KR20030026069A - 티엔에프계 단백질과 플라보피리돌의 조합에 의한 암세포특이적인 세포사멸 유도용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암세포의 세포사멸 유도용 혼합 조성물에 관한 것이다. 종래에 존재하던 종양괴사인자(TNF ; tumor necrosis factor 이하 "TNF"라 한다)계 단백질과 플라보피리돌(Flavopiridol) 등은 각각이 그 뛰어난 항암 효과에도 불구하고 과량 투여시 독성등의 심각한 부작용이 발생하는 단점이 있었으나, 본 발명은 상기 TNF계 단백질과 플라보피리돌을 혼합한 조성물을 제공하여 저농도의 TNF계 단백질과 플라보피리돌을 사용함으로써 고농도의 단독 처리시 나타날 수 있는 독성이나 부작용을 감소시키고, 효능에 있어서도 암세포에 특이적으로 작용하고, 현저한 상승효과를 나타내는 암세포의 세포사멸 유도용 조성물을 제공한다.

Description

티엔에프계 단백질과 플라보피리돌의 조합에 의한 암세포 특이적인 세포사멸 유도용 조성물 {Apoptosis-inducing cancer-cell-specific composition by combination with TNF family protein and flavopiridol}

본 발명은 TNF계 단백질과 플라보피리돌의 조합에 의하여 암세포의 세포사멸이 상승적으로 일어날 수 있도록 한 세포사멸 유도 조성물에 관한 것이다.

종양괴사인자인 TNF(tumor necrosis factor)는 많은 종류의 세포에서 생산되는 다양한 기능을 하는 사이토카인(cytokine)으로서 염증, 감염, 기타 환경적 자극에 대한 반응으로서 생성된다.

TNF는 개체 또는 세포의 반응을 유발하여 일반적으로, 열, 조직손상, 암의 괴사, 식욕부진, 다른 사이토카인의 분비, 세포의 생장, 분화, 세포사멸 등을 초래한다. 이러한 반응은 TNF의 결합에 의해 유도되는 세포 표면의 수용체, 즉 TNFR1(TNF receptor 1) 과 TNFR2(TNF receptor 2)의 삼량체화(trimerization)에 의해 유발된다. 대부분의 TNF에 의한 생물학적 활성들은 TNFR1에 의해 전달되지만, 많은 부분 역시 TNFR2에 의해 매개된다. 하지만 TNFR2는 TNF에 의한 세포사멸현상에는 영향을 미치지 못하는 것으로 추측된다.

TNF에 의한 세포사멸에는 활성화된 TNF 수용체에 연속적으로 상호결합하는 일련의 단백질들에 의해 활성화된 캐스페이즈(caspase: cysteine-dependent aspartate-directed protease)들이 관여하여 세포사멸에 이르게 된다.

한편 TNF는 NF-κB(nuclear factor-kappaB)를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. TNF에 민감하게 반응하는 세포에서 NF-κB를 활성화시키면, TNF에 노출되었을 때 일어나게 되는 세포사멸을 억제할 수 있다는 것이 여러 종류의 세포를 이용한 실험들을 통하여 알려져 있으며, 반대로 대부분의 경우 NF-κB의 활성을 억제하게 되면 TNF에 대한 세포의 민감도를 높일 수 있다고 알려져 있다.

예를 들면, 지질다당류(lipopolysaccharides)는 NF-κB를 활성화시켜서 골수(myeloid)세포의 TNF에 의한 세포사멸을 저해하며, 전립선암세포에 특이적으로 발현하는 Par-4 단백질은 NF-κB의 활성을 억제하여 TNF에 의한 세포사멸을 증가시킨다.

그러나 NF-κB가 어떻게 세포사멸을 저해하는가는 확실하지 않다. 한가지 가능성은 NF-κB에 의해 발현되는 유전자산물들이 세포사멸의 신호전달체계를 방해할 수 있을 것이라는 것이다. 예를 들면, NF-κB에 의해 조절되는 유전자 중에는 IAP(세포사멸저해제, inhibitor of apoptosis), TRAF1, 그리고 TRAF2 등이 포함되어 있으며, 이들은 캐스페이즈-8의 활성화를 억제하는 것으로 판단된다. 따라서 만약 NF-κB의 저해제와 TNF를 조합하여 사용하면 세균 또는 바이러스에 의한 감염증이나 암을 치료할 수 있을 것이다. TNF는 암 이외의 여러 종류의 질병(관절염, 골다공증, 천식 등을 포함)에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

TNF는 강력한 항암 활성을 가지고 있지만, 심한 전신독성(systemic toxicity) 때문에 항암제로서의 임상적 사용에 제한을 받는다. 하지만 최근에 있어, 알킬화제 항암제의 일종인 멜파란(melphalan)과 고용량의 TNF를 조합하여 단리된 사지관류(isolated limb perfusion) 또는 단리된 간 관류(isolated hepatic perfusion) 방법을 통하여 흑색종(melanoma), 육종(sarcoma) 그리고 간암(hepatic cancer)의 치료에 사용하여 상당한 반응율을 보이고 있다.

TNF는 그 자체가 갖는 암세포에 대한 직접적인 독성에 의해서라기보다, 암조직과 관련된 혈관에 손상을 입히고, 또한 면역 기작을 활성화시키는 등의 간접적인 방법으로 항암효과를 나타내며, TNF와 감마인터페론(interferon-γ)과 멜파란(melphalan)의 조합적 처치에 의한 단리된 사지관류(isolated limb perfusion) 후에 암의 미세혈관과 거대 혈관이 상당히 손상을 입는다는 것이 밝혀져 있다. 이런 긍정적인 효과로 인해 TNF를 치료용량(therapeutic dose)으로 전신투약(systemic administration)을 하기 위해, TNF의 독성을 낮추려는 연구를 촉진되고 있다.

이러한 TNF를 이용한 질병치료방법에 대한 예로서는, 미합중국특허 5,750,495등이 있으며, 여기에서는 TNF-α을 이용하여 다낭신(polycystic kidney disease)을 치료하는 방법에 대하여 소개하고 있다.

TRAIL은 2형 막횡단(type II transmenbrane) 단백질로서, TNF계 단백질에 속한다. 사람의 TRAIL은 281개의 아미노산으로 구성되어 있으며, FasL(TNF수용체와 관련된 세포표면 수용체)과 TNF와 각각 28%, 23%의 상동성(homology)을 갖는다. 최근까지 사람에 있어서, DR4, DR5(Apo-2, TRAIL-R2, TRICK2 또는 KILLER로도 불린다.), DcR1(TRID, TRAIL-R3, 또는 LIT로도 불린다.), DcR2(TRAIL-R4 또는 TRUNDD라고도 불린다.), TR1 등 5종류의 수용체가 알려져 있다. TRAIL과 DR4 또는 DR5의 결합은 수용체의 삼량체화(trimerization)를 유도하여, 이것은 더 나아가 TNF와 유사하게 신호전달의 말단에 있는 캐스페이즈들의 활성화를 통해 세포의 자기사멸을 활성화시킨다. 하지만 TNF나 FasL과는 달리 TRAIL은 정상세포에는 세포독성을 나타내지 않으며, 쥐에 주입했을 때도 전신독성(systemic toxicity)을 보이지 않고 항암효과를 나타낸다. 따라서 TRAIL은 상당히 유망한 암치료제로서의 유용성을 보인다.

진핵세포의 세포주기는 일련의 싸이클린(cyclin) 단백질들이 여러 종류의 싸이클린(cyclin) 의존성을 갖는 인산화효소(CDK, cyclin-dependent kinase)들을 활성화시킴으로써 진행된다. 세포 속에는 이러한 인산화효소들을 조절하는 작은 분자량의 단백질 저해제가 존재하는데, p21, p27, p15, p16등이 포함된다. 이러한 단백질 저해제들은 종종 사람의 암세포 내에서 돌연변이가 일어나 있거나, 조절이 비정상적으로 일어나고 있는 현상이 관찰된다.

이러한 실험결과들은 CDK들의 기능을 저해하는 합성화합물들이 세포주기를 방해함으로써 세포의 분열을 막아 항암작용을 할 수 있다는 가능성을 제시하였으며, 그 중에서 플라보피리돌은 임상시험이 진행중인 대표적인 CDK 저해제이다. 플라보피리돌은 특히 CDK2와 CDK4의 작용을 저해하여 세포로 하여금 G1 phase에서 멈추게 함으로써 세포의 과량증식을 막아 암을 치료할 수 있다(Carlson 등, 1996, Cancer Res. 56: 2973-2978).

미합중국특허 6,087,366에서는 이러한 플라보피리돌 혹은 이의 염들을 이용하여 신경세포의 세포주기를 저해함으로써 알츠하이머나 파킨슨씨 병의 치료에 이용하는 방법이 나타나 있으며, 미합중국특허 6,225,473 에서는 이러한 플라보피리돌의 제조방법에 대하여 나타나 있다.

플라보피리돌은 쥐를 이용한 사람 암세포의 이종조직(xenograft)실험을 통해서도 암조직의 발달을 저해하는 효능이 있음이 입증되었다. 하지만 사람을 대상으로 한 임상실험에서 여러 가지 부작용을 수반하여 독성을 나타낸다.

위에서 언급한 바와 같이, TNF, TRAIL, 플라보피리돌등은 그 각각이 우수한 항암기능을 가지고 있으나, 개별적으로 임상에 쓰일 때, 고농도로 투약함에 따라 여러 가지 부작용을 수반하게 되는 문제점이 있었다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 TNF-α나 TRAIL을 플라보피리돌과 조합 처리함으로써 암특이적 세포사멸을 촉진시키고 저농도에서 세포사멸을 극대화하여 고농도에서 단독처리시 나타날 수 있는 독성을 예방하고 나아가 보다 안전하고 효과적인 항암치료법을 제시하는 암세포 특이적인 세포사멸 유도 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 다양한 사람의 암 세포주에서의 TNF-α와 플라보피리돌의 동시처리에 의한 상승적 세포사멸(synergistic apoptosis) 효과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 사람의 폐암 세포주인 A549에서의 TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리시 상승적 세포사멸 유도에 대한 처리 시간별 효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리시 세포사멸 유도 효과와 플라보피리돌의 단독 처리시의 효과를 비교한 그래프이다.

도 4는 TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리시의 처리 농도에 따른 세포 사멸 유도 효과를 비교한 그래프이다.

도 5는 TNF-α와 플라보피리돌의 동시처리 후에 나타나는 세포내 단백질의 양적인 변화를 전기영동 패턴으로 나타낸 사진이다.

도 6은 TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리에 의한 NF-κB의 전사활성의 변화를 측정한 그래프이다.

도 7은 TNF-α와 플라보피리돌의 조합 처리시에 나타나는 DNA 절단구조(laddering)를 관찰한 전기영동 사진이다.

도 8은 정상 세포주인 래트-2(rat2)에서의 TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리시 비독성 효과를 나타낸 그래프이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 TNF계 단백질과 플라보피리돌을 혼합하여 사용함으로써, 단독으로 사용할 때보다 그 효과가 현저하게 상승되는 암세포 특이적인 세포사멸 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에 사용되는 TNF계 단백질로는 TNF-α, TRAIL 등이 사용될 수 있으며, 그밖에 이와 유사한 단백질들이 사용될 수 있으며, 본 발명의 플라보피리돌은 하기의 구조식에만 국한되는 것이 아니라 이들의 염이나 그밖에 이와 유사한 것까지 포함한다.

본 발명의 상시와 같은 효과를 뒷받침하기 위해서 TNF-α, TRAIL, 플라보피리돌(flavopiridol: NSC649890, L86-8275, (-)cis-5,7-dihydroxy-2-(2-chlorophenyl) -8- [4-(3-hydroxy-1-methyl)-piperidinyl]-4H-1-benzopyran-4-one) 등을 단독으로 또는 조합하여 사람의 암세포 등을 포함한 여러 종류의 세포에 처리하여 세포독성을 FACScan 또는 DNA 단편(fragment) 관찰을 통하여 분석하였다. 약제가 처리된 세포에서의 여러 생물학적 변화를 이해하기 위해 웨스턴 블로팅(Western blot)방법이나 일시적 형질도입(transient transfection)방법을 이용하여 실험을 실시하였다.

본 발명의 조성물에는 세포사멸 효과를 향상시키기 위하여, 약제학적으로 첨가가 가능한 통상의 첨가제가 첨가될 수 있으며, TNF계 단백질은 1.0 내지 2000μg/㎖, 플리보피리돌은 1.0 내지 1000μg/㎖가 함유되는 것이 바람직하다.

하기 실시예 등을 통하여 본 발명은 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

<실시예1>

다양한 사람의 암세포주에서의 TNF-α와 플라보피리돌 혹은 TRAIL과 플라보피리돌의 조합처리에 의한 상승적 세포사멸(synergistic apoptosis)

사람의 암세포주들은 5% 소태아혈청(FBS: fetal bovine serum)을 포함하는 RPMI1640 배지(1000units/㎖ 페니실린 지(penicillin G), 100㎍/㎖스트렙토마이신 지(streptomycin G), 0.25㎍/㎖ 암포테리신 비(Amphotericin B), 2mM 글루타민(Glutamine) 포함)로 세포배양기 내에서 5% CO₂, 37℃조건 하에서 배양하였다. 사용한 사람의 암 세포주는 직장암 세포주 HCT-116, 방광암 세포주 T24, 직장암 세포주 HCT15, 폐암 세포주 A549 등이다. 암 세포에서 세포사멸 발생 여부를 측정하기 위해 FACScan(flow cytometric analysis)를 실시하였다. 그 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

먼저, 암 세포주를 직경이 60㎜인 배양접시(culture dish)에 5x10⁵개를 접종하고 5㎖의 상기 세포 배지 내에서 하루동안 키운 뒤 TNF-α(Boehringer Mannheim사 제품, 10ng/㎖)또는 TRAIL (Serotec사 제품, 50ng/㎖)을 각각 플라보피리돌(0.5μM)과 조합하여 동시 처리하였다. 표시된 시간동안 처리후의 상층의 배지를 15㎖ falcon 튜브(Becton Dickinson사 제품)에 모으고 붙어있는 세포를 5㎖ PBS로 두 번 세척한 후 0.5㎖의 0.15% 트립신(trypsin) 처리하여 떼어낸 후 보관된 상층의 배지와 합하였다. 그 다음 튜브를 200xg(gravity)의 속도로 5분간 원심분리하여 세포를 가라앉힌 후, 상층액을 제거하고 가라앉은 세포들을 300㎕의 PBS로 다시 잘 현탁(suspension)시키고 난 후, 교반(vortexing)시키면서 4℃로 냉각된 75% 에탄올 5㎖를 서서히 첨가하여 세포를 고정시켰다. 이것을 4℃에서 최소한 3시간 이상 방치 후 다시 원심 분리하여 에탄올을 제거 후 0.1㎎/㎖농도의 RNase(Sigma사 제품)가 든 PBS를 세포 밀도가 1x10⁶/㎖이 되도록 첨가한 후 여기에 다시 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, 1㎎/㎖,증류수)를 최종 농도 50㎍/㎖이 되도록첨가하여 30분간 상온으로 빛이 차단된 곳에 방치하여 염색하였다.

그 후 염색된 세포를 488㎚의 여기(excitation)파장과 588㎚의 방사(emission)파장으로 FACSort(Becton Dickinson사 제품)를 이용하여 10,000개의 세포를 FACScan 분석하였다. 히스토그램의 수치분석은 모디피트 소프트웨어(Modifit software ; Veriety software house사, Maine주 Topsham 소재)로 분석하였다.

TNF-α와 플라보피리돌 또는 TRAIL과 플라보피리돌을 조합하여 동시에 처리하는 경우, 하기의 표 1에서 보는 바와 같이 현저한 상승적 세포사멸이 유도됨을 확인하였다. 이러한 결과는 도 1에서와 같이 다양한 종류의 세포를 통한 실험에서도 관찰되었다(도1 : TNF-α와 플라보피리돌을 각각 10ng/㎖와 0.5μM농도로 각각 혹은 동시 처리하여 24시간동안 배양하였다. C; control, T; TNF-α(10ng/㎖), F.P; 플라보피리돌(0.5μM), +;TNF-α와 플라보피리돌을 각각 10ng/㎖와 0.5μM 농도로 동시 처리).

<TNF-α 혹은 TRAIL과 CDK 저해제인 플라보피리돌의 동시 처리에 의한 인간 폐암 세포주인 A549에서의 상승적 세포사멸 효과>

세포주	처리조건	처리시간(hrs)	세포주기 및 세포사멸
			G0/G1	S	G2/M	세포사멸(%)
A549	대조군TNF-α(10ng/ml)	6	58	33	9	0
			65	23	12	0
	플라보피리돌(0.5μM)TNF-α+플라보피리돌	6	65	21	14	0
			45	21	16	18
	TRAIL(50ng/ml)TRAIL+플라보피리돌	6	58	33	9	0
			48	19	11	22

(TNF-α, TRAIL, 플라보피리돌을 각각 10ng/㎖, 50ng/㎖, 0.5μM농도로 단독 혹은 동시 처리하였다.)

<실시예2>

사람의 폐암 세포주인 A549에서의 TNF-α와 플라보피리돌의 동시처리 시 상승적 세포사멸 유도에 대한 처리 시간별 효과

A549 세포주를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배양한 후 TNF-α와 플라보피리돌을 각각 10ng/㎖, 0.5μM 농도로 동시 처리하여 각각 0, 3, 6, 12, 24시간 동안 배양처리 하였고, 이를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 FACScan을 실시하였다.

아래의 표 2 및 도 2에서와 같이 동일조건에서 시간이 경과함에 따라 세포사멸이 점차적으로 증가됨을 확인하였다.(도2)

<TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리에 시간 증가에 따른 A549 세포주의 상승적 세포사멸 효과 증가>

시간(hrs)	G0/G1	S	G2/M	세포사멸(%)
0	58	33	9	0
3	48	32	13	7
6	32	11	25	31
12	30	0	17	52

<비교예1>

TNFα와 플라보피리돌의 처리순서가 세포사멸에 미치는 효과

A549 세포주를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배양한 후 TNF-α를 10ng/㎖ 농도로 6시간 처리한 후 5㎖ PBS로 2번 세척한 후 다시 플라보피리돌을 0.5μM농도로 6시간 처리하거나, 혹은 그 반대 순서로 각각 6시간 처리하거나, 혹은 동시 처리한 후 각각 6시간 혹은 12시간 동안 처리하였고, 이를 실시예 1에서와 동일 방법으로 고정 후 FACScan을 실시하였다.

하기의 표 3에서와 같이 TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리 시에만 현저하게 세포사멸이 유도됨을 확인함으로써, 동시에 두 약제에 세포가 노출되어야만 상승적 세포사멸이 유도됨을 알 수 있었다.

<TNF-α 와 플라보피리돌의 처리 순서가 세포사멸에 미치는 효과>

세포주	처리조건	처리시간(hrs)	세포주기 및 세포사멸
			G0/G1	S	G2/M	세포사멸(%)
A549	대조군	6	58	33	9	0
		12	61	30	9	0
	TNF-α	6	65	23	12	0
		12	75	12	13	0
	플라보피리돌	6	65	21	14	0
		12	66	16	17	0
	TNF-α→플라보피리돌	6→6	71	14	15	0
	플라보피리돌→TNF-α	6→6	66	16	17	1
	TNF-α+플라보피리돌	6	45	21	16	18
		12	31	11	10	48

<비교예2>

TNF-α와 플라보피리돌의 처리순서가 세포 사멸에 미치는 효과

실시예 1과 동일한 방법으로 A549 세포주를 배양한 후, TNF-α를 10 ng/ml농도로 3시간 동안 처리한 후에 처리액을 제거한 후 추가로 TNF-α와 플라보피리돌을 각각 10 ng/ml, 0.5 μM로 6시간 처리하거나, 혹은 플라보피리돌을 0.5 μM 농도로 3시간 동안 처리 후, 처리액을 제거하고 추가로 TNF-α와 플라보피리돌을 각각 10 ng/ml, 0.5 μM로 6시간 처리하거나, 혹은 TNF-α만을 10 ng/ml 농도로 9시간, 혹은 플라보피리돌만을 0.5 μM농도로 9시간 처리한 후 각각을 실시예1에서와 같은 방법으로 고정한 후 FACScan을 실시하였다.

하기 표 4에서와 같이 TNF-α와 플라보피리돌을 동시 처리 전에 TNF-α를 먼저 3시간 처리한 군에서는 세포사멸이 일어나지 않았고, 플라보피리돌을 먼저 처리한 군에서만 세포사멸이 강하게 일어났다.

<TNF-α 와 플라보피리돌의 처리 순서가 세포사멸에 미치는 효과>

세포주	처리조건	처리시간(hrs)	세포주기 및 세포사멸
			G0/G1	S	G2/M	세포사멸(%)
A549	대조군	9	55	36	9	0
	TNF-α	9	64	24	12	0
	플라보피리돌	9	60	21	19	0
	TNF-α→TNF-α+플라보피리돌	3→6	58	23	19	0
	플라보피리돌→TNF-α+플라보피리돌	3→6	25	15	10	50

<실시예 3>

TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리시의 세포사멸 유도효과의 효능(potency) 비교분석

폐암 세포주인 A549를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배양한 후 TNF-α와 플라보피리돌을 6시간 동안 각각 표시된 농도별로 따로 처리하거나 동시에 조합하여 처리한 후, 세포사멸 발생정도를 FACScan을 수행하여 비교하였다.

단독처리 시에는 플라보피리돌의 경우 50μM에서도, TNF-α의 경우 50ng/㎖의 농도에서도 유의한 세포사멸은 관찰되지 않았으며(도3, 도4(A)), 따라서 각 약제를 동시처리하면 낮은 농도에서 유의한 세포사멸을 유도할 수 있었다. 그리고 TNF-α의 존재하에서는 세포사멸의 발생정도가 플라보피리돌의 농도에 의존성을 보임을 알 수 있었다(도4(B)).

<실시예 4>

TNF-α와 플라보피리돌의 동시처리 시의 세포사멸 유도에 있어서의 캐스페이즈들의 역할 분석

A549를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배양한 후 여러 가지의 캐스페이즈들에 대한 펩티드성 저해제(peptide inhibitor, Alexis biochemical사 제품)들을 다양한 농도로 처리하고, 30분 후 TNF-α, 플라보피리돌을 동시 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 고정한 후 세포사멸의 발생정도를 FACScan을 통해 비교하였다.

하기의 표 5에서 보는 바와 같이 캐스페이즈 저해제(caspase inhibitor)들에 의해 농도 의존성을 가지고 세포사멸 발생이 저해됨을 확인하였고, 특히 Z-YVAD-FMK가 상당히 세포사멸을 억제함을 알 수 있다. 이를 통해 TNF-α와 플라보피리돌의 동시처리에 의한 세포사멸 유도에 활성화된 다양한 캐스페이즈들이 관여함을 확인하였다.

<TNF-α와 플라보피리돌의 동시처리에 의한 인간 폐암 세포주인 A549에서의 상승적 세포사멸에 있어서 캐스페이즈들의 역할 분석: TNF-α, 플라보피리돌을 각각 10ng/ml과 0.5μM농도로 처리하였다. 캐스페이즈 펩타이드 저해제들은 각각 3, 10, 30μM로, TNF-α와 플라보피리돌을 처리하기 30분 전에 세포에 처리하였다.>

세포주	처리시간(hrs)	처리조건	농도	세포주기 및 세포사멸
				G0/G1	S	G2/M	세포사멸(%)
A549	6	대조군TNF-α	0	64	25	11	0
			10ng/ml	67	23	10	0
		플라보피리돌+TNF-α	0.5μM	65	21	12	0
			10ng/ml	44	18	17	21
		캐스페이즈 1 저해제(Z-YVAD-FMK)(플라보피리돌+TNF-α)	3μM	53	18	12	17
			10μM	44	21	19	11
			30μM	54	26	17	3
		캐스페이즈 3 저해제(Z-DEVD-FMK)(플라보피리돌+TNF-α)	3μM	40	22	19	19
			10μM	45	21	19	15
			30μM	48	19	23	10
		캐스페이즈 8 저해제(Z-IETD-FMK)(플라보피리돌+TNF-α)	3μM	44	18	22	16
			10μM	46	22	17	15
			30μM	50	22	20	8
		캐스페이즈 9 저해제(Z-LEHD-FMK)(플라보피리돌+TNF-α)	3μM	47	15	23	15
			10μM	44	20	19	17
			30μM	46	21	18	15

<실시예5>

TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리 후에 나타나는 세포내 단백질의 양적인 변화 측정

폐암 세포주인 A549 세포를 직경 100㎜인 배양접시에 4x10⁶개를 상기 세포배양액에 깔아 하루동안 배양 한 뒤, TNF-α와 플라보피리돌을 각각 또는 합하여 표시된 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그 후 세포를 10㎖ PBS로 조심해서 2번 세척 후 단백질분해효소 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail; Roche사 제품, complete^TM-mini)이 든 PBS(1 tablet/50㎖ PBS)를 배양접시 당 1 ㎖씩 넣고 세포를 긁어모아 초음파처리로 세포를 파쇄시켰다. 이 샘플을 마이크로원심분리기로 12000 rpm으로 20분간 원심분리 후 상층액을 모아 브레드포드 염색시약(Bradford dye reagent, Bio-Rad사 제품)로 단백질을 정량한 후 40㎍의 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 젤(gel)상에서 전개하여 이를 다시 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane, Bio-Rad사 제품)으로 옮긴 후 각각의 조사하고자 하는 단백질에 특이적인 일차 항체와 고추냉이 퍼옥시데이즈(HRP, horseradish peroxidase)가 붙은 2차 항체(Amersham 또는 Bio-Rad사 제품), 그리고 ECL 화학발광시약(chemiluminescence reagent, Amersham사 제품)를 사용하여 각각의 단백질의 양적 변화를 분석하였다.

TNF-α와 플라보피리돌의 동시처리에 의해 캐스페이즈-3와 캐스페이즈-8이 활성화 됨을 확인하였고, 캐스페이즈의 기질인 Rb, PARP, 라민 비(Lamin B) 단백질이 분해됨을 확인하였다(도5 : C;control, T;TNF-α를 10ng/㎖ 농도로 처리, F.P; 플라보피리돌을 표시된 농도로 처리, +;TNF-α와 플라보피리돌을 각각 10ng/㎖, 0.5μM 농도로 동시 처리).

<실시예 6>

TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리에 의한 NF-κB의 전사활성(transcriptional activity)의 변화 측정

폐암 세포주인 A549를 직경 100㎜인 배양접시 2개에 각각 4x10⁶개씩 실시예 1에서와 동일한 배지에 깔고 난 후 24시간동안 배양하였다. 그 후 각 배양접시를 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum)을 포함하지 않는 RPMI 배지 10㎖로 세척 후, 이 중 1개의 배양접시에는 pNF-κB-루시퍼레이즈 플라스미드(Luciferase plasmid, Stratagene사 제품, 카탈로그 No. 219078)를 리포펙트아민플러스 진핵세포 이입시스템(lipofectAMINE PLUS^TMeukaryotic cell transfection system, Gibco-BRL사 제품)을 사용하여 제조회사의 지시대로 이입(transfection)시켰고, 다른 1개의 배양접시는 pNF-κB-루시퍼레이즈 플라스미드만을 제외한 대조 군으로 처리하였다. pNF-κB-루시퍼레이즈 플라스미드는 NF-κB 전사인자(transcription factor)에 의해서 발현이 조절될 수 있도록 프로모터 부위에 5개의 NF-κB결합인자를 포함하고 있으며, 표지 단백질인 루시퍼레이즈의 발현이 이 프로모터에 의존하도록 구성되어 있다. 자세히 기술하면 다음과 같다.

밑이 둥근 폴리스티렌 튜브(Becton Dickinson사 제품)에 9㎍의 플라스미드 DNA를, 대조군의 경우 동일 부피의 TE (10mM Tris, pH8.0, 1mM EDTA) 용액을, 54㎕의 PLUS 시약(Gibco-BRL사 제품)과 미리 섞은 후 FBS가 없는 RPMI1640 배지를 첨가하여 최종 900㎕로 만들었다. 그리고 다른 또 하나의 튜브(tube)에 36㎕의 리포펙트아민 시약(lipofectAMINE reagent, Gibco-BRL사 제품)에 소태아혈청(FBS)이 없는 RPMI1640 배지를 첨가하여 최종 900㎕로 만들었다. 그 후 상온에서 15분간 방치 후 각각을 서로 섞어 다시 상온에서 15분간 방치하였다. 그리고 나서 이 혼합액을 7.8㎖의 소태아혈청(FBS)이 없는 RPMI1640 배지로 교환된 A549 세포 배양 100㎜ 접시에 방울방울 떨어뜨려 이입(transfection)시켰다. 그리고 나서 37℃ CO₂세포배양기에서 5시간 배양한 후 다시 5% 소태아혈청(FBS)이 든 RPMI1640 배지로 교환한 후 다시 1시간 동안 배양기 내에서 배양하였다. 그 후 각 배양접시를 1㎖의 0.1% 트립신(trypsin) 용액(Gibco-BRL사 제품)으로 처리하여 세포를 떼어낸 후 모든 세포를30㎖의 5% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지로 옮겨 잘 섞은 후 12-웰 접시에 웰 당 2.5㎖씩 분주하였다. 그리고 나서 16시간 동안 배양기에서 배양한 후 TNF-α와 플라보피리돌을 각각 최종 농도 10ng/㎖, 0.5μM로 단독으로 혹은 조합하여 이중으로 2 웰 씩 처리하여 다시 6시간 동안 배양하였다.

그리고 나서 루시퍼레이즈 분석 시스템(luciferase assay system, Promega사 제품)을 제조회사의 지시대로 사용하여 세포 추출액 내의 루시퍼레이즈의 활성도를 측정하였다. 이 경우 빛(luciferase 활성도)의 세기는 루멧 모델 LB953 루미노미터(Lumat model LB953 Luminometer; Berthold사제품, Germany소재)를 사용하여 측정하였으며, 세포추출액 내의 단백질의 양은 중탄산염분석(bicarbonate assay, BCA)방법으로 소혈청단백질(bovine serum albumin, BSA)을 표준으로 하여 측정하였고, 이 값으로 활성도 측정값이 동일 단백질 양을 대변하도록 보정하였다.

TNF-α 단독으로 처리한 경우 루시퍼레이즈의 양이 증가하여 A549 세포가 TNF에 반응하는 것을 확인한 반면, 플라보피리돌은 루시퍼레이즈의 양적 변화에 영향을 미치지 못하였다. TNF-α와 플라보피리돌을 조합하여 처리하면 루시퍼레이즈양이 증가하지 않음을 알 수 있다(도6).

<실시예 7>

플라보피리돌과 TNF-α의 조합 처리시에 나타나는 DNA 절단구조(laddering) 관찰

A549 세포(1x10⁶cells)를 60㎜ 배양접시(culture dish)에 접종하고 하루동안 배양한 후, 플라보피리돌과 TNF-α를 표시된 농도로 단독으로 또는 조합하여 24시간동안 처리한 다음, DNA를 분리하기 위해 세포를 수거하였다. DNA 분리과정은 다음과 같다.

배지에 떠 있는 세포와 바닥에 붙어 있는 세포를 수거하여 PBS(phosphate buffered saline) 1㎖로 세척하고, 마이크로 원심분리기에서 5000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포침전을 얻는다. 상층액은 버리고, 침전된 세포에 파쇄용액(lysis buffer)(1% NP-40, 20mM EDTA, 50mM Tris-HCl, pH 7.5)를 넣어 부드럽게 피펫팅(pipetting) 하면서 세포를 파쇄한다. 세포파쇄액(cell lysate)를 5000rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 새 튜브에 취한다. 여기에 NaCl과 SDS를 넣어 최종농도가 0.2M, 0.5%가 되게 한 다음, 상층액의 동량에 해당하는 PCI(phenol: chloroform: isoamylalchol=25:24:1)용액을 첨가하여 교반(vortexing)하였다. 이것을 14,000rpm에서 2내지 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 취하여 페놀정제(phenol extraction)을 2회 더 반복한다. 상층액을 에탄올 침전하여 침전물을 100 ㎕의 물에 녹이고, RNase A를 넣어 37℃에서 10분간 반응시키면서 RNA를 제거하였다. 새로 만든 신선한 프로티네이즈 케이(proteinase K)로 37℃에서 10분간 반응시키면서 단백질을 제거하였다. 다시 페놀정제와 에탄올 침전법을 이용하여 DNA를 침전시킨 후, DNA를 1.5% 아가로오스 젤에서 전기영동하고, EtBr로 염색하여 자외선(UV) 하에서 확인하였다.

도 7에서 보는 바와 같이 플라보피리돌과 TNF-α를 동시에 처리한 세포들에서 세포사멸의 한 특징이 되는 DNA 절단구조(laddering)가 상당히 일어남을 관찰하였다(도7 : M; 1Kb DNA marker, C; control(0.1% DMSO), D; 1μM doxorubicun, T;TNF-α를 10ng/㎖ 농도로 처리, F.P; 플라보피리돌을 표시된 농도로 처리, +; TNF-α와 플라보피리돌을 각각 10ng/㎖, 0.5μM농도로 처리).

<실시예 8>

쥐의 정상 섬유아세포주 래트2(rat2)에서 TNF-α와 플라보피리돌의 동시 처리 시 비독성(non-cytotoxic)효과 확인

쥐의 세포주인 래트2(rat2) 세포를 60㎜ 배양접시에 5x10⁵개를 접종한 후 24시간동안 실시예 1에서와 같은 조건에서 배양 후 TNF-α와 플라보피리돌을 각각 10ng/㎖, 0.5μM 농도로 각각 단독으로 혹은 동시 처리하여 6시간동안 배양하였다. 그 후 실시예 1에서와 동일방법으로 세포를 떼어내 고정시켜 FACScan 분석을 하였다.

암세포주에서와는 달리 정상 세포주인 래트2(rat2)에서는, 도 8에서 보는 바와 같이 TNF-α와 플라보피리돌을 동시에 처리하였음에도 전혀 세포사멸을 관찰하지 못하였다. TNF-α와 플라보피리돌을 암세포에 동시처리 하였을 때에만 세포사멸이 일어나는 것으로 보아 항암 특이성을 지님을 알 수 있었다(도8).

이상에서 본 바와 같이 본 발명은 TNF-α와 플라보피리돌 또는 TRAIL 과 플라보피리돌의 조합에 의해 암세포에서 특이적으로 상승적 세포사멸을 촉진하는 세포사멸 유도 조성물을 제공하는 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

1. TNF계 단백질과 플라보피리돌(flavopiridol, 이의 염을 포함한다)을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 암세포 특이적인 세포 사멸 유도용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 TNF계 단백질이 TNF-α, TRAIL 또는 이들의 N-말단 또는 C-말단 등을 포함한 단백질 상의 변형체로 이루어지는 그룹중에서 1이상 선택되는 것임을 특징으로 하는 암세포 특이적인 세포사멸 유도용 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 TNF계 단백질이 1.0 내지 2000㎍/㎖, 상기 플라보피리돌이 1.0 내지 1000㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 상기 암세포 특이적인 세포 사멸 유도용 조성물.