KR20030009522A - Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor - Google Patents

Abstract

새로운 생물학적 합성 온콜리틱 분자가 제공된다. 제공되는 생물학적 합성 온콜리틱 분자는 오스테오폰틴으로부터 유도된 기능적 영역을 포함한다. 적절한 생물학적 합성 온콜리틱 분자는 오스테오폰틴으로부터 유도된 아폽토틱 영역을 포함한다. 제시된 본 발명에 따른 온콜리틱 분자는 세포의 아폽토시스를 향상시키는 능력을 가진다. 따라서, 본 발명에 의한 생물학적 합성 온콜리틱 분자를 특징짓는 치료적 사용이 개시된다.New biologically synthetic oncolytic molecules are provided. Provided biologically synthetic oncolytic molecules include functional regions derived from osteopontin. Suitable biologically synthetic oncolytic molecules include apoptotic regions derived from osteopontin. The oncolytic molecules according to the present invention presented have the ability to enhance apoptosis of cells. Accordingly, therapeutic uses to characterize biologically synthetic oncolytic molecules according to the present invention are disclosed.

Description

생물학적 합성 온콜리틱 분자 및 그 분자의 사용{BIOSYNTHETIC ONCOLYTIC MOLECULES AND USES THEREFOR}Biologically Synthetic Oncolytic Molecules and Uses of the Molecules {BIOSYNTHETIC ONCOLYTIC MOLECULES AND USES THEREFOR}

오스테오폰틴(osteopontin)은 도처에 존재하는 외부 세포 기질 인단백질(extracellular matrix phosphoprotein)이며 세포 접착(adhesion) 및 이전(migration)의 기능을 담당한다. 오스테오폰틴은 또한 αvβ3 인터그린(integrins) 및 플로테오글리칸 CD44와 같은 두 개의 형태의 수용체를 경유하는 형질 도입 경로의 세포 내부 신호를 개시한다. 오스테오폰틴은 산화적인 스트레스에 대한 세포 반응의 중요한 매개체라는 것이 밝혀졌으며, 이 과정에서 오스테오폰틴은 항 산화적인 작용 및 항-아폽토시스적인 효과를 나타낸다. 더욱이, 오스테오폰틴은 오스테오폰틴을 인식하는 여러 가지 세포 형태에 있어 아폽토시스를 억제할 수 있는 능력을 가진다(Weber, G. F. et al.(1997) Proc. Assoc. Am. Phys., 109:1-9). 오스테오폰틴의 발현은 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 종양 형성(tumorigenesis) 및 신진 대사(metastasis)를 포함하는 병리적인 상태와 관련된다(Oates, A.J. et al.(1997) Invasion Metast., 17:1-15).Osteopontin is an extracellular matrix phosphoprotein that is present everywhere and is responsible for the function of cell adhesion and migration. Osteopontin also initiates intracellular signals of the transduction pathway via two forms of receptors, such as αvβ3 integrins and floateoglycan CD44. Osteopontin has been found to be an important mediator of cellular responses to oxidative stress, in which osteopontin has antioxidant and anti-apoptotic effects. Moreover, osteopontin has the ability to inhibit apoptosis in various cell types that recognize osteopontin (Weber, GF et al. (1997) Proc. Assoc. Am. Phys., 109: 1- 9). Osteopontin expression is associated with pathological conditions including atherosclerosis, tumorigenesis and metastasis (Oates, AJ et al. (1997) Invasion Metast., 17: 1 -15).

세포의 아폽토시스(apoptosis), 또는 프로그램화된 세포 소멸은 세포의 독특한 일정 부분(subsets)이 발달되지 않는 상태에(embryonic development)있는 동안 및 조직에서 정상 세포의 전이(turnover) 상태에서 세포가 소멸하도록 만드는 매커니즘이다. 아폽토시스는 또한 바이러스 감염, 독성 제제에 대한 노출, 뢴트겐 선 치료를 포함하는 다양한 형태의 세포의 손상으로 인하여 시작된다. 세포 증식 및/또는 생존과 세포의 사멸 사이의 균형은 암과 같은 성장 제어를 벗어난 특징을 가지는 질병의 발병뿐만 아니라 정상적인 생리학적 상태에 대해서도 중요한 요소가 된다.Apoptosis, or programmed cell extinction, of a cell causes the cell to disappear during the development of a unique subset of the cell and in the turnover of normal cells in the tissue. It is a mechanism of making. Apoptosis also begins due to various types of cell damage, including viral infections, exposure to toxic agents, and roentgen treatment. The balance between cell proliferation and / or survival and cell death is important for normal physiological conditions as well as for the development of diseases that are characterized by out-of-growth control such as cancer.

본 발명의 여러 가지 특징과 이점은 아래의 상세한 설명 및 청구 범위로부터명백해질 것이다.Various features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description, and from the claims.

도 1의 A는 사람의 오스테오폰틴-B(OPN-b)의 아미노 산 서열(SEQ ID NO:1)을 도시한 것으로서, 인간의 오스테오폰틴 유전자의 적절한 스플라이스 변형체를 도시한 것이다.FIG. 1A depicts the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of human osteopontin-B (OPN-b), showing the appropriate splice variant of the human osteopontin gene.

도 1의 B 및 C는 OPN-a/nt(SEQ ID NO : 2) 및 OPN-b/nt(SEQ ID NO : 3)의 아미노 산 서열을 도시한 것으로서, 각각 인간의 오스테오폰틴-A 및 오스테오폰틴-B의 잘려진(truncated) 유도체를 나타내고, 아폽토시스를 유도한다.B and C in FIG. 1 depict amino acid sequences of OPN-a / nt (SEQ ID NO: 2) and OPN-b / nt (SEQ ID NO: 3), respectively representing human osteopontin-A and Truncated derivatives of osteopontin-B are shown and induce apoptosis.

도 1의 D는 "온콜리신 N(oncolysin N)"이라고 명명된 첫 번째 발생 생물학적 온콜리틱 분자를 도시한 것이다(SEQ ID NO : 4).1D depicts the first occurring biological oncolytic molecule named “oncolysin N” (SEQ ID NO: 4).

도 2a는 두 번째 발생 생물학적 합성 온콜리틱 분자 온콜리신 1(SEQ ID NO : 5) 및 온콜리신 2 (SEQ ID NO : 6)을 도시한 것으로서, 이들은 온콜리신 N으로부터 유도된 것이다.FIG. 2A depicts the second occurring biologically synthetic oncolytic molecules oncolysine 1 (SEQ ID NO: 5) and oncolysine 2 (SEQ ID NO: 6), which are derived from oncolysin N.

도 2b는 두 번째 발생 생물학적 온콜리틱 분자, 온콜리신 3 (SEQ ID NOs :7 및 8을 각각 나타낸다)의 뉴클레오티드 및 아미노 산 서열을 도시한 것이다.2B depicts the nucleotide and amino acid sequences of the second occurring biological oncolytic molecule, oncolysine 3 (representing SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively).

도 3은 제어 세포(control cell)와 비교할 때 온콜리신 1/소핀(Sophin C)으로 감염된 세포에 있어 신호 형질 도입의 경로에 있어서의 변형을 도시한 것이다. 막대 그래프는 감소된 SHP-1 단백질 발현 및 증가된 PI-3 키나제 발현을 양적으로 도시한 것이다.FIG. 3 shows the modifications in the pathway of signal transduction in cells infected with oncolysin 1 / soffin (Sophin C) as compared to control cells. Bar graphs quantitatively show reduced SHP-1 protein expression and increased PI-3 kinase expression.

도 4는 실험적인 동물 종양 모델에 있어서 종양 영역에 온콜리신 1-감염의효과를 도시한 것이다.4 shows the effect of oncolysine 1-infection on tumor areas in an experimental animal tumor model.

도 5는 서로 다른 종양 모델에 대하여 서로 다른 양으로 투여된 온콜리신 1의 효과를 도시한 것이다.5 shows the effect of oncolysine 1 administered in different amounts on different tumor models.

스트레스에 대한 세포적 반응의 조절에 있어 오스페오폰틴을 위한 역할의 관측된 지표가 주어지면, 오스테오폰틴의 세포적 활성(viability)에 영향을 미치는 매커니즘에 대한 보다 정확한 이해의 필요성이 존재한다. 오스테오폰틴에 의한 아폽토시스의 억제는 CD44 및 αvβ3 인터그린(integrin) 양쪽 모두의 조화된 결찰(ligation)( 및 이들을 통하여 신호하는 것)을 요구한다. 본 발명은 최소한 부분적으로 αvβ3 인터그린 및 CD44의 잘못된 결찰(misligtion)이 아폽토시스의 결과를 유발한다는 놀라운 발견에 근거하고 있다. 특별히, 아폽토시스의 유도는 N-터미날(terminal) 오스테오폰틴에 의한 αvβ3 인터그린 및 CD44의 결합(engagement)으로부터 발생하며 오스테오폰틴의 N-터미날은 αvβ4를 결합하기에는 충분하지만 활성화시키지는 못하고 CD44는 결합 및 활성화하기에 충분하다. αvβ4의 결합은 그것의 수용체를 통하여 임의의 신호를 하는 것(예를 들어, MAPK 신호하는 것)을 방해한다. CD44의 결합은 JNK 신호하는 것을 활성화시키고, MAPK 신호하는 것이 존재하지 않는 상태에서 JNK 신호는 아폽토시스를 활성화시키는 결과를 유발한다. 오스테오폰틴의 기능적 영역의 상세한 이해 및 이러한 복합 기능적 사이토킨(cytokine)은 세포적 아폽토시스의 조절하는 역할의 이해에 근거하여, 본 발명은 다양한 치료 응용에서 사용될 수 있는 오스테오폰틴의 명확한 기능과 유사한 기능을 가지는 생물학적 합성 분자를 제공하고, 특별히 암 치료 및 관절염과 같은 염증을 유발하는 조건을 치료하는데 사용되는 합성 분자를 제공한다. 특히, 본 발명에 따른 생물학적 합성 분자는 적어도 인터그린 수용체 및/또는 인터그린 및 CD44 수용체 양쪽을 동시에 발현하는 비정상적인 또는 필요하지 않는 세포의 제거에 사용될 수 있다.Given the observed indicators of the role for Osteopontin in the regulation of cellular responses to stress, there is a need for a more accurate understanding of the mechanisms affecting the cellular viability of osteopontin. Inhibition of apoptosis by osteopontin requires coordinated ligation of (and signaling through) both CD44 and αvβ3 integrins. The present invention is based, at least in part, on the surprising finding that incorrect misligtion of αvβ3 intergreens and CD44 results in apoptosis. Specifically, the induction of apoptosis results from the binding of αvβ3 intergreen and CD44 by N-terminal osteopontin and the N-terminal of osteopontin is sufficient to bind αvβ4 but does not activate and binds CD44. And enough to activate. Binding of αvβ4 interferes with any signal (eg, MAPK signaling) through its receptor. Binding of CD44 activates JNK signaling, and in the absence of MAPK signaling, JNK signaling results in activating apoptosis. Based on a detailed understanding of the functional domain of osteopontin and the understanding of these complex functional cytokines' role in regulating cellular apoptosis, the present invention provides a function similar to the clear function of osteopontin that can be used in various therapeutic applications. It provides a biologically synthetic molecule having a compound, and specifically a synthetic molecule used to treat cancer causing conditions such as inflammation and arthritis. In particular, the biosynthetic molecules according to the invention can be used for the removal of abnormal or unnecessary cells which simultaneously express at least the intergreen receptor and / or both the intergreen and CD44 receptor.

본 발명은 적어도 부분적으로는 세포의 아폽토시스의 조절자(modulator)로서 오스테오폰틴(osteopontin)을 위한 새로운 기능의 해명에 근거한다. 특별히, 오스테오폰틴은 어떤 영역을 포함하며 이러한 영역을 오스테오폰틴으로부터 분리되는 경우 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있는 능력을 가지는 것으로 밟혀졌다. 이러한 아폽토시스 조각(fragment)의 결합은 세포의 아폽토시스를 유발하는 오스테오폰틴 수용체(receptors)를 잘못 결합시킨다(mis-ligates). 특별히 이 조각(fragment)은 세포에서 공동으로 발현될 때(co-expressed) CD44v 및 αvβ3 인터그린을 결합한다. 공동 발현은 정상적인 상태에서는 극단적으로 드물기 때문에, 이러한 아폽토시스적인 조각을 포함하는 단백질은 이러한 수용체를 공동으로 발현하는 비정상적인 세포를 파괴하기 위하여 이용될 수 있고, 이러한 수용체는 여러 가지 준 안정 상태의 세포(metastatic cells) 및 관절염에 포함된 것과 같은 과도하게 활성화된(hyperactivated) 매크로파지(macrophage)를 포함한다.The present invention is based, at least in part, on the elucidation of a novel function for osteopontin as a modulator of apoptosis of cells. In particular, osteopontin has been stepped down to include certain regions and to have the ability to induce apoptosis of cells when these regions are separated from osteopontin. This binding of apoptosis fragments mis-ligates the osteopontin receptors that cause cell apoptosis. In particular, this fragment binds CD44v and αvβ3 intergreens when co-expressed in cells. Since co-expression is extremely rare in normal conditions, proteins containing these apoptotic fragments can be used to destroy abnormal cells that co-express these receptors, and these receptors are metastatic cells) and hyperactivated macrophages such as those included in arthritis.

오스테오폰틴의 온콜리틱 기능, 특히 아폽토틱 영역의 발견에 기초하여, 본 발명은 오스테오폰틴 유도 아폽토틱 조각(osteopontin derived apoptotic fragment)에 따라 형성된 생물학적 합성 분자를 특징으로 한다. 본 발명에 따른 생물학적 합성 분자는 아폽토시스를 향상시키는 것뿐만 아니라 세포의 성장 과정을 조절하기 위해서도 유용하다. 따라서, 한 가지 실시 형태에 있어서, 본 발명은 아폽토틱 성분 및 생물학적 모듈(biomodular) 성분을 포함하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자를 특징으로 하며, 이러한 것들은 아폽토시스를 향상시키는 분자를 형성한다. "생물학적 합성 분자(biosynthetic molecule)"라는 용어는 자연적으로 발생하는 단백질의 구성 요소보다 더 간단한 구성 성분 또는 구성 요소의 조합 또는 결합(a combination or union)에 의하여 형성되거나 합성되는 분자를 포함하고, 따라서 이러한 분자는 자연적으로 발생하는 분자의 단지 선택된 활성만을 가진다. 본 발명에 따른 생물학적 합성 분자는 인위적으로(자동화된 과정을 포함한다) 만들어지거나 형성되고, 따라서 자연적으로 발생하는 생물학적 과정으로부터 만들어지는 자연-발생적인 분자와는 구별된다. 다른 방법으로서, 본 발명의 생물학적 합성 분자를 생성하기 위하여 유기체(an organism)가 사용될 수 있고, 적어도 인위적인 합성 과정이 한 단계라도 존재한다면, 사람이 발명한 것이 된다.Based on the oncolytic function of osteopontin, in particular the discovery of apoptotic regions, the present invention features biologically synthetic molecules formed according to osteopontin derived apoptotic fragments. Biosynthetic molecules according to the invention are useful not only for enhancing apoptosis but also for regulating the growth process of cells. Thus, in one embodiment, the invention features a biologically synthetic oncolytic molecule comprising an apoptotic component and a biomodular component, which form a molecule that enhances apoptosis. The term "biosynthetic molecule" includes molecules formed or synthesized by a combination or union of components or components that are simpler than components of naturally occurring proteins, and thus Such molecules have only selected activities of naturally occurring molecules. Biologically synthetic molecules according to the invention are made or formed artificially (including automated processes) and are thus distinguished from naturally-occurring molecules made from naturally occurring biological processes. Alternatively, an organism can be used to generate the biologically synthetic molecules of the present invention, and if at least one artificial synthetic step exists, it is invented by a human.

"온콜리틱(oncolytic)" 또는 "온콜리틱 분자(oncolytic molecule)"는 조절적인(modulatory) 또는 통제하는(regulatory) 활성을 가지는 분자를 포함하고 이러한 활성은 예를 들어 고등동물이나 인간과 같은 유기체에 있어서 아폽토시스적인 반응과 정상적으로 관련된다. 아폽토시스적인 반응과 관련된 활성(예를 들어, 생물학적 또는 기능적 활성)은 발현 신호(a delevelopmental signals), 성장 저해 조건, 바이러스 감염, 세포 손상 또는 질병에 반응하는 프래그램된 세포 소멸의 유도와 관련될 수 있다. "활성(activity)", "생물학적 활성(biological activity)" 또는 "기능적 활성(functional activity)" 이란 용어는 본 발명에 따른 분자(예를 들어, 생물학적 합성 분자 또는 단백질, 폴리 펩티드 또는 핵산 분자)에 의하여 발휘된 활성을 언급하는 것으로서 표준적인 기술에 따라 생체 내에서 또는 시험 과정(in vitro)에서 결정된다.An "oncolytic" or "oncolytic molecule" includes a molecule having a modulatory or regulating activity, such activity being for example a higher animal or a human being Normally associated with apoptotic responses in organisms. Activity associated with an apoptotic response (eg, biological or functional activity) may be associated with the induction of programmed decay in response to a delevelopmental signals, growth inhibition conditions, viral infections, cell damage or disease. have. The terms "activity", "biological activity" or "functional activity" refer to molecules according to the invention (e.g., biologically synthetic molecules or proteins, polypeptides or nucleic acid molecules). Refers to the activity exerted by it and is determined in vivo or in vitro according to standard techniques.

"아폽토시스적 반응(apoptotic response)"은 프로그램된 세포 소멸의 유도와 관련된 임의의 반응을 포함하고 세포의 소멸은 염색질 응축(chromatin condensation) 및 단편을 만드는 것(fragmentation), 감소된 세포 생활성(viability) 및 세포 용해(lysis)를 포함하지만 이러한 것들에 제한되는 것은 아니다. "아폽토시스적인 반응을 조절한다(modulates)" 또는 "아폽토시스적 반응의 조절자(modulator)"는 상승조절(upregulation), 아폽토시스적인 반응을 향상 또는 증가시키는 것을 포함하며 이러한 것으로서 본 명세서에서 정의되어 있다. "아폽토시스적인 반응을 조절한다" 또는 "아폽토시스적인 반응의 조절자"라는 용어는 본 명세서에서 정의된 것처럼 또한 하강 규제(downregulation), 아폽토시스적인 반응의 억제 또는 감소를 포함한다."Apoptotic response" includes any response associated with the induction of programmed cell death, and cell death is associated with chromatin condensation and fragmentation, reduced cell viability ) And cell lysis, but are not limited to these. “Modulates an apoptotic response” or “modulator of an apoptotic response” includes and is defined herein as upregulation, enhancing or increasing an apoptotic response. The terms "modulate apoptotic response" or "modulator of apoptotic response" also include downregulation, inhibition or reduction of apoptotic response, as defined herein.

본 발명은 아울러 아폽토시스적인 구성요소를 포함하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자를 특징으로 한다. "아폽토시스적인 구성 성분(apoptotic component)"라는 용어(본 명세서에서는 "아폽토시스 영역(domain)" 또는 "프로-아폽토시스 영역"라는 용어로도 또한 언급된다)는 어떤 분자의 조각(a piece) 또는 구성 요소(constituent)를 포함하고 이러한 조각 또는 요소는 분자의 한 부분으로서 분자보다 더 작고 세포의 아폽토시스를 향상시키는 기능을 한다. 본 명세서에서 기술된 것처럼, 본 명세서에서 기술된 것처럼, 아폽토시스적 구성 성분(component)은 세포 표면에서 발현된 인터그린(예를 들어, αvβ3) 및 CD44(예를 들어 CD44V)를 결합할 수(ligating) 있는 능력이 성분을 포함하고, 이러한 성분은 CD44(예를 들어, JNK 신호 경로의 활성)를 통하여 신호하는 결과를 유발하고 인터그린 신호를 방해한다(예를 들어, MAPK 신호를 활성화 시킬 수 있는 임의의 다른 리간드(ligand)의 결합을 방해하는 것). 예를 들어, 아폽토시스적 성분을 포함하는 분자는 아폽토시스적인 구성 성분이 없는 동일한 세포와 비교할 때 아폽토시스적 구성 성분이 존재하는 상태에서 생존 가능한 세포(a viable cell)가 아폽토시스를 유발 시킬 수 있는 능력을 가진다. 적절한 아폽토시스적 구성 성분 또는 프로-아폽토시스적 영역은 SEQ ID NO:1로 표현되는 사람의 오스테오폰틴 서열의 아미노 산147-170을 포함한다. 다른 선택 가능한 것으로서, 아폽토시스적 구성 성분 또는 프로-아폽토시스적 영역은 SEQ ID NO:1의 아미노 산 147-170에 대한 0-5, 5-10, 10-15 또는 15-20의 연속적인(consecutive) 아미노 산 잔여물(residues) N 터미널 또는 C 터미널을 포함하고, SEQ ID NO:1의 아미노 산 147-170을 구성하는 아폽토시스적 활성 영역을 적어도 60%, 적절하게는 적어도 70%, 보다 적절하게는 적어도 80%, 가장 적절하게는 적어도 90-95%를 유지한다(예를 들어 아폽토시스 분석 시험에서 공지된 임의의 분야에서 결정되는 것처럼, 단독으로 분석되거나 또는 본 명세서에서 정의된 것처럼 생물학적 합성 분자의 내용물(context)로서 분석된다). 다른 실시 형태에 있어서, 아폽토시스적 구성 성분 또는 프로-아폽토시스적 영역은 SEQ ID NO:1의 147-170으로부터 24 아미노 산 잔여물(residues) 보다 작은 수를 포함한다(예를 들어, SEQ ID NO:1의 147 내지 170으로부터 서열(sequence)의 단지 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 의 연속적인 아미노 산 잔여물을 포함하고, 그럼에도 불구하고 SEQ ID NO:1의 아미노산 147-170을 구성하는 적어도 60%, 적절하게는 적어도 70%, 보다 적절하게는 적어도 80%, 가장 적절하게는 적어도 90-95%의 아폽토시스적 활성 영역을 유지한다). 다른 실시 형태에 있어서, 아폽토틱 반응 또는 프로-아폽토틱 영역은 치환된 1,2, 3,4,5,6,7,8,9 또는 10 아미노 산 잔여물을 가지지만 그럼에도 불구하고 적어도 SEQ ID NO:1의 아미노 산을 구성하는 영역의 아폽토틱 활성을 적어도 60%, 적절하게는 적어도 70%, 보다 적절하게는 적어도 80%, 보다 더 적절하게는 적어도 90-95%를 유지한다.The invention also features biologically synthetic oncolytic molecules comprising apoptotic components. The term "apoptotic component" (also referred to herein as the term "apoptotic domain" or "pro-apoptotic region") refers to a piece or component of a molecule. (constituent) and such fragments or elements are smaller than the molecule as part of the molecule and function to enhance apoptosis of the cell. As described herein, as described herein, an apoptotic component is capable of binding intergreens (eg αvβ3) and CD44 (eg CD44V) expressed at the cell surface. Ability to contain components, which can result in signaling through CD44 (eg, activity of the JNK signaling pathway) and interfere with intergreen signaling (eg, can activate MAPK signals). Interfering with the binding of any other ligand). For example, a molecule containing an apoptotic component has the ability of a viable cell to induce apoptosis in the presence of an apoptotic component as compared to the same cell without an apoptotic component. . Suitable apoptotic components or pro-apoptotic regions include amino acids 147-170 of the human osteopontin sequence represented by SEQ ID NO: 1. As another selectable, the apoptotic component or pro-apoptotic region is consecutive of 0-5, 5-10, 10-15 or 15-20 to amino acid 147-170 of SEQ ID NO: 1. Amino acid residues comprising at least 60%, suitably at least 70%, more suitably an apoptotic active region comprising an N terminal or a C terminal and constituting amino acids 147-170 of SEQ ID NO: 1 Maintain at least 80%, most suitably at least 90-95% (e.g., the content of a biologically synthesized molecule as analyzed alone or as defined herein, as determined in any art known in apoptosis assays). (context). In another embodiment, the apoptotic component or pro-apoptotic region comprises a number less than 24 amino acid residues from 147-170 of SEQ ID NO: 1 (eg, SEQ ID NO: Comprising only 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23 consecutive amino acid residues of the sequence from 147 to 170 of 1 and nevertheless amino acid of SEQ ID NO: 1 At least 60%, suitably at least 70%, more suitably at least 80%, and most suitably at least 90-95% of the components 147-170). In another embodiment, the apoptotic response or pro-apoptotic region has substituted 1,2,3,4,5,6,7,8,9 or 10 amino acid residues but nevertheless at least SEQ ID NO. Maintain at least 60%, suitably at least 70%, more suitably at least 80%, even more suitably at least 90-95% of the apoptotic activity of the regions making up the amino acid of NO: 1.

아폽토시스적 구성 성분에 대한 추가에 있어서, 본 발명에 따른 생물학적 합성 분자는 생물학적 모듈러(biomodular) 구성 성분을 포함할 수 있다. "생물학적 모듈러 구성 성분(biomodular component)"은 분자의 한 부분으로서 분자의 크기보다 더 작은 분자의 한 조각 또는 구성 요소를 포함하고, 이러한 조각 또는 요소는 아폽토시스적 구성 성분의 기능과 명확하게 구분되는 생물학적 기능 또는 아폽토시스적 구성 성분과는 명확하게 구분되는 생물학적 구조 중의 어느 하나를 가진다. 생물학적 모듈러 구성 요소는 아폽토시스적 구성 성분을 포함하는 자연-발생적인 분자에서는 발견되지 않거나 또는 자연-발생적인 분자의 내부에 존재하기 때문에아폽토시스적 구성성분에 대한 동일한 인접 관련성(in the same proximal relations)에서는 발견되지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 생물학적 모듈러 구성 요소는 폴리펩타이드가 된다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드 생물학적 모듈러 구성 요소는 시그널 펩타이드(signal peptide), 링커 영역(a linker domain), 및 골지 과정 영역(a golgi processing domain)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.In addition to the apoptotic component, the biologically synthesized molecule according to the present invention may comprise a biological modular component. A "biomodular component" is a portion of a molecule that contains a piece or component of a molecule that is smaller than the size of the molecule, which piece or element is a biological component that is clearly distinguished from the function of the apoptotic component. Have a biological structure that is clearly distinct from a functional or apoptotic component. Biological modular components are not found in naturally-occurring molecules, including apoptotic components, or because they exist inside of naturally-occurring molecules, they may be present in the same proximal relations. Not found In one embodiment, the biological modular component is a polypeptide. Polypeptide biological modular components according to the present invention include, but are not limited to, signal peptides, a linker domain, and a golgi processing domain.

"시그널 펩타이드(signal peptide)" 또는 "시그널 서열(signal sequence)"이란 용어는 분비성(secretory) 또는 구성적(integral) 막 단백질(membrane proteins)의 N-터미너스(terminus)에서 발생하고 수 많은 소수성 아미노 산 잔여물을 포함하는 약 20 아미노 산을 포함하는 펩티드와 관련된다. 예를 들어, 시그널 서열은 적어도 약 14-28 아미노 산 잔여물을 포함하고, 적절하게는 약 16-26 아미노 산 잔여물을 포함하고, 적어도 약 40-70%, 적절하게는 약 50-65%, 및 보다 적절하게는 약 55-60% 소수성 아미노 산 잔여물(예를 들어, 아날린(Alanine), 발린(Valine), 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 티로신(Tyrosine), 트립토판(Tryptophan), 또는 프롤린(Proline))을 가진다. "시그널 서열(signal sequence)"과 같은 것은 또한 "시그널 펩티드(signal peptide)"로서 관련 분야에서 언급되고, 서열을 포함하는 단백질을 세포의 내부 원형질 (endoplasmic) 망상 조직(reticulum)으로부터 골지 장치(golgi apparatus)로 및 궁극적으로는 지질 이중층(a lipid bilayer)(예를 들어, 세크리틴을 위하여)에게 유도하는 역할을 한다. 적절한 시그널 시퀀스는 인간의 오스테오폰틴으로부터 유도된다(예를 들어 SEQ ID NO:1로서 제시된 인간의 오스테오폰틴 서열의 아미노 산 1-16을 포함한다).The terms "signal peptide" or "signal sequence" occur in the N-terminus of secretory or integral membrane proteins and are numerous. It relates to a peptide comprising about 20 amino acids including hydrophobic amino acid residues. For example, the signal sequence comprises at least about 14-28 amino acid residues, suitably comprises about 16-26 amino acid residues, and at least about 40-70%, suitably about 50-65% And, more suitably, about 55-60% hydrophobic amino acid residues (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine ), Tryptophan, or Proline). Such as "signal sequences" are also referred to in the art as "signal peptides", and proteins comprising sequences are incorporated into the Golgi apparatus from the internal endoplasmic reticulum of the cell. apparatus and ultimately to a lipid bilayer (eg for sacritin). Suitable signal sequences are derived from human osteopontin (including amino acids 1-16 of the human osteopontin sequence shown as SEQ ID NO: 1).

"링커(linker)"라는 용어는 단백질의 내부에 포함될 때 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 생물학적 합성 분자를 포함하고 구형의 폴딩(globular folding)을 최소화하고, 모듈러 단백질을 구분된 기능적인 영역 내부로 분리하고, 단백질, 펩티드 또는 생물학적 분자의 기능성을 유지하는 기능을 한다.The term "linker" includes a polypeptide or a biologically synthetic molecule according to the invention when included inside a protein, minimizes globular folding, separates modular proteins into distinct functional regions, , To maintain the functionality of proteins, peptides or biological molecules.

"골지 과정 영역(golgi processing domain)"이란 용어는 단백질의 내부에 포함될 때 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 생물학적 합성 분자를 포함하고, 분자에 대하여 내부 원형질 망상 조직 및 골지 장치를 통한 수송을 경유하여 세포로부터 분비되는 능력을 수여하는 기능을 하며, 예를 들어 카보하이드레이트(carbohydrate)의 첨가를 경유한다. 적절한 골지 과정 영역은 인간의 오스테오폰틴으로부터 유도된다(예를 들어, SEQ ID NO:1로 제시된 서열의 아미노 산 17-30을 포함한다). 추가적인 실시 예로서의 생물학적 모듈러 구성 성분은 예를 들어 헤파린 결합 영역(heparin binding domain) 및/또는 콜라겐 결합 영역(collagen binding domains)을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것처럼, "헤파린 결합 영역"이란 용어는 생물학적 합성 분자의 결합을 이용하는 성분을 포함하고 이러한 성분은 예를 들어 표적 세포(a target cell)를 둘러싸고 있는 외부세포 기질에 있어서 헤파린을 가진 외부세포 기질 구성 성분에게 결합되고, 표적 세포에 대한 생물학적 합성 분자의 상호 작용을 안정화시킨다. "헤파린 결합 영역"은 적어도 하나, 적절하게는 둘, 보다 적절하게는 세 개, 네게, 다섯 개 또는 여섯 개 "헤파린 결합 모티프(motifs)"를 포함하고 이러한 모티프(motifs)는 분자식(formula) arg-xaa-염기 잔여물(basic residue)-염기 잔여물로 표현되고, 적절하게는 arg-xaa-(arg 또는 lys)-(arg 또는 lys)로 표현된다. 예시적인 헤파린 결합 모피프는 적절하게 RXRR, RXKK, RXRK 및 RXKR을 포함한다. 연속적인 헤파린 결합 모티프는 적절하게 두 개의 아미노 산에 의하여 분리되고, 예를 들어 xaa-xaa 에 의하여 분리된다. 이러한 이유로 적절한 헤파린 결합 영역은 분자식 (R-X-R/K)-(X-X-R-X-R/K)_n으로 표현되고, 위 식에서 n=1이되고, 적절하게는 2, 보다 적절하게는 3 또는 4가 된다. 적절한 실시 형태에 있어서, n=2가 된다(추가적인 연속적인 헤파린 결합 모티프가 첨가될 수 있지만, 결과적으로는 생물학적 합성 온콜리틱 분자의 아폽토시스적 효과를 증가시키기 보다는 감소시킬 것이다). 특별히 적절한 헤파린 결합 영역은 아미노 산 서열 RSKKAARGRR(SEQ ID NO:6의 아미노 산 62 내지 71). 다른 특별히 적절한 헤파린 결합 도메인은 아미노 산 서열 RSKKAARGRRAARGRR(SEQ ID NO:8의 아미노 산 62 내지 77)이 된다.The term "golgi processing domain" includes a polypeptide or a biologically synthetic molecule according to the present invention when contained within a protein, and from the cell via transport through the internal plasma network and the Golgi apparatus to the molecule. It functions to confer the ability to be secreted, for example via the addition of carbohydrate. Suitable Golgi process regions are derived from human osteopontin (eg, comprising amino acids 17-30 of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1). Biological modular components as further embodiments include, for example, heparin binding domains and / or collagen binding domains. As used herein, the term "heparin binding region" includes components that utilize the binding of biologically synthetic molecules, which components have heparin, for example, in the extracellular matrix surrounding a target cell. It binds to extracellular matrix components and stabilizes the interaction of biologically synthetic molecules with target cells. A "heparin binding region" comprises at least one, suitably two, more suitably three, four, five or six "heparin binding motifs" and these motifs are formula arg -xaa-basic residue-is expressed as base residue, suitably as arg-xaa- (arg or lys)-(arg or lys). Exemplary heparin binding morphs include RXRR, RXKK, RXRK and RXKR as appropriate. Successive heparin binding motifs are suitably separated by two amino acids, for example by xaa-xaa. For this reason a suitable heparin binding region is represented by the molecular formula (RXR / K)-(XXRXR / K) _n , where n = 1, suitably 2, more suitably 3 or 4. In a suitable embodiment, n = 2 (additional successive heparin binding motifs may be added but will eventually reduce rather than increase the apoptosis effect of biologically synthetic oncolytic molecules). Particularly suitable heparin binding regions are amino acid sequence RSKKAARGRR (amino acids 62-71 of SEQ ID NO: 6). Another particularly suitable heparin binding domain is the amino acid sequence RSKKAARGRRAARGRR (amino acids 62-77 of SEQ ID NO: 8).

본 명세서에서 사용된 것처럼, "콜라겐 결합 영역(collagen binding domain)"은 생물학적 합성 분자를 외부 기질(matrix) 구성 성분에게 결합시키는 것을 이용하는 구성 성분을 포함하고, 이러한 외부 기질 구성 성분으로서는 표적 세포를 둘러싸고 있는 외부 기질에서 콜라겐을 가진 것이 있고 , 이러한 결합은 생물학적 분자와 표적 세포 사이의 상호 작용을 안정화시킨다. 특별히 적절한 콜라겐 결합 영역은 아미노 산 서열 PAGAAGGPAGPAGPAGPAGPAGP(SEQ ID NO:6의 아미노 산 65내지 87)을 가진다.As used herein, "collagen binding domain" includes components that utilize binding biological synthetic molecules to an external matrix component, which surrounds the target cell. There is collagen in the external matrix, which binds to stabilize the interaction between the biological molecule and the target cell. Particularly suitable collagen binding regions have the amino acid sequence PAGAAGGPAGPAGPAGPAGPAGP (amino acids 65-87 of SEQ ID NO: 6).

따라서, 본 발명에 따른 생물학적 합성 분자는 적어도 아폽토시스 영역 및 생물학적 모듈러 구성 성분의 결합에 의하여 형성된다. "형성된(formed)" 또는 "형성하는(forming)"이란 용어는 적어도 두 개의 구성 요소를 구조적 및/또는 기능적 관련(association)으로 가져가는 것을 포함한다. 예를 들어, 재-조합 핵산 분자(a recombinant nucleic acid molecule)는 적어도 두 개의 핵 산 구성 성분을 함께 가져가는 것에 의하여 형성될 수 있다. 또 다른 것으로서, 재-조합 단백질은 적어도 두 개의 단백질 구성 성분을 함께 가져가는 것에 의하여 형성될 수 있다. 더욱이, 조성물(a composition)은 적어도 두 개의 조성물을 함께 가져가는 것에 의하여 형성될 수 있다.Thus, the biologically synthetic molecules according to the invention are formed by the combination of at least an apoptotic region and a biological modular component. The term “formed” or “forming” includes bringing at least two components into a structural and / or functional association. For example, a recombinant nucleic acid molecule can be formed by bringing together at least two nucleic acid components. As another example, the recombination protein can be formed by bringing together at least two protein components. Moreover, a composition can be formed by bringing together at least two compositions.

적절한 실시 형태에 있어서, 본 발명은 오스테오폰틴으로부터 유도된 아폽토시스적 구성 성분을 포함하는 생물학적 합성 분자를 특징으로 한다. "로부터 유도된(derived from)" 구성 성분, 예를 들어 오스테오폰틴, 은 오스테오포틴으로부터 기원하는 어떤 특징을 가지고 그러한 것으로 인지될 수 있지만 오스테오폰틴과 동일하지는 않는 특징들을 가지는 구성 성분을 포함한다. 적절하게, 아폽토시스적 구성 성분은 인터그린(예를 들어, αvβ3 인터그린)을 결합하는 충분한 서열 정보를 가지지만 인터그린(예를 들어, αvβ3 인터그린)을 경유하여 신호를 보내는 충분한 서열 정보는 부족하다. 하나의 실시 형태에 있어서, 아폽토시스적 구성 성분은 오스테오폰틴으로부터 유도된 폴리펩티드가 된다. 따라서, 아폽토시스적 구성 성분은 오스테오폰틴의 특징(예를 들어, 아폽토시스를 향상시키는 기능)을 가지지만, 오스테오폰틴과 동일하지는 않다. 한 가지 실시 형태에 있어서, 아폽토시스적 구성 성분은 오스테오폰틴의 아폽토시스적 영역과 적어도 50% 확인성(identity)을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 아폽토시스적 구성 성분은 오스테오폰틴의 아폽토시스적 영역과 적어도 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 동일하다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 아폽토시스적 구성 성분은 인간의 오스테오폰틴-B(SEQ ID NO:1)의 아미노 산 147-170을 구성하는 아미노 산 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 아폽토시스적 구성 성분은 인간의 오스테오폰틴-B(SEQ ID NO:1)의 대략적으로 아미노 산 147-170과 적어도 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 아폽토시스적 구성 성분은 길이에 있어서 적어도 5-50 아미노 산인 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 아폽토시스적 구성 성분은 길이에 있어서 10-45, 15-40 또는 20-30 사이에 있거나, 또는 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29 아미노 산이 되는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 아폽토시스적 구성 성분은 길이에 있어서 50 아미노 산 보다 더 큰 폴리펩티드를 포함한다.In a suitable embodiment, the invention features a biologically synthetic molecule comprising apoptotic components derived from osteopontin. A “derived from” component, such as osteopontin, includes components that have certain characteristics originating from osteopotin and may be recognized as such but are not identical to osteopontin. do. Suitably, the apoptotic component has sufficient sequence information to bind intergreen (eg αvβ3 intergreen) but lacks sufficient sequence information to signal via intergreen (eg αvβ3 intergreen). Do. In one embodiment, the apoptotic component is a polypeptide derived from osteopontin. Thus, the apoptotic component has the characteristics of osteopontin (eg, functions to enhance apoptosis), but is not the same as osteopontin. In one embodiment, the apoptotic component comprises a polypeptide having at least 50% identity with the apoptotic region of osteopontin. In another embodiment, the apoptotic component is at least 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or more identical to the apoptotic region of osteopontin. In yet another embodiment, the apoptotic component comprises the amino acid sequence making up amino acids 147-170 of human osteopontin-B (SEQ ID NO: 1). In another embodiment, the apoptotic component is at least 55%, 65%, 70%, 75%, 80% with approximately amino acids 147-170 of human osteopontin-B (SEQ ID NO: 1) , 85%, 90%, 95% or more identical polypeptides. In another embodiment, the apoptotic component comprises a polypeptide that is at least 5-50 amino acids in length. In another embodiment, the apoptotic component is between 10-45, 15-40 or 20-30 in length, or 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, or 29 amino acid in length. It includes a polypeptide which becomes. In another embodiment, the apoptotic component comprises a polypeptide that is greater than 50 amino acids in length.

본 발명의 다른 실시 형태는 인간의 오스테오폰틴(예를 들어, SEQ ID NO:1의 아미노 산 147-170)의 아폽토시스적 영역과 충분히 일치하는(homologous) 아미노 산 서열을 가진 아폽토시스적 구성 성분을 포함하는 생물학적 합성 분자를 특징으로 한다. "충분히 일치하는(sufficiently homologous)"이란 용어는 첫 번째 아미노 산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 이러한 아미노 산 또는 뉴클레오티드 서열은 두 번째 아미노 산 또는 뉴클레오티드 서열에게 동일한(identical) 또는 등가적인(equivalent)(예를 들어, 유사한 가지 체인(side chain)을 가지는 아미노 산 잔여물) 충분한 또는 최소한 수의 아미노 산 잔여물 또는 뉴클레오티드를 포함하며 이는 첫 번째 및 두 번째 아미노 산 또는 뉴크레오티드 서열이 공통적인 구조적 영역 및/또는 공통적인 기능적 활성을 공유하도록 하기 위함이다. 예를 들어, 적어도 40%, 적절하게는 50%, 보다 적절하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 공유하고 공통적인 기능 활성을 공유하는 아미노 산 또는 뉴크레오티드 서열은 본 명세서에서 "충분히 일치하는" 것으로 정의된다.Another embodiment of the invention provides an apoptotic component having an amino acid sequence that is sufficiently homologous to the apoptotic region of human osteopontin (eg, amino acids 147-170 of SEQ ID NO: 1). It comprises a biologically synthetic molecule comprising. The term "sufficiently homologous" includes the first amino acid or nucleotide sequence, which amino acid or nucleotide sequence is identical or equivalent to the second amino acid or nucleotide sequence (e.g., For example, amino acid residues having similar side chains) include sufficient or at least a number of amino acid residues or nucleotides, which are structural regions in which the first and second amino acid or nucleotide sequences are common and / or Or to share common functional activity. For example, amino acid or nucleotide sequences that share at least 40%, suitably 50%, more suitably 60%, 70%, 80% or 90% identity and share common functional activity are It is defined herein as "sufficiently consistent."

적절한 실시 형태에 있어서, 아폽토시스적 구성 성분은 아폽토시스적 활성을 유지하고, 적절하게는 오스테오폰틴의 아폽토시스적 활성을 유지한다. 다른 실시 형태에 있어서, 분자는 온콜리틱 활성을 유지한다. 본 발명은 더욱이 본 발명의 생물학적 합성 온콜리틱 분자를 인코드(encode)하는 분리된 핵 산 분자를 특징으로 한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 분리된 핵산 분자(an isolated nucleic acid molecule)는 아폽토시스적 영역을 인코드하는 핵 산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 생물학적 조절 영역을 인코드 하는 핵 산 서열을 포함한다.In a suitable embodiment, the apoptotic component retains apoptotic activity and suitably maintains apoptotic activity of osteopontin. In another embodiment, the molecule maintains oncolytic activity. The invention further features an isolated nucleic acid molecule that encodes a biologically synthetic oncolytic molecule of the invention. In one embodiment, an isolated nucleic acid molecule of the invention comprises a nucleic acid sequence that encodes an apoptotic region. In another embodiment, an isolated nucleic acid molecule of the invention comprises a nucleic acid sequence that encodes a biological regulatory region.

본 발명의 다양한 특징은 아래의 서브섹션에 의하여 추가적으로 상세하게 기술될 것이다.Various features of the invention will be described in further detail by the following subsections.

I. 분리된 핵산 분자(Isolated Nucleic Acid Molecules)I. Isolated Nucleic Acid Molecules

본 발명의 한 가지 특성은 생물학적 합성 분자 또는 그들이 일부분을 인코드하는(예를 들어, 생물학적 모듈러 영역으로서 아폽토틱 영역과 같은 것을 인코딩하는 부분) 분리된 핵산 분자와 관련된다. "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 도는 게놈 DNA) 및 RNA 분자(예를 들어, mRNA) 및 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA 유사체(analogs)를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥(single-stranded) 또는 이중 가닥으로 될 수 있지마, 적절하게는 이중 가닥으로 된 DNA가 된다.One aspect of the invention relates to biologically synthesized molecules or to isolated nucleic acid molecules that encode a portion thereof (eg, a portion encoding such as an apoptotic region as a biological modular region). The term “nucleic acid molecule” includes DNA molecules (eg cDNA or genomic DNA) and DNA molecules (eg mRNA) and DNA or RNA analogs generated using nucleotide analogues. The nucleic acid molecule may not be single-stranded or double-stranded, but suitably double-stranded DNA.

"분리된(isolated)" 핵산 분자는 핵산의 자연적인 공급원(source)에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 적절하게, "분리된" 핵산은 핵산이 유도되는 유기체의 게놈적(genomic) DNA에서 핵산을 자연적으로 측면에서 보호하는(flank) 서열(예를 들어, 핵산의 5' 및 3' 끝 부분에 위치하는 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 실시 형태에 있어서, 분리된 핵산 분자는 핵산이 유도되는 세포의 게놈적인 DNA에서 핵산 분자를 자연적으로 측면에서 보호하는 뉴클레오티드 서열의 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb 또는 0.1kb 보다 더 작은 것을 포함할 수 있다. 더욱이, cNDA 분자와 같은 "분리된" 핵산 분자는 다른 세포적 물질일 실질적으로 없거나, 또는 재-조합 기술에 의하여 생산될 때 배양 매개체(culture medium)가 없을 수 있거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 선구 물질(precursors) 또는 다른 화학물(chemicals)이 없을 수 있다.An “isolated” nucleic acid molecule is one that is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of nucleic acid. Suitably, an “isolated” nucleic acid is located at a sequence (eg, at the 5 ′ and 3 ′ ends of the nucleic acid that flanks the nucleic acid naturally in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived). Sequence). For example, in various embodiments, an isolated nucleic acid molecule is 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb of a nucleotide sequence that naturally laterally protects the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the cell from which the nucleic acid is derived. And smaller than 0.1 kb. Moreover, "isolated" nucleic acid molecules, such as cNDA molecules, may be substantially free of other cellular materials, or may be free of culture medium when produced by recombination techniques, or chemically synthesized when chemically synthesized. There may be no precursors or other chemicals.

다른 적절한 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 핵산 분자가 적어도 오스테오폰틴의 아폽토틱 영역(예를 들어, SEQ ID NO:1의 아미노 산 147 내지 170) 인코드를 하는 것을 포함한다. 적절하게, 분리된 핵산 분자는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6의 임의의 생물학적 합성 분자를 인코드 한다. 예시적인 핵산은 SEQ ID NO:7로 나타난다.In another suitable embodiment, an isolated nucleic acid molecule according to the present invention comprises the nucleic acid molecule encoding at least an apoptotic region of osteopontin (eg, amino acids 147-170 of SEQ ID NO: 1). do. Suitably, the isolated nucleic acid molecule encodes any biologically synthetic molecule of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6. Exemplary nucleic acids are shown in SEQ ID NO: 7.

두 개의 아미노 산의 서열 또는 두 개의 핵산의 퍼센트 상동 관계(percent homology)를 결정하기 위하여, 서열은 최적의 비교 목적을 위하여 정열된다(예를 들어, 갭(gaps)이 두 번째 아미노 또는 핵산과의 최적의 정열을 위하여 첫 번째 아미노 산 또는 핵산 서열에 도입될 수 있다). 해당하는 아미노 산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노 산 잔여물 또는 뉴클레오티드는 그 다음 단계에서 비교될 수 있다. 첫 번째 서열에서 위치가 두 번째 서열에서 해당하는 위치(position)로서 동일한 아미노 산 잔여물 또는 뉴클레오티드에 의하여 차지되는 경우, 그 때에는 분자는 그 위치에서 상사적으로 된다(homologous)(예를 들어, 본 명세서에서 사용된 것처럼, 아미노 산 또는 핵산 "상사(homology)"는 아미노 산 또는 핵산 "동일(identity)"과 등가적이다). 두 개의 서열 사이의 퍼센트 상사는 서열에 의하여 공유된 동일한 위치의 수효의 함수이다(예를 들어, % 호몰로지(homology) = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100). 두 개의 서열 사이에 퍼센트 호몰로지의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 두 개의 서열의 비교를 위하여 사용된 수학적 알고리즘의 적절한, 제한되지 않는 예는 Karlin and Altschul(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 이고, 이는 Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad.Sci USA 90:5873-77로 수정된다. 그러한 알고리즘은 NBLAST and XBLAST Programs of Altschul, et al.(1990)J. Mol. Biol. 215:403-10으로 결합된다. BLAST 뉴클레오티드 연구는 본 발명에 따른 온코스타틴 핵산 분자(oncostatin nucleic acid molecules)와 상사적인 뉴클레오티드 서열을 얻기 위하여 NBLAST 프로그램, 스코어(score)=100, 워드길이(wordlength)=12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 연구는 본 발명에 따른 온코스타틴 단백질 분자와 상사적인 아미노 산을 얻기 위하여 XBLST 프로그램, 스코어=50, 워드길이=3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭이 형성된(gapped) 정열을 얻기 위하여, 갭이 형성된(gapped) BLAST가 Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402에서 기술된 것과 같은 방식으로 이용될 수 있다. BLAST 및 갭이 형성된 BLAST를 이용할 때, 각각 프로그램(예를 들어 XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미트(default parameters)가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov가 참조로 이용될 수 있다. 서열의 비교를 위하여 이용될 수 있는 수학적 알고리즘의 또 다른 적절한, 제한되지 않는 예는 Myers and Miller, CABIOS(1989)의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 GCG 서열 정열 소트프 패키지의 일부분인 ALLGN 프로그램(버젼 2.0)으로 결합된다. 아미노 산 서열을 비교하기 위하여 ALLGN 프로그램을 이용할 때, PAM 120 웨이트 레지듀 테이블(weight residue table), 갭 랭스 페널티 오브 12(a gap lengthpenalty of 12) 및 갭 패널티 오브 4(a gap penalty of 4)가 사용될 수 있다.To determine the sequence of two amino acids or percent homology of two nucleic acids, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps with a second amino or nucleic acid May be introduced into the first amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment). The amino acid residues or nucleotides at the corresponding amino acid position or nucleotide position can be compared in the next step. If a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecule is homologous at that position (eg, seen As used herein, amino acid or nucleic acid “homology” is equivalent to amino acid or nucleic acid “identity”). The percent similarity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences (eg,% homology = total # x 100 of # / positions of the same position). Determination of percent homology between two sequences can be performed using a mathematical algorithm. Suitable, non-limiting examples of mathematical algorithms used for the comparison of two sequences are described in Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, which describes Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Revised Acad.Sci USA 90: 5873-77. Such algorithms are described in NBLAST and XBLAST Programs of Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. BLAST nucleotide studies can be performed with the NBLAST program, score = 100, wordlength = 12, to obtain nucleotide sequences similar to the oncostatin nucleic acid molecules according to the present invention. BLAST protein studies can be performed with the XBLST program, score = 50, wordlength = 3, to obtain amino acids similar to oncostatin protein molecules according to the present invention. To obtain a gapped alignment for comparison purposes, a gapped BLAST is used in the same manner as described in Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25 (17): 3389-3402. Can be. When using BLAST and gapped BLAST, default parameters of a program (eg XBLAST and NBLAST) may be used, respectively. http://www.ncbi.nlm.nih.gov may be used as a reference. Another suitable, non-limiting example of a mathematical algorithm that can be used for comparison of sequences is the algorithm of Myers and Miller, CABIOS (1989). Such algorithms are combined into the ALLGN program (version 2.0), which is part of the GCG sequence alignment sort package. When using the ALLGN program to compare amino acid sequences, the PAM 120 weight residue table, a gap length penalty of 12 and a gap penalty of 4 Can be used.

본 발명의 따른 핵산 또는 그들의 일부분은 표준 PCR 증폭 기술(amplification techniques)에 따른 템플리트(template) 또는 적당한 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primers)로서 cDNA, mRNA 또는 대안으로 게놈적인 DNA를 사용하여 증폭될 수 있다. 이러한 방식으로 증폭된 핵산은 적당한 벡터(vector)로서 복제될 수 있고 DNA 서열 분석에 의하여 특징 지워질 수 있다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 자동화된 DNA 합성장치(synthesizer)를 사용하는 것과 같은 표준 합성 기술에 의하여 준비될 수 있다. 본 발명에 있어서 사용을 위한 프로브/프라이머(probes/primers)는 실질적으로 정제된 올리코뉴클레오티드를 전형적으로 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 탐지 서열 인코딩(a sense sequence encoding) SEQ ID NO:1의 적어도 약 12, 적절하게는 약 25, 보다 적절하게는 약 40, 50 또는 75 연속적인 뉴클레오티드에 대한 엄격한 조건 아래에서 잡종이 생기는(hybridize) 뉴클레오티드 서열의 영역을 포함한다.Nucleic acids according to the present invention or portions thereof can be amplified using cDNA, mRNA or alternatively genomic DNA as a template according to standard PCR amplification techniques or as suitable oligonucleotide primers. Nucleic acid amplified in this manner can be replicated as a suitable vector and characterized by DNA sequencing. Moreover, oligonucleotides can be prepared by standard synthetic techniques, such as, for example, using an automated DNA synthesizer. Probes / primers for use in the present invention typically comprise substantially purified oligonucleotides. Oligonucleotides are hybridized under stringent conditions for at least about 12, suitably about 25, more suitably about 40, 50 or 75 consecutive nucleotides of a sense sequence encoding SEQ ID NO: 1. (hybridize) includes a region of nucleotide sequence.

본 발명에 따른 생물학적 합성 분자의 "생물학적 활성" 부분을 인코딩하는 핵산 조각(a nucleic acid fragment)은 핵산 분자의 일부분을 분리시키는 것에 의하여 제조될 수 있고 이러한 핵산 분자는 일부분이 유도되는 자연적으로 발생하는 단백질의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 인코드하고, 자연적으로 발생하는 단백질의 인코드 된 부분을 발현하고(예를 들어 실험적(invitro)인 재조합 발현(expression)) 자연적으로 발생하는 단백질의 인코드된 부분의 활성을 이용한다(access). 본 명세서에서 사용된 것처럼, "자연적으로 발생하는" 핵산 분자는RNA 또는 DNA 분자와 관련되고 자연에서 발생하는 뉴클레오티드 서열을 가진다(예를 들어, 자연적인 단백질을 인코드하는 것).A nucleic acid fragment encoding a "biologically active" portion of a biologically synthetic molecule according to the invention can be prepared by separating a portion of a nucleic acid molecule and such nucleic acid molecule is a naturally occurring molecule from which the portion is derived. Encode a polypeptide having a biological activity of the protein, express an encoded portion of a naturally occurring protein (eg, an experimental recombinant expression) and encode a naturally occurring protein Access the activity of As used herein, a "naturally occurring" nucleic acid molecule is associated with an RNA or DNA molecule and has a naturally occurring nucleotide sequence (eg, encodes a natural protein).

본 발명은 더욱이 유전적인 코드의 저하(degeneracy)로 인하여 다르지만 동일한 생물학적 합성 분자(예를 들어 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:8로 제시되는 아미노 산 서열을 가지는 단백질을 인코드 하는 것)를 인코드 하는 핵산 분자를 포함한다.The present invention furthermore, due to the degeneracy of the genetic code, differs from amino acids represented by the same biological synthetic molecule (eg SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8). Encoding a protein having an acid sequence).

본 발명의 생물학적 분자 아미노 산 서열의 첨가에 있어서, 당업자는 변화가 그러한 아미노 산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내부로 돌연변이(mutation)에 의하여 도입될 수 있고 그에 의하여 기능을 변화시키지 않고 인코드된 생물학적 합성 분자의 아미노 산 서열에서의 변화에 이르도록 할 수 있다. 예를 들어, "비-본질적(non-essential)" 아미노 산 잔여물에 아미노 산 치환체(substitutions)(특별히 보존하는 아미노 산 치환체)에 이르는 뉴클레오티드 치환체는 인코딩하는 핵산 서열에서 만들어질 수 있다. "비-본질적인" 아미노 산 잔여물은 생물학적 활성을 변화시키지 않고 서열로부터(예를 들어, SEQ ID NO:1의 아미노 산 147 내지 170) 변화될 수 있는 잔여물인 반면, "본질적인(essential)" 아미노 산 잔여물은 생물학적 활성을 위하여 요구된다. 예를 들어, 단백질 또는 서로 다른 종(species)으로부터의 단백질의 영역을 보존하는 아미노 산 잔여물은 특별히 변화에 따르지 않는 것으로 예측된다.In the addition of the biological molecular amino acid sequences of the present invention, those skilled in the art will appreciate that changes can be introduced by mutation into a nucleotide sequence encoding such amino acid sequence, thereby encoding encoded biologically without altering function. Changes in the amino acid sequence of the molecule. For example, nucleotide substituents ranging from “non-essential” amino acid residues to amino acid substitutions (specifically conserved amino acid substituents) can be made in the nucleic acid sequence encoding. A "non-essential" amino acid residue is a residue that can be changed from a sequence (eg, amino acids 147-170 of SEQ ID NO: 1) without changing biological activity, while an "essential" amino Acid residues are required for biological activity. For example, amino acid residues that conserve regions of protein or proteins from different species are not expected to be particularly subject to changes.

따라서, 본 발명의 다른 특징은 활성을 위하여 본질적이지 않는 아미노 산 잔여물에 있어서 변화를 인코드 하는 생물학적 합성 분자-인코딩 핵산분자(biosynthetic molecule-encoding nucleic acid molecules)와 관련된다. 인코드된 생산물은 예를 들어 SEQ ID NO:1의 아미노 산 147 내지 170과 비교하여 아미노 산 서열에서 차이가 나지만, 생물학적 활성을 유지한다. 한 가지 실시 형태에 있어서, 분리된 핵산 분자는 적어도 SEQ ID NO:2의 아미노 산 147 내지 170에 약 60% 상사적인 뉴클레오티드 서열 인코딩 단백질을 포함한다. 적절하게, 핵산 분자에 의하여 인코드 된 단백질은 SEQ ID NO:1의 아미노산 147 내지 170에 적어도 약 60% 상사적이고, 보다 적절하게 SEQ ID NO:1의 아미노 산 147 내지 170에 적어도 약 65 내지 70% 상사적이고, 보다 적절하게는 SEQ ID NO:1의 아미노 산 147 내지 170에 대하여 적어도 약 75 내지 80 % 상사적이며, 보다 적절하게는 SEQ ID NO:1의 아미노산 적어도 약 85 내지 90% 상사적이며, 가장 적절하게는 SEQ ID NO:1의 아미노산 147 내지 170에 대하여 적어도 약 95% 상사적이다.Accordingly, another feature of the present invention relates to biosynthetic molecule-encoding nucleic acid molecules that encode changes in amino acid residues that are not essential for activity. The encoded product differs in amino acid sequence, for example, compared to amino acids 147-170 of SEQ ID NO: 1, but retains biological activity. In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence encoding protein that is at least about 60% similar to amino acids 147-170 of SEQ ID NO: 2. Suitably, the protein encoded by the nucleic acid molecule is at least about 60% similar to amino acids 147 to 170 of SEQ ID NO: 1, and more suitably at least about 65 to 70 to amino acids 147 to 170 of SEQ ID NO: 1. % Similar, more suitably at least about 75 to 80% similar to amino acids 147 to 170 of SEQ ID NO: 1, and more suitably at least about 85 to 90% similar to amino acids of SEQ ID NO: 1 And most suitably at least about 95% similar to amino acids 147-170 of SEQ ID NO: 1.

적절하게, 보존 아미노산 치환체(conservative amino acid substitutions)는 하나 또는 그 이상의 비-본질적인 아미노 산 잔여물에서 만들어진다. "보전 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"은 아미노산 잔여물이 유사한 가지 체인(side chain)을 가지는 아미노 산 잔여물로 치환되는 하나이다. 유사한 가지 체인을 가지는 아미노 산 잔여물의 패밀리(families)는 본 발명의 기술 분야에서 정의되었다. 이러한 패밀리는 염기 가지 사슬(basic side chain)(예를 들어, 리신(lysine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine)), 산 가시 사슬(예를 들어, 아스파틱 산(aspartic acid), 글루타믹 산(glutamic acid), 전하를 띠지 않는 극성 가지 사슬(uncharged polar side chanins)(예를 들어, 글리신(glycine), 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 티로신(tyrosine), 시스테인(cysteine)), 비극성 가지 사슬(예를 들어, 알라닌(alanine), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 플로린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 메티오닌(methionine), 트립토판(tryptophan)), 베타-브랜치드 가지 사슬(beta-branched side chains)(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향성 가지 사슬(aromatic side chains)(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 가진 아미노 산을 포함한다. 이러한 이유로, 예측된 비-본질적 아미노 산 잔여물은 동일한 가지 사슬 패밀리로부터 다른 아미노 산 잔여물에 의하여 적절하게 치환된다.Suitably, conservative amino acid substitutions are made from one or more non-essential amino acid residues. "Conservative amino acid substitution" is one in which amino acid residues are substituted with amino acid residues having similar side chains. Families of amino acid residues having similar branched chains have been defined in the art. This family includes basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), acid spine chains (e.g. aspartic acid, gluta) Glutamic acid, uncharged polar side chanins (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, threonine, Tyrosine, cysteine), nonpolar branch chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methalanine) (methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g. tyrosine, Amino acids with phenylalanine, tryptophan, histidine). For this reason, the predicted non-essential amino acid residues are suitably substituted by other amino acid residues from the same branched chain family.

대안으로, 다른 실시 형태에 있어서, 돌연변이(mutation)가 코딩 서열의 전부 또는 일부분을 따라서 도입될 수 있고, 예를 들어 포화 뮤타제너시스(saturation mutagenesis)와 같은 방식으로 도입될 수 있고, 결과로서 나타나는 돌연변이체(mutants)는 활성을 유지하는 돌연변이체를 확인하기 위한 생물학적 활성을 위하여 분류될 수 있다(screened). 핵산 인코딩 SEQ ID NO:1의 뮤타제너시스를 따르면, 새로이 인코드 된 단백질은 재-조합적으로 발현될 수 있고 단백질의 활성이 결정될 수 있다.Alternatively, in other embodiments, mutations can be introduced along all or a portion of the coding sequence, for example introduced in the same way as saturation mutagenesis, and the resulting mutations. Mutants can be screened for biological activity to identify mutants that remain active. According to the mutagenesis of the nucleic acid encoding SEQ ID NO: 1, the newly encoded protein can be recombinedly expressed and the activity of the protein can be determined.

II. 분리된 생물학적 합성 분자(Isolated Biosynthetic Molecules)II. Isolated Biosynthetic Molecules

본 발명의 한 가지 특징은 분리된 생물학적 합성 분자 및 그들이 일부분과 관련된다. 한 가지 실시 형태에 있어서, 본 발명의 생물학적 합성 분자는 재조합DNA 기술에 의하여 생산된다. 재조합 발현에 대한 대안으로, 생물학적 합성 분자는 표준적인 펩티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.One feature of the invention relates to isolated biologically synthetic molecules and portions thereof. In one embodiment, the biologically synthetic molecules of the invention are produced by recombinant DNA technology. As an alternative to recombinant expression, biologically synthetic molecules can be chemically synthesized using standard peptide synthesis techniques.

"분리된(ioslated)" 또는 "정제된(purified)" 생물학적 합성 분자는 세포적 물질(cellular) 또는 세포로부터 다른 오염 단백질(other contaminating proteins) 또는 분자가 유도되는 조직 소스(tissue source)로부터 실질적으로 자유롭고(free of), 화학적으로 합성될 때 화학적 선구물질 또는 다른 화학물로부터 실질적으로 자유롭다. "세포적인 물질로부터 실질적으로 자유로운(substantially free of cellular material)"이란 용어는 재-조합 분자가 세포의 세포적인 구성 성분으로부터 분리되는 제조 과정을 포함하고 재-조합 분자는 세포의 구성 성분으로부터 분리되고 재-조합적으로 생산된다. 한 가지 실시 형태에 있어서, "세포적인 물질로부터 실질적으로 자유로운" 이란 용어는 비-생물학적 합성 분자의 약 30%(건조 중량)(또한 본 명세서에서 "오염물질(contaminating material)"로서 언급되기도 한다)보다 적은 값, 보다 적절하게는 약 오염물질의 약 20%보다 적은 값, 보다 적절하게는 오염 물질의 약 10%보다 더 작은 값, 가장 적절하게는 오염물질의 약 5%보다 더 작은 값을 가지는 제조물(preparations)을 포함한다. 본 발명의 생물학적 합성 분자가 재-조합적으로 생산될 때, 배양 매개체(cultrue medium)로부터 실질적으로 자유롭고, 예를 들어 배양 매개물은 제조물 부피의 약 20% 보다 더 작은 값, 보다 적절하게는 약 10%보다 더 작은 값, 가장 적절하게는 약 5%보다 더 작은 값을 나타낸다.An "ioslated" or "purified" biologically synthetic molecule is substantially derived from a tissue source from which other contaminating proteins or molecules are derived from a cellular or cell. It is free of and substantially free from chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized. The term "substantially free of cellular material" includes a manufacturing process in which the recombination molecule is separated from the cellular components of the cell and the recombination molecule is separated from the components of the cell and Produced in recombination. In one embodiment, the term "substantially free from cellular material" is about 30% (dry weight) of the non-biological synthetic molecule (also referred to herein as "contaminating material"). Less than about 20% of contaminants, more suitably less than about 10% of contaminants, most suitably less than about 5% of contaminants Preparations. When the biosynthetic molecules of the present invention are produced recombinantly, they are substantially free from a cultrue medium, for example, the culture medium has a value of less than about 20% of the preparation volume, more suitably about 10 A value less than% is shown, most suitably less than about 5%.

"화학적 선구 물질 또는 다른 화학물로부터 실질적으로자유로운(substantially free of chemical precursors or other chemicals)"라는 용어는 생물학적 합성 분자가 분자의 합성에 포함된 화학적 선구 물질 또는 다른 화학물로부터 분리되는 제조물을 포함한다. 한 가지 실시 형태에 있어서, "화학적 선구 물질 또는 다른 화학물로부터 실질적으로 자유로운" 이란 용어는 화학적 선구 물질 또는 오염 물질의 약 30%(건조 중량) 보다 더 작은 값, 보다 적절하게는 화학적 선구 물질 또는 오염 물질의 약 20% 보다 더 작은 값, 보다 더 적절하게는 화학적 선구 물질 또는 오염 물질의 약 10% 보다 더 작은 값, 가장 적절하게는 화학적 선구 물질 또는 오염 물질의 약 5% 보다 더 작은 값을 가지는 제조물(preparations)을 포함한다.The term "substantially free of chemical precursors or other chemicals" includes preparations in which biologically synthetic molecules are separated from chemical precursors or other chemicals involved in the synthesis of the molecule. . In one embodiment, the term “substantially free from chemical precursors or other chemicals” means a value less than about 30% (dry weight) of the chemical precursors or contaminants, more suitably chemical precursors or A value less than about 20% of the contaminant, more suitably less than about 10% of the chemical precursor or contaminant, most suitably less than about 5% of the chemical precursor or contaminant Eggplants include preparations.

본 발명에 따른 생물학적 합성 분자의 생물학적인 활성 부분은 본 발명의 생물학적 합성 분자에 대하여 상사적 이거나 유도된 분자를 포함하고, 예를 들면, SEQ ID NO:1에서 제시된 아미노 산 서열을 포함하고, 이는 완전한 길이의 폴리펩티드 보다 더 작은 아미노 산을 포함하고, 완전한 길이의 폴리펩티드(full-length polypeptide)의 적어도 한 가지 활성을 나타낸다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 완전한 길이의 폴리펩티드의 적어도 한 가지 활성을 가진 영역(a domain) 또는 모티프(motif)를 포함한다. 생물학적 활성 부분은 예를 들어 길이에 있어 10, 25, 50, 100 또는 더 많은 아미노 산이 되는 폴리펩티드가 될 수 있다.The biologically active moiety of the biologically synthetic molecule according to the invention comprises a molecule analogous to or derived from the biologically synthetic molecule of the invention, for example comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 It contains smaller amino acids than full length polypeptides and exhibits at least one activity of a full-length polypeptide. Typically, the biologically active moiety comprises a domain or motif with at least one activity of the full length polypeptide. The biologically active moiety can be, for example, a polypeptide that is 10, 25, 50, 100 or more amino acids in length.

본 발명은 또한 키메릭 또는 퓨전(chimeric or fusion) 단백질을 포함한다. "키메릭 단백질" 또는 "퓨전 단백질"이란 용어는 두 번째 폴리텝티드(예를 들어, 비-오스테오폰틴-유도된 폴리펩티드)에게 효과적으로 결합된(operatively linked)첫 번째 폴리펩티드(예를 들어, 오스테오폰틴-유도된 폴리펩티드)를 포함한다. "오스테오폰틴-유도된 폴리펩티드(osteopontin-derived polypeptide)"는 오스테오폰틴으로부터 유도된 아미노 산 서열을 가지는 폴리펩티드를 의미하는 반면, "비-오스테오폰틴 유도된 폴리펩티드"는 오스테오폰틴에게 실질적으로 상사적이지 않는 단백질에 해당하는 아미노 산 서열을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 퓨전 단백질 내부에서, 첫 번째 폴리펩티드는 오스테오폰틴의 전부 또는 일부분에 해당할 수 있다. 적절한 실시 형태에 있어서, 퓨전 단백질은 오스테오폰틴의 적어도 하나의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 퓨전 단백질은 오스테오폰틴의 적어도 두 개의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 퓨전 단백질 내부에서, "효과적으로 결합된(operatively linked)" 이란 용어는 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드가 서로 서로에 대하여 인-플레임으로 융화된다(fused in-frame). 첫 번째 폴리펩티드는 두 번째 폴리펩티드의 N-터미너스 또는 C-터미너스에 융화될 수 있다.The invention also includes chimeric or fusion proteins. The term “chimeric protein” or “fusion protein” refers to a first polypeptide (eg, austene that is operatively linked to a second polypeptide (eg, a non-osteopontin-derived polypeptide). Opontin-derived polypeptide). "Osteopontin-derived polypeptide" refers to a polypeptide having an amino acid sequence derived from osteopontin, while "non-osteopontin derived polypeptide" is substantially equivalent to osteopontin. A polypeptide having an amino acid sequence corresponding to a protein that is not similar. Inside the fusion protein, the first polypeptide may correspond to all or part of osteopontin. In a suitable embodiment, the fusion protein comprises at least one biologically active moiety of osteopontin. In another embodiment, the fusion protein comprises at least two biologically active moieties of osteopontin. Inside the fusion protein, the term "operatively linked" is the first polypeptide and the second polypeptide are fused in-frame with respect to each other. The first polypeptide can be compatible with the N-terminus or C-terminus of the second polypeptide.

예를 들어, 한 가지 실시 형태에 있어서, 퓨전 단백질은 내부에서 관련된 폴리펩티드 서열(예를 들어, 아폽토틱 영역 시퀀스)이 GST 서열의 C-터미너스에 융화되는 GST-퓨전 단백질이다. 그러한 퓨전 단백질은 재-조합 단백질의 정제(purification)에 이용될 수 있다.For example, in one embodiment, the fusion protein is a GST-fusion protein in which the related polypeptide sequence (eg, apoptotic region sequence) is fused to the C-terminus of the GST sequence. Such fusion proteins can be used for purification of the recombination protein.

다른 실시 형태에 있어서, 퓨전 단백질은 그것의 N-터미너스에 헤테로로쿠스(hetrologous) 신호 서열을 포함한다. 예를 들어, 자연적인 오스테오폰틴 신호 서열(즉, SEQ ID NO:1의 아미노 산 1 내지 16)는 제거되어 다른 단백질로부터 신호 서열에 의하여 치환될 수 있다. 어떤 숙주 세포(host cell)에 있어서(예를 들어, 포유류 숙주 세포), 퓨전 단백질의 발현 및/또는 분비는 헤테로로쿠스 신호 서열의 사용에 의하여 증가될 수 있다.In another embodiment, the fusion protein comprises a heterologous signal sequence at its N-terminus. For example, the natural osteopontin signal sequence (ie, amino acids 1-16 of SEQ ID NO: 1) can be removed and replaced by signal sequences from other proteins. In certain host cells (eg, mammalian host cells), expression and / or secretion of the fusion protein may be increased by the use of heterorocus signal sequences.

다른 실시 형태에 있어서, 퓨전 단백질은 내부에서 관련 서열(예를 들어 아폽토틱 영역 서열)이 임뮤노글로빈(immunoglobulin) 단백질 패밀리의 멤버(a member)로부터 유도된 서열에게 융화되는(fused) 임뮤노글로빈 퓨전단백질이다. 용해성 유도체는 또한 임뮤노글로빈 상수(Fc) 영역에게 융화되는 세포 표면 글리코프로테인(glycoprotein)의 외부세포의 영역을 구성하는 임뮤노글로빈 유전자 슈퍼패밀리(immunoglobulin gene superfamily) 내부에서 세포 표면 글루코프로테인으로부터 만들어진다(참조로서 예를 들어, Capon et al.(1989) Natrue 337:525-531 및 Capon U.S. Patents 5,116,964 및 5,428,130[CD4-IgG1 constructs]; Linsley et al.(1991) J. Exp. Med. 173:721-730[a CD28-IgG1 construct 및 a B7-1-IgG1 construct]; 및 Linsley, et al.(1991) J. Exp. Med. 174:561-569 및 U.S. Patent 5,434,131[a CTLA4-IgG1] 가 있다).In another embodiment, the fusion protein has an immunoglobin in which the relevant sequence (eg, apoptotic region sequence) is fused to a sequence derived from a member of the immunoglobulin protein family. It is a fusion protein. Soluble derivatives are also made from cell surface glucoproteins inside the immunoglobulin gene superfamily that make up the region of the outer cells of cell surface glycoproteins that are fused to the immunoglobin constant (Fc) regions ( For example, see Capon et al. (1989) Natrue 337: 525-531 and Capon US Patents 5,116,964 and 5,428,130 [CD4-IgG1 constructs; Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 721- 730 [a CD28-IgG1 construct and a B7-1-IgG1 construct]; and Linsley, et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 561-569 and US Patent 5,434,131 [a CTLA4-IgG1]). .

본 발명의 임뮤노글로빈 퓨전 단백질은 약학적 조성물과 결합되고 환자에게 투여되며 세포의 아폽토시스의 조절을 위하여 치료적으로 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 임뮤노글로빈 퓨전 단백질은 환장에 있어서 항체(antibodies)를 생성하기 위한 임뮤노겐(immunogens)으로 사용될 수 있고, 리간드(ligands)를 정제하기 위하여 사용될 수 있으며 스크리닝 분석(screening assays)에서 사용될 수 있다.The immunoglobin fusion proteins of the invention can be combined with pharmaceutical compositions and administered to patients and used therapeutically for the regulation of apoptosis of cells. Moreover, the immunoglobin fusion proteins of the present invention can be used as immunogens to produce antibodies in the subject, can be used to purify ligands and can be used in screening assays. Can be used.

적절하게, 본 발명의 키메릭 또는 퓨전 단백질은 표준 재-조합 DNA 기술에 의하여 생산된다. 예를 들어, 서로 다른 폴리펩티드 서열을 위한 DNA 단편(fragment) 코딩은 종래의 기술에 의하여 인-프레임(infram)으로 함께 결찰되고(ligate), 이러한 종래의 기술로서는 적당한 말단(termini)을 제공하기 위하여 리게이션(ligation), 제한 효소 흡수(restriction enzyme digestion)를 위하여 무딘-끝 부분을 가진(blunt-ended) 또는 엇갈린-끝 부분을 가진(stagger-ended) 말단을 이용하고, 불필요한 결합을 방지하기 위하여 적당한 알칼리 포스페타제 처리(alkaline phosphatase treatment)로서 응집력이 있는 끝 부분(cohesive end)으로 내부를 채우고(filling-in), 효소의 리게이션(enzymatic ligation)을 이용하는 것을 들 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 퓨전 유전자는 자동화된 DNA 합성 장치를 포함하는 종래의 기술에 의하여 합성될 수 있다. 대안으로, 유전자 단편의 PCR 증폭이 앵커 프라이머(anchor primers)를 사용하여 수행될 수 있고 이러한 앵커 프라이머는 키메릭 유전자 서열을 발생시키기 위하여 차후로 다듬어지고(anneal) 다시 증폭될 수 있는 두 개의 연속적인 유전자 단편 사이에서 보충적으로 돌출(overhangs)을 발생시킨다(참조로서, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology, eds, Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). 더욱이, 많은 발현 벡터(expression vectors)는 상업적으로 이용 가능하고 이미 퓨전 성분(moiety)(예를 들어, GST 폴리펩티드)를 인코드 한다. 관련 영역을 인코딩 하는 핵산(예를 들어, 아폽토틱 영역 서열)은 그러한 관련 영역에게 인-프레임으로 결합되도록 하기 위하여 발현 벡터로서 복제될 수 있다.Suitably, the chimeric or fusion proteins of the invention are produced by standard recombination DNA techniques. For example, DNA fragment coding for different polypeptide sequences is ligated together in-frame by conventional techniques, to provide suitable terminis for such conventional techniques. Use blunt-ended or staggered-ended ends for ligation, restriction enzyme digestion, and to prevent unnecessary binding Suitable alkaline phosphatase treatments include filling-in with a cohesive end and using enzymatic ligation. In other embodiments, the fusion gene can be synthesized by conventional techniques, including automated DNA synthesis apparatus. Alternatively, PCR amplification of gene fragments can be performed using anchor primers, which are then successively annealed and then amplified again to generate chimeric gene sequences. Complementary overhangs occur between gene fragments (see, for example, Current Protocols in Molecular Biology, eds, Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Moreover, many expression vectors are commercially available and already encode fusion moieties (eg, GST polypeptides). Nucleic acid encoding a relevant region (eg, apoptotic region sequence) can be replicated as an expression vector in order to be bound in-frame to such relevant region.

III. 재-조합 발현 벡터 및 숙주 세포(Recombinant Expression Vectors and Host Cells)III. Recombinant Expression Vectors and Host Cells

본 발명의 다른 특징은 벡터와 관련되며, 적절하게는 발현 벡터와 관련되고, 관련 영역(a domain of interest)을 인코딩 하는 핵산을 포함한다(예를 들어, 아폽토틱 영역 서열). 본 명세서에서 사용된 것처럼, "벡터(vector)"는 핵산이 결합될 수 있는 다른 핵산을 운반할 능력이 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한 가지 형태는 "플라스미드(plasmid)"이며, 원형의 이중 가닥으로 된 DNA 루프를 의미하며 이러한 루프 내부에는 추가적인 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있다. 다른 형태의 벡터는 바이러스 벡터가 되며, 이러한 바이러스 벡터에서는 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈 내부에서 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 도입되는 숙주 세포의 내부에서 스스로 복제될(replication) 수 있는 능력을 가진다(예를 들어, 복제의 박테리아성 기원을 가지고 에피소멀(episomal) 포유동물 벡터를 가지는 박테리아 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피소멀 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내부로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내부로 결합되고(integrated), 그에 의하여 숙주 세포를 따라서 복제된다. 더욱이, 어떤 벡터는 그들이 효과적으로 결합되는 유전자의 발현으로 유도될 수 있는 능력을 가진다. 그러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터(expression vectors)"로 언급된다. 일반적으로, 재-조합 DNA 기술에 있어서 발현 벡터의 유용성은 종종 플라스미드 형태가 된다. 본 명세서에서는. "플라스미드" 및 "벡터"는 폴라스미드가 가장 공통적으로 사용되는 벡터 형태이므로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함을 가진 레트로바이러스, 아데노바이러스(adenoviruses) 및 아데노-관련된 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터를 포함하고, 이러한 벡터는 동일한 기능으로서 역할을 한다.Another feature of the invention relates to a vector, suitably to an expression vector, and comprises a nucleic acid encoding a domain of interest (eg, apoptotic region sequence). As used herein, "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of carrying another nucleic acid to which a nucleic acid can be bound. One form of the vector is a "plasmid," which refers to a circular double stranded DNA loop within which additional DNA segments can be ligated. Other forms of vector become viral vectors, in which additional DNA segments can be ligated within the viral genome. Some vectors have the ability to replicate themselves within the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having an bacterial origin of replication and having episomal mammalian vectors). Other vectors (eg, non-episomal mammalian vectors) are integrated into the genome of the host cell upon introduction into the host cell and thereby replicate along the host cell. Moreover, some vectors have the ability to be guided by the expression of genes to which they are effectively bound. Such vectors are referred to herein as "expression vectors." In general, the utility of expression vectors in recombination DNA techniques is often in the form of plasmids. In this specification. "Plasmid" and "vector" can be used interchangeably because polamide is the most commonly used vector form. However, the present invention includes other forms of expression vectors such as viral vectors (e.g., retroviruses with a defective replication, adenoviruses and adeno-associated viruses), and these vectors serve as the same function. .

본 발명의 재-조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현을 위하여 적당한 형태로서 본 발명의 핵산을 포함하고, 재-조합 발현 벡터는 하나 또는 그 이상의 조절 서열(regulatory sequences)을 포함하고, 발현을 위하여 사용되는 숙주 세포에 기초하여 선택되고, 발현되어야 할 핵산 서열과 효과적으로 결합될 수 있는 것을 의미한다. 재-조합 발현 벡터의 내부에서, "효과적으로 결합된(operably liked)" 것은 관련 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 발현을 허용하는 방법으로 조절 서열에 결합되는 것을 의미한다(예를 들어, 실험적으로 전사/번역 시스템(transcription/translation system)에서 또는 숙주 세포에서 벡터가 숙주 세포로 도입될 때). "조절 서열(regulatory sequence)"이란 용어는 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers) 및 다른 발현 제어 요소를 포함한다(예를 들어, 폴리아데닐레이션 신호(polyadenylation signals). 그러한 조절 서열은 예를 들어, Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)에 기술되어 있다. 조절 서열은 많은 형태의 숙주 세포에 있어서 뉴클레오티드 서열의 구성적인 발현(constitutive expression)을 유도하는 것과 단지 어떤 숙주 세포에 있어서 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 것을 포함한다(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열). 해당 분야의 통상의 기술을 가진 자는 발현 벡터는 전환되어야(transformed) 할 숙주 세포의 선택, 필요한 단백질의 발현 수준 등과 같은 요소에 의존할 것이라고 추측할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 수 있고 그에 의하여 본 명세서에서 기술된 것처럼 핵산에 의하여 인코드 된 퓨전 단백질 또는 펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 생산한다. 본 발명의 재-조합 발현 벡터는 프로카리오틱(prokaryotic) 또는 유카리오틱(eukaryotic) 세포에 있어서 발현을 위하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 재-조합 단백질은 E. coil, 곤충 세포(박큘로바이러스(baculovirus) 발현 벡터를 사용한다), 효모 세포 또는 포유 동물 세포와 같은 박테리아성 세포에 있어서 발현될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)에 추가적으로 기술되어 있다. 대안으로, 재-조합 발현 벡터는 실험적으로(in vitro) 전사되고 번역될 수 있고, 예를 들어 T7 프로모터 조절 시퀀스 및 T7 폴리머라제(polymerase)를 사용할 수 있다.Recombinant expression vectors of the invention comprise nucleic acids of the invention in a form suitable for expression of nucleic acids in a host cell, wherein the recombination expression vectors comprise one or more regulatory sequences, and It means that it can be effectively combined with the nucleic acid sequence to be selected and expressed based on the host cell used. Inside the recombination expression vector, "operably liked" means that the relevant nucleotide sequence is bound to the regulatory sequence in a manner that allows for nucleotide expression (e.g., experimentally a transcription / translation system) transcription / translation system) or when the vector is introduced into the host cell. The term “regulatory sequence” includes promoters, enhancers and other expression control elements (eg, polyadenylation signals. Such regulatory sequences are described, for example, Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) The regulatory sequence is responsible for inducing constitutive expression of the nucleotide sequence in many types of host cells. Only inducing expression of a nucleotide sequence in a certain host cell (eg, tissue-specific regulatory sequences.) One of ordinary skill in the art will recognize that an expression vector may be transformed into a host cell. It will be assumed that it will depend on factors such as the choice, the level of expression of the required protein, etc. The expression vector of the invention is introduced into a host cell. And thereby produce a protein or peptide comprising a fusion protein or peptide encoded by a nucleic acid as described herein .. The recombinant expression vectors of the present invention may be prokaryotic or eukaryotic. For example, the recombination protein may be a bacterium such as E. coil, insect cells (using baculovirus expression vectors), yeast cells, or mammalian cells. Suitable host cells are further described in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) Alternatively, recombination expression vectors are experimental. It can be transcribed and translated in vitro, for example using T7 promoter regulatory sequences and T7 polymerase.

프로카리오테스(prokaryotes)에서의 단백질 발현은 퓨전 또는 비-퓨전 단백질 중의 어느 하나의 발현을 유도하는 연속적인 또는 유도될 수 있는(constitutive or inducible) 프로모터를 포함하는 벡터를 이용하여 E. coil에서 가장 빈번하게 수행된다. 퓨전 벡터는 수 많은 아미노 산을 내부에 인코드 된 단백질에 추가하고, 대개는 재-조합 단백질의 아미노 터미너스에게 추가한다. 그러한 퓨전 단백질은 전형적으로 세 가지 목적으로서 역할을 한다: 1) 재-조합 단백질의 발현을 증가시키는 것; 2) 재-조합 단백질의 용해성을 증가시키는 것; 3) 친화성 정제(affinitypurification)에 있어서 리간드로서 반응하는 것에 의하여 재-조합 단백질의 정제에 도움을 주는 것. 종종, 퓨전 발현 벡터에 있어서, 프로테오리틱 분열 장소(proteolytic cleavage site)가 퓨전 성분 및 재-조합 단백질의 접합부에 도입되고 퓨전 단백질의 정제에 수반하는 퓨전 성분으로부터 재-조합 단백질의 분리를 가능하도록 한다. 그러한 효소 및 그들과 같은 기원의 인지 서열(cognate recognition sequence)은 팩터 Xa, 트롬빈(thrombin) 및 엔테로키나제(enterokinase)를 포함한다. 전형적인 퓨전 발현 벡터는 pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B and Johnson, K. S.(1988) Gene 67:31-40), pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRIT5(Pharmacia, Piscatawsy, NJ)를 포함하고 이러한 벡터들은 글루타티온 S-트랜스레페라제(flutathione S-transferase(GST), 말토스 E 결합 단백질(maltose E binding protein), 또는 단백질 A를 각각 표적 재-결합 단백질에게 융화한다(fuse).Protein expression in prokaryotes is most pronounced in E. coils using vectors containing constitutive or inducible promoters that induce the expression of either fusion or non-fusion proteins. Frequently performed. Fusion vectors add a number of amino acids to the proteins encoded therein, usually to the amino terminus of the recombination protein. Such fusion proteins typically serve three purposes: 1) to increase expression of the recombination protein; 2) increasing the solubility of the recombination protein; 3) assist in the purification of recombination proteins by reacting as ligands in affinitypurification. Often, in fusion expression vectors, proteolytic cleavage sites are introduced at the junction of the fusion component and the recombination protein and allow for the separation of the recombination protein from the fusion component involved in the purification of the fusion protein. Do it. Such enzymes and cognate recognition sequences of their origin include factors Xa, thrombin, and enterokinase. Typical fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) And pRIT5 (Pharmacia, Piscatawsy, NJ) These vectors fuse the glutathione S-transferase (GST), maltose E binding protein, or Protein A to the target re-binding protein, respectively.

적당한 유도할 수 있는 비-퓨전 E. coli 발현 벡터의 실시 예는 pTrc(Amann et al.(1988) Gene 69:301-315) 및 pET 11d(Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California(1990) 60-89)를 포함한다. pTrc로부터 표적 유전자 발현은 하이브리드-trp-락 퓨전 프로모터(hybrid trp-lap fusion promoter)로부터 숙주 RNA 폴리머라제 전사에 의존한다. pET 11d 벡터로부터 표적 유전자 발현은 공동-발현되는 바이러스 성 RNA 폴리머라제(T7 gn1)에 의하여 매개된 T7 gn10-락 퓨전 프로모터로부터 전사에 의존한다. 이러한 바이러스 성 폴리머라제는 락UV 5 프로모터의 전사적 제어(transcriptional control)가 이루어지면서 T7 gn1 유전자를 안착시키는(harboring) 기생하는 λ 프로파지(a resident λ prophage)로부터 숙주 스트레인(strains) BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의하여 공급된다.Examples of suitable inducible non-fusion E. coli expression vectors include pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301-315) and pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Target gene expression from pTrc is dependent on host RNA polymerase transcription from the hybrid-trp-lap fusion promoter. Target gene expression from the pET 11d vector is dependent on transcription from the T7 gn10-lock fusion promoter mediated by the co-expressed viral RNA polymerase (T7 gn1). Such viral polymerases host host strain BL21 (DE3) from parasitic λ prophage, which harbors the T7 gn1 gene, while undergoing transcriptional control of the lacUV 5 promoter. Or HMS174 (DE3).

E. coli에 있어서 재-조합 단백질 발현을 최대로 만드는 한 가지 방법은 재-조합 단백질을 단백질 가수 분해에 의하여(proteolytically) 쪼개는 손상된 능력을 가진 숙주 박테리아 내에서 단백질을 발현하는 것이다(Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California(1990) 119-128). 다른 방법은 각각의 아미노 산을 위한 개별적인 코돈(codons)이 우선적으로 E. coli에서 이용되도록 하기 위하여 발현 벡터의 내부로 삽입되어져야 할 핵산의 핵산 서열을 변경하는 것이다(Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). 본 발명에 따른 이러한 핵산 서열의 변경은 표준 DNA 합성 기술에 의하여 수행될 수 있다.One way to maximize recombination protein expression in E. coli is to express the protein in host bacteria with impaired ability to proteolytically cleave the recombination protein (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Another method is to alter the nucleic acid sequence of the nucleic acid that must be inserted into the expression vector so that individual codons for each amino acid are preferentially used in E. coli (Wada et al. (1992). Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Such alteration of nucleic acid sequences according to the invention can be carried out by standard DNA synthesis techniques.

또 다른 실시 형태에 있어서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터가 된다. 효모 S. 세리비새(cerivisae)에 있어서 발현을 위한 벡터의 실시 예는 pYepSec 1(Baldari, et al.(1987) Embo J. 6:229-234), pMFa(Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88(Schultz et al.(1987) Gene 54:113-123), pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA), 및 picZ(InVtrogen Corp, San Diego, CA)를 포함한다.In another embodiment, the expression vector is a yeast expression vector. Examples of vectors for expression in yeast S. cerivisae include pYepSec 1 (Baldari, et al. (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30 : 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), And picZ (InVtrogen Corp, San Diego, Calif.).

대안으로, 재-조합 단백질은 바큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충세포에서 발현될 수 있다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)에서 단백질을 발현하기 위하여 이용 가능한 바큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(series)(Smith et al(1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈(Lucklow and Summers(1989) Virology 170:31-39)를 포함한다.Alternatively, the recombination protein can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors. Baculovirus vectors available for expressing proteins in cultured insect cells (eg, Sf9 cells) include the pAc series (Smith et al (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) and pVL. Series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).

다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현된다. 포유동물 발현 벡터의 실시 예는 pCDM8(Seed, B.(1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC(Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195)를 포함한다. 포유동물의 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 조절 요소(elements)에 의하여 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스 2(Adenovirus 2), 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 및 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40)로부터 유도된다. 프로카리오틱 및 유카리오틱 세포의 양쪽을 위한 다른 적당한 발현 시스템을 위해서 아래의 16장 및 17장을 참조할 수 있다; Sambook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.In another embodiment, the nucleic acid according to the invention is expressed in mammalian cells using a mammalian expression vector. Examples of mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). When used in mammalian cells, the control of expression vectors is often provided by viral regulatory elements. For example, commonly used promoters are derived from polyoma, Adenovirus 2, cytomegalovirus and Simian Virus 40. Reference may be made to Chapters 16 and 17 below for other suitable expression systems for both prokaryotic and eukaryotic cells; Sambook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

다른 실시 형태에서, 재-조합 포유동물 발현 벡터는 우선적인 특별한 세포 형태에서 핵산의 발현을 유도할 능력이 있다(예를 들어, 조직-특이적 조절 요소는 핵산을 발현하기 위하여 사용된다). 조직-특이적 조절 요소(tissue-specific regulatory elements)는 당해 업계에 공지되어 있다. 적당한 조직-특이적 프로모터의 비-제한적인 실시 예는 알부민 프로모터(Calame and Eaton(1988) Adv.Immunol. 43:235-275), 특별히 T 세포 수용체의 프로모터(Winoto and Baltimore(1989) EMBO J. 8:729-733) 및 이뮤노겐플로빈(Banerji et al.(1983) Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore(1983) Cell 33:741-748), 뉴론-특이적 프로모터(예를들어 뉴로필라멘트 프로모터; Byme and Ruddle(1989) PNAS 86:5473-5477), 판크레아스(pancreas)-특이적 프로모터(Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), 및 유방선(mammary gland)-특이적 프로모터(예를 들어, 밀크 유장(milk whey) 프로모터; U. S. Patent No.4,873,316 및 유럽 공개 공보 No. 264,166)를 포함한다. 발생상의-조절 프로모터(developmentally-regulated promoters)는 또한 예를 들어 뮤린 혹스 프로모터(murine hox promoters)(Kessel and Gruss(1990) Science 249:374-379) 및 α-페토프로테인 프로모터(Campes and Tilghman(1989) Genes Dev. 3:537-546)를 포함한다.In other embodiments, the recombinant mammalian expression vector is capable of inducing expression of nucleic acids in a particular cell type that is preferential (eg, tissue-specific regulatory elements are used to express nucleic acids). Tissue-specific regulatory elements are known in the art. Non-limiting examples of suitable tissue-specific promoters include albumin promoters (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), particularly promoters of T cell receptors (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) and immunogenflobin (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuron-specific promoters (e.g. neuros) Filament promoter; Byme and Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), pancreas-specific promoter (Edlund et al. (1985) Science 230: 912-916), and mammary gland -Specific promoters (eg milk whey promoter; US Patent No. 4,873,316 and European Publication No. 264,166). Developmentally-regulated promoters are also described, for example, in murine hox promoters (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) and α-fetoprotein promoters (Campes and Tilghman (1989). Genes Dev. 3: 537-546).

추가적으로 본 발명은 안티센스(antisense) 적응(oreintation)에 있어서 발현 벡터 내부로 복제되는 DNA 분자를 포함하는 재-조합 발현 벡터를 제공한다. 즉, DNA 분자는 온코스타틴 mRNA에게 안티세스인 RNA 분자의 발현(DNA 분자의 전사에 의하여)을 위하여 허용하는 방법으로 조절 서열에 대하여 효과적으로 결합된다. 안티센스 오리엔테이션(antisense orientation)에 있어서 복제된 핵산에 효과적으로 결합된 조절 서열은 예를 들어, 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 다양한 형태에 있어서 안티센스 RNA 분자의 연속적인 발현을 유도하도록 선택될 수 있거나, 또는 조절 서열은 안티센스 RNA의 구성적인, 조직 특이적 또는 세포 형태 특이적 발현을 유도하도록 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 높은 효과를 가지는 조절 영역의 제어 하에서 생산된 안티센스 핵산의 내부에서 재-조합 플라스미드, 파지미드(phagemid) 또는 약화된(attenuated) 바이러스의 형태가 될 수 있고, 이들의 활성은 벡터가 도입되는 이들의 형태에 의하여 결정될 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하여 유전자 발현의 조절을 위한 개시된 문헌을 위하여 Weintraub, H. et al. Antisense RNA as a moleclular tool for genetic alalysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986을 참조할 수 있다.In addition, the present invention provides a recombination expression vector comprising a DNA molecule that is replicated into the expression vector in antisense orintation. In other words, the DNA molecule is effectively bound to the regulatory sequence in a manner that allows for oncotin mRNA expression (by transcription of the DNA molecule) of an RNA molecule that is antises. Regulatory sequences that are effectively bound to the cloned nucleic acid in antisense orientation can be selected to induce continuous expression of antisense RNA molecules in various forms such as, for example, viral promoters and / or enhancers, or Regulatory sequences can be selected to induce constitutive, tissue specific or cell form specific expression of antisense RNA. Antisense expression vectors can be in the form of re-combination plasmids, phagemids or attenuated viruses inside of antisense nucleic acids produced under the control of a highly effective regulatory region, the activity of which is determined by the vector It can be determined by the form of these introduced. For the disclosed literature for the regulation of gene expression using antisense genes, see Weintraub, H. et al. Antisense RNA as a moleclular tool for genetic alalysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. See 1 (1) 1986.

본 발명의 다른 특징은 본 발명의 재-조합 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포와 관련된다. "숙주 세포(host cell)" 및 "재-조합 숙주 세포"라는 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 그러한 용어는 특별한 종속 세포(subject cell) 뿐만 아니라 그러한 어떤 세포의 자손 또는 잠재적 자손(progeny)과 관련되어 언급되는 것으로 이해된다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인하여 어떤 변형체가 자손 세대에서 나타날 수 있기 때문에, 그러한 자손은 사실 모 세포와 동일하지 않지만, 여전히 본 명세서에서는 그러한 용어의 범위에 포함된다.Another feature of the invention relates to a host cell into which the recombination expression vector of the invention is introduced. The terms "host cell" and "recombinant host cell" are used interchangeably herein. Such terms are understood to be referred to in relation to the progeny or progeny of any such cell as well as a particular subject cell. Since certain variants may appear in progeny generation due to mutations or environmental influences, such progeny are in fact not identical to the parent cell, but are still included within the scope of such terms herein.

숙주 세포는 프로카리오틱 또는 유카리오틱 세포가 될 수 있다. 예를 들어, 온코스타틴 단백질은 E. coli, 곤충 세포, 효모 또는 포유동물 세포(예를 들어 중국산 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS 세포)와 같은 박테리아성 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적당한 숙주 세포는 당해 업계에 공지되어 있다.The host cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell. For example, oncostatin proteins can be expressed in bacterial cells such as E. coli, insect cells, yeast or mammalian cells (eg, Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells). Other suitable host cells are known in the art.

벡터 DNA는 형질 전환(transformation) 또는 트랜스펙션(transfection) 기술을 통하여 프로카리오틱 또는 유카리오틱 세포 내부로 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것처럼, "형질 전환" 및 "트랜스펙션"은 외부 핵산(예를 들면, DNA)을숙주 세포 내부로 도입하기 위한 다양한 업계-인지된 기술을 언급하는 것으로 의도되고, 칼슘 포스페이트(calcium phosphate) 또는 칼슘 클로라이드(calcium chloride) 공동-침전(co-precipitation), DEAE-덱스트란-중개된 트래스펙션(dextran-mediated transfection), 리포펙션(lipofection) 또는 일렉트로포레이션(electroporation)을 포함한다. 숙주 세포를 형질 전환하거나 또는 트랜스펙션을 하는 적당한 방법에 대해서는 Sambook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 및 다른 실험실 매뉴얼을 참조할 수 있다.Vector DNA can be introduced into procartic or eukaryotic cells through transformation or transfection techniques. As used herein, “transformation” and “transfection” are intended to refer to various industry-recognized techniques for introducing foreign nucleic acids (eg, DNA) into host cells, and calcium phosphate. calcium phosphate or calcium chloride co-precipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, lipofection or electroporation. Include. For suitable methods of transforming or transfecting host cells, see Sambook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and other laboratory manuals.

포유동물 세포의 안정된 트랜스펙션을 위하여, 사용된 발현 벡터 및 트랜스펙션 기술에 따라서, 단지 세포의 소량 부분만이 그들이 게놈 내부로 외부 DNA를 통합할 수 있다(integrate). 이러한 성분(ingegrants)을 확인하고 선택하기 위하여, 선택할 수 있는 마커(marker)(예를 들어, 항생 물질에 대한 저항성)를 인코드 하는 유전자는 일반적으로 관련 유전자를 따라서 숙주 세포 내부로 도입된다. 적절한 선택할 수 있는 마커는 G418, 히그로미신(hygromycin) 및 메소트렉사이트(methotrexate)와 같은 약제물에 대한 저항성을 주는 것들을 포함한다. 선택성을 가진 마커를 코딩하는 핵산은 재-조합 단백질을 인코딩하는 것과 같은 동일한 벡터 상에서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 도입된 핵산을 이용하여 안정적으로 트랜스펙션된 세포는 약제 선택(drug selection)(예를 들어, 선택 가능한 마커 유전자가 생존하고 다른 세포가 사멸하도록 결합하는 세포)에 의하여 확인될수 있다. 배지에 있는 프로카리오틱 또는 유카리오틱 숙주 세포와 같은 본 발명에 따른 숙주 세포는 재-조합 단백질을 생성(예를 들어, 발현하도록)하도록 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가적으로 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 재-조합 단백질을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 한 가지 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 방법은 재-조합 단백질이 생산될 수 있는 적당한 매개체에서 본 발명의 숙주 세포(재-조합 단백질을 인코딩 하는 재-조합 발현 벡터를 내부로 도입할 수 있는)를 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 방법은 추가로 매개체 또는 숙주 세포로부터 재-조합 단백질을 분리시키는 것을 포함한다.For stable transfection of mammalian cells, depending on the expression vector and transfection technology used, only a small portion of the cells can integrate external DNA into the genome. To identify and select these inegrants, genes encoding selectable markers (eg, resistance to antibiotics) are generally introduced into the host cell along with the relevant genes. Suitable selectable markers include those that give resistance to drugs such as G418, hygromycin and mesotrexate. Nucleic acid encoding a marker with selectivity can be introduced into a host cell on the same vector as encoding a recombination protein. Cells stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified by drug selection (eg, cells that selectable marker genes survive and bind to other cells to die). Host cells according to the present invention, such as prokaryotic or eukaryotic host cells in the medium, can be used to produce (eg, express) recombination proteins. Thus, the present invention additionally provides a method for producing a recombination protein using the host cell of the present invention. In one embodiment, the method according to the invention is capable of introducing internally a host cell of the invention (a recombination expression vector encoding a recombination protein) in a suitable medium from which the recombination protein can be produced. Culturing). In another embodiment, the method according to the invention further comprises separating the recombination protein from the mediator or host cell.

IV. 약학적 조성물(Pharmaceutical Compositions)IV. Pharmaceutical Compositions

본 발명에 따른 핵산 분자, 단백질 및 생물학적 합성 분자(또한 본 명세서에서 "활성 화합물(active compounds)"로 언급된다)은 투여를 위한 적당한 약학 조성물로 결합될 수 있다. 그러한 조성물은 전형적으로 핵산 분자, 단백질 또는 항체 및 약학적으로 수용 가능한 캐리어를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것처럼, "약학적으로 수용 가능한 캐리어(pharmaceutically acceptable carrier)"는 임의의 또는 모든 용매(solvents), 분산매(dispersion media), 코팅제(coatings), 항-박테리아 및 항균(antifungal) 제제, 이소토닉(isotonic) 및 흡수 지연 제제와 같은 약학적으로 투여할 수 있는 것들을 포함한다. 약학적 활성 성분을 위한 그러한 매개체 또는 제제의 사용은 당해 업계에 공지되어 있다. 임의의 공지된 매개체 또는 제재가 활성 화합물과 양립하지 않는 경우를 제외하고는, 조성물에 있어서 그들의조합이 고려된다. 보충적인 활성 화합물이 또한 조성물의 내부로 결합될 수 있다.Nucleic acid molecules, proteins and biologically synthetic molecules (also referred to herein as "active compounds") according to the present invention may be combined into suitable pharmaceutical compositions for administration. Such compositions typically comprise nucleic acid molecules, proteins or antibodies and pharmaceutically acceptable carriers. As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” means any or all solvents, dispersion media, coatings, anti-bacterial and antifungal agents. Pharmaceutically administrable such as isotonic and absorption delaying agents. The use of such mediators or agents for pharmaceutically active ingredients is known in the art. Except insofar as any known vehicle or agent is incompatible with the active compound, combinations thereof are contemplated in the composition. Supplementary active compounds can also be incorporated into the compositions.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여를 위하여 의도된 경로와 양립할 수 있도록 만들어진다. 투여 경로의 실시 예로는 예를 들어 정맥 주사와 같은(intravenous) 비-경구적인(parenteral), 피내의(intradermal), 피하의(subcutaneous), 구강의(oral)(예를 들어, 흡입(inhalation)), 혈관의 침투를 위한 피부의(transdermal)(국부적(topical)), 점막 침투의(transmucosal) 및 직장의(rectal) 투여를 포함한다. 비-경구적인, 피내의 또는 피하의 투여를 위한 용액 또는 서스펜션은 아래의 성분을 포함할 수 있다: 주사를 위하여 물과 같은 살균된 희석제(a sterile diluent), 염수(saline solution), 비휘발성 오일(fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용제; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아성 제제; 아스코르빅 산(ascorbic acid) 또는 소디움 바이설피트(bisulfite)와 같은 항독제; 에틸렌아민테트라아세틱 산과 같은 켈레이팅 제제(chelating agents); 아세테이트, 시트레이트(citrates) 또는 포스페이트(phosphates) 및 소디움 클로라이드 또는 데스트로스와 같은 긴장(tonicity)의 조정을 위한 제제. pH는 하이드로클로릭 산 또는 소디움 하이드록사이드(hydrochloric acid or sodium hydroxide)와 같은 산 또는 염기를 이용하여 조정될 수 있다. 이러한 비 경구적 제조물은 앰플 형태로(in ampoules), 일회용 주사기 형태로(disposable syringes) 또는 다양한 일회용 유리병 형태로 유리 또는 플라스틱으로 만들어서 밀봉될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the invention is made to be compatible with the route intended for administration. Examples of routes of administration include, for example, intravenous, parenteral, intradermal, subcutaneous, oral (e.g., inhalation). ), Transdermal (topical), transmucosal and rectal administration of the skin for the penetration of blood vessels. Solutions or suspensions for non-oral, intradermal or subcutaneous administration may include the following components: a sterile diluent, saline solution, non-volatile oils such as water for injection; (fixed oils), polyethylene glycol, glycerin, propylene glycol or other synthetic solvents; Antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl parabens; Anti-toxic agents such as ascorbic acid or sodium bisulfite; Chelating agents such as ethyleneaminetetraacetic acid; Formulations for the adjustment of tonicity such as acetates, citrates or phosphates and sodium chloride or dextrose. The pH can be adjusted with an acid or base, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide. Such oral preparations may be sealed in glass or plastic in ampoules, in disposable syringes or in the form of various disposable vials.

주사용으로 사용하기에 적당한 약학적 조성물은 살균 수용액(sterileaqueous solutions)(물에 용해될 수 있는 곳에서) 또는 분산매(dispersions) 및 살균된 주사용 용액 및 분산의 임시적인(extemporaneous) 제조물을 위한 살균된 분말을 포함한다. 정맥 주사 투여를 위하여, 적당한 캐리어는 생리 염수, 세균 발육 저지된 물, 크레모포아 EL^TM(BASF, Parsippany, NJ) 또는 포스페이트 버퍼된 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에 있어서, 모든 조성물은 살균되어야 하고 용이한 주사 가능성이 존재하는 범위까지 유동성을 가져야 한다. 그것은 제조와 저장의 조건에 대하여 안정성을 가져야 하고 박테리아 및 균(fungi)과 같은 미생물(microorganisms)의 오염 행위에 대항하여 보존되어야 한다. 캐리어는 예를 들어, 물, 에탄올, 포리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 그와 같은 것들) 및 그들의 적당한 혼합물을 포함하는 용매(a solvent) 또는 분산 매개체가 될 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어 레시틴(lecithin)과 같은 코팅제의 사용에 의하여, 분산의 경우에 필요한 입자 크기를 유지하는 것에 의하여, 계면 활성제(surfactants)의 사용에 의하여 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄, 페놀, 아스코빅 산, 티메로살(thimerosal) 및 그와 같은 다양한 항-박테리아성 및 향균성(antifungal) 제제에 의하여 이루어질 수 있다. 많은 경우에 있어서, 예를 들어 설탕, 마니톨, 소르비톨(sorbitol)과 같은 폴리알콜, 소디움 클로라이드와 같은 등장액(iostonic)을 조성물에 포함하는 것이 적절하다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트(monostearate) 및 겔라틴과같은 흡수를 지연시키는 제제를 조성물에 포함하는 것에 의하여 발생된다.Pharmaceutical compositions suitable for use in injections may be used for sterilizing aqueous solutions (where they can be dissolved in water) or dispersions and for disinfecting injectable solutions and temporary preparations of dispersions. Powders. For intravenous administration, suitable carriers include physiological saline, bacteriostatic water, Cremophora EL ^™ (BASF, Parsippany, NJ) or phosphate buffered saline (PBS). In all cases, all compositions must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. It must be stable against the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be, for example, a solvent or dispersion medium comprising water, ethanol, polyol (eg, glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols and the like) and suitable mixtures thereof. Proper fluidity can be maintained by the use of surfactants, for example by the use of a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in case of dispersion. Prevention of the action of microorganisms can be achieved, for example, by parabens, chlorobutane, phenol, ascorbic acid, thimerosal and various such anti-bacterial and antifungal agents. In many cases, it is appropriate to include, for example, sugars, mannitol, polyalcohols such as sorbitol, iostonic such as sodium chloride in the composition. Prolonged absorption of the injectable compositions is caused by the inclusion of agents in the composition that delay absorption such as, for example, aluminum monostearate and gelatin.

살균된 주사 가능한 용액은 적당한 용액에서 필요한 양으로 활성 화합물(예를 들어, 온코스타틴 단백질 또는 항-온코스타틴 항체)를 결합하는 것에 의하여 제조될 수 있고, 적당한 용액은 하나 또는 필요한 경우에는 위에서 열거된 성분들의 조합물을 가지며, 여과된 살균 과정(filtered sterilization)을 거친다. 일반적으로, 분산매(dispersions)는 활성 화합물을 염기 분산 매개체 및 위에서 열거된 것으로부터 필요한 다른 구성 성분을 포함하는 살균된 운반체(vehicle)로 결합하는 것에 의하여 제조될 수 있다. 주사 가능한 용액의 제조를 위한 살균된 분말의 경우에, 제조의 적절한 방법은 진공 건조 및 냉동 건조 과정이며 이러한 과정은 활성 성분에 사전에 미리 살균-여과된 그들의 용액으로부터 필요한 성분을 추가하여 생산한다.Sterile injectable solutions can be prepared by combining the active compounds (e.g., oncostatin protein or anti-oncostatin antibody) in the required amount in a suitable solution, and one suitable solution, if necessary, as listed above. It has a combination of ingredients and undergoes filtered sterilization. In general, dispersions can be prepared by combining the active compound into a sterile vehicle which contains a base dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the preparation of injectable solutions, suitable methods of preparation are vacuum drying and freeze drying processes, which are produced by adding the necessary ingredients from their solutions previously pre-sterilized-filtered to the active ingredients.

구강의(oral) 투여되는 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 및 식용 가능한 캐리어를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐 내에 밀봉되거나 타블릿(tablets) 내부로 압축될 수 있다. 구강 치료 투여의 목적을 위하여, 활성 화합물은 엑스시피언츠(excipients)와 결합될 수 있고 타블릿, 정제(troches) 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 구강 내 투여 조성물은 양치질 약으로 사용을 위하여 유동성 캐리어를 사용하여 제조될 수 있고, 이 과정에서 유동성 캐리어 내에 있는 화합물은 구강적으로, 입속에서 헹구는 방식(swished) 및 가래를 나오게 하는 방식(expectorated) 또는 삼켜지는 방식으로 적용된다. 약학적으로 양립하는 결합 제제 및/또는 보조 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 타블릿,알약(pills), 캡슐, 정제 또는 그와 같은 것은 아래 성분의 임의의 것을 포함할 수 있거나, 또는 유사한 성질을 가진 화합물을 포함할 수 있다: 미세결정 셀로로스(microcrystalline cellulose), 검 트래거캔스(gum tragcanth), 젤라틴과 같은 교결제(binder); 전분 도는 락토오소와 같은 엑스피언트(excipient), 알기닉 산과 같은 분해(disintegrating) 제제, 프리모겔(Primogel) 또는 콘 전분(corn starch); 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes)와 같은 윤활제; 콜로이달 실리콘 다이옥사이드와 같은 글리단트(glidant); 슈크로스나 사카린과 같은 감미제(sweetening agent); 페프민트, 메틸 살리실레이트 또는 오레지 향미료와 같은 향미제.Oral administered compositions generally include an inert diluent and an edible carrier. They may be enclosed in gelatin capsules or compressed into tablets. For the purpose of oral therapeutic administration, the active compounds may be combined with excipients and used in the form of tablets, tablets or capsules. Intraoral administration compositions can be prepared using a fluid carrier for use as a gargling medicine, in which the compound in the fluid carrier is orally, swished and expelled out of the mouth. Or swallowed. Pharmaceutically compatible binding agents and / or adjuvants may be included as part of the composition. Tablets, pills, capsules, tablets or the like may include any of the following ingredients, or may include compounds with similar properties: microcrystalline cellulose, gum trager Binders such as gum tragcanth, gelatin; Starch or excipients such as lactoso, disintegrating agents such as alginic acids, Primogel or corn starch; Lubricants such as magnesium stearate or Steotes; Glidants, such as colloidal silicon dioxide; Sweetening agents such as sucrose or saccharin; Flavoring agents such as peppermint, methyl salicylate or orange flavoring.

흡입(inhalation)에 의한 투여를 위하여, 화합물은 가압된 컨테이너 또는 디스펜서(dispenser)로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달되고 이러한 컨테이너 또는 디스펜서는 예를 들어 카본 다이옥사이드 또는 네뷸라이저(nebulizer)와 같은 적당한 추진제(propellant)를 포함한다.For administration by inhalation, the compound is delivered in aerosol spray form from a pressurized container or dispenser and such container or dispenser is a suitable propellant such as, for example, carbon dioxide or nebulizer. It includes.

체계적인 투여는 단지 점막을 통한 침투나 피막을 통한 침투 수단에 의해서 만들어질 수 있다. 점막 침투 또는 피막 침투를 통한 투여를 위하여, 스며들어야 할 막(barrier)에 대하여 적절한 침투제(penetrants)가 공식화된 형태로(in the formulation) 사용된다. 그러한 침투제는 일반적으로 당해 업계에 공지되어 있고, 예를 들어 점막을 통한 투여(transmucosal administraion)을 위한 세정제, 담즙 염(bile salt) 및 푸시딕 산(fusicid acid) 유도체를 포함한다. 점막을 통한 투여는 코 스프레이(nasal sprays) 또는 좌약(suppositories)을 통하여 이루어질 수 있다. 피하 투여를 위하여, 활성 하합물은 일반적으로 당해 업계에 알려진 연고(ointments), 고약(salves), 겔 또는 크림 형태로 만들어질 수 있다.Systemic administration can only be made by means of penetration through the mucosa or through the membrane. For administration via mucosal penetration or membrane penetration, appropriate penetrants are used in the formulation for the barrier to be permeated. Such penetrants are generally known in the art and include, for example, detergents, bile salts and fusicid acid derivatives for transmucosal administraion. Administration through the mucosa may be via nasal sprays or suppositories. For subcutaneous administration, the active compounds may generally be made in the form of ointments, salves, gels or creams known in the art.

화합물은 또한 좌약 형태로 제조되거나(예를 들어 코코아 버트나 다른 글리세리드와 같은 종래의 좌약의 주약(suppository bases)을 사용한다) 또는 직장의 전달을 위한 보유 관장액(retention enemas)의 형태로 제조될 수 있다.The compounds may also be prepared in the form of suppositories (eg, using suppository bases of conventional suppositories such as cocoa butter or other glycerides) or in the form of retention enemas for delivery of the rectum. have.

하나의 실시 형태에 있어서, 활성 화합물은 신체로부터의 빠른 소진을 막기 위하여 화합물을 보호하는 캐리어와 함께 제조되고, 예를 들어 제어된 방출 형성제를 함께 사용하며, 임플랜트(implant) 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한다. 생물학적으로 낮은 등급을 가진(biodegradable), 생물학적으로 양립할 수 있는 폴리머가 사용될 수 있고, 이러한 폴리머로는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리글리코익 산(polyglycolic acid), 콜라겐, 폴리오소에스테르(polyorthoesters) 및 폴리락틱 산(polylactic acid) 같은 것들이 있다. 그러한 형성제(formulations)를 제조하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 물질은 또한 상업적으로 Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc로부터 얻을 수 있다. 리포소멀 서스펜션(liposomal suspensions)(바이러스 항원에 대하여 단일 세포로부터 만들어진 항체로 감염된 세포에 대하여 표적이 된 리포솜을 포함한다)이 또한 약학적으로 수용 가능한 캐리어로서 사용될 수 있다. 이러한 것들은 예를 들어 U.S. Patent No. 4,522,811에서 기술된 것과 같은 당업계에서 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있다.In one embodiment, the active compound is prepared with a carrier that protects the compound to prevent rapid burnout from the body, for example using a controlled release former, and implant and microencapsulated delivery. It includes a system. Biodegradable, biologically compatible polymers can be used, such polymers include ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polio Such as polyorthoesters and polylactic acid. It will be clear to those skilled in the art how to make such formulations. Such materials can also be obtained commercially from Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomal suspensions (including liposomes targeted to cells infected with antibodies made from single cells to viral antigens) can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. These are for example U.S. Patent No. It may be prepared according to methods known in the art such as described in 4,522,811.

투여의 용이성과 복용량의 균일성을 위하여 1회적인 복용 단위 형태로서 구강적인(oral) 또는 비-경구적인 조성물을 제조하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 1회분의 복용 단위(dosage unit form)는 치료되어야할 환자를 위하여 단위로 사용되는 복용량으로 맞추어진 물리적으로 구분된 단위를 의미한다; 각각의 단위는 필요한 약학적 캐리어와 관련하여 원하는 약학적 효과를 만들기 위하여 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명에 따른 복용 단위 형태의 명시는 활성 화합물의 특유한 특징 및 발생되어야 할 특별한 치료적 효과에 의하여 표시되고 직접적으로 이러한 것들에 의존하며, 개별적인 치료를 위한 그러한 활성 화합물을 혼합하는 업계의 필연적인 제한에 따른다. 그러한 화합물의 독성 및 치료적 효과는 세포 배지에서 또는 실험 동물에 대하여 표준적인 약학적 절차에 의하여 결정되고, 예를 들어 LD50(모집단(population)의 50%에 이르는 치사량) 및 ED50(모집단의 50%에 있어서 치료 효과를 나타내는 복용량)과 같은 것을 들 수 있다. 독성과 치료 효과의 복용 비율(dose ratio)은 치료적 지표(therapeutic index)가 되고 LD50/ED50의 비율로서 나타낼 수 있다. 큰 치료 지표를 나타내는 화합물이 적절하다. 독성 면에서의 효과를 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 이러한 화합물이 사용되는 때에는 그러한 화합물을 감염된 조직의 위치에 대하여 표적으로 하는 전달 시스템을 설계하기 위하여 특별히 주의를 기울어야 하며 이러한 주의는 감염이 되지 않는 세포를 손상시킬 수도 있는 잠재적인 가능성을 최소화하기 위한 것으로서 부작용(side effect)을 감소시키기 위한 것이다.It is especially advantageous to prepare oral or non-oral compositions in single dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. As used herein, a dosage unit form means a physically separated unit that is adapted to the dosage used as a unit for the patient to be treated; Each unit comprises a predetermined amount of active compound calculated to produce the desired pharmaceutical effect with respect to the required pharmaceutical carrier. The specification of the dosage unit form according to the invention is indicated and directly depends on these specific characteristics of the active compound and the particular therapeutic effect to be generated, which inevitably limits the industry to mixing such active compounds for individual treatment. Follow. Toxicity and therapeutic effects of such compounds are determined by standard pharmaceutical procedures in cell media or for experimental animals, for example LD50 (fatality up to 50% of population) and ED50 (50% of population). The dose which shows a therapeutic effect in the above) is mentioned. The dose ratio of toxic and therapeutic effects is a therapeutic index and can be expressed as the ratio of LD50 / ED50. Compounds that exhibit large therapeutic indices are appropriate. Although compounds that have a toxic effect can be used, special care must be taken when such compounds are used to design a delivery system that targets those compounds to the location of the infected tissue. To minimize the potential for damaging the cells, to reduce side effects.

세포 배양 분석 또는 동물 연구로부터 얻은 자료는 인간에 대한 사용을 위한 복용 범위를 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 복용량은 독성이거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도(circulating concentrations)의 범위 내가 되는 것이 적절하다. 복용량은 사용된 복용 형태 또는 사용되는 투여 경로에 따라서 이러한 범위 내에서 다양하게 될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용된 임의의 화합물에 대하여, 치료적으로 효과적인 복용은 세포 배양 분석으로부터 먼저 평가될 수 있다. 복용량(a dose)은 세포 배양에서 결정된 것으로서 IC50을 포함하는 순환 플라즈마 농도 범위를 이루기 위하여(즉, 증세의 최대 값의 반을 억제하는 시험 화합물의 농도) 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 그러한 정보는 인간의 유용한 복용량을 보다 정확하게 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 플라즈마에 있어서의 수준이 예를 들어, 높은 실행 액체 크로마토그래피에 의하여 측정될 수 있다.Data obtained from cell culture assays or animal studies can be used to form dosage ranges for use in humans. It is appropriate that dosages of such compounds fall within the range of circulating concentrations, including ED50, which is toxic with little or no toxicity. Dosages may vary within this range depending upon the dosage form employed or the route of administration utilized. For any compound used in accordance with the methods of the invention, a therapeutically effective dose can be evaluated first from a cell culture assay. A dose may be formulated in an animal model to achieve a circulating plasma concentration range (ie the concentration of test compound that inhibits half of the maximum value of symptoms) as determined in cell culture. Such information can be used to more accurately determine useful doses of humans. Levels in the plasma can be measured, for example, by high performance liquid chromatography.

본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터 내부로 삽입되어 유전자 치료 벡터(gene therapy vectors)로 사용될 수 있다. 유전자 치료 벡터는 예를 들어 정맥 주사, 국부 투여(local administration)에 의하여 환자에게 전달되거나( Chen et al.(1994) PNAS 91:3054-3057 참조) 스테레오탁틱 주사(stereotactic injection)를 통하여 환자에게 전달된다(Chen et al. (1994) PNAS 91:3054-3057). 유전자 치료 벡터의 약학적 제조는 수용 가능한 희석제 내에 있는 유전자 치료 벡터를 포함할 수 있고, 유전자 전달 매체가 삽입되는 느린 방출 기질(a slow release matrix)을 포함할 수 있다. 대안으로, 완전한 유전자 전달 벡터는 예를 들어 레트로바이러스 벡터와 같은 단지 재-조합 세포만을 사용하여 생산될 수 있고, 약학적 제조는 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 또는 그 이상의 세포를 포함할 수 있다.The nucleic acid molecule according to the present invention can be inserted into a vector and used as gene therapy vectors. Gene therapy vectors may be delivered to a patient, for example, by intravenous injection, local administration (see Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057) or via stereotactic injection. Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057. Pharmaceutical preparation of gene therapy vectors may include gene therapy vectors in an acceptable diluent and may comprise a slow release matrix into which a gene delivery medium is inserted. Alternatively, a complete gene transfer vector can be produced using only recombination cells, such as for example retroviral vectors, and pharmaceutical preparation can include one or more cells producing a gene delivery system.

약학적 조성물은 투여를 위한 지침과 함께 컨테이너, 팩 또는 디스펜서 내에 포함될 수 있다.The pharmaceutical composition may be included in a container, pack or dispenser with instructions for administration.

V. 본 발명의 사용 및 방법(Uses and Methods of the Invention)V. Uses and Methods of the Invention

본 발명은 환자(예를 들어, 환자가 인간이 되는 경우)를 치료하는 예방 및 치료 방법 양쪽 모두를 제공한다. 한 가지 특징으로서, 본 발명은 예방적으로 환자의 발생을 방지하는 방법을 제공한다. 예방을 위한 제제의 투여는 원하지 않는 질병 또는 장애의 증세가 명백해지기 전에 이루어질 수 있고, 이러한 투여는 질병 또는 장애를 예방하기 위하여 또는 그러한 것들의 진행을 지연시키기 위하여 이루어질 수 있다. 본 발명에 의한 예방 방법은 본 명세서에서 기술된 치료 방법과 유사한 방법으로 행해질 수 있으며, 이러한 방법은 복용량 및 치료 영역이 다른 경우에도 행해 질 수 있다.The present invention provides both prophylactic and therapeutic methods for treating a patient (eg, when the patient becomes a human). In one aspect, the present invention provides a method of prophylactically preventing the occurrence of a patient. Administration of the agent for prevention can be effected before the symptoms of the unwanted disease or disorder become evident, and such administration can be effected to prevent the disease or disorder or to delay the progression thereof. The prophylactic method according to the invention can be carried out in a manner similar to the treatment methods described herein, and this method can be carried out even when the dosage and the treatment area are different.

본 발명의 또 다른 특징은 치료의 목적을 위하여 환자를 처치하는 것(treating)과 관련된다. 한 가지 실시 형태로서, 본 발명은 아폽토틱 반응을 조절하는(modulating) 방법을 포함한다. 특별히, 아폽토틱 반응의 조절은 세포의 염색질의 조절, 세포 생존성(viability)의 조절 또는 세포 용해(lysis)의 조절을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 적절한 실시 형태는 아폽토시스의 조절을 포함하고, 특별히 프로그램화된 세포 소멸의 향상을 포함한다. 따라서, 제시된 방법은 비정상적인 또는 원하지 않는 세포를 제거하는데 있어서 치료적 유용성을 가진다. 그러한 조절 방법은 암과 같은 질병에 유용하고, 예를 들어 관절염(arthritis)과 같은 매크로파지의 과도한 활성에 의하여 특징을 가지는 염증을 발생시키는 질병에 대하여 유용하다.Another feature of the invention relates to treating a patient for treatment purposes. In one embodiment, the present invention includes a method of modulating apoptotic responses. In particular, modulation of apoptotic responses includes, but is not limited to, regulation of cell chromatin, regulation of cell viability or regulation of cell lysis. Suitable embodiments of the present invention include regulation of apoptosis and include enhancement of specifically programmed cell death. Thus, the presented methods have therapeutic utility in removing abnormal or unwanted cells. Such modulating methods are useful for diseases such as cancer and for diseases that cause inflammation characterized by excessive activity of macrophages, such as arthritis, for example.

본 발명의 조절 방법은 아폽토틱 반응과 관련된 하나 또는 그 이사의 활성을 규제하는 제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 적절한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 생물학적 온콜리틱 분자와 접촉된 세포는 환자의 내부에 존재한다. 환자 내부에서 세포를 접촉시키는 것은 생물학적 합성 분자의 직접적인 투여에 의하여 또는 실시 예 3-5에서 예시로서 제시된 레트로바이러스적인 분자의 전달에 의하여 또는 환자의 내부로 도입하거나 또는 폴리펩티드를 발현하기 위하여 당업계에 인지된 임의의 수단에 의하여 이루어질 수 있다.The modulatory method of the present invention involves contacting the cell with an agent that regulates the activity of one or its directors involved in the apoptotic response. In a suitable embodiment, the cells in contact with the biological oncolytic molecules of the invention are present in the patient. Contacting cells within a patient is known in the art either by direct administration of a biosynthetic molecule or by delivery of a retroviral molecule set forth as an example in Examples 3-5 or introduced into the patient or expressing a polypeptide. It may be made by any means recognized.

본 발명은 추가로 아래와 같은 실시 예로서 제시되지만 결코 추가적인 제한으로 이해되지 않아야 한다. 이러한 적용 예를 통하여 인용된 모든 참조(문헌 참조, 반포된 특허 및 공개된 특허)의 전체적인 내용은 본 명세서의 의하여 명백하게 참조로서 결합된다.The invention is further presented by the following examples, but should never be understood as further limitations. The entire contents of all references (document references, published patents and published patents) cited throughout this application are hereby expressly incorporated by reference.

실시 예(Exemplification)Example

실시 예 1Example 1

첫 번째 발생 오스테오폰틴-유도된 생물학적 분자인 온콜리신 N(oncolysin N)은 자연적으로 발생하는 오스테오폰틴 폴리펩티드로부터 분리시키는 경우 프로-아폽토틱 활성을 충분히 부여하기 위하여 오스테오폰틴의 영역 분리에 기초하도록 처리되었다. 특별히, 온콜리신 N 분자는 아래의 영역을 포함하도록 설계되었다:(1) 신호 서열(즉, 신호 펩티드), 천연적인 오스테오폰틴 아미노 산 서열(즉 SEQ ID NO:1로서 제시된 인간의 오스테오폰틴-B 아미노 산 서열의 아미노 산 1-16)로부터 실시 예로서 유도되었다; (2) 골지 프로세싱 영역, 천연적인 오스테오폰틴 아미노 산 서열(즉, SEQ ID NO:1로서 제시된 인간의 오스테오폰틴-B 아미노 산 서열의 아미노 산 17-30)로부터 유도되었다; (3) 프로-아폽토틱 영역, 아폽토시스를 유도하기 에 충분한 인간의 오스테오폰틴-B의 인접하는(contiguous) 아미노 산 잔여물(즉, SEQ ID NO:1로서 제시된 인간의 오스테오폰틴-B 아미노 산 서열의 아미노산 147-170), 이러한 영역은 아폽토틱 활성을 위하여 필요하지 않거나 또는 대안으로 프로-아폽토틱 활성을 감소시키는 추가적인 오스테오폰틴-B 서열이 결핍되고, 이러한 영역은 생물학적 합성 분자의 영역이 된다; (4) 두 개의 링커 영역, 첫 번째 링커는 신호 서열을 골지 프로세싱 영역에 실시 가능한 형태로 결합하고, 두 번째 링커는 골지 프로세싱 영역을 프로-아폽토틱 영역에 실시 가능하도록 결합된다. 신호 서열 및 골지 프로세싱 영역은 생물학적 합성 온콜리신 N 분자의 골지 및 분비(golgi and secretion)를 통한 과정을 이용하여 합성을 최적화한다. 링커 영역은 기능적인 영역의 독립적인 폴딩을 강제한다. 온콜리신 N의 신호 서열은 SEQ ID NO:4의 gly 17 및 gly 18에서 쪼개지며 N-터미날 서열 GGPGIPVK(SEQ ID NO:4의 아미노 산 18-25에 해당한다)를 가지는 성숙한 폴리펩티드를 이용한다. "첫 번째 발생" 생물학적 합성 온콜리틱 분자로 명해지는 온콜리신 N 분자는 아폽토틱 반응을 조절하는 능력을 가지며, 특별히 세포 아폽토시스를 향상시키는 능력을 가진다. 아폽토시스 분석에 있어서, 천연적인 오스테오폰틴-B는 아폽토틱 활성을 가지지 않는 반면에, 어떤 N-터미날 오스테오폰틴 생물학적 활성 단편(fragments)은 적어도 부분적으로 아폽토시스를 유도할 수 있는 능력을 가진다(즉, N-터미날 오스테오폰틴 a 및 오스테오폰틴 b 서열, 각각 도 1b-1c에 제시되고 SEQ ID NOs:2-3으로 제시된 OPN-a/nt 및 OPN-b/nt). 생물학적 합성 온콜리신 N 분자는 아폽토시스를 유도하는데 있어서 적어도 부분적으로는 효과적인 것은 마찬가지였다. 아폽토틱 활성의 유도는 수많은 업계-인지된 분석 중의 임의의 하나에 따라 수행될 수 있다. 예시적인 분석이 아래에서 제시된다, 즉 준-안정적인 종양 세포 라인(a metastatic tumor cell line)에서 오스테오폰틴-유도된 생물학적 합성 분자인 온콜리신 N에 의한 아폽토시스의 유도가 아래에서 기술된다.Oncolysin N, the first-occurring osteopontin-derived biological molecule, is used to separate regions of osteopontin to provide sufficient pro-apoptotic activity when isolated from naturally occurring osteopontin polypeptides. It was processed to base. In particular, the oncolysine N molecule was designed to include the following regions: (1) signal sequence (ie, signal peptide), natural osteopontin amino acid sequence (ie, human Osteo as shown by SEQ ID NO: 1) Amino acids 1-16 of pontin-B amino acid sequence); (2) derived from the Golgi processing region, the native osteopontin amino acid sequence (ie, amino acid 17-30 of the human osteopontin-B amino acid sequence set forth as SEQ ID NO: 1); (3) pro-apoptotic regions, contiguous amino acid residues of human osteopontin-B sufficient to induce apoptosis (ie, human osteopontin-B amino shown as SEQ ID NO: 1) Amino acids 147-170 of the acid sequence), which region is not necessary for apoptotic activity or alternatively lacks an additional osteopontin-B sequence that reduces pro-apoptotic activity, which region of the biosynthetic molecule Becomes; (4) Two linker regions, the first linker binds the signal sequence to the Golgi processing region in a form feasible, and the second linker binds the Golgi processing region to the pro-apoptotic region. The signal sequence and Golgi processing regions utilize synthesis through the Golgi and secretion of biologically synthesized oncolysine N molecules to optimize synthesis. The linker region enforces independent folding of the functional region. The signal sequence of oncolysin N is cleaved at gly 17 and gly 18 of SEQ ID NO: 4 and uses a mature polypeptide having the N-terminal sequence GGPGIPVK (corresponding to amino acids 18-25 of SEQ ID NO: 4). Oncolysine N molecules, referred to as "first generation" biologically synthetic oncolytic molecules, have the ability to modulate apoptotic responses, and in particular to enhance cellular apoptosis. In apoptosis assays, natural osteopontin-B does not have apoptotic activity, whereas certain N-terminal osteopontin biologically active fragments have the ability to at least partially induce apoptosis (ie , N-terminal osteopontin a and osteopontin b sequences, OPN-a / nt and OPN-b / nt, respectively, shown in FIGS. 1B-1C and represented by SEQ ID NOs: 2-3). Biologically synthetic oncolysine N molecules were equally at least partially effective in inducing apoptosis. Induction of apoptotic activity can be performed according to any one of a number of industry-recognized assays. Exemplary assays are presented below, ie the induction of apoptosis by oncolysin N, an osteopontin-derived biological synthetic molecule in a metastatic tumor cell line, is described below.

세포는 배지에서 배양되고 외인성 온콜리신 N의 다양한 양으로 처리되었다. 아폽토시스는 프로피디움 이오다이드(propidium iodide)의 섭취에 따라서 유동 시토메트릭 분석(flow cytometric analysis)에 의하여 결정되었다. 세포는 5 mM EDTA를 포함하는 포스페이트 버퍼된 염수에서 수확되고 50%의 에탄올에서 30동안 응고되었다(fixed). RNA는 실온에서 30분 동안 40μM RNAse A으로 처리되어 제거되고, 세포는 5mM EDTA를 포함하는 포스페이트 버퍼된 염수에서 100μg/mL 프로피디움 이오다이드로 배양된다. 아폽토틱 세포에서 DNA 쪼개짐은 유동 시토메트릭 분석에 의하여 입수되고(access), 하이포디플로이드 핵(hypodiploid nuclei)을 포함하는 세포는 순수한 핵보다 더 작은 프로피디움 이오다이드를 결합한다.Cells were cultured in media and treated with varying amounts of exogenous oncolysine N. Apoptosis was determined by flow cytometric analysis according to ingestion of propidium iodide. Cells were harvested in phosphate buffered saline containing 5 mM EDTA and fixed for 30 hours in 50% ethanol. RNA is removed by treatment with 40 μM RNAse A for 30 minutes at room temperature and cells are incubated with 100 μg / mL propidium iodide in phosphate buffered saline containing 5 mM EDTA. DNA cleavage in apoptotic cells is accessed by flow cytometry analysis, and cells containing hypodiploid nuclei bind smaller propidium iodide than pure nuclei.

세포 아폽토시스는 또한 핵 응축(nuclear condensation), 염색질 분해(fragmentation) 및 트리판 블루 배제(Trypan blue exclusion)에 의하여 입수되는 생존성(viability)과 같은 당업계의 표준 기준에 의하여 결정된다.Cell apoptosis is also determined by standard criteria in the art, such as viability obtained by nuclear condensation, fragmentation and Trypan blue exclusion.

실시 예 2Example 2

이 실시 예는 온콜리신 N의 구조 및 활성에 기초하는 두 개의 "두 번째 발생" 생물학적 합성 온콜리틱 분자의 처리를 기술한다. 특별히, 두 개의 두 번째 발생 생물학적 합성 온콜리틱 분자는 온콜리신 N, 온콜리신 1(본 명세서에서는 "소핀 C(sophin C)"로 언급되기도 한다)으로부터 발생된다.This example describes the treatment of two “second occurrence” biologically synthetic oncolytic molecules based on the structure and activity of oncolysin N. In particular, two second-generation biologically synthetic oncolytic molecules are generated from oncolysin N, oncolysine 1 (also referred to herein as "sophin C").

온콜리신 2를 발생시키기 위하여, 합성 콜라켄 결합 영역이 온콜리신 N의 C 터미너스에서 만들어졌다. 온콜리신 2의 아미노 산 서열은 SEQ ID NO:6으로서 제시된다. 세포의 아폽토시스 분석은 실시 예 1에서 기술된 것과 같다. 온콜리신 2는 온콜리신 N 보다 아폽토시스를 향상시키는 데 있어 보다 효과적이다.To generate oncolysine 2, synthetic collagen binding regions were made at the C terminus of oncolysine N. The amino acid sequence of oncolysin 2 is shown as SEQ ID NO: 6. Apoptosis analysis of the cells is as described in Example 1. Oncolysine 2 is more effective at improving apoptosis than oncolysine N.

온콜리신 1/소핀 C를 발생시키기 위하여, 합성 헤파린 결합 영역이 온콜리신 N의 C 터미너스에서 만들어졌다. "헤파린 결합 영역"은 적어도 하나, 적절하게는 둘, 보다 적절하게는 세 개, 네 개, 다섯 개, 또는 여섯 개 헤파린 결합 모티프를 포함하고 헤파린 결합 모티프는 공식 arg-xaa-염기 잔여물-염기 잔여물, 적절하게는 arg-xaa-(arg 또는 lys)-(arg 또는 lys)를 가진다. 예시적인 헤파린 결합 모티프는 적절하게는 임의의 두 개의 아미노 산에 의하여 분리된다, 즉 xaa-xaa에 의하여 분리된다. 이러한 이유로 적절한 헤파린 결합 영역은 공식 (R-X-R/K)-(X-X-R-X-R/K)_n으로 표현되고, n=1, 적절하게는 2, 보다 적절하게는 3 또는 4가 된다. 적절한 실시 형태로는 n=3이 된다. (추가적인 연속적인 헤파린 결합 모티프가 첨가될 수 있지만, 궁극적으로 생물학적 합성 온콜리틱 분자의 아폽토틱 효과를 증가시키기보다는 감소시키게 될 것이다.) 헤파린 결합 영역의 첨가는 아폽토틱 활성을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다. 온콜리신 1/소핀 C 의 아미노 산 서열(두 개의 헤파린 결합 모티프, RSKK 및 RGRR을 가지는)이 SEQ ID NO:5로 제시된다. 기계적인 분석은 추가적인 헤파린 결합 모티프를 포함하는 것은 예를 들어 CD44와 같은 두 번째 수용체 또는 성장 요소 수용체(예를 들어, EGF 또는 hbGF-R과 같은 성장 요소 수용체)를 이용하여 종양 세포의 표면에 인터그린(integrin) 수용체의 잘못된 결찰(misligtion)을 향상시키는 것으로 나타났다. 예시적인 잘못된 결찰 수용체는 her-2가되며, 유방 암 세포에 의하여 발현되고, 본 명세서에서 기술된 것처럼 생물학적 합성 온콜리틱 분자가 유방 암 세포에 대하여 저항하는 데 효과를 가지도록 만든다.To generate oncolysine 1 / sopin C, a synthetic heparin binding region was made at the C terminus of oncolysine N. A "heparin binding region" comprises at least one, suitably two, more suitably three, four, five, or six heparin binding motifs, wherein the heparin binding motif has the formula arg-xaa-base residue-base Residue, suitably arg-xaa- (arg or lys)-(arg or lys). Exemplary heparin binding motifs are suitably separated by any two amino acids, ie by xaa-xaa. For this reason a suitable heparin binding region is represented by the formula (RXR / K)-(XXRXR / K) _n , where n = 1, suitably 2, more suitably 3 or 4. In a preferred embodiment, n = 3. (Additional successive heparin binding motifs may be added, but will ultimately reduce rather than increase the apoptotic effect of biologically synthesized oncolytic molecules.) The addition of heparin binding regions significantly increases apoptotic activity. appear. The amino acid sequence of oncolysin 1 / sopin C (with two heparin binding motifs, RSKK and RGRR) is shown as SEQ ID NO: 5. Mechanical analysis suggests that additional heparin binding motifs may be intercalated to the surface of tumor cells using a second receptor such as CD44 or a growth factor receptor (eg, a growth factor receptor such as EGF or hbGF-R). It has been shown to enhance misligtion of green receptors. Exemplary erroneous ligation receptors are her-2, expressed by breast cancer cells, and making the biologically synthetic oncolytic molecules effective as resistant to breast cancer cells as described herein.

실시 예 3Example 3

이 실시 예는 실험적(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 양쪽 모두에서 포유동물 숙주에 있어 높은 수준의 온콜리신 1/소핀 C 발현의 안정된 유도를 허용하는 레트로바이러스 발현 벡터의 생성을 제시한다.This example demonstrates the generation of retroviral expression vectors that allow stable induction of high levels of oncolysine 1 / sopin C expression in mammalian hosts both in vitro and in vivo. .

온콜리신은 9kb 레트로바이러스의 테트-온 발현 벡터로 복제된다. 이러한 벡터는 포유동물 숙주에서 높은 수준의 안정된 발현을 위하여 설계된다. 레트로바이러스의 테트-유도성 벡터는 감염성을 가지는,복제-부적격레트로바이러스(replication-incompetent retrovirus)를 생산하고 이러한 레트로바이러스는 관련 유전자를 다양한 범위의 포유동물 세포 형태로 생체 내 또는 실험적으로 도입되도록 사용될 수 있다. 레트로바이러스의 높은 효율성을 가진 형질 도입(transduction)은 복제된 유전자를 거의 모든 유사 분열적으로 활성을 가지는 세포의 숙주 게놈 내부로 안정적으로 결합할 수 있다. 테트라시클린(tetracycline)(Tc) 제어된 트랜색티베이터(transactivator) 및 역 Tc 제어된 트랜색티베이터(rtTA)는 관련 유전자를 포함하는 동일하게 결합된 레트로바이러스의 구조로부터 발현된다. RtTA는 TRE를 결합하고 독시시클린(Doxycycline)의 존재 하에서 전사를 활성화시킨다. 관련 유전자(예를 들어, 도 2b에서 제시된 삽입 서열)는 복수의 복제 장소(MCS)에 삽입되고, TRE의 제어가 이루어진다. TRE는 42-bp TeTO 서열의 7개의 복사로 구성되고, 시토메갈로바이러스(PminCMV)의 최소한 직접적인 초기 프로모터의 정확한 업스트림(upstream)으로 위치된다.Oncolysine is replicated with a tet-on expression vector of 9 kb retrovirus. Such vectors are designed for high levels of stable expression in mammalian hosts. Tet-derived vectors of retroviruses produce infectious, replication-incompetent retroviruses that can be used to introduce relevant genes in vivo or experimentally into a wide range of mammalian cell forms. Can be. Highly efficient transduction of retroviruses can reliably bind the cloned gene into the host genome of almost all mitotically active cells. Tetracycline (Tc) controlled transactivator and reverse Tc controlled transactivator (rtTA) are expressed from the structure of identically bound retroviruses containing related genes. RtTA binds TRE and activates transcription in the presence of doxycycline. Relevant genes (eg, insertion sequences shown in FIG. 2B) are inserted into a plurality of replication sites (MCS) and control of the TRE is made. The TRE consists of seven copies of the 42-bp TeTO sequence and is located precisely upstream of the at least direct initial promoter of cytomegalovirus (PminCMV).

실시 예 4Example 4

이 실시 예는 시험관 내의 실험에서 소핀 C 발현이 유방 암 세포 라인에서 유도되는 경우, 세포는 복수개의 핵 형상으로 되고 충분한 아폽토시스를 수행하는 반면, 유도되지 않은 제어 세포는 생존하여 남아 있다는 것을 제시한다.This example suggests that when in vitro experiments, Sopin C expression is induced in a breast cancer cell line, the cells become a plurality of nuclear shapes and undergo sufficient apoptosis, while uninduced control cells remain alive.

p레트로-온콜리신으로 감염된 작은 세포 카시노마 및 유방 암 세포에서 아폽토시스의 유도(Induction of apoptosis in small cell carcinoma and Breast cancercells by infection with pRetro-oncolysin)Induction of apoptosis in small cell carcinoma and Breast cancer cells by infection with pRetro-oncolysin

50,000 유방 종양 세포는 4μg/ml 폴리브렌(polybrene)을 포함하는 DME+10% FBS에서 약 500,000 바이러스 입자로 감염되었다. 48 시간 후, MDA-MB-231 세포는 3 μg의 독시시클린을 이용하여 규정된 매개체에서 6시간 동안 유도되었다. 아폽토시스가 FragEL^TM아폽토틱 분석을 사용하여 입수되었다(assess). 유도되지 않은 세포는 광학 현미경으로 10배의 배율로 관찰할 때 생존하였고 블루(blue)로 표시되었다. 세포 발현 온콜리신 1/소핀 C는 10배의 배율로서 관찰될 때 갈색을 띤 얼룩진 세포로서 나타남으로서 아폽토시스를 수행했다. 각각의 실험은 복제적으로 반복하여 3번 실시되었다. 작은 세포 폐 카시노마 세포가 바이러스 입자를 생성하는 온콜리신 1/소핀 C로 감염되었을 때 유사한 결과가 얻어졌다.50,000 breast tumor cells were infected with about 500,000 virus particles in DME + 10% FBS containing 4 μg / ml polybrene. After 48 hours, MDA-MB-231 cells were induced for 6 hours at the mediators defined using 3 μg of doxycycline. Apoptosis was obtained using the FragEL ^™ apoptotic assay. Uninduced cells survived and were shown in blue when observed at 10 × magnification under an optical microscope. Cell expression Oncolysine 1 / Sopin C performed apoptosis by appearing as brownish stained cells when observed at a magnification of 10 times. Each experiment was repeated three times in duplicate. Similar results were obtained when small cell lung carcinoma cells were infected with oncolysin 1 / sopin C, which produces virus particles.

온콜리신을 발현하는 MDA-MB-231 인간 유방 암 세포에서 착색시키는 튜블린(Tubulin Staining in MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells Expressing Oncolysin)Tubulin Staining in MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells Expressing Oncolysin for staining in MDA-MB-231 human breast cancer cells expressing oncolysine

온콜리신 1-감염된 MDA-MB-231 종양 세포가 독시시클린 3μg/ml로 유도되었다. 6시간 후, 이 세포는 간접적인 형광성 이뮤노케미스트리를 사용하는 튜블린을 위하여 착색된 10% 포말데리드(formaldehyde)에서 응고되었다(fixed). 제어 유도되지 않은 감염된(control uninduced infected) MDA-MB-231 세포는 핵 주로 핵 주위를 착색하는 전형적인 튜블린을 보여주었다. 유도된 MDA-MB-231 세포는 복합핵 주위로 안정화된 튜블린을 나타내었다. 주목되는 것은, 나타난 효과는 탁솔(toxal), 비-수용체-매개된 아폽틱 제제에 의하여 유도된 것과 유사하다.Oncolysine 1-infected MDA-MB-231 tumor cells were induced at 3 μg / ml of doxycycline. After 6 hours, the cells were fixed in 10% formaldehyde stained for tubulin using indirect fluorescent immunochemistry. Control uninduced infected MDA-MB-231 cells showed typical tubulin staining around the nucleus, mainly the nucleus. Induced MDA-MB-231 cells showed stabilized tubulin around the multinucleus. Note that the effect shown is similar to that induced by a toxal, non-receptor-mediated apoptic agent.

MDA-MB-231 인간 유방 암 세포 발현 온콜리신의 핵 착색(Nuclear Stain of MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cell Expressing Oncolysin)Nuclear Stain of MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cell Expressing Oncolysin

감염된 세포는 독시시클린을 이용하여 유도하지 않거나 또는 6시간 동안 유도된 후에 H 및 E로 착색되었다. 복합 핵 형성(multinucleation)이 단지 유도된 세포에서 관찰되었고, 아폽토틱 페노타입(phenotype)을 나타내었다.Infected cells were not induced with doxycycline or stained with H and E after 6 hours of induction. Multiple nucleation was observed only in the induced cells, indicating apoptotic phenotype.

실시 예 5Example 5

이 실시 예는 생체 내에 투여된 온콜리신 1/소핀 C는 효과적인 항-종양 제제라는 것을 보여준다.This example shows that oncolysin 1 / sopin C administered in vivo is an effective anti-tumor agent.

일차 종양 성장 및 전이(metastasis)에 대항하는 온콜리신 1/소핀 C의 효과를 평가하기 위하여, 1x10⁷MDA-MB-231 유방암 세포가 누드 마이스(nude mice)의 좌측 옆구리로 피하(subcutaneously) 주사되었다. 6주 후에 결과로서 발생하는 종양은 방부 처리되어 해부되고, 조심스럽게 분리되고(mince), 1mm-종양 조각은 트로카 바늘(trocar needle)을 사용하여 누드 마우스의 오른쪽 옆구리로 이식된다. 일주일 후에, 종양이 약 10mm로 측정될 때, 마우스(생쥐)는 다른 실험 그룹으로 분류된다. 한 세트의 24 마리 동물 관련(bearing) MDA-MB-231 제노그래프트(xenografes)가 3개의 그룹으로 나누어지고 다음과 같은 치료를 받았다: 8 마리의 첫 번째 그룹은 p레트로-온콜리신(1x10⁶바이러스 입자)로 주사되었다. 하루 후 그 후 매주 단위로(3주 동안) 이 동물은 복막 케버티(peritoneal cavity)를 통하여 유도성 제제 독시시크신(Doxycyxlin)(1mg/kg) 의 주사로 매주 치료되었다. 8마리의 두 번째 그룹은 독시시크린(감염되지 않은 종양) 주사로 매주 치료되었고 세 번째 그룹은 온콜리신 단백질(10μg/kg)의 주사가 매주 투여되었다. 다른 일련의 실험에서, p레트로-온콜리신은 종양 관련 생쥐의 골수 기질(marrow stroma) 내부로 주사되었다. 하루 후에, 독시시클린의 매주 단위의 주사로 위에서 설명한 것과 같은 방법으로 치료되었다. 종양은 마이크로칼리퍼(microcalipers)로 이틀마다 한 번씩 측정되었고, 종양 크기는 길이x너비x높이x0.5236으로 계산되었다. 체중은 주사를 투여하는 때에 측정되었고, 4일 후에는 주 단위로 측정되었다. 첫 번째 주사 후 4일 째 되는 날, 혈액 샘플이 Unoppette^TM마이크로-컬렉션 키트를 사용하여 꼬리 혈관(tail vein)으로부터 수집되었다. 총 류코사이트 및 프레트렛(leukocyte and platelet) 계산은 인위적으로 헤모시토미터(a hemocytometer)를 사용하여 결정되었다. Hema3^TM으로 착색된 블러드 스미어(blood smear)가 그라뉼로사이트 및 림포사이트(granulocytes and lymphocytes)의 절대치를 수집하기 위하여 사용되었다. 치료-관련된 독성이 체중에 있어서의 차이, 간장(liver) 및 신장 마커(kindney marker) 효소 및 혈액학적 매개 변수에 근거하여 치료 그룹 사이에서평가되었다. 치료를 행한 후 20주가 지난 뒤, 동물은 마취제를 이용하여 목을 베어서(decapitation) 죽였다. 종양이 분해되고, 무게를 측정하고, 카스파제(caspase) 효소 결정을 위하여 스냅-냉동되었다. 몇몇 경우에 있어서, 종양이 응고되었고, 발생학적으로(histologically) 시험되었다. 간장, 심장, 자궁, 난소, 허파 돌기 코드(lungs spinal cord) 및 모든 긴 골격(bones)이 발생학적으로 평가되었다.To evaluate the effect of oncolysin 1 / sopin C on primary tumor growth and metastasis, 1 × 10 ⁷ MDA-MB-231 breast cancer cells were injected subcutaneously into the left flank of nude mice. It became. After 6 weeks, the resulting tumor is embalmed, dissected, carefully separated (mince), and 1 mm-tumor pieces are implanted into the right flank of nude mice using a trocar needle. A week later, when the tumor was measured at about 10 mm, mice (mouses) were classified into different experimental groups. One set of 24 animal-bearing MDA-MB-231 xenografes was divided into three groups and received the following treatments: The first eight groups were p-retro-oncolysine (1 × 10 ^6). Virus particles). One day later and then weekly (for three weeks) the animals were treated weekly with injections of the inducible agent Doxycyxlin (1 mg / kg) through the peritoneal cavity. A second group of 8 dogs were treated weekly with doxycycline (uninfected tumors) injection and the third group received weekly injections of oncolysine protein (10 μg / kg). In another set of experiments, p-retro-oncolysine was injected into the marrow stroma of tumor associated mice. One day later, a weekly injection of doxycycline was treated in the same manner as described above. Tumors were measured once every two days with microcalipers, and tumor size was calculated as length x width x height x 0.5236. Body weight was measured at the time of injection and weekly after 4 days. Four days after the first injection, blood samples were collected from the tail vein using the Unoppette ^™ micro-collection kit. Total leukocyte and platelet calculations were determined artificially using a hemocytometer. Blood smear stained with Hema3 ^™ was used to collect the absolute values of granulocytes and lymphocytes. Treatment-related toxicity was evaluated between treatment groups based on differences in body weight, liver and kidney marker enzymes, and hematological parameters. Twenty weeks after the treatment, the animals were decapitation with anesthesia and killed. Tumors were digested, weighed and snap-frozen for caspase enzyme determination. In some cases, tumors were coagulated and tested histologically. Liver, heart, uterus, ovary, lungs spinal cord and all long bones were assessed embryologically.

도 4에서 도시된 결과는 통제가 대비되는 그룹 1과 3에 있어서 종양 크기의 현저한 감소를 보여주었다. 모든 치료된 생쥐는 양 6개월 후에 건강한 상태로 남았다. 이와 대조적으로, 모든 통제 동물은 그들의 종양의 결과로서 죽거나 또는 과도한 종양의 부담에 대한 결과로서 희생되었다. 나타나는 결과는 생체 내에서 종양 부담(tumor burden)의 감소 및 생존성의 연장에 있어서, 소핀 C의 효과성을 제시하여 주었다. 추가로 나타난 결과는 소핀 C는 직접적으로 또는 바이러스 전달 시스템에 의하여 투여될 수 있는 가능성을 보여준다.The results shown in FIG. 4 showed a significant reduction in tumor size in groups 1 and 3 in contrast to controls. All treated mice remained healthy after 6 months. In contrast, all control animals died as a result of their tumors or were sacrificed as a result of excessive tumor burden. The results shown suggested the effectiveness of Sopin C in reducing tumor burden and prolonging viability in vivo. Further results show the possibility that Sopin C can be administered directly or by a viral delivery system.

도 5에 나타난 결과는 복용 반응 연구(dose response studies)에 추가하여 넓은 범위의 종양 모델에 있어서 효력을 입수하기 위한 실험을 예시해 준다. 종양 크기에 대한 소핀 C의 효과는 유방, 전립선 및 자궁 세가지 형태의 종양에 대하여 평가되었다. 50 및 500μg/kg 단백질 양쪽에 있어서 종양 크기의 감소를 보여주는 결과는 도 5에 도시되어 있다.The results shown in FIG. 5 illustrate experiments to take effect in a wide range of tumor models in addition to dose response studies. The effect of sopin C on tumor size was evaluated for three types of tumors: breast, prostate and uterus. Results showing reduction in tumor size for both 50 and 500 μg / kg protein are shown in FIG. 5.

등가물(Equivalent)Equivalent

당업자는 본 명세서에서 기술된 발명의 특정한 실시 형태와 등가적인 많은 것이 단지 흔한 실험을 사용하여 인지할 수 있고 확신할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 아래에서 첨부되는 청구범위에 포함되는 것으로 이해된다.Many skilled in the art will recognize and be sure that many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein are merely using common experiments. Such equivalents are to be understood as included in the appended claims below.

Claims (40)

아폽토틱 성분(an apoptotic component) 및 적어도 하나의 생물학적 모듈러(biomodular) 성분을 포함하고, 아폽토시스를 향상시키는 분자를 형성하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자(a biosynthetic oncolytic molecule).A biosynthetic oncolytic molecule comprising an apoptotic component and at least one biomodular component and forming a molecule that enhances apoptosis. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 아폽토틱 성분은 오스테온폰틴(osteopontin)으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.Biologically synthesized oncolytic molecules, wherein the apoptotic component is derived from osteopontin. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 아폽토틱 성분은 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.A biologically synthetic oncolytic molecule, characterized in that the apoptotic component is a polypeptide. 청구항 3에 있어서,The method according to claim 3, 아폽토틱 성분은 길이에 있어서 5 내지 50 아미노 산 잔여물(residues) 사이의 아미노 산 서열을 포함하고 SEQ ID NO:1의 아미노 산 잔여물 147 내지 170 서열과 적어도 90% 동일한(identical) 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.The apoptotic component comprises an amino acid sequence between 5 and 50 amino acid residues in length and is at least 90% identical to the amino acid residues 147 to 170 sequence of SEQ ID NO: 1 Biologically synthesized oncolytic molecules. 청구항 3에 있어서,The method according to claim 3, 아폽토틱 성분은 SEQ ID NO:1의 잔여물 147 내지 170을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.Wherein said apoptotic component comprises residues 147-170 of SEQ ID NO: 1. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 생물학적 모듈러 성분은 신호 펩티드(a signal peptide), 링커 영역(a linker domain), 골지 프로세싱 영역(a golgi processing domain), 헤파린 결합 영역(a heparin binding domain) 및 콜라겐 결합 영역(a collagen binding domain)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.The biological modular component is a signal peptide, a linker domain, a golgi processing domain, a heparin binding domain and a collagen binding domain. A biologically synthetic oncolytic molecule, characterized in that it is selected from the group consisting of. 아폽토틱 성분, 첫 번째 생물학적 모듈러 성분 및 두 번째 생물학적 모듈러 성분을 포함하고, 세포의 아폽토시스를 조절(modulate)하는 분자를 포함하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.A biologically synthetic oncolytic molecule comprising an apoptotic component, a first biological modular component and a second biological modular component, and comprising a molecule that modulates apoptosis of the cell. 청구항 7에 있어서,The method according to claim 7, 첫 번째 및 두 번째 생물학적 모듈러 성분은 단일 펩티드, 링커 영역 및 골지 프로세싱 영역으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.And the first and second biological modular components are selected from the group consisting of a single peptide, a linker region and a Golgi processing region. 청구항 8에 있어서,The method according to claim 8, 세 번째 생물학적 모듈러 성분을 추가로 포함하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.A biologically synthetic oncolytic molecule further comprising a third biological modular component. 청구항 9에 있어서,The method according to claim 9, 세 번째 생물학적 모듈러 성분은 헤파린 결합 영역 또는 콜라겐 결합 영역인 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.And a third biological modular component is a heparin binding region or a collagen binding region. 아폽토틱 성분, 단일 펩티드, 링커 영역 및 골지 프로세싱 영역을 포함하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.A biologically synthetic oncolytic molecule comprising an apoptotic component, a single peptide, a linker region and a Golgi processing region. 청구항 11에 있어서,The method according to claim 11, 헤파린 결합 영역을 추가로 포함하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.A biologically synthetic oncolytic molecule further comprising a heparin binding region. 청구항 12에 있어서,The method according to claim 12, 콜라겐 결합 영역을 추가로 포함하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.A biologically synthetic oncolytic molecule further comprising a collagen binding region. 청구항 11에 있어서,The method according to claim 11, SEQ ID NO:4의 아미노 산 서열에 대하여 충분히 상사적인(homologous) 아미노 산 서열을 포함하고, 상기에서 분자는 온콜리틱 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.A biologically synthetic oncolytic molecule comprising an amino acid sequence sufficiently homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, wherein the molecule maintains oncolytic activity. 청구항 12에 있어서,The method according to claim 12, SEQ ID NO:5의 아미노 산 서열에 충분히 상사적인 아미노 산 서열을 포함하고, 상기에서 분자는 온코리틱 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.A biologically synthesized oncolytic molecule comprising an amino acid sequence sufficiently similar to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, wherein the molecule maintains oncortical activity. 청구항 13에 있어서,The method according to claim 13, SEQ ID NO:6의 아미노 산 서열에 충분히 상사적인 아미노 산 서열을 포함하고, 상기에서 분자는 온콜리틱 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.A biologically synthetic oncolytic molecule comprising an amino acid sequence sufficiently similar to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, wherein the molecule maintains oncolytic activity. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 분자는 염색질의 구조(chromatin), 세포 생존성(cell viability) 및 세포 리시스(lysis)의 조절을 구성하는 그룹으로부터 선택된 아폽토틱 반응을 조절하는 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.The molecule is a biologically synthetic oncolytic molecule characterized in that it modulates an apoptotic response selected from the group consisting of the regulation of chromatin, cell viability and cell lysis. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 분자는 아폽토틱 반응을 향상시키는 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.The molecule is a biologically synthetic oncolytic molecule, characterized in that it enhances an apoptotic response. 청구항 18에 있어서,The method according to claim 18, 아폽토틱 반응은 세포 리시스인 것을 특징으로 하는 생물학적 합성 온콜리틱 분자.A biosynthetic oncolytic molecule, characterized in that the apoptotic response is cellular lysis. 생물학적 온콜리틱 분자를 인코드(encode)하는 핵 산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자(an isolated nucleic acid molecule).An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence that encodes a biological oncolytic molecule. 청구항 20의 핵 산 분자를 포함하는 발현 백터(an expression vector).An expression vector comprising the nucleic acid molecule of claim 20. 청구항 20의 벡터를 포함하는 숙주 세포(a host cell).A host cell comprising the vector of claim 20. 온콜리틱 분자가 생성되도록 하기 위한 조건 아래에서 청구항 22의 숙주 세포를 배양하는 것(culturing)을 포함하는 온콜리틱 분자를 생산하는 방법.A method of producing an oncolytic molecule comprising culturing the host cell of claim 22 under conditions for causing the oncolytic molecule to be produced. 청구항 23에 있어서,The method according to claim 23, 매개체(medium) 또는 숙주 세포로부터 온콜리틱 분자를 분리시키는 것을 포함하는 온콜리틱 분자를 생산하는 방법.A method of producing oncolytic molecules comprising isolating oncolytic molecules from a medium or host cell. 청구항 1의 온콜리틱 분자 및 약학적으로 수용 가능한 캐리어(a pharmaceutically acceptable carrier)를 포함하는 약학적 조성물(composition).A pharmaceutical composition comprising the oncolytic molecule of claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 아폽토틱 반응이 조절되도록 하기 위하여 세포를 청구항 1의 온콜리틱 분자와 접촉(contacting)하는 것을 포함하는 세포에 있어서 아폽토틱 반응을 조절하는 방법(a method of modulating an apoptotic response).A method of modulating an apoptotic response in a cell comprising contacting the cell with the oncolytic molecule of claim 1 so that the apoptotic response is regulated. 청구항 27에 있어서,The method of claim 27, 세포는 환자의 내부에 존재하고 온콜리틱 분자가 그 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는 아폽토틱 반응을 조절하는 방법.A cell is present inside a patient and oncolytic molecules are administered to the patient. SEQ ID NO:4의 아미노 산 서열을 포함하는 치료성 폴리펩티드(a therapeutic polypeptide).A therapeutic polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO:5의 아미노 산 서열을 포함하는 치료성 폴리 펩티드.A therapeutic polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO:6의 아미노 산 서열을 포함하는 치료성 폴리 펩티드.A therapeutic polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO:8의 아미노 산 서열을 포함하는 치료성 폴리 펩티드.A therapeutic polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. 청구항 28의 치료성 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding the therapeutic polypeptide of claim 28. 청구항 39의 치료성 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding the therapeutic polypeptide of claim 39. 청구항 30의 치료성 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding the therapeutic polypeptide of claim 30. 청구항 31의 치료성 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding the therapeutic polypeptide of claim 31. SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 1-195를 포함하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides 1-195 of SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 1-213을 포함하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides 1-213 of SEQ ID NO: 7. 청구항 32-38중의 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.An expression vector comprising the nucleic acid molecule of any one of claims 32-38. 청구항 39의 벡터를 포함하는 숙주 세포.A host cell comprising the vector of claim 39.