CN1252274C - 用于将外源基因导入气道上皮细胞的重组仙台病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于将外源基因导入气道上皮细胞的重组仙台病毒载体，以及利用该载体导入外源基因的方法。所述重组仙台病毒载体能通过与被粘液覆盖的自然状态的气道上皮细胞短暂的接触而将基因有效转移至这些细胞中。此外，所述载体不仅能将基因导入最表层，还可导入至主要表达CFTR的粘膜下腺体中。由此可知所述载体可用于CF(CFTR-缺陷型疾病)的基因治疗。

Description

用于将外源基因导入气道上皮细胞 的重组仙台病毒载体
发明领域
本发明提供用于将外源基因导入气道上皮细胞的重组仙台病毒载体，以及利用该载体转导外源基因的方法。
背景技术
随着分子克隆技术的进步，许多因突变而导致重要人类疾病的基因相继得到确认和分离。患者缺失或突变的基因可通过回体(ex vivo)技术来取代，这种技术通过在体外用裸露的DNA、包裹在脂质体中的DNA、以及适当的染色体整合型载体对细胞进行转染，然后再将其导入宿主器官(回体基因治疗)来得以实现。
基因治疗提供了将所需基因转移至受试者并使其在体内表达的治疗手段。基因转移可通过回体方法，即转染受试者的细胞或组织，然后再将其导入该宿主中来完成。也可以将基因直接导入受试者。
Nabel等人(Science(1990)249：1285-1288)用含有β-gal表达质粒的脂质体对猪进行体内动脉内转染时，在动脉壁上观察到位点特异性基因表达。但是，回体治疗还存在若干缺点。例如，如果仅转染分化后的正在复制的细胞，则导入的基因功能有可能随这些细胞的成熟和死亡而丢失。同时，回体方法只能用于转染非常有限的一部分细胞，而且只能用于转染那些最初从机体内取出的细胞。
如上所述，在基因治疗中，适当选择所要转导的基因、表达转导基因的靶细胞、适应于靶组织的基因转移方法、以及给药的途径是非常重要的。
肺囊胞性纤维化(Cystic fibrosis，CF)是一种常染色体隐性遗传病，它导致先天性代谢障碍。CF患者在美国和欧洲较常见。每2,000-2,500个婴幼儿中就有一个罹患此病。该疾病的主要症状是由于外分泌异常导致了粘性分泌物在诸如肺部、呼吸道、胰腺、肝脏和小肠等器官中积累。目前对CF的治疗主要采用肺移植和对肺传染性疾病的抗生素治疗来进行。尤其肺传染病是致死性的。
已经确认肺囊胞性纤维化跨膜传导调节子(CFTR)基因的变异是导致CF的原因(Riordan，J.R.等，Science 245：1066-1073，1989)，因此可以期待开发将携有正常CFTR基因的载体导入气道上皮细胞的CF来进行基因治疗。在CF的基因治疗中，外源基因需直接导入体内，因为回体治疗不能用于肺部和上呼吸道。
有人尝试将载体给药至肺。Hazinski等(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.(1991)4：206-209)公开了DNA经脂质体介导而转移至完整的啮齿动物肺部的方法。将阳离子脂质体与以下三种基因构成的融合基因结合，使其成为基因复合体。三种基因分别为：1)与劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子相连的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因；2)与小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子相连的CAT基因；和3)巨细胞病毒-β-半乳糖苷酶(CMV-β-gal)融合基因。将脂质体/DNA复合体投入大鼠的颈部气管，可检测到一定程度的基因表达。
Brigham等人(Am.J.Med.Sci.(1989)298：278-281)公开了利用脂质体将CAT基因向鼠肺部进行体内转染的方法。转染通过静脉内、气管内、或腹腔内注射而实现。除腹腔内给药外，静脉内给药和气管内给药都能使CAT基因在肺内表达。
Canonico等人(Clin.Res.(1991)39：219A)描述了由CMV启动子驱动的人类α-1抗胰蛋白酶基因在牛肺上皮培养细胞中的表达。所述基因由脂质体导入培养细胞中。试验中还检测了通过向新西蓝白兔(New Zealand whiterabbit)静脉运送了与脂质体复合的基因复合体后，α-1抗胰蛋白酶在其肺组织切片中的表达。
此外，美国专利第5,958,893号公开了利用现有载体如腺病毒载体和阳离子脂质体转导编码截短型CFTR的基因的方法。
但是，有报告指出，利用腺病毒介导向气道上皮细胞的基因转移时，其效率较低。有人分析腺病毒颗粒被表层浆膜摄入的速率较低的原因，是由于气道上皮细胞的表面既不存在作为腺病毒的受体的αβγ3整联蛋白，也不存在CAR受体(Goldman，M.等，Gene Ther.3：811-818，1996，Boucher，R.C.，J.Clin.Invest 103：441-445，1999)。另外，在使用阳离子脂质体的情况下，据报道是粘液阻止了它们的摄入，通过除去粘液可提高基因转移效率(Kitson，C.等，Gene Ther.6：534-546，1999，Zabner，J.等，J.Biol.Chem.270：18997-19007，1995，Fasbender，A.等，Gene Ther.4：1173-1180，1997)。
迄今为止，尚无关于能将外源基因有效地导入气道上皮细胞的载体***和基因转移方法的报道。因此，迫切希望开发能有效地用于向气道上皮细胞转移基因的载体。
仙台病毒属于副粘病毒科，是非常有效的基因转移载体，它的开发在最近取得了很大的进展(Kato，A.等，EMBO J.16：578-598，1997，WO97/16538，WO97/16539)。仙台病毒毒性较低且能以非常高的水平表达导入基因。这种病毒的安全性很好，因为***该病毒载体的基因不会整合至宿主染色体中。据报道，仙台病毒载体的转染能力与腺病毒不同(Goldman，M.等，Gene Ther.3：811-818，1996，Boucher，R.C.，J.Clin.Invest 103：441-445，1999)。例如，与未受损部位相比，腺病毒更易于感染受损部位(Kitson，C.等，Gene Ther.6：534-546，1999，Zabner，J.等，J.Biol.Chem.270：18997-19007，1995，Fasbender，A.等，Gene Ther.4：1173-1180，1997)。所有这些报道提示，仙台病毒可弥补腺病毒的缺陷。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能将外源基因导入气道上皮细胞的载体以及一种利用所述载体转导外源基因的方法。
本发明人分别研究了各种含有外源基因的重组仙台病毒载体、腺病毒载体和阳离子脂质体复合物在体外和体内对来自各种动物的气道上皮细胞的基因转导效力。结果显示，仙台病毒载体比腺病毒载体和阳离子脂质体复合物能更有效地将外源基因导入气道上皮细胞。
本发明人还发现，重组仙台病毒载体不仅能将外源基因有效地导入容许性小鼠呼吸道，而且还能导入雪貂(ferret)、绵羊和人类等非容许性大动物的气道上皮细胞。并且，本发明人还发现重组仙台病毒载体不仅能感染上皮细胞的最表面，还能对未受损部位的粘膜下的腺体进行感染。根据这些发现完成了本发明。
具体地，本发明提供了含有携带外源基因的重组仙台病毒载体的，能将外源基因导入气道上皮细胞的组合物。
本发明还提供了将外源基因导入气道上皮细胞的方法，该方法包括使含有重组仙台病毒载体的组合物与被粘液覆盖的气道上皮细胞接触的过程，其中所述仙台病毒携带外源基因。
以下详细地说明本发明。
本文中“重组仙台病毒载体”是指由重组仙台病毒cDNA重建的病毒和病毒样颗粒产物，它包含重组仙台病毒RNA以及具有感染性的仙台病毒的构造物。本文中“感染性”是指病毒通过与细胞吸附而将其核酸等转移至细胞中的能力以及通过包括病毒包膜与宿主细胞膜融合在内的各种机理而进入细胞的能力。所述重组仙台病毒载体可以是核糖核蛋白体(RNP)。
本文中“基因”包含RNA和cDNA。
“气道上皮细胞”是指存在于鼻、咽、气管、或任何导气通道的内表面的层状纤毛上皮细胞以及杯状细胞和无纤毛细胞(Clara cell)，或者是存在于肺内的包括I型和II型肺细胞(pneumocyte)在内的换气泡表面的细胞。
本发明的重组仙台病毒载体携带重组仙台病毒的基因。天然的仙台病毒基因组由一个较短的3’前导区和核衣壳(N)基因、磷酸蛋白(P)基因、基质(M)基因、融合(F)基因、血凝素-神经氨酸酶(HN)基因、大(L)基因、和一个较短的5’拖尾区依次组成。
作为起始物质产生重组仙台病毒载体的仙台病毒基因可以有缺失或被修饰，只要所重建的重组仙台病毒载体可以感染气道上皮细胞，并在感染细胞中表达载体所携带的外源基因即可。例如，可使用不完整的病毒如DI颗粒(J.Virol.68：8413-8417，1994)。
为了用于基因治疗，重组仙台病毒载体最好是具有感染性，但不具有传播能力。最好是使F基因、HN基因和M基因中的至少一个缺失而使其丧失传播能力。这类载体包含，例如，仅在F基因中有缺陷的仙台病毒Z株的基因。其它例子还有pSeV18+b(+)(Yu，D.等，Genes to Cells 2：457-466，1997)和pSeV(+)(Kato，A.等，EMBO J.16：578-587，1997)。
重组仙台病毒基因可通过将外源基因***上述仙台病毒基因中而获得。外源基因可以是任何基因，只要它编码能在靶气道上皮细胞中表达的蛋白即可。为了对CF进行基因治疗，可使用CF的结构基因如CFTR基因(Riordan，J.R.等，Science 245：1066-1073，1989)，。外源基因包括编码天然蛋白的基因，以及通过对上述基因进行缺失、取代、或***等修饰而获得的能编码功能相当于天然蛋白的那些基因。例如，美国专利第5,958,893号公开了一种修饰型CFTR基因。其它外源基因的例子包括编码α-1胰蛋白酶(Long等，Biochem 23：4828-2837，1984)，DNA酶，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶等基因。
携有外源基因的重组仙台病毒载体可按Kato，A.等(EMBO J.16：578-587，1997)和Yu，D.等(Genes to Cells 2：457-466，1997)所述的方法来制备。
首先，制备含有所需基因的cDNA碱基序列的DNA试剂。该DNA试剂的浓度优选在25ng/μl以上，且最好能通过电泳确认其为单个质粒。靶cDNA序列中如果有NotI识别位点应先除去。为了用所述DNA试剂去扩增所需DNA片断，制备包含NotI识别位点序列、下述转录终止序列(E)、间插序列(I)、和转录起始序列(S)；以及靶基因序列的一部分的正向侧和反向侧(反义链)合成型DNA序列作为引物对，从样品中扩增并回收所需基因片段。
制备正向侧合成型DNA序列时，从5’侧任选两个或多个寡核苷酸DNA，优选不含NotI识别位点的4个碱基，如GCG和GCC的序列，但最好是包含ACTT序列，并在3’侧添加NotI识别位点gcggccgc。另外，在3’末端还添加任意的9个碱基，或9加6的倍数个碱基作为间隔臂。此外，在3’侧添加一段对应于ORF中始于目标cDNA的起始密码子ATG(含ATG)的25个碱基的序列。在这种情况下，从目标cDNA选出近25个碱基，使得正向侧合成型寡核苷酸DNA的3’末端为G或C。
制备反向侧合成型DNA序列时，从5’侧任选两个或多个寡核苷酸DNA，优选不含NotI识别位点的4个碱基，如GCG和GCC的序列，但最好是包含ACTT序列，并在3’侧添加NotI识别位点gcggccgc，以及一个寡核苷酸DNA***片段以调整长度。这一寡核苷酸DNA的长度被设计成使得包括NotI识别位点gcggccgc在内的cDNA互补链碱基数和仙台病毒基因组的EIS碱基数的总和为6的倍数(所谓“6的法则”；Kolakofski，D.等，J.Virol.72：891-899，1998，Calain，P.和Roux，L.，J.Virol.67：4822-4830，1993)。反向侧合成型寡核苷酸DNA的3’末端可如下制备：在所述***片段的3’侧添加仙台病毒S序列的互补链，优选5’-CTTTCACCCT-3’，I序列，优选5’-AAG-3’，以及E序列的互补链，优选5’-TTTTTCTTACTACGG-3’，一段以G或C结尾的互补链，其对应于从目标cDNA序列终止密码子开始反向计数的25个碱基。
PCR利用使用ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Co.)的标准方法进行。优选使用Vent聚合酶(NEB)，所扩增的靶片段用NotI消化后***质粒载体pBluescript的NotI位点。所得PCR产物的碱基序列通过测序仪检验，从中选出带有正确序列的质粒。用NotI处理选出的质粒并回收靶片段，然后***仙台病毒基因组cDNA质粒，如pSeV18+b(+)(Yu，D.等，Genes to Cells 2：457-466，1997)或pSeV(+)(Kato，A.等，EMBO J.16；578-587，1997)中的NotI位点，获得已***外源cDNA的重组仙台病毒cDNA。或者，也可以不使用质粒载体pBluescript而直接将扩增的靶片段***到NotI位点中来获得重组仙台病毒cDNA。
通过在体外或在细胞中转录如上述制备的重组仙台病毒cDNA来重建病毒，可获得重组病毒载体。病毒可通过已知方法从cDNA重建(WO97/16538，WO97/16539)。
从cDNA重建病毒可如下方法实施：
将猴肾细胞系LLCMK2在6孔塑料板上用含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100个单位/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)的极限必需培养基(MEM)培养至70％-80％铺满(1×106cells)。然后用已被UV辐射灭活了的能表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3以2PFU/细胞的浓度感染这些细胞(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8122-8126，1986，Kato，A.等，Genes Cells 1：569-579，1996)。感染1小时后，用60-2μg，最好是3-5μg上述重组仙台病毒cDNA和能表达合成整个仙台病毒基因组所必需的反式作用的病毒蛋白的质粒(24-0.5μg pGEM-N，12-0.25μg pGEM-P，和24-0.5μgpGEM-L，或更理想的是1μg pGEM-N，0.5μg pGEM-P和1μg pGEM-L)(Kato，A.等，Genes Cells 1：569-579，1996)通过Superfect(QIAGEN Inc.)脂转染方法对这些细胞进行共转染。将转染后的细胞培养在不含血清、但含有100μg/ml利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)，最好是40μg/ml阿糖胞苷(AraC)的MEM中，使这些药物的浓度最佳化，从而使得痘苗病毒的细胞毒活性最小而病毒的回收量最大(Kato，A等，1996，Genes Cells 1：569-579)。转染的48小时后，回收细胞并通过反复冻融3次使细胞破碎，然后将它们注射至10日龄鸡胚的绒毛尿囊腔中。3天后，回收尿囊液，通过检测血凝素(HA)活性来测定病毒滴度。HA可通过“终点稀释法”测定(Kato，A.等，1996，Genes Cells1：569-579)。未检测出HA的试样再次注射至鸡胚中。所收获的仙台病毒的滴度通常为108-109PFU/ml，其中包含的痘苗病毒vTF7-3的残留滴度是在103-104PFU/ml以下。可以将试样稀释106倍后，再注释于鸡胚中增殖以便除去痘苗病毒。将在鸡胚中传代二代或三代后获得的重组病毒保存，作为已***了目标cDNA的重组病毒载体。所保存的病毒的空斑形成能力通常为109PFU/ml或10,240HA单位/ml，为维持病毒的滴度，将病毒保存在-80℃。
对用于重建的宿主细胞无特别限制，只要重组型仙台病毒的cDNA能在这些细胞中得到重建即可。作为宿主的细胞系包括猴肾CV-1细胞和仓鼠肾BHK细胞，以及LLCMK2细胞和人源的细胞等培养细胞。
重建的重组仙台病毒可在其包膜表面结合粘附分子、配体、受体等，从而促进对特定细胞的粘附。
上述含有病毒载体的绒毛尿囊液可作为本发明的含有重组仙台病毒载体的组合物使用。
本发明的组合物可包含任何符合生理学要求的培养基，如去离子水、5％葡萄糖的水溶液等。组合物中还可包含其它附加成分，如稳定剂、杀生物剂等。此外，含有重组仙台病毒载体的组合物可以做成冻干剂。这种组合物中除了上述添加剂以外，还可包含诸如白蛋白、PrionexTM(Pentapharm，Japan)等其它稳定剂。
重组仙台病毒中所含的外源基因可通过使含有该重组仙台病毒载体的组合物与被粘液覆盖的气道上皮细胞接触而被导入气道上皮细胞中。由于当使用阳离子脂质将基因转移至气道上皮细胞时，气道粘液严重阻碍阳离子脂质介导的基因转移，所以，为了导入外源基因，需将粘液除去。相反，本发明的含有仙台病毒载体的组合物可以仅通过其与带有粘液的气道上皮细胞的接触而轻易地将外源基因导入其中。
本发明的导入外源基因的方法可用于使预期能治疗气道上皮细胞疾病的外源基因，或编码所述细胞中缺陷的蛋白的内源基因进行表达的基因治疗。例如，本发明的含有携带CFTR基因的病毒载体的组合物可用于治疗CF。基因治疗可通过将本发明的含有病毒载体的组合物通过体内或回体施用于病灶部位的气道上皮细胞并使外源基因在这些细胞中表达而实现。体内基因转移可通过局部用药来实施，如对鼻腔或肺进行灌滴或利用喷雾器进行吸入。喷雾器的实例包括市售商品和通常用于治疗哮喘的那些器具。
本发明的含有病毒的组合物可应用于任何哺乳动物，包括人类、小鼠、兔、绵羊、牛和猴等。
附图简述
图1显示本发明的重组仙台病毒载体和一种阳离子脂质复合体在小鼠肺部和鼻内的体内基因转移效率。误差范围用SEM表示。
图2显示本发明的重组仙台病毒载体(A)和一种阳离子脂质复合体(B)通过滴鼻(短暂接触)和鼻腔灌注(较长时间接触)向小鼠鼻内转移基因时，接触时间对转移效率的影响。误差范围用SEM表示。
图3显示本发明的重组仙台病毒载体和腺病毒载体通过滴鼻方式向小鼠鼻内进行基因转移的效率。误差范围用SEM表示。
图4显示通过用本发明的重组仙台病毒载体和腺病毒载体经滴鼻导入β-gal基因后，经X-gal染色检测的小鼠细支气管、气管和鼻内β-gal基因表达的显微镜检照片。
图5显示通过用本发明的重组仙台病毒载体和腺病毒载体经滴鼻导入β-gal基因后，经X-gal染色检测小鼠气管和鼻内β-gal基因表达的显微镜检照片。NC表示非纤毛样分泌细胞，BC表示基底细胞。
图6显示用本发明的重组仙台病毒载体经滴鼻导入β-gal基因后，该基因在雪貂肺内的表达。R1表示右上肺叶、R4表示右下肺叶、L1表示左上肺叶。
图7显示用本发明的重组仙台病毒载体经滴鼻导入β-gal基因后，检测该基因在雪貂肺内表达的显微镜检照片。图 a为左上肺叶，图 b为中右肺叶，图 c粘膜下腺体，图 d为对照图。此外，Lm表示支气管腔，sm表示粘膜下腺体。
图8显示本发明的重组仙台病毒载体及一种阳离子脂质复合体向来自健康人供体的人类鼻上皮细胞转移基因的效率。误差范围用SEM表示。
图9显示本发明的重组仙台病毒载体及一种阳离子脂质复合体向绵羊气管细胞转移基因的效率。F表示未处理细胞，MD表示除去了粘液的细胞。误差范围用SEM表示。
图10显示本发明的重组仙台病毒载体及一种阳离子脂质复合体向添加了粘蛋白的绵羊气管细胞转移基因的效率。F表示未处理细胞，MD表示除去了粘液的细胞。误差范围用SEM表示。
图11显示本发明的重组仙台病毒载体及腺病毒载体向绵羊气管细胞的边缘部分和中央部转移基因的效率。误差范围用SEM表示。
图12显示本发明的重组仙台病毒载体及腺病毒载体向绵羊气管细胞转移GFP基因时，GFP信号的显微镜检照片。
图13图示常规全细胞构成的示意图。
图14显示，在能表达样品-1 SeV/CFTR的COS7细胞中，-60mV时被毛喉素(forskolin)诱导的向内流入的电流随时间变化的图谱。膜电位保持-60mV的支持电位。纵向的震动用以15秒的间隔从-100mV到+60mV的矩形脉冲(持续时间，1秒)来表示。虚线表示0电流水平。
图15显示毛喉素对能表达样品-1 SeV/CFTR的COS7细胞中膜电流的影响。膜电位保持-60mV的支持电位。虚线表示0电流水平。优降糖(Glibenclamide)(300μM)抑制毛喉素诱导的Cl电流。
图16显示在没有或有10μM毛喉素时获得的电流-电压的关系。膜电流的振幅至少用100毫秒(ms)指令脉冲(持续1秒)来测定。直线由最小二乘法得到。
图17显示能表达样品-1 SeV/CFTR的COS7细胞中的净膜电流，它通过从应用10μM毛喉素期间记录的膜电流中减去应用毛喉素之前记录的膜电流而获得。膜电位保持-60mV的支持电位。虚线表示0电流水平。
实施本发明的最佳模式
以下，记载了本发明的实施范例，但本发明不仅局限于这些实施范例。
实施例1
重组仙台病毒载体的构建和重建
重组仙台病毒通过已知方法进行构建(Kato，A.等，EMBO J.16：578-598，1997，Hasan，M.K.等，J.Gen.Verol.78：2813-2810，1997)。首先，将18bp的带有NotI限制性位点的间隔臂序列(5′-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3′)***克隆化SeV基因组cDNA(pSeV(+))的前导序列与N-蛋白编码序列5′端之间的基因座位中，获得含有来自丁型肝炎病毒反基因组链(antigenomic strand)的自我裂解型核酶位点的质粒pSeV18+b(+)。将含有核定位信号的大肠杆菌lacZ、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)和大肠杆菌lacZ的完整cDNA用带有NotI位点的引物以及一组新的针对外源基因的SeV E和S信号序列标签经聚合酶链式反应扩增，然后***克隆化基因组的NotI位点。带有外源基因的模板SeV基因组的全长被设计成6个核苷酸的倍数。将带有外源基因的模板SeV基因组和编码N-蛋白、编码P-蛋白和编码L-蛋白的质粒(pGEM-N，pGEM-P，pGEM-L)与市售阳离子脂质GL-67-DOPE-PEG(Genzyme Co.Ltd.)混合，然后与痘苗病毒vT7-3(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8122-8126，1986，Kato，A.等，Genes Cells 1：569-579，1996)一起共转染LLCMK2细胞。40小时后，将这些细胞回收并通过3轮反复冻融而破碎，然后注射至10日龄鸡胚的绒毛尿囊腔中。然后回收病毒，通过在受精卵中第二次传代而除去痘苗病毒。病毒滴度通过用鸡红细胞进行的血凝素试验(HA)来测定(Kato，A.等，Genes Cells 1：569-579，1996)，将含有病毒的绒毛尿囊液冻存在-80℃备用，它可以作为含有本发明的重组仙台病毒载体的组合物使用。
实施例2
通过鼻滴入或鼻灌注向小鼠鼻腔和肺部进行体内基因转移
2-1.仙台病毒载体与阳离子脂质的对比
pCMV-萤光素酶如下构建：将pGL3-对照载体(Promega)的HindIII-BamHI片段***受CMV-IE启动子驱动的pcDNA3(Invitrogen)的多克隆位点构建pCMV-萤光素酶。然后将pCMV-萤光素酶与GL-67-DOPE-PEG(Genzyme Co.Ltd.)组合得到GL-67-pCMV-luc。
为了调查所述载体向肺进行基因转移的效率，以及接触时间对基因转移效率的影响，将所述载体通过滴注和灌注的方式给药至鼻腔。首先，将实施例1中制备的含有萤光素酶的仙台病毒载体(SeV-luc)或通过已知方法制备的GL-67-pCMV-luc(80μg DNA/小鼠)以100μl的各种浓度经鼻内滴注的方式给药至雄性balb/c小鼠(6-8周龄)(Yonemitsu，Y等，Gene Ther.4：631-638，1997)。
通过将导管***鼻内5mm，用蠕动泵(P-1型，Pharmacia Biotech)以5-6μl/分钟的速度灌注上述各种载体溶液150μl。2天后，腹腔内注射过量的戊巴比妥，在充分麻醉的情况下将小鼠处死，切取鼻甲骨、气管和肺进行萤光素酶活性试验。
作为对照，将实施例1中所用pSeV18+b(+)也按上所述方法进行基因转移。该质粒也用于以下实施例中作为对照。
萤光素酶活性测定如下述按照已知方法进行(Yonemitsu，Y等，Gene Ther.4：631-638，1997)。首先，用PBS洗涤组织，在1x含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中用剪刀将组织剪碎，于4℃以13,000rpm离心10分钟后，取30μl上清加至100μl的萤光素酶活性测定缓冲液(Promega)中。在20℃进行10秒钟的预保温后，紧接着用Turner TD20e发光仪(Turner Co.)进行10秒钟的累计积分(integration)，测定光密度。在这种情况下，1pg重组萤光素酶(Promega)相当于2.56×101RLU。蛋白浓度通过Bradford方法用市售蛋白分析***(Bio-Rad Laboratories Ltd.，Hertfordshire，UK)根据对应于牛血清白蛋白标准曲线来测定。数据表示为RLU/mg蛋白，每份样品测试两次以上。
图1(肺)和图2(鼻)显示SeV-luc和GL-67-p-CMV-luc之间基因转移效率的对比。如图1所示，SeV-luc转染的肺的萤光素酶活性以剂量依赖性方式高出GL-67-pCMV-luc转染的肺的酶活性10,000倍以上。SeV的萤光素酶基因表达与接触时间无关，均比GL-67-pCMV-luc高约10,000倍。这些结果提示，SeV仅通过与气道上皮细胞接触就能有效地向小鼠肺部和鼻内转移基因。
2-2.仙台病毒载体与腺病毒载体的比较
将SeV-luc或含有萤光素酶基因的腺病毒载体AdCMV-萤光素酶(Ade-luc)(Kendall，J.M.等，Cell Calcium 19：133-142，1996)按照与实施例1相同的方式滴入鼻内，切取鼻甲骨、气管和肺进行萤光素酶活性试验。
制备携带猴病毒大T抗原的核定位信号以及lacZ基因的仙台病毒载体和腺病毒载体(SeV-NLS-lacZ和AdCMV-nls-lacZ)，按照2-1中所述的方法滴入鼻内。切取支气管、气管和鼻甲骨。将每种组织用经过冰冷却的含2％多聚甲醛和0.25％戊二醛的0.1M PBS固定10分钟，然后在室温摇床上进行X-gal染色(溶液：5mM氰化亚铁钾，5mM氰化亚铁，2mM氯化镁，1mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷)3小时。将被X-gal染色的组织再固定后，用石蜡包埋，切出5μm切片进行光学显微镜镜检。结果见图3，4和5。
如图3所示，被SeV-luc转染的细胞比被Ade-luc转染的细胞的基因表达高5,000倍。
无论是周哪种载体接种，X-gal阳性细胞以相似频率分散在细支气管中(图4)。另一方面，用AdCMV-nls-lacZ处理的小鼠的气管或鼻内，蓝细胞很少见。但用SeV-NLS-lacZ处理的小鼠中，X-gal日性细胞很常见。如图5所示，蓝染不仅可见于纤毛柱状细胞，还可见于无纤毛的分泌细胞(NC)。相比之下，在基细胞(BC)中，未检测到蓝色信号。
这些结果揭示，仙台病毒能将基因转移至腺病毒载体转导不了基因的气道上皮细胞。
实施例3
向雪貂肺部转移基因
将雪貂(体重500-600g)麻醉，以3×108或3×109pfu/ml(每组n＝3)如实施例2所述从鼻内滴入3ml含纯化SeV-LacZ的BSS溶液。作为对照(n＝2)，滴入3ml SeV-Luc(109pfu/ml)。在感染48小时后，处死雪貂，在气管中原位***导管，用冰冷却的固定液(2％***，0.2％戊二醛，2mM MgCl2，5mM EGTA的PBS溶液，pH 7.3)将肺扩张。将气管和肺一起切出，如实施例2所述进行X-Gal染色。将每个肺切成7部分：气管、4个右肺叶(上部(R1)、中部(R2，R3)、下部(R4))和2个左肺叶(上部(L1)和下部(L2))，用带刻度尺的镜头进行显微镜镜检，计算出气道上皮和粘膜下腺体中的β-gal阳性细胞。为了计算蓝细胞在整个气道中占的百分比，每个气道评估10个放大20x的视野，随机从每个肺叶的不同区域任意取3-8气道(近端、中部和远端)进行评估。重复测量的误差(ERM)表示为方差的系数(CV)，这里为18％。在同一种动物里，接受了3×108pfu/ml的个体之间，CV为24-43％，接受了3×109pfu/ml的个体之间为8-14％。
气道上皮细胞(图6A，图7a和b)和粘膜下腺体(图6B和图7c)显示出剂量依赖性的β-半乳糖苷酶活性。粘膜下腺体是主要的CFTR表达部位。对照中未发现活性(图7d)。
实施例4
向人健康供体的鼻上皮细胞转移基因
通过洗刷从人健康供体(6例男性和3例女性)收集鼻上皮细胞。用磷酸盐缓冲液(PBS：137mM NaCl，3mM KCl，8mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，pH7.2)洗涤2次后，将细胞重新悬浮在含有10％胎牛血清的培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基；DMEM)，将它们分为2或3组，分别置于96孔培养板上。通过用相差显微镜观察纤毛摆动以及对台盼蓝阳性细胞计数来证实鼻细胞的活力。将载体溶液(SeV-luc和GL-67-pCMV-1uc)添加至每个孔。24小时后收集细胞，用PBS洗涤3次，如实施例2所述进行萤光素酶活性试验。结果见图8。
经证实，被SeV-luc转染的细胞中的萤光素酶活性比被GL-67-pCMV-luc转染的细胞中的高1,000倍。
实施例5
向绵羊气管上皮细胞转移基因
5-1.粘液对基因转移的影响
用天然绵羊气管模型检查粘液对各种载体的基因转移效率的影响，所述模型用已知方法制备(Kitson，C.等，Gene Ther.6：534-546，1999)。处死动物后，将切出的绵羊气管的上皮层的肌肉和动脉外膜切离，切成0.5cm2的方形小片后，在相差显微镜下确认纤毛的摆动。在部分组织中，用已知方法除去粘液(Kitson，C.等，Gene Ther.6：534-546，1999)。将这些组织置于气-液界面上。分别在其顶部表面添加10μl SeV-luc或GL-67-luc载体溶液进行转染。48小时后，如实施例2所述对这些小片进行萤光素酶活性测定。结果见图9。
如图9所示，与GL-67-luc-介导的基因转移相比，粘液未显著影响SeV介导的基因转移。
5-2.粘液的粘性对基因转移的影响
重复5-1的过程，不同的是在即将进行基因转移之前添加各种浓度的牛唾液腺粘蛋白。结果见图10。
如图10所示，GL-67-luc介导的基因转移因添加粘蛋白而受到抑制。添加了粘蛋白的试剂与未添加粘蛋白的试剂相比，萤光素酶活性没有明显的不同。说明不是粘液的粘性，而是粘蛋白本身对阳离子脂质介导的基因转移有阻碍活性。另一方面，血浆粘蛋白成分虽不影响SeV的感染效力，但粘液的粘性对SeV介导的基因转染有一定的影响。
5-3.位点特异性转染效力
对绵羊气管上皮细胞如5-1所述用SeV-luc或AdCMV-luc进行转染。在基因转移之后，切开该组织的边缘并将其切断，分别测定边缘部分和中部的萤光素酶活性。结果见图11。其次，用SeV-GFP和携有受CMV-IE启动子驱动的GFP的高滴度腺病毒第5血清型AdCMV-GFP(Kramel BiotechInternational Ltd.)取代SeV-luc和AdCMV-luc进行同样的基因转移。基因转移的2天后，在荧光相差显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的信号。结果见图12。
如图11和12所示，AdCMV-luc在绵羊气管组织的受损边缘区显示较高的表达，而在未受损的中部的表达则相对较少。相反，用SeV-luc-处理的组织在边缘区和中部的基因表达未显示出显著差异。
实施例6
SeV/CFTR的构建和电子生理学的特性
构建能表达CFTR(CF的致病基因)的重组仙台病毒载体。将CFTR基因(Riordan，J.R.等，Science 245：1066-1073，1989)用含有E和S信号序列的引物对经PCR扩增。所用引物对如下所示：
正向引物：5′-acttgcggccgccaaagttcaatgcagaggtcgcctctggaaaaggccagc-3′(SEQ ID NO：4)
反向引物：5′-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggctaaagccttgtatcttgcacctcttcttc-3′(SEQ ID NO：5).
将所扩增的片段***pSeV18+b(+)的NotI位点，如实施例1所述重建该病毒。
用所制备的表达CFTR的仙台病毒(样品-1SeV/CFTR)感染COS7细胞，通过全细胞钳位电路(patch clamp)技术对感染细胞进行分析。图13显示全细胞钳位电路技术概要。将一个含有移液管溶液的玻璃移液管与浸泡液中的细胞接触，利用负压除去细胞膜。在这种情况下，移液管溶液含有145mMNMDG+，148.4mM Cl-，6.7mM Mg2+，5mM ATP，10mM葡萄糖，0.1mMEGTA，和10mM HEPES(用Tris滴定，pH调整到7.4)，浸泡液包含141mMNa+，152.4mM Cl-，152.4mM H2PO4 -，5mM K+，1.7mM Mg2+，2mM Ca2+，10mM葡萄糖，0.1mM EGTA，和10mM HEPES(用Tris，调整到pH 7.4)。通过全细胞记录检查毛喉素(forskolin)对表达样品-1SeV/CFTR的细胞中膜电流的影响(图14)。结果观察到毛喉素浓度依赖性内向电流(influx current)(轨道下降)受到优降糖(glibenclamide，一种氯离子通道阻断剂)的抑制(向上位移)。内向电流可通过在一次洗涤后再添加毛喉素而恢复，并再次受到优降糖的抑制，这表明所观察到的电流变化是一种特异性的药物诱导型应答。
接着检查每种药物诱导型反应对时间的依赖性(图15)。毛喉素在表达样品-1 SeV/CFTR的COS7细胞中诱导了一种Cl-流，可观察到氯离子通道的一种很有特征的，时间非依存的反应特性。优降糖(300μM)可抑制毛喉素诱导的Cl-流。
图16是根据上述数据得出的，在表达样品-1 SeV/CFTR的COS7细胞中，存在或不存在毛喉素时电流-电压的关系。如果不出现Cl流，直线将在原点处交交叉。在所得图中，可见直线在10-20mV之间交叉。这表明由CFTR诱导(毛喉素非依赖型)的电流以外的Cl电流在这些COS7细胞中流动。图17显示在有或无毛喉素时所得膜电流的差异(净膜电流)，它通过在使用毛喉素期间所记录的电流中减去使用毛喉素之前所记录的电流而获得。
工业实用性
本发明提供了一种用于将外源基因导入气道上皮细胞中的重组仙台病毒载体，以及将外源基因导入该载体的方法，而传统载体不能将外源基因有效地导入气道上皮细胞。本发明的重组仙台病毒载体能通过与被粘液覆盖的气道上皮细胞短暂接触而将基因有效地转移至该细胞中。本发明的载体还可感染来自比小鼠更大的动物的气道上皮细胞。由此，通过本发明的载体使得向气道上皮细胞有效地转移基因的基因治疗成为可能。此外，本发明的载体不仅可以将基因导入气道上皮细胞的上端表面，还可导入主要表达CFTR的粘膜下腺体中，这说明它可用于CF，一种CFTR缺陷型疾病的基因治疗。
                             序列表
<110>株式会社载体研究所(DNAVEC Research Inc.)
<120>用于将外源基因导入气道上皮的重组仙台病毒载体
<130>D3-105PCT
<140>
<141>
<150>US 60/163,055
<151>1999-11-02
<150>JP 1999-359218
<151>1999-12-17
<160>5
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>1
ctttcaccct                                                           10
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>2
tttttcttac tacgg                                                     15
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>3
cggccgcaga tcttcacg                                                  18
<210>4
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>4
acttgcggcc gccaaagttc aatgcagagg tcgcctctgg aaaaggccag c             51
<210>5
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>5
atccgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggctaa agccttgtat    60
cttgcacctc ttcttc                                                    76

Claims (15)

1.一种用于将外源基因导入气道上皮的组合物，其包含携有外源基因的重组仙台病毒载体，其中所述外源基因是囊性纤维变性跨膜传导调节子基因或它的能编码功能等价于囊性纤维变性跨膜传导调节子的蛋白的衍生物。
2.权利要求1的组合物，其中所述仙台病毒不包含F基因，HN基因，和M基因中的至少一个。
3.权利要求1或2的组合物，其进一步包含鸡胚绒毛膜尿囊液。
4.一种用于治疗囊性纤维变性的药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项的组合物。
5.一种将外源基因导入气道上皮细胞的体外方法，包括使含有重组仙台病毒载体的组合物与被粘液覆盖的气道上皮细胞接触，其中所述病毒载体上携有外源基因。
6.权利要求5的方法，其中所述仙台病毒载体不含有F基因，HN基因，和M基因中的至少一个。
7.权利要求5或6的方法，其中所述组合物进一步包含鸡胚绒毛膜尿囊液。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述外源基因是囊性纤维变性跨膜传导调节子基因或它的能编码功能等价于囊性纤维变性跨膜传导调节子的蛋白的衍生物。
9.权利要求5-8中任一项的方法，其中所述气道上皮细胞来源于鼻、咽、气管、或肺内的任何传气通道或气体交换表面。
10.包含携有外源基因的重组仙台病毒载体在制备需要将基因转移到气道上皮的基因治疗的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述仙台病毒不包含F基因，HN基因，和M基因中的至少一个。
12.权利要求10或11的用途，其中所述组合物进一步包含鸡胚绒毛膜尿囊液。
13.权利要求10-12任一项的用途，其中所述基因治疗是对囊生纤维变性的治疗。
14.权利要求10-13任一项的用途，其中所述外源基因是囊性纤维变性跨膜传导调节子基因或它的能编码功能等价于囊性纤维变性跨膜传导调节子的蛋白的衍生物。
15.权利要求10-14任一项的用途，其中所述气道上皮位于鼻、咽、气管、或肺内的任何传气通道或气体交换表面。
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