KR20020047096A - 초활성 돼지 성장 호르몬 분비 호르몬 유사체 - Google Patents
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Abstract
성장 호르몬(GR) 및 성장 호르몬 분비 호르몬(GHRH)의 결핍증 또는 유전 질환으로 인한 부적합한 성장은 서열 1의 서열을 갖는 신규한 GHRH 유사체를 이용한 재조합 단백질 요법으로 경감시킬 수 있다. 또한, (1) 성장 호르몬 경로와 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍증을 치료하는 방법, (2) 유전적 질환과 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍증을 치료하는 방법, (3) 동물에서 성장 능력을 향상시키는 방법, (4) 성장 결핍 질환을 앓고 있는 동물을 치료하는 방법, (5) 식용 동물의 효율을 증대시키는 방법 및 (6) 동물에서 성장을 증진시키는 방법이 포함된다.
Description
본원은 1999년 7월 26일에 출원된 미국 가특허원 제60/145,624호를 우선권으로 청구한다.
성장 호르몬(GH) 경로는 일련의 상호의존성 유전자들로 구성되어 있으며, 이러한 유전자들의 생성물은 정상적인 성장을 위해 필요하다. GH 경로 유전자는 (1) 리간드, 예를 들어, GH 및 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), (2) 전사 인자, 예를들어, pit 1의 프로펫(prophet), 또는 prop 1과 pit 1, (3) 효능제, 예를 들어, 성장 호르몬 분비 호르몬(GHRH) 및 길항제, 예를 들어, 소마토스타틴 및 (4) 수용체, GHRH 수용체(GHRH-R) 및 GH 수용체(GH-R)를 포함한다. 이들 유전자는 시상하부, 뇌하수체, 간 및 골을 포함한 상이한 기관 및 조직에서 발현된다. GH 경로의 효과적이고 조절된 발현은 최적의 직선형 성장뿐만 아니라, 탄수화물, 단백질 및 지방 대사의 항상성을 위해 필수적이다. 뇌하수체 전엽으로부터 GH 합성 및 분비는 GHRH에 의해 촉진되고, 소마토스타틴에 의해 억제되며, 이들 둘 다는 시상하부 호르몬이다. 사람 및 기타 척추동물의 신체적 성장을 조절하는데 있어서 GH의 핵심적인 역할 및 뇌하수체로부터 GH 분비를 조절하는 생리학적으로 관련된 경로는 익히 공지되어 있다. GH는 주로 간 및 기타 표적 기관에서 IGF-I의 생성을 증대시킨다. IGF-I 및 GH는 차례로 시상하부 및 뇌하수체에 피드백하여, GHRH 및 GH 분비를 억제한다. GH는 말초 조직에 직간접적으로 작용을 하며, 간접 작용은 주로 IGF-I에 의해 매개된다.
어린이 및 성인에 있어서 직선형 성장(사춘기 이전 환자) 또는 신체 구성에 손상이 있고, GH 또는 GHRH 요법에 반응하는 넓은 범위의 임상적 증상이 있다. 모든 경우에 있어서, GHRH-GH-IGF-I 축이 작용적이나, 각종 가능한 원인에 대해 최적의 민감성 또는 반응성으로 반드시 작용하는 것은 아니다.
어린이에 있어서 GH 결핍증의 주된 특징은 단신이다. 유사한 표현형이 GH 축의 다른 지점에서의 유전적 결함에 의해 발생될 뿐만 아니라(Parks et al., 1995), 비-GH-결핍 단신으로 나타난다. 비-GH-결핍증은 상이한 병인을 갖는다:(1) 유전적 질환인 터너 증후군[참조: Jacobs et al., 1990; Skuse et al., 1999], 연골저형성증[참조: Tanaka et al., 1998; Key and Gross, 1996] 및 크론병[참조: Savage et al., 1999); (2) 자궁내 성장 지연[참조: Albanese and Stanhope, 1997; Azcona et al., 1998); 및 (3) 만성 신부전[참조: Sohmiya et al., 1998; Benfield and Kohaut, 1997]. GH 축이 영향을 받지 않는 경우(즉, 환자가 정상적인 호르몬, 유전자 및 수용체를 갖는 경우)는 성장 지연의 전체 경우 중의 50% 이상을 차지한다. 이들 경우에 있어서, GHRH 또는 GH 요법이 효과적인 것으로 제시되어 있다[참조: Gesundheit and Alexander, 1995].
뇌하수체 전엽으로부터의 감소된 GH 분비는 골격근량이 25세 이상부터 나이가 들어감에 따라 상실되도록 한다. GHRH-GH-IGF-I은 나이가 들면서, 그리고 초로기에 급격한 변화를 겪으며(D'Costa et al., 1993), GH 생성 속도 및 GH 반감기의 감소, GH 및 GHRH 자극에 대한 IGF-I 반응의 감소가 골격근량의 손실(근육손상), 골다공증 및 지방 증가 및 제지방 체중의 감소를 야기시킨다(Bartke, 1998). 이전의 연구에 따르면 상당히 많은 정상적인 초로기 사람들에서 GH 및 IGF의 혈청 수준이 청소년층의 수준에 비해 70 내지 80%까지 상당히 감소하는 것으로 제시되어 있다[참조:Corpas et al., 1993; Iranmanesh et al., 1991]. 근육손상의 발생은 GH 요법에 의해 상쇄될 수 있음이 입증되어 왔다. 그러나, 이것은 비용 및 빈번한 부작용으로 인해 초로기에서 논쟁적인 요법으로 남아 있다.
재조합 단백질의 제조는 이들 상태를 치료하는데 유용한 도구를 제공한다. GH 대체 요법이 성장 결핍증 환자에게 널리 사용되고 있고 만족할만한 성장을 제공하며, 어린이 환자에게 긍정적인 정신적 효과를 나타낼 수 있다[참조: Rosenbaum and Saigal, 1996; Erling, 1999] 하더라도, 이러한 요법은 GH의 빈번한 투여에 대한 비실용적인 요건[참조: Monti et al., 1997; Heptulla et al., 1997) 및 바람직하지 않은 부작용[참조: Blethen et al., 1996; Watkins, 1996; Shalet et al., 1997; Allen et al., 1997]을 포함한 몇 가지 불리한 점을 갖는다.
성숙 펩타이드 또는 절단된 분자로서(췌장 소도세포 종양 및 여러 곳에 위치한 유암종에서 볼 수 있는 바와 같이) 두개외로 분비된 GHRH가 종종 생물학적으로 활성이며, 심지어 선단비대증을 초래할 수 있는 것으로 충분히 확립되어 있다[참조: Esch et al., 1982; Thorner et al., 1984]. GH-결핍증 어린이 또는 성인에의 재조합 GHRH의 투여는 IGF-1 수준을 증대시키고, GHRH 투여량에 비례하여 GH 분비량을 증가시키며, 게다가 GHRH의 일시적 투여량에 대한 반응을 발생시킨다[참조: Bercu and Walker, 1997]. 따라서, GHRH 투여는 정상 이하의 GH 및 IGF-I 수준을 증대시키는 보다 생리학적인 대안을 제공한다[참조: Corpas et al., 1993].
GHRH 단백질 요법이 실질적인 부작용 없이 정상적인 주기적 GH 분비를 수반 및 촉진하더라도, 생체내에서의 GHRH의 짧은 반감기는 빈번한(1일 1 내지 3회) 정맥내, 피하 또는 비내(300배 이상의 고용량을 필요로 함) 투여를 요구한다. 따라서, 장기간 치료에 있어서, GHRH 투여는 비실용적이다. 그러나, 제조된 단백질 종(Tyr1-40 또는 Tyr1-Leu44) 또는 보다 짧은 절단된 분자로서 두개외로 분비된 GHRH가 생물학적으로 활성이다[참조: Thorner et al., 1984]. 중요하게는, 혈액 공급에서의 GHRH의 낮은 수준(100pg/ml)은 GH 분비를 자극하고[참조: Corpas etal., 1993], GHRH를 유전자 치료학적 발현을 위한 우수한 후보로 만들어 준다. 직접적인 플라스미드 DNA 유전자 전달은 현재 대두되고 있는 디수의 유전자 요법 전략의 근간이 되고 있으며, 따라서 바이러스 유전자 또는 지질 입자를 필요로 하지 않는다[참조: Muramatsu et al., 1998; Aihara and Miyazaki, 1998]. 골격근이 바람직한 표적 조직이며, 이는 근섬유가 수명이 길고, 면역적격 숙주에서 수개월 또는 수년에 걸쳐 발현하는 원형 DNA 플라스미드가 형질도입될 수 있기 때문이다[참조: Davis et al., 1993; Tripathy et al., 1996]. 이전의 보고는 사람 GHRH cDNA 가 마우스에서 주사가능한 근원성 발현 벡터에 의해 근육으로 전달되어, GH 분비를 가장 적합한 정도로 2주간에 걸쳐 일시적으로 자극하는 것으로 입증하였다[참조: Draghia-Akli et al., 1997].
야생형 GHRH는 사람(Frohman et al., 1984) 및 가축 모두의 순환계에서 비교적 짧은 반감기를 나타낸다. 혈장에서 60분 동안 배양 후 GHRH(1-44)NH2의 95%가 분해되는 한편, 유사한 조건하에서 GHRH의 보다 짧은 (1-40)OH를 60분 동안 배양한 경우에 단지 77%가 분해되는 것으로 나타났다(Frohman et al., 1989). 유전자 요법 벡터내에 보다 짧은 GHRH 종(1-40)OH를 암호화하는 cDNA를 삽입한 결과, 보다 긴 혈청 중 반감기 및 증대된 효능을 갖는 분자를 생성시킬 수 있으며, 플라스미드가 주사된 동물에서 보다 많은 GH 분비량을 제공할 것이다. 또한, 프로테아제 민감성 아미노산의 아미노산 치환을 통한 돌연변이 유발은 hGHRH 분자의 혈청 반감기를 연장시킬 수 있다. 게다가, GHRH의 생물학적 활성의 증강은 특이적 수용체에 대한 결합 친화성을 증대시킬 수 있는 초활성 유사체를 사용하여 달성된다.
성장 호르몬의 분비를 증대시키기 위한 목적으로서 신규한 GHRH 유사체 단백질[참조: 미국 특허 제5,847,066호, 제5,846,936호, 제5,792,747호, 제5,776,901호, 제5,696,089호, 제5,486,505호, 제5,137,872호, 제5,084,442호, 제5,036,045호, 제5,023,322호, 제4,839,344호, 제4,410,512호 및 제RE33,699호] 또는 GHRH의 합성 또는 천연 펩타이드 단편[참조: 미국 특허 제4,833,166호, 제4,228,158호, 제4,228,156호, 제4,226,857호, 제4,224,316호, 제4,223,021호, 제4,223,020호 및 제4,223,019호]을 투여하는 것에 관한 특허들이 허여되어 있다. 다음의 돌연변이를 함유하는 GHRH 유사체가 보고되어 있다: 1번 위치에서 Tyr이 His로; 2번 위치에서 Ala이 Val, Leu 또는 다른 아미노산으로; 8번 위치의 Asn이 Gln, Ser 또는 Thr로; 15번 위치의 Gly가 Ala 또는 Leu로; 27번 위치의 Met가 Nle 또는 Leu로; 및 28번 위치의 Ser이 Asn으로 치환[참조: 미국 특허 제5,846,936호]. 본 발명의 유사체는 미국 특허 제5,846,936호에 보고되어 있는 활성에 필요한 아미노산 치환 중의 어느 것도 포함하지 않는다.
미국 특허 제5,756,264호의 특정 양태가 치료학적 유전자가 근원성 조직내로 전달되는 유전자 요법에 관한 것이고, 명세서에 언급된 일례가 성장 호르몬 분비 호르몬이라 하더라도, 두 가지 중요한 차이가 상기 시스템과 본 발명을 구별한다. 첫째, 본 발명은 GH 분비촉진제로서의 기능을 향상시키는 유의한 개질, 즉 요법을 달성시키는 능력을 연장시킬 수 있는 프로테아제에 대한 감소된 민감성 및 증대된 안정성 및 요법을 달성시키는 능력을 증강시킬 수 있는 증대된 생물학적 활성을 갖는 야생형과 상이한 성장 호르몬 분비 호르몬의 유사체에 관한 것이다. 또한, 본발명의 한 국면에 있어서, 이는 SPc5-12(Li et al., 1999)로 명명된 특유한 합성 프로모터를 이용하며, 당해 프로모터는 골격 α-액틴으로부터의 근위 혈청 반응 요소(SRE), 다중 MEF-2 부위, MEF-1 부위 및 TEF-1 결합 부위를 함유하며, 천연 근원성 프로모터의 전사 효능을 상당히 능가한다. 이러한 합성 프로모터의 특이성은, 예를 들어, 근원성 프로모터 및 이의 용도에 관한 허여된 특허[참조예: 미국 특허 제5,374,544호] 또는 핵산 서열의 근원성 발현 시스템에 관한 허여된 특허[참조예: 미국 특허 제5,298,422호]를 능가하는 현저한 진보성이다.
이와 같이, 본 발명은 성장 호르몬의 분비를 향상시키는 돌연변이를 함유한 유사체의 사용을 교시한다. 실시예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 유사체는 선행 기술의 유사체에서 볼 수 있는 8번 위치에서의 Gln, Ser 또는 Thr로의 치환이 없음에도 불구하고 성장 호르몬의 분비를 성공적으로 증대시킨다. 또한, 본 발명은, 근섬유의 수명이 길고 원형 DNA 플라스미드가 형질도입될 수 있기 때문에, 바람직하게 선택된 골격근 조직내로 발현이 합성 근원성 프로모터에 의해 조절되는 본 발명의 유사체를 도입시키는 유전자 요법 기술을 제공한다. 이것은, GHRH 단백질의 빈번한 투여에 대한 필요가 이를 장기간 치료제로서 사용할 수 없다는 점에서, 현행 기술을 능가하는 진보성이다.
발명의 요약
본 발명의 양태는 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 성장 호르몬 분비 호르몬이다.
본 발명의 추가의 양태는 (1) 성장 호르몬 경로와 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍증을 치료하는 방법, (2) 유전적 질환과 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍증을 치료하는 방법, (3) 동물에서 성장 능력을 향상시키는 방법, (4) 성장 결핍 질환을 앓고 있는 동물을 치료하는 방법, (5) 식용 동물의 효율을 증대시키는 방법, (6) 화상, 외상, AIDS 또는 기타 소모성 질환과 연관된 동물 소모성 증상을 치료하는 방법, (7) 정상 성장과 연관된 것보다 높은 수준으로 동물에서 성장 호르몬의 생성을 촉진하는 방법 및 (8) 동물의 성장을 증진시키는 방법을 포함한다. 이들 모든 방법은 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현에 적합한 위치에서 연속적으로 및 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역을 포함하는 플라스미드 벡터를 도입하는 단계를 포함한다.
바람직한 양태에 있어서, 프로모터는 합성 근원성 프로모터이고, hGH3' 비해독 영역은 3' 비해독 영역내에 존재한다.
특정 양태에 있어서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 또는 양이온성 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 특정 양태에 있어서, 벡터는 근원성 세포 또는 근조직내로 도입된다. 또 다른 추가의 특정 양태에 있어서, 동물은 사람, 애완 동물, 사역 동물 또는 식용 동물이다.
추가의 양태는 서열 1을 약제학적으로 허용되는 담체 중에 포함함을 특징으로 하는, 동물에서 성장 호르몬의 분비를 자극하기 위한 약제학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 성장 호르몬-분비 호르몬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 추가의 양태에 있어서, 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현을 위해 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역으로 구성된 플라스미드 벡터를 치료학적 유효량으로 동물내에 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 동물에서 성장 호르몬을 증대시키는 방법이 제공된다. 특정 양태에 있어서, 프로모터는 합성 근원성 프로모터이다. 또 다른 특정 양태에 있어서, 3' 비해독 영역은 hGH3' 비해독 영역이다. 또 다른 특정 양태에 있어서, 동물은 사람, 애완 동물, 식용 동물 및 사역 동물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 특정 양태에 있어서, 벡터는 근원성 세포내로 도입된다. 추가의 특정 양태에 있어서, 벡터는 상기 동물의 근조직내로 도입된다. 또 다른 특정 양태에 있어서, 도입은 성장 호르몬 경로와 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍 질환을 치료한다. 추가의 특정 양태에 있어서, 결핍 질환은 상기 동물에서 유전자 물질의 변화로 인한 결과이다. 추가의 양태에 있어서, 상기 도입은 상기 동물에서 성장 능력을 향상시킨다. 또 다른 양태에 있어서, 도입은 식용 동물의 효율을 증대시킨다. 추가의 양태에 있어서, 도입은 화상, 외상, AIDS 또는 다른 소모성 질환과 연관된 동물 소모성 증상을 치료한다. 또 다른 특정 양태에 있어서, 도입은 상기 동물의 성장 증진을 초래한다. 또 다른 특정 양태에 있어서, 벡터는 상기 동물에 단일 투여로 도입된다. 추가의 특정 양태에 있어서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 양태에 있어서, 합성 근원성 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현을 위해 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역으로 구성된 벡터를 치료학적 유효량으로 동물에 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 동물에서 성장 호르몬 경로와 연관된 호르몬-관련된 결핍증을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 합성 근원성 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현을 위해 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역으로 구성된 벡터를 치료학적 유효량으로 동물에 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 동물에서 정상 성장과 연관된 것보다 높은 수준으로 성장 호르몬의 생성을 촉진하는 방법이 제공된다.
기타 및 추가의 목적, 특징 및 이점은 하기 명세서를 독해하고 명세서의 일부를 형성하는 도면을 참고함으로써, 명백하고 궁극적으로 보다 용이하게 이해될 수 있을 것이며, 또한 본 발명에 따른 바람직한 양태의 실시예가 기재 목적상 제공될 것이다.
본 발명은, 성장 호르몬 분비 호르몬 유사체의 투여를 이용하는 성장 결핍증의 치료, 성장 능력의 개선, 동물에서 정상적인 성장과 관련된 것보다 높은 수준으로 성장 호르몬의 생성 자극 및 성장의 강화에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 근육-특이적 프로모터에 의해 조절되는 상기 성장 호르몬 분비 호르몬 유사체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을, 특히 유전자 요법 기술을 사용하여, 근조직내로 적용하는 것에 관한 것이다.
도 1A 내지 도 1C는 GHRH 초활성 유사체가 GH 분비촉진 활성 및 안정성을 증대시킴을 명시한다. 도 1A는 돼지 야생형(1-40)OH 아미노산 서열과 유사체 HV-GHRH와의 비교도이다. 도 1B는 돼지의 원발성 뇌하수체 배양물에서 돼지 GH 분비에 대한 상이한 GHRH 종들의 효과를 도시한다. 도 1C는 4 내지 6시간의 배양 동안에 HV-GHRH 및 야생형 돼지 GHRH의 안정성 변화를 명시한다.
도 2A 내지 도 2E는 초활성 유사체 GHRH 근원성 발현 벡터의 단일 주사 후 2개월에 걸쳐 GHRH, GH 및 IGF-I 혈청 수준의 증대를 명시한다. 도 2A는 SPc5-12 합성 프로모터 및 GH의 3'UTR을 함유하는 작제물을 도시한다. 돌연변이된 단백질의 모델로서, HV-GHRH 작제물이 사용되고, 양성 대조군으로서 돼지 야생형과 비교되며, 음성 대조군으로서 β-갈락토시다제 작제물과 비교되었다. 도 2B는 pSP-GHRH 주사된 돼지 대 위약 주사된 대조 돼지에서 혈청 GHRH의 상대적인 수준을 도해한다. 도 2C는 체중/혈량 증대에 대해 교정된 대조 돼지 대 pSP-GHRH 주사된 돼지에서의 혈청 GHRH의 절대 수준을 명시한다. 도 2D는 pSP-HV-GHRH 주사된 돼지에서 GH 수준의 변화를 도시한다. 도 2E는 pSP-GHRH 플라스미드 작제물의 직접적인 근육내 주사 후 혈장 IGF-1 수준을 도시한다.
도 3A 내지 도 3C는 돼지의 성장에 대한 근원성 GHRH 발현 벡터의 효과를 명시한다. 도 3A는 pSP-GHRH 또는 pSP-GHRH-HV가 주사된 돼지에서 2개월에 걸친 평균 체중의 변화를 도시한다. 도 3B는 pSP-GHRH 주사된 돼지 대 대조군에서 사료 효율의 상태를 도시한다. 도 3C는 주사 후 45일째에 pSP-HV-GHRH 주사된 돼지와 위약 주사된 대조 돼지와의 비교도이다.
도 4는 상이한 양으로 주사된 pSP-GHRH-HV의 10일령 새끼 돼지에 대한 효과를 명시한다.
도 5는 상이한 양으로 주사된 pSP-GHRH-HV의 10일령 새끼 돼지의 IGF-I 수준에 대한 효과를 도시한다.
도 6은 새끼 돼지에 pSP-GHRH-HV 플라스미드를 주사하는 시간 경과를 도해한다.
본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 발명내에서 각종 치환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련가에게는 용이하게 명백할 것이다.
본원에서 사용된 용어 "동물"은 동물계의 모든 종을 의미한다. 바람직한 양태에 있어서, 동물은 보다 구체적으로는 사람, 애완 동물(개, 고양이, 말), 사역 동물(말, 소), 식품을 생산하는 동물(닭, 소, 어류) 또는 그 자신이 식품인 동물(개구리, 닭, 어류, 게, 바다가재, 새우, 홍합, 가리비, 염소, 멧돼지, 소, 양, 돼지, 타조, 에뮤, 뱀장어)을 포함한 식용 동물 및 당해 분야에 익히 공지되어 있는 기타 동물을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "소모성 질환"은 체중(대부분 근육량)이 감소하고, 근력이 상실되고, 골의 탈회(불수의, 공지된 메카니즘 없음)를 가질 수 있거나, 바이러스/세균 감염을 가질 수 있거나 특정 기초 대사의 탈조절화를 가질 수 있는 질환으로서 정의된다. 이러한 질환의 특정 예는 AIDS, 폐렴 및 암이다.
본원에서 사용된 용어 "유효량"은, 당업자에게 공지되어 있는 수 개의 종점을 사용하여 모니터링할 수 있는, 숙주에서 효과를 유발하는데 필요한 조성물의 양으로서 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "효율"은 동물의 1일 먹이 섭취량 대 당해 동물에 의해 증가된 체중으로서 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "성장 결핍증"은 성장이 정상에 미치지 못하는 모든건강 상태, 의학적 상태 또는 질환으로서 정의된다. 결핍증은 성장 호르몬 경로(예를 들어, GHRH-GH-IGF-I 축)에 직접적으로 영향을 미치거나, 성장 호르몬 경로에 간접적으로 영향을 미치거나, 성장 호르몬 경로에 전혀 영향을 미치지 않는 변형의 결과일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "성장 호르몬"은 성장과 관련이 있고, 화학적 메신저로서 작용하여, 표적 세포에 작용을 발휘하는 호르몬으로서 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "성장 호르몬 분비 호르몬"은 성장 호르몬의 분비를 촉진하거나 자극하는 호르몬으로서 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "성장 호르몬 분비 호르몬 유사체"는 GHRH 분자의 천연 형태의 아미노산 서열에서 아미노산 돌연변이(합성 덱스트로 또는 사이클릭 아미노산 부재)를 함유하지만, 이러한 돌연변이는 GHRH 분자에 천연적으로 존재하지 않으면서, 성장 호르몬의 합성 및 분비를 증강시키는 작용을 유지하는 단백질로서 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "근원성"은 구체적으로는 근조직을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 화합물의 투여 후 수여 포유동물에 의해 허용될 수 있는 화합물을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "분비촉진제"는 하류-조절된 분자의 합성 및 분비를 증강시키는 천연 또는 합성 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 생리학적으로 유의한 화합물의 투여량을 의미한다. 화합물은 수여 동물에서 당해 화합물의 존재로 인해 생리학적변화가 일어나는 경우 생리학적으로 유의한 것이다. 예를 들면, 성장 결핍증의 치료에서 성장을 증대시키는 조성물은 치료학적으로 효과적인 것이며, 소모성 질환에서 소모율을 감소시키거나 성장을 증진시키는 조성물은 치료학적으로 효과적인 것이다. 당업자는 치료학적으로 효과적인 수준으로 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 제공하기 위해 사용되는 벡터의 충분량을 인지하고 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료"는 성장 결핍 질환의 적어도 하나의 증상을 호전시키거나 동물의 성장을 호전시키는 작용으로서 정의된다. 당업자는 증상의 완치가 용어 "치료"의 범위내에 속할지라도 용어 "치료"가 반드시 완치를 가리키는 것이 아님을 인지하고 있다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 세포 또는 유기체내로 핵산을 전달하는 모든 비히클을 의미한다. 이의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 또는 양이온성 지질을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "소모성 증상"은 소모성 질환과 연관된 상태로서 정의된다.
본 발명의 양태는 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 성장 호르몬-분비 호르몬 유사체 및 이를 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 추가의 양태는 (1) 성장 호르몬 경로와 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍증을 치료하는 방법, (2) 유전적 질환과 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍증을 치료하는 방법, (3) 동물에서 성장 능력을 향상시키는 방법, (4) 성장 결핍 질환을 앓고 있는 동물을 치료하는 방법, (5) 식용 동물의 효율을 증대시키는 방법,(6) 화상, 외상, AIDS 또는 기타 소모성 질환과 연관된 동물 소모성 증상을 치료하는 방법, (7) 정상 성장과 연관된 것보다 높은 수준으로 동물에서 성장 호르몬의 생성을 촉진하는 방법 및 (8) 동물에서 성장을 증진시키는 방법을 포함한다. 이들 모든 방법은 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현에 적합한 위치에서 연속적으로 및 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역을 포함하는 플라스미드 벡터를 도입하는 단계를 포함한다. 특정 양태에 있어서, 이들 방법은 성장을 증진, 향상 또는 촉진하는 결과를 제공하거나 성장 호르몬의 생성 증대를 제공한다.
특정 양태에 있어서, 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현에 적합한 위치에서 연속적으로 및 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역으로 구성된 플라스미드 벡터를 치료학적 유효량으로 동물내로 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 동물에서 성장 호르몬 경로와 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍증을 치료하는 방법이 제공한다. 당업자는 성장 호르몬 경로에서의 이러한 결핍이 직간접적으로 성장에 영향을 미칠 수 있으며, 영향을 받는 단계는 GHRH 작용 또는 기능의 상류 또는 하류일 수 있음을 인지하고 있다. GHRH 작용 또는 기능으로부터의 하류 단계가 영향을 받는 특정 양태에 있어서, 원래 유전자 요법 형태로 투여되는 본 발명의 GHRH 유사체의 증대된 수준은 상기 영향을 받는 단계를 극복한다.
다른 특정 양태에 있어서, 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현에 적합한 위치에서 연속적으로 및 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역으로 구성된 플라스미드 벡터를 치료학적 유효량으로 동물내로 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 동물에서 유전적 질환과 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍증을 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 결핍증은 유전적 질환에 의해 직간접적으로 유발될 수 있으며, 다른 표현형이 또한 존재할 수 있다. 유전적 질환의 예는 크로이츠펠트-야콥병, 코헨 증후군, 아미노프테린-메토트렉세이트 증후군, 가부키 증후군, 울프-히르쉬호른 증후군, 러셀-실버 증후군, 밀러-디커 증후군, 랑게르한스 세포 조직구증, 로버츠 증후군 및 18q-증후군을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 양태에 있어서, 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현에 적합한 위치에서 연속적으로 및 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역으로 구성된 플라스미드 벡터를 치료학적 유효량으로 동물내로 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 성장 결핍 질환을 앓고 있는 동물을 치료하는 방법이 제공된다. 성장 결핍 질환은 유전적 결함이거나 성장 호르몬 경로에서의 결핍에 기인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현에 적합한 위치에서 연속적으로 및 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역으로 구성된 플라스미드 벡터를 치료학적 유효량으로 동물내로 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 동물에서 성장 능력을 향상시키는 방법이 제공된다. 본원에서 사용된 용어 "성장 능력"은 동물의 성장 양상 또는 상태로서 정의된다. 성장 능력은 동물 자신 또는 동물의 부모의 유전적 질환, 성장 관련 결핍증 또는 성장에 영향을 미치는 물질에의 노출의 결과일 수 있다. 특정 양태에 있어서 동물에서 성장 능력을 향상시키는 방법은 동물의 성장을 증대시키는 방법을 포함한다.
또 다른 양태에 있어서, 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현에 적합한 위치에서 연속적으로 및 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역으로 구성된 플라스미드 벡터를 유효한 양으로 동물내로 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 정상 성장과 연관된 수준보다 높은 수준으로 동물에서 성장 호르몬의 생성을 자극하는 방법이 제공된다. 정상 성장과 연관된 수준보다 높은 수준은 성장-관련된 결핍증이 없는 동물을 포함하여, 성장-관련된 결핍증을 갖는 동물 또는 집단내의 다른 유사한 동물과 유사한 성장 수준을 갖는 동물의 기본적이고 선천적인 성장을 포함한다.
또 다른 양태에 있어서, 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발에 적합한 위치에서 연속적으로 및 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역으로 구성된 플라스미드 벡터를 유효한 양으로 동물내로 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 동물에서 성장을 증진시키는 방법이 제공된다. 성장을 증진시키고자 하는 동물은 성장 결핍증을 갖거나 갖지 않을 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현에 적합한 위치에서 연속적으로 및 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역으로 구성된 벡터가 제공된다. 당업자는 서열 1을 암호화하는 것으로 여러 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 사용될 특정 서열은 변형되는 특정 서열 및 당업자가 특정적으로 사용하고자 하는 실험 조건에 따라 부분적으로 결정된다. 본원에 제시된 바와 같이, 당업자는 부위-지시된 돌연변이 유발을 위해 GHRH cDNA 서열을 사용하여, 천연 또는 종-특이적 서열과 프로테아제 내성 등을 위해 적합한 아미노산 치환 둘 다를 함유하도록 서열을 변화시킬 수 있다. 본원에 제공된 실시예는 부위-지시된 돌연변이 유발과 같은 방법에 의해 뉴클레오티드 서열을 변이시켜, 목적하는 서열을 획득하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 당업자는, 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 변이를 위한 주형으로서 진뱅크로부터 입수가능한 서열 8 또는 이와 유사한 서열을 이용하거나 다른 공지된 방법을 이용함으로써 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 획득하는 방법을 인지할 것이다. 각 코돈의 워블(세번째) 위치로 인해 다수의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 서열 1의 아미노산 서열은 서열에 대한 진뱅크에의 접근 수단이 제공된 숙련가, 부위-지시된 돌연변이 유발에 대해 본원에 제공된 방법, 및 예를 들어, 표준 생화학 또는 분자생물학 문헌[참조예:Biochemistry, 3rded., L. Stryer; W.H. Freeman and Co., N.Y. (1988)]에서 볼 수 있는 바와 같은 유전자 암호에 대한 코돈표에 의해 용이하게 제조할 수 있다.
바람직한 양태에 있어서, 프로모터는 합성 근원성 프로모터이고, hGH 3' 비해독 영역은 3' 해독 영역내에 존재한다. 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, SPc5-12(Li et al., 1999)(서열 6)로 명명된 합성 프로모터를 이용하며, 당해 프로모터는 골격 α-액틴으로부터의 근위 혈청 반응 요소(SRE), 다중 MEF-2 부위, MEF-1 부위 및 TEF-1 결합 부위를 함유하며, 천연 근원성 프로모터의 전사 효능을 상당히 능가한다. 트랜스-작용 인자 결합 부위 및 인핸서를 포함한 다른 요소들이 본 발명의 양태에 따라 사용될 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, 천연 근원성 프로모터가 사용되며, 당업자는 국립 생명공학 정보 센터(NCBI: National Center for Biochemistry Information) 진뱅크 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html) 또는 NCBI PubMed 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/)를 포함한 데이터베이스로부터 상기 프로모터 서열을 입수하는 방법을 인지하고 있다. 당업자는 또한 상기 월드 와이드 웹 사이트를 이용하여, 본 발명과 관련된 서열 또는 문헌을 입수할 수 있음을 인지하고 있다.
특정 양태에 있어서, hGH 3' 비해독 영역(서열 7)은 플라스미드와 같은 핵산 벡터에서 사용된다.
특정 양태에 있어서, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 동물의 체내 성장 호르몬을 증대시키는 방법이 제공된다. 실시예에 기술된 바와 같이, 당업자는 부위-지시된 돌연변이 유발을 위한 주형으로서 GHRH cDNA(서열 8)을 사용하여, 천연 돼지 서열 및 프로테아제 내성 등에 바람직한 아미노산 치환을 둘 다 함유하는 서열의 변화를 생성시킬 수 있다. 이와 같이, 실시예는 부위-지시된 돌연변이 유발과 같은 방법에 의해 뉴클레오티드 서열을 변이시켜 목적하는 서열을 획득하는 방법을 교시한다. 따라서, 당업자는 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 변이를 위한 주형으로서 진뱅크(상기 참조)로부터 입수가능한 서열 8 또는 이와 유사한 서열을 이용하거나 다른 방법을 이용함으로써 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 획득하는 방법을 인지하고 있다. 각 코돈의 워블(세번째) 위치로 인해 다수의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 서열 1의 아미노산 서열은 서열에 대한 진뱅크에의 접근 수단이 제공된 숙련가, 부위-지시된 돌연변이 유발에 대해 본원에 제공된 방법, 및 예를 들어, 표준 생화학 또는 분자생물학 문헌[참조예:Biochemistry, 3rded., L. Stryer; W.H. Freeman and Co., N.Y. (1988)]에서 볼 수 있는 바와 같은 유전자 암호에 대한 코돈표에 의해 용이하게 제조할 수 있다.
특정 양태에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 또는 양이온성 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 특정 양태에 있어서, 상기 벡터는 근원성 세포 또는 근조직내로 도입된다. 추가의 특정 양태에 있어서, 상기 동물은 사람, 애완 동물, 사역 동물 또는 식용 동물이다.
추가의 양태는 약제학적으로 허용되는 담체에 서열 1을 포함함을 특징으로 하는, 동물에 성장 호르몬의 분비를 자극하기 위한 약제학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 성장 호르몬-분비 호르몬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
상기 작제물을 플라스미드 벡터를 통해 동물내로 도입하는 특정 양태 이외에, 핵산으로 당해 분야에 공지되어 있는 동물 또는 이의 세포를 형질감염시키기 위한 전달 시스템이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 다른 비-바이러스 또는 바이러스 방법이 사용될 수 있다. 당업자는 비-바이러스 형태의 DNA 또는 RNA에 대한 표적 시스템은 다음의 4가지 성분을 필요로 한다는 것을 인지한다: 1) 관심의대상인 DNA 또는 RNA; 2) 세포 표면 수용체 또는 항원을 인식하여 이에 결합하는 잔기; 3) DNA 결합 잔기; 및 4) 세포 표면으로부터 세포질로 복합체의 수송을 가능하게 하는 용해성 잔기. 또한, 치료학적 유전자 조합체를 전달하기 위해 리포좀 및 음이온성 지질을 사용하여 동일한 효과를 달성할 수 있다. 효능적인 바이러스 벡터로는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 소 유두종 바이러스와 같은 바이러스로부터 유도된 발현 벡터가 포함된다. 또한, 에피좀 벡터가 사용될 수 있다. 다른 DNA 벡터 및 수송 시스템이 당해 분야에 알려져 있다.
당업자는 각종 세균성 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 또는 백시니아 바이러스로부터 유도된 발현 벡터가 뉴클레오티드 서열을 표적 기관, 조직 또는 세포군으로 전달하기 위해 사용될 수 있음을 인지하고 있다. 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법을 사용하여, 성장 호르몬 분비 호르몬 유사체를 암호화하는 유전자를 발현시키는 재조합 벡터를 작제할 수 있다. 일시적 발현은 비복제 벡터로 한달 이상 지속할 수 있으며, 만일 적합한 복제 요소가 벡터 시스템의 일부인 경우에 보다 길게 지속할 수 있다.
핵산
1. 벡터
용어 "벡터"는 핵산 서열을 세포내로 도입하고, 여기서 이를 복제하기 위해 당해 핵산 서열을 삽입할 수 있는 캐리어 핵산 분자를 의미하는 것으로 사용된다. 핵산 서열은 외인성일 수 있으며, 이것은 벡터가 삽입되는 세포에 대해 핵산 서열이 이질적이거나 당해 서열이 세포내의 한 서열과 동종이지만 보통 당해 서열이 발견되지 않는 숙주 세포 핵산내에 위치하고 있음을 의미한다. 이러한 벡터로는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파아지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)가 포함된다. 당업자는 본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[참조: Maniatis et al., 1998 및 Ausubel et al., 1994]에 기술되어 있는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 용이하게 작제할 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 특정 양태에 있어서, 핵산 서열은 GHRH의 전체 또는 일부를 암호화한다. 특정 경우에 있어서, RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 해독된다. 다른 경우에 있어서는, 이들 서열이, 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생성시 해독되지 않는다. 발현 벡터는 각종 "조절 서열"을 함유할 수 있으며, 여기서, 조절 서열은 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 전사 및 가능한 해독에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 전사 및 해독을 통제하는 조절 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 수행하고, 하기되어 있는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
a. 프로모터 및 인핸서
"프로모터"는 전사의 개시 및 속도를 조절하는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. 이것은 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 용어 "작동적으로 위치하는", "작동적으로 연결된", "조절하에" 및 "전사 조절하에"는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 정확한 작용 위치 및/또는 배향에 있어 당해 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절함을 의미한다. 프로모터는 "인핸서"와 함께 사용되거나 그렇지 않을 수 있으며, 여기서, 인핸서는 핵산 서열의 전사 활성화에 연루된 시스-작용 조절 서열을 의미한다.
프로모터는 암호화 절편 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비암호화 서열을 분리하여 수득할 수 있는 바와 같이 유전자 또는 서열과 천연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"이라 부른다. 유사하게는, 인핸서는 당해 서열의 하류 또는 상류에 위치하는 핵산 서열과 천연적으로 연관된 것일 수 있다. 다른 방도로서, 암호화 핵산 절편을 재조합 또는 이종 프로모터의 조절하에 위치시킴으로써 특정한 이점을 획득할 수 있으며, 여기서, 재조합 또는 이종 프로모터는 이의 자연 환경에서 핵산 서열과 통상적으로 연관이 없는 프로모터를 의미한다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 이의 자연 환경에서 핵산 서열과 통상적으로 연관이 없는 인핸서를 의미한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 다른 원핵, 바이러스 또는 진핵 세포로부터 분리된 프로모터 또는 인핸서 및 "천연"이지 않은, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변형시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서를 합성적으로 제조하는 것 이외에, 본원에 기술된 조성물과 관련하여 재조합 클로닝 및/또는 PCR™을 포함한 핵산 증폭 기술을 이용하여 제조할 수 있다[참조: 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제4,683,202호 및제5,928,906호]. 게다가, 비핵 소기관, 예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체 등내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 유도하는 조절 서열이 또한 사용될 수 있다.
물론, 발현을 위해 선택된 세포 유형, 소기관 및 유기체에서 DNA 단편의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것은 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 숙련가는 일반적으로는 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합체의 사용을 인지하고 있다[참조: Sambrook et al., (1989), 당해 문현은 본원에 참고로 인용되어 있음]. 사용되는 프로모터는 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대량 생산에서 유리한 것처럼 도입된 DNA 단편의 고수준 발현을 유도하기에 적합한 조건하에서 구성적, 조직-특이적, 유도성 및/또는 유용적일 수 있다. 프로모터는 이종 또는 내인성일 수 있다. 특정 양태에 있어서, 프로모터는 문헌[참조: Li et al., (1999)]에 기술된 바와 같이 합성 근원성 프로모터이다.
조직-특이적 프로모터 또는 요소의 동정법 및 이들의 활성을 특성화하기 위한 검정법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이러한 영역의 예로는 사람 LIMK2 유전자(Nomoto et al., 1999), 소마토스타틴 수용체 2 유전자(Kraus et al., 1998), 쥐 내피 레틴산 결합 유전자(Lareyre et al., 1999), 사람 DNA CD4(Zhao-Emonet et al., 1998), 마우스 알파2(XI) 콜라겐(Tsumaki, et al., 1998), D1A 도파민 수용체 유전자(Lee et al., 1997), 인슐린-유사 성장 인자 II(Wu et al., 1997) 및 사람 혈소판 내피 세포 흡착 분자-1(Almendro et al., 1996)이 포함된다.
b. 개시 시그널 및 내부 리보좀 결합 부위
또한, 특정 개시 시그널이 암호화 서열의 효율적인 해독을 위해 요구될 수 있다. 이들 시그널로는 ATG 개시 코돈이 포함된다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 해독 조절 시그널이 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이러한 것을 용이하게 결정하고, 필요한 시그널을 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈이 전체 삽입물의 해독을 보장하기 위해 목적하는 암호화 서열의 리딩 "프레임내"에 위치해야 한다는 것은 익히 공지되어 있다. 외인성 해독 조절 시그널 및 개시 코돈은 천연적이거나 합성된 것일 수 있다. 발현 효율은 적합한 전사 인핸서 요소의 삽입에 의해 증대될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에 있어서, 내부 리보좀 유입 부위(IRES) 요소를 사용하여, 다중유전자 또는 폴리시스트론 메시지를 형성한다. IRES 요소는 5' 메틸화 Cap 의존성 해독의 리보좀 스캐닝 모델을 우회하고, 내부 부위에서 해독을 개시할 수 있다[참조: Pelletier and Sonenberg, 1988]. 피코르나바이러스 계열의 2종의 일원(폴리오 및 뇌척수염)으로부터 IRES 요소가 공개되어 있고[참조: Pelletier and Sonenberg, 1988], 또한 포유동물 메시지로부터의 IRES가 공지되어 있다[참조: Macejak and Sarnow, 1991]. IRES 요소는 이종 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 다중 오픈 리딩 프레임이 함께 전사될 수 있으며, 각각은 폴리시스트론 메시지를 형성하는 IRES에 의해 분리된다. IRES 요소의 보조로, 각 오프 리딩 프레임은 효율적인 해독을 위해 리보좀에 인접가능하다. 다수 유전자는 단일 메시지를 전사하는 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현시킬 수 있다[참조: 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호].
c. 다중 클로닝 부위
벡터는 표준 재조합 기술과 병용하여 벡터를 분해시킬 수 있는 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있다[참조: Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998 및 Cocea, 1997, 당해 문헌은 본원에 참고로 인용되어 있음]. "제한 효소 분해"는 핵산 분자의 특정 부위에만 작용하는 효소로 핵산 분자를 촉매적으로 절단하는 것을 의미한다. 다수의 제한 효소가 시판되고 있다. 이러한 효소의 사용은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 빈번하게, 벡터는 MCS내에서 절단하여 외인성 서열을 벡터에 연결가능하게 하는 제한 효소를 사용하여 선형화하거나 단편화한다. "연결"은 서로 인접해 있거나 그렇지 않을 수 있는 두 핵산 분자 단편 사이의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 의미한다. 제한 효소 및 연결 반응과 관련된 기술은 재조합 기술 분야의 숙련가에게는 익히 공지되어 있다.
d. 스플라이싱 부위
대부분의 전사된 진핵 DNA 분자는 RNA 스플라이싱을 겪어, 원발성 전사물로부터 인트론을 제거할 것이다. 게놈 진핵 서열을 함유하는 벡터는 단백질 발현을 위한 전사물의 적합한 프로세싱을 보장하기 위해 공급체 및/또는 수용체를 필요로 할 수 있다[참조: Chandler et al., 1997, 당해 문헌은 본원에 참고로 인용되어 있다].
e. 폴리아데닐화 시그널
발현에 있어서, 전형적으로 전사물의 적합한 폴리아데닐화를 달성하기 위해 폴리아데닐화 시그널을 포함할 것이다. 폴리아데닐화 시그널의 특성은 본 발명의 성공적인 실시를 위해 중요한 것은 아니고/아니거나, 이러한 서열은 어는 것이든 사용가능할 수 있다. 바람직한 양태는 각종 표적 세포에서 편리하고/하거나 충분히 작용하는 것으로 공지되어 있는 SV40 폴리아데닐화 시그널 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. 또한, 발현 카세트의 요소로서 전사 종결 부위가 고려된다. 이들 요소는 메시지 수준을 증강시키고/시키거나, 카세트로부터 다른 서열로의 리딩을 최소화시키는 역할을 할 수 있다.
f. 복제 기점
숙주 세포에서 벡터를 증식하기 위해, 벡터는 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 하나 이상의 복제 기점 부위(종종 "ori"로 지칭)를 함유할 수 있다. 다른 방도로서, 숙주 세포가 효모인 경우 자가 복제 서열(ARS)을 사용할 수 있다.
g. 선택 및 선별 마커
본 발명의 특정 양태에 있어서, 세포는 본 발명의 핵산 작제물을 함유하고, 세포는 발현 벡터내에 마커를 포함함으로써 시험관내 또는 생체내에서 동정될 수있다. 이러한 마커는 동정가능한 변화를 세포에 제공하여, 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 가능하게 할 것이다. 일반적으로는, 선택 마커는 선택을 가능하게 하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 당해 마커의 존재가 이의 선택을 가능하게 하는 것인 한편, 음성 선택 마커는 당해 마커의 존재가 이의 선택을 저해하는 것이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
통상적으로는, 약물 선택 마커의 삽입은 형질전환체의 클로닝 및 동정을 보조하며, 예를 들면, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대해 내성을 제공하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 조건의 실행을 기초로 하여 형질전환체의 선별을 가능하게 하는 표현형을 제공하는 마커 이외에, 색도 분석을 기초로 하는 GFP와 같은 선별 마커를 포함한 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 다른 방도로서, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 선별가능한 효소가 사용될 수 있다. 당업자는 또한 가능한 FACS 분석과 병용하여 면역학적 마커를 사용하는 방법을 공지하고 있다. 사용되는 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것은 아니다. 또한, 선택 및 선별 마커의 예는 당업자에게 익히 공지되어 있다.
2. 숙주 세포
본원에서 사용된 용어 "세포", "세포주" 및 "세포배양물"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어 모두는 또한 후속 세대 모두를 가리키는 후손을 포함한다. 모든 후손은 정교한 또는 부적합한 돌연변이로 인해 동일하지 않을 수 있다. 이종 핵산 서열을 발현시키는 관점에서, "숙주 세포"는 원핵 또는 진핵 세포를 의미하며, 벡터를 복제하고/하거나 벡터에 의해 암호화된 이종 유전자를 발현시킬 수 있는 모든 형질가능한 유기체를 포함한다. 숙주 세포는 벡터에 대한 수용체로 사용될 수 있으며, 또한 사용되어 왔다. 숙주 세포는 "형질감염" 또는 "형질전환"될 수 있으며, 이것은 외인성 핵산이 숙주 세포내로 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다. 형질전환된 세포는 원발성 해당 세포 및 이의 후손을 포함한다.
숙주 세포는 목적하는 결과가 벡터의 복제 또는 벡터-암호화된 핵산 서열의 일부 또는 전체의 발현인지에 따라 원핵세포 또는 진핵세포로부터 유도될 수 있다. 다수의 세포주 및 배양물이 숙주 세포로 이용되고 있으며, 이들은 생배양물 및 유전물질의 보관 기관인 ATCC(American Type Culture Collection: 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)(www.atcc.org)를 통해 입수가능하다. 적합한 숙주는 벡터 골격 및 목적하는 결과를 기초로 하여 당업자라면 누구나 결정할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 또는 코스미드가 다수의 벡터의 복제를 위해 원핵 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현을 위한 숙주 세포로 사용된 세균 세포로는 DH5a, JM109 및 KC8이 포함되며, 또한 SURERCompetent Cell 및 SOLOPACKa Gold Cell(STRATAGENER, La Jolla)과 같이 다수의 시판 세균이 이용가능하다. 다른 방도로서, 이. 콜라이(E. coli) LE392와 같은 세균 세포가 파아지 바이러스를 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
벡터의 복제 및/또는 발현을 위한 진핵 숙주 세포의 예로는 HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos 및 PC12가 포함된다. 각종 세포 유형 및 유기체로부터의 다수의 숙주 세포가 이용가능하며, 당업자에게 익히 공지되어 있다. 마찬가지로, 바이러스 벡터가 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 특히 당해 벡터의 복제 또는 발현을 허용하는 세포와 병용하여 사용할 수 있다.
특정 벡터는 조절 서열을 사용할 수 있으며, 이러한 조절 서열은 벡터가 진핵 및 원핵 세포 모두에서 복제 및/또는 발현이 되도록 해 준다. 당업자는 상기 모든 세포를 유지하고, 벡터의 복제를 허용하는 조건을 이해한다. 또한, 벡터의 대량 생산뿐만 아니라, 벡터에 의해 암호화된 핵산 및 이들의 발현 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드의 생성을 가능하게 하는 기술 및 조건은 익히 공지되어 있다.
3. 발현 시스템
상기 논의된 구성의 적어도 일부 또는 전체를 포함하는 다수의 발현 시스템이 존재한다. 원핵 및/또는 진핵계 시스템을 본 발명에 사용하여, 핵산 서열 또는 이의 발현 폴리펩타이드, 단백질 및 펩타이드를 생성시킬 수 있다. 이러한 다수의 시스템은 시판되고 있고, 또한 널리 이용되고 있다.
곤충 세포/바큘로바이러스 시스템은 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제5,871,986호 및 제4,879,236호에 기술된 바와 같은 이종 핵산 단편의 고수준의 단백질 발현을 생성시킬 수 있다. 상기 시스템은, 예를 들어, 상품명 MAXBACR2.0(INVITROGENR) 및 BACPACK™(제조원: CLONTECHR, 바큘로바이러스 발현 시스템)으로 구입할 수 있다.
발현 시스템의 다른 예로는 합성 엑다이손-유도성 수용체를 포함하는 COMPLETE CONTROLa 유도성 포유류 발현 시스템(STRATAGENER) 또는 이. 콜라이 발현 시스템인 이의 pET 발현 시스템이 포함된다. 유도성 발현 시스템의 다른 예로는 전장 CMV 프로모터를 사용하는 유도성 포유동물 발현 시스템인 T-REX(테트라사이클린-조절된 발현) 시스템을 보유하는 INVITROGENR으로부터 입수가능하다. INVITROGENR은 또한 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica) 발현 시스템이라고 하는 효모 발현 시스템을 제공하며, 당해 시스템은 메틸향성 효모 피키아 메타놀리카에서 재조합 단백질의 고수준 생성을 위해 디자인 된 것이다. 당업자는 발현 작제물과 같은 벡터를 발현시켜, 핵산 서열 또는 이의 발현 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드를 생성시키는 방법을 인지하고 있을 것이다.
돌연변이 유발
돌연변이 유발은 사용하는 경우에 다양한 표준 돌연변이 절차에 의해 달성될 수 있다. 돌연변이는 유기체의 양 또는 구조에서 변화가 일어나는 과정이다. 돌연변이는 단일 유전자, 유전자들의 블록 또는 전체 염색체의 뉴클레오티드 서열의 변형을 포함할 수 있다. 단일 유전자의 변화는 DNA 서열내 단일 뉴클레오티드 염기의 결실, 부가 또는 치환을 포함하는 점 돌연변이의 결과일 수 있거나, 다수의 뉴클레오티드가 삽입 또는 결실되어 발생하는 변화의 결과일 수 있다.
돌연변이는 게놈내 트랜스포손의 이동 또는 DNA 복제의 충실에서의 오류와 같은 과정의 결과로서 자발적으로 발생할 수 있다. 이들은 또한 화학적 또는 물리적 돌연변이원에 노출시켜 유도된다. 이러한 돌연변이 유도제로는 이온화 방사선, 자외선 및 다양한 화학물질, 예를 들어, 알킬화제 및 폴리사이클릭 방향족 탄화수소가 포함되며, 이들 모두는 (일반적으로는 일부 대사성 생형질전환 후) 핵산과 직간접적으로 상호작용할 수 있다. 상기 환경 물질에 의해 유도된 DNA 병소는 영향을 받은 DNA가 복제하거나 복원할 때 염기 서열의 변형을 유도하여, 결국 돌연변이를 일으킬 수 있다. 또한, 돌연변이는 특정 표적화 방법을 사용하여, 부위-지시할 수 있다.
부위-지시된 돌연변이 유발
구조-유도된 부위-특이적 돌연변이 유발은 단백질-리간드 상호작용의 이해 및 조작을 위한 강력한 도구가 된다[참조: Wells, 1996, Braisted et al., 1996]. 이러한 기술은 1종 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 선택된 DNA내로 도입함으로써 서열 변이체의 제조 및 시험을 제공한다.
부위-특이적 돌연변이 유발은 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 충분한 수의 인접한 비변형 뉴클레오티드를 사용한다. 이러한 방식으로, 프라이머 서열은 횡단하는 결실 연결부의 양쪽상에서 안정한 이본쇄를 형성하기에 충분한 크기 및 복합성을 갖는다. 길이가 약 17 내지 25개 뉴클레오티드의 프라이머가 바람직하며, 서열의 연결부 양쪽에서 약 5 내지 10개 잔기가 변형된다.
당해 기술은 전형적으로는 일본쇄 및 이본쇄 형태 모두로 존재하는 박테리오파아지 벡터를 사용한다. 부위-지시된 돌연변이 유발에 유용한 벡터로는 M13 파아지와 같은 벡터가 포함된다. 이들 파아지 벡터는 시판되고 있으며, 이들의 사용은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이본쇄 플라스미드가 또한 부위-지시된 돌연변이 유발에 통상적으로 사용되는데, 이 경우는 파아지로부터 플라스미드로 해당 유전자를 전달하는 단계를 배제한다.
일반적으로는, 일본쇄 벡터를 일차로 수득하거나, 이본쇄 벡터의 2가닥을 용융시키는데, 이들은 이의 서열내에 목적하는 단백질을 암호화하는 DNA 서열 또는 유전 요소를 포함하고 있다. 합성적으로 제조된 목적하는 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 하이브리드화 조건을 선택할 때 부정합 정도를 고려하여 일본쇄 DNA와 어닐링한다. 하이브리드화된 산물은 돌연변이-보유 가닥의 합성을 완성하기 위해, 이. 콜라이 폴리머라제 I(클레노우 단편)과 같은 DNA 중합 효소로 처리한다. 이와 같이, 이종 이본쇄가 형성되는데, 여기서, 한 가닥은 본래 비돌연변이된 서열을 암호화하고, 다른 한 가닥은 목적하는 돌연변이를 함유한다. 다음, 당해 이종 이본쇄 벡터를 사용하여, 이. 콜라이 세포와 같은 적합한 숙주 세포를 형질전환시키고, 돌연변이 서열 배열을 함유한 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선택한다.
19개 아미노산 치환을 모두 검사하는 포화 돌연변이 유발에 의해 단백질의 제공된 잔기의 작용 중요성 및 정보 내용에 관한 포괄적인 정보를 가장 잘 입수할 수 있다. 이러한 방법의 단점은 다중잔기 포화 돌연변이 유발의 작업시간이 상당하다는 점이다[참조: Warren et al., 1996, Brown et al., 1996; Zeng et al., 1996; Burton and Barbas, 1994; Yelton et al., 1995; Jackson et al., 1995; Short et al., 1995; Wong et al., 1996; Hilton et al., 1996]. 수백 및 가능한 수천의 부위 특이적 돌연변이체가 연구되어야 한다. 그러나, 개선된 기술은 돌연변이체를 보다 빠르고 신속하게 생산 및 선별할 수 있도록 해 준다["워크-쓰루(walk-through)" 돌연변이 유발 기술에 대해 참조: 미국 특허 제5,798,208호 및 제5,830,650호].
부위-지시된 돌연변이 유발의 다른 방법이 미국 특허 제5,220,007호, 제5,284,760호, 제5,354,670호, 제5,366,878호, 제5,389,514호, 제5,635,377호 및 제5,789,166호에 기술되어 있다.
시험관내 스캐닝 돌연변이 유발
오류 유발 PCR을 사용하여 랜덤 돌연변이 유발을 도입할 수 있다[참조: Cadwell and Joyce, 1992]. 돌연변이 유발 속도는 PCR을 주형이 희석된 다수의 튜브에서 실시함으로써 증대시킬 수 있다.
한 가지 특히 유용한 돌연변이 유발 기술은 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발이며, 여기서, 다수의 잔기가 개별적으로 아미노산 알라닌으로 치환되어 측쇄 상호작용을 상실하는 효과를 결정할 수 있는 한편, 단백질 변형에서 대규모 혼동의 위험을 최소화할 수 있다[참조: Cunningham et al., 1989].
최근 수년 동안에, 미량의 단백질을 사용하여 리간드 결합에 대한 평형 상수를 측정하는 기술이 개발되었다[참조: Blackburn et al., 1991; 미국 특허 제5,221,605호 및 제5,238,808호]. 소량의 물질로 작용 검정을 실시하는 능력은 항체의 포화 돌연변이를 위한 고도로 효율적인 시험관내 방법을 개발하는데 응용될 수 있다. 본 발명자들은 PCR 돌연변이 유발을 단백질 돌연변이체의 고도의 처리 생성을 위해 결합된 시험관내 전사/해독과 조합함으로써 클로닝 단계를 우회하였다. 여기서, PCR 산물은 돌연변이 단일쇄 항체의 시험관내 전사/해독을 위한 주형으로서 직접 사용된다. 모든 19개 아미노산 치환이 이러한 방식으로 생성되고 분석될 수 있는 높은 효율로 인해, 현재는 해당하는 많은 잔기에 대해 포화 돌연변이를 실시하는 것이 가능하며, 이러한 방법은 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이로 기술될 수 있다(Burks et al., 1997).
시험관내 스캐닝 포화 돌연변이는 (i) 리간드 결합 특이성을 조절하는 잔기의 동정, (ii) 활성을 유지하는 아미노산 및 주어진 위치에서 활성을 상실하는 아미노산의 동정을 기초로 하여 리간드 결합의 보다 나은 이해, (iii) 활성 부위 또는 단백질 서브도메인의 전체 유연성의 평가 및 (iv) 증대된 결합을 제공하는 아미노산 치환의 동정을 포함한 다량의 구조-기능 정보를 수득하는 신속한 방법을 제공한다.
투여량 및 제형
본 발명의 조성물(활성 성분; 예를 들어, 서열 1 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터)은 활성 성분과 동물의 체내 작용 부위가 접촉하도록 하는 모든 수단에 의해 제형화되고 투여되어 여러 성장 결핍 상태에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 아미노산 서열 유사체인 본 발명의 화합물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터로서 정의된다. 상기 조성물은 상기 화합물의 치료학적 유효량을 생성시키기에 충분한 양으로 투여된다. 당업자는 치료학적으로 효과적인 수준으로 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 제공하기 위해 사용되는 벡터의 충분량을 인지하고 있다. 당업자는 또한 용어 "투여" 및 "도입"은 상호교환적으로 사용할 수 있음을 인지하고 있다.
조성물은 개별적인 치료 활성 성분으로서 또는 치료 활성 성분의 배합물로서 약제와 함께 이용되고 있는 모든 통상적인 수단에 의해 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 사용될 수 있으나, 일반적으로는 선택된 투여 경로 및 표준 약제 실행을 기초로 하여 선택된 약제학적 담체와 함께 투여된다. 이러한 약제학적 조성물은 사람 및 수의용 임상 의학에서 치료 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 뇌하수체 기능저하 왜소발육증과 같은 성장-관련된 질환 및 성장 호르몬 생성에서의 비정상으로 인한 당뇨병의 치료에 유용하다. 게다가, 이들은 식육 생산을 위해 축산된 동물의 성장을 자극하거나 사료 효율을 증강시키거나, 젖 생산을 증대시키거나, 난 생산을 자극하기 위해 사용할 수 있다.
투여되는 용량은 활성 성분의 치료학적 유효량이며, 물론 특정 활성 성분의 약력학적 특징 및 이의 투여 방식 및 경로; 동물의 유형; 수혜자의 연령; 수혜자의 성별; 수혜자의 건강; 수혜자의 체중; 증상의 특성 및 정도; 동시 치료의 종류; 치료 회수; 및 목적하는 효과와 같은 공지된 인자에 따라 변할 수 있다. 투여될 본 발명의 벡터의 적합한 용량은 치료받을 개인 및 상태에 따라 다소 변할 것이다. 당업자는 정상 성장과 연관된 성장 호르몬의 공지된 순환 수준 및 벡터의 성장 호르몬 분비 활성을 기초로 하여 적합한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 당해 분야에 익히 공지되어 있는 바와 같이, 성장-관련된 질환의 치료는 성장 호르몬 생성의 불충분 정도에 따라 개별적으로 투여량을 변화하는 것이 필수적일 것이다. 가축에서 성장 활성을 자극하기 위해 사용되는 투여량은 사람의 뇌하수체 왜소발육증과 같은 성장 호르몬 결핍의 경우에 정상 성장을 회복하기 위해 사용된 투여량(체중 kg당)보다 상당히 높을 것이다.
따라서, 본 발명은 정상 성장과 연관된 수준으로 성장 호르몬의 생성을 자극하기에 충분한 양의 본 발명에 따른 유사체를 투여함을 특징으로 하여, 성장 호르몬의 불충분한 생성을 특징으로 하는 성장-관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 성장 호르몬의 정상 수준은 개인에 따라 상당히 다양하며, 해당 개인의 경우 순환 성장 호르몬의 수준은 하루 동안에 상당히 변한다.
또한, 본 발명은 정상 성장과 연관된 수준보다 높은 수준으로 성장 호르몬의 생성을 자극하기에 충분한 양의 본 발명의 GHRH 유사체를 투여함으로써, 동물의 성장 속도를 증대시키는 방법을 제공한다.
유전자 요법 투여: 필요한 경우, 유전자 요법 벡터는 투여 경로에 대해 당해 분야에 공지된 방식으로 고형, 반고형, 액상형 또는 기체형의 제제로 제형할 수 있다. 당해 분야에 공지된 수단을 사용하여, 조성물이 표적 기관에 도달하기까지 조성물의 분비 및 흡수를 억제할 수 있다. 본 발명의 조성물에 유해를 주지 않는 약제학적으로 허용되는 형태가 사용되어야 한다. 약제학적 제형에서, 조성물은 단독으로 또는 다른 약제학적 활성 화합물과 적합히 배합하여 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 경로를 통해 동물 체내의 여러 부위로 전달되어 특정 효과를 달성할 수 있다[참조: Rosenfeld et al. (1991); Rosenfeld et al. (1991a); Jaffe et al., 1992]. 당업자는 비록 1종 이상의 경로가 투여를 위해 사용될 수 있으나, 특정 경로가 다른 경로보다 더욱 신속하고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 인지하고 있다. 국소 또는 전신 전달이 체강내로 제제의 적용 또는 적하, 에어로졸의 흡입 또는 흡인 또는 비경구 투여(근육내, 정맥내, 복강, 피하, 피내 및 경피 투여를 포함)에 의해 달성될 수 있다.
당업자는 다른 전달 방법을 사용하여 벡터를 세포내로 투여할 수 있음을 인지하고 있다. 이러한 예로는 (1) 전기천공(전기), 유전자 총(물리력) 또는 다량의 액체를 적용(압력)과 같은 물리적 수단을 사용하는 방법 및 (2) 벡터를 리포좀 또는 수송 분자와 같은 다른 물질과 복합체를 형성하는 방법이 포함된다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 바람직하게는 조성물의 일부로서 상기 투여 경로 또는 당업자에게 공지되어 있고 특정 적용에 적합한 다른 경로를 사용하여, 숙주에 치료 유전자를 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 숙주 세포내로 벡터의 효과적인 유전자 전달은 치료 효과(예: 치료 대상의 특정 질환과 연관된 특정 증상의 완화)의 관점에서 또는 숙주내 전달된 유전자의 증거 또는 유전자의 발현에 의해 모니터링할 수 있다(예: 서열분석과 노던 또는 서던 하이브리드화 또는 전이 검정과 병용하여 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 숙주 세포 핵산을 검출하거나 면역블롯 분석, 항체-매개 검출, mRNA 또는 단백질 반감기 연구 또는 특수 검정법을 사용하여 전달된 핵산에 의해 암호화된 단백질 또는 폴리펩타이드를 검출하거나 이러한 전달로 인한 수준 또는 기능의 영향을 검출한다).
본원에 기술된 방법이 모두를 포함하는 것이 아니며, 특정한 용도에 적합한 추가의 방법이 당업자게 자명할 것이다. 게다가, 조성물의 유효량은 목적하는 효과를 발휘하는 것으로 공지되어 있는 화합물과의 유사성을 통해 추가로 조절될 수 있다.
게다가, 실질적인 투여량 및 스케쥴은 조성물이 다른 약제학적 조성물과 함께 투여되는 지에 따라 또는 약력학, 약물 특성 및 대사에 따라 변할 수 있다. 마찬가지로, 투여량도 시험관내 적용에서 사용된 특정 세포주에 따라(예를 들어, 세포 표면에 존재하는 벡터 수용체의 수 또는 유전자 전달에 사용되는 특정 벡터가 세포주에서 복제할 수 있는 능력에 따라) 변할 수 있다. 또한, 세포당 벡터의 첨가량은 벡터에 삽입된 치료학적 유전자의 길이 및 안정성 및 서열의 성질에 따라 변할 수 있으며, 특히 경험적으로 결정될 필요가 있는 변수이고, 본 발명의 방법에 속하지 않는 인자(예를 들어, 합성과 관련된 비용)로 인해 변할 수 있다. 당업자는 특정 상황에 따라 필요한 조정을 용이하게 수행할 수 있다.
하기 실시예는 단지 예시로서 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
GHRH 초활성 유사체는 GH 분비촉진 활성 및 안정성을 증대시킨다
GHRH는 사람(Frohman et al., 1984) 및 돼지의 순환계에서 약 12분의 비교적 짧은 반감기를 갖고 있다. 생물학적 반감기를 연장하고/하거나 GH 분비촉진 활성을 향상시키는 GHRH 유사체를 사용함으로써, 증강된 GH 분비를 달성한다. GHRH 돌연변이체를 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 생성시켰다. Gly15를 Ala15로 치환시켜, α-나선 형태 및 양친성 구조를 증대시킴으로써, 트립신-유사 효소에 의한 분해를 감소시켰다(Su et al., 1991). Ala15 치환을 갖는 GHRH 유사체는 GHRH 수용체보다 4 내지 5배 큰 친화성을 나타낸다(Campbell et al., 1991). Met의 산화로 인한 생물학적 활성의 손실을 줄이기 위해, 유리 COOH-말단을 갖는 분자를 사용하여, 약간 더 안정한 형태를 가지도록(Kubiak et al., 1989), Met27 및 Ser28을 Leu27 및 Asn28로의 치환을 수행하였다. 이에 따라, GHRH-15/27/28로 표시된 삼중 아미노산 치환 돌연변이체가 형성되었다. 디펩티딜 펩티다제 IV는 가장 적합한 혈청 GHRH 분해 효소이다[참조: Walter et al., 1980; Martin et al., 1993]. GHRH15/27/28을 선택한 다음, Ile2를 Ala2로 치환하거나(GHRH-TI) Val2로 치환함으로써(GHRH-TV) 또는 Tyr1 및 Ala2를 His1 및 Val2로 치환시킴으로써(GHRH-HV(도 1A); H1V2A15L27N28), 보다 빈약한 디펩티다제 기질을 형성시켰다.
실시예 2
DNA 작제물
돌연변이된 돼지 GHRH cDNA 서열의 생물학적 효능을 시험하기 위해, 골격 α-액틴으로부터의 근위 혈청 반응 요소(SRE), 다중 MEF-2 부위, MEF-1 부위 및 TEF-1 결합 부위를 함유하는 새로이 기술된 합성 근육 프로모터, SPc5-12에 의해 최고 수준의 골격근-특이적 유전자 발현을 지시할 수 있는 플라스미드 벡터를 작제하였다(Li et al., 1999). 31개 아미노산 시그널 펩타이드 및 전체 성숙 펩타이드 돼지 GHRH(Tyr1-Gly40) 및/또는 GHRH 돌연변이체를 암호화하는 pGHRH의 228-bp 단편, 이에 이어서 hGH cDNA의 3'비해독 영역을 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 근원성 GHRH 발현 벡터내로 삽입하였다. 플라스미드 pSPc5-12는 pSK-GHRH 골격의 SacI/BamHI 부위(Draghia-Akli et al., 1997)에 SPc5-12 합성 프로모터의 360 bp SacI/BamHI 단편(Li et al., 1999)을 함유한다.
야생형 및 돌연변이된 돼지 GHRH cDNA를 키트 변형된 부위 II 시험관내 돌연변이 유발 시스템(Promega; Madison, WI)을 사용하여 사람 GHRH cDNA(서열 8)의 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 수득하였다. 사람 GHRH cDNA를 BamHI-Hind III 단편으로서 pALTER 프로메가 벡터의 상응하는 부위내로 서브클로닝시키고, 제조업체의 지침에 따라 돌연변이 유발을 실시하였다. 서열 2: 5'-AGGCAGCAGGGAGAGAGGAACCAAGAGCAAGGAGCATAATGACTGCAG-3'의 프라이머를 사용하여 사람 아미노산 34 및 38을 변이시킴으로써, 사람 cDNA로부터 돼지 야생형 cDNA를 수득하였다. 돼지 HV 돌연변이를 서열 3: 5'-ACCCTCAGGATGCGGCGGCACGTAGATGCCATCTTCACCAAC-3'의 프라이머를 사용하여 수행하였다. 돼지 15Ala 돌연변이를 서열 4: 5'-CGGAAGGTGCTGGCCCAGCTGTCCGCC-3'의 프라이머를 사용하여 수행하였다. 돼지 27Leu28Asn 돌연변이를 서열 5: 5'-CTGCTCCCAGGACATCCTGAACAGGCAGCAGGGAGAG-3'의 프라이머를 사용하여 수행하였다. 돌연변이 유발 후, 생성된 클론을 서열분석하여 정확성을 검증하고, 후속적으로 당업자에게 익히 공지되어 있는 방업에 의해 본 실시예에 기술된 pSK-GHRH의 BamHI/Hind III 부위내로 서브클로닝시켰다.
당업자는 서열 8 대신에 Mus musculus(서열 9; 진뱅크 기탁번호 NM_010285); Bos taurus(서열 10; 진뱅크 기탁번호 AF168686 또는 서열 11; 진뱅크 기탁번호 BTU29611); Equus caballus(서열 12; 진뱅크 기탁번호 AF097587); Rattus norvegicus(서열 13; 진뱅크 기탁번호 RNU10156)로부터 유래된 것을 포함한 다른 GHRH 서열을 사용할 수 있음을 인지하고 있다.
실시예 3
세포 배양 및 형질감염
실험은 동일한 결과를 갖는 돼지 뇌하수체전엽 배양물 및 원발성 닭 근모세포 배양물에서 실시하였다. 그러나, 모든 도면은 돼지 뇌하수체전엽 배양물을 사용하여 발생된 데이터를 명시한다. 원발성 닭 근모세포 배양물은 다음과 같이 수득하였다. 닭 배아 조직을 회수하고, 피부 및 연골을 제거한 후, 기계적으로 해리하였다. 세포 현탁액을 투박한 무명천 및 렌즈 페이퍼에 통과시키고, 1 x 108내지2 x 108개/100mm 플라스틱 배양 디쉬의 밀도로 플레이팅하였다. 현탁액에 남은 세포군을 2 x 106내지 3 x 106개 세포/콜라겐-피복된 100mm 플라스틱 디쉬에 플레이팅하고, 5% CO2환경하에 37℃로 배양하였다. 이어서, 세포를 형질감염 24시간 전에 10% 열불활성화된 말 혈청(HIHS), 5% 닭 배아 추출물(CEE)(Gibco BRL; Grand Island, NY) 및 젠타마이신이 보충된 최소 필수 배지(MEM)에 1.5 x 106개 /100mm 플레이트의 밀도로 배양하였다. 보다 자세한 내용을 위해서는 문헌[Draghia-Akli et al., 1997 및 Bergsma et al., 1986]을 참조한다. 돼지 뇌하수체전엽 배양물은 문헌[Tanner et al., 1990]에 필수적으로 기술된 바와 같이 수득하였다. 요약하면, 뇌하수체 조직을 효소 조건하에 해리하고, 흡착이 이루어지기에 충분한 시간 동안 플라스틱 디쉬에 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 세정하고, 실험 이전에 배양 배지에 노출시켰다. 세부 사항을 위해서는 문헌[Tanner et al., (1990)]을 참조한다.
제조업체의 지침에 따라 리포펙타민을 사용하여 100mm 평판당 4mg의 플라스미드로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후, 배지를 2% HIHS 및 2% CEE가 함유된 MEM으로 교체하여 세포를 분화시켰다. 분화 후 72시간 경과하여 배지 및 세포를 회수하였다. 형질감염의 효율은 대조 평판의 β-갈락토시다제 조직화학으로 측정한 결과 10%인 것으로 나타났다. 회수 하루 전에 세포를 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)로 2회 세척하고, 배지를 MEM, 0.1% 소 혈청 알부민으로 교체하였다. 조성된 배지를 0.25용적의 1% 트리플루오로아세트산 및 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드를 가하여 처리하고, -80℃로 동결시킨 다음, 동결건조시키고, C-18 Sep-컬럼(Peninsula Laboratories, Belmont, CA) 상에서 정제하며, 재동결건조시키고, 방사선면역검정에 사용하거나 원발성 돼지 뇌하수체전엽 배양물을 위해 조성된 배지에 현탁시켰다.
실시예 4
GHRH 초활성 유사체는 GH 분비촉진 활성 및 안정성을 증대시킨다
골격 근모세포를 실시예 3에서와 같이 각 작제물로 형질감염시키고, 조성된 배양 배지 세포로부터 정제된 GHRH 일부를 돼지 뇌하수체전엽 세포 배양물에서의 성장 호르몬 분비에 대해 검정하였다. 도 1B에서 도시된 바와 같이, 24시간 후에 배지를 수거하고, 돼지 특이적 GH-방사선면역검정으로 정량하였다. 그 결과, 야생형 pGHRH에 비해 변형된 GHRH 종(GH15/27/28; GHRH-TI; GHRH-TV)에서 약 20% 내지 50%에 해당하는 GH 분비가 증대한 것으로 나타났다. 4개 돌연변이체 중 단지 1종(GHRH-HV)만이 GH 분비촉진 활성의 실질적인 증대를 나타내었으며, 여기서 pGH 수준은 200ng/ml의 기준치에서 1600ng/ml까지 상승하였다(도 1B).
실시예 5
HV-GHRH 분자의 혈장 배양
대조 돼지로부터 풀링된 돼지 혈장을 수거하고 -80℃에 저장하였다. 화학적으로 합성된 HV-GHRH를 펩타이드 합성법으로 제조하였다. 돼지 혈장을 해동시키고, 원심분리하여 37℃에 방치하여, 평형화시켰다. GHRH 돌연변이체를 혈장 샘플에 100㎍/ml의 최종 농도로 용해시켰다. GHRH 돌연변이체의 첨가 후에 즉시, 15분, 30분, 60분, 120분 및 240분 후, 1ml의 혈장을 회수하고, 1ml의 1M TFA로 산성화시켰다. 산성화 혈장을 C18 친화성 SEP-Pak 컬럼 상에서 정제하고, 동결건조시킨 다음, 월터스 600 멀티시스템 전달 시스템, 월터스 인텔리전트 샘플 프로세서, 717형 및 월터스 스펙트로모니터 490(Walters Associates, Millipore Corp., Milford, MA)을 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 214nm에서 검정을 실시하였다. 이들 시점에서 분해된 펩타이드의 비율을 적분 피크 측정법으로 측정하였다.
이어서, GHRH 펩타이드를 배양한 후 고체상 추출하고, HPLC 분석하여 돼지 혈장에서의 야생형 GHRH 및 유사체 GHRH-HV의 안정성을 시험하였다. 도 1C에서 도시된 바와 같이, 혈장에서 배양 60분 이내에 야생형 GHRH(1-44)NH2의 95%가 분해되었다. 대조적으로, 돼지 혈장에서 GHRH-HV의 배양은 폴리펩타이드의 적어도 75%가 배양 4 내지 6시간 동안에 효소 분해에 대해 보호된 것으로 나타났다. 따라서, 동일한 조건하에서, GHRH-HV의 대부분은 온전하게 남아있는 한편, 야생형 GHRH는 완전히 분해되었다. 이것은 GHRH-HV가 혈청 프로테아제에 대해 안정성이 상당히 증대하였음을 의미한다(도 1C).
실시예 6
동물 연구
GHRH 연구에서 5마리의 3-4주령 잡종 거세 수퇘지 3그룹(Yorkshire, Landrace, Hampshire and Duroc)을 사용하였다. 동물을 개별적으로 수용하고, 체중 다이어트의 6%(25% 단백질 돼지 밀, Producers Cooperative Association, Bryan, TX)와 함께 물을 무제한 공급하였다. 동물의 체중을 격일로 오전 8:30분에 재고, 이어서 먹이를 추가하였다. 동물은 NIH 가이드, USDA 및 동물 복리 법령 가이드라인에 따라 유지시켰다.
실시예 7
돼지에 플라스미드 DNA의 근육내 주사
pSPc5-12-HV-GHRH, pSPc5-12-wt-GHRH 및 pSPc5-12bgal의 내독소-비함유 플라스미드(Qiagen Inc., Chatsworth, CA) 제제를 PBS(pH 7.4) 중에 1mg/ml로 희석하였다. 동물을 처리 중의 한가지에 균일하게 배정하였다. 돼지를 이소플루란(유도 동안 2-6%의 농도, 유지 동안 1-3%의 농도)으로 마취시켰다. 경부 카테터를 외과적 처치로 이식하여 주사 후 3, 7, 14, 21, 28, 45 및 65일째에 동물로부터 채혈하였다. 마취되어 있는 동안 10mg의 플라스미드를 돼지의 반건양근 조직에 직접 주사하였다. 주사 후 2분 경과하여 주사된 근육을 캘리퍼 세트 사이에 넣고, 60밀리초의 4회 펄스와 함께 200V/cm의 최적화 조건을 사용하여 전기천공하였다(Aihara et al., 1998). 주사 후 65일째에, 동물을 치사시키고, 내부 기관 및 주사된 근육을 수거한 다음, 중량을 재고 액체 질소에 동결시킨 다음, -80℃에 저장하였다. 시체의 중량을 재고, 중성자 활성화에 의해 분석하였다. 등 지방을 측정하였다.
실시예 8
pSP-HV-GHRH의 근육 주사는 2개월에 걸쳐 돼지 GHRH, GH 및 IGF-I 혈청 수준을 증대시킨다
최적화된 프로테아제 내성 pSP-HV-GHRH 벡터가 GHRH의 장기간 발현을 촉진하고 GH 및 IGF-I 분비된 수준을 자극하는 능력을 측정하였다. pSP-HV-GHRH뿐만 아니라, 야생형 작제물 pSP-wt-GHRH(야생형 대조군) 및 합성 근원성 프로모터 이. 콜라이 β-갈락토시다제 발현 벡터 pSP-bgal(위약 대조군)의 개요도가 도 2A에 도시되어 있다. 동물의 안락하도록, 거세된 3주령 수컷 돼지를 마취하고, 경정맥 카테터를 삽입하여, 혈액 샘플을 채취하였다. 플라스미드 발현 벡터 DNA(pGHRH-HV, pSP-GHRH 또는 pSP-bgal의 DNA 10mg)를 반건양근 조직에 직접 주사한 다음 전기천공하였다(실시예 7 참조).
실시예 9
돼지 GHRH, GH 및 IGF-1 측정
돼지 GHRH를 이종 사람 검정 시스템(Penisula Laboratories, Belmont, CA)으로 측정하였다. 검정 감도는 1pg/튜브이다. 혈장 중의 돼지 GH를 특수 이중 항체 처리 RIA(펜실바니아 주립대학)로 측정하였다. 검정 감도는 4ng/튜브이다. 돼지 IGF-1는 이종 사람 검정법(Diagnostic System Lab., Webster, TX)에 의해 측정한다. 데이터는 마이크로소프트 엑셀 통계 분석 패키지를 사용하여 분석한다. 도면에 도시된 값은 평균±표준편차이다. 특정 p값은 스튜던트 t 시험을 사용하여 비교하여 수득하였다. p<0.05는 통계상 유의 수준으로 설정된 것이다. pSP-GHRH-HV가 반건양근에 주사된 돼지에서 GHRH 수준은 주사 후 7일째에 증대하였고(도 2B), 14일째에 대조 수준보다 150% 이상이었다(652.4±77pg/ml 대 419.6±13pg/ml). pSP-GHRH-HV 발현 활성은 60일까지 정체기에 도달하였으며, 이것은 위약 주사된 대조치보다 약 2 내지 3배 높은 수준이었다. pSP-GHRH-HV 주사된 돼지에 의해 분비된, 0일째와 60일째 사이의 증가된 체중에 대해 교정된(혈액 용적은 전체 체중의 8%에 이른다) 혈청 GHRH의 절대량은 위약 주사된 대조치보다 3배 높았다(1426.49±10.47ng 대 266.84±25.45ng)(도 2C). 반건양근에 주사된 야생형 pSP-GHRH 주사된 동물은 주사 후 45일째에 GHRH 수준이 단지 약간 증대한 것으로 나타났으나, 주사 후 60일째에 생물학적 효과를 나타내기에 충분한 수준으로 2배로 증대하였다(779.36ng).
어린 동물은 GH 수준이 아주 높으며, 나이가 들면서 서서히 감소한다. 최초 주사한 지 7 및 14일 후에, 24시간에 걸쳐 매 15분 마다 혈액 샘플을 채취하고, pGH 수준을 검정하고, 이를 pGH 함량의 전체 변화에 대해 외삽하였다. pGHRH-HV 주사된 돼지(도 2D)는 주사 7일 후(델타 변이 HV = +1.52, wt = -0.73 대 대조군 = -3.2ng/ml) 및 14일 후(델타 변이 HV = +1.09, wt = -4.42 대 대조군 = -6.88ng/ml)에 명백한 GH 함량 증가를 보였다.
GH의 증대된 전신 수준은 또한 IGF-I의 상승된 수준을 의미한다. 혈청 돼지 IGF-1 수준은 주사 후 약 3일째에 pSP-GHRH-HV 주사된 돼지에서 증대하기 시작하였다(도 2E). 21일째에 이들 동물은 평균 약 3배 혈청 IGF-1 수준이 증대하였고, 이는 60일(p<0.03)에 걸쳐 유지되었다. 대조적으로, 야생형 pSP-GHRH 발현 벡터로 주사된 돼지는 도 2E에 도시된 바와 같이 순환하는 IGF-1 수준(p = 0.39)에서 단지 40%만 증대한 것으로 나타났다.
실시예 10
근원성 GHRH 발현 벡터는 돼지 성장을 증대시킨다
근원성 pSP-GHRH 발현 벡터의 근육내 주사 후 전신 순환 분비된 돼지 GH는 거세된 어린 수컷 돼지에서 65에 걸쳐 증대하였다. 주사 후 30 및 65일째에(농도측정, K40) 또는 사후에(기관, 시체, 체지방, 직접적인 해부 후 중성자 활성화 챔버) 신체 조성을 생체내 측정하였다. 야생형 pSP-GHRH 주사된 동물은 위약 대조군보다 평균 21.5% 무거운 한편(37.125kg 대 29.375kg), pSP-GHRH-HV 주사된 돼지는 도 3A에 도시된 바와 같이 37.8% 더 무거웠다(41.775kg; p = 0.014). 사료 효율 또한 대조군과 비교할 경우에 GHRH 작제물이 주사된 돼지에서 20%까지 향상되었다(pSP-HV-GHRH에 kg 중량 증가를 위해 0.267kg 사료/일이고, pSP-wt-GHRH의 경우 0.274kg이며, pSP-bgal 주사된 돼지의 경우 0.334kg이다)(도 3B). 농도 계측, K40 칼륨 챔버 및 중성자 활성화 챔버에 의한 신체 조성 연구는 GHRH 주사된 동물에서 모든 신체 성분의 일정한 증대를 보여주었고, 체지방이 상대적으로 높고, 이로 인한 병리현상인 장기비대의 징후는 없었다. 45일 후 위약 주사된 대조 돼지 및 pSP-GHRH-HV 주사된 돼지의 사진을 도 3C에서 도시한다.
표 I에 제시된 pSP-HV-GHRH 주사된 돼지의 대사 프로파일은 pSP-GHRH 및pSP-GHRH-HV의 주사 후 혈청 요소 수준의 유의적인 감소를 내포하며(대조군에서 9±0.9mg/dl, 주사된 돼지에서 각각 8.3±1mg/dl 및 6.875±0.5mg/dl)(p=0.006), 이것은 감소된 아미노산 이화대사를 의미한다. 혈청 글루코즈 수준은 대조군과 플라스미드 GHRH 주사된 돼지 사이에 유사하였다(대조 돼지에서 99.2±4.8mg/dl, pSP-GHRH-HV 주사된 돼지에서 104±6.9mg/dl, 야생형 pSP-GHRH 주사된 동물에서 97.5±8mg/dl)(p=0.263). 다른 대사 변화는 발견되지 않았다.
| 글루코즈 | 요소 | 크레아티닌 | 총 단백질 | |
| 대조군 | 99.2±4.8 | 9±0.9 | 0.82±0.06 | 46±0.22 |
| pSP-wt-GHRH | 97.5±8 | 8.3±1 | 0.83±0.056 | 476±0.35 |
| pSP-HV-GHRH | 104.8±6.9 | 6.875±0.5 | 0.78±0.04 | 488±0.23 |
실시예 11
상이한 수준의 pSP-HV-GHRH를 사용한 실험
새끼 돼지의 성장에 pSP-HV-GHRH가 미치는 영향을 추가로 연구하기 위해, 출생 후 10일째에 2마리 새끼 돼지의 그룹에 pSP-HV-GHRH를 주사하였다(3mg, 1mg, 100㎍). 도 4에 도시된 바와 같이, 100㎍의 플라스미드로 주사된 그룹이 최상의 성장 곡선을 나타내었으며, 생후 50일째에 대조군과 통계상 유의차를 보였다. 3mg이 주사된 그룹 동물 중의 한마리는 항체를 생성시키고, 유의적으로 감소된 성장 패턴을 나타내었다.
또한, 2마리 새끼 돼지의 그룹에 출생 후 10일째에 표시된 용량의 pSP-HV-GHRH를 주사하였다. IGF-I 값은 주사 후 10일째에 상승하기 시작하였고, 주사 후 35일째에 100㎍의 플라스미드가 주사된 돼지는 대조군보다 평균 10.62배 높은 IFG-I를 보였다. 1mg이 주사된 돼지는 대조군에 비해 평균 7.94배 높았고, 3mg이 주사된 돼지는 대조군에 비해 평균 1.16배이었다.
따라서, 특정 양태에 있어서, pSP-HV-GHRH의 보다 낮은 용량을 주사한다. 특정한 양태에 있어서, 약 100㎍(0.1mg)의 플라스미드를 사용한다. 다른 특정 양태에 있어서, 약 200 내지 300㎍을 주사한다.
실시예 12
pSP-HV-GHRH와 연령 비교
pSP-HV-GHRH 주사를 위한 새끼 돼지의 연령을 최적화하기 위해, 2마리 새끼 돼지의 그룹에 출생시에 2mg의 pSP-HV-GHRH를 주사하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 생후 14일째 주사된 그룹이 최상의 성장 곡선을 나타내었으며, 매시점에서 대조군과 통계학적 유의차를 보였다. 21일째 주사된 그룹에 속한 한마리는 항체를 생성시키고, 유의적으로 감소된 성장 패턴을 보였다. 지나치게 초기(즉, 약 10 내지 14일령 이내)에 처치되는 경우, 인슐린 내성이 있을 가능성이 있다. 특정 양태에 있어서, 처치는 천연 GH 및 IGF-I 수준이 가장 낮을 때(약 생후 10 내지 14일째) 가장 효과적이며, GHRH 수준이 정상적으로 높을 경우 역효과가 발생할 수 있다.
실시예 13
요약
요약하면, 최적의 주사 시점은 생후 14일째이다(주사 후 40일째에 대조군보다 평균 8파운드 무겁다)(p<0.04). 바람직한 주사 용량은 2-5ml 용량 중의 100㎍ 플라스미드이다(주사 후 40일째에 대조군보다 평균 6파운드 무겁다)(p<0.02). 호르몬 및 생화학적 상수는 암퇘지 1(시간 경과) 및 암퇘지 3(투여량 곡선)의 자손에서 및 체중 증가와 상호관련하여 정상이며(IGF-I, IGF-BP3, 인슐린, 요소, 글루코즈, 총 단백질, 크레아티닌), 유해한 부작용은 없다. 이전 실험으로부터의 신체 조성 연구는 HV-GHRH가 모든 신체 성분(대조군과 유사하지만 보다 큰 신체 조성)의 일정한 증대를 결정하는 한편, 제지방 체중의 증가 및 지방 감소를 결정한다는 것을 보여주었다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 문헌은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가 수준을 의미한다. 모든 특허 및 문헌의 내용은 각 문헌이 특정적으로 및 개별적으로 참고로 인용되는 것이 필요한 경우에 본원에서 인용한다.
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발명자로서 기재된 모마니 등에게 1980년 9월 16일에 허여된 미국 특허제4,223,019호.
간행물
당업자는 본 발명을 응용 실시하여 본원에 언급된 목적 및 이점뿐만 아니라, 본 발명 고유의 목적 및 이점을 달성할 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 본원에 기술된 성장 호르몬, 성장 호르몬 분비 호르몬, 유사체, 플라스미드, 벡터, 약제학적 조성물, 치료, 방법, 절차 및 기술은 현재 바람직한 양태를 제시하는 것으로, 예시하고자 하는 것이며, 발명의 범주를 한정하고자 하는 것은 아니다. 당업자는 본 발명을 변형 사용할 수 있으나, 이들 모두는 본 발명의 취지내에 포함되거나 특허청구의 범위에 의해 한정된다.
Claims (21)
- 조성물로서, 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 성장 호르몬-분비 호르몬.
- 제1항의 성장 호르몬 분비 호르몬을 약제학적으로 허용되는 담체 중에 포함하는, 동물에서 성장 호르몬의 분비를 자극하기 위한 약제학적 조성물.
- 조성물로서, 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 성장 호르몬-분비 호르몬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열.
- 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현을 위해 작동적으로 연결된 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터.
- 제4항에 있어서, 프로모터가 합성 근원성 프로모터인 벡터.
- 제4항에 있어서, 3' 비해독 영역이 hGH 3' 비해독 영역인 벡터.
- 치료학적 유효량의 제4항의 벡터를 동물에 도입하는 단계를 포함하여, 동물에서 성장 호르몬을 증대시키는 방법.
- 치료학적 유효량의 제4항의 벡터를 동물에 도입하는 단계를 포함하여, 동물에서 성장 호르몬 경로와 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍 질환을 치료하는 방법.
- 제8항에 있어서, 결핍 질환이 동물내에서의 유전자 물질 변화의 결과인 방법.
- 치료학적 유효량의 제4항의 벡터를 동물에 도입하는 단계를 포함하여, 동물에서 성장 능력을 향상시키는 방법.
- 치료학적 유효량의 제4항의 벡터를 동물에 도입하는 단계를 포함하여, 동물의 효율을 증대시키는 방법.
- 치료학적 유효량의 제4항의 벡터를 동물에 도입하는 단계를 포함하여, 화상, 외상, AIDS 또는 다른 소모성 질환과 연관된 동물의 소모성 질환을 치료하는 방법.
- 치료학적 유효량의 제4항의 벡터를 동물에 도입하는 단계를 포함하여, 동물에서 성장을 증진시키는 방법.
- 치료학적 유효량의 제4항의 벡터를 동물에 도입하는 단계를 포함하여, 성장 호르몬 경로와 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍 질환을 치료하는 방법.
- 제7항 내지 14항 중의 어느 한 항에 있어서, 동물이 사람, 애완 동물, 식용동물 및 사역 동물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제7항 내지 14항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가 근원성 세포내로 도입되는 방법.
- 제7항 내지 14항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가 동물의 근조직내로 도입되는 방법.
- 제7항 내지 14항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가 단일 투여로 동물내로 도입되는 방법.
- 제4항에 있어서, 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 벡터.
- 근원성 합성 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현을 위해 작동적으로 연결된 hGH의 3' 비해독 영역으로 구성된 벡터의 치료학적 유효량을 동물내로 도입하는 단계를 포함하여, 동물에서 성장 호르몬 경로와 연관된 성장 호르몬-관련된 결핍증을 치료하는 방법.
- 근원성 합성 프로모터, 서열 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 기능적인 발현을 위해 작동적으로 연결된 hGH의 3' 비해독 영역으로 구성된 벡터의 치료학적 유효량을 동물내로 도입하는 단계를 포함하여, 정상 성장과 연관된 수준보다 높은 수준으로 동물에서 성장 호르몬의 생성을 자극하는 방법.
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