KR20020045288A - Immunopotentiating composition containing the extract of Rhodiola root - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 면역기능강화제, 특히 항박테리아제, 항균제, 항암제, 항종양제로서 사용될 수 있는 새로운 물질인 홍경천(Rhodiola sachalinensis) 뿌리 추출물을 함유한 조성물 관한 것이다.The present invention relates to a composition containing a root extract of Rhodiola sachalinensis , a novel substance that can be used as an immunostimulating agent, in particular an antibacterial, antibacterial, anticancer, and antitumor agent.
홍경천 (Rhodiola)은 다년생 초본식물로서 (蕭培根; 中國本草圖鑑 (第1卷), 驪江出版社, 서울, p314, 1994), 육질이 있는 근경이 있고 뿌리와 줄기가 중요한 약용 부위로 사용되고 있다. 홍경천은 분류상 피자식물문, 경천과, 홍경천속에 속하며 전 세계적으로 96종이 있는 것으로 보고되어 있는데, 특히 중국에 70종이 있고 서장에는 34종과 2가지 변종이 있어 전체 종의 50% 가량이 분포하고 있다.Rhodiola is a perennial herbaceous plant (蕭 培根; 中國 本草 圖鑑 (第 1 卷), 驪 江 出版社, Seoul, p314, 1994). It has fleshy roots and is used as an important medicinal site. . Hongkyungcheon is classified as pizza plant gate, Gyeongcheondae, and Hongkyungcheon by category, and there are 96 species worldwide. Especially, there are 70 species in China, and 34 species and 2 varieties in Xinjiang. have.
또한, 홍경천은 온도가 낮고 건조하며 산소가 결핍되고 강한 자외선이 비취며 낮과 밤의 온도 차이가 심한 해발 2,000∼5,000m의 악조건에서도 그 적응력이 강한 독특한 식물이다. 따라서, 인삼, 가시오가피가 발견된 이후에 원기를 회복시키고, 병과 독을 극복하여 장수하게 하는 가장 훌륭한 보건 약용식물의 일종으로 알려져 ' 고원 인삼 '이라는 별칭도 가지고 있다.In addition, Hongkyeongcheon is a unique plant that has a low temperature, dryness, oxygen deficiency, strong ultraviolet light and strong adaptability even under bad conditions of 2,000 ~ 5,000m above sea level, where the temperature difference between day and night is severe. Therefore, it is known as one of the best health medicinal plants that rejuvenate after the discovery of ginseng and thorny ginseng, and overcome disease and poison.
종래에 홍경천은 항스트레스제(한국공개특허 제98-8056호), 숙취제거제(한국공개특허 제98-61433호), 당뇨병, 저혈압 및 피로회복 치료조성물(한국공개특허 제94-23490호) 및 순환기 질환의 예방제(한국공개특허 제99-71183호)로 사용되었다.Traditionally, Hong Kyung-cheon is an anti-stress agent (Korean Patent No. 98-8056), a hangover remover (Korean Patent No. 98-61433), a composition for treating diabetes, hypotension and fatigue (Korean Patent No. 94-23490) and It was used as a preventive agent of circulatory disease (Korean Patent Publication No. 99-71183).
한편, 일산화 질소(이하 'NO'라 함)는 신경계, 면역계 및 혈액순환계에서 생리학적으로 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다(Mayer and Hemmens, 1997.Trends in Biochemical Science 22, 477∼481). 세포생물학적 관점에서, NO는 구아니릴-시클라제(guanylyl cyclase)의 헴 구조에 결합하여 cGMP 생성량을 증가시킴으로써, 세포의 생리학적 현상들을 매개하는 것으로 알려져 있다(Murphy and Walker, 1998.Acta Physiologica Scandinavia 164, 373∼380).On the other hand, nitrogen monoxide (hereinafter referred to as 'NO') is known to play a physiologically important role in the nervous system, immune system and blood circulation system (Mayer and Hemmens, 1997. Trends in Biochemical Science 22 , 477-481). From a cytobiological point of view, NO is known to mediate physiological phenomena in cells by binding to heme structure of guanylyl cyclase and increasing cGMP production (Murphy and Walker, 1998. Acta Physiologica Scandinavia 164 , 373-380).
또한, 활성화된 대식세포들에 의해 합성된 NO는 비-특이 면역성의 세포독성/세포증식억제(cytotoxic/cytostatic) 작용을 한다(Knight, 2000.Annuals of Clinical and Laboratory Science 30, 145). 대식세포에서, 이러한 비-특이 면역작용을 하는 NO는 유도성 일산화질소 신타아제(inducible Nitric Oxide synthase, 이하 'iNOS'라 함)에 의해 L-아지닌(L-arginine)으로부터 합성된다. 대식세포에서 iNOS 유전자 발현의 유도를 위해서는 일차신호인 인터페론-γ(이하, 'IFN-γ'라 함)가 요구된다. 그런 다음, 박테리아 종양괴사인자-α(TNF-α), 리포폴리사카라이드(lipopolyscharride, 이하, "LPS"라 함) 또는 전구-염증 시토킨(pro-inflammatory cytokines)의 이차신호에 의해서 발현이 활성화된다. 그러나, 일차신호 또는 이차신호만 있는 경우에는 iNOS 유전자는 발현되지 않고, 두 신호에 대식세포가 동시에 노출되었을 때, 즉 두 신호의 상승작용에 의해서만 발현될 수 있다.In addition, NO synthesized by activated macrophages has a non-specific immune cytotoxic / cytostatic action (Knight, 2000. Annuals of Clinical and Laboratory Science 30 , 145). In macrophages, these non-specific immune functions are synthesized from L-arginine by inducible Nitric Oxide synthase (hereinafter referred to as iNOS). Induction of iNOS gene expression in macrophages requires a primary signal, interferon-γ (hereinafter referred to as 'IFN-γ'). Expression is then activated by secondary signals of bacterial tumor necrosis factor-α (TNF-α), lipopolyscharride (hereinafter referred to as "LPS") or pro-inflammatory cytokines. do. However, iNOS gene is not expressed when there is only a primary signal or a secondary signal, and can be expressed only when macrophages are simultaneously exposed to both signals, that is, by synergy of two signals.
이러한 대식세포에서 iNOS 유전자의 발현에 의해 유도되는 NO는 체내의 면역기능강화 효과, 즉 항박테리아, 항균, 항종양 및 항암 효과를 나타낸다. 따라서,당업계에서는 종래부터 iNOS 유전자의 발현을 증가시켜, 항박테리아제, 항균제, 항종양제, 항암제 등으로 이용하고자 하는 연구가 많이 이루어졌다.NO induced by the expression of the iNOS gene in these macrophages shows an immune enhancing effect in the body, that is, antibacterial, antibacterial, antitumor and anticancer effects. Therefore, in the art, many studies have been made to increase the expression of iNOS gene and to use it as an antibacterial agent, an antibacterial agent, an antitumor agent, an anticancer agent, and the like.
이에 본 발명자들 또한 대식세포에서 iNOS 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 면역기능을 강화시킬 수 있는 물질을 찾고자 많은 연구를 수행한 결과, 홍경천 뿌리 추출물이 iNOS 유전자의 발현유도를 통한 NO의 생성을 증가시켜 면역기능을 강화시킬 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Therefore, the present inventors also conducted a lot of research to find a substance that can enhance the immune function by increasing the expression of iNOS gene in macrophages, Rhodiola root extract increases the production of NO through induction of iNOS gene expression It has been found that the immune function can be enhanced, and the present invention has been completed.
따라서, 본 발명의 목적은 대식세포에서 iNOS 유전자 발현을 증가시켜 면역기능을 강화시킬 수 있는 홍경천 뿌리 추출물 함유 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition containing Rhodiola chinensis root extract that can enhance immune function by increasing iNOS gene expression in macrophages.
도 1은 RAW264.7세포에서 다양한 농도의 홍경천 뿌리 추출물과 IFN-γ의 상승작용(synergism)에 의한 일산화질소 생성효과를 나타낸 도면이다.(도면에서, *는 비처리 시료와의 통계학적 NO 생성량 차이가 p<0.05임을 나타낸다.)1 is a diagram showing the effect of nitrogen monoxide production by synergism of the Rhodiola root extract and IFN-γ at various concentrations in RAW264.7 cells. The difference is p <0.05).
도 2는 RAW264.7세포에서 홍경천 뿌리 추출물의 처리 시간에 따른 IFN-γ와의 상승작용에 의한 일산화질소 생성효과를 나타낸 도면이다.(도면에서, *는 비처리 시료와의 통계학적 NO 생상량 차이가 p<0.05임을 나타낸다.)Figure 2 is a diagram showing the effect of nitrogen monoxide production by synergism with IFN-γ according to the treatment time of the Rhodiola sachalinensis extract in RAW264.7 cells. Is p <0.05.)
도 3은 RAW264.7세포에서 일산화질소 신타아제(nitric oxide synthase;NOS) 및 유도성 일산화질소 신타아제(inducible nitric oxide synthase;iNOS) 억제제에 의해 홍경천 뿌리 추출물과 IFN-γ의 상승작용 억제효과를 나타내는 도면이다.(도면에서, *는 비처리 시료와의 통계학적 NO 생성량 차이가 p<0.05임을 나타내고, **는 홍경천 뿌리 추출물(RSE)과 IFN-γ만 처리한 시료와의 통계학적 NO 생성량 차이가 p<0.05임을 나타낸다.)Figure 3 shows the synergistic inhibitory effect of Rhodiola root extract and IFN-γ by nitric oxide synthase (NOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) inhibitors in RAW264.7 cells (In the figure, * indicates that the difference in statistical NO production from the untreated sample is p <0.05, and ** indicates statistical NO production between the Rhodiola root extract (RSE) and the sample treated with IFN-γ only.) The difference is p <0.05).
도 4a는 RAW264.7세포에서 홍경천 뿌리 추출물과 IFN-γ의 상승작용에 의해 iNOS 유전자 발현이 증가됨을 RT-PCR을 통해 보여주는 도면이다.Figure 4a is a diagram showing via RT-PCR that iNOS gene expression is increased by synergy of Rhodiola root extract and IFN-γ in RAW264.7 cells.
도 4b는 RAW264.7세포에서 홍경천 뿌리 추출물과 IFN-γ의 상승작용에 의해iNOS 유전자 발현이 증가됨을 노던 블랏 분석을 통해 보여주는 도면이다.Figure 4b is a diagram showing the Northern blot analysis to increase the expression of iNOS gene by synergistic effect of Rhodiola root extract and IFN-γ in RAW264.7 cells.
상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명에 따른 조성물은 대식세포의 iNOS 유전자 발현을 유도하여, NO의 생성을 증가시킴으로써, 면역기능을 강화시킬 수 있는 물질로 홍경천 뿌리 추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the composition according to the present invention is characterized in that it contains the honggyeongcheon root extract as a substance that can induce the iNOS gene expression of macrophages, increase the production of NO, enhance the immune function .
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 홍경천 뿌리를 물 또는 알코올 등을 이용하여 예로부터 전통적으로 내려오거나, 한의서 또는 교과서에 기재되어 있는 통상적인 추출방법으로 추출한 뿌리 추출물이 iNOS 유전자의 발현을 유도하여 NO의 생성을 증가시킴으로써 면역기능을 강화시킬 수 있음을 발견하고, 이를 유효성분으로 하는 면역기능강화제 조성물을 제공하는 것이다.In the present invention, the root extract of Rhodiola sachalinensis, which is traditionally descended using water or alcohol, or extracted by conventional extraction methods described in Chinese medicine or textbooks, induces the expression of iNOS gene and increases the production of NO. It is to find that the function can be enhanced, and to provide an immunostimulator composition using the same as an active ingredient.
본 발명의 면역기능강화제에서 유효성분인 홍경천 뿌리 추출물의 유효량은투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어 질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 홍경천 뿌리 추출물이 1∼1,000㎎/㎏체중의 농도로 투여되도록 제형화 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기한 범위를 벗어난 양일 수도 있다.The effective amount of the Honggyeongcheon root extract as an active ingredient in the immunostimulating agent of the present invention may be appropriately selected depending on the administration method, the type of formulation, the patient's age, the patient's weight, the patient's sensitivity and the condition of the disease, specifically limited Generally, but not always, the Rhodiola root root extract may be formulated to be administered at a concentration of 1 to 1,000 mg / kg body weight. Of course, the dose of the active ingredient may be an amount outside the above range.
홍경천 뿌리 추출물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 의약품 등의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여경로를 통해 면역기능강화를 위해 투여될 수 있으며, 투여 제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.Formulations for administering the honggyeongcheon root extract within the above range may have a conventional form, for example, may be used in the form of pills, capsules or drinks, medicines and the like. They may be administered for immune function through oral or various parenteral routes of administration, and are suitable for the dosage form and are already well known to those skilled in the art and various excipients, carriers or diluents which can be easily selected by those skilled in the art. It may contain.
한편, 홍경천 뿌리 추출물의 iNOS 유전자 발현유도를 통한 NO 생성 증가효과를 알아보기 위해서, 쥐의(murine) 대식세포주인 RAW264.7세포들을 이용하였다. 그 이유는, RAW264.7세포가 일반적인 대식세포의 활성화를 연구하는데 사용되어질 수 있고, 대식세포들의 활성화 연구에 폭넓게 사용되어지고 있기 때문이다(Liu et al., 1999.Journal of Immunology 163, 6606∼6613).On the other hand, in order to determine the effect of increasing the production of NO by the iNOS gene expression of the Rhodiola root extract, RAW264.7 cells, a murine macrophage line, were used. The reason is that RAW264.7 cells can be used to study the activation of macrophages in general and are widely used to study the activation of macrophages (Liu et al., 1999. Journal of Immunology 163 , 6606-). 6613).
본 발명에 따르면, 홍경천 뿌리 추출물은 IFN-γ처리된 RAW264.7세포에 처리하였을 때, 현저하게 NO 생성량을 증가시킬 수 있다. 도 1에서 보는 바와 같이, 효율적으로 NO 생성량을 증가시킬 수 있는 홍경천 뿌리 추출물의 처리농도는 1∼1000㎍/㎖이고, 바람직하게는 10∼100㎍/㎖이다. 또한, 도 2에서 보는 바와 같이, 홍경천 뿌리 추출물은 6시간 이상, 바람직하게는 6∼24시간 처리하면, NO 생성량이 증가한다.According to the present invention, the red ginseng root extract can significantly increase NO production when treated with IFN-γ-treated RAW264.7 cells. As shown in FIG. 1, the treatment concentration of the Rhodiola sachalinensis extract which can efficiently increase NO production amount is 1 to 1000 µg / ml, and preferably 10 to 100 µg / ml. In addition, as shown in Figure 2, the Rhodiola chinensis root extract is treated for 6 hours or more, preferably 6 to 24 hours, NO production amount increases.
한편, 본 발명에 따르면, 홍경천 뿌리 추출물을 단독으로 사용할 경우, NO 생성량이 전혀 증가하지 않고, IFN-γ가 존재하는 상태에서 홍경천 뿌리 추출물을 처리할 경우에만, 이들의 상승작용(synergism)에 의해서 NO 생성량을 증가시킬 수 있다. 이러한 결과는 홍경천 뿌리 추출물이 대식세포의 이차 활성화 신호물질로 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.On the other hand, according to the present invention, when the honggyeongcheon root extract alone is used, NO production is not increased at all, and only when treating the honggyeongcheon root extract in the presence of IFN-γ, by their synergism (synergism) NO production can be increased. These results indicate that Rhodiola root extract can be used as a secondary activation signal of macrophages.
또한, 본 발명에 따르면, 홍경천 뿌리 추출물과 IFN-γ의 상승작용에 의한 NO의 생성량 증가효가는 NOS 억제제인 NGMMA(NG-monomethyl-L-arginine) 또는 iNOS 억제제인 아미노구아니딘(aminoguanidine; 이하, "AG"라 함)에 의해서 감소될 수 있으며, 이런 결과는 홍경천 뿌리 추출물의 NO 생성량 증가 효과가 iNOS 유전자 발현증가에 관련되어 있음을 간접적으로 확인시켜 준다. 홍경천 뿌리 추출물의 NO 생성량 증가효과가 iNOS 유전자 발현 증가를 유도하기 때문이라는 직접적인 증거로 RT-PCR 및 노던블랏 검사를 한 결과, 도 4a 및 4b에서 보는 바와 같이, IFN-γ가 존재하였을 때 홍경천 뿌리 추출물이 iNOS 유전자의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있다.In addition, according to the present invention, the effect of increasing the amount of NO produced by the synergistic effect of Rhodiola sachalinensis extract and IFN-γ is N G MMA (N G -monomethyl-L-arginine) or iNOS inhibitor aminoguanidine (aminoguanidine; It may be reduced by the following "AG", and this result indirectly confirms that the effect of increasing the NO production of Rhodiola root extract is related to the iNOS gene expression increase. As a result of RT-PCR and Northern blot test as direct evidence that the increase of NO production of the Rhodiola sachalinensis extract induces the increase of iNOS gene expression, as shown in FIG. 4A and FIG. It can be seen that the extract increases the expression of the iNOS gene.
따라서, IFN-γ가 존재하는 상황에서 홍경천 뿌리 추출물을 처리하면, iNOS 유전자 발현 증가를 통한 NO의 생성량을 증가된다.Therefore, when the Rhodiola root extract is treated in the presence of IFN-γ, NO production is increased through iNOS gene expression.
또한, Knight, J.A.,Annuals of Clinical and Laboratory Science 30,145∼158(2000)에, 활성화된 대식세포들에서 iNOS 발현증가에 의해 합성된 NO가 비-특이 면역성의 세포독성/세포증식억제(cytotoxic/cytostatic) 작용을 하여, 면역기능강화 효과, 즉 항박테리아, 항균, 항종양 및 항암 효과를 제공할 수 있다는 것이 기재되어 있다.In addition, Knight, JA, Annuals of Clinical and Laboratory Science 30 , 14 5-158 (2000) showed that NO synthesized by increased iNOS expression in activated macrophages is a non-specific immune cytotoxicity / cytoproliferation inhibition ( It has been described that it can have a cytotoxic / cytostatic action to provide an immune enhancing effect, that is, antibacterial, antibacterial, antitumor and anticancer effect.
따라서, 대식세포의 iNOS 발현 증가를 통해 NO의 합성량을 증가시킬 수 있는 홍경천 뿌리 추출물은 면역기능강화제, 즉, 항박테리아제, 항종양제, 항암제로서 사용될 수 있고, 여기에 국한되지 않고, 당업계에서 알려진 대식세포의 다양한 면역기능 작용을 증진시키는데 이용할 수 있다.Thus, Rhodiola sachalinensis extract, which can increase the amount of NO synthesized by increasing iNOS expression of macrophages, can be used as an immune enhancing agent, i.e., but not limited to, antibacterial agents, antitumor agents, and anticancer agents. It can be used to enhance various immune functions of macrophages known in the art.
한편, IFN-γ는 세포면역기능을 하는 세포인 T 세포에 의해서 분비되는 면역기능 조절물질로서, IFN-γ는 박테리아 침입 등의 면역기능 세포들이 활성화되는 상태가 체내에서 일어나면, 자연적으로 발생한다. 따라서, 본 발명의 홍경천 뿌리 추출물은 단독으로 사용하여도 체내의 IFN-γ와 상승작용을 하여 면역기능 강화 현상을 보일 수 있다. 그러나, 바람직하게는 iNOS 발현 증가의 상승작용을 더욱 증가시키기 위해서, IFN-γ와 동시에 사용한다.On the other hand, IFN- [gamma] is an immune function regulator secreted by T cells, which are cell-immunological function, IFN- [gamma] occurs naturally when a state of activation of immune function cells such as bacterial invasion occurs in the body. Thus, even when used alone, the Honggyeongcheon root extract may exhibit an enhanced immune function by synergistically with IFN-γ in the body. However, it is preferably used simultaneously with IFN-γ to further increase the synergy of increased iNOS expression.
한편, 본 발명의 조성물은 홍경천 뿌리 추출물의 형상을 특별히 한정하지는 않지만, 액상, 고형물로서 사용할 수 있다.On the other hand, the composition of the present invention is not particularly limited to the shape of the Rhodiola root root extract, it can be used as a liquid, solid.
이하, 본 발명을 실시예와 도면에 의해서 더욱 상세하게 설명하지만, 이에 의해서 본 발명이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, although an Example and drawing demonstrate this invention in detail, this invention is not limited by this.
실시예Example
[참고 실시예 1] 홍경천 뿌리 추출물의 제조Reference Example 1 Preparation of Rhodiola sativus Root Extract
전북 무주 소재 덕유생약(주)로부터 홍경천(Rhodiola sachalinensis)을 구입하였다. 홍경천의 건조 뿌리 300g을 7시간동안 100℃의 증류수로 추출하였다. 추출물은 0.45㎛ 여과막으로 여과한 후, 동결 건조하였다. 이때, 수득량은 11.5g이었고, 얻어진 홍경천 추출물은 -20℃에서 보관하였다. Rhodiola sachalinensis was purchased from Deokyu Pharmaceutical Co., Ltd. in Muju, Jeonbuk. 300 g of dried roots of Honggyeongcheon were extracted with distilled water at 100 ° C. for 7 hours. The extract was filtered through 0.45 μm filtration membrane and then lyophilized. At this time, the yield was 11.5g, the obtained honggyeongcheon extract was stored at -20 ℃.
[참고 실시예 2] 액상 추출물의 제조Reference Example 2 Preparation of Liquid Extract
사용하기 전에, 건조된 추출물 1g을 10㎖의 행크균형염 용액(Hank's balanced salt solution; 물 1ℓ에 0.185g/ℓ 염화칼슘 이수화물, 0.1g/ℓ 황산마그네슘 무수물, 0.4g/ℓ 염화칼륨, 0.06g/ℓ 인산칼륨 일염기 무수물, 0.35g/ℓ 나트륨 비카본산, 8.0g/ℓ 염화나트륨, 0.05g/ℓ 인산나트륨 이염기 무수물 및 1.0g/ℓ D-글루코스을 용해하여 제조)에 용해하였고, 0.22㎛ 여과막으로 여과하여 액상의 형태로 제조하였다.Prior to use, 1 g of dried extract was added to 10 ml of Hank's balanced salt solution; 0.185 g / l calcium chloride dihydrate, 0.1 g / l magnesium sulfate anhydride, 0.4 g / l potassium chloride, 0.06 g / l potassium phosphate monobasic anhydride, 0.35 g / l sodium bicarboxylic acid, 8.0 g / l sodium chloride, 0.05 g / l sodium phosphate dibasic anhydride and 1.0 g / l D-glucose) Filtration to prepare a liquid form.
[참고 실시예 3] 실험에 사용한 시약들Reference Example 3 Reagents Used in the Experiment
쥐(murine)의 재조합 인터페론-γ(IFN-γ)는 겐자임(Genzyme(Munchen, Germany))사로부터 구입하였다. 행크의 균형염 용액(HBSS), RPMI-1640, 설파닐아민, N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 디하이드로클로라이드, 폴리마익신 B, NG-모노메틸-L-아지닌(NGMMA) 및 아미노구아니딘(AG)는 시그마화학(Sigma chemical company (St. Louis, MO, USA))으로부터 얻었다. RNA-분리 키트는 퀴아젠(Qiagen(Hilden, Germany))에서 구입하였고, 타카라 RNA PCR 키트 ver2.1(TaKaRa RNA PCR kit ver2.1(AMV))은 TaKaRa(Bohan, ROK)로부터 얻었다. 송아지 혈청(Fetal bovine serum; 이하 'FBS'라 함) 및 항생제는 Gibco/RBL(Gaithersberg, MD)로부터 구입하였다. 조직 배양 실험의 모든 시약들 및 배지는 측색계 LAL 검사(colorimetric Lim㎕us amoebocyte lysate assay; 검사 한계 10pg/㎖; Whittaker Bioproducts, Walkersville, MD)를 사용하여 내독소 함량에 대한 검사를 하였다. 시약들 모두 내독소를 함유하지 않았다. 조직배양 플레이트 및 100mm 직경의 페트리 디쉬(petri dishes)는 Nunc(NAperville, IL)로부터 구입하였다.Murine recombinant interferon-γ (IFN-γ) was purchased from Genzyme (Munchen, Germany). Hank's balanced salt solution (HBSS), RPMI-1640, sulfanylamine, N- (1-naphthyl) -ethylenediamine dihydrochloride, polymyxin B, N G -monomethyl-L-azinine (N G MMA) and aminoguanidine (AG) were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO, USA). RNA-isolation kits were purchased from Qiagen (Hilden, Germany) and Takara RNA PCR kit ver2.1 (TaKaRa RNA PCR kit ver2.1 (AMV)) was obtained from TaKaRa (Bohan, ROK). Fetal bovine serum (hereinafter referred to as 'FBS') and antibiotics were purchased from Gibco / RBL (Gaithersberg, MD). All reagents and media in tissue culture experiments were tested for endotoxin content using a colorimetric Limμlus amoebocyte lysate assay (test limit 10 pg / ml; Whittaker Bioproducts, Walkersville, MD). All of the reagents did not contain endotoxins. Tissue culture plates and 100 mm diameter petri dishes were purchased from Nunc (NAperville, IL).
[참고 실시예 4] RAW264.7 대식세포주의 배양REFERENCE EXAMPLE 4 Culture of RAW264.7 Macrophage Line
쥐의 대식세포주인 RAW264.7세포는 미국 조직 배양 보관소(American Tissue Culture Collection; ATCC TIB-71, Rockville, MD)로부터 얻었다. 10% 가열불활성화된 송아지 혈청, 1% L-글루타민, 1% 비-필수(non-essential) 아미노산, 1% 항생제/항균제(10,000U/㎖의 페니실린, 25㎍/㎖의 암포테리신 D 또는 10㎎/㎖의 스트렙토마이신), 1.5%의 탄산나트륨 및 1% 기본 필수 비타민들을 첨가한 완전 RPMI 1640 배지에서, 37℃의 온도로 가습된 5% CO2상태를 유지하면서 24 시간 동안 배양하였다.Rat macrophage lines, RAW264.7 cells, were obtained from the American Tissue Culture Collection (ATCC TIB-71, Rockville, MD). 10% heat-inactivated calf serum, 1% L-glutamine, 1% non-essential amino acids, 1% antibiotic / antibacterial (10,000 U / ml penicillin, 25 μg / ml amphotericin D or 10 mg / ml streptomycin), 1.5% sodium carbonate and 1% basic essential vitamins were added to the complete RPMI 1640 medium, which was incubated for 24 hours while maintaining a humidified 5% CO 2 state at a temperature of 37 ° C.
[실시예 1] 홍경천 뿌리 추출물의 NO 합성 효과Example 1 NO Synthesis Effect of Rhodiola Radix Root Extract
실험에 쓰인 배양배지는 iNOS 유전자 발현의 이차 신호물질인 LPS의 활성에 의해서 유전자 발현이 증가될 가능성을 배제하기 위해서, LPS 억제제인 100U/㎖의 폴리마익신 B(polymyxin B)를 처리하였다.The culture medium used in the experiment was treated with LPS inhibitor 100U / ml polymyxin B in order to exclude the possibility of increased gene expression by the activity of LPS, a secondary signal of iNOS gene expression.
참고 실시예 3에서 배양된 264.7세포들을 10U/㎖의 IFN-γ이 존재하는 배지에서, 참고 실시예 2의 액상의 홍경천 뿌리 추출물을 1, 10, 100 및 1000㎍/㎖의농도로 24시간 처리하고, RAW264.7세포의 NO 생성량을 측정하였다. NO 생성량 측정은 NO가 배양액과 접촉하여 변형된 니트라이트(nitrite)의 농도를 측정하여 조사하였다. 대조군으로 IFN-γ을 처리하지 않은 상태에서 액상의 홍경천 뿌리 추출물을 처리하였다.The 264.7 cells cultured in Reference Example 3 were treated in a medium containing 10 U / ml of IFN-γ, and the liquid Rhodiola root extract of Reference Example 2 was treated for 24 hours at concentrations of 1, 10, 100 and 1000 µg / ml. Then, NO production amount of RAW264.7 cells was measured. NO production was determined by measuring the concentration of modified nitrites in contact with NO. As a control, the liquid Rhodiola root extract was treated without IFN-γ.
한편, 니트라이트의 농도는 그리에스 반응(Griess reaction)으로 측정하였다. 즉, 100㎕/웰의 시료와 동일양의 그리에스 용액(5% 인산 용액에 용해된 1% 설파닐아마이드 및 증수류에 용해된 알파-나프틸아민의 혼합액)을 혼합하고, 상온에서 10분간 반응시켰다. 그런 다음, Titertek ELISA Reader(Flow, Rockville, MD)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.Meanwhile, the concentration of nitrite was measured by the Gries's reaction. That is, 100 μl / well of sample and the same amount of Gries solution (mixture of 1% sulfanylamide dissolved in 5% phosphoric acid solution and alpha-naphthylamine dissolved in distillate) are mixed, and at room temperature for 10 minutes. Reacted. Then, absorbance was measured at 540 nm using a Titertek ELISA Reader (Flow, Rockville, MD). The results are shown in FIG.
도 1에서 보는 바와 같이, IFN-γ가 존재하는 상태에서 액상의 홍경천 뿌리 추출물 처리량을 증가함에 따라, NO의 생성량이 증가하는 것을 알 수 있다. 한편, NO의 생성량의 증가는 추출물의 처리량이 1㎍/㎖ 이상이면, NO 생성량 차이가 나타났고, 10㎍/㎖ 이상일 때 IFN-γ를 처리하지 않을 때와 유의적인 차이를 나타냈다. 또한, 100㎍/㎖ 이상에서는 NO 생성량이 포화되었다. 한편, IFN-γ를 처리하지 않고, 액상의 홍경천 뿌리 추출물만을 처리하였을 때는, 전혀 NO 생성량이 증가되지 않았다.As shown in Figure 1, it can be seen that the production amount of NO increases with increasing the amount of the Rhodiola root extract in the liquid phase in the presence of IFN-γ. On the other hand, the increase in the amount of NO produced showed a difference in the amount of NO produced when the throughput of the extract was 1 µg / ml or more, and was significantly different from that when IFN-γ was not treated when 10 µg / ml or more. In addition, the amount of NO produced was saturated at 100 µg / ml or more. On the other hand, when only the liquid Rhodiola root extract was treated without IFN- [gamma], NO production was not increased at all.
[실시예 2] 홍경천 뿌리 추출물 처리 시간에 따른 NO합성 효과Example 2 NO Synthesis Effect According to Rhodiola sativus Root Extract Treatment Time
RAW264.7 세포에 액상의 홍경천 뿌리 추출물을 100㎍/㎖로 처리하고, 배양시간을 0 , 6, 12, 18시간으로 다양하게 한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.RAW264.7 cells were treated with 100 μg / ml of the liquid Rhodiola root extract, and the culture was carried out in the same manner as in Example 1 except that the incubation time was varied to 0, 6, 12, and 18 hours. The results are shown in FIG.
도 2에서 보는 바와 같이, 액상의 홍경천 뿌리 추출물을 처리한 시간이 증가함에 따라 생성된 NO 생성량이 증가하며, 효과적인 처리 시간은 6시간 이상이라는 것을 알 수 있다.As shown in Figure 2, the amount of NO produced is increased as the treatment time of the liquid honggyeongcheon root extract increases, it can be seen that the effective treatment time is more than 6 hours.
[실시예 3] 홍경천 뿌리 추출물에 대한 NOS 및 iNOS 억제제의 효과Example 3 Effect of NOS and iNOS Inhibitor on Rhodiola Root Extract
LPS 억제제 폴리마익신 B 100U/㎖이 부가된 배양배지 내의 RAW264.7 세포에 액상의 홍경천 뿌리 추출물 100㎍/㎖ 및 IFN-γ 10U/㎖를 처리한 상태에서, 2mM NGMMA 또는 100uM AG를 더 부가하고, 24시간 동안 참고 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다. 그런 다음, 실시예 1에 설명된 것과 동일한 방법에 의해서 NO 생성량을 측정하였다. 대조군으로 2mM NGMMA 및 100uM AG이 전혀 부과되지 않은 배양배지에서 NO 생성량을 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.An LPS inhibitor poly town iksin B 100U / ㎖ adducted culture honggyeongcheon liquid in RAW264.7 cells in culture medium root extract 100㎍ / ㎖ and in a state in which process the IFN-γ 10U / ㎖, 2mM N G MMA or 100uM AG Further, and incubated in the same manner as in Reference Example 3 for 24 hours. Then, NO production amount was measured by the same method as described in Example 1. As a control, NO production was measured in culture medium that was not imposed with 2 mM N G MMA and 100 uM AG. The results are shown in FIG.
도 3에서 보는 바와 같이, NOS 억제제인 NGMMA 또는 iNOS 억제제인 AG를 더 부가하였을 때에 NO 생성량이 현저하게 감소함을 알 수 있다. 이러한 결과는 홍경천 뿌리 추출물이 iNOS 유전자의 발현을 증가시켜 NOS의 생성량을 증가시키는데 관여한다는 것을 나타낸다.As shown in Figure 3, it can be seen that the NOS inhibitor N G MMA or the NO production significantly decreased the iNOS inhibitor AG when hayeoteul further added. These results indicate that Rhodiola root extract is involved in increasing the production of NOS by increasing the expression of iNOS gene.
[실시예 4] RT-PCR에 의한 홍경천 뿌리 추출물의 iNOS mRNA 발현촉진 효과 검사Example 4 iNOS mRNA Expression Promotion Effect Test of Rhodiola Radix Root Extract by RT-PCR
LPS 억제제 폴리마익신 B 100U/㎖이 부가된 배양배지 내의 RAW264.7 세포에 액상의 홍경천 뿌리 추출물 10㎍/㎖ 또는 100㎍/㎖, IFN-γ 10U/㎖, 또는 이들을 모두 처리한 다음, 참고 실시예 3과 동일한 방법으로 8시간동안 배양하였다. 배양배지로부터 세포들을 분리하고, RNA-분리 키트를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 TaKaRa RNA PCR 키트를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 즉, 1mM dNTP, 1U/㎕ RNase 억제제, 0.25U/㎕ AMV(Avian Myeloblastosis Virus) 역전사 효소, 0.125μM 올리고-dT-아댑터 프라이머 및 1㎍ RNA의 혼합액을 55℃에서 30분동안 배양하여 cDNA를 제조하였다. 그런 다음, 혼합액에 있는 AMV 역전사 효소의 활성을 억제하기 위해서 99℃에서 5분동안 불활성시켰다.RAW264.7 cells in culture medium supplemented with LPS inhibitor polymyxin B 100U / ml were treated with 10 μg / ml or 100 μg / ml of liquid Rhodiola root extract, IFN-γ 10U / ml, or both Incubated for 8 hours in the same manner as in Example 3. Cells were isolated from the culture medium and RNA was extracted using an RNA-separation kit. The extracted RNA was subjected to RT-PCR using TaKaRa RNA PCR kit. That is, cDNA was prepared by culturing a mixture of 1 mM dNTP, 1 U / μl RNase inhibitor, 0.25 U / μL Avian Myeloblastosis Virus (AMV) reverse transcriptase, 0.125 μM oligo-dT-adapter primer, and 1 μg RNA at 55 ° C. for 30 minutes. It was. It was then inactivated at 99 ° C. for 5 minutes to inhibit the activity of AMV reverse transcriptase in the mixture.
DNA 온도 순환기(DNA thermal cycler; Perkin Elmer, Cetus, Norwalk, CT)를 이용한 PCR을 통해 상기에서 얻어진 cDNA를 증폭시켰다. PCR 반응 조건들은 다음과 같다.The cDNA obtained above was amplified by PCR using a DNA thermal cycler (Perkin Elmer, Cetus, Norwalk, CT). PCR reaction conditions are as follows.
iNOS에 대한 PCR용 프라이머들Primers for PCR for iNOS
(+) 프라이머(positive primer) : 5'-TTTGGAGCAGAAGTGCAAAGTCTC-3'Positive primer: 5'-TTTGGAGCAGAAGTGCAAAGTCTC-3 '
(-) 프라이머(negative primer) : 5'-GATCAGGAGGGATTTCAAAGACCT-3'Negative primer: 5'-GATCAGGAGGGATTTCAAAGACCT-3 '
β-액틴(β-actin)에 대한 PCR용 프라이머들Primers for PCR for β-actin
(+) 프라이머(positive primer) : 5'-TTGTAACCAACTGGGACGATATGG-3'Positive primer: 5'-TTGTAACCAACTGGGACGATATGG-3 '
(-) 프라이머(negative primer) : 5'-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3'Negative primer: 5'-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3 '
상기 0.8mM의 iNOS PCR용 프라이머 또는 β-액틴 프라이머, 1X PCR 완충용액, 0.2mM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP가 각각 0.05mM씩 포함된 용액) 및 0.03U Taq 중합효소(Taq polymerase)의 농도로 30㎕의 증류수에 혼합시키고 다음과 같은과정에 의해서 PCR을 수행하였다.0.8mM iNOS PCR primer or β-actin primer, 1X PCR buffer, 0.2mM dNTP (solution containing 0.05 mM each of dATP, dTTP, dGTP and dCTP) and 0.03U Taq polymerase (Taq polymerase) 30 μl of distilled water was mixed at the concentration, and PCR was performed by the following procedure.
PCR을 수행한 후, 시료 10㎕를 EtBr(ethidium bromide)이 포함된 1% 아가로스 겔에서 전기영동시키고, UV로 감광시켜 DNA 밴드를 확인하였다. 그 결과는 도 4a에 나타내었다. After PCR, 10 μl of the sample was electrophoresed on a 1% agarose gel containing EtBr (ethidium bromide), and photosensitive to UV to identify DNA bands. The results are shown in Figure 4a.
도 4a에서 보는 바와 같이, IFN-γ만을 처리하면, iNOS의 발현이 아주 적고, 홍경천 뿌리 추출물만을 처리하면 발현이 전혀 되지 않았다. 그러나, IFN-γ와 홍경천 뿌리 추출물을 동시에 처리하면, iNOS의 발현량이 증가함을 보여준다. 한편, β-액틴의 결과는 각 시료들마다 RT-PCR 수행에 사용된 mRNA시료가 동일함을 나타낸다. 이러한 결과는, 본 발명의 홍경천 뿌리 추출물이 대식세포의 iNOS 발현에 이차적 활성화물질로 작용함을 보여준다. 즉, iNOS 유전자의 발현을 위해서는, IFN-γ 및 홍경천 뿌리 추출물이 동시에 처리되어야 함을 나타낸다.As shown in Figure 4a, when only IFN-γ treatment, the expression of iNOS is very little, only when the Rhodiola root extract was not expressed at all. However, when the IFN-γ and Rhodiola root extracts were treated simultaneously, iNOS expression was increased. On the other hand, the results of β-actin indicates that the mRNA samples used to perform RT-PCR for each sample is the same. These results show that the Rhodiola root extract of the present invention acts as a secondary activator for iNOS expression of macrophages. That is, for the expression of iNOS gene, IFN-γ and Rhodiola root extract should be treated simultaneously.
[실시예 5] 노던 블랏 분석에 의한 홍경천 뿌리 추출물의 iNOS mRNA 발현촉진 효과 검사Example 5 iNOS mRNA Expression Promoting Effect Test of Rhodiola Radix Root Extract by Northern Blot Analysis
노던블랏 수행시 사용된 프로브의 염기서열은 센스(Sense ; 5'-GGCCTTGGCTCC AGCATGTAC-3')와 안티센스(Antisense ; 5'-GTTCTGGATGAGAGCGGCAGC-3')로 구성된다. 그리고 562bp 크기의 iNOS DNA 담편 프로브는 실시예 4의 RT-PCR 방법을 이용하였다.The base sequence of the probe used in the Northern blot is composed of sense (Sense; 5'-GGCCTTGGCTCC AGCATGTAC-3 ') and antisense (Antisense; 5'-GTTCTGGATGAGAGCGGCAGC-3'). And the 562 bp iNOS DNA fragment probe was used for the RT-PCR method of Example 4.
한편, 실시예 4와 같은 방법으로, 실험군 및 대조군을 설정하고 각 군으로부터 RNA를 분리하였다. 그런 다음, 15∼20㎍의 RNA 시료를 채취하여, 포름알데히드/포름아마이드로 변성시키고(denaturing), 20X SSC(3.0M 염화 나트륨, 0.3M 시트르산 나트륨, pH 7.0) 존재하에서 모세관작용을 이용한 나일론막으로 이동시켰다(transferring). 사전-하이브리드형성(pre- hybridizing)을 시킨 후에, 1X 10cpm/㎖의 활성을 갖는 [α-32P] dCTP 표지된 iNOS DNA 단편 프로브, 5X SSC, 10X 덴하트 용액(Denhardt's solution), 50% 포름아마이드, 10mM Na2HPO4(인산나트륨 이염기) 및 0.5% SDS(sodium dodecyl sulfate)의 혼합용액으로 하이브리드 형성을 42℃에서 20시간동안 수행하였다. 그런 다음, 나일론 막을 2X SSC/0.5% SDS, 1X SSC/0.5% SDS 및 0.2X SSC/0.5% SDS의 세척용액으로 3단계 세척을 통하여 잉여량의 방사선을 제거하였다. 그런 다음, 나일론 막을 건조시킨 후, 방사선 표지정도를 X-레이 필름에 감광시켜 확인하였다. 그 결과는 도 4b에 나타내었다.On the other hand, in the same manner as in Example 4, experimental and control groups were set and RNA was separated from each group. Then, 15-20 μg of RNA sample was taken, denatured with formaldehyde / formamide, and nylon membrane using capillary action in the presence of 20X SSC (3.0M sodium chloride, 0.3M sodium citrate, pH 7.0). Transferred to. After pre-hybridizing, [α- 32 P] dCTP labeled iNOS DNA fragment probe with 1 × 10 cpm / ml activity, 5X SSC, 10 × Denhardt's solution, 50% form Hybrid formation was carried out at 42 ° C. for 20 hours with a mixed solution of amide, 10 mM Na 2 HPO 4 (sodium phosphate dibasic) and 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS). The nylon membrane was then removed with excess radiation through a three step wash with a wash solution of 2X SSC / 0.5% SDS, 1X SSC / 0.5% SDS and 0.2X SSC / 0.5% SDS. Then, after drying the nylon membrane, the degree of radiolabeling was confirmed by photosensitizing the X-ray film. The results are shown in Figure 4b.
결과로, 도 4b에서 보여지는 바와 같이, 실시예 4와 동일하게 홍경천 뿌리 추출물이 iNOS 유전자 발현을 증가시킴을 노던블랏 분석을 통해서도 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 4b, it could be confirmed through Northern blot analysis that the honggyeongcheon root extract increased the iNOS gene expression as in Example 4.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 홍경천 뿌리 추출물은 IFN-γ와의 상승작용에 의해서, 대식세포의 iNOS 유전자의 발현을 증가시켜 NO의 생성양을증가시킬 수 있고, 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 항박테리아제, 항종양제, 항암제 등의 면역기능강화제로서 사용될 수 있다.As described above, the honggyeongcheon root extract according to the present invention can increase the amount of NO production by increasing the expression of iNOS gene of macrophages by synergy with IFN-γ, and thus, the composition according to the present invention May be used as an immunostimulating agent, such as antibacterial agent, antitumor agent, anticancer agent.
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Payment date: 20070426 Year of fee payment: 5 |
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