KR20020075797A

KR20020075797A - 엔도텔린 유발성 질환 치료제

Info

Publication number: KR20020075797A
Application number: KR1020027010589A
Authority: KR
Inventors: 유야마히로노리; 후지모리아키라; 사나기마사나오; 하라다히로노리; 고아쿠쓰아키코; 모리미키코; 야마모토노부유키
Original assignee: 야마노우치세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2002-10-05
Also published as: WO2001060370A1; HUP0204139A3; AU2000279614A1; EP1256344B1; CN1434715A; EP1256344A4; RU2002124599A; ES2277856T3; DE60032517D1; EP1256344A1; DE60032517T2; JP3832229B2; US6774131B1; JP2006176542A; ATE348617T1; BR0017120A; HUP0204139A2; JP2001302514A; CA2395711A1; AR031679A1

Abstract

N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로서 함유하는, 전립선암 치료용 약제학적 조성물.

Description

엔도텔린 유발성 질환 치료제{Remedies for endothelin-induced diseases}

N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디딜)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 이의 염은 국제 공개공보 제97/22595호에 기재되어 있으며, 엔도텔린 ET_A수용체에 대한 ET-1의 결합을 억제하는 작용 및 ET-1 유발성 혈관 수축 및 승압을 억제하는 작용이 개시되어 있으며 심혈관계 질환을 위시해서 엔도텔린이 관여하는 각종 질환의 치료에 사용할 수 있다는 것이 시사되어 있다.

본 발명자는 신규한 치료제의 제조를 목적으로 하여 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 이의 염의보다 구체적인 질환에 대한 치료 가능성에 관해 예의 검토하였다.

본 발명은 의약, 특히 전립선암 등의 엔도텔린 유발성 질환의 동통 완화제; 조골성(造骨性) 병변의 개선제 및/또는 조골에 따르는 동통 완화제; 전립선암의 골 전이에 따른 조골성 병변의 개선제 및/또는 전립선암의 골 전이에 수반되는 동통 완화제; 전립선암의 세포 증식 억제제; 또는 전립선암의 진행 억제제에 관한 것이다.

도 1은 포르말린 동통에 대한 ET-1에 의한 증강작용(A. 제1기, B. 제2기, C. 부종)을 도시한 것이다.

도 2는 포르말린 동통의 ET-1에 의한 증강작용에 대한 화합물 1의 억제작용(A. 제1기, B. 제2기, C. 부종)을 도시한 것이다.

도 3은 마우스 골아세포형 세포 MC3T3-E1의 ET-1 유발 세포내 Ca²⁺농도 상승에 대한 화합물 1의 억제효과를 도시한다.

도 4는 마우스 골아세포형 세포인 MC3T3-E1에서 ET-1 유발 세포 증식([³H]-티미딘 혼입)을 억제하는 화합물 1의 효과를 도시한 것이다.

도 5는 마우스 골아세포형 세포 MC3T3-E1에서 ET-1 유발성 세포 증식(세포수)을 억제하는 화합물 1의 효과를 도시한 것이다.

도 6은 호르몬 불응성 사람 전립선암 세포 PPC-1에서 ET-1 유발성 세포 증식을 억제하는 화합물 1의 효과를 도시한 것이다.

본 발명을 실시하기 위한 최선의 방식

하기 실시예 및 시험 실시예에 근거하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만 본 발명은 이들 실시예 등으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예 등에서 사용하는 화합물 1은 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드·칼륨염을 의미한다.

그 결과, 본 발명자는 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 이의 염이 암(특히 전립선암, 유방암, 난소암), 관절염, 전립선염, 신경 교종, 말초동맥 폐색증, 월경곤란증, 편두통, 협심증, 급성 심근경색, 뇌경색, 지주막하 출혈, 당뇨병성 신경장애, 류마티즈 관절염, 녹내장, 소화성 궤양, 출산시의 진통 등의 엔도텔린 유발성 질환의 동통 완화에 효과적인 것을 밝혀내고 본 발명을 완성하였다.

ET-1은 사람이나 실험동물에서 동통을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 예를 들면, 사람의 상완 동맥에 ET-1을 투여하면 허혈성의 근육통이 야기된다[참조: J. Hypertension, 8, 811-817, 1990]. 또한, 동통 모델로서 범용되고 있는 마우스 포르말린 동통 모델에서, ET-1이 포르말린에 의한 동통의 제1기 및 제2기를 유의적으로 증강시킨다는 것이 보고되어 있다[참조: Can. J. Physiol. Pharmacol., 75, 596-600, 1997]. 본 모델에서, 제1기는 지각 신경의 직접 자극에 의한 동통을 의미하며, 제2기는 염증성 2차 반응에 의한 동통을 의미한다[참조: Pain, 38, 247-352, 1989].

하기 시험 실시예 1에 기재된 바와 같이, 본 발명의 유효성분은 마우스 포르말린 동통 모델에서 ET-1에 의한 동통의 증강을 억제하는 작용을 나타낸다.

또한, 본 발명자는 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 이의 염이 조골성 병변의 개선 및/또는 조골에 수반되는 동통의 완화에 효과적임을 밝혀내고 발명을 완성하였다.

파골 세포를 억제하는 작용을 가지며 골 대사를 개선시키는 비스포스포네이트는 유방암의 골 전이에 따르는 골 동통을 개선하는 효과를 가지기 때문에, 장기적인 골 병변의 개선은 골 동통의 개선에 결부된다고 생각된다. 유방암 골 전이 환자와 달리, 전립선암 환자에서 조골성 골 전이 병변이 관찰되지만[참조: Semin., 0ncol., 21, 630-656, 1996], 골아 세포에 작용하여 골 대사를 개선시키는 약물이 전립선암의 골 전이에 수반되는 골 동통을 개선시키는 효과를 갖는 것으로 예상된다.

ET-1은, 마우스 골아세포형 세포인 MC3T3-E1 및 랫트 두개골로부터 초대(初代) 배양한 골아 세포에서 ET_A수용체를 통해 세포내 Ca²⁺농도를 상승시키거나 DNA 합성을 증가시키거나 ALP 활성을 저하시키는 작용을 나타내는 것으로 보고되어 있다[참조: Am. J. Physiol., 257, E797-E803, 1989/Biochem. Biophys. Res. Commun., 170(3), 998-1005, 1990/ Bone, 21(2), 143-146, 1997].

하기 시험 실시예 2에 기재된 바와 같이, 본 발명의 유효 성분은 마우스 골아세포형 세포인 MC3T3-E1의 ET-1 유발성 세포 반응을 억제하는 작용을 나타낸다.

또한, 본 발명자는 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 이의 염이 전립선암의 골 전이에 수반되는 동통을 완화하거나 전립선암의 골 전이에 의한 조골성 병변을 개선시키는데 효과적임을 밝혀내고 발명을 완성하였다.

사람 전립선암 세포주가 ET-1 생성능을 가지고[참조: Nat. Med., 1(9), 944-949, 1995] ET_A수용체를 통해 증식능을 나타내며[참조: Cancer Res, 56, 663-668, 1996] 골 전이를 갖는 전립선암 환자에서는 골 전이를 갖지 않은 전립선암 환자와 비교하여 혈장중의 ET-1 농도가 상승된다는 것[참조: Nat. Med., 1(9), 944-949, 1995]이 보고되어 있으며, 이들 보고와 시험 실시예 1 및 2의 결과를 함께 생각하면, 본 발명의 유효성분은 특히, 전립선암 환자의 골 전이에 수반되는 동통 개선 또는 전립선암의 골 전이에 의한 조골성 병변의 개선에 효과적인 것으로 강하게 시사된다. 또한, 하기 시험 실시예 5에 기재된 바와 같이, 본 발명의 유효성분은 전립선암 환자의 동통 스코어 및 진통제의 사용량을 저하시켜 골 세포 마커를 감소시킨다.

또한, 본 발명자는 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 이의 염이 전립선암의 암 세포 증식 억제에 효과적임을 밝혀내고 본 발명을 완성하였다.

하기 시험예 3과 4에 기재된 바와 같이, 본 발명의 유효성분은 호르몬 불응성 사람 전립선암 세포의 ET-1에 의한 세포 증식을 억제하는 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명자는 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 이의 염이 전립선암의 진행 억제에 효과적임을 밝혀내고 본 발명을 완성하였다.

하기 시험 실시예 5에 기재된 바와 같이, 본 발명의 유효성분은 전립선암 환자의 전립선암 마커의 증대를 억제 또는 저하시킨다.

즉, 본 발명은, N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로서 함유하는, 암(특히 전립선암, 유방암, 난소암), 관절염, 전립선염, 신경 교종, 말초동맥 폐색증, 월경곤란증, 편두통, 협심증, 급성 심근경색, 뇌경색, 지주막하 출혈, 당뇨병성 신경장애, 류마티즈 관절염, 녹내장, 소화성 궤양, 출산시의 진통 등의 엔도텔린 유발성 질환의 동통 완화용 약제학적 조성물; 조골성 병변의 개선용 약제학적 조성물 및/또는 조골에 수반되는 동통 완화용 약제학적 조성물, 특히 전립선암의 골 전이에 따른 조골성 병변 개선용 약제학적 조성물; 및/또는 전립선암의 골 전이에 따르는 동통 완화용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 전립선암 등의 엔도텔린 유발성 질환의 동통 완화제; 조골성 병변의 개선제 및/또는 조골에 수반되는 동통 완화제, 특히 전립선암의 골 전이에 따른 조골성 병변 개선제 및/또는 전립선암의 골 전이에 수반되는 동통 완화제의 제조를 위한, N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는, 전립선암 등의 엔도텔린 유발성 질환의 동통및/또는 조골에 수반되는 동통, 특히 전립선암의 골 전이에 수반되는 동통의 완화방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는, 조골성 병변, 특히 전립선암의 골 전이에 따른 조골성 병변의 개선방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로서 함유하는, 전립선암의 암 세포 증식 억제용 약제학적 조성물 및/또는 전립선암의 진행 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 전립선암의 암 세포 증식 억제제 및/또는 전립선암의 진행 억제제를 제조하기 위한, N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는, 전립선암의 암 세포의 증식 및/또는 전립선암의 진행의 억제방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 유효성분은 특히 경구 흡수성이 우수하므로 우수한 경구 치료제가 될 수 있다. 하기 시험 실시예 6에 기재된 바와 같이, 본 발명의 유효성분은 사람에게 경구 투여한 경우의 혈장중 농도가 공지된 ET_A수용체 길항제인 ABT-627[1-(N,N-디부틸카바모일메틸)-2(R)-(4-메톡시페닐)-4(S)-(3,4-메틸렌디옥시페닐)피롤리딘-3(R)-카복실산]의 1/2배 양이고 AUC가 약 18배로서 현저하게 우수하다.

하기에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분은 N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다. 이러한 염으로 국제 공개특허공보 제97/22595호에 기재된 염을 들 수 있으며 구체적으로는 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 무기 산(예: 황산, 질산 및 인산), 유기산(예: 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 아스파르트산 및 글루탐산)과의 산 부가염 및 무기 염기(예: 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 알루미늄) 및 유기 염기(메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민, 라이신, 오르니틴)와의 염이나 암모늄 염 등을 들 수 있다. 특히 바람직한 것으로서 칼륨염을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 유효성분에는 각종 이성체의 혼합물 및 이의 단리된 각종 이성체, 수화물 및 용매화물 모두가 포함된다. 또한 본 발명의 유효성분 중에는 결정 다형을 갖는 화합물도 있으며 이들 결정형 모두를 포함한다.

이들 화합물은 상기한 국제 공개특허공보 제97/22595호에 기재된 제법에 따라, 또는 이에 준해 용이하게 입수할 수 있다.

본 발명의 약제는 경구 또는 비경구 투여에 적합한 유기 또는 무기의 담체, 부형제 또는 기타 첨가제를 사용하여 통상적인 방법에 따라서 경구 고형 제제, 경구 액형 제제 또는 주사제로서 조제할 수 있다. 본 발명 약제학적 조성물의 유효성분은 우수한 경구 흡수성을 갖기 때문에, 본 발명의 약제는 경구 제제에 적합하다. 가장 바람직한 것은 환자가 스스로 용이하게 복용할 수 있으며 보존 및 소지 운반에 편리한 경구 고형 제제이다.

경구 고형 제제로는 정제, 산제, 세립제, 과립제, 캡슐제, 환제, 서방(徐放)제 등이 사용된다. 이러한 고형 제제에서, 하나 이상의 활성 물질이 하나 이상의 불활성 희석제, 예를 들면, 락토스, 만니톨, 글루코스, 미세결정 셀룰로스, 전분, 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 및 메타실리케이트 알루미네이트 마그네슘과 혼합된다. 조성물은 통상적인 방법에 따라서 불활성 희석제 이외의 첨가제, 예를 들면, 하이드록시프로필 셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸 셀룰로스(HPMC)와 같은 결합제; 마그네슘 스테아레이트, 폴리에틸렌글리콜, 전분 및 활석과 같은 윤활제; 섬유소 칼슘 글리콜레이트 및 칼멜로스 칼슘과 같은 붕해제; 락토스와 같은 안정화제; 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 용해 보조제; 폴리에틸렌 글리콜과 같은 가소제; 산화티탄, 활석 및 황색 산화철과 같은 착색제를 함유할 수 있다. 정제 또는 환제는 필요에 따라 슈크로스, 젤라틴, 한천, 펙틴, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스프탈레이트 등의 당의나 위용성 또는 장용성 물질의 필름으로 피복될 수 있다.

경구 액상 제제는 약제학적으로 허용되는 유제, 액제, 현탁제, 시럽제 및 엘릭서제 등을 포함하며 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 정제수 및 에탄올을 포함한다. 이러한 조성물은 불활성 희석제 이외에, 습윤제 및 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제 및 방부제를 함유할 수 있다.

정맥 주사, 근육 주사 및 피하 주사용 주사제로서는 멸균 수성 또는 비수성의 액제, 현탁제, 유탁제를 포함한다. 수성 액제 및 현탁제의 희석제로는, 예를 들면, 주사용 증류수 및 생리 식염수가 포함된다. 비수용성의 액제 및 현탁제의 희석제로는 예를 들면, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브유와 같은 식물성 오일, 에탄올과 같은 알콜류 및 폴리소르베트 80 등이 있다. 이러한 조성물은 추가로 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예: 락토스) 및 용해보조제(예: 글루탐산, 아스파라긴산)와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 이들은, 예를 들면, 세균 보관 필터를 통한 여과, 멸균제와의 배합 또는 조사에 의해 멸균시킨다. 이들은 또한 멸균 고체 조성물을 제조하고 사용전에 멸균수 또는 멸균 주사용 용매 속에 용해하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 화합물의 투여량은 투여 경로, 질환의 증상, 투여 대상의 나이 및 성별 등을 고려하여 개개의 경우에 따라 적절하게 결정되지만 통상적으로 경구 투여의 경우, 성인 1인당 유효성분 약 0.1 내지 500mg/일, 바람직하게는 1 내지 250mg/일이며, 이는 1회 내지 2회에 나누어 투여된다.

또한, 본 발명의 약제는 기타 동통 완화제와 동시에 또는 시간을 두고 병용할 수 있다. 예를 들면, 전립선암 및 유방암 등의 암성 동통에 대하여는, WHO 방식 암성 동통 치료법에서 사용되고 있는 모르핀 등의 강한 아편양 진통제, 펜타조신 및 부프레노르핀 등의 약한 아편양 진통제, 인도메타신 및 이부프로펜 등의 비스테로이드성 소염 진통제를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약제는 엔도텔린 유발성 질환의 치료에 사용되는 기타 약제와 동시에 또는 시간을 두고 병용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약제와 병용할 수 있는, 전립선암의 치료제로는 이포스파미드, 테가푸르·우라실 등의 항악성 종양제, 에티닐에스트라디올 등의 에스트로겐, 하이드로코르티손, 프레드니솔론 및 베메타존 등의 부신 피질 호르몬, 클로로프로마존 아세테이트 등의 프로게스트론, 류프로레린 아세테이트 등의 LH-RH 유도체, 고세레린 아세테이트 등의 LH-RH 효능제, 시스플라틴 등의 항악성 종양 백금 착화합물, 플루타미드 등의 항안드로겐제, 포스페스트롤 및 인산에스트라무스틴나트륨 등의 전립선암 치료제 및 페플로마이신 설페이트 등의 항종양성 항생제를 들 수 있다.

실시예1 캡슐제

성분명	2mg 캡슐	10mg 캡슐	20mg 캡슐
화합물 1	2.0mg	10mg	20.0mg
락토스	298.0mg	290.0mg	280.0mg
총계	300.0mg	300.0mg	300.0mg

상기 성분을 함께 혼합하며 캡슐내에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

시험 실시예 1

마우스 포르말린 동통 모델에서 ET-1에 의한 동통 증강 작용을 억제하는 화합물 1의 효과

(방법)

①사용되는 동물

본 실험에서는 수컷 ICR계 마우스(5주령, 일본 SLC)를 사용한다.

②동통 반응의 측정

마우스를 관찰용 케이지에 투입하고, 5분 이상 환경에 익숙하게 한 다음, 마우스의 좌측 뒷발에 생리식염수를, 우측 뒷발에 0.7% 포르말린 함유 생리식염수를 각각 20㎕씩 피하 투여한다. 그 직후에 출현하는 핥기(licking) 및 물어뜯기(biting) 반응의 지속 시간을 40분 동안 5분 마다 계측한다. 계측 종료후, 양쪽 발목을 절단하여 중량을 측정한다. 포르말린 투여 직후로부터 5분 동안의 반응 시간을 제1기, 투여 후 10분 내지 40분까지 30분 동안의 반응시간의 총계를 제2기로 정의하여 동통의 지표로 한다. 또한, 우측 발 중량-좌측 발 중량(mg)에 의해 산출된 부종을 염증성 반응의 지표로 사용한다. 또한 핥기 반응 시간의 계측은 모든 경우 10:00와 18:00 사이에 실시한다.

③피검약

ET-1을 함유하는 0.7% 포르말린 함유 생리 식염수를 3, 10, 30pmol/발의 용량으로 우측 뒷발에 피하 투여하고, 포르말린 동통 및 부종을 증강시키는 ET-1의작용을 검토한다.

화합물 1(0.3 내지 3mg/kg)을 1㎖/100g의 용량으로 경구 투여하고 투여한지 60분 후에 ET-1(10pmol/발)를 함유하는 0.7% 포르말린 함유 생리식염수를 우측 뒷발에 피하 투여하고 포르말린 동통 및 부종의 ET-1 유발성 증강 작용에 대한 화합물 1의 효과를 검토한다.

④통계 처리

결과는 평균치±표준 오차로 나타낸다. 두 그룹 간의 유의차 검정은 스튜던트 비쌍체 t-검정(Studuent unpaired t-test)에 의해 p값을 산출한다. 다수 그룹간의 유의차 검정은 원-웨이 분산분석으로 분석하고 더네트 다중 범위 검정(Dunnett's multiple range test)에 의해 p값을 산출한다. p값이 5% 이하인 경우를 유의적이라고 정의한다.

(결과)

①포르말린 동통 및 부종의 ET-1에 의한 증강작용

0.7% 포르말린 용액을 마우스 뒷발에 피하 투여함으로써 2상 동통 반응이 확인된다. 투여 직후로부터 5분 이내에 출현하는 일과성 동통 반응(핥기 및 물어뜯기 반응; 제1기)과 포르말린 용액 투여후 20분 전후를 피크로 하는 지속성 동통반응(제2기)이 확인된다(도 1A, 1B). 또한, 0.7% 포르말린 용액을 투여함으로써 뒷 다리에 부종이 야기된다(도 1C).

포르말린 용액과 ET-1(3, 10, 30pmol/발)을 동시에 투여하면 제1기, 제2기 및 부종이 또한 용량 의존적으로 유의적으로 증강된다(도 1A, 1B 및 1C).

②포르말린 동통의 ET-1에 의한 증강작용에 대한 피검약의 작용

화합물 1(0.3, 1.3mg/kg, p.o.)는 ET-1(10pmol/발)에 의해 유발된 포르말린 동통(제1기, 제2기) 및 부종의 증강작용을 유의적으로 억제한다(도 2A, 2B 및 2C).

시험 실시예 2

골아세포형 세포 MC3T3-E1의 ET-1 유발 세포 증식에 대한 억제시험

(방법)

①사용되는 세포

본 실험에는 마우스 골아세포형 세포 MC3T3-E1을 사용한다[참조: Journal of Cell B1010gy, 96(1), 191-198, 1983].

②세포내 Ca²⁺농도 측정

세포를 셀 데스크(직경 13.5mm)에서 배양하고, 융합점에 도달한 후에 혈청의 부재하에 약 12시간 이상 배양한 후 본 실험에 사용한다. Hank's balanced salt solution(HBSS)(140mM NaCl, 4mM KCl, 1mM K₂HPO₄, 1mM MgCl₂, 1mM CaCl₂, 10mM 글루코스, 20mM Hepes, pH= 7.4)중 세포에 Fura 2-AM(4μM)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한다. HBSS가 투입된 석영 셀에 셀 데스크를 고정하고, 세포내 Ca²⁺측정 장치(CAF-110) 내에 석영 셀을 장착하여 37℃에서 교반기를 사용하여 교반 조건하에 정상 상태에 도달한 경우 실험을 개시한다. 세포내 Ca²⁺농도의 측정은340/380nm 여기 파장에 의한 500nm의 형광 강도비를 측정하고 수득된 형광 강도비로부터 계산식에 의해 세포내 Ca²⁺농도를 산출한다[참조: J. Biol. Chem., 260, 3440-3450, 1985].

③DNA 합성량 측정

DNA 합성량은 [³H]-표지된 티미딘의 혼입량을 측정한다. 세포를 FCS 0.2%의 배지를 사용하여 1.5×10⁴세포/웰의 비율로 96-웰 플레이트에 접종하고 2일 동안 배양한다. 이어서 용매 및 ET-1을 가하고 24시간 동안 배양한다. 계속해서 배양액에 [³H-메틸]-티미딘을 0.5μ Ci/웰로 첨가하여 6시간 동안 펄스-표지한다. 계속해서 최종 농도가 O.2%가 되도록 SDS 용액을 첨가하여 세포를 용해시킨 다음, DNA 합성에 사용된 [³H-메틸]-티미딘의 방사능을 액체 신틸레이션 카운터로 측정한다. 대조군로서 용매를 첨가한 측정치를 100%로 정의하고 DNA 합성 증가율을 산출한다.

④세포수 측정

세포수는 셀 카운팅 키트(Cell Counting Kit, 공급원: DOJINDO)의 시약 용액을 사용하여 측정한다. 세포를 FCS 0.5%의 배지를 사용하여 1.0×10⁴세포/웰의 비율로 24-웰 플레이트에 접종하여 1일 동안 배양한다. 이어서 용매 및 ET-1을 가하여 72시간 동안 배양한다. 계속해서 배양액에 시약 용액을 100㎕/웰로 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양한다. 반응 후, 24-웰 플레이트의 각 웰로부터 200㎕씩96-웰 플레이트로 옮기고 흡광도(파장 405nm, 참조 파장 650nm)를 플레이트 리더로 측정한다. 대조군로서 용매를 가한 측정치를 100%로 정의하고 세포수 증가율을 산출한다.

⑤피검약

각각의 실험에서, ET-1 및 화합물 1은 이의 최종 농도로서 10^-13내지 10^-6및 10^-12내지 10^-4M의 농도 범위(모두 10배 비율)로 시험한다. 화합물 1은 세포내 Ca²⁺농도 측정의 경우 ET-1을 첨가하기 약 2분전에, 그 이외의 실험에서는 ET-1을 첨가하기 약 2시간 전에 첨가한다.

⑥통계처리

결과는 평균치±표준 오차로 나타낸다. 그룹간의 유의차 검정은 원-웨이 분산분석으로 해석하여 더네트 다중 범위 검정에 의해 p값을 산출한다. p값이 5% 이하인 경우를 유의적이라고 정의한다. 각 실험의 ET-1의 EC₅₀값 및 화합물의 IC₅₀값은 로지스틱 회귀법에 의해 산출한다.

(결과)

①MC3T3-E1에서 ET-1에 의해 유발된 세포내 Ca²⁺농도 상승에 대한 화합물 1의 억제효과,

마우스 골아세포형 세포인 MC3T3-E1에서, ET-1(10^-12내지 10^-6M)은 농도 의존적으로 세포내 Ca²⁺농도를 상승시킨다(도 3A). ET-1의 EC₅₀값은 7.39×10^-9M이다. 화합물 1(10^-12내지 10^-4M)은 ET-1(10^-8M)에 의해 유발된 세포내 Ca²⁺농도 상승을 농도 의존적으로 억제한다(도 3 B). 화합물 1의 IC₅₀값은 1.02×10^-8M이다.

②MC3T3-E1의 ET-1 유발 세포 증식에 대한 화합물 1의 억제효과

마우스 골아세포형 세포인 MC3T3-E1에서 ET-1(10^-13내지 10^-6M)은 [³H]-티미딘의 혼입을 농도 의존적으로 유의적으로 상승시키고 DNA 합성을 증가시킨다(도 4A). ET-1의 EC₅₀값은 9.84×10^-12M이다. 화합물 1(10^-12내지 10^-6M)은 ET-1(10^-10M)에 의해 유발된 [³H]-티미딘의 혼입 상승작용을 농도 의존적으로 억제한다(도 4B). 화합물 1의 IC₅₀값은 1.15×10^-8M이다.

유사하게, WST-1을 사용한 세포수 측정 실험에서도 ET-1(10^-12내지 10^-6M)은 MC3T3-E1의 세포수를 농도 의존적으로 유의적으로 상승시킨다(도 5A). ET-1의 EC₅₀값은 2.20×10^-11M이다. 화합물 1(10^-11내지 10^-6M)은 ET-1(10^-9M)에 의해 유발된 세포수 상승작용을 농도 의존적으로 억제한다(도 5B). 화합물 1의 IC₅₀값은 9.54×10^-9M이다.

시험 실시예 3

호르몬 불응성 사람 전립선암 세포의 ET-1 유발성 세포 증식에 대한 억제시험(1)

(방법)

①사용 세포

본 실험에서는 호르몬 불응성 사람 전립선암 세포주인 PPC-1을 사용한다[참조: International Journal of Cancer, 44, 898-903, 1989].

②PPC-1 세포 증식에 대한 ET-1의 작용 및 피검약에 의한 증식 억제 효과의 검토

세포 증식의 지표로서 DNA 합성량을 측정한다. DNA 합성량은 [³H]-표지된 티미딘의 혼입량을 측정한다. 세포를 FCS가 첨가되지 않은 배지를 사용하여 1×10⁴세포/웰의 비율로 96-웰 플레이트에 접종하여 5일 동안 배양한다. 이어서 용매 및 ET-1을 가하여 24시간 동안 배양한다. 계속해서 배양액에 [³H-메틸]-티미딘을 0.5μCi/웰로 첨가하여 6시간 동안 펄스-표지한다. 계속해서 최종 농도가 0.2%가 되도록 SDS 용액을 첨가하여 세포를 용해시킨 다음, DNA 합성에 사용된 [³H-메틸]-티미딘의 방사능을 액체 신틸레이션 카운터에서 측정한다. 대조군로서 용매를 첨가한 측정치를 100%로 정의하고 DNA 합성 증가율을 산출한다.

③피검약

본 실험에서, ET-1 및 화합물 1은 이의 최종 농도로서 10^-13내지 10^-6M(10배비) 및 10^-10내지 3×10^-6M의 농도 범위(3배비)로 시험한다. 화합물 1은 ET-1를 첨가하기 약 2시간 전에 첨가한다.

④통계처리

결과는 평균치±표준 오차로 나타낸다. 그룹 간의 유의차 검정은 원-웨이 분산분석으로 해석하고, 더네트 다중 범위 검정에 의해 p값을 산출한다. p값이 5% 이하인 경우를 유의적이라고 정의한다. 화합물 1의 IC₅₀값은 로지스틱 회귀법에 의해 산출한다.

(결과)

도 6A에 도시된 바와 같이, 호르몬 불응성 사람 전립선암 세포주 PPC-1에서 ET-1(10^-13내지 10^-6M)은 농도 의존적으로 [³H]-티미딘의 혼입을 상승시켜 세포 증식을 촉진하는 작용을 나타낸다. ET-1의 작용은 10^-8M 이상으로 유의적이다.

화합물 1(10^-10내지 3×10^-6M)은 ET-1(10^-8M)에 의해 유발되는 PPC-1 세포 증식의 촉진을 농도 의존적으로 억제하며 IC₅₀값은 28±9.8nM이다(도 6 B). 화합물 1의 억제작용은 3×10^-7M 이상으로 유의적이다.

시험 실시예 4

호르몬 불응성 사람 전립선암 세포의 ET-1 유발 세포 증식에 대한 억제시험(2)

(방법)

①사용되는 세포

②세포 증식에 대한 ET-1의 작용 및 피검약에 의한 ET-1 유발 증식 억제효과의 검토

세포수는 알라마 블루(alamar blue)의 시험 용액을 사용하여 측정한다. 24-웰 플레이트에 세포를 2×10⁴세포/웰로 접종하고, 접착 후 배지를 FCS를 첨가하지 않은 배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양한다. 이어서 용매 및 ET-1(1^-11내지 10^-6M)을 첨가하며 96시간 동안 배양한다. 배지의 최종 용량을 500㎕로 하고 배양액에 알라마 블루 50㎕를 첨가하여 4시간 동안 배양한다. 반응 후 24-웰 플레이트의 각 웰로부터 반응액 100㎕를 채취하며 96-웰 플레이트로 옮기고 흡광도(파장 405nm, 참조 파장 650nm)를 플레이트 리더로 측정한다. 대조군으로서 용매를 가한 측정치를 10O%로 정의하고 세포수 증가율을 산출한다.

화합물의 억제효과의 검토에서는 ET-1을 10^-7M로 첨가하기 30분전에 화합물 1을 10^-9내지 -10^-5M의 최종 농도로 첨가한다.

또한 본 실험에서 ET-1의 붕괴될 수 있기 때문에, 자극 후 48시간째에 새로운 첨가 배지로 교환한다.

(결과)

표 2에 기재된 바와 같이, ET-1에 의한 세포 증식은 10^-11M의 PPC-1에서 관찰된다.

ET-1(M)	세포 생장율(%)
0(대조군)	100.0
10^-11	119.6
10^-10	122.3
10^-9	124.0
10^-8	115.3
10^-7	119.3
(n= 7)

또한, 표 3에 기재된 바와 같이 화합물 1은 10^-6M에서 10^-7M의 ET-1에 의한 PPC-1의 세포 증식를 억제한다.

ET-1	화합물 1	세포 생장율(%)
-	-	100.0
10^-7M	0	110.5
	10^-6M	99.2
	10^-5M	98.1
(n=7)

시험 실시예 5

전립선암 환자에 대한 임상 시험

(방법)

전립선암 환자에 대한 임상시험은 하기의 조건으로 실시한다.

대상: 호르몬 비의존성 또는 항 안드로겐 요법후에 재발한 D2기의 전립선암 환자 18명(45세 이상)

피검약: 화합물 1

제형: 2, 10 및 40mg 정제

용량: 2, 4, 10, 20, 60, 120 및 240mg/일(1일 1회 또는 2회 투여)

투여 기간: 4주간(28일)

평가 지표: 하기의 항목을 투여 전후에 측정한다.

①전립선 특이적 항원(PSA)

②골 대사 마커(골 알칼리포스파타제 또는 데옥시피리디놀린)

③골 동통(동통 스코어 VAS(visual analogue scale)의 변화/진통제의 사

용량의 변화)

(결과)

화합물 1은 2mg/일의 용량으로부터 각 효과 지표를 개선시킨다는 것이 확인된다. 화합물 1은 환자 18명중 9명의 동통 스코어 VAS를 개선시킨다. 화합물 1은 환자 18명중 4명의 진통제의 사용량을 저하시킨다. 화합물 1은 환자 10명의 전립선암 마커 PSA를 개선시키고 2명의 PSA를 유지시킨다. 화합물 1은 환자 18명중 11명의 골 대사 마커 골 알카리포스파타제를 감소시켜 환자 18명중 14명의 골 대사 마커 데옥시피리디놀린/크레아티닌 비를 약 4O% 개선시킨다.

시험 실시예 6

사람에게 경구 투여한 경우의 혈장중 농도

(방법)

화합물 1의 경구 투여시의 약력학, 인용성 및 안전성을 평가할 목적으로 전립선 적출 수술을 시행한 진행성 전립선암 환자 3명을 대상으로 하여, 화합물 1 10mg을 1회 투여한다. 화합물 1의 혈장중 미변화체 농도를 측정하기 위해 투여 전 및 투여 후 30분, 1시간, 1시간30분, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간 및 48시간의 각 시점에서, 헤파린리튬을 함유하는 폴리에틸렌 튜브로부터 혈액 6㎖을 채취하고 신속하게 원심분리(4℃, 1O분 동안 , 3500rpm)하여 혈장을 수득한다. 혈장 샘플은 농도를 측정할 때까지 -70℃에서 냉동 보존한다. 혈장중 농도는 LC-MS/MS법을 사용하여 측정한다.

(결과)

표 4에 기재된 바와 같이, 화합물 1을 10mg으로 1회 경구투여시의 Cmax 및 AUC는 ABT-627을 20mg 투여한 경우와 비교하여 각각 약 11배 및 약 18배가 높은 값을 나타낸다.

	AUC(ng·h/㎖)	C_max(ng/㎖)	T_max	T_1/2(h)
화합물 1 10mg	14700	1000	2	13
ABT-627 20mg	^*802	^*93.5	^*0.6	^*28.4
화합물(10mg)/ABT-627(20mg)	18	11
*) 참조 문헌: 6th International Conference on Endothelin, Oct 10-13, 1999,abstract No. 219

시험 실시예 1의 결과로부터 화합물 1이 엔도텔린 유발성의 질환의 동통 완화제로서 유용하다는 것이 확인된다.

시험 실시예 2의 결과로부터 화합물 1이 조골성 골 병변을 개선하며 조골에 수반되는 동통 완화제로서 유용하다는 것이 확인된다.

또한 시험 실시예 2에서 ET-1은 10^-11M 정도의 대단히 저농도에서 골아형 세포의 세포 반응을 일으키는 것으로 나타난다. 사람 전립선암 세포주의 ET-1 생성능에 관한 보고에서는 약 수십 pg/㎖ 10⁶세포/24시간의 ET-1 생성이 보고되어 있다(참조: Nat. Med., 1(9), 944-949, 1995). 이러한 농도는 약 1×10^-11M에 상응하며 시험 실시예 2의 결과는 전립선암의 골 전이 환자의 골 전이 부위에서 전립선암 세포로부터 생성된 ET-1이 조골성의 골 병변을 형성할 수 있다는 가능성을 강하게 시사하는 증거이다. 시험 실시예 2에서, 화합물 1은 10nM 부근의 저농도에서 ET-1에 의한 골아형 세포의 세포 반응을 억제하는 것으로 나타난다. 따라서 화합물 1은, ET-1가 관여하는 것으로 시사되는 전립선암 환자에서 조골성 골 병변을 개선시키는 효과를 나타낸다는 것이 강하게 시사된다. 또한 시험 실시예 1의 결과를 함께 생각하면, 화합물 1이 전립선암의 골 전이에 따르는 동통 완화제로서 유용하다는 것이 강하게 시사된다.

또한, 시험 실시예 5의 결과에 의해서도, 화합물 1이 전립선암의 골 전이에 수반되는 동통 완화제로서 유용한 것이 확인된다.

시험 실시예 3 및 4의 결과로부터, 화합물 1이 호르몬 내성 전립선암의 암 세포 증식 억제제로서 유용하다는 것이 확인되며 화합물 1이 전립선암의 진행 억제효과를 나타낸다는 것이 강하게 시사된다.

또한, 시험 실시예 5의 결과에 따라서도 화합물 1이 전립선암의 진행 억제제로서 효과적이라는 것이 확인된다.

또한, 시험예 6에서, 화합물 1은 공지된 ET_A수용체 길항제로서 입증된 ABT-627의 1/2배 용량에서 AUC가 약 18배로 높으며 화합물 1의 경구 투여시의 경구 흡수성 및 약력학이 특히 우수한 것으로 시사된다. 사람 ET_A수용체에 대한 친화성(Ki 값)은 화합물 1이 0.697nM(W0 97/22595)이고, ABT-627이 0.48nM(J. Pharmacol. Exp. Ther., 276, 473-481, 1996)로서 거의 동등하지만 화합물 1은 ABT-627보다 우수한 경구 치료제인 것으로 기대된다.

또한, 시험 실시예 5에서, 화합물 1은 2mg의 용량으로부터 유효성을 나타내는데, 이는 전립선암 환자에 대하여 10mg의 용량으로부터 유의적인 동통 개선이 보고된 ABT-627(Proceedings of ASC0. Vol. 19, 1314, 2000)의 1/5의 양이며 화합물 1은 전립선암의 우수한 경구 치료제임이 확인된다.

본 발명에 따라서, 임상 시험에서 효과적인, 전립선암의 우수한 경구 치료제가 제공될 수 있다. 즉, 암(특히 전립선암, 유방암), 관절염, 전립선염, 신경 교종, 말초 동맥 폐색증, 월경곤란증, 편두통, 협심증, 급성 심근경색, 뇌경색, 지주막하 출혈, 당뇨병성 신경장애, 류마티즈 관절염, 녹내장, 소화성 궤양, 출산시의 진통 등의 엔도텔린 유발성 질환의 동통 완화제가 제공될 수 있다. 또한, 조골성 병변의 개선제 및/또는 조골에 수반되는 동통 완화제, 특히 전립선암의 골 전이에 따른 조골성 병변 개선제 및/또는 전립선암의 골 전이에 수반되는 동통 완화제가 제공될 수 있다. 또한, 전립선암의 암 세포 증식 억제제 및/또는 전립선암의 진행 억제제를 제공할 수 있다.

Claims

N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로서 함유하는, 엔도텔린 유발성 질환의 동통 완화용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 엔도텔린 유발성 질환이 전립선암인 약제학적 조성물.
N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로서 함유하는, 조골성 병변 개선용 약제학적 조성물.
N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로서 함유하는, 조골에 수반되는 동통 완화용 약제학적 조성물.
N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로서 함유하는, 전립선암의 골 전이에 수반되는 동통 완화용 약제학적 조성물.
N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로서 함유하는, 전립선암의 골 전이에 따른 조골성 병변 개선용 약제학적 조성물.
N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로서 함유하는, 전립선암의 암 세포 증식 억제용 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 전립선암이 호르몬 비의존성 전립선암인, 암 세포 증식 억제용 약제학적 조성물.
N-[6-메톡시-5-(2-메톡시페녹시)-2-(2-피리미디닐)-4-피리미디닐]-2-페닐에텐설폰아미드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로서 함유하는, 전립선암 진행 억제용 약제학적 조성물.