KR20020057990A - 기도 상피로의 외인성 유전자 도입용 재조합센다이바이러스 벡터 - Google Patents

기도 상피로의 외인성 유전자 도입용 재조합센다이바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

기도 상피세포로 외인성 유전자를 전달하는 재조합 센다이바이러스 벡터 및 그 벡터를 사용한 외인성 유전자의 도입방법을 제공한다. 재조합 센다이바이러스 벡터를 점액으로 덮인 무처리 기도 상피세포에 단시간 접촉시키는 것만으로 효율 좋게 유전자를 전달하는 것이 가능하다. 더욱이, 본 벡터는 세포의 선단표면 뿐 아니라, CFTR이 주로 발현하는 점막하 조직선에도 유전자를 도입할 수 있다. 따라서, 본 벡터는 CFTR이 결손된 질환인 CF에 대한 유전자치료에 사용하는 것이 가능하다.

Description

기도 상피로의 외인성 유전자 도입용 재조합 센다이바이러스 벡터 {Recombinant Sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia}
기술분야
본 발명은, 기도 상피로의 외인성 유전자 도입용 재조합 센다이바이러스 벡터 및 그 벡터를 사용한 외인성 유전자 도입방법에 관한 것이다.
배경기술
분자 클로닝 기술의 출현과 더불어, 중요한 인간 질병의 원인이 되는 돌연변이와 연관된 유전자들의 확장 배열이 확인 및 분리되고 있다. 인간 환자들에 있어서, 결실 또는 돌연변이된 유전자들은 엑스 비보(ex vivo)기술에 의해 치환될 수 있고, 이것은, 인 비트로(in vitro)에서 DNA 그 자체, 리포솜에 캡슐로 넣어진 DNA 및 적절한 융합 벡터를 숙주기관에 도입하는 세포의 형질전환을 포함한다("엑스 비보" 유전자 치료).
유전자 치료는, 목적으로 하는 유전자를 차후에 인 비보에서 발현하도록 피실험자에게 유전자를 전달하는 수단을 제공한다. 유전자 전달(gene transfer)은 엑스 비보로 피실험자의 세포나 조직을 트랜스펙션시키고, 형질전환된 물질을 숙주에 재도입시키면서 수행될 수 있다. 선택적으로, 유전자는 수용자에게 직접적으로 투여될 수 있다.
나벨 등(Nabel et al., Science (1990) 249: 1285-1288)은, β-gal 발현 플라스미드를 포함하는 리포솜을 사용하여 인 비보에서 돼지의 내부동맥으로 트랜스펙션시키는 것에 관한 것이다. 부위-특이적 유전자 발현은 동맥 벽에서 관찰된다. 엑스 비보 유전자 치료에는, 몇가지 결점들이 있다. 예를 들어, 분화된 복제 세포들만이 감염된 경우, 이들 세포가 성숙되고 죽었을 때 새로 도입된 유전자 기능은 상실될 것이다. 또한, 엑스 비보 접근은 단지 제한된 수의 세포만을 트랜스펙션시키는 데는 이용될 수 있고, 몸에서 최초로 떼어내지 않은 세포를 감염시키는 데는 이용될 수 없다.
상기에서 기술된 바와 같이, 유전자 치료에서, 도입될 유전자, 도입 유전자가 발현될 표적세포, 표적조직에 적합한 유전자 전달 방법 및 투여경로 등을 적절히 선택하는 것은 매우 중요하다.
낭포성 섬유증(cystic fibrosis; CF)은, 물질대사의 선천적 결함을 일으키는 상염색체 열성 유전병이다. CF 환자는 미국 및 유럽에서 빈번히 발견되고, 2,000 내지 2,500 유아들 중 한명은 이 질병을 앓고 있다. 주된 증상으로서, 외분비 이상이 점액성 분비물을 만들며, 이는 폐, 호홉관, 췌장, 간장 및 소장 같은 기관에 축적된다. 현재, CF의 치료는 폐 이식 및 폐 감염증의 항생물질 치료에 초점을 맞추고 있다. 특히 폐 감염증은 치명적이다.
CF의 원인유전자인 낭포성 섬유증 막관통 전도성 제어인자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; CFTR) 유전자는 확인되었고(Riordan, J. R.et al., Science 245: 1066-1073, 1989), 정상 CFTR 유전자를 운반하는 벡터가기도 상피로 도입되어지는 CF의 유전자 치료를 개발할 것으로 기대되고 있다. CF의 유전자 치료에 있어, 외인성 유전자는, 엑스 비보 치료가 폐와 상부기도에는 적용될 수 없기 때문에, 인 비보에서 도입되어져야 한다.
폐에 벡터를 투여하기 위한 몇 가지 시도들이 이루어졌다. 하진스키 등(Hazinski et al.,Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1991) 4: 206-209)은, 본래 그대로의 설치류 폐로의 리포솜-매개된 DNA 유전자 전달에 대해 개시한다. 양이온성 리포솜은 1) 라우스육종 바이러스(RSV)프로모터에 연결된 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(AT)유전자; 2) 마우스유방암바이러스(MMTV)프로모터에 연결된 CAT 유전자; 및 3) 사이토메갈로 바이러스 β-갈락토시다제(CMV-β-gal)융합 유전자로 구성된 세개의 융합 유전자 구조물(fusion gene construct)로 복합체화 되었다. 리포솜/DNA 복합체는 쥐의 경부 기관에 적하되었고 유전자 발현의 탐지 가능한 정도로 관찰되었다.
브리그함 등(Brigham et al.,Am. J. Med. Sci. (1989) 298: 278-281)은, 리포솜 매개물을 사용하여 CAT 유전자를 가지고 쥐과의 폐로 인 비보에서의 트랜스펙션에 대해 기술한다. 트랜스펙션은 정맥내, 기관내 또는 복막내에 주입에 의해 실시되었다.
정맥내 및 기관내 투여에서는 페에서의 CAT 유전자가 발현되었다. 그러나, 복강내 투여에서는 그렇지 못했다.
카노니코 등(Canonico et al.,Clin. Res. (1991) 39:219A)은 배양된 소의 폐 상피세포에서 CMV 프로모터에 의해 유래된 인간 α-1 안티트립신 유전자의 발현에대해 기술한다. 유전자는 양이온성 리포솜을 사용한 배양균내에서 세포에 첨가된다. 또한, 실험자들은 리포솜에 복합체화된 유전자 구조물의 정맥내 전달후에 뉴질랜드 흰 토끼의 폐 조직 단편에서 α-1 안티트립신의 존재를 탐지하였다.
더욱이, 미국특허 제5,958,893는, 양이온성 리포솜 또는 아데노 바이러스 벡터와 같은 최근에 유용한 벡터들을 사용하여 절단된 CFTR를 코드하는 유전자를 도입하는 방법을 개시한다.
그러나, 기도 상피로의 아데노바이러스-매개된 유전자 전달은 낮은 유전자 전달 효율을 만들고, 선단 원형질막으로의 아데노바이러스-매개된 유전자의 낮은 도입 속도는 비효율적 유전자 전달의 원인이 될 수 있다. 그리고, αβγ3 인터그린과 기도 상피세포의 선단 표면에 있는 아데노바이러스의 수용체인 CAR 수용체의 부족도 그 원인이 될 수 있다(Goldman, M. et al., Gene Ther. 3: 811-818, 1996, Boucher, R. C., J. Clin. Invest 103: 441-445, 1999). 양이온성 리포솜의 경우, 알려진 바와 같이 점액이 리포솜의 도입을 방해했고, 유전자 전달 효율은 점액 제거에 의해 향상되었다(Kitson, C. et al., Gene Ther. 6: 534-546, 1999, Zabner, J. et al., J. Biol. Chem. 270: 18997-19007, 1995, Fasbender, A. et al., Gene Ther. 4: 1173-1180, 1997).
현재까지, 기도 상피로 외인성 유전자의 효율적 도입을 가능하게 하는 유전자 전달 방법과 벡터계에 대해 유용하게 보고된 바 없다. 따라서, 기도 상피세포로 효율 좋게 유전자전달을 행하기 위한 벡터의 개발이 절실히 요망되고 있다.
파라믹소바이러스과에 속하는 센다이바이러스는 유전자 전달을 위한 벡터로매우 유용하고, 그것의 개발은 진행중이다(Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-598, 1997, 국제공개공보 제97/16538호, 국제공개공보 제97/16539호). 센다이바이러스는 낮은 독성을 보이고, 바이러스에 의해 도입된 유전자는 지극히 높은 수준으로 발현한다. 또한, 이 바이러스는 바이러스 벡터로 삽입된 유전자가 숙주 염색체로 결코 융합되지 않기 때문에 매우 안전하다. 센다이바이러스 벡터의 트랜스펙션능은 아데노바이러스의 것과는 다르다고 알려져 있다(Goldman, M. et al., Gene Ther. 3: 811-818, 1996, Boucher, R. C., Clin. Invest 103: 441-445, 1999). 예를 들어, 아데노바이러스는 손상되지 않는 부위와 비교해, 손상부위를 감염시키기 쉽다(Kitson, C. et al., Gene Ther. 6: 534-546, 1999, Zabner, J. et al., J. Biol. Chem. 270: 18997-19007, 1995, Fasbender, A., et al., Gene Ther. 4: 1173-1180, 1997). 이 보고서는 센다이 바이러스가 아데노바이러스의 결점을 보완할 수 있다고 시사한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 목적은, 기도 상피로의 외인성 유전자 도입용 벡터 및 그 벡터를 사용한 외인성 유전자 도입방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 각각 외인성 유전자를 포함한 재조합 센다이바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 양이온성 지질 복합체의 인 비보와 인 비트로에서 다양한 동물들에서 유래된 기도 상피세포로의 유전자 전달 효율성을 조사하였다. 그 결과는, 센다이바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터와 양이온성 지질 복합체 보다 기도 상피세포로 훨씬 더 효율적으로 외인성 유전자를 도입한다는 것을 보여주었다.
또한, 본 발명자들은 제조합 센다이바이러스 벡터가 허용성 마우스 기도관 뿐 아니라 흰 족제비, 양, 인간 같은 대형동물의 비허용성 기도 상피세포로도 외인성 유전자를 효율적으로 도입한다는 것을 발견했다. 더욱이, 센다이바이러스 벡터는 상피세포의 선단 표면 뿐 아니라 점막하 조직선(submucosal gland)도 감염시킨다는 것을 발견했다. 이 발견들을 토대로 해서, 본 발명이 완성되었다.
구체적으로, 본 발명은 외인성 유전자를 운반하는 재조합 센다이바이러스 벡터를 포함하는, 기도 상피로 외인성 유전자를 도입하기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 점액으로 피복된 기도 상피로 외인성 유전자를 운반하는 재조합 센다이바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 접촉시키는 것을 포함하는 기도 상피로 외인성 유전자를 도입하는 방법을 제공한다.
본 발명은 아래에 보다 상세히 설명되어 있다.
본 명세서에 사용된 "재조합 센다이바이러스 벡터"는 바이러스의 재구성 생성물 및 재조합 센다이바이러스 cDNA로부터의 바이러스-양 입자(virus-like particle)들을 의미하고, 재조합 센다이바이러스 RNA 및 감염성을 가지는 센다이바이러스 몸체를 포함한다. 여기에 사용된 "감염성"이라는 용어는, 세포로의 접착을 통해 바이러스의 핵산등을 세포로 전달하는 바이러스의 능력 및 바이러스의 세포막과 숙주 세포막의 융합을 포함하는 다양한 메카니즘을 통한 세포로의 침투능력을 의미한다. 재조합 센다이바이러스 벡터는 리보핵단백질(RNP)일 수 있다.
여기에 사용된 "유전자"는 RNA와 cDNA를 포함한다.
"기도 상피세포"는 다열섬모상피세포는 물론 코, 인두, 기관 또는 임의의 전도기도(conducting airway)에 있어서의 기도 내부 표면에 존재하는 배세포 및 클라라 세포 또는 폐의 Ⅰ형과 Ⅱ형 폐포세포를 포함하는 가스-교환 폐포 표면에 존재하는 세포를 의미한다.
본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터는 재조합 센다이바이러스 유전자를 운반한다. 천연의 센다이바이러스 게놈은 짧은 3' 리더 영역, 뉴클레오캡시드(N)유전자, 포스포(P)유전자, 매트릭스(M)유전자, 융합(F)유전자, 적혈구 응집소-뉴라민 가수분해효소(HN)유전자, 라지(L)유전자 및 짧은 5'트레일러 영역이 이 순서로 구성되어 있다.
재조합 센다이바이러스 벡터를 생산하기 위한 출발 물질로 사용되는 센다이 바이러스 유전자는, 재구축된 재조합 센다이바이러스 벡터가 기도 상피세포를 감염시킬 수 있고 그 벡터가 운반하는 외인성 유전자를 감염된 세포에서 발현시킬 수 있는 한, 결실 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, DI입자(J. Virol. 68: 8413-8417, 1994)처럼 바이러스가 사용될 수 있다.
유전자 치료에 사용되는, 재조합 센다이 바이러스 벡터는, 감염성을 가지지만 전염성은 결여하고 있는 것이 바람직하다. 전염성은 F유전자, HN유전자 및 M유전자 중 적어도 하나를 결실시킴으로써 제거될 수 있다. 예를 들어, 이러한 벡터들은 F 유전자만 결실된 센다이바이러스 Z주의 유전자를 포함한다. 부가적인 예로서 pSeV18+b(+)(Yu, D. et al., Gene to Cells 2: 457-466, 1997) 및 pSeV(+) (Kato,A. et al., EMBO J. 16: 578-587, 1997)가 있다.
재조합 센다이바이러스 유전자는, 상기에서 기술한 것처럼 센다이바이러스 유전자에 외인성 유전자를 삽입함으로써 얻어질 수 있다. 표적 기도 상피세포에서 발현되는 단백질을 코드하는 한, 임의의 외인성 유전자를 사용할 수 있다. CF의 유전자치료를 위해, CF 원인유전자인 CFTR 유전자(Riordan, J. R. et al., Science 245: 1066-1073, 1989)가 사용될 수 있다. 외인성 유전자는 천연형 단백질을 코드하는 유전자 및 결실, 치환 또는 삽입에 의해 상기 유전자를 변형시켜 얻는 유전자 로서 천연형 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,958,893호는 변형된 CFTR 유전자에 대해 개시하고 있다. 다른 외인성 유전자의 예로는 α-1 안티트립신(Long et al., Biochem. 23: 4828-2837, 1984), DNase, 과산화물 불균등화 효소(superoxide dismutase)(SOD), 카탈라아제 등을 코드하는 유전자를 포함한다.
예를 들어, 외인성 유전자를 운반하는 재조합 센다이바이러스는, 하기에 기술된 것처럼 카토 등(Kato, A. et al., EMBO J. 16:578-587, 1997)과 유, 디 등(Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466, 1997)의 방법을 참조하여 제조될 수 있다.
먼저, 목적으로 하는 유전자의 cDNA염기 서열을 포함하는 DNA 시료를 준비한다. DNA 시료는, 25 ng/㎕이상의 농도에서 전기영동학적으로 단일 플라스미드로서 인식될 수 있는 것이 바람직하다. 표적 cDNA 서열에 NotⅠ인식 부위가 존재한다면 , 이것은 제거되어야 한다. 포워드 또는 리버스(안티센스 가닥)측 합성 DNA서열은,시료로부터 목적으로 하는 유전자 부분을 증식하고 회수하기 위해 Not Ⅰ인식 효소 제한 부위 서열; 하기에 언급된 전사 종결 서열(E), 개재 서열(I), 전사 개시 서열(S) 및 표적 유전자 서열의 일부분을 포함하는 프라이머 쌍으로 조제된다.
포워드측 합성 DNA 서열로서, 5'측으로부터 임의의 2이상의 올리고 DNA, 바람직하게는 GCG와 GCC의 NotⅠ 인식부위-유래의 서열이 포함되지 않은 4개 염기, 보다 바람직하게는 ACTT를 선택하여, 3'측에 NotⅠ인식부위 gcggccgc를 부가하고, 더욱이 선택적으로 스페이서 서열로서 6염기의 배수를 갖거나 갖지 않는 9염기를 부가한다. 게다가, ATG를 포함하는 목적으로 하는 cDNA의 시작코돈 ATG로부터 ORF의 25염기에 상응하는 서열이 3'측에 첨가된다. 이 경우, 포워드측 합성 올리고 DNA의 3'말단이 G 또는 C가 되도록, 대략 25염기는 목적으로하는 cDNA로부터 선택된다.
리버스측 합성 DNA 서열로서, 5'측으로부터 임의의 2개 이상의 올리고 DNA, 바람직하게는 GCG 또는 GCC의 NotⅠ 인식 부위-유래의 서열이 포함되지 않은 4염기, 보다 바람직하게는 ATCC를 선택하여, 3'측에 NotⅠ 인식 부위 gcggccgc를 부가하고, 더욱이 길이를 조절하기 위해 삽입단편의 올리고 DNA를 부가한다. 이 올리고 DNA의 길이는, NotⅠ 인식부위 gcggccgc를 포함하는, cDNA의 상보성 가닥 염기와 센다이바이러스 게놈으로부터 유래된 EIS염기의 총수가 6의 배수가 되도록 설계된다(소위 "6의 룰(rule of six)"; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-899, 1998, Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67:4822-4830, 1993). 리버스측 합성 올리고 DNA의 3'말단은, 삽입단편의 3'측에, 센다이바이러스 S 서열의 상보성 가닥서열, 바람직하게는 5'-CTTTCACCCT-3', I 서열, 바람직하게는 5'-AAG-3' 및 E 서열의 상보성 가닥 서열, 바람직하게는 5'-TTTTTCTTACTACGG-3', 목적으로 하는 cDNA 서열의 종결 코돈으로부터 역방향으로 세어 25염기에 상응하는 상보 서열의 마지막이 G 또는 C로 끝나는 상보 서열을 부가함으로써 제조된다.
ExTaq 폴리머라제(다까라주조)를 사용한 일반적인 방법이, PCR에 사용될 수 있다. 바람직하게는, Vent 폴리머라제(NEB)가 사용될 수 있고, 증식된 표적단편은 NotI으로 소화된 후 플라스미드 벡터 pBluescript의 NotI 부위에 삽입된다. 얻어진 PCR 생성물의 염기서열을 서열 분석기에 의해 확인하여 정확한 서열을 가진 플라스미드를 선택한다. 그 선택된 플라스미드는, Not Ⅰ으로 절단하고 pSeV18+b(+)(Yu, D. et al., Genes to Cells 2: 457-466, 1997) 또는 pSeV(+) (Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-587, 1997) 같은 센다이바이러스의 게놈 cDNA 플라스미드의 NotⅠ 부위에 삽입하여 외인성 cDNA가 삽입된 재조합 센다이바이러스 cDNA를 얻는다. 또한, 재조합 센다이바이러스 cDNA는 플라스미드 벡터 pBluescript를 사용하지 않고 NotⅠ부위에 직접 삽입함으로써 얻어질 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 바이러스를 재구축시키기 위해 상기에 기술한 것처럼 인 비트로 또는 세포내에서 제조된 재조합 센다이바이러스 cDNA를 전사시킴으로써 얻어질 수도 있다. 바이러스는 공지 방법에 의해 cDNA로부터 재구축될 수 있다(국제공개공보 제97/16538호, 국제공개공보 제97/16539호).
cDNA로부터의 재구축은 다음과 같이 행해질 수 있다.
원숭이 신장 유래 세포주 LLCMK2는, 6웰의 플라스틱 플레이트상에서, 10% 소태아혈청(FCS) 및 항생물질(100 units/㎖ 페니실린 G 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신)을 포함하는 최소필수배지(MEM)에서 70% 내지 80% 컨플루언트(1×106세포)가 될 때까지 배양된다. 이 세포는, T7 폴리머라제를 발현하는 2 PFU/세포의 재조합 백시니아바이러스 vTF7-3(Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)로 감염된다. 재조합 백시니바이러스 vTF7-3는 UV 조사에 의해 불활성화된다. 감염 1시간 후, 세포들은 상기의 재조합 센다이바이러스 cDNA 60~2 ㎍, 더 바람직하게는 3~5 ㎍과 전장 센다이바이러스 게놈 재합성을 위해 필수적인 트랜스로 작용하는 바이러스의 단백질을 발현하는 플리스미드(24~0.5 ㎍의 pGEM-N, 12~0.25 ㎍의 pGEM-P 및 24~0.5 ㎍의 pGEM-L, 보다 바람직하게는 1 ㎍의 pGEM-N, 0.5 ㎍의 pGEM-P 및 1 ㎍의 pGEM-L) (Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)을 슈퍼펫트(Superfect)(QIAGEN사)을 사용한 리포펙션 방법 같은 트랜스펙션 방법에 의해, 동시 트랜스펙션된다. 트랜스펙션된 세포는 100 ㎍/㎖의 리팜피신(Sigma) 및 시토신아라비노시드(AraC), 보다 바람직하게는 40 ㎍/㎖의 시토신아라비노사이드를 포함하는 혈청 함유하지 않는 MEM에서 배양하여 백시니바이러스의 회수를 최대로 하고 바이러스의 독성을 최소화하기 위한 상기 약의 최적농도를 결정한다(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579). 트랜스펙션 48 시간 후, 세포들은 회수되고, 동결해동을 반복함으로써 파괴되고, 10일령의 발육계란의 장뇨막내로 주입된다. 3일 후, 장뇨액을 회수하고, 적혈구 응집활성(HA)를 측정함으로써 바이러스의 적정농도(titer)를 결정한다. HA는 "엔도-포인트(endo-point)희석법" (Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579)에 의해 결정될 수 있다. HA가 검출되지 않았던 시료들은 더욱이 발육 계란에 주입된다. 회수된 센다이바이러스의 적정농도는 통상 108~109PFU/㎖ 이고, 함께 포함되어 있던 백시니바이러스 vTF7-3의 적정농도는 103~104PFU/㎖ 이하이다. 시료를 106배로 희석하고 계란에서 재증폭시켜 백시니바이러스를 제거한다. 발육계란에서 두 번 또는 세 번째 계대를 통해 얻어진 재조합 바이러스을 저장하여, 목적으로 하는 cDNA가 삽입된 재조합 바이러스 벡터를 얻는다. 저장된 바이러스의 플라크 형성능은 일반적으로 109PFU/㎖ 또는 10,240 HA unit/㎖ 이고, 이 값은 바이러스가 -80℃에서 저장된다면 유지될 것이다.
재조합 센다이바이러스 cDNA가 숙주 세포에서 재구축될 수 있는 한 재구축에 사용된 숙주세포는 특별히 제한되지 않는다. 숙주로 사용된 세포주는, 원숭이 신장으로부터 유래된 CV-1세포들 같은 배양된 세포는 물론, 햄스터 신장에서 유래된 BHK 세포 LLCMK2 세포들 및 인간 기관에서 유래된 세포들을 포함한다.
재구축된 재조합 센다이바이러스는, 특정 세포에 접착을 용이하게 하도록 외피표면에 접착인자, 리간드, 수용체 등에 결합될 수 있다.
상기의 바이러스 벡터를 포함하는 상기에 기술된 장뇨액은, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터를 포함하는 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 탈이온화된 물, 5% 덱스트로오스수용액 등의 생리학적으로 허용가능한 배지를 포함할 수 있다. 안정제 및 살생물제와 같은 다른 보조 성분들은 조성물에 포함될 수 있다. 재조합 센다이바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 동결건조된 제제형태로 될 수 있다. 이러한 조성물은 부가적으로 상술의 보조제나 알부민, 프리오넥스(Prionex)(Pentapharm, Japan) 등의 안정화제를 더 포함할 수 있다.
점액에 의해 피복된 기도 상피세포로 재조합 센다이바이러스 벡터를 포함하는 조성물에 접촉시킴으로써 재조합 센다이바이러스에 포함된 외인성 유전자는 기도 상피세포로 도입될 수 있다. 양이온성 지질이 기도 상피세포로의 유전자 운반에 사용될 때, 기도점액은 양이온성 지질-매개된 유전자 전달에 심각한 장벽이 되므로, 점액은 외인성 유전자를 도입하기 위해서는 제거되어야 한다. 대조적으로, 본 발명의 센다이 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은, 점액을 가진 기도 상피 세포에 단지 접촉시키는 것으로써 외인성 유전자를 쉽게 도입시킬 수 있다.
본 발명의 외인성 유전자를 도입하는 방법은, 기도 상피세포의 질환을 치료하는 것으로 기대되는 외인성 유전자 또는 세포내에 부족한 단백질을 코드하는 외인성 유전자를 발현함으로써 유전자 치료에 이용될 수 있다. 예를 들어, CFTR 유전자를 운반하는 바이러스 벡터를 포함하는 본 발명의 조성물은, CF의 치료에 유용할 수 있다. 유전자 치료는 인 비보 또는 엑스 비보에서 질병이 없는 부위의 기도 상피 세포로의 본 발명의 조성물을 포함하는 바이러스 벡터를 투여하고, 그리고, 그 세포에서 외인성 유전자가 발현하도록 함으로써, 수행될 수 있다. 인 비보에서의 유전자 전달은 폐 또는 비강으로 분무기를 사용한 흡입 또는 적하와 같은 국소 투여에 의해 수행될 수 있다. 분무기의 예는 시판용으로 유용한 것들과 통상적으로 천식의 치료에 사용되는 것들을 포함한다.
본 발명의 조성물을 포함하는 바이러스 벡터는 인간, 마우스, 토끼, 양, 소, 원숭이 등을 포함하는 임의의 포유동물에 적용될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터 및 양이온성 지질복합체의 마우스 폐 및 코로의 인 비보에서 유전자 전달효율을 나타낸다. 에러바는 SEM을 나타낸다.
도 2는, 비강적하(단시간 접촉) 및 비강관류(장시간 접촉)에 의해 평가된 마우스 코에 있어서 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터(A)와 양이온성 지질복합체(B)의 유전자 전달효율을 나타낸다. 에러바는 SEM을 나타낸다.
도 3은, 비강적하에 의해 평가된 마우스 코에 있어서 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터와 아데노바이러스 벡터의 유전자 전달효율을 나타낸다. 에러바는 SEM을 나타낸다.
도 4는, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터 및 아데노바이러스 벡터의 비강적하에 의해 도입된 마우스 세기관지(bronchile), 기관 및 코에 있어서의 β-gal 유전자 발현을 X-gal 염색에 의해 탐지한 현미경사진이다
도 5는, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터 및 아데노바이러스 벡터의 비강적하에 의해 도입된 β-gal의 마우스 기관 및 코에 있어서의 유전자발현을 X-gal 염색에 의해 탐지한 현미경사진이다. NC는 섬모가 없는 분비세포를, BC는 기저세포를 나타낸다.
도 6은, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터의 비강적하에 의해 도입된 β-gal의 횐족제비 폐에서의 유전자발현을 나타낸다. R1은 우엽하부, R4는 우엽하부, L1은 좌엽상부를 나타낸다.
도 7은, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터의 비강적하에 의해 도입된 β-gal의 흰족제비 폐에서의 유전자발현을 탐지하는 현미경사진을 나타낸다. 사진 a는 좌엽상부, b는 우엽중앙, c는 점막하 조직선(submucosal gland), d는 대조군이다. 또한, Lm은 기관지강, sm은 점막하 조직선을 나타낸다.
도 8은, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터 및 양이온성 지질복합체의 인간 정상 기증자로부터 채취한 인간 코 상피세포로의 유전자 전달효율을 나타낸다. 에러바는 SEM을 나타낸다.
도 9는, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터 및 양이온성 지질복합체의 양 기관세포로의 유전자 전달효율을 나타낸다. F는 무처리 세포, MD는 점액을 제거한 세포를 나타낸다. 에러바는 SEM을 나타낸다.
도 10은, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터 및 양이온성 지질복합체의 점액소가 첨가된 양 기관세포로의 유전자 전달효율을 나타낸다. F는 무처리 세포, MD는 점액이 제거되 세포를 나타낸다. 에러바는 SEM을 나타낸다.
도 11은, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터 및 아데노바이러스 벡터의 양 기관세포의 단부 및 중앙부로의 유전자 전달효율을 나타낸다. 에러바는 SEM을 나타낸다.
도 12는, 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터 및 아데노바이러스 벡터에 의해 양 기관세포로의 도입된 GFP의 신호들을 탐지한 현미경사진을 나타낸다.
도 13은, 통상의 전체-세포의 형태를 모식적으로 나타낸다.
도 14는, 시료-1 SeV/CFTR을 발현하는 COS7 세포에 있어서의, -60 mV에서의 포스코린-유도성 내부전류의 경시적 변화를 나타낸다. 막전위는 보유전위 -60 mM에서 유지되었다. 세로방향의 편향은, 15초 간격으로 -100 mV부터 +60 mV까지의 직각펄스(기간, 1초)를 나타낸다. 점선은 전류레벨 0을 나타낸다.
도 15는, sample-1 SeV/CFTR을 발현하는 COS7 세포중의 막전류에 있어서의 포스코린의 효과를 나타낸다. 막전위는 보유전위 -60 mV에서 유지되었다. 점선은 전류레벨 0을 나타낸다. 글리벤클라미드(300 μM)는 포스코린-유도성 C1 전류를 저해했다.
도 16은, 10 μM 포스코린의 존재하 또는 비존재하에 있어서 얻어진 전류-전압의 관계를 나타낸다. 막전류의 진폭은, 커맨드 펄스(기간, 1초)의 최후 100 ㎳의 중간값으로 측정되었다. 직선은, 최소 2승법(least square method)에 의해 얻었다.
도 17은, 시료-1 SeV/CFTR을 발현하는 COS7 세포에 있어서, 10 μM 포스코린의 투여중에 기록된 막전류로부터 포스코린의 투여전에 기록된 막전류를 뺌으로써 얻어진 최종적인 막전류를 나타낸다. 막전위는 보유전위 -60 mV에서 유지되었다. 점선은 전류레벨 0을 나타낸다.
실시예
아래에, 본 발명의 실시예를 기재하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
재조합 센다이바이러스 벡터의 구축 및 재구축
재조합 센다이바이러스는 공지의 방법에 의하여 구축되었다(Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-598, 1997, Hasan, M. K. et al., J. Gen. Verol. 78: 2813-2810, 1997). 먼저, NotI 제한부위를 갖는 18 bp의 스페이서서열(5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3')의 염기쌍이, 클로닝된 pSeV 게놈 cDNA(pSeV(+))의 N-단백질을 코드하는 서열의 5'말단과 리더서열과의 사이의 인접유전자좌(proximal locus)에 삽입되고, 또한 간염 델타 바이러스의 안티게놈가닥(antigenomic strand) 유래의 자기개열 리보자임부위를 포함하는 플라스미드 pSeV18+b(+)를 얻었다. 핵이행 신호(nuclear localising signal)를 포함하는 대장균 lacZ, 루시페라아제, 녹색형광단백질(GFP) 및 대장균 lacZ의 cDNA 전체를, NotI 부위와 외인성 유전자를 위한 SeV E 및 S 신호 서열의 새로운 세트를 포함하는 를 가진 프라이머를 사용한 폴리머라아제 연쇄반응에 의해 증폭시켜, 클로닝된 게놈의 NotI 부위에 삽입했다. 외인성 유전자를 포함하는 주형 SeV 게놈의 전체 길이는 복수의 6 뉴클레오티드로 재배열되었다. 외인성 유전자를 포함하는 주형 센다이바이러스 게놈과 N-단백질, P-단백질 및 L-단백질을 코드하는 플라스미드(pGEM-N, pGEM-P, pGEM-L)를, 시판의 양이온성 지질 GL-67-DOPE-PEG(Genzyme Co. Ltd.)와 복합체화하여, 백시니아바이러스 vT7-3(Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)과 함께 LLCMK2 세포로 동시 트랜스펙션하였다. 40시간 후, 동결 및 해동을 3회 반복함으로써 세포를 파괴하여, 10일령 발육계란의 장뇨막강내에 주입했다. 그 후, 바이러스는 회수되였고, 난에 있어서의 두 번째 계대에 의해 백시니아바이러스가 제거되었다. 바이러스 적정농도는 닭 적혈구를 사용한 적혈구 응집활성(HA)(Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)에 의해 측정되었고, 바이러스를 포함하는 장뇨액은 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터 함유 조성물로서, 사용 직전까지 -80℃에서 보존되었다.
실시예 2
비강적하 또는 비강관류에 의한 마우스의 비강 및 폐로의 생체내 유전자전달
2-1. 센다이바이러스 벡터와 양이온성 지질과의 비교
pGL3-대조군 벡터(Promega)의 HindIII-BamHI 단편을 인간 사이토메갈로바이러스 인접의 초기(CMV-IE) 프로모터에 의해 유래된 pcDNA3(Invitrogen)의 멀티클로닝 부위에 삽입함으로써 pCMV-루시페라아제를 구축했다. pCMV-루시페라아제를 GL-67-DOPE-PEG(Genzyme Co. Ltd.)와 복합체화하여, GL-67-pCMV-luc를 얻었다.
폐로의 벡터의 유전자 전달효율 및 접촉시간의 유전자 전달효율에 주는 영향을 조사하기 위해, 각 벡터들이 비강내로의 적하 및 관류에 의해 투여되었다. 먼저, 웅성 balb/c 마우스(6 내지 8주령)의 비강내에, 100 ㎕의 여러 농도의 실시예 1에서 제조된 루시페라아제 유전자를 포함하는 센다이바이러스 벡터(SeV-luc) 또는GL-67-pCMV-luc(80 ㎍ DNA/마우스)를 공지의 방법(Yonemitus, Y. et al., Gene Ther. 4: 631-638, 1997)에 따라, 적하했다.
비강관류는, 카테테르(catheter)를 5 mm 비강내에 삽입하고, 페리스타릭 펌프(P-1형, Pharmacia Biotech)를 사용하여 각 150 ㎕의 상기의 벡터용액을 5 내지 6 ㎕/분의 속도로 관류함으로써 실시했다. 유전자 전달 2일후, 과잉량의 펜토바르비탈(pentobarbitar)을 복강내에 주사함으로써, 충분한 마취하에서 마우스를 도살했다. 비갑개, 기관 및 폐를 적출하여, 루시페라아제 활성을 측정했다.
대조군으로서, 실시예 1에서 사용한 pSeV18+b(+)를 사용하여, 상기와 동일하게 유전자 전달과정을 행했다. 이 플라스미드는 아래의 실시예에 있어서도 대조군으로 사용되었다.
루시페라아제 활성은, 공지의 방법(Yonemitsu, Y. et al., Gene Ther. 4: 631-638, 1997)에 따라, 아래와 같이 하여 측정했다. 먼저, 조직을 PBS로 세척하고, 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 1×용해용 완충액 속에서 가위로 잘게 잘라, 4℃, 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 30 ㎕의 상층액을 100 ㎕의 루시페라아제 활성 측정용 완충액(Promega)에 첨가했다. 20℃에서 10초간 미리 항온처리한 후 바로 빛의 강도를 10초간 적분하여 터너 TD20e 루미노미터(Turner TD20e luminometer)(Turner Co.)에 의해 측정했다. 이 조건에서, 1 pg의 재조합 루시페라아제(Promega)는, 2.56×101RLU와 동등하였다. 단백질농도는, 시판의 단백질 분석계(Bio-Rad Laboratories Ltd., Hertfordshire, UK)를 사용하여, 소혈청 알부민에대응하는 표준곡선에 따라, 브래드포드(Bradford)의 방법에 의해 측정했다. 자료는, RLU/mg 단백질로서 나타내고, 각 시료들을 2회 이상 측정했다.
SeV-luc와 GL-67-pCMV-luc의 유전자 전달효율을 비교한 결과를 도 1(폐) 및 도 2(코)에 각각 나타냈다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, SeV-luc로 트랜스펙션된 폐는, 용량 의존적으로 GL-67-pCMV-luc 보다도 10,000배 이상 높은 루시페라아제 활성을 나타냈다. SeV에 의한 루시페라아제 유전자 발현량은, GL-67-pCMV-luc 보다도 접촉시간의 길이에 상관 없이, 약 10,000배 높은 것이 나타내어졌다. 이들 결과로부터, 센다이바이러스 벡터는 기도 상피세포에 접촉시키는 것만으로도 용이하게, 마우스의 폐 및 코에 유전자를 효율 좋게 전달할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
2-2. 센다이바이러스 벡터와 아데노바이러스 벡터와의 비교
SeV-luc 또는 루시페라아제 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터, AdCMV-루시페라아제(Ade-luc) (Kendall, J. M. et al., Cell Calcium 19: 133-142, 1996)를, 실시예 1과 동일한 방법으로 마우스의 비강내에 적하하여, 비갑개, 기관 및 폐를 적출하여, 루시페라아제 활성을 측정했다.
또한, 시미안바이러스 라지T항원의 핵이행 신호를 가진 lacZ 유전자를 운반하는 센다이바이러스 벡터(SeV-NLS-lacZ) 및 아데노바이러스 벡터(AdCMV-nls-lacZ)를 조제하여, 상기 2-1과 동일한 방법으로 마우스의 비강내에 적하했다. 기관지, 기관 및 비갑개를 적출하여, 각각의 조직을 10분동안 0.25% 글루타르알데히드를 포함하는 빙냉 2% 파라포름알데히드와 함께 0.1 M PBS 용액에 고정하고, 회전 진탕하면서 실온에서 3시간동안 X-gal 염색(용액: 5 mM 시안화 칼륨 제1철(potassiumferrus cyanide), 5 mM 시안화 제2철(ferric cyanide), 2 mM 염화마그네슘, 1 mg/ml 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드)했다. X-gal 염색된 조직을 재고정하여, 파라핀을 쌓고, 5 ㎛의 절편을 광학현미경하에서 조사하였다. 결과를 도 3, 4 및 5에 나타내었다.
도 3에 나타내는 바와 같이, SeV-luc로 트랜스펙션된 세포는 Ade-luc로 트랜스펙션된 세포의 5,000배 높은 유전자발현을 나타냈다.
X-gal 양성 상피세포는, 어떤 벡터로 접종한 경우도, 동일한 빈도로 세기관지내에서 분포되어 있었다(도 4). 한편, AdCVM-nls-lacZ로 처리된 마우스의 기관 또는 코에서는 청색 세포가 거의 검출되지 않았지만, SeV-NLS-lacZ로 처리된 동물에서는 X-gal 양성 세포가 높은 빈도로 관찰되었다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 청색세포는, 섬모를 갖는 원주세포 뿐 아니라, 섬모를 갖지 않는 분비세포(NC)에 서도 보였다. 대조적으로, 기저세포(BC)에는 청색 신호는 검출되지 않았다.
이들 결과는, 아데노바이러스 벡터에서는 유전자를 도입할 수 없는 기도 상피세포에 대해서도, 센다이바이러스 벡터를 사용하면 유전자를 전달하는 것이 가능한 것을 나타내고 있었다.
실시예 3
흰족제비 폐로의 유전자전달
흰족제비(체중 500~600 g)를 마취시켜, 실시예 2와 동일하게 하여, 3×108또는 3×109pfu/㎖의 BSS 용액에 정제 SeV-lacZ을 포함하는 3 ㎖을 비강내에 적하했다(각군에 대해 n=3). 대조군(n=2)에는 SeV-Luc(109pfu/㎖)의 3 ㎖를 적하했다. 감염 48시간 후, 흰족제비를 도살하여, 인 시츄에서 기관에 카뉴레(canule)를 삽입하여, 빙냉 고정액(2% 포르말린, 0.2% 글루타르알데히드, 2 mM MgCl2, 5 mM EGTA를 포함하는 PBS용액, pH7.3)으로 폐를 팽창시켰다. 기관 및 폐를 한 덩어리로 하여 적출하여, 실시예 2와 동일하게 하여 X-gal 염색을 행했다. 각 폐를, 7개의 부분, 즉 기관, 4개의 우엽(상부(R1), 중앙(R2, R3) 및 하부(R4)) 및 2개의 좌엽(상부(L1) 및 하부(L2))으로 따로 따로 잘라, 기도 상피 및 점막하 조직선에서의 β-gal 양성 세포를, 계수선 부착 렌즈(graticulated lens)를 사용하여 포인트 카운팅(point counting)에 의해 현미경하에서 계수했다. 하나의 기도 당 청색세포의 비율을 얻기 위해, 하나의 기도에 대해 10×20배 확대시야를 조사하여, 폐엽의 다른 영역(근위, 중앙, 원위)으로부터 무작위로 채취된 3~8개의 기도를 각 폐엽에 대해 조사했다. 점막하 조직의 경우는 폐엽당 10~28개(적어도 4개 조직선을 포함)를 조사하였다. 변동계수(CV)로서 나타내어지는 반복측정의 오차(ERM)는, 18%였다. 동일 동물내에서의 CV는, 3×108pfu/㎖를 수용한 동물에서는 24%와 43%의 사이, 3×109pfu/㎖를 수용한 동물에서는 8%와 14% 사이였다.
기도 상피(도 6A 및 도 7a 및 7b) 및 점막하 조직선(도 6B 및 도 7c)은 용량 의존적으로 β-갈락토시다아제 활성을 보였다. 점막하 조직선은 CFTR의 주된 발현부위이다. 대조군에서는 전혀 활성을 보이지 않았다(도 7d).
실시예 4
인간 정상 기증자의 비강상피세포로의 유전자전달
비강상피세포는 인간 정상 기증자(남성 6명, 여성 3명)로부터 닦아내어 채취했다. 인산완충식염수(PBS: 137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH7.2)로 2회 세척한 후, 세포를 10% 소태아혈청을 포함하는 배양배지(Dalbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에 재현탁시켜, 2군 또는 3군으로 분할하여, 96-배양플레이트의 각 웰에 두었다. 비강세포의 생존은, 섬모운동의 위상차현미경에 의한 관찰 및 트리판블루 양성세포수의 현미경에 의한 계수에 의해 확인되었다. 벡터용액(SeV-luc 및 GL-67-pCMV-luc)이 각 웰에 첨가되었다. 24시간 후, 세포를 모으고, PBS로 3회 세척했다. 그 후, 실시예 2와 동일하게 루시페라아제 활성을 측정했다. 결과를 도 8에 나타내었다.
SeV-luc로 트랜스펙션된 세포는 GL-67-pCMV-luc로 트랜스펙션된 세포보다 약 1,000배 높은 루시페라아제 활성을 나타냈다.
실시예 5
양 기관 상피세포로의 유전자전달
5-1. 점액이 유전자전달에 미치는 영향
점액이 각 벡터의 유전자 전달효율에 미치는 영향을 양 기관 모델을 사용하여 조사했다. 양 기관 모델은 공지의 방법에 따라 조제했다(Kitson, C. et al., Gene Ther. 6: 534-546, 1999). 도살후, 절제된 양 기관의 상피층을 근육과 외막으로 따로 따로 잘라, 0.5 ㎠의 정방형 절편으로 절단하고, 그 후 차례로 위상차현미경하에서 섬모운동을 확인했다. 몇 개의 조직에 있어서는, 공지의 방법에 따라 점액을 제거했다(Kitson, C. et al., Gene Ther. 6: 534-546, 1999). 이들 조직을 기체-액체 계면에 두었다. 10 ㎕의 SeV-luc 또는 GL-67-luc 벡터 용액을 트랜스펙션을 행하기 위하여 선단표면에 적하하였다. 48시간 후, 실시예 2와 동일하게, 선단표면의 루시페라아제 활성을 측정했다. 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타내어지는 바와 같이, 점액은 GL-67-luc 매개한 유전자전달과 비교하여, SeV 매개한 유전자전달에 커다란 영향을 미치지 않았다.
5-2. 점액의 점성이 유전자전달에 미치는 영향
유전자전달 직전에 여러 농도의 소 타액선 점액을 가한 것 이외에는 상기 5-1과 동일한 과정을 행했다. 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타내어지는 바와 같이, GL-67-luc에 의한 유전자전달은 점액의 첨가에 의해 저해되었다. 또한, 시료에 점액을 첨가한 경우의 루시페라아제 활성은 무처리 세포의 루시페라아제 활성과 중요한 차이가 없어던 것으로부터, 점액의 점성이 아니라, 점액 자체가 양이온성 지질을 매개로 한 유전자전달의 장벽이 되고 있는 것이 나타났다. 한편, 장액의 점액성분은 SeV에 의한 감염효율에 영향을 주지 않지만, 점성은 SeV를 매개로 한 트랜스펙션에 약간 영향을 주는 것으로 나타났다.
5-3. 부위 특이적 트랜스펙션 효율
5-1과 동일한 방법으로, 양 기관 상피가 SeV-luc 또는 AdCMV-luc로 트랜스펙션되었다. 유전자전달 후, 조직의 단부를 절개, 절단하여, 단부 및 중앙부의 루시페라아제 활성을 각각 측정했다. 결과를 도 11에 나타내었다. 또한, SeV-luc와 AdCMV-luc 대신에, SeV-GFP 및 CMV-IE 프로모터에 유래된 GFP를 운반하는 높은 적정농도의 아데노바이러스 혈청형 5인 AdCMV-GFP(Kramel Biotech International Ltd.)를 사용하여, 상기의 동일한 유전자 전달 과정을 행했다. 유전자전달 2일 후, 형광위상차현미경하에서 녹색형광단백질(GFP)신호를 관찰했다. 결과를 도 12에 나타냈다.
도 11 및 12에 나타내는 바와 같이, 양 기관 조직에 있어서 AdCMV-luc는 손상된 단부에서 높은 발현을 보였고, 반면 손상받지 않는 중앙부에서는 상대적으로 발현이 적게 보였다. 대조적으로, SeV-luc로 처리한 조직은, 단부와 중앙부에서의 유전자발현에 중요한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 6
SeV/CFTR의 구축과 전기생리학적 특성
CF의 원인유전자인 CFTR을 발현하는 재조합 센다이바이러스 벡터를 구축했다. CFTR 유전자(Riordan, J. R. et al., Science 245: 1066-1073, 1989)를 E 및 S 신호 서열을 포함하는 프라이머세트를 사용한 PCR에 의해 증폭했다. 사용한 프라이머세트를 아래에 나타내었다.
포워드 프라이머: 5'-acttgcggccgccaaagttcaatgcagaggtcgcctctggaaaaggccagc-3'(서열번호: 4)
리버스 프라이머: 5'-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggctaaagccttg
tatcttgcacctcttcttc-3'(서열번호: 5)
증폭단편을 pSeV18+b(+)의 NotI 부위에 삽입하여, 실시예 1과 동일하게 하여 바이러스의 재구축을 행했다.
제조된 CFTR 발현 센다이바이러스(sample-1 SeV/CFTR)로 감염된 COS7세포를 감염시키고 얻어진 감염세포를 전체 세포 패치 고정(whole-cell patch clamp)법에 의해 분석했다. 도 13에 전체 세포 패치 고정법의 개략을 나타내었다. 배쓰용액(bath solution) 중의 세포에 피펫용액을 함유하는 유리 피펫을 접촉시켜, 음압을 걸어 세포막을 제거했다. 이 때, 피펫용액은 145 mM NMDG+, 148.4 mM Cl-, 6.7 mM Mg2+, 5 mM ATP, 10 mM 글루코오스, 0.1 mM EGTA 및 10 mM HEPES (Tris에 의해 pH7.4로 적정했다)를 함유하고, 배쓰 용액은 141 mM Na+, 152.4 mM Cl-, 152.4 mM H2PO4 -, 5 mM K+, 1.7 mM Mg2+, 2 mM Ca2+, 10 mM 글루코오스, 0.1 mM EGTA 및 10 mM HEPE (Tris에 의해 pH7.4로 적정했다)를 함유한다. 시료-1 SeV/CFTR을 발현하는 COS7 세포중의 막전류에 있어서의 포스코린(forskolin)의 효과를, 전체 세포 기록법(whole-cell recording)에 의해 조사했다(도 14). 그 결과, 포스코린농도 의존적인 내향 전류가 관찰되었고(하향으로 기록이 내려갔다), 이것은글리벤클라미드(glibenclamide)(염화물 채널 차단제)에 의해 억제되었다(상향으로 추이되었다). 한번 세척한 후, 다시 포스코린을 가하면 내향 전류가 재현되고, 글리벤클라미드에 의해 다시 억제되는 것으로부터, 관찰된 전류의 변화가 특이적인 약제-유도반응인 것이 확인되었다.
이어서, 각각의 약제-유도반응의 시간 의존성을 조사했다(도 15). Sample-1 SeV/CFTR을 발현하는 COS7 세포에 있어서, 포스코린은 Cl-전류를 유도하여, 염화물 채널에 특징적인, 시간-비의존적인 반응이 관찰되었다. 글리벤클라미드(300 μM)는 포스코린 유도성 Cl-전류를 저해했다.
도 16은, sample-1 SeV/CFTR을 발현하는 COS7 세포에 있어서의, 포스코린 존재하 또는 비존재하의, 상기의 자료를 토대로 도출한 전류와 전압의 관계를 나타내었다. 내인성 Cl 전류가 없으면, 직선은 원점에서 교차하였다. 얻어진 그래프에서는 직선은 10~20 mV에서 교차했다. 이것은, COS7 세포에, CFTR에 의해 유도되는 전류 이외(포스코린 비의존성)의 다른 Cl 전류가 흐르고 있는 것을 시사하였다. 도 17은, 포스코린 투여중에 기록된 전류로부터 포스코린 투여전에 기록된 전류를 뺌으로써, 포스코린의 존재하 또는 비존재하에 있어서의 막전류의 차이(정미의 막전류)를 나타내었다.
산업상이용가능성
본 발명은, 종래의 유전자 도입용 벡터로는 효과적으로 유전자를 도입할 수없었던 기도 상피로의 외인성 유전자 도입용 재조합 센다이바이러스 벡터와 그 벡터를 사용한 외인성 유전자 도입방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터를 세포에 단시간 접촉시키는 것만으로 천연의 점액으로 덮인 기도 상피세포에 효율 좋게 유전자를 전달하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 벡터는, 마우스보다 대형 포유동물에 유래하는 기도 상피세포에 대해서도 감염시킬 수 있으며. 이는, 본 발명의 벡터에 의해, 기도 상피세포로의 유전자도입이 유효한 유전자치료가 가능하다는 것을 시사한다. 더욱이, 본 발명의 벡터는 기도 상피세포의 선단표면 뿐 아니라, CFTR이 주로 발현하는 점막하 조직선에도 유전자를 도입할 수 있기 때문에, CFTR이 결손된 질환인 CF에 대한 유전자치료에 사용하는 것이 가능하다.

Claims (10)

  1. 외인성 유전자를 운반하는 재조합 센다이바이러스 벡터를 포함하는, 기도 상피로의 외인성 유전자 도입용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 센다이바이러스 벡터가 F 유전자, HN 유전자 및 M 유전자 중 적어도 하나를 포함하지 않는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 계란장뇨액을 더욱 포함하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 낭포성 섬유증의 치료를 위한 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 유전자가, 낭포성 섬유증 막관통 전도성 제어인자(CFTR)유전자 또는 CFTR과 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 상기 유전자의 유도체인 조성물.
  6. 외인성 유전자를 운반하는 재조합 센다이바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 점액으로 피복된 기도 상피에 접촉시키는 것을 포함하는, 기도 상피로의 외인성 유전자 도입방법.
  7. 제6항에 있어서, 센다이바이러스 벡터가 F 유전자, HN 유전자 및 M 유전자 중 적어도 하나를 포함하지 않는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 조성물이 계란장뇨액을 더욱 포함하는 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 유전자가, 낭포성 섬유증 막관통 전도성 제어인자(CFTR)유전자 또는 CFTR과 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 상기 유전자의 유도체인 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 기도 상피가 코, 후두, 기관 또는 폐의 전도기도 또는 가스 교환면에 존재하는 방법.
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