한 산염화물(acid chloride) 또는 산 무수물(acid anhydride)응ㄹ 이용하여 카르복시기화(carboxylating) 한다.

본 발명의 고체 지지체에 부착될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 단편(프로브)에 대해서는, 1쇄(single stranded) 또는 2쇄(double-stranded)의 DNA, RNA 단편 등, 염기수에도 특별히 제한은 없다. 올리고뉴클레오티드 또는 DNA단편의 고정은, 고체지지체의 표면으로의 화학결합 등에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 탄화물의 표면처리층을 형성한 고체 지지체를 이용하는 경우, 표면을 활성화, 즉, DNA와 화학결합하기 쉽게 한 후에, DNA의 말단염기의 아미노기를 결함할 수 있다.

이 경우의 표면처리층을 형성한 고체 지지체의 화학수식 또는 활성화의 일례를 들면, 그 고체 지지체를 염소가스중에서 고체 지지체에 자외선 조사하여 탄화물의 탄소를 염소화하고, 이어서, 암모니아가스중에서 자외선 조사하여 아미노화한 후, 적당한 산염화물을 이용하여 카르복시화하고, 말단의 카르복시기를 탈수축합제인 카르보디이미드 (carbodiimide) 또는 디시클로헥시카르보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide), 1-[3-(디메틸아미노)프로필] 3-에틸카르보디이미드 (ethylcarbodiimide)를 이용하여, N-히드록시숙신이미드(hydroxysuccinimide)를 탈수축합함으로써, 아미드결합을 통해 탄화수소기의 말단에 N-히드록시숙신이미드 에스테르기 등의 활성 에스테르기가 결합한 기를 고정화할 수 있고, 활성화된다.

이리하여, 본 발명의 고체 지지체 표면을 활성화시켜 두면, 예를 들면, 염기배열이 이미 해명되어 있는 수만개의 DNA 단편(프로브)를 담지시킬 수 있다.

또한, 그 고체 지지체상에 올리고dT 프라이머(oligodT primer)를 결합시켜두고, 역전사반응 등으로 목적의 cDNA를 신장시키는 동시에 고체 지지체에 결합하는 것도 가능하다.

또한, PCR 등을 이용하여 고체 지지체 상에서 다수의 DNA쇄를 신장시키고, 또한, 결합시키는 것도 가능하다.

이렇게 하여, DNA 단편을 결합시킨 후, 이것에 형광표식한 DNA 샘플을 흘리면, DNA 샘플은, 그 고체 지지체 상에 결합시킨 DNA 단편(프로브) 중의 상보적인 배열을 가지는 프로브와 합성되기 때문에, 형광 스폿으로서 DNA 샘플의 배열을 해명할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 고체 지지체는, 어떤 DNA의 염기배열을 종래와 동일한 방법을 그대로 사용하면서 종래보다 매우 명료하게 해석, 특정할 수 있기 때문에, 생체 게놈의 해석, 유전자 발현의 모니터링, 게놈 불일치 등의 유전자 해석 등에 이용되는 것 외에, 종양 유전자의 돌연변이의 검출 등 유전자 진단이나 의약품의개발 등에 유용하다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더 설명한다.

(실시예 1)

(1) 아래와 같이 하여, 유전자 해석용에 이용하기 위한 고체 지지체로서 폴리에틸렌 테레프탈레이트 수지를 준비했다. 우선, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 수지는, 25mm(폭) ×75mm(길이) ×1mm(두께)인 것을 이용했다. 이어서, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 수지의 표면에, 타겟(target)으로서, 탄화 하프늄, 탄화 니오브, 탄화규소, 탄화 탄탈, 탄화 티탄, 탄화 텅스텐, 탄화 지르코늄을 이용하고, 아르곤가스를 작동가스로 하여 고주파 스퍼터법에 의해, 각각의 타겟의 탄화물로 이루어진 피막을 각각 약 10nm의 두께로 형성한 고체 지지체를 만들었다.

(2) 이어서, 이것들의 고체 지지체 표면을 화학수식하고, 활성화시켰다.

즉, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 수지의 표면을 1분간 염소화한 후, 10분간 아미노화하고, 염화수시닐(succinyl chloride) 용액에 10분간 직접 침지했다. 이어서, 초순수(超純水, ultra pure water)로 세정후, 활성화액에 침지하여 직접 활성화를 행했다. 활성화액의 조성은, 1,4-디옥산(dioxane) 1mL, 하이드로겐 시안아미드(hydrogen cyanamide) 25mL 및 N-히드록시숙신이미드(hydroxysuccinimide) 150mg이고, 이것들을 용해한 것이다. 또한, 초순수에서 세정후, 65℃에서 건조하여 활성화했다.

상기와 같이 하여 만든 고체 지지체 표면에, 500pmol/mL 농도의 FAMdA17용액2μL를 적하(滴下)했다(스폿). 이 때, 완충물(buffer)로서 초순수 또는 10% 포름아미드(formamide), 10% 포름알데히드(formaldehyde), 10% 글리세린, 또는 50% DMSO를 사용했다.

이어서, 인큐베이션(incubation)을 행했다. 조건은, 물/포름아미드=1/1 분위기중 65℃에서 1시간으로 했다(건조).

이리하여 얻어진 유전자 해석용으로서 이용되는 고체 지지체에 대해, 형광강도를 측정했다. 측정시간은 1분으로 하고, 장치는 LAS-1000Plus를 이용하여, 스폿 후 및 건조(65℃)후의 형광강도를 측정했지만, 종래 이용되던 고체 지지체보다 모두 우수한 값이었다.

본 발명의 고체 지지체는, 모두 스폿 후 및 건조 후의 형광강도에 대해서도, 종래의 고체 지지체 상의 스폿 후 및 건조 후의 형광강도보다 우수했다. 즉, 본 발명의 고체 지지체는, 어떠한 것에 있어서도 스폿한 DNA 또는 단백질 등의 생체물질 단편이 씻겨나가지 않고 고체 지지체상에 잔류하고, 스폿이 명료하게 검출될 수 있었다.

한편, 종래의 고체 지지체는, 스폿한 DNA 또는 단백질 등의 생체물질의 단편이 씻겨져버리고, 고체 지지체상에 잔류하지 않고, 스폿이 명료하게 검출될 수 없었다.

(실시예 2)

기체로서, 25mm(폭) ×75mm(길이) ×0.5mm(두께)의 실리콘을 이용했다. 이 실리콘 기체의 표면에, 타겟으로서 탄화탄탈을 이용하고, 아르곤가스를 작동가스로하여 고주파 스퍼터법에 의해, 탄화물로 이루어진 피막을 약 10nm의 두께로 했다.

이어서, 이 실리콘 기체의 표면을 화학수식하고, 활성화시켰다. 실리콘 기체 표면을 염소가스 중에서 1분간 자외선 조사하여 염소화한 후, 암모니아가스 중에서 10분간 아미노화하고, 무수숙신산용액에 20분간 침지했다. 무수숙신산용액은, N-메틸-2-피로리돈(pyrrolidone)에 무수 숙신산을 140mM/L, 붕산염 나트륨(sodium borate)(pH8)을 0.1M/L을 용해시켜 만들었다.

이어서, 활성화액에 침지하여 직접활성화를 행했다. 활성화액은, 200mL 비이커에, N-히드록시숙신이미드(hydroxysuccinimide)를 115mg과 1-[3-(디메틸아미드)프로필(propyl)] 3-에틸카르보디이미드를 959mg를 인산염 버퍼(phosphate buffer)(pH6) 50mL에 용해하고, 이것에 실리콘 기체를 침지하여 반응시키고, 세정했다.

이어서, 활성화한 기판에 DNA를 스폿팅(spotting)했다. DNA 샘플을 농도가 0.3㎍/μL로 되도록 50% DMSO 용액(스폿팅 버퍼)에 용해하여 스폿팅용 용액을 준비했다. 이어서, 스폿팅 장치를 이용하여, 슬라이드 글라스(slide glass) 표면에 DNA 샘플을 다수 부착했다.

그리고 나서, DNA 고정화를 위해 인큐베이션을 행했다. 우선, 물과 포름알데히드를 1:1로 혼합한 용액을 습도가 조절된 체임버(chamber)인 타이트 박스(tight box)에 넣었다. 이어서, 용액에 접촉하지 않도록 실리콘 기체를 습도가 조절된 체임버에 넣고, 3시간 방치했다. 그 후, 세정액(2 ×SSC, 0.2% SDS)으로 2번 세정하고, 또한, 0.1% SSC와 멸균수(sterile water)로 씻어내고, 원심건조했다.

이어서, 프리하이브리다이제이션(prehybridization) 용액(50% 포름아미드, 5 ×덴하르트액(denhardt solution)에 블록킹(blocking)했다. 블록킹 용액을 기판에 적하하고, 기포가 들어가지 않도록 커버글라스를 살짝 올려놓았다. 그 후, 기판을 습도가 조절된 체임버에 넣고, 60℃에서 1시간 블록킹을 행했다. 그 후, 0.1 ×SSC로 커버글라스를 씻어내고, 멸균수로 15분간 세정하여 원심 건조했다.

그리고 나서, DNA 샘플을 형화표식 라벨 키트(lable kit)로 형광표식한 후, 표준화한 DNA를 알칼리 변성했다. 표식 라벨을 하이브리다이제이션 버퍼(20% SSC, 20% 포름아미드, 0.5% SDS)에 용해하여 0.3㎍/μL로 조정하고, 하이브리다이제이션 용액으로 했다.

DNA를 고정한 실리콘 기체를 열수(hot water)에 5분간 침지한 후, 하이브리다이제이션 용액을 기판에 적하하고, 기포가 들어가지 않도록 커버글라스를 살짝 올려놓았다. 그 후, 습도가 조절된 체임버 중에서 12시간 하이브리다이제이션했다.

그 후, 0.1 ×SSC로 커버 글라스를 씻어내고, 세정액(2 ×SSC, 0.2% SDS)로 2번 세정하고, 또한, 0.1% SSC와 멸균수로 씻어내어 원심건조했다.

이리하여 얻어진 기판을, 후지사진필름제(Fuji Film) 플루오로이미지 분석기(fluoroimage analyzer) FLA-8000로 관찰을 행했다. 본 발명의 형광강도는, 1352이고, 종래의 845보다 높았다.

본 발명의 고체 지지체는, 어떤 DNA의 염기배열을 종래와 동일한 방법을 그대로 이용하면서 종래보다 매우 명료하게 해석 및 특정할 수 있기 때문에, 생체 게놈의 해석, 유전자 발현의 모니터링, 게놈 불일치 등의 유전자 또는 단백질 등의 생체물질 등에 이용되는 것 외에, 종양 유전자의 돌연변이의 검출 등 유전자 진단이나 의약품의 개발 등에 유용하다.

Claims (4)

1. 고체지지체의 표면에, 탄화 하프늄, 탄화 니오브, 탄화규소, 탄화 탄탈, 탄화 토륨, 탄화 티탄, 탄화 우라늄, 탄화 텅스텐, 탄화 지르코늄, 탄화 몰리브덴, 탄화 크롬, 또는 탄화 바나듐으로 이루어진 표면처리층이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 고체지지체.
2. 제 1항에 있어서, 상기 표면처리층의 두께가 1nm∼1000nm인 것을 특징으로 하는 고체지지체.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 표면처리층의 피막 상에는 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 단편을 담지시킨 것을 특징으로 하는 고체지지체.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 기재된 고체 지지체의 표면에 유전자를 담지시켜 유전자 또는 단백질 등의 생체물질을 해석하는 방법.