JP2008505846A - Peptides that are selectively lethal to malignant and transformed mammalian cells - Google Patents

Abstract

【課題】膜貫通リーダー配列と融合する場合、悪性細胞および形質転換細胞に対し選択的致死性を有する、ヒトｐ５３のアミノ酸残基１２−２６の全部または一部に対応するペプチドを含む組成物を提供する。該ペプチドは、動物、好ましくはヒトにおいて新生物疾患を処置するのに有用である。そのカルボキシ末端において膜貫通リーダー配列と融合した対象ペプチドを投与することにより、患者の新生物疾患を処置する方法をまた提供し、インビトロでの悪性細胞、形質転換細胞もしくは新生物細胞を殺すことにおける対象ペプチドの有効性レベルを評価する方法も提供する
【解決手段】対象ペプチドのタンパク質分解を減らすために、１つ以上のＤ−アミノ酸は、対象ペプチドのｐ５３部分および／または膜貫通リーダー配列において、対応するＬ−アミノ酸と置換することができ、さらに、対象ペプチドがタンパク質分解を受けにくくするために、擬似ペプチド結合またはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合は、ｐ５３配列または膜貫通リーダー配列のいずれかまたは両方において、ペプチド結合と置換することができ、さらに、対象ペプチドの膜貫通リーダー配列およびｐ５３部分は、レトロ−インベルソ異性体および部分修飾レトロ−インベルソ異性体を含むことができる。このような異性体は、タンパク質分解の影響をあまり受けず、従って半減期を長くする。
【選択図】なしA composition comprising a peptide corresponding to all or part of amino acid residues 12-26 of human p53, which has selective lethality to malignant cells and transformed cells when fused with a transmembrane leader sequence. provide. The peptides are useful for treating neoplastic diseases in animals, preferably humans. Also provided is a method of treating a neoplastic disease in a patient by administering a peptide of interest fused at its carboxy terminus with a transmembrane leader sequence, in killing malignant, transformed or neoplastic cells in vitro. A method for assessing the efficacy level of a peptide of interest is also provided. To reduce proteolysis of a peptide of interest, one or more D-amino acids are present in the p53 portion and / or transmembrane leader sequence of the peptide of interest. In order to be able to substitute the corresponding L-amino acid and further make the subject peptide less proteolytic, the pseudo-peptide bond or retro-inverso pseudo-peptide bond is either a p53 sequence or a transmembrane leader sequence or both. Can be substituted with peptide bonds, and , Transmembrane leader sequence and p53 portion of the subject peptides, retro - inverso isomers and partially modified retro - may include inverso isomer. Such isomers are less susceptible to proteolysis and thus have a longer half-life.
[Selection figure] None

Description

本発明は、新生物疾患の処置のための治療モダリティに関する。より具体的には、本発明は、悪性細胞および形質転換細胞を選択的に破壊する合成ペプチド、およびそれに基づく新生物疾患の処置のための方法に関する。   The present invention relates to therapeutic modalities for the treatment of neoplastic diseases. More specifically, the present invention relates to synthetic peptides that selectively destroy malignant and transformed cells and methods for the treatment of neoplastic diseases based thereon.

ｐ５３タンパク質は、細胞サイクルの肝要なレギュレーターである。一部、有糸***を誘発するタンパク質の転写をブロックすることによって、および有糸***をブロックし、アポトーシスを促進するタンパク質の転写を誘発することによって、ｐ５３タンパク質は、有糸***を誘発する多くの腫瘍誘発遺伝子タンパク質の発ガン性効果をブロックする。ｐ５３タンパク質の欠如は、細胞形質転換および悪性疾患と関係する。［非特許文献１］。
Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ ＆ Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０ The p53 protein is an important regulator of the cell cycle. In part, p53 protein induces mitosis by blocking transcription of proteins that induce mitosis and by inducing transcription of proteins that block mitosis and promote apoptosis. Blocks the carcinogenic effects of tumor-inducing gene proteins. The lack of p53 protein is associated with cell transformation and malignancy. [Non-Patent Document 1].
Haffner, R & Oren, M .; (1995) Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 84-90

ｐ５３タンパク質分子は、３９３個のアミノ酸でできている。それは、残基９３−３１３からなるＤＮＡ−結合ドメインにおけるＤＮＡの特異的配列に結合するドメインを含んでいる。この領域の結晶構造は、Ｘ線結晶構造解析によって決定された。残基３１２−３９３は、ｐ５３タンパク質のホモテトラマーの形成に関与する。残基１−９３は、活性の調節およびｐ５３タンパク質の半減期に関与する。   The p53 protein molecule is made up of 393 amino acids. It contains a domain that binds to a specific sequence of DNA in a DNA-binding domain consisting of residues 93-313. The crystal structure of this region was determined by X-ray crystal structure analysis. Residues 312-393 are involved in the formation of homotetramers of the p53 protein. Residues 1-93 are involved in the regulation of activity and the half-life of the p53 protein.

ｐ５３タンパク質は、別の重要な調節タンパク質ＭＤＭ−２タンパク質に結合する。ＭＤＭ−２タンパク質をコード化するＭＤＭ−遺伝子は、公知の腫瘍誘発遺伝子である。ＭＤＭ−２タンパク質は、ｐ５３タンパク質と複合体を形成し、そしてそれはユビキネーション（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｉｏｎ）経路によるｐ５３タンパク質の分解をもたらす。ｐ５３タンパク質は、ｐ５３タンパク質の残基１４−２２を含むアミノ酸配列を使ってＭＤＭ−２タンパク質に結合し、そしてそれは不変である。ｐ５３タンパク質の全部のＭＤＭ−２タンパク質結合ドメインは、残基１２−２６に及ぶ。［非特許文献２］。
Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ ＆ Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０ The p53 protein binds to another important regulatory protein, MDM-2 protein. The MDM-gene that encodes the MDM-2 protein is a known tumor-inducing gene. The MDM-2 protein forms a complex with the p53 protein, which results in degradation of the p53 protein by the ubiquination pathway. The p53 protein binds to the MDM-2 protein using an amino acid sequence that includes residues 14-22 of the p53 protein, and it is unchanged. The entire MDM-2 protein binding domain of the p53 protein spans residues 12-26. [Non-Patent Document 2].
Haffner, R & Oren, M .; (1995) Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 84-90

ＭＤＭ−２タンパク質が、公知の腫瘍誘発遺伝子の発現生成物であることを考慮すれば、ＭＤＭ−２タンパク質が非常に重要な調節タンパク質であることは驚くべきことではない。さらに、ＭＤＭ−２タンパク質の過剰発現または増幅は、ヒトの胸腫瘍の５０％を含めて、ヒトの悪性腫瘍の４０〜６０％に見いだされた。ｐ５３タンパク質とＭＤＭ−２タンパク質との間の複合体の形成は、ｐ５３タンパク質の活性ドメイン、またはそれの中のＤＮＡ結合部位の活性ドメインをブロックすることによって、ｐ５３タンパク質の転写活性の抑制およびそれによるその分子の抗腫瘍性効果の抑制をもたらし得ることが示唆されている。より一般的には、これらおよび他の実験的観察は、ｐ５３タンパク質の抗腫瘍性効果が、ｐ５３タンパク質にＭＤＭ−２タンパク質が結合することを妨害することができるペプチドによって促進することができることを示唆していると解釈されている。実際、多くの研究者が、ＭＤＭ−２／ｐ５３複合体が合理的な薬剤デザインのための標的であり得ることを示唆している。例えば、［非特許文献３］、および［特許文献１］（Ｐｉｃｋｓｌｅｙら）を参照のこと。
Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｗａｓｙｌｙｋ ｅｔ ａｌ．，“ｐ５３ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅａｔｈ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＭＤＭ２ ｂｙ ａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＭＤＭ２ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐ５３”，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，１９２１−３４（１９９９） 米国特許第５，７７０，３７７号 Given that MDM-2 protein is an expression product of a known tumor-inducing gene, it is not surprising that MDM-2 protein is a very important regulatory protein. Furthermore, overexpression or amplification of MDM-2 protein was found in 40-60% of human malignancies, including 50% of human breast tumors. The formation of a complex between the p53 protein and the MDM-2 protein represses and thereby inhibits the transcriptional activity of the p53 protein by blocking the active domain of the p53 protein, or the active domain of the DNA binding site therein. It has been suggested that it may result in suppression of the antitumor effect of the molecule. More generally, these and other experimental observations suggest that the antitumor effect of p53 protein can be facilitated by peptides that can prevent the MDM-2 protein from binding to p53 protein. It is interpreted as being. Indeed, many researchers have suggested that the MDM-2 / p53 complex may be a target for rational drug design. For example, see [Non-Patent Document 3] and [Patent Document 1] (Picksley et al.).
Christine Wasylyk et al. , “P53 Mediated Death of Cells Overexpressing MDM2 by an Inhibitor of MDM2 Interaction with p53”, Oncogene, 18, 1921-34 (1999) US Pat. No. 5,770,377

進化は、天然に存在するタンパク質においてＬアミノ酸がほとんど排他的に存在していることを確証している。従って、事実上、全てのプロテアーゼは、隣接したＬアミノ酸の間のペプチド結合を切断する。そのため、Ｄ−アミノ酸で構成された人工のタンパク質またはペプチドは、タンパク分解性破壊に対して概して抵抗性を有する。例えば、［特許文献２］参照。血清プロテアーゼは、特異性基質要件を有する。プロテアーゼが切断するためには、基質は、Ｌアミノ酸およびペプチド結合の両方を有しなくてはならない（［非特許文献４］）。
米国特許出願第１０／３９９，１２７号 Ｐｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｈｅｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．１０：１２６８−１２７３ Evolution confirms that L amino acids are almost exclusively present in naturally occurring proteins. Thus, virtually all proteases cleave peptide bonds between adjacent L amino acids. Therefore, artificial proteins or peptides composed of D-amino acids are generally resistant to proteolytic destruction. For example, see [Patent Document 2]. Serum proteases have specific substrate requirements. In order for the protease to cleave, the substrate must have both L amino acids and peptide bonds ([Non-Patent Document 4]).
US patent application Ser. No. 10 / 399,127 Power et al. , 1993 Pharmaceutical Res. 10: 1268-1273

線形修飾レトロペプチド構造は、上記文献に見られ、そして用語「レトロ異性体」は、配列の方向が親ペプチドと比較して逆である異性体を包含すると規定されている。例えば、［非特許文献５］および［特許文献３］（Ｂｏｎｎｙ）を参照のこと。配列の方向が反対であり、そして各アミノ酸残基のキラリティーが逆であるレトロ−インベルソ異性体もまた、上記文献で見られる。
Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｅｔｒｏ−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，Ａｃｃ．ｏｆ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１２（１），１−７（１９７９） 米国特許出願第１０／３９９，１２７号 Linearly modified retropeptide structures are found in the above literature and the term “retro isomer” is defined to include isomers whose sequence orientation is reversed compared to the parent peptide. For example, see [Non-Patent Document 5] and [Patent Document 3] (Bonny). Retro-inverso isomers in which the orientation of the sequence is reversed and the chirality of each amino acid residue is reversed are also found in the literature.
Goodman, M.M. et al. "On the Concept of Linear Modified Retro-Peptide Structures", Acc. of Chem. Res. , 12 (1), 1-7 (1979) US patent application Ser. No. 10 / 399,127

報告されるところによれば、Ｊａｍｅｓｏｎらは、最近、これらの２つの特性（逆合成およびキラリティー変更）を組み合わせることによって、ＣＤ４レセプターのヘアピンループのアナログを設計した。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献６］および［非特許文献７］。Ｄ−鏡像体および逆合成を組み合わせることの最終結果は、それぞれのアミド結合におけるカルボニル基およびアミノ基の位置が交換されるということであり、一方、それぞれのα炭素における側鎖基の位置は維持される。Ｊａｍｅｓｏｎらは、報告するところによれば、それらの逆Ｄペプチドに対する生体活性の増加を実証し、そのことは、タンパク質分解に対するその感受性に起因して、その従来の全−Ｌ鏡像体のインビボ活性を限定することと対照をなす。
Ｊａｍｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＣＤ４ ａｎａｌｏｇｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４） Ｂｒａｄｙ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４） Reportedly, Jameson et al. Recently designed a hairpin loop analog of the CD4 receptor by combining these two properties (reverse synthesis and chirality modification). For example, see: [Non-Patent Document 6] and [Non-Patent Document 7]. The end result of combining the D-enantiomer and reverse synthesis is that the position of the carbonyl and amino groups in each amide bond is exchanged, while the position of the side chain group at each α carbon is maintained. Is done. Jameson et al. Reportedly demonstrated an increase in bioactivity against their reverse D peptides, due to its sensitivity to proteolysis, in vivo activity of its conventional all-L enantiomer. Contrast with limiting.
Jameson et al. , “A rationally designed CD4 analoginhibitives experimental allergic encephalomyelitis”, Nature, 368, 744-746 (1994). Brady, L.M. et al. , “Reflections on a Peptide”, Nature, 368, 692-693 (1994).

本発明は、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続アミノ酸を含んでいるペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体を提供する。ここで、当該ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する。   The present invention provides a peptide comprising at least about 6 contiguous amino acids of the amino acid sequence: PPLSQETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1), or an analog or derivative thereof. Here, the peptide or analog or derivative thereof is fused to a transmembrane leader sequence and is selectively lethal to malignant or transformed cells.

このようなペプチドの例としては、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）またはそのアナログもしくはその誘導体、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはそのアナログもしくはその誘導体、およびＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログもしくはその誘導体が挙げられる。細胞膜を通って輸送され、そして悪性細胞または形質転換細胞を選択的に殺すために、リーダー配列は、好ましくは、ペプチド、そのアナログもしくはその誘導体のカルボキシル末端に置かれる。好ましくは、リーダー配列は、主に正帯電アミノ酸残基を含む。本発明に従って使われ得るリーダー配列の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ペネトラチン（ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ）（配列番号４）；（Ａｒｇ）_８（配列番号２６）または（Ｒ）_４−（Ｒ）_１６（配列番号２７）からの任意のｐｏｌｙ−Ｒ；ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４７−６０）（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号５）；Ｄ−ＴＡＴ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号６）；Ｒ−ＴＡＴ Ｇ（Ｒ）_９ＰＰＱ（配列番号７）；ＳＶ４０−ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号８）；ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＩＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号９）；ＨＩＶ ＲＥＶ（３４−５０）−（ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ）（配列番号１０）；ＦＨＶ（３５−４９）コート−（ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ）（配列番号１１）；ＢＭＶ ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ）（配列番号１２）；ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲＥＸ４−１６−（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ）（配列番号１３）；ＣＣＭＶ ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ）（配列番号１４）；Ｐ２２ Ｎ（１４−３０）（ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ）（配列番号１５）；ＬＡＭＢＤＡ Ｎ（１−２２）（ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ）（配列番号１６）；Ｐｈｉ Ｎ（１２−２９）（ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ）（配列番号１７）；酵母ＰＲＰ６（１２９−１２４）（ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ）（配列番号１８）；ヒトＵ２ＡＦ（ＳＱＭＴＲＱＡＲＲＬＹＶ）（配列番号１９）；ヒトＣ−ＦＯＳ（１３９−１６４）ＫＲＲＩＲＲＥＲＮＫＭＡＡＡＫＳＲＮＲＲＲＥＬＴＤＴ（配列番号２０）；ヒトＣ−ＪＵＮ（２５２−２７９）（ＲＩＫＡＥＲＫＲＭＲＮＲＩＡＡＳＫＳＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ）（配列番号２１）；酵母ＧＣＮ４（ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ）（配列番号２２）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２３）；ｐ−ｖｅｃＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＫＡＨＳＫ（配列番号２４）。好ましくは、アンテナペディアタンパク質の貫通リーダー配列の正帯電リーダー配列が使われる。 Examples of such peptides include PPLSQETFFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1) or analogs or derivatives thereof, PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2) or analogs or derivatives thereof, and ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3) or analogs or derivatives thereof. It is done. In order to be transported across the cell membrane and to selectively kill malignant or transformed cells, the leader sequence is preferably placed at the carboxyl terminus of the peptide, analog or derivative thereof. Preferably, the leader sequence mainly comprises positively charged amino acid residues. Examples of leader sequences that can be used in accordance with the present invention include, but are not limited to: penetratin (KKWKMRRNQFWVKVQRG) (SEQ ID NO: 4); (Arg) ₈ (SEQ ID NO: 26) or (R) ₄ Any poly-R from (R) ₁₆ (SEQ ID NO: 27); HIV-1 TAT (47-60) (YGRKKRRQRRRPQ) (SEQ ID NO: 5); D-TAT (GRKKRRQRRRPPPQ) (SEQ ID NO: 6); R— TAT G (R) ₉ PPQ (SEQ ID NO: 7); SV40-NLS (PKKRKV) (SEQ ID NO: 8); Nucleoplasmin-NLS (KRPAAIKKAGQAKKK) (SEQ ID NO: 9); HIV REV (34-50)-(TRQARNRNRRRWRRQR SEQ ID NO: 10); FHV (3 -49) Coat- (RRRRNRTRRRNRRRVR) (SEQ ID NO: 11); BMV GAG (7-25)-(KMMTRARQRAAARRNRWTAR) (SEQ ID NO: 12); HTLV-II REX4-16- (TRRQRTRRRRRNR) (SEQ ID NO: 13); CCMV GAG ( 7-25)-(KLTRAQRRAAARKNKRNTR) (SEQ ID NO: 14); P22 N (14-30) (NAKTRHERRKRLAIER) (SEQ ID NO: 15); LAMBDA N (1-22) (MDAQTRRRERREKEKQWKAAN) (SEQ ID NO: 16); Phi N -29) (TAKTRYKARRAELIAERR) (SEQ ID NO: 17); yeast PRP6 (129-124) (TRRNRKRNRIQEQLNRK) (SEQ ID NO: 18); human U2 AF (SQMTRQARRRLYV) (SEQ ID NO: 19); human C-FOS (139-164) KRRIRRRENKMAAAKSNRNRRELDTDT (SEQ ID NO: 20); human C-JUN (252-279) (RIKAERKRMRNRIAASKSRKRKLERIAR (RQNRQR)) SEQ ID NO: 22); KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 23); p-vecLLIILRRRIRKQAKAHSK (SEQ ID NO: 24). Preferably, a positively charged leader sequence of the antennapedia protein penetrating leader sequence is used.

上述の対象ペプチドのいずれかが、それに対してなされる特異性変化を有し得、そしてその変化は、ペプチドをタンパク質分解に影響されないようにすることを、本発明はさらに意図している。例えば、対象ペプチドは、イソスター擬似ペプチド結合またはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換された１つ以上のペプチド結合を有し得る。本発明の別の実施形態においては、対象ペプチドは、天然ｐ５３タンパク質の対応する部分の方向ペプチド異性体であり得る。本発明のこの実施形態においては、エナンチオペプチド、レトロ−インベルソペプチド、そして部分修飾レトロ−インベルソペプチドが特に意図されている。   The present invention further contemplates that any of the above-described subject peptides can have a specificity change made thereto, and that change renders the peptide unaffected by proteolysis. For example, a subject peptide can have one or more peptide bonds replaced with an isostere pseudopeptide bond or a retro-inverso pseudopeptide bond. In another embodiment of the invention, the peptide of interest can be the directional peptide isomer of the corresponding portion of the native p53 protein. In this embodiment of the invention, enantiopeptides, retro-inverso peptides, and partially modified retro-inverso peptides are specifically contemplated.

よって本発明は、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する上述の対象ペプチド、そのアナログもしくはその誘導体を提供する。そのペプチドは、１つ以上のＤ−アミノ酸を含み、またはイソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換された少なくとも１つのペプチド結合を有している。   Thus, the present invention provides the above-mentioned peptide of interest, analogs or derivatives thereof fused to a transmembrane leader sequence and selectively lethal to malignant cells or transformed cells. The peptide contains one or more D-amino acids or has at least one peptide bond substituted with an isostere pseudopeptide bond or a retro-inverso pseudopeptide bond.

例えば、Ｄ−アミノ酸は、対象ペプチドのＮ末端に位置することができる。Ｎ末端Ｄ−アミノ酸が存在することで、ペプチドの安定性は増す。これは、Ｎ末端残基に作用するエキソペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸を基質として利用することができないからである。別の実施形態においては、Ｄ−アミノ酸は、対象ペプチドのＣ末端に位置することができる。Ｃ末端Ｄ−アミノ酸が存在することでもまた、ペプチドを安定化させる。これは、Ｃ末端残基に作用するエキソペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸を基質として利用することができないからである。   For example, the D-amino acid can be located at the N-terminus of the subject peptide. The presence of the N-terminal D-amino acid increases the stability of the peptide. This is because exopeptidases acting on the N-terminal residue cannot use D-amino acids as substrates. In another embodiment, the D-amino acid can be located at the C-terminus of the subject peptide. The presence of the C-terminal D-amino acid also stabilizes the peptide. This is because exopeptidases acting on the C-terminal residue cannot use D-amino acids as substrates.

特に、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の内の少なくとも６つの連続アミノ酸を含んでいるペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体が提供される。ここで、当該ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、膜貫通リーダー配列と融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する。そして少なくとも１つのアミノ酸がＤ型であるか、または１つ以上のペプチド結合が、イソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換される。その例としては、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）、ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を含むペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体が挙げられる。   In particular, a peptide comprising at least 6 contiguous amino acids of the amino acid sequence: PPLSQETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1) or an analog or derivative thereof is provided. Here, the peptide or analog or derivative thereof is fused to a transmembrane leader sequence and is selectively lethal to malignant or transformed cells. And at least one amino acid is in the D form, or one or more peptide bonds are replaced with an isostere pseudopeptide bond or a retro-inverso pseudopeptide bond. Examples thereof include a peptide comprising the amino acid sequence: PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2), ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3), an analog thereof, or a derivative thereof.

別の実施形態においては、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する対象ペプチド、そのアナログまたはその誘導体は、ｐ５３タンパク質に見られる天然の配列と逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。このようなペプチドは、本明細書中においてレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチドと呼ばれる。   In another embodiment, the subject peptide, analog or derivative thereof fused to a transmembrane leader sequence and selectively lethal to malignant or transformed cells is a native sequence found in the p53 protein. Contains all D-amino acids assembled in reverse order. Such peptides are referred to herein as retro-inverso (RI) peptides.

例えば、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の逆順序で組み立てられる少なくとも６つの連続Ｄ−アミノ酸を含んでいるレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体であって、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有するものが提供される。好ましい実施形態において、ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）の逆順序で組み立てられた少なくとも６つの連続Ｄ−アミノ酸を含んでいる。   For example, a retro-inverso (RI) peptide comprising at least 6 consecutive D-amino acids assembled in reverse order of the amino acid sequence: PPLSQETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1), or an analog or derivative thereof, a transmembrane leader sequence And those that are selectively lethal to malignant or transformed cells are provided. In a preferred embodiment, the peptide or analog or derivative thereof comprises at least 6 consecutive D-amino acids assembled in the reverse order of the amino acid sequence PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2) or ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3).

ｐ５３配列の一部のみが逆（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｔｅｄ）にされた部分修飾レトロ−インベルソ（ＰＭＲＩ）ペプチドもまた、提供される。例えば、Ｄ型のアミノ酸の一部のみを有して、そして配列番号１に示されたアミノ酸配列の逆順序で組み立てられた少なくとも６つのアミノ酸を含んでいるペプチドが提供される。好ましい実施形態においては、少なくとも６つのＤ−アミノ酸の一部は、配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログもしくはその誘導体の逆順序で組み立てられる。   Also provided is a partially modified retro-inverso (PMRI) peptide in which only a portion of the p53 sequence is retro-inverted. For example, peptides are provided that have only a portion of D-form amino acids and that contain at least six amino acids assembled in the reverse order of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. In a preferred embodiment, some of the at least six D-amino acids are assembled in the reverse order of the sequence PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2) or ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3) or an analog or derivative thereof.

１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはインベルソ擬似ペプチド結合を含んでいる前述のペプチドの内のいずれかにおいて、または前述のレトロ−インベルソペプチドもしくは部分修飾レトロ−インベルソペプチドのいずれかにおいて、膜貫通リーダー配列もまた、１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはインベルソ擬似ペプチド結合を含むことができる。   In any of the foregoing peptides comprising one or more D-amino acids or one or more isostere pseudopeptide bonds or inverso pseudopeptide bonds, or the aforementioned retro-inverso peptide or partially modified retro-inverso In any of the peptides, the transmembrane leader sequence can also include one or more D-amino acids or one or more isostere pseudopeptide bonds or inverso pseudopeptide bonds.

別の本発明の実施形態においては、膜貫通リーダー配列は、それ自身、レトロ−インベルソペプチド異性体、または部分修飾レトロ−インベルソペプチド異性体である。レトロ−インベルソ型の膜貫通リーダー配列は、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示される配列のいずれかと逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。部分修飾レトロ−インベルソ型の膜貫通リーダー配列は、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示される配列のいずれかと逆順序のＤ型アミノ酸残基の一部を有している。   In another embodiment of the invention, the transmembrane leader sequence is itself a retro-inverso peptide isomer or a partially modified retro-inverso peptide isomer. The retro-inverso-type transmembrane leader sequence includes all D-amino acids assembled in reverse order with either of the sequences shown in SEQ ID NOs: 4-24 or SEQ ID NOs: 26-27. The partially modified retro-inverso type transmembrane leader sequence has a portion of the D-type amino acid residue in the reverse order to either of the sequences shown in SEQ ID NOs: 4-24 or SEQ ID NOs: 26-27.

薬学上受容できる担体と混合される対象ペプチドの内の少なくとも１つを含んでいる薬剤組成物もまた提供される。このような薬剤組成物はまた、１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合を含有している対象ペプチドのいずれかを含むことができ、対象のレトロ−インベルソペプチドまたは部分修飾レトロ−インベルソペプチドのいずれかもまた含むことができる。さらに、被検体の新生物疾患を処置するための方法、すなわち、選択的に被検体の悪性腫瘍または新生物性細胞を殺す方法が提供される。１つの実施形態において、その方法は、アミノ酸の配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも１つの約６つの連続アミノ酸を含んでいる治療有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を被検体に投与することを含む。ここで、当該ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、そのカルボキシ末端において膜貫通リーダー配列と融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する。別の実施形態においては、その方法は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に示される配列を有する治療有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を被検体に投与することを含む。ここで、膜貫通リーダー配列は、ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体のカルボキシ末端に融合する。   Also provided is a pharmaceutical composition comprising at least one of the subject peptides mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. Such a pharmaceutical composition can also comprise either one or more D-amino acids or a subject peptide containing one or more isostere pseudopeptide bonds or retro-inverso pseudopeptide bonds, Either a retro-inverso peptide or a partially modified retro-inverso peptide can also be included. Further provided is a method for treating a neoplastic disease in a subject, ie, a method of selectively killing a malignant tumor or neoplastic cell in a subject. In one embodiment, the method administers to a subject a therapeutically effective amount of a peptide comprising at least about six consecutive amino acids of the amino acid sequence: PPLSQETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1), or an analog or derivative thereof. Including that. Here, the peptide or analog or derivative thereof is fused at its carboxy terminus to a transmembrane leader sequence and is selectively lethal to malignant or transformed cells. In another embodiment, the method comprises administering to the subject a therapeutically effective amount of a peptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or an analog or derivative thereof. Here, the transmembrane leader sequence is fused to the carboxy terminus of the peptide or analog or derivative thereof.

その方法のさらなる実施形態では、１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合、またはレトロ−インベルソペプチドもしくは部分修飾レトロ−インベルソペプチド、を有している治療有効量の対象ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を被検体に投与することを含む。ここで、膜貫通リーダー配列は、ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体のカルボキシ末端に融合する。   In a further embodiment of the method has one or more D-amino acids or one or more isostere pseudopeptide bonds or retro-inverso pseudopeptide bonds, or retro-inverso peptides or partially modified retro-inverso peptides Administering to a subject a therapeutically effective amount of a subject peptide or analog or derivative thereof. Here, the transmembrane leader sequence is fused to the carboxy terminus of the peptide or analog or derivative thereof.

インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞を殺すことにおける対象ペプチドの有効性を評価する方法もまた提供される。その方法は、少なくとも１つの対象ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、ならびに生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいて、ペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない（通常）細胞の増殖へのその影響を評価する工程を含む。   Also provided are methods for assessing the effectiveness of a subject peptide in killing malignant, neoplastic or transformed cells in vitro. The method comprises contacting at least one peptide of interest or analog or derivative thereof with a malignant cell, neoplastic cell or transformed cell in vitro, as well as the proportion or percentage of dead cells compared to living cells. On the basis of the efficacy level of the peptide and its effect on the growth of untransformed (usually) cells in culture.

本発明によれば、悪性細胞および形質転換細胞は、ｐ５３タンパク質内のアミノ酸配列および単一の連続したポリペプチド鎖としてのリーダー配列を含んでいる合成ペプチドを投与することによって、選択的に破壊されることが見いだされた。この作用のメカニズムは、ＭＤＭ−２タンパク質に結合しているｐ５３タンパク質からは独立していると考えられる。なぜなら、ｐ５３ペプチドは、ｐ５３タンパク質を全く生産しない形質転換細胞を選択的に殺すからである。ｐ５３ペプチドはまた、通常細胞を殺すことなしに、標準レベルまたは高いレベルのｐ５３タンパク質を発現する悪性細胞および形質転換細胞を選択的に殺す。   According to the present invention, malignant cells and transformed cells are selectively destroyed by administering a synthetic peptide containing the amino acid sequence within the p53 protein and the leader sequence as a single continuous polypeptide chain. Was found. The mechanism of this action is thought to be independent of the p53 protein bound to the MDM-2 protein. This is because the p53 peptide selectively kills transformed cells that do not produce any p53 protein. The p53 peptide also selectively kills malignant and transformed cells that express normal or high levels of p53 protein without killing normal cells.

本発明によれば、ヒトｐ５３のアミノ酸残基１２−２６の全部または一部に対応しているペプチドを含んでいる組成物が提供される。この領域は、ｍｄｍ−２タンパク質と接触することが知られており、そしてｍｄｍ−２に結合されている場合、α−ヘリックス構造を取る。カルボキシ末端において膜貫通リーダー配列と融合する場合、対象ペプチドは、悪性ヒト細胞および形質転換ヒト細胞を選択的に殺す。   According to the present invention, a composition comprising a peptide corresponding to all or part of amino acid residues 12-26 of human p53 is provided. This region is known to contact the mdm-2 protein and takes an α-helical structure when bound to mdm-2. When fused to a transmembrane leader sequence at the carboxy terminus, the peptide of interest selectively kills malignant and transformed human cells.

本発明の第１の態様においては、次のアミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続アミノ酸を含んでいるペプチドが提供される。ここで、少なくとも約６つの連続アミノ酸を含んでいるペプチドは、リーダー配列に融合させられる。好ましくは、ペプチドは、少なくとも約８個から少なくとも約１５個のアミノ酸残基を含んでいる。好ましい実施形態においては、配列番号１での配列の少なくとも約８個から少なくとも約１５個のアミノ酸を含んでいるペプチドは、次のアミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）を有する。別の好ましい実施形態においては、配列番号１に示された配列の少なくとも約８個から少なくとも約１５個のアミノ酸を含んでいるペプチドは、次のアミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）を有する。さらに別の好ましい実施形態においては、配列番号１で示された配列の少なくとも約８個から少なくとも約１５個のアミノ酸を含んでいるペプチドは、次のアミノ酸配列：ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を有する。   In a first aspect of the invention, there is provided a peptide comprising at least about 6 consecutive amino acids of the following amino acid sequence: PPLSQETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1). Here, a peptide comprising at least about 6 consecutive amino acids is fused to a leader sequence. Preferably, the peptide contains at least about 8 to at least about 15 amino acid residues. In a preferred embodiment, the peptide comprising at least about 8 to at least about 15 amino acids of the sequence in SEQ ID NO: 1 has the following amino acid sequence: PPLSQETFFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1). In another preferred embodiment, a peptide comprising at least about 8 to at least about 15 amino acids of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 has the following amino acid sequence: PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2). In yet another preferred embodiment, a peptide comprising at least about 8 to at least about 15 amino acids of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 has the following amino acid sequence: ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3).

本発明のペプチドを細胞の中に組み込むように機能するリーダー配列は、様々なソースから得ることができる。好ましくは、リーダー配列は、主に正帯電のアミノ酸残基を含んでいる。これは、正帯電リーダー配列は、対象ペプチドのα−ヘリックスを安定させるからである。本発明のペプチドと結合できるリーダー配列の例は、［非特許文献８］に記載されており、その例としては、以下に限定されないが、次の膜貫通リーダー配列（多くの場合、タンパク質のリーダー配列を構成しているアミノ酸残基の番号が、タンパク質の名前の直ぐ後に挿入して示される。）が挙げられる：
ペネトラチン（ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ）（配列番号４）；（Ａｒｇ）_８（配列番号２６）もしくは（Ｒ）_４−（Ｒ）_１６からの任意のポリ−Ｒ（配列番号２７）；ＨＩＶ−Ｉ ＴＡＴ（４７−６０）（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号５）；Ｄ−ＴＡＴ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号６）；Ｒ−ＴＡＴ Ｇ（Ｒ）_９ＰＰＱ（配列番号７）；ＳＶ４０−ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号８）；ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＩＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号９）；ＨＩＶ ＲＥＶ（３４−５０）−（ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ）（配列番号１０）；ＦＨＶ（３５−４９）コート−（ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ）（配列番号１１）；ＢＭＶ ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ）（配列番号１２）；ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲＥＸ ４−１６−（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ）（配列番号１３）；ＣＣＭＶ ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ）（配列番号１４）；Ｐ２２ Ｎ（１４−３０）（ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ）（配列番号１５）；ＬＡＭＢＤＡ Ｎ（１−２２）（ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ）（配列番号１６）；Ｐｈｉ Ｎ（１２−２９）（ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ）（配列番号１７）；酵母ＰＲＰ６（１２９−１２４）（ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ）（配列番号１８）；ヒトＵ２ＡＦ（ＳＱＭＴＲＱＡＲＲＬＹＶ）（配列番号１９）；ヒトＣ−ＦＯＳ（１３９−１６４）ＫＲＲＩＲＲＥＲＮＫＭＡＡＡＫＳＲＮＲＲＲＥＬＴＤＴ（配列番号２０）；ヒトＣ−ＪＵＮ（２５２−２７９）（ＲＩＫＡＥＲＫＲＭＲＮＲＩＡＡＳＫＳＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ）（配列番号２１）；酵母ＧＣＮ４（ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ）（配列番号２２）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２３）；ｐ−ｖｅｃ ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＫＡＨＳＫ（配列番号２４）。他の膜貫通リーダー配列もまた、使用することができる。このような配列は、広く入手することが可能であり、例えば、以下に記載されている：［非特許文献９］および［非特許文献１０］。
Ｆｕｔａｋｉ，Ｓ．ら（２００１）Ａｒｇｉｎｉｎｅ−Ｒｉｃｈ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，：５８３６−５８４０ Ｓｃｈｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６０４３−６０４９ Ｅｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６９：２３７−２４４ Leader sequences that function to incorporate the peptides of the invention into cells can be obtained from a variety of sources. Preferably, the leader sequence contains predominantly positively charged amino acid residues. This is because the positively charged leader sequence stabilizes the α-helix of the peptide of interest. Examples of leader sequences that can bind to the peptides of the present invention are described in [Non-Patent Document 8] and include, but are not limited to, the following transmembrane leader sequences (often protein leaders): The number of the amino acid residue constituting the sequence is shown immediately after the name of the protein.):
Penetratin (KKWKMRRNQFWVKVQRG) (SEQ ID NO: _4); (Arg) ₈ (SEQ ID NO: 26) or _(R) 4 - any poly -R (SEQ ID NO: 27) from _{(R) 16; HIV-I} TAT (47-60 ) (YGRKKRRQRRRPPPQ) (SEQ ID NO: 5); D-TAT (GRKKRRQRRRPQ) (SEQ ID NO: 6); R-TAT G (R) ₉ PPQ (SEQ ID NO: 7); SV40-NLS (PKKRKVV) (SEQ ID NO: 8); Plasmin-NLS (KRPAAIKKAGQAKKKK) (SEQ ID NO: 9); HIV REV (34-50)-(TRQARNRNRRRWRERRQR) (SEQ ID NO: 10); FHV (35-49) Coat-(RRRRNRTRNRNRRRVR) (SEQ ID NO: 11); BMV GAG -25)-(K TRAQRRAAARNRNRTAR (SEQ ID NO: 12); HTLV-II REX 4-16- (TRRQRTRRARRNR) (SEQ ID NO: 13); CCMV GAG (7-25)-(KLTRAQRRAAARNKNKRNTR) (SEQ ID NO: 14); P22 N (14-30) ( NAKTRRHERRKLLAIER (SEQ ID NO: 15); LAMBDA N (1-22) (MDAQTRRERRERAEKQAQWKAAN) (SEQ ID NO: 16); Phi N (12-29) (TAKTRYKARRAELIAERRR) (SEQ ID NO: 17); (SEQ ID NO: 18); human U2AF (SQMTRQARRLYV) (SEQ ID NO: 19); human C-FOS (139-164) KRRIRRERN KMAAAKSRNRRRRELDTDT (SEQ ID NO: 20); human C-JUN (252-279) (RIKAERKRMRRNIAASKSKRKRKLLERIAR) (SEQ ID NO: 21); yeast GCN4 (KRRANTEAARRSRAKLKLKLKLQL (SEQ ID NO: 22); 24). Other transmembrane leader sequences can also be used. Such sequences are widely available and are described, for example: [Non-patent document 9] and [Non-patent document 10].
Futaki, S .; (2001) Arginine-Rich Peptides, J. et al. Biol. Chem. 276: 5836-5840 Scheller et al. (2000) Eur. J. et al. Biochem. 267: 6043-6049 Elmquist et al. , (2001) Exp. Cell Res. 269: 237-244

好ましくは、アンテナペディアタンパク質の貫通リーダー配列の正帯電リーダー配列が使用される。このリーダー配列は、次のアミノ酸配列：ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）を有する。好ましくは、このリーダー配列は、ｐ５３ペプチドのカルボキシル末端に結合させ、合成ペプチドが、形質転換細胞および悪性細胞を殺すことができるようにする。   Preferably, a positively charged leader sequence of the antennapedia protein penetrating leader sequence is used. This leader sequence has the following amino acid sequence: KKWKMRRNQFWVKVQRG (SEQ ID NO: 4). Preferably, this leader sequence is attached to the carboxyl terminus of the p53 peptide, so that the synthetic peptide can kill transformed and malignant cells.

タンパク分解への感受性を減らすために、上述の対象ペプチド、すなわち配列番号１〜３（ｐ５３ペプチド）または配列番号４〜２５もしくは２６〜２７（膜貫通リーダー配列）のいずれかは、１つ以上のＤ型アミノ酸を含むことができ、および／または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくは１つ以上のレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合を含むことができる。そのため、例えば、対象ペプチドの１つのみのアミノ酸または全てのアミノ酸までもがＤ型であることが可能である。好ましくは、Ｄ−アミノ酸は、対象ペプチドのＮ末端に位置する。このような位置は、ペプチドがＮ末端残基に作用するエキソペプチダーゼにさらに低感度となるようにする。なぜなら、このようなエキソペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸を基質として利用することができないからである。Ｄ−アミノ酸はまた、膜貫通リーダー配列のＣ末端に位置することもできる。そしてその配列は、そのカルボキシ末端においてｐ５３ペプチドと融合する。このようなＤ−アミノ酸の位置は、ペプチドを安定させるのを助ける。これは、Ｃ末端残基に作用しているエキソペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸を基質として利用することができないからである。   In order to reduce susceptibility to proteolysis, any of the aforementioned peptides of interest, ie SEQ ID NO: 1-3 (p53 peptide) or SEQ ID NO: 4-25 or 26-27 (transmembrane leader sequence) It can contain D-form amino acids and / or can contain one or more isostere pseudopeptide bonds or one or more retro-inverso pseudopeptide bonds. Thus, for example, only one amino acid or even all amino acids of the subject peptide can be D-type. Preferably, the D-amino acid is located at the N-terminus of the subject peptide. Such a position makes the peptide even less sensitive to exopeptidases acting on the N-terminal residue. This is because such an exopeptidase cannot use a D-amino acid as a substrate. The D-amino acid can also be located at the C-terminus of the transmembrane leader sequence. The sequence is then fused to the p53 peptide at its carboxy terminus. Such D-amino acid positions help stabilize the peptide. This is because an exopeptidase acting on the C-terminal residue cannot use a D-amino acid as a substrate.

あるいは、本発明の対象ペプチドは、逆配列だけでなく、Ｄ−アミノ酸全ても含んでいるレトロ−インベルソペプチド（ＲＩ）として合成することができる。この実施形態においては、ペプチドは、逆配列および全ての不斉中心における逆の立体配置の両方を含んでいる。   Alternatively, the subject peptide of the present invention can be synthesized as a retro-inverso peptide (RI) containing not only the reverse sequence but also all D-amino acids. In this embodiment, the peptide contains both the reverse sequence and the reverse configuration at all asymmetric centers.

さらに別の実施形態においては、対象ペプチドは、ｐ５３の配列または膜貫通リーダー配列の一部のみが逆になっている部分修飾レトロ−インベルソペプチド（ＰＭＲＩ）として合成することができる。例えば、Ｄ型のアミノ酸の一部のみを有し、そして逆順序で組み立てられた少なくとも６つのアミノ酸を含んでいるペプチドが提供される。   In yet another embodiment, the peptide of interest can be synthesized as a partially modified retro-inverso peptide (PMRI) in which only a portion of the p53 sequence or transmembrane leader sequence is reversed. For example, peptides are provided that have only a portion of D-form amino acids and that contain at least six amino acids assembled in reverse order.

特に、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも６つの連続アミノ酸を含んでいるペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体が提供される。ここで、当該ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する。そして少なくとも１つのアミノ酸は、Ｄ型であり、または１つ以上のペプチド結合は、イソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換される。その例としては、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）、ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を含むペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体が挙げられる。   In particular, a peptide comprising at least 6 consecutive amino acids of the amino acid sequence: PPLSQETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1), or an analog or derivative thereof is provided. Here, the peptide or analog or derivative thereof is fused to a transmembrane leader sequence and is selectively lethal to malignant or transformed cells. And at least one amino acid is in the D form, or one or more of the peptide bonds is replaced with an isostere pseudopeptide bond or a retro-inverso pseudopeptide bond. Examples thereof include a peptide containing the amino acid sequence: PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2), ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3), or an analog or derivative thereof.

別の実施形態においては、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有するペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体は、ｐ５３タンパク質に見られる天然の配列と逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。このようなペプチドは、本明細書中においてレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチドと呼ばれる。   In another embodiment, a peptide fused to a transmembrane leader sequence and selectively lethal to malignant or transformed cells, or an analog or derivative thereof, is a natural sequence found in p53 protein. Contains all D-amino acids assembled in reverse order. Such peptides are referred to herein as retro-inverso (RI) peptides.

例えば、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の逆順序で組み立てられる少なくとも６つの連続Ｄ−アミノ酸を含んでいるレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体であって、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有するものが提供される。好ましい実施形態において、ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）の逆順序で組み立てられた少なくとも６つの連続Ｄ−アミノ酸を含んでいる。   For example, a retro-inverso (RI) peptide comprising at least 6 consecutive D-amino acids assembled in reverse order of the amino acid sequence: PPLSQETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1), or an analog or derivative thereof, a transmembrane leader sequence And those that are selectively lethal to malignant or transformed cells are provided. In a preferred embodiment, the peptide or analog or derivative thereof comprises at least 6 consecutive D-amino acids assembled in the reverse order of the amino acid sequence PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2) or ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3).

ｐ５３配列の一部のみが逆にされた部分修飾レトロ−インベルソ（ＰＭＲＩ）ペプチドもまた、提供される。例えば、Ｄ型のアミノ酸の一部のみを有して、そして配列番号１に示されたアミノ酸配列の逆順序で組み立てられた少なくとも６つのアミノ酸を含んでいるペプチドが提供される。好ましい実施形態においては、少なくとも６つのＤ−アミノ酸の一部は、配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログもしくはその誘導体の逆順序で組み立てられる。   Also provided are partially modified retro-inverso (PMRI) peptides in which only a portion of the p53 sequence is inverted. For example, peptides are provided that have only a portion of D-form amino acids and that contain at least six amino acids assembled in the reverse order of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. In a preferred embodiment, some of the at least six D-amino acids are assembled in the reverse order of the sequence PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2) or ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3) or an analog or derivative thereof.

１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはインベルソ擬似ペプチド結合を含んでいる前述のペプチドの内のいずれかにおいて、または前述のレトロ−インベルソペプチドもしくは部分修飾レトロ−インベルソペプチドのいずれかにおいて、膜貫通リーダー配列は、細胞膜を通り抜け、そして特に、悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を殺すために、ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体のカルボキシル末端の終端に位置している。しかし、ｐ５３ペプチドのＮ末端に膜貫通リーダー配列を有しているペプチドは、本明細書中で記述されたインビトロ実験のような種々の実験におけるコントロールペプチドとして有用である。さらに、膜貫通リーダー配列はまた、１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはインベルソ擬似ペプチド結合を含むことができる。   In any of the foregoing peptides comprising one or more D-amino acids or one or more isostere pseudopeptide bonds or inverso pseudopeptide bonds, or the aforementioned retro-inverso peptide or partially modified retro-inverso In any of the peptides, the transmembrane leader sequence traverses the cell membrane and is located at the carboxyl-terminal end of the peptide or analog or derivative thereof, particularly to kill malignant cells, transformed cells or neoplastic cells. Yes. However, peptides having a transmembrane leader sequence at the N-terminus of the p53 peptide are useful as control peptides in various experiments such as the in vitro experiments described herein. In addition, the transmembrane leader sequence can also include one or more D-amino acids or one or more isostere pseudopeptide bonds or inverso pseudopeptide bonds.

別の本発明の実施形態においては、膜貫通リーダー配列は、それ自身、レトロ−インベルソペプチド異性体、または部分修飾レトロ−インベルソペプチド異性体である。レトロ−インベルソ型の膜貫通リーダー配列は、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示される配列のいずれかと逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。部分修飾レトロ−インベルソ型の膜貫通リーダー配列は、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示される配列のいずれかと逆順序のＤ型アミノ酸残基の一部を有している。   In another embodiment of the invention, the transmembrane leader sequence is itself a retro-inverso peptide isomer or a partially modified retro-inverso peptide isomer. The retro-inverso-type transmembrane leader sequence includes all D-amino acids assembled in reverse order with either of the sequences shown in SEQ ID NOs: 4-24 or SEQ ID NOs: 26-27. The partially modified retro-inverso type transmembrane leader sequence has a portion of the D-type amino acid residue in the reverse order to either of the sequences shown in SEQ ID NOs: 4-24 or SEQ ID NOs: 26-27.

ＲＩペプチドおよびＰＭＲＩペプチドの合成は、結果として２つの非アミノ酸残基を新たに形成した異性体に導入することをもたらす。その残基は、それぞれ形質転換配列のアミノ側およびカルボキシ側におけるｇｅｍ−ジアミノアルキル（ｇＸａａ）残基および２−アルキルマロニル（ｍＸａａ）残基である。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献１１］，（この全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる）。［非特許文献１２］に記載されているように、方向変換残基を含まない立体化学ペプチド異性体および方向ペプチド異性体は、合成が困難であることを示さない。このようなペプチドは、適切なＮ^α−および側鎖保護されたＬアミノ酸およびＤアミノ酸を使った固相ペプチド合成方法を用いて得ることができる。［非特許文献１３］を参照のこと。［非特許文献１２］Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．（２００３）および［非特許文献１３］Ｃｈａｎら（２０００）の両方は、その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。
Ｓｃｈｅｉｂｌｅｒ，Ｌ． ＆ Ｃｈｏｒｅｖ，Ｍ．（２００３）Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｖｏｌ．２２Ｃ）（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，編），５２８−５５１頁，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．（２００３）“Ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｓｏｍｅｒｓ：Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ４：３３９−３５６ Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ The synthesis of RI and PMRI peptides results in the introduction of two non-amino acid residues into the newly formed isomer. The residues are gem-diaminoalkyl (gXaa) and 2-alkylmalonyl (mXaa) residues on the amino and carboxy sides of the transforming sequence, respectively. For example, see: [Non-Patent Document 11], which is incorporated herein by reference as if fully set forth. As described in [Non-Patent Document 12], stereochemical peptide isomers and directional peptide isomers that do not contain directional residues do not show that they are difficult to synthesize. Such peptides suitable N ^alpha - can be obtained by using and side chain protected solid phase peptide synthesis method using L-amino acids and D-amino acids. See [Non-Patent Document 13]. [Non-patent Document 12] Fischer, P. et al. M.M. (2003) and [Non-Patent Document 13] Chan et al. (2000) are both incorporated herein by reference as if fully set forth.
Scheibler, L.M. & Chorev, M.M. (2003) In Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry, 4th edition, Vol. 22C) (Goodman, M., ed.), 528h, et. Fischer, P.A. M.M. (2003) “The Design, Synthesis and Application of Stereochemical and Directional Peptide ISomers: A Critical Review”, Current Protein and Peptide-3. Chan et al. , (2000) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach, Oxford University Press

しかし、ＰＭＲＩペプチドの合成は、方向反転するｇＸａａ残基およびｍＸａａ残基の側面に位置する様々なタイプおよび数のアミノ酸残基のためにいっそう困難である。ただし、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．（２００３）は、本発明のＰＭＲＩペプチドを合成することにおいて使用するためのペプチドアセンプリだけでなく、ｇＸａａモノマーおよびｍＸａａモノマーの調製のための応用スキームも提供している。   However, the synthesis of PMRI peptides is more difficult because of the various types and numbers of amino acid residues located on the sides of gXaa and mXaa residues that reverse direction. However, Fischer, P.A. M.M. (2003) provides an application scheme for the preparation of gXaa and mXaa monomers as well as peptide assembly for use in synthesizing the PMRI peptides of the present invention.

構造上関係するアミノ酸配列は、本発明の実施において配列番号１、２、３、または４で示される開示された配列と置換することができる。そのアナログまたは誘導体を含めた配列番号１、２または３に示された配列のいずれかが、リーダー配列（例として、配列番号４が挙げられるが、これに限定されない。）と結合する場合、本明細書中において「合成ペプチド」と記される。これらの合成ペプチドの３次元構造を模倣する堅固な分子は、ペプチドミメティックスと呼ばれ、そして本発明の範囲の中にまた含まれている。ｐ５３ペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシル端末のいずれかもしくは両方におけるαヘリックス安定化アミノ酸残基は、それがＭＤＭ−２タンパク質に結合している場合、ｐ５３タンパク質のこの領域の構造であることが知られているαヘリックス構造を安定させるために加えることができる。αヘリックス安定化アミノ酸残基の例としては、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ（特にヘリックスのアミノ末端の上において）、Ｍｅｔ、およびＰｈｅが挙げられる。   Structurally related amino acid sequences can be substituted in the practice of the invention for the disclosed sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 4. When any of the sequences shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3 including its analogs or derivatives binds to a leader sequence (examples include but are not limited to SEQ ID NO: 4) In the specification, it is described as “synthetic peptide”. Robust molecules that mimic the three-dimensional structure of these synthetic peptides are called peptidomimetics and are also included within the scope of the present invention. An α-helix stabilizing amino acid residue at either the amino terminus or the carboxyl terminal of the p53 peptide or both is known to be the structure of this region of the p53 protein when it is bound to the MDM-2 protein. Can be added to stabilize the α-helix structure. Examples of alpha helix stabilizing amino acid residues include Leu, Glu (especially above the amino terminus of the helix), Met, and Phe.

本発明のペプチドのアミノ酸挿入誘導体は、単一または多数のアミノ酸配列内の挿入だけでなく、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合を含んでいる。挿入アミノ酸配列変異体は、１つ以上のアミノ酸残基が、対象ペプチド中の所定の部位に導入されるものである。しかし、ランダムな挿入もまた、得られた生成物の適切なスクリーニングで可能である。欠損変異体は、１つ以上のアミノ酸を対象ペプチドの配列から取り除くことによって作ることができる。置換アミノ酸変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が取り除かれ、その場所に異なった残基が挿入されたものである。一般的な置換は、以下の表１のとおりに作られたものである。   Amino acid insertional derivatives of the peptides of the invention include amino and / or carboxyl terminal fusions as well as insertions within single or multiple amino acid sequences. An insertion amino acid sequence variant is one in which one or more amino acid residues are introduced into a predetermined site in a target peptide. However, random insertion is also possible with proper screening of the resulting product. Deletion mutants can be made by removing one or more amino acids from the sequence of the subject peptide. Substitution amino acid variants are those in which at least one residue in the sequence has been removed and a different residue inserted in its place. General substitutions were made as shown in Table 1 below.

合成ペプチドがアミノ酸置換によって誘導体化される場合、アミノ酸は、一般に、疎水性、親水性、電気陰性度、大きい側鎖などのような同様の特性を有する他のアミノ酸によって置換される。本明細書中で使われる用語「誘導体」、「類似体」、「アナログ」、「フラグメント」、「部分」および「同様の分子」は、配列番号１、２、３、または４に示したアミノ酸配列を有し、当該の誘導体、アナログ、部分、または同様の分子が、形質転換細胞または新生物細胞に浸入し、選択的に殺す能力を維持する限り、アミノ酸の置換、挿入、付加または除去を伴う対象ペプチドを意味する。   When synthetic peptides are derivatized by amino acid substitution, amino acids are generally substituted by other amino acids with similar properties such as hydrophobicity, hydrophilicity, electronegativity, large side chains, and the like. As used herein, the terms “derivative”, “analog”, “analog”, “fragment”, “moiety” and “similar molecule” refer to the amino acids shown in SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 4. As long as it has a sequence and the derivative, analog, moiety, or similar molecule of interest maintains the ability to invade and selectively kill transformed or neoplastic cells, amino acid substitutions, insertions, additions or removals Means the subject peptide involved.

本発明の合成ペプチドは、多くの公知の技法により合成することができる。例えば、ペプチドは、最初にＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３年）によって［非特許文献１４］において記述された固相技法を使って調製することができる。他のペプチド合成技法は、［非特許文献１５］および当業者が容易に入手できる他の参考文献に見出すことができる。ペプチド合成技法の概説は、［非特許文献１６］に見出すことができる。ペプチドはまた、［非特許文献１７］に記載されている溶液法によって合成することもできる。様々なペプチド合成における使用に適した保護基は、上記の文献ならびに［非特許文献１８］に記載されている。本発明のペプチドはまた、ｐ５３タンパク質のより大きい部分から、またはｐ５３タンパク質の全長から化学的切断または酵素切断によって調製することができる。同様に、本発明の合成ペプチドにおける使用のためのリーダー配列は、このようなリーダー配列がそれから得られるタンパク質の全長またはより大きい部分から化学的切断または酵素切断によって調製することができる。
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４ Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，（１９７６） Ｊ．Ｓｔｕｒａｒｔ ＆ Ｊ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ，（１９８４） Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ，第３版，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，編，１０５−２３７頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，Ｎ．Ｙ．（１９７６） Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，Ｎ．Ｙ．（１９７３） The synthetic peptides of the present invention can be synthesized by a number of known techniques. For example, peptides can be prepared using solid phase techniques first described in Merrifield (1963) in [Non-Patent Document 14]. Other peptide synthesis techniques can be found in [15] and other references readily available to those skilled in the art. An overview of peptide synthesis techniques can be found in [Non-Patent Document 16]. Peptides can also be synthesized by the solution method described in [Non-patent Document 17]. Protecting groups suitable for use in various peptide syntheses are described in the above documents as well as in [Non-Patent Document 18]. The peptides of the invention can also be prepared by chemical or enzymatic cleavage from a larger portion of the p53 protein or from the full length of the p53 protein. Similarly, leader sequences for use in the synthetic peptides of the invention can be prepared by chemical or enzymatic cleavage from the full length or larger portion of the protein from which such leader sequences are derived.
Merrifield (1963), J.M. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 M.M. Bodanszky et al. , Peptide Synthesis, John Wiley and Sons, 2nd edition, (1976). J. et al. Sturart & J.M. S. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, III, (1984). The Proteins, Vol. II, 3rd edition, Neuroth, H.M. et al. Ed., Pp. 105-237, Academic Press, New York, N.A. Y. (1976) J. et al. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N .; Y. (1973)

さらに、本発明のペプチドはまた、組換えＤＮＡ技法によって調製することができる。タンパク質を構築するために使われる大部分のアミノ酸に関して、１以上のコード化ヌクレオチドのトリプレット（コドン）は、特定のアミノ酸残基に対しコード化することができる。遺伝情報のこの特性は、冗長性として公知である。従って、多くの様々な異なったヌクレオチド配列は、悪性哺乳動物細胞、形質転換哺乳動物細胞に選択的に致死性を有する特定の対象ペプチドに対してコード化することができる。本発明はまた、遺伝子コード化を規定するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、すなわち、そこから本発明のペプチドを酵素で、または化学的に切断することができる対象ペプチドまたはキメラペプチドを発現することができるＤＮＡ分子もまた意図されている。   Furthermore, the peptides of the invention can also be prepared by recombinant DNA techniques. For most amino acids used to construct a protein, a triplet (codon) of one or more encoding nucleotides can be encoded for a particular amino acid residue. This property of genetic information is known as redundancy. Thus, many different nucleotide sequences can be encoded for a particular peptide of interest that is selectively lethal to malignant and transformed mammalian cells. The present invention can also express deoxyribonucleic acid (DNA) molecules that define gene encoding, ie, target peptides or chimeric peptides from which the peptides of the present invention can be enzymatically or chemically cleaved. DNA molecules are also contemplated.

１つ以上のＤ型アミノ酸を有している対象ペプチドは、天然Ｌアミノ酸の代わりに１つ以上のＤ−アミノ酸をペプチド鎖に組み込むことによって合成することができる。線形Ｄ型ペプチドの合成は、自動手順による合成を含めたペプチド合成の従来のプロトコルを使って調製することができる。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献１９］。
Ｓｃｈｅｉｂｌｅｒ，Ｌ． ＆ Ｃｈｏｒｅｖ，Ｊ．（２００３）Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｒｉｃｓ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｖｏｌ．２２Ｃ）（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，編），５２８−５５１頁，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ A subject peptide having one or more D-type amino acids can be synthesized by incorporating one or more D-amino acids into the peptide chain in place of the natural L-amino acids. The synthesis of linear D-type peptides can be prepared using conventional protocols for peptide synthesis, including synthesis by automated procedures. For example, see: [Non-Patent Document 19].
Scheibler, L.M. & Chorev, J .; (2003) In Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry, 4th edition, Vol. 22C) (Goodman, M., ed., T1), 528h.

還元されたイソスター擬似ペプチド結合は、わずかな生体活性の損失で、または全く生体活性を損失しないで、タンパク分解切断に対する安定性を向上させる擬似ペプチド結合である。そのため、対象ペプチドは、１つ以上のペプチド結合がイソスター擬似ペプチド結合で置換されていることを除いて、配列番号１〜３（ｐ５３ペプチド）のいずれか、または配列番号４〜２４もしくは２６〜２７（膜貫通リーダー配列）のいずれかに示されたアミノ酸配列を有するＬアミノ酸ペプチドと同一であり得る。１つ以上の還元イソスター擬似ペプチド結合でペプチドを合成する方法は、当技術分野で周知である。以下を参照のこと：［非特許文献２０］（その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。）。
Ｃｏｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４１：１８１−１８４ A reduced isostere pseudopeptide bond is a pseudopeptide bond that improves stability against proteolytic cleavage with little or no loss of bioactivity. Therefore, the subject peptide is any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 (p53 peptide), or SEQ ID NOs: 4 to 24 or 26 to 27, except that one or more peptide bonds are replaced with isostere pseudopeptide bonds. It can be identical to an L amino acid peptide having the amino acid sequence shown in any of (transmembrane leader sequences). Methods for synthesizing peptides with one or more reduced isostere pseudopeptide bonds are well known in the art. See: [Non-Patent Document 20] (incorporated herein by reference as if fully set forth).
Couder et al. , (1993) Int. J. et al. Peptide Protein Res. 41: 181-184

ペプチド結合はまた、レトロインベルソ擬似ペプチド結合で置換することができる。そのため、対象ペプチドは、１つ以上のレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合がペプチド結合と置換していることを除いて、配列番号１〜３（ｐ５３ペプチド）または配列番号４〜２４もしくは２６〜２７（膜貫通リーダー配列）のいずれかに示されるアミノ酸配列を有しているＬアミノ酸ペプチドと同一であり得る。１つ以上のレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合を有するペプチドを合成するための手順は、既存の文献から得ることができる。例えば、以下を参照のこと：
［非特許文献２１］（その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。）。
Ｄａｌｐｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｉｎ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４１：５６１−５６６ Peptide bonds can also be replaced with retro-inverso pseudopeptide bonds. Therefore, the subject peptide is SEQ ID NO: 1-3 (p53 peptide) or SEQ ID NO: 4-24 or 26-27 (membrane) except that one or more retro-inverso pseudopeptide bonds are replaced with peptide bonds. The L amino acid peptide having the amino acid sequence shown in any of the penetrating leader sequences). Procedures for synthesizing peptides having one or more retro-inverso pseudopeptide bonds can be obtained from existing literature. For example, see:
[Non-Patent Document 21] (incorporated herein by reference as if fully set forth).
Dalpozzo et al. (1993) In. J. et al. Peptide Protein Res. 41: 561-566

対象ＲＩペプチドは、Ｄ−アミノ酸を使って、そしてレトロ−インベルソペプチドアナログにおけるアミノ酸配列が、モデルの役割をする選択されたペプチドの配列と正反対であるように、ペプチド鎖の中にアミノ酸を結合させることで、合成することができる。よって、配列番号１に示されるペプチドのレトロ−インベルソペプチドは、次の配列：ＬＬＫＷＬＤＳＦＴＥＱＳＬＰＰ（配列番号２８）で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。配列番号２に示されるペプチドのレトロ−インベルソペプチドは、次の配列：ＳＦＴＥＱＳＬＰＰ（配列番号２９）で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。配列番号３に示されるペプチドのレトロ−インベルソペプチドは、次の配列：ＬＬＫＷＬＤＳＦＴＥ（配列番号３０）で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。   The subject RI peptide uses D-amino acids and binds amino acids into the peptide chain such that the amino acid sequence in the retro-inverso peptide analog is exactly opposite to the sequence of the selected peptide that serves as a model Can be synthesized. Thus, the retro-inverso peptide of the peptide shown in SEQ ID NO: 1 contains all the D-amino acids assembled in the following sequence: LLKWLDSFTEQSLPP (SEQ ID NO: 28). The retro-inverso peptide of the peptide shown in SEQ ID NO: 2 comprises all D-amino acids assembled in the following sequence: SFTEQSLPP (SEQ ID NO: 29). The retro-inverso peptide of the peptide shown in SEQ ID NO: 3 contains all the D-amino acids assembled in the following sequence: LLKWLDSFTE (SEQ ID NO: 30).

レトロ−インベルソペプチドは、Ｆｍｏｃ−２，４−ジメチルオキシ−４’＆（カルボキシメチルオキシ）−ベンズヒドリルアミン樹脂におけるＦｍｏｃ化学によって合成することができる。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献２２］（その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。）。
Ｂｒｉａｎｄ，Ｊ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，（１９９５）“Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｓ ａ ｎｅｗ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｂｅ：ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ”．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７０，１１９２１−１１９２６ Retro-inverso peptides can be synthesized by Fmoc chemistry on Fmoc-2,4-dimethyloxy-4 ′ & (carboxymethyloxy) -benzhydrylamine resin. For example, see: [Non-Patent Document 22] (incorporated herein by reference as if fully set forth).
Briand, J.M. P. et al. (1995) “Retro-Inverso peptidomics as a new immunological probe: validation and application to the detection of autoantibodies in rheumetics”. J. et al. Biol Chem. 270, 11921-11926

レトロ−インベルソのペプチドのＮＨ_２−末端は、アセチル化することができる。酸切断の後に、粗ペプチドは、分取ＨＰＬＣ装置を使ったカラムクロマトグラフィーのような標準的な方法によって精製することができる。レトロ−インベルソのペプチドの純度は、分析用ＨＰＬＣまたは当技術分野で周知の他の方法により決定することができる。 Retro - NH of inverso peptide 2 _- terminus may be acetylated. After acid cleavage, the crude peptide can be purified by standard methods such as column chromatography using preparative HPLC equipment. The purity of the retro-inverso peptide can be determined by analytical HPLC or other methods well known in the art.

ＲＩペプチド（およびＰＲＭＩペプチドの中のＲＩ配列）におけるＬ−ＩｌｅおよびＬ−Ｔｈｒの適切な立体異性体は、これらのアミノ酸において２つの不斉中心が存在するために、Ｄ−アロＩｌｅおよびＤ−アロＴｈｒである。   The appropriate stereoisomers of L-Ile and L-Thr in the RI peptide (and the RI sequence in the PRMI peptide) are D-allo Ile and D- Allo Thr.

対象ＰＭＲＩ−ペプチドの合成に関しては、溶液ベースの方法が好ましい。溶液ベースの化学により、種々の周知の反応によってＰＭＲＩ−ペプチドの合成のために必要とされる適切に保護されたｇｅｍ−ジアミノアルキル部分および２−アルキルマロニル部分を生成することができる。次いで、生成された粗構築ブロックおよび擬似ペプチドユニットは、精製および特性評価にかけることができる。
ＨＯ−Ａｌａ−（ＲＳ）−ｍＰｈｅ−（Ｒ）−Ｌｙｓ（Ｎ^２−Ｂｏｃ）−ＮＨ_２またはＨＯ−ｍＧｌｙ−（Ｒ）−Ｐｈｅ−ＮＨ_２のような前駆体を組み込んで樹脂上にＰＭＲＩユニットを生成させること、または前もって形成させたＰＭＲＩ単位ＰＧ−Ｘａａ^１Ψ［ＮＨＣＯ］Ｘａａ^２−ＯＨ（Ψ＝擬似ペプチド結合）を構築ブロックとして組み込むことのいずれかによる固相合成によってもまた、ＰＭＲＩ−ペプチドを作製することができる。しかし、遅い反応速度、副反応、および反応条件と固体支持体との間の適合性の欠如が、ＰＭＲＩ−ペプチドの固相合成を複雑にし、それが選択すべき方法とはならない。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献２３］。本明細書中で引用された全ての特許、論文および書籍の章の開示は、その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。
Ｓｃｈｅｉｂｌｅｒ，Ｌ． ＆ Ｃｈｏｒｅｖ，Ｍ．（２００３）Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｖｏｌ．２２Ｃ）（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，編），５２８−５５１頁，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ For the synthesis of the subject PMRI-peptides, solution-based methods are preferred. Solution-based chemistry can produce appropriately protected gem-diaminoalkyl and 2-alkylmalonyl moieties required for the synthesis of PMRI-peptides by various well-known reactions. The generated crude building blocks and pseudopeptide units can then be subjected to purification and characterization.
^{HO-Ala- (RS) -mPhe- (} R) -Lys (N 2 -Boc) -NH 2 or HO-mGly- (R) -Phe- NH 2 such as precursor incorporated is PMRI units on the resin Or by solid phase synthesis by incorporating the previously formed PMRI unit PG-Xaa ¹ Ψ [NHCO] Xaa ² —OH (Ψ = pseudopeptide bond) as a building block. Peptides can be made. However, slow reaction rates, side reactions, and lack of compatibility between the reaction conditions and the solid support complicate the solid phase synthesis of PMRI-peptide, which is not the method of choice. For example, see: [Non-Patent Document 23]. The disclosures of all patent, paper and book chapters cited herein are hereby incorporated by reference as if set forth in their entirety.
Scheibler, L.M. & Chorev, M.M. (2003) In Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry, 4th edition, Vol. 22C) (Goodman, M., ed.), 528h, et.

培養で増殖した細胞に適用される場合、合成ペプチドは、悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有し、細胞数の用量依存減少をもたらす。この効果は、一般に２〜３時間以内、最大でも４８時間で観察することができる。培養で増殖したラット膵臓腺房細胞（ＢＭＲＰＡ７４３０）の細胞株は、Ｋ−ｒａｓで形質転換された。通常の培養細胞株は、膵臓腺房細胞に特有の構造を示す；形質転換細胞（ＴＵＣ−３）は、一般的な膵臓ガン細胞として現われて、腺房細胞の分化モルフォロジーを欠いている。ＢＭＲＰＡ．４３０細胞が、リーダー配列の配列番号４とカップリングした配列番号１の一次構造を有する合成ペプチドで５０μｇ／ｍｌの用量において処理された場合、その細胞は影響を受けなかった。しかし、ＴＵＣ−３細胞が、リーダー配列の配列番号４とカップリングした配列番号１の一次構造を有するペプチドで１００μｇ／ｍｌの用量において処理された場合、その細胞は、３から４日以内に死んだ。配列番号１を配列番号２または配列番号３のいずれかと置き換えた以外は同じ実験を行った場合も、同様の結果が得られた。さらに、形質転換細胞および悪性細胞の細胞死は、リーダー配列の配列番号４とカップリングした配列番号１の一次構造を有する合成ペプチドで１００μｇ／ｍｌの用量において処理されたヒトの乳ガン細胞株および黒色腫およびヒーラ細胞で観察された。それと対照的に、同じ用量における同じ合成ペプチドは、悪性でない、そして形質転換していないヒトの胸細胞株もしくは線維芽細胞株に対しては影響を与えなかった。   When applied to cells grown in culture, synthetic peptides are selectively lethal to malignant or transformed cells, resulting in a dose-dependent decrease in cell number. This effect can generally be observed within 2-3 hours, at most 48 hours. A cell line of rat pancreatic acinar cells (BMRPA 7430) grown in culture was transformed with K-ras. Normal cultured cell lines show a structure unique to pancreatic acinar cells; transformed cells (TUC-3) appear as common pancreatic cancer cells and lack the differentiation morphology of acinar cells. BMRPA. When 430 cells were treated with a synthetic peptide having the primary structure of SEQ ID NO: 1 coupled with leader sequence SEQ ID NO: 4 at a dose of 50 μg / ml, the cells were not affected. However, if TUC-3 cells were treated at a dose of 100 μg / ml with a peptide having the primary structure of SEQ ID NO: 1 coupled to the leader sequence SEQ ID NO: 4, the cells died within 3 to 4 days It is. Similar results were obtained when the same experiment was performed except that SEQ ID NO: 1 was replaced with either SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. In addition, cell death of transformed and malignant cells was detected in human breast cancer cell lines treated with a synthetic peptide having the primary structure of SEQ ID NO: 1 coupled to leader sequence SEQ ID NO: 4 at a dose of 100 μg / ml and black Observed in tumor and healer cells. In contrast, the same synthetic peptide at the same dose had no effect on non-malignant and untransformed human breast or fibroblast cell lines.

配列番号４に示されたリーダー配列が、ＰＮＣ２９（次のアミノ酸の配列：ＭＰＦＳＴＧＫＲＩＭＬＧＥ（配列番号２５）を有しているコントロールタンパク質）のカルボキシ末端に位置する場合、悪性細胞または通常細胞に対する影響はなかった。   When the leader sequence shown in SEQ ID NO: 4 is located at the carboxy terminus of PNC29 (control protein having the following amino acid sequence: MPFSTGKRIMMLGE (SEQ ID NO: 25)), there is no effect on malignant cells or normal cells It was.

さらに、配列番号４に示されたリーダー配列にカルボキシ末端において融合する配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、成長因子の存在下でｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ細胞株に分化するヒト幹細胞の能力に影響を与えない。このことは、化学療法薬として投与されるとき、このペプチドが骨髄細胞に有害ではないことを示す。以下を参照のこと：［非特許文献２４］（この開示は、その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。）。
Ｋａｎｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，（２００１年１０月２３日）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８（２２）；１２４３８−１２４４３ Furthermore, a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 fused at the carboxy terminus to the leader sequence shown in SEQ ID NO: 4 affects the ability of human stem cells to differentiate into hematopoietic cell lines in the presence of growth factors. Absent. This indicates that the peptide is not harmful to bone marrow cells when administered as a chemotherapeutic agent. See: [Non-Patent Document 24] (the disclosure of which is incorporated herein by reference as if set forth in its entirety).
Kanovsky et al. (October 23, 2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98 (22); 12438-12443

培養されたガン細胞が、リーダー配列と結合していない配列番号１の一次構造を有するペプチドで１００μｇ／ｍｌの用量において処理された場合、細胞は影響を受けなかった。同様に、培養されたガン細胞が、リーダー配列の配列番号４（現在のところ好ましいリーダー配列）で同じ用量において処理された場合も、細胞はまた影響されなかった。これらの結果は、合成ペプチドのリーダー配列が処理される細胞の細胞膜を合成ペプチドが通り抜けることを可能にし、そして合成ペプチドの効果は細胞内である必要があることを示す。   When cultured cancer cells were treated at a dose of 100 μg / ml with a peptide having the primary structure of SEQ ID NO: 1 that was not bound to the leader sequence, the cells were not affected. Similarly, when cultured cancer cells were treated at the same dose with the leader sequence SEQ ID NO: 4 (the currently preferred leader sequence), the cells were also unaffected. These results indicate that the synthetic peptide leader sequence allows the synthetic peptide to pass through the cell membrane of the cell being processed and that the effect of the synthetic peptide needs to be intracellular.

合成ペプチドが、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ−２タンパク質との結合を妨害することにより作用するかどうか決定するために、合成ペプチドを、同種接合欠失によりｐ５３タンパク質を作る能力をなくされた形質転換結腸直腸腺ガン細胞に対してテストした。驚くべきことに、合成ペプチドは、選択的に形質転換細胞を殺したが、普通の細胞に影響を有しなかった。これらの結果は、作用機構がＭＤＭ−２タンパク質に結合するｐ５３タンパク質から独立しているように考えられることを示す。これは、ｐ５３ペプチドは、ｐ５３タンパク質を全く生産しない形質転換細胞を選択的に殺すからである。これらの結果は、ＭＤＭ−２タンパク質へのｐ５３タンパク質の結合を妨害することが、合成ペプチドが悪性細胞および形質転換細胞の選択的な死を引き起こすメカニズムではないかもしれないことを示す。本明細書中で開示された合成ペプチド、それらの誘導体、アナログ、そしてペプチド模倣分子は、ガンのような新生物疾患の処置に有用であるけれども、形質転換細胞および悪性細胞に対する作用に関するメカニズムは、見いだされていない。   In order to determine whether a synthetic peptide acts by interfering with the binding of p53 protein to MDM-2 protein, the transformed peptide has been rendered the ability to make p53 protein by homozygous deletion transformed colorectal Tested against adenocarcinoma cells. Surprisingly, the synthetic peptide selectively killed transformed cells but had no effect on normal cells. These results indicate that the mechanism of action appears to be independent of the p53 protein that binds to the MDM-2 protein. This is because the p53 peptide selectively kills transformed cells that do not produce any p53 protein. These results indicate that interfering with the binding of p53 protein to MDM-2 protein may not be a mechanism by which synthetic peptides cause selective death of malignant and transformed cells. Although the synthetic peptides, their derivatives, analogs, and peptidomimetic molecules disclosed herein are useful for the treatment of neoplastic diseases such as cancer, the mechanisms for action on transformed and malignant cells are: Not found.

本発明のペプチドは、インビボにおける新生物細胞に対して有効である。例えば、膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡｌ．ＴＵＣ−３を異種移植され、約３〜６ミリの発達した腫瘍の大きさを有するマウスは、対象合成ペプチド（例えば、カルボキシ末端においてリーダー配列と融合した配列番号３で示したアミノ酸配列を有しているペプチド）の投与の後に腫瘍の大きさが劇的に減少した。   The peptides of the present invention are effective against neoplastic cells in vivo. For example, pancreatic cancer cells BMRPAl. A mouse xenografted with TUC-3 and having a developed tumor size of about 3-6 mm has the subject synthetic peptide (eg, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 fused to the leader sequence at the carboxy terminus) The tumor size decreased dramatically after administration of the peptide.

本発明のペプチドの観察された特性と一致して、対象ペプチドは、新生物細胞または悪性細胞、すなわち、動物、特にヒトにおけるガン細胞を選択的に殺す。そのため、本発明の合成ペプチドは、被検体の動物またはヒトにおける新生物細胞を殺すために有効な量で投与される。   Consistent with the observed properties of the peptides of the present invention, the subject peptides selectively kill neoplastic or malignant cells, ie cancer cells in animals, particularly humans. Therefore, the synthetic peptides of the present invention are administered in an amount effective to kill neoplastic cells in the subject animal or human.

本発明の合成ペプチドは、薬学上受容できる担体と共に、治療有効用量の本発明の少なくとも１つの合成ペプチドを含んでいる薬剤組成物として好ましくはヒトの患者に投与することができる。用語「治療有効量」または「薬学的有効量」は、新生物細胞または悪性細胞、すなわち、ガン細胞を選択的に殺すことを含めた増殖抑制を個体においてもたらすのに必要とされる用量を意味する。   The synthetic peptides of the invention can be administered to a human patient, preferably as a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective dose of at least one synthetic peptide of the invention together with a pharmaceutically acceptable carrier. The term “therapeutically effective amount” or “pharmaceutically effective amount” means the dose required to provide growth inhibition in an individual, including selectively killing neoplastic or malignant cells, ie, cancer cells. To do.

好ましくは、１つ以上の本発明のペプチドを含有する組成物は、選択的に新生物性細胞を殺し、それにより、ガンのような新生物疾患または悪性疾患を処置
する目的のために、静脈内に投与される。１つ以上の本発明のペプチドを使って効果的に処置することができる種々のガンの例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：乳ガン、前立腺ガン、肺ガン、子宮頸管ガン、大腸ガン、黒色腫、膵臓ガンおよび全ての固体の組織腫瘍（上皮細胞腫瘍）、ならびに血液のガン（リンパ腫および白血病が例とされるがそれらに限定されない）。 Preferably, the composition containing one or more peptides of the present invention selectively kills neoplastic cells and thereby intravenously for the purpose of treating neoplastic or malignant diseases such as cancer. Be administered within. Examples of various cancers that can be effectively treated with one or more peptides of the present invention include, but are not limited to: breast cancer, prostate cancer, lung cancer, cervical canal Cancer, colon cancer, melanoma, pancreatic cancer and all solid tissue tumors (epithelial cell tumors), and blood cancers (including but not limited to lymphomas and leukemias).

本発明の合成ペプチドの投与は、経口、静脈内、鼻腔内、坐薬、筋肉内、腹腔内、皮内投与もしくは皮下投与、または注入もしくは移植によって可能である。このような方法で投与される場合、本発明の合成ペプチドは、担体および／またはアジュバントのような他の成分と組み合わせることができる。それらが薬学上受容できて、それらの意図される投与のために有効である必要があり、組成物の活性成分の活性を劣化する可能性がなく、そして細胞の中に対象ペプチドを導入することを妨げる可能性がないことを除いて、他の成分の性質については制限がない。このペプチド組成物はまた、経皮パッチの中に浸み込ませるか、または好ましくは液体状または半液体状の皮下挿入物に含ませることができ、そのパッチまたは挿入物は、治療有効量の１つ以上の対象合成ペプチドを時限放出する。   Administration of the synthetic peptides of the present invention can be by oral, intravenous, intranasal, suppository, intramuscular, intraperitoneal, intradermal or subcutaneous administration, or infusion or transplantation. When administered in such a manner, the synthetic peptides of the invention can be combined with other components such as carriers and / or adjuvants. They must be pharmaceutically acceptable, effective for their intended administration, do not degrade the activity of the active ingredients of the composition, and introduce the peptide of interest into the cell There is no restriction on the nature of the other ingredients, except that there is no possibility of interfering. The peptide composition can also be immersed in a transdermal patch, or preferably included in a liquid or semi-liquid subcutaneous insert, the patch or insert being in a therapeutically effective amount. Time-release one or more subject synthetic peptides.

注射に適した製薬の形態としては、無菌注射用の溶液または分散液を即座に調製するための無菌水溶液もしくは無菌分散液および無菌粉末が挙げられる。いかなる場合であっても、最終的な溶液形態は、無菌で、そして流動性である必要がある。一般的な担体としては、例えば、以下のものを含有する溶媒もしくは分散媒が挙げられる：水緩衝水溶液、すなわち、生体適合性緩衝液、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物、界面活性剤または植物油。殺菌法は、当技術分野で認められる任意の技法を利用して達成することができ、例としては、濾過または抗菌剤もしくは抗カビ剤の添加が挙げられるが、それらに限定されない。このような添加剤の例としては、パラベン、クロロブタノール（ｃｈｌｏｒｂｕｔａｎｏｌ）、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールが挙げられる。糖類または塩化ナトリウムのような等張剤もまた、対象組成物に組み入れることができる。   Pharmaceutical forms suitable for injection include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. In any case, the final solution form must be sterile and fluid. Common carriers include, for example, solvents or dispersion media containing the following: aqueous buffer solutions, ie biocompatible buffers, ethanol, polyols (eg, glycerol, propylene glycol, polyethylene glycol), Suitable mixtures thereof, surfactants or vegetable oils. The sterilization method can be accomplished utilizing any technique recognized in the art, examples include but are not limited to filtration or addition of antibacterial or antifungal agents. Examples of such additives include parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid or thimerosal. Isotonic agents such as sugars or sodium chloride can also be incorporated into the subject compositions.

本明細書中で使われる「薬学上受容できる担体」としては、任意の、および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤薬および抗カビ剤、等張剤などが挙げられる。このような媒体および添加剤の使用は、当技術分野で周知である。   As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents and the like. The use of such media and additives is well known in the art.

対象合成ペプチドを含んでいる無菌注射用溶液の作製は、必要とされる量の１つ以上の上記の主題合成ペプチドを、１つ以上の上記に列挙された種々の成分と共に適切な溶媒に溶かし込み、必要に応じて殺菌、好ましくは濾過殺菌を続けることにより達成される。無菌粉末を得るためには、必要に応じて上記の溶液を真空乾燥または凍結乾燥する。   Preparation of a sterile injectable solution containing a subject synthetic peptide involves dissolving the required amount of one or more of the subject synthetic peptides together with one or more of the various listed ingredients in a suitable solvent. And sterilization as needed, preferably by filter sterilization. In order to obtain a sterile powder, the above solution is vacuum-dried or freeze-dried as necessary.

不活性希釈剤および／または吸収可能な食用担体などは、ペプチドが経口投与される場合、薬剤組成物の一部であり得る。薬剤組成物は、硬いまたは柔らかい殻ゼラチンカプセルの中にあってもよく、錠剤に圧縮することができ、またはエリキシル剤、懸濁液、シロップなどの形であってもよい。   Inert diluents and / or absorbable edible carriers and the like can be part of the pharmaceutical composition when the peptide is administered orally. The pharmaceutical composition may be in hard or soft shell gelatin capsules, compressed into tablets, or in the form of elixirs, suspensions, syrups and the like.

そのため、対象合成ペプチドは、便利および効果的に薬学的有効量で投与するために、治療有効用量の適切な薬学上受容できる担体と混合される。薬学的有効量の例としては、少なくとも約２５ｕｇ／ｍｌから少なくとも約３００ｕｇ／ｍｌの範囲にあるペプチド濃度が挙げられる。   As such, the subject synthetic peptides are mixed with a therapeutically effective dose of a suitable pharmaceutically acceptable carrier for convenient and effective administration in pharmaceutically effective amounts. Examples of pharmaceutically effective amounts include peptide concentrations in the range of at least about 25 ug / ml to at least about 300 ug / ml.

ヒトに適用される本発明の方法で使われる合成ペプチドの正確な治療有効量は、新生物疾患の段階の変化、腫瘍の大きさおよび悪性度、転移の存在または程度などのために一概に述べることができない。さらに、個人の体重、性別および全体的な健康状態は、考慮されなくてはならず、用量に影響するであろう。しかし、本発明の合成ペプチドを、１服用あたり少なくとも約１０ｍｇ、より好ましくは１服用あたり１０００ｍｇまでの量で投与することが、一般に言える。本発明のペプチド組成物は、最終的に血流から除去されるから、薬剤組成物の再投与が指示され、そしてそれが好ましい。   The exact therapeutically effective amount of the synthetic peptide used in the method of the invention applied to humans is generally stated due to changes in stage of neoplastic disease, tumor size and grade, presence or extent of metastasis, etc. I can't. In addition, an individual's weight, sex and overall health status must be considered and will affect the dose. However, it can generally be said that the synthetic peptides of the invention are administered in an amount of at least about 10 mg per dose, more preferably up to 1000 mg per dose. Since the peptide composition of the present invention is eventually removed from the bloodstream, re-administration of the pharmaceutical composition is indicated and is preferred.

本発明の合成ペプチドは、服用調剤と適合性のある手法で、治療に有効である量で投与することができる。全身への用量は、患者の年齢、体重および体調、ならびに投与経路に依存する。成人への投与のための例示的な適切用量は、体重１キログラムあたり約０．１〜約２０ｍｇの範囲である。好ましくは、その用量は、体重１キログラムあたり約０．１〜約１０ｍｇである。   The synthetic peptides of the present invention can be administered in a therapeutically effective amount in a manner compatible with the dosage formulation. Systemic dose depends on the patient's age, weight and physical condition, and route of administration. Exemplary suitable doses for administration to adults range from about 0.1 to about 20 mg per kilogram body weight. Preferably, the dose is about 0.1 to about 10 mg per kilogram body weight.

本発明に従って、新生物疾患を処置する方法もまた提供される。その方法は、治療有効量の上述の合成ペプチド（そのアナログと誘導体を含む。）を、このような処置を必要としている被検体に投与することを含む。そのため、例えば、１つの実施形態において、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合した、配列番号１で示した少なくとも約６つの連続アミノ酸を含む有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、被検体に投与することができる。別の実施形態においては、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合した、配列番号１に示した少なくとも約８個から少なくとも約１０個の連続アミノ酸を含んでいる有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することができる。例えば、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合した、配列番号１に示したアミノ酸配列を含んでいる有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することができる。そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合した、配列番号２に示したアミノ酸配列を含んでいる有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体もまた、被検体に投与することができる。さらに別の実施形態においては、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合した、配列番号３に示したアミノ酸配列を含んでいる有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することができる。１つ以上のＤ−アミノ酸またはイソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合を含んでいる対象ペプチドのいずれか、またはカルボキシル末端において膜貫通リーダー配列と融合している前述のＲＩペプチドまたはＰＭＲＩペプチドのいずれかもまた、被検体における悪性細胞または新生物細胞を殺す方法において使用することができる。   In accordance with the present invention, a method of treating a neoplastic disease is also provided. The method includes administering a therapeutically effective amount of a synthetic peptide as described above (including analogs and derivatives thereof) to a subject in need of such treatment. Thus, for example, in one embodiment, an effective amount of a peptide comprising at least about 6 contiguous amino acids set forth in SEQ ID NO: 1 fused to a leader sequence at its carboxy terminus, or an analog or derivative thereof is administered to a subject. can do. In another embodiment, an effective amount of a peptide comprising at least about 8 to at least about 10 contiguous amino acids set forth in SEQ ID NO: 1 fused to a leader sequence at its carboxy terminus, or an analog or derivative thereof. Can be administered to a subject. For example, an effective amount of a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 fused to a leader sequence at its carboxy terminus or an analog or derivative thereof can be administered to a subject. An effective amount of a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an analog or derivative thereof fused to a leader sequence at its carboxy terminus can also be administered to a subject. In yet another embodiment, an effective amount of a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an analog or derivative thereof fused to a leader sequence at its carboxy terminus can be administered to a subject. . Any of the subject peptides containing one or more D-amino acids or isostere or retro-inverso pseudopeptide bonds, or of the aforementioned RI or PMRI peptides fused to a transmembrane leader sequence at the carboxyl terminus Either can also be used in a method of killing malignant or neoplastic cells in a subject.

処置方法に従って、合成ペプチドの混合物を投与することができる。そのため、例えば、有効量の上述のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体の内の１つを投与することに加えて、２つ以上の上述のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体の混合物を被検体に投与することもまたできる。   According to the method of treatment, a mixture of synthetic peptides can be administered. Thus, for example, in addition to administering an effective amount of one of the aforementioned peptides or analogs or derivatives thereof, a mixture of two or more of the aforementioned peptides or analogs or derivatives thereof is administered to the subject. You can also do that.

本発明により、インビトロでの悪性細胞、形質転換細胞、または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法もまた提供される。その方法は、悪性細胞、形質転換細胞、または新生物細胞を上述のペプチドのいずれかと接触させる工程、生きている細胞と比べた死んだ細胞の割合またはパーセンテージに基づいて有効性レベルを評価する工程、およびそして培養中の形質転換していない（通常）細胞の増殖に対するペプチドの効果を評価する工程を含んでいる。従って、インビトロにおける悪性細胞、形質転換細胞、または新生物細胞を殺すが、培養中の形質転換していない細胞または通常細胞に対しては悪影響を与えないようなペプチドは、新生物疾患で苦しんでいる患者を処置するのに使用するための価値ある候補であると考えられる。   The present invention also provides a method for assessing the level of peptide efficacy in selectively killing malignant, transformed or neoplastic cells in vitro. The method comprises contacting a malignant cell, transformed cell, or neoplastic cell with any of the peptides described above, assessing the level of efficacy based on the percentage or percentage of dead cells compared to living cells. And evaluating the effect of the peptide on the growth of untransformed (usually) cells in culture. Thus, peptides that kill malignant cells, transformed cells, or neoplastic cells in vitro but do not adversely affect untransformed or normal cells in culture suffer from neoplastic disease. Are considered valuable candidates for use in treating patients.

以下の実施例は、本発明をさらに例証するものであり、その範囲を限定することは意図していない。   The following examples further illustrate the invention and are not intended to limit its scope.

アミノ末端に結合しているリーダー配列を有する対象ペプチドの有効性を比較するために、以下の実験を行った。上述のように、カルボキシル末端上におけるリーダー配列で合成されたペプチドは、ＭＤＭ−２に結合されている場合に、このペプチドのｐ５３部分の活性構造であるペプチド中のα−ヘリックス形成を促進した。上述されるように、配列番号１、２、および３に示されたアミノ酸配列を有する対象ペプチドは、同型接合でｐ５３遺伝子−欠損されたものを含めて、多種多様なヒトのガン細胞に、強く毒性を有する。配列番号１〜３に示された配列を有している各ペプチドに対するα−ヘリックス確率分析を、２つの異なる方法を使って行った。一つは、タンパク質データベース［非特許文献２５］からヘリックス確率を使ったものである。そしてもう一つは、ヘリックスの核生成（σ）および成長（ｓ）に基づいたイジングモデルを使ったものである。それは、２０個の天然Ｌアミノ酸の各々に対するブロックコポリマーから実験的に決定された平衡定数であり、［非特許文献２６］および［非特許文献２７］に記述されるこれらのパラメータに対する帯電の効果を包含することにより修正されている。確率分析は、リーダー配列がアミノ末端上にある場合、ペプチドが細胞膜を通り抜けたとしても、α−へリックス構造の含有量は、ずっと低いことを示した。
Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：８４６−８５６ Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２６：３５１−３７２） Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２６：３７３−３９３） In order to compare the effectiveness of the peptides of interest having a leader sequence attached to the amino terminus, the following experiment was performed. As described above, a peptide synthesized with a leader sequence on the carboxyl terminus promoted α-helix formation in the peptide, which is the active structure of the p53 portion of this peptide when bound to MDM-2. As described above, the subject peptides having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 are strongly resistant to a wide variety of human cancer cells, including those homozygous and p53 gene-deficient. Toxic. An α-helix probability analysis for each peptide having the sequence shown in SEQ ID NOs: 1-3 was performed using two different methods. One is using the helix probability from the protein database [Non-patent Document 25]. The other uses an Ising model based on helix nucleation (σ) and growth (s). It is an equilibrium constant determined experimentally from block copolymers for each of the 20 natural L amino acids, and the effect of charging on these parameters described in [Non-Patent Document 26] and [Non-Patent Document 27]. It has been modified by inclusion. Probabilistic analysis showed that when the leader sequence was on the amino terminus, the content of α-helix structure was much lower even though the peptide passed through the cell membrane.
Karplus, K .; et al. (1998) Bioinformatics 14: 846-856. Vasquez, M.M. et al. , (1987) Biopolymers (26: 351-372). Vasquez, M.M. et al. , (1987) Biopolymers (26: 373-393)

配列番号３で示した配列を有しているペプチドを、アミノ末端と結合しているリーダー配列により固相合成によって合成した。このペプチドは、下の表２でＰＮＣ２８’と記される。ＰＮＣ２８’ペプチドを、３つの異なった濃度、すなわち、２５、５０および１００μｇ／ｍｌにおいて形質転換した膵臓がん（ＴＵＣ−３）細胞と共にインキュベートした。２週間のインキュベーションの後に、ペプチドの最も高い用量において、細胞死が起こらず、そして細胞の約半分が腺房を形成するのが見られ、そして形質転換していないモルフォロジー表現型を示した。同じ現象は、５０μｇ／ｍｌにおいても観察され、そして２５μｇ／ｍｌにおいては非常に少しの細胞が元の状態に戻ることが見られた。それとは対照的に、リーダー配列がペプチドのカルボキシル末端に結合している場合（表２でのＰＮＣ２８）、５０および１００μｇ／ｍｌの用量において１００％の細胞死が約４日以内に起こった。   A peptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 3 was synthesized by solid phase synthesis with a leader sequence attached to the amino terminus. This peptide is denoted PNC28 'in Table 2 below. PNC28 'peptide was incubated with pancreatic cancer (TUC-3) cells transformed at three different concentrations, namely 25, 50 and 100 μg / ml. After 2 weeks of incubation, at the highest dose of peptide, cell death did not occur and about half of the cells were seen to form an acinus, indicating an untransformed morphological phenotype. The same phenomenon was observed at 50 μg / ml and very few cells were seen to return to their original state at 25 μg / ml. In contrast, when the leader sequence was attached to the carboxyl terminus of the peptide (PNC28 in Table 2), 100% cell death occurred within about 4 days at doses of 50 and 100 μg / ml.

これらの結果は、リーダー配列を優先的にｐ５３ペプチドのＭＤＭ−２部分のカルボキシル末端に加えれば、ペプチドが細胞膜を通り抜け、特に悪性細胞を殺すことができることを示す。表２において、リーダー配列は、ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）である。   These results indicate that if the leader sequence is preferentially added to the carboxyl terminus of the MDM-2 portion of the p53 peptide, the peptide can cross the cell membrane and kill especially malignant cells. In Table 2, the leader sequence is KKWKMRRNQFWVKVQRG (SEQ ID NO: 4).

これらの結果は、対象ペプチドの特異性を示す。すなわち、正帯電残基のリーダーまたはクラスターは、ガン細胞毒性のためには、任意のエフェクターペプチドのカルボキシ末端に置かれなければならない。   These results indicate the specificity of the peptide of interest. That is, the positively charged residue leader or cluster must be placed at the carboxy terminus of any effector peptide for cancer cytotoxicity.

２０〜２２ｇの重さのＮｕ／Ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インディアナポリス、インディアナ州、ｎ＝１０）に、生の膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０^６細胞／マウス）を左の後ろ足部分の皮下（ｓ．ｃ．）に異種移植した。腫瘍が発達して増大することを可能にし、そして毎日の試験の間に、全てのマウスが非常に類似の成長速度で腫瘍を発達させたことを観察した。 Nu / Nu mice weighing 20-22 g (Harlan Laboratories, Indianapolis, Ind., N = 10) were treated with live pancreatic cancer cells BMRPA1. TUC-3 (1 × 10 ⁶ cells / mouse) was xenografted subcutaneously (sc) in the left hind paw region. Tumors were allowed to develop and grow, and during daily testing, it was observed that all mice developed tumors with very similar growth rates.

１２日後、腫瘍は、直径３〜６ｍｍの大きさに達していた。そしてマウスをそれぞれ５匹の２つのグループに分けた。各グループは、Ａｌｚｅｔ（登録商標）浸透圧ポンプの皮下移植を行い、２０ｍｇ／マウスの濃度で各ペプチドを含んでいる全体容量０．０９５ｍｌの通常生理食塩溶液を一定の割合で１４日の規定期間にわたって送達した。マウスの１つのグループには、そのカルボキシ末端においてペネトラチンリーダー配列（配列番号４）と融合しているＰＮＣ−２８（配列番号３に示されるアミノ酸を有しているペプチド）を与えた。そしてもう一つのグループには、次のアミノ酸の配列：ＭＰＦＳＴＧＫＲＩＭＬＧＥ（配列番号２５）を有する同様の大きさのコントロールペプチドを与えた。ポンプを、製造業者のガイドラインに従い、そして無菌条件下で充填した。マウスの皮下に微小ポンプを差し込むポケットを作ることによって、麻酔されたネズミの左側面にポンプを皮下移植した。各ポケットを簡単な縫合で閉じた。それらの内部チャンバーから、ポンプはそれぞれのマウスの中に連続的に０．２５μｌ／時間の量を送達した。マウスが動物施設の隔離区域に返されたときに、外科手術から回復するまでマウスを観察した。その動物はＮｕ／Ｎｕマウスであり、そのため免疫性欠陥であったから、病原体に曝された場合、それらは大いに感染しやすい。従って、外科手術および全ての術前および術後の処置は、無菌のボンネット環境で行った。   After 12 days, the tumor had reached a size of 3-6 mm in diameter. The mice were then divided into two groups of 5 animals each. Each group received a subcutaneous implantation of an Alzet® osmotic pump and a total volume of 0.095 ml of normal saline solution containing each peptide at a concentration of 20 mg / mouse at a constant rate for a specified period of 14 days. Delivered over. One group of mice was given PNC-28 (a peptide having the amino acid shown in SEQ ID NO: 3) fused at its carboxy terminus with a penetratin leader sequence (SEQ ID NO: 4). And another group was given a control peptide of similar size having the following amino acid sequence: MPFSTGKRIMMLGE (SEQ ID NO: 25). The pump was filled according to the manufacturer's guidelines and under aseptic conditions. The pump was implanted subcutaneously on the left side of the anesthetized rat by creating a pocket into which the micropump was inserted under the mouse. Each pocket was closed with a simple suture. From their internal chamber, the pump delivered a volume of 0.25 μl / hour continuously into each mouse. When the mice were returned to the isolated area of the animal facility, they were observed until they recovered from surgery. Because the animals are Nu / Nu mice and therefore immune deficient, they are highly susceptible to infection when exposed to pathogens. Therefore, surgery and all pre- and post-operative procedures were performed in a sterile bonnet environment.

図１に明らかに示されるように、４８〜７２時間の期間以内のマウスへの送達で、ＰＮＣ−２８は、効果的に腫瘍成長を抑制する。それと対照的に、コントロールペプチドＰＮＣ−２９は、通常細胞または腫瘍細胞に影響を与えなかった。ＰＮＣ−２９によって処理されたマウスにおいては、腫瘍は一定の割合で増大し続け、結果として、２週間の処置の期間およびポンプがそれ以上のペプチド溶液を放出することを停止したそれ以後の期間に、直径１０〜１６ｍｍの腫瘍をもたらした。マウスの両方のグループにおける腫瘍の大きさの測定結果の統計上分析により、ｐ＜０．００１というそれらの間の有意性を得た。   As clearly shown in FIG. 1, PNC-28 effectively suppresses tumor growth with delivery to mice within a period of 48-72 hours. In contrast, the control peptide PNC-29 did not affect normal cells or tumor cells. In mice treated with PNC-29, the tumor continued to grow at a constant rate, resulting in a period of 2 weeks of treatment and subsequent periods when the pump stopped releasing any further peptide solution. Resulted in tumors 10-16 mm in diameter. Statistical analysis of tumor size measurements in both groups of mice gave a significance between them of p <0.001.

実施例２と同じ方法を使って、生きている膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０^６細胞／ネズミ）をマウス（ｎ＝１０）の中に移植するのと同時に、ポンプを始動させた。５匹のマウスにＰＮＣ２８を投与し、そして５匹のネズミは、まったく処置しなかった（擬似処置）。結果を以下の表にした。 Using the same method as in Example 2, live pancreatic cancer cells BMRPA1. At the same time that TUC-3 (1 × 10 ⁶ cells / murine) was transplanted into mice (n = 10), the pump was started. Five mice received PNC28 and five mice were not treated at all (sham treatment). The results are shown in the table below.

実施例２と同じ方法を使って、生きている膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０^６細胞／ネズミ）を５匹のマウスの腹腔に移植した。腫瘍細胞移植と同時に、ポンプを右の肩部分に配置した。５匹全てのマウスにおいて、３週間後に目に見える腫瘍はなかった。 Using the same method as in Example 2, live pancreatic cancer cells BMRPA1. TUC-3 (1 × 10 ⁶ cells / murine) was transplanted into the abdominal cavity of 5 mice. Simultaneously with tumor cell transplantation, a pump was placed on the right shoulder. There were no visible tumors after 3 weeks in all 5 mice.

配列番号２または３に示したアミノ酸配列を有しているペプチドを、カルボキシ末端と結合している膜貫通リーダー配列との固相合成によって、１つ以上のＤ型アミノ酸で合成した。固相ペプチド合成法は、Ｃ末端アミドを有するペプチドを生じさせるジシクロヘキシルカルボジミドによる活性化により、それぞれの保護されたアミノ酸残基を、樹脂支持体、好ましくは４−メチル−ベンズヒドリルアミン樹脂にカップリングさせることを伴う。側鎖官能基を、以下のようにして保護した：セリン、トレオニン、グルタミン酸およびアスパラギン酸に対してベンジル；ヒスチジンおよびアルギニンに対してトシル；リシンに対して２−クロロベンジルオキシカルボニル、ならびにチロシンに対して２，６−ジクロロベンジル。カップリングの後に、加えられたアミノ酸のαアミノ基におけるｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を、トリフルオロ酢酸による処理によって除去し、続いてジイソプロピルエチルアミンで中和する。次いで、次の保護された残基を、ペプチド鎖を増殖させて、遊離アミノ基にカップリングさせる。最後の残基を結合させた後、保護されたペプチド樹脂をフッ化水素で処理し、樹脂からペプチドを切断し、そして側鎖官能基を脱保護する。粗生成物は、逆相ＨＰＬＣによってさらに精製することができる。ペプチドを、３つの異なった濃度、すなわち２５、５０、および１００μｌ／ｍｌにおいて膵臓ガン細胞（ＴＵＣ３）のような悪性細胞、形質転換細胞もしくは新生物細胞とインキュベーションして、これらの濃度においてこのような細胞を殺すことの有効性レベルを評価することができる。   Peptides having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 were synthesized with one or more D-type amino acids by solid phase synthesis with a transmembrane leader sequence attached to the carboxy terminus. Solid phase peptide synthesis involves the activation of each protected amino acid residue into a resin support, preferably a 4-methyl-benzhydrylamine resin, by activation with dicyclohexylcarbodiimide to yield a peptide having a C-terminal amide. With coupling. Side chain functional groups were protected as follows: benzyl for serine, threonine, glutamic acid and aspartic acid; tosyl for histidine and arginine; 2-chlorobenzyloxycarbonyl for lysine and for tyrosine 2,6-dichlorobenzyl. After coupling, the t-butyloxycarbonyl protecting group in the α-amino group of the added amino acid is removed by treatment with trifluoroacetic acid followed by neutralization with diisopropylethylamine. The next protected residue is then coupled to the free amino group by growing the peptide chain. After the last residue is attached, the protected peptide resin is treated with hydrogen fluoride to cleave the peptide from the resin and deprotect the side chain functional groups. The crude product can be further purified by reverse phase HPLC. Peptides are incubated with malignant cells, transformed cells or neoplastic cells such as pancreatic cancer cells (TUC3) at three different concentrations, namely 25, 50, and 100 μl / ml, at such concentrations The effectiveness level of killing the cells can be assessed.

配列番号２または配列番号３に示されたアミノ酸配列の逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸を全て有しているレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチドを、Ｄ−アミノ酸を使って合成する。レトロ−インベルソ型は、ＡＢＩ ４３３Ａペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア、米国）を使った標準的なＦｍｏｃ化学によって合成する。以下を参照のこと：［非特許文献２８］。粗生成物を、Ｃ１８分取カラム（Ｖａｒｉａｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニア、米国）による逆相ＨＰＬＣによってさらに精製する。ペプチドの識別を質量分析により確認する。ペプチドをそのカルボキシ末端において膜貫通リーダー配列と融合させ、そして３つの異なった濃度、すなわち２５、５０、および１００μｌ／ｍｌにおいて膵臓ガン細胞（ＴＵＣ３）のような悪性細胞、形質転換細胞もしくは新生物細胞とインキュベーションして、これらの濃度においてこのような細胞を殺すことの有効性レベルを評価することができる。
Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３９：３２３−３３１ Retro-inverso (RI) peptides having all D-amino acids assembled in reverse order of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 are synthesized using D-amino acids. The retro-inverso form is synthesized by standard Fmoc chemistry using an ABI 433A peptide synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). See: [Non-Patent Document 28]. The crude product is further purified by reverse phase HPLC on a C18 preparative column (Varian, Palo Alto, California, USA). The identity of the peptide is confirmed by mass spectrometry. The peptide is fused with a transmembrane leader sequence at its carboxy terminus and malignant, transformed or neoplastic cells such as pancreatic cancer cells (TUC3) at three different concentrations, namely 25, 50 and 100 μl / ml And the level of effectiveness of killing such cells at these concentrations can be assessed.
Ben-Yedida et al. (2002) Molecular Immunology, 39: 323-331.

アミノ酸の全てがＤ型ではない部分および配列番号２または３に示された配列の逆順序ではない部分を有する部分修飾レトロ−インベルソ（ＰＭＲＩ）ペプチドを、ＰＭＲＩ−ペプチドの合成のために必要とされる、適切に保護されたｇｅｍ−ジアミノアルキル部分および２−アルキルマロニル部分を生成するための溶液ベースの化学を使って合成する。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献２９］。アシルアジドおよびアシルアミドのクルチウス転位およびホフマン転位をＰＭＲＩ−ペプチドの合成のために利用する。転位基は、転移の間その構造を維持し、トポグラフィー的に補足的なｇｅｍ−ジアミノアルキル誘導体に光学的に純粋なアミノ酸を変換するための手段を与える。イソシアネート中間体を、過剰のカルボン酸によるＧｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｉｃｋ型反応においてトラップし、Ｎ，Ｎ’−ジアシル化ｇｅｍ−ジアミノアルキル残基との付加体を得る。イソシアネートをＮ−保護アミノ酸でトラップすることにより、レトロ−インベルソ擬似ペプチドユニットを得る。生成した粗構築ブロックおよび擬似ペプチドユニットを精製および特性評価にかける。ペプチドを、そのカルボキシ末端において膜貫通リーダー配列と融合させ、そして３つの異なった濃度、すなわち２５、５０、および１００μｌ／ｍｌにおいて膵臓ガン細胞（ＴＵＣ３）のような悪性細胞、形質転換細胞もしくは新生物細胞とインキュベーションし、これらの濃度においてこのような細胞を殺すことの有効性レベルを評価することができる。
Ｓｃｈｅｉｂｌｅｒ，Ｌ．およびＣｈｏｒｅｖ，Ｍ（２００３）Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｖｏｌ．２２Ｃ）（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，編），５２８−５５１頁，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ A partially modified retro-inverso (PMRI) peptide having a portion in which all of the amino acids are not in the D form and a portion not in the reverse order of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 is required for the synthesis of PMRI-peptide. Synthesized using solution-based chemistry to produce appropriately protected gem-diaminoalkyl and 2-alkylmalonyl moieties. For example, see: [Non-Patent Document 29]. The Curtius and Hoffman rearrangements of acyl azides and acylamides are utilized for the synthesis of PMRI-peptides. The rearrangement group maintains its structure during the transfer and provides a means for converting optically pure amino acids into topographically complementary gem-diaminoalkyl derivatives. The isocyanate intermediate is trapped in a Goldschmidt-Wick type reaction with excess carboxylic acid to give an adduct with an N, N′-diacylated gem-diaminoalkyl residue. By trapping the isocyanate with an N-protected amino acid, a retro-inverso pseudopeptide unit is obtained. The resulting crude building blocks and pseudopeptide units are subjected to purification and characterization. The peptide is fused at its carboxy terminus with a transmembrane leader sequence and malignant cells such as pancreatic cancer cells (TUC3), transformed cells or neoplasms in three different concentrations, namely 25, 50 and 100 μl / ml The level of effectiveness of incubating with cells and killing such cells at these concentrations can be assessed.
Scheibler, L.M. And Chorev, M (2003) In Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weyl) Methods of Organic Chemistry, 4th Edition, Vol. 22C) (Goodman, M., ed.), Pages 528-551, Thieme, Stuttgart.

前述の明細書およびその中で報告された実験結果は、例示的なものであり、本出願人の発明の範囲を限定するものではない。当業者は、本出願人の発明から外れないで、種々の改変ができることは認識するであろう。   The foregoing specification and experimental results reported therein are exemplary and are not intended to limit the scope of Applicants' invention. Those skilled in the art will recognize that various modifications can be made without departing from the Applicant's invention.

膵臓ガン細胞を異種移植された同種接合ＮＵ／ＮＵマウスにおけるＰＮＣ−２８（そのカルボキシ末端において配列番号４に融合された配列番号３）のインビボ腫瘍抑制効果を図式的に示す。星印の付いた矢印は、腫瘍増殖期間の１３日目（正確には１３．５日）における皮下ポンプ移植の時点を示す。3 schematically shows the in vivo tumor suppressive effect of PNC-28 (SEQ ID NO: 3 fused to SEQ ID NO: 4 at its carboxy terminus) in allogeneic NU / NU mice xenografted with pancreatic cancer cells. The arrow with an asterisk indicates the time of subcutaneous pump implantation at day 13 (exactly 13.5 days) of the tumor growth period.

Claims (28)

アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続アミノ酸を含むペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体であって、ここで、前記ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、そのカルボキシル末端において膜貫通リーダー配列と融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有し、その中の少なくとも１つのアミノ酸がＤ−アミノ酸であるか、または少なくとも１つのペプチド結合がイソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合であるペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   A peptide comprising at least about 6 consecutive amino acids of the amino acid sequence: PPLSQETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1) or an analog or derivative thereof, wherein the peptide or analog or derivative thereof is a transmembrane leader sequence at its carboxyl terminus And is selectively lethal to malignant or transformed cells, in which at least one amino acid is a D-amino acid, or at least one peptide bond is an isostere pseudopeptide bond or retro A peptide which is an inverso pseudopeptide bond or an analogue or derivative thereof. アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の逆順序で組み立てられた少なくとも６つの連続的なＤ−アミノ酸を含むレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体であって、ここで、前記ＲＩペプチドは、そのカルボキシル末端において膜貫通リーダー配列と融合し、そして前記ペプチドは、悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有するＲＩペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   A retro-inverso (RI) peptide comprising at least 6 consecutive D-amino acids assembled in reverse order of amino acid sequence: PPLSQETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 1) or an analog or derivative thereof, wherein said RI peptide Is an RI peptide or analog or derivative thereof that is fused at its carboxyl terminus to a transmembrane leader sequence and the peptide is selectively lethal to malignant or transformed cells. 少なくとも６つの連続アミノ酸を含む部分修飾レトロ−インベルソ（ＰＭＲＩ）ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体であって、ここで、前記少なくとも６つの連続アミノ酸の一部が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸であり、前記ＰＭＲＩペプチドは、そのカルボキシル末端において膜貫通リーダー配列と融合し、悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有するＰＭＲＩペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   A partially modified retro-inverso (PMRI) peptide comprising at least 6 consecutive amino acids or an analog or derivative thereof, wherein a part of the at least 6 consecutive amino acids is the reverse of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A PMRI peptide or analog thereof or a derivative thereof, which is a D-amino acid assembled in order, wherein the PMRI peptide is fused with a transmembrane leader sequence at its carboxyl terminus and is selectively lethal to malignant cells or transformed cells Derivative. アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を含む、請求項１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   The peptide of claim 1 or an analog or derivative thereof, comprising the amino acid sequence: PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2) or ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3). アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）の逆順序で組み立てられた少なくとも６つの連続的なＤ−アミノ酸を含む、請求項２に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   3. The peptide of claim 2 or an analog or derivative thereof, comprising at least 6 consecutive D-amino acids assembled in reverse order of amino acid sequence: PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2) or ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3). 前記少なくとも６つのＤ−アミノ酸が、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）の逆順序で組み立てられた、請求項３に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   4. The peptide according to claim 3, or an analog or derivative thereof, wherein the at least six D-amino acids are assembled in the reverse order of the amino acid sequence: PPLSQETFS (SEQ ID NO: 2) or ETFSDLWKLL (SEQ ID NO: 3). 前記ペプチドのＮ−末端アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   The peptide according to claim 1 or an analog or derivative thereof, wherein the N-terminal amino acid of the peptide comprises a D-amino acid. 前記膜貫通リーダー配列のカルボキシ末端アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   The peptide of claim 1, wherein the carboxy terminal amino acid of the transmembrane leader sequence comprises a D-amino acid, or an analog or derivative thereof. 前記ペプチドのＮ−末端ペプチド結合が、イソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換されている、請求項１に記載のペプチド。   2. The peptide of claim 1, wherein the N-terminal peptide bond of the peptide is substituted with an isostere pseudopeptide bond or a retro-inverso pseudopeptide bond. 前記膜貫通リーダー配列が、以下に示すものの内の少なくとも１つである、請求項１から請求項９に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体：ペネトラチン（配列番号４）、Ａｒｇ_８（配列番号２６）、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するポリ−Ｒ、ＨＩＶ−１のＴＡＴ（配列番号５）、Ｄ−ＴＡＴ（配列番号６）、Ｒ−ＴＡＴ（配列番号７）、ＳＶ４０−ＮＬＳ（配列番号８）、ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ（配列番号９）、ＨＩＶ ＲＥＶ（配列番号１０）、ＦＨＶコート（配列番号１１）、ＢＭＶ ＧＡＧ（配列番号１２）；ＨＴＬＶ−ＩＩ（ＲＥＸ）（配列番号１３）、ＣＣＭＶ ＧＡＧ（配列番号１４）、Ｐ２２Ｎ（配列番号１５）；Ｌａｍｂｄａ Ｎ（配列番号１６）、Ｐｈｉ Ｎ（配列番号１７）、酵母ＰＲＰ６（配列番号１８）；ヒトＵ２ＡＦ（配列番号１９）、ヒトＣ−ＦＯＳ（配列番号２０）、ヒトＣ−ＪＵＮ（配列番号２１）、酵母ＧＣＮ４（配列番号２２）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２３）、またはｐ−ｖｅｃ（配列番号２４）。 The peptide of claim 1 to 9, or an analog or derivative thereof: penetratin (SEQ ID NO: 4), Arg ₈ (SEQ ID NO: 26), wherein the transmembrane leader sequence is at least one of the following: ), Poly-R having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, HIV-1 TAT (SEQ ID NO: 5), D-TAT (SEQ ID NO: 6), R-TAT (SEQ ID NO: 7), SV40-NLS (sequence) No. 8), nucleoplasmin-NLS (SEQ ID NO: 9), HIV REV (SEQ ID NO: 10), FHV coat (SEQ ID NO: 11), BMV GAG (SEQ ID NO: 12); HTLV-II (REX) (SEQ ID NO: 13), CCMV GAG (SEQ ID NO: 14), P22N (SEQ ID NO: 15); Lambda N (SEQ ID NO: 16), Phi N (SEQ ID NO: 17), yeast P RP6 (SEQ ID NO: 18); human U2AF (SEQ ID NO: 19), human C-FOS (SEQ ID NO: 20), human C-JUN (SEQ ID NO: 21), yeast GCN4 (SEQ ID NO: 22), KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 23), Or p-vec (SEQ ID NO: 24). 前記膜貫通リーダー配列がＤ−アミノ酸を含むか、または少なくとも１つのペプチド結合が、イソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換されている、請求項１０に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   11. The peptide of claim 10 or an analog thereof or an analog thereof, wherein the transmembrane leader sequence comprises a D-amino acid or at least one peptide bond is replaced with an isostere pseudopeptide bond or a retro-inverso pseudopeptide bond. Derivative. 前記膜貫通リーダー配列が、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示された配列のいずれかと逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含む、請求項１１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   12. The peptide of claim 11 or an analog thereof or an analogue thereof, wherein the transmembrane leader sequence comprises all D-amino acids assembled in reverse order with any of the sequences shown in SEQ ID NOs: 4-24 or SEQ ID NOs: 26-27. Its derivatives. 前記膜貫通リーダー配列が、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示された配列のいずれかと逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸の一部を含む、請求項１１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。   12. The peptide of claim 11 or a peptide thereof, wherein the transmembrane leader sequence comprises a portion of a D-amino acid assembled in reverse order with any of the sequences shown in SEQ ID NOs: 4-24 or SEQ ID NOs: 26-27. Analog or derivative thereof. 薬学上受容できる担体と混合された、少なくとも１つの請求項１から請求項９に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を含む薬剤組成物。   10. A pharmaceutical composition comprising at least one peptide according to claims 1 to 9 or an analogue or derivative thereof, mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. 薬学上受容できる担体と混合された、少なくとも１つの請求項１０に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を含む薬剤組成物。   11. A pharmaceutical composition comprising at least one peptide according to claim 10 or an analogue or derivative thereof in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. 薬学上受容できる担体と混合された、少なくとも１つの請求項１１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を含む薬剤組成物。   A pharmaceutical composition comprising at least one peptide according to claim 11 or an analogue or derivative thereof in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. 薬学上受容できる担体と混合された、少なくとも１つの請求項１２に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を含む薬剤組成物。   13. A pharmaceutical composition comprising at least one peptide according to claim 12 or an analogue or derivative thereof in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. 薬学上受容できる担体と混合された、少なくとも１つの請求項１３に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を含む薬剤組成物。   14. A pharmaceutical composition comprising at least one peptide according to claim 13 or an analogue or derivative thereof, mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. 治療有効量の、少なくとも１つの請求項１から請求項９に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することを含む、被検体の悪性細胞、新生物細胞を選択的に殺す方法。   10. selectively killing malignant cells, neoplastic cells of a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of at least one peptide of claim 1 to 9 or analog or derivative thereof. Method. 治療有効量の、少なくとも１つの請求項１０に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することを含む、被検体の悪性細胞、新生物細胞を選択的に殺す方法。   A method for selectively killing malignant cells or neoplastic cells of a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of at least one peptide according to claim 10 or an analog or derivative thereof. 治療有効量の、少なくとも１つの請求項１１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することを含む、被検体の悪性細胞、新生物細胞を選択的に殺す方法。   A method for selectively killing malignant cells or neoplastic cells of a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of at least one peptide according to claim 11 or an analog or derivative thereof. 治療有効量の、少なくとも１つの請求項１２に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することを含む、被検体の悪性細胞、新生物細胞を選択的に殺す方法。   A method for selectively killing malignant cells or neoplastic cells of a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of at least one peptide according to claim 12 or an analog or derivative thereof. 治療有効量の、少なくとも１つの請求項１３に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することを含む、被検体の悪性細胞、新生物細胞を選択的に殺す方法。   A method for selectively killing malignant cells or neoplastic cells of a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of at least one peptide according to claim 13 or an analog or derivative thereof. 悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法であって、
請求項１から請求項９に記載のいずれかにペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、
生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいたペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない細胞の増殖へのその影響を評価する工程、
を含む方法。 A method for assessing the effectiveness level of a peptide in selectively killing malignant cells, transformed cells or neoplastic cells, comprising:
Contacting the peptide or analog thereof or derivative thereof according to any one of claims 1 to 9 with a malignant cell, neoplastic cell or transformed cell in vitro;
Assessing the effectiveness level of the peptide based on the proportion or percentage of dead cells compared to living cells and its effect on the growth of untransformed cells in culture;
Including methods. 悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法であって、
請求項１０に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、
生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいたペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない細胞の増殖へのその影響を評価する工程、
を含む方法。 A method for assessing the effectiveness level of a peptide in selectively killing malignant cells, transformed cells or neoplastic cells, comprising:
Contacting the malignant cell, neoplastic cell or transformed cell in vitro with the peptide or analog or derivative thereof according to claim 10;
Assessing the effectiveness level of the peptide based on the proportion or percentage of dead cells compared to living cells and its effect on the growth of untransformed cells in culture;
Including methods. 悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法であって、
請求項１１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、
生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいたペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない細胞の増殖へのその影響を評価する工程、
を含む方法。 A method for assessing the effectiveness level of a peptide in selectively killing malignant cells, transformed cells or neoplastic cells, comprising:
Contacting the peptide of claim 11 or an analog or derivative thereof with a malignant cell, neoplastic cell or transformed cell in vitro;
Assessing the effectiveness level of the peptide based on the proportion or percentage of dead cells compared to living cells and its effect on the growth of untransformed cells in culture;
Including methods. 悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法であって、
請求項１２に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、
生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいたペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない細胞の増殖へのその影響を評価する工程、
を含む方法。 A method for assessing the effectiveness level of a peptide in selectively killing malignant cells, transformed cells or neoplastic cells, comprising:
Contacting the peptide according to claim 12 or an analog or derivative thereof with a malignant cell, neoplastic cell or transformed cell in vitro;
Assessing the effectiveness level of the peptide based on the proportion or percentage of dead cells compared to living cells and its effect on the growth of untransformed cells in culture;
Including methods. 悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法であって、
請求項１３に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、
生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいたペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない細胞の増殖へのその影響を評価する工程、
を含む方法。 A method for assessing the effectiveness level of a peptide in selectively killing malignant cells, transformed cells or neoplastic cells, comprising:
Contacting the malignant cell, neoplastic cell or transformed cell in vitro with the peptide of claim 13 or an analog or derivative thereof;
Assessing the effectiveness level of the peptide based on the proportion or percentage of dead cells compared to living cells and its effect on the growth of untransformed cells in culture;
Including methods.