KR100834049B1 - Medium and method for cell suspension culture of Rhodiloa sachalinensis, and feed additives and feeds containing Rhodiloa sachalinensis cells obtained from the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 홍경천의 세포 현탁배양용 배지, 상기 배지를 이용한 홍경천의 세포 현탁배양 방법, 및 상기 방법으로부터 얻어진 홍경천 세포를 함유하는 사료첨가제 및 사료에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 자연산 홍경천에 비해 유효성분인 살리드로사이드(salidroside)의 함량이 3~4배 증가되어 뛰어난 면역활성화 효과를 나타내는 홍경천 세포를 대량으로 얻을 수 있는 바, 얻어진 홍경천 세포는 사료첨가제 및 사료로 효율적으로 활용될 수 있다.The present invention relates to a cell suspension culture medium of honggyeongcheon, a cell suspension culture method of honggyeongcheon using the medium, and a feed additive and feed containing honggyeongcheon cells obtained from the method, according to the present invention an active ingredient Phosphorus salidroside (salidroside) content is increased three to four times to obtain a large amount of ryecheoncheon cells showing excellent immune activation effect, the obtained ryecheoncheon cells can be efficiently used as feed additives and feed.
홍경천, 현탁배양, 살리드로사이드, 면역활성화, 사료첨가제, 사료 Hong Kyungcheon, Suspension Culture, Salidroside, Immune Activation, Feed Additive, Feed
Description
도 1은 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 NAA 및 BA 농도의 영향을 보여주는 그래프이고;1 is a graph showing the effect of NAA and BA concentrations on salidroside production during 3 week cell suspension culture of Rhodiola sachaline in 2B 5 liquid medium;
도 2는 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 GA3 농도의 영향을 보여주는 그래프이며;FIG. 2 is a graph showing the effect of GA 3 concentration on salidroside production upon 3-week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA;
도 3은 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 TDZ 농도의 영향을 보여주는 그래프이고;FIG. 3 is a graph showing the effect of TDZ concentration on salidroside production upon 3-week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA;
도 4는 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 제아틴 농도의 영향을 보여주는 그래프이며;FIG. 4 is a graph showing the effect of zeatin concentration on salidroside production upon 3-week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA;
도 5는 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 스퍼민 농도의 영향을 보여주는 그래프이고;FIG. 5 is a graph showing the effect of spermine concentration on salidroside production upon 3-week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA;
도 6은 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 스퍼미딘 농도의 영향을 보여주는 그래프이며;FIG. 6 is a graph showing the effect of spermidine concentration on salidroside production upon 3 week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA;
도 7은 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 KNO3 농도의 영향을 보여주는 그래프이고;FIG. 7 is a graph showing the effect of KNO 3 concentration on salidroside production upon 3-week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA;
도 8은 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 (NH4)2SO4 농도의 영향을 보여주는 그래프이며;FIG. 8 is a graph showing the effect of (NH 4 ) 2 SO 4 concentration on salidroside production in 3 week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA. ;
도 9는 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 NaH2PO4·2H2O 농도의 영향을 보여주는 그래프이고;FIG. 9 is a graph showing the effect of NaH 2 PO 4 .2H 2 O concentration on salidroside production during 3 week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA ego;
도 10은 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 CaCl2·2H2O 농도의 영향을 보여주는 그래프이며;FIG. 10 is a graph showing the effect of CaCl 2 .2H 2 O concentration on salidroside production upon 3 week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA;
도 11은 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 MgSO4·7H2O 농도의 영향을 보여주는 그래프이고;FIG. 11 is a graph showing the effect of MgSO 4 .7H 2 O concentration on salidroside production upon 3 week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA;
도 12는 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 홍경천의 3 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산에 대한 통기속도의 영향을 보여주는 그래프이며;FIG. 12 is a graph showing the effect of aeration rate on salidroside production upon 3-week cell suspension culture of Rhodiola saline in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA;
도 13은 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 0.4 ℓ/분의 통기속도로 홍경천의 7 주간 세포 현탁배양 시 살리드로사이드 생산양상을 보여주는 그래프이며;FIG. 13 is a graph showing salidroside production during 7-week cell suspension culture of Rhodiola sachaline at aeration rate of 0.4 L / min in 2B 5 liquid medium containing 1 mg / L NAA and 5 mg / L BA;
도 14는 본 발명에 따라 얻어진 홍경천 세포가 항체생성능에 미치는 영향을 보여주는 그래프이고;14 is a graph showing the effect of the ryekyungcheon cells obtained in accordance with the present invention on the antibody production performance;
도 15는 본 발명에 따라 얻어진 홍경천 세포가 대식세포의 활성화에 미치는 영향을 보여주는 그래프이며;FIG. 15 is a graph showing the effect of erythrocytes obtained according to the present invention on the activation of macrophages;
도 16은 본 발명에 따라 얻어진 홍경천 세포가 비장세포 비율에 미치는 영향을 보여주는 그래프이고;Figure 16 is a graph showing the effect on the ratio of splenocytes of the erythrocytes obtained according to the present invention;
도 17은 본 발명에 따라 얻어진 홍경천 세포가 사이토카인 유전자발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.Figure 17 is a graph showing the effect of ryekyungcheon cells obtained according to the present invention on cytokine gene expression.
본 발명은 홍경천의 세포 현탁배양 배지 및 방법, 및 그로부터 얻어진 홍경천 세포를 함유하는 사료첨가제 및 사료에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 자연산 홍경천에 비해 유효성분인 살리드로사이드(salidroside)의 함량이 3~4배 증가되어 뛰어난 면역활성화 효과를 나타내는 홍경천 세포를 대량으로 얻을 수 있는, 홍경천의 세포 현탁배양 배지 및 방법, 및 그로부터 얻어진 홍경천 세포를 함유하는 사료첨가제 및 사료에 관한 것이다.The present invention relates to a cell suspension culture medium and method of honggyeongcheon, and a feed additive and feed containing the honggyeongcheon cells obtained therefrom, and more specifically, the content of salidroside (salidroside) which is an active ingredient compared to natural honggyeongcheon The present invention relates to a cell suspension culture medium and method of ryekyungcheon, and feed additives and feeds containing the ryecheoncheon cells obtained therefrom, which can be obtained in large quantities, resulting in a large amount of ryecheoncheon cells exhibiting an excellent immunoactivating effect.
홍경천(Rhodiloa sachalinensis A. Bor)은 돌나무과의 돌꽃속에 속하는 다년생 초본으로 참돌꽃이라고도 부른다. 대부분은 해발 1,700~2,300 m 사이의 주야간 온도차가 크고, 저온, 건조, 광풍, 강자외선과 같은 고산지대의 혹독한 환경에서 석회암이나 화강암 등의 암석 사이에서 서식한다. 대부분 노지에서 자생하는 홍경천은 바위틈에서 적은 영양분의 섭취로 인하여 10년이 넘어도 뿌리가 작고 일부는 썩는 경우가 많고, 가을에 씨가 떨어져 긴 겨울을 지내고 이듬해 바위틈에서 싹이 트기 때문에 생존확률이 0.01%에도 미치지 못한다. 따라서 고산지대에 야생하는 종들은 새로운 줄기를 위하여 스스로 자신의 뿌리 한쪽을 썩혀 거름으로 희생시켜가며 생존하다. Rhodiloa sachalinensis A. Bor is a perennial herb belonging to the genus Asteraceae, also called cactus. Most of them have large day and night temperatures between 1,700 and 2,300 m above sea level and inhabit between rocks such as limestone and granite in harsh environments such as low temperature, dryness, wind and strong ultraviolet. Rhodiola vulgaris, which grows mostly in open fields, have small roots and some rot even after 10 years due to the ingestion of less nutrients in the cracks, and the survival rate is 0.01 because the seeds fall in the fall and spend long winters and sprout in the cracks the following year. Less than% Thus, wild species in the highlands survive on their own roots by decaying their own roots for new stems.
형태학적으로 홍경천은 전체에 분백색이 돌고 밑부분은 갈색 인편으로 덮여 있으며 원줄기는 높이 7~30 ㎝에 이르고 총생한다. 잎은 호생이고 육질이며 도란 형 또는 타원형이고 길이 1~3 ㎝, 너비 5~15 ㎜로서 끝이 둔하고 윗가장자리에 둔한 톱니가 있다. 꽃은 이가화로서 7~8월에 피고 연한 황색이며 취산화서는 원줄기 끝에 생기고 많은 꽃이 밀착한다. 수꽃에는 퇴화된 암술이 있으며 수술은 8~10개로서 꽃잎보다 길고 암꽃은 작으며 흔히 자주 빛이 돌고 4~5개의 암술이 있다. 열매는 뿔 모양으로 4~5개 열리며 길이 6~7 mm로서 직립한다.Morphologically, the red gyeongcheoncheon is white in color and the bottom is covered with brown scales, and its main stem is 7 ~ 30 ㎝ in height. The leaves are rosacea, flesh, obovate or oval, 1 ~ 3 ㎝ long, 5 ~ 15 ㎜ wide, with dull ends and upper teeth. Flowers are digahwa, blooms in July-August, light yellow, and hydrangea is formed at the end of main stem, and many flowers adhere closely. Male flowers have degenerative pistils, 8 ~ 10 stamens, longer than petals, female flowers are small, often light, and 4 ~ 5 pistils. Fruits are 4-5 in horn shape, 6-7 mm long, upright.
홍경천은 전초를 약으로 쓸 수 있지만 대개 굵은 뿌리를 약으로 쓴다. 민간에서는 진정제, 해열제, 수렴제로 쓰였으며, 중추신경계에 대한 긴장작용, 항피로 효과, 신경증과 고혈압에 대해 효과가 있다고 알려져 있고, 특히, 강장약, 노인성 심장쇠약, 음위에 쓰이며 당뇨병, 폐결핵, 빈혈, 간 및 담낭질병에 가루약이나 탕제로 쓸 뿐 아니라, 정신 및 육체피로, 신경쇠약, 산후 및 병후허약, 건망증에 사용된다. 또한, 홍경천 뿌리의 추출액은 감기와 독감예방, 수명연장, 신체 저항력 증진과 물리적·정신적 스트레스를 치료하는데 이용한다. 이것은 또한 신체의 면역기능과 능력을 증진시키기 위하여 한국에서 전통적인 약재로 사용되고 있다.Honggyeongcheon can be used as a medicine, but the thick root is usually used as a medicine. It has been used as a sedative, antipyretic and astringent in the public, and is known for its effects on the nervous system, anti-fatigue effect, neurosis and hypertension. It is especially used for tonics, senile heart failure, and vulgaris. It is used as a powder or aggression in liver and gallbladder diseases, as well as in mental and physical fatigue, nervous breakdowns, postpartum and postpartum weakness, and forgetfulness. In addition, the extract of the roots of honggyeongcheon is used to prevent colds and flu, prolong life, improve physical resistance and treat physical and mental stress. It is also used as a traditional medicine in Korea to enhance the body's immune function and ability.
홍경천은 중국 의약문헌들에 기재되어 있을 정도로 오랜 역사를 가지고 있다. 천여년 전부터 중국의 서장 지역에서는 홍경천은 신체를 튼튼히 하고, 여러 혹독한 환경에 적응하는 약으로 이용되어 왔다. 또한 '정주본초'에 수재되어 자보원지, 양폐, 지혈 등에 이용되고, 인삼이나 가시오가피와 동일하게 열악한 환경에서의 생체의 내성을 증진시키는 작용은 물론 동물실험 결과 항피로, 항방사선, 항산소 결핍증 등의 작용 및 장기기억의 개선 작용이 있는 것으로 보고되어 있다.Hong Kyung-cheon has a long history as described in Chinese medical literature. For over a thousand years, Hongqing has been used as a medicine to strengthen the body and to adapt to various harsh environments in the western part of China. In addition, it is used in botanical gardens, pneumonia, and hemostasis, and is used to improve resistance of living organisms in the same harsh environment as ginseng and thorny opi, as well as anti-fatigue, anti-radiation, and anti-oxygen deficiency. It has been reported that there is an action of and to improve the long-term memory.
특히, 주요 약리성분으로 밝혀진 하기 화학식 1의 살리드로사이드(p-하이드 록시펜에틸-β-D-글루코사이드)는 무산소증, 극초단파방사성 및 피로환자의 치료효과와 중추신경의 억제작용, 강심작용, 아드레날린 분비 촉진으로 인한 혈당조절 작용을 하고, 사람들의 정신노동과 육체노동의 효율을 향상시키고 산소결핍에 대한 뇌 조직의 인내력을 높이고 심근의 저항력을 강화시키는 것으로 알려져 있다:In particular, salidoxide (p-hydroxyphenethyl-β-D-glucoside) of Formula 1, which is found to be a major pharmacological component, has the therapeutic effect of anoxia, microwave radioactivity and fatigue patients, central nervous system inhibition, cardiac action, It is known to improve blood sugar control by promoting adrenaline secretion, improve people's efficiency of mental and physical labor, increase endurance of brain tissue against oxygen deficiency and strengthen myocardial resistance:
상기한 바와 같이, 홍경천은 제한된 지역에서만 자생하는 특성과 더불어 유효 생리활성 물질을 함유하고 있어, 생리활성의 지속적 탐색 외에도 주요 생리활성 물질의 안정적이고 효율적인 생산을 이루어야 할 필요가 있다. 이에, 본 발명자들은 홍경천 세포배양을 확대하고, 세포배양으로부터 생리활성 물질인 살리드로사이드를 분리·동정한 바 있다(문헌 ([Kim et al.(2004) Production of salidroside from callus culture of Rhodiola sachalinensis A. Bor., Korean J. Plant Biotechnol. 31: 89-94] 및 [Kim et al.(2004) Identification of salidroside from Rhodiola sachalinensis A. Bor and its production through cell suspension culture. Korean J. Medicinal Crop. Sci. 12(3): 203-208]).As described above, since the Hong Kyungcheon contains an effective bioactive substance, which is native to only a limited area, it is necessary to achieve stable and efficient production of major bioactive substances in addition to the continuous search for the biological activity. Accordingly, the present inventors have expanded the culture of Rhodiola sachaline and isolated and identified salidroside, a bioactive substance from the cell culture (Kim et al. (2004) Production of salidroside from callus culture of Rhodiola sachalinensis A). Bor., Korean J. Plant Biotechnol. 31: 89-94 and Kim et al. (2004) Identification of salidroside from Rhodiola sachalinensis A. Bor and its production through cell suspension culture.Korean J. Medicinal Crop. Sci. 12 (3): 203-208].
나아가, 본 발명자들은 홍경천 현탁배양 세포에서 살리드로사이드 함량 및 생산성을 증진시키기 위하여 최적의 조성을 갖는 배양배지와 이를 이용한 배양방법을 개발해내기 위하여 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 배양배지 및 방법을 이용함으로써 자연산 홍경천에 비해 살리드로사이드의 함량이 3~4배 증가된 홍경천 세포를 대량으로 얻을 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Furthermore, the present inventors carried out a continuous study to develop a culture medium having an optimal composition and a culture method using the same in order to improve the salicide side content and productivity in the Hong Kyungcheon suspension culture cells. As a result, it was confirmed that by using the culture medium and the method according to the present invention can be obtained in large quantities of the ryecheoncheon cells with a 3 to 4 times increase in the content of the salidroside compared to the natural ryecheoncheon, to complete the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 자연산 홍경천에 비해 살리드로사이드의 함량이 크게 증가된 홍경천 세포를 대량으로 얻을 수 있는, 홍경천의 세포 현탁배양용 배지를 제공하기 위한 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a medium for cell suspension culture of honggyeongcheon, which can obtain a large amount of honggyeongcheon cells in which the content of salidroside is significantly increased compared to natural honggyeongcheon.
본 발명의 다른 목적은 상기 배지를 이용하는 홍경천의 세포 현탁배양 방법을 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a cell suspension culture method of honggyeongcheon using the medium.
본 발명의 또다른 목적은 상기 방법으로부터 얻어진 홍경천 세포를 함유하는 면역활성화 기능을 갖는 사료첨가제를 제공하기 위한 것이다.It is another object of the present invention to provide a feed additive having an immunoactivating function containing the ryecheoncheon cells obtained from the above method.
본 발명의 또다른 목적은 상기 사료첨가제를 함유하는 면역활성화 기능을 갖는 사료를 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a feed having an immunoactivating function containing the feed additive.
본 발명의 제1면은 KNO3, (NH4)2SO4, NaH2PO4·2H2O, CaCl2·2H2O 및 MgSO4·7H2O의 함량이 2배로 증가된 B5 배지(2B5 배지)에 0.5 초과~1 ㎎/ℓ의 나프탈렌아세트산(NAA; naphthaleneacetic acid) 및 2 초과~5 ㎎/ℓ의 N6-벤질아데닌(BA; N6-benxyladenine)을 추가로 함유하는, 홍경천의 세포 현탁배양용 배지에 관한 것이 다. 상기 배지는 지베렐산(GA3; giberellic acid)을 함유하지 않고, 0.001~0.05 ㎎/ℓ의 티디아주론(TDZ; thidiazuron), 1 초과~2 ㎎/ℓ의 제아틴(zeatin; 6-(4-hydroxy-3-methyl-2-butenylamino)purine), 1~50 ㎎/ℓ의 스퍼민(spermine) 및 1~100 ㎎/ℓ의 스퍼미딘(spermidine)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 배지는 95~100 mM의 KNO3, 0.8~2 mM의 (NH4)2SO4, 2~4 mM의 NaH2PO4·2H2O, 1~6 mM의 CaCl2·2H2O 및 1~6 mM의 MgSO4·7H2O를 함유하는 것이 바람직하다.The first surface is KNO 3, (NH 4) 2
본 발명의 제2면은 상기 배지에서 홍경천 캘러스를 0.3~0.5 ℓ/분의 통기속도로 4~5 주간 현탁배양하는 단계를 포함하는, 홍경천의 세포 현탁배양 방법에 관한 것이다.The second aspect of the present invention relates to a cell suspension culture method of honggyeongcheon, including the step of suspension culture of the honggyeongcheon callus in the medium at aeration rate of 0.3 ~ 0.5 L / min for 4 to 5 weeks.
본 발명의 제3면은 상기 방법으로부터 얻어지는 홍경천 세포를 함유하는 면역활성화 기능을 갖는 사료첨가제에 관한 것이다.The third aspect of the present invention relates to a feed additive having an immunoactivating function containing the ryeolangen cells obtained from the method.
본 발명의 제4면은 상기 사료첨가제를 함유하는 면역활성화 기능을 갖는 사료에 관한 것이다.The fourth aspect of the present invention relates to a feed having an immunoactivating function containing the feed additive.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에서는, 홍경천 세포 현탁배양에서 살리드로사이드의 생산성을 개선하고자, 다양한 농도의 호르몬 옥신(auxin)인 NAA와 사이토카인(cytokinin)인 BA의 배합물, 기타 호르몬, 매크로원소(macroelements)의 첨가, 및 생물배양기의 통기속 도 및 배양시간에 의한 영향을 조사하였다. 즉, KNO3, (NH4)2SO4, NaH2PO4·2H2O, CaCl2·2H2O 및 MgSO4·7H2O의 함량이 2배로 증가된 B5(이하, '2B5'라 한다) 기본배지(B5 배지: 문헌 [Gamborg et al., 1968, Exp. Cell Res. 50: 151-158])에 0.5~5 ㎎/ℓ NAA와 0.5~5 ㎎/ℓ BA의 배합물 및 0.5~5 ㎎/ℓ NAA와 0.5~5 ㎎/ℓ 키네틴(kinetin)의 배합물을 첨가하여 캘러스의 생장과 살리드로사이드 함량을 측정한 결과, 0.5 초과~1 ㎎/ℓ, 특히 1 ㎎/ℓ의 NAA와 2 초과~5 ㎎/ℓ, 특히 5 ㎎/ℓ의 BA의 배합물이 첨가된 배지에서 최적의 결과를 얻을 수 있었다. 반면, NAA와 키네틴의 배합물이 첨가된 배지에서는 홍경천 캘러스의 생장과 살리드로사이드 생산이 저조한 것으로 나타났다.In the present invention, in order to improve the productivity of salidroside in the Rhodiola saline cell suspension culture, a combination of various concentrations of hormone auxin NAA and cytokinin BA, addition of other hormones, macroelements, And the effect of aeration rate and incubation time of the bioculture. That is, K 5 3 (NH 4 ) 2 SO 4 , NaH 2 PO 4 · 2H 2 O, CaCl 2 · 2H 2 O and MgSO 4 · 7H 2 O increased twice in the content of B 5 (hereinafter, '2B 5 In a basal medium (B5 medium: Gamborg et al., 1968, Exp. Cell Res. 50: 151-158), a combination of 0.5-5 mg / l NAA and 0.5-5 mg / l BA, and Callus growth and salidroside content of the callus were measured by adding a combination of 0.5-5 mg / l NAA and 0.5-5 mg / l kinetin, and more than 0.5-1 mg / l, in particular 1 mg / l. Optimal results were obtained with media in which a combination of NAA and greater than 2-5 mg / l, especially 5 mg / l BA, was added. On the other hand, medium and combination of NAA and kinetin were found to have low growth and salidroside production of Rhodiola callus.
또한, 1 ㎎/ℓ NAA와 5 ㎎/ℓ BA가 첨가된 2B5 배지를 기본조건으로 하여 GA3 (0.01~2 ㎎/ℓ), TDZ(0.001~0.05 ㎎/ℓ), 제아틴(0.01~5 ㎎/ℓ), 스퍼민(1~100 ㎎/ℓ) 및 스퍼미딘(1~100 ㎎/ℓ)을 첨가한 효과를 측정한 결과, 세포생장은 대조구에 비해 약간 감소하는 경향이 있으나, 살리드로사이드의 생산성은 GA3을 함유하지 않고, 0.001~0.05 ㎎/ℓ의 TDZ, 1 초과~2 ㎎/ℓ의 제아틴, 1~50 ㎎/ℓ의 스퍼민 및/또는 1~100 ㎎/ℓ의 스퍼미딘 첨가 시, 특히 5 ㎎/ℓ 스퍼민 첨가 시 증가하는 것으로 확인되었다.In addition, GA 3 (0.01-2 mg / L), TDZ (0.001-0.05 mg / L), Zeatin (0.01-) were prepared based on 2B 5 medium containing 1 mg / L NAA and 5 mg / L BA. 5 mg / l), spermine (1-100 mg / l) and spermidine (1-100 mg / l) were measured. As a result, cell growth tended to decrease slightly compared to the control. The productivity of the side contains no GA 3 , 0.001 to 0.05 mg / l TDZ, greater than 1 to 2 mg / l zeatine, 1 to 50 mg / l spermine and / or 1 to 100 mg / l spur It was found that the addition of midine increased, especially with the addition of 5 mg / l spermine.
한편, 매크로원소가 홍경천 세포의 생장 및 살리드로사이드 생산에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과 95~100 mM, 특히 98.92 mM의 KNO3; 0.8~2 mM, 특히 1.01 mM의 (NH4)2SO4; 2~4 mM, 특히 2.18 mM의 NaH2PO4·2H2O; 1~6 mM, 특히 2.04 mM의 CaCl2·2H2O; 및 1~6 mM, 특히 1.01 mM의 MgSO4·7H2O 존재 시 살리드로사이드의 생산성이 증가하는 것으로 나타났다.On the other hand, the effects of macroelements on the growth and salidroside production of Rhodiola sachaline cells were investigated. As a result, KNO 3 of 95-100 mM, particularly 98.92 mM; 0.8-2 mM, in particular 1.01 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 2-4 mM, in particular 2.18 mM NaH 2 PO 4 .2H 2 O; 1-6 mM, in particular 2.04 mM CaCl 2 .2H 2 O; And in the presence of 1-6 mM, in particular 1.01 mM MgSO 4 .7H 2 O, increased the productivity of salidroside.
나아가, 본 발명에서는 상기 배지에서 홍경천 캘러스를 0.3~0.5 ℓ/분, 특히 0.4 ℓ/분의 통기속도로 4~5 주간, 특히 5 주간 현탁배양함으로써, 높은 살리드로사이드 생산성 증가효과를 얻을 수 있었다.In addition, in the present invention, high salicide side productivity increase effect can be obtained by suspending cultured Rhodiola scalp callus in the medium at 0.3-0.5 L / min, especially 0.4 L / min for 4-5 weeks, especially 5 weeks. .
본 발명에 따른 배지 및 방법을 이용하여 얻어진 홍경천 세포는 높은 항체생성능 증가효과, 대식세포 활성화 효과, T/B 세포 증가효과, 사이토카인 유전자발현 증가효과를 가져 면역활성화 기능을 가지므로, 사료첨가제 및 사료로 효율적으로 활용될 수 있다. 본 발명에 따른 홍경천 세포를 사료첨가제로 사용하는 경우, 바람직하게는 0.1~0.5중량%, 보다 바람직하게는 0.3중량%로 함유할 수 있다.Rhodiola sachaline cells obtained using the medium and method according to the present invention have a high antibody production increase effect, macrophage activation effect, T / B cell increase effect, cytokine gene expression effect has an immune activation function, feed additives and It can be effectively used as feed. In the case of using the honggyeongcheon cells according to the present invention as a feed additive, it may preferably contain 0.1 to 0.5% by weight, more preferably 0.3% by weight.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are only intended to help the understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by them in any way.
실시예 1: NAA 및 BA/키네틴 배합물의 효과 및 최적농도 탐색Example 1 Exploration and Optimization of NAA and BA / Kinetin Formulation
홍경천의 현탁배양 세포는 상기 김 등(2004)이 유도하여 0.5 ㎎/ℓ NAA와 1 ㎎/ℓ BA가 첨가된, 하기에 나타낸 조성을 갖는 2B5 액체배지(2B5: B5 배지의 매크 로원소가 두 배, 3% 슈크로스, pH 5.7) 및 25 ℃의 암 상태에서 100 rpm의 회전식 진탕배양 조건에서 유지되고 있는 세포주를 사용하였다.Suspension cultured cells of Rhodiola sachalinensis were induced by Kim et al. (2004) and added 2 mg of a medium of 2B 5 liquid medium (2B 5 : B 5 medium) having the composition shown below to which 0.5 mg / L NAA and 1 mg / L BA were added. Cell line maintained at 100 rpm of rotary shaking culture conditions in a double state, 3% sucrose, pH 5.7) and 25 ° C. in the dark.
살리드로사이드 생산에 대한 외재호르몬 NAA와 BA/키네틴의 영향 및 처리농도 최적화를 위해, 현탁배양 세포를 0.5~5 ㎎/ℓ NAA와 0.5~5 ㎎/ℓ BA 및 0.5~5 ㎎/ℓ NAA와 0.5~5 ㎎/ℓ 키네틴을 함유하는 새로운 배지에 이식하여 2 주간 전배양(preculture)하였다. 그 후, 현탁세포만을 20 ㎛ 공극 크기의 체에 수확하고 무균증류수에 3회 세척한 후 수분을 충분히 제거하였다. 수분을 제거한 현탁세포를 무균대 내에서 0.5 g(신선한 wt)씩 정량하여 이식하였다. 30 ㎖ 액체배지/100 ㎖ 엘렌마이어 플라스크의 기본조건으로 3% 슈크로스, pH 5.7로 조정한 2B5 기본배지 에서 3 주간 배양한 후, 현탁세포를 수확하여 여과지(왓트만 No. 2)로 충분히 습기를 제거한 후 생중량을 측정하고, 액체질소로 급속동결 후 48 시간 동결건조기 ((주)일신, 한국)에서 동결건조하여 건중량을 측정하였다. 모든 처리는 5회 반복하여 최대치와 최소치를 제거한 3처리구의 수치만으로 평균과 오차를 계산하였다.For the effect of exogenous hormone NAA and BA / kinetine on salidroside production and optimization of treatment concentrations, suspension cultured cells were treated with 0.5-5 mg / l NAA and 0.5-5 mg / l BA and 0.5-5 mg / l NAA. The cells were transplanted into fresh medium containing 0.5-5 mg / L kinetin and precultured for 2 weeks. Thereafter, only suspended cells were harvested in a 20 μm pore size sieve, washed three times in sterile distilled water, and water was sufficiently removed. Suspension cells from which moisture was removed were quantified and transplanted by 0.5 g (fresh wt) in aseptic mass. After culturing for 3 weeks in a 2B 5 base medium adjusted to 3% sucrose and pH 5.7 as the basic conditions of a 30 mL liquid medium / 100 mL Elenmeyer flask, the suspension cells were harvested and thoroughly filtered with filter paper (Watman No. 2). After removing moisture, fresh weight was measured, and after freezing with liquid nitrogen, freeze-drying was performed for 48 hours in a freeze dryer (Ilsin, Korea) to measure dry weight. All treatments were repeated five times to calculate the mean and error using only the values of the three treatments with the maximum and minimum values removed.
살리드로사이드의 함량을 정량분석하기 위하여, 현탁배양 세포의 동결건조 시료 0.2 g을 실온에서 10 ㎖의 메탄올씩으로 3회 반복 추출한 후, 여과지(왓트만 No. 2)로 여과하여 여액을 합하고 회전증발기로 농축시켰다. 농축된 시료를 메탄올 3 ㎖로 재용해시켜 HPLC 분석에 사용하였다. HPLC 분석은 워터스(Waters)(워터 Co., U.S.A)의 주입기(600), 펌프(600), 자동샘플기(717plus), 검출기(486 가변 흡광도), 통합기(오토크로(Autochro)-WIN, 영린)를 이용하였으며, 컬럼은 μ-본다팩(Bondapak) C18 (300×3.9 ㎜ I.D., 10 ㎛)을, 이동상으로는 20% 메탄올(v/v)을 사용하였다. 시료는 10 ㎕ 주입하고, 용매는 1 ㎖/분의 속도 및 214 ㎚에서 자외선 흡광도로 검출하였다.In order to quantify the content of the salicide side, 0.2 g of the lyophilized sample of suspension cultured cells was extracted three times with 10 ml of methanol at room temperature, and then filtered through a filter paper (Whatman No. 2) to combine the filtrates, and a rotary evaporator. Concentrated. The concentrated sample was redissolved with 3 ml of methanol and used for HPLC analysis. HPLC analysis was performed by Waters (Water Co., USA) injector 600, pump 600, autosampler (717plus), detector (486 variable absorbance), integrator (Autochro-WIN, Younglin) and the column was μ-Bondapak C 18 (300 × 3.9 mm ID, 10 μm) was used as the mobile phase by 20% methanol (v / v). 10 μl of the sample was injected, and the solvent was detected by ultraviolet absorbance at a rate of 1 ml / min and 214 nm.
그 결과로서, NAA/BA 배합이 살리드로사이드 생산성에 미치는 영향을 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 1 ㎎/ℓ NAA와 5 ㎎/ℓ BA의 배합에서 살리드로사이드 %함량은 0.274±0.129로 생산성이 25 ㎎/ℓ 배지에 이르는 결과를 얻었다. 반면, NAA/키네틴의 배합에서는 NAA/BA 배합에 비해 생장속도가 전반적으로 감소하고 살리드로사이드 %함량과 생산성이 매우 낮은 것으로 나타났다.As a result, the effect of NAA / BA formulation on salidroside productivity is shown in FIG. 1. As shown in FIG. 1, the% salidroside content of 0.274 ± 0.129 in the combination of 1 mg / L NAA and 5 mg / L BA resulted in productivity reaching 25 mg / L medium. On the other hand, the combination of NAA / kinetine showed a general decrease in growth rate and very low salicide side content and productivity compared to NAA / BA formulation.
실시예 2: 기타 호르몬의 효과 및 최적농도 탐색Example 2: Exploration and Optimal Concentration of Other Hormones
1 ㎎/ℓ NAA와 5 ㎎/ℓ BA를 기본조건으로 설정하고 세포와 식물체의 생육 및 물질대사 등에 영향을 주는 주요 호르몬인 GA3, TDZ, 제아틴, 스퍼민, 스퍼미딘 등이 살리드로사이드 생산성에 미치는 효과를 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 조사하였다.Salidroside productivity of GA 3 , TDZ, zeatine, spermine, spermidine, etc., which are 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA as basic conditions and affect the growth and metabolism of cells and plants The effect on was investigated under the same conditions as in Example 1.
그 결과를 도 2 내지 도 6에 나타내었다. GA3는 0.01 ㎎/ℓ에서 2 ㎎/ℓ까지 처리한 결과, GA3 무처리구(0.4±0.03 g, 건조 wt)에 비해 생장은 감소하는 경향 (0.34±0.01~0.39±0.01 g, 건조 wt)이었으며, %함량에서도 대조구 0.19±0.139%에 비해 0.04±0.013%(GA3 2 ㎎/ℓ)~0.18±0.039%(GA3 0.01 ㎎/ℓ)로 감소하여, 생산성에서 최대 21 ㎎/ℓ(GA3 0.01 ㎎/ℓ 처리구)를 나타내었다(도 2). TDZ는 0.001~0.05 ㎎/ℓ 농도에서 대조구(0.19±0.139%)에 비해 %함량은 0.32± 0.251%(TDZ 0.001 ㎎/ℓ)에서 0.38±0.266%(TDZ 0.05 ㎎/ℓ)로 증가하였으며, 생장(0.01 ㎎/ℓ에서 0.32±0.07~0.05 ㎎/ℓ에서 0.39±0.01 g)에서는 유의적인 변화를 보이지 않았다. 반면, 생산성에 있어서 최대 49 ㎎/ℓ(TDZ 0.05 ㎎/ℓ)를 나타내어 대조구에 비해 약 2배의 유의적인 변화를 보였다(도 3). 제아틴 역시 생장은 증가하지 않았으나 %함량은 0.10±0.023%(제아틴 0.1 ㎎/ℓ)에서 0.46±0.250%(제아틴 2 ㎎/ℓ)로 증가하였으며, 생산성에서는 최대 56 ㎎/ℓ(제아틴 2 ㎎/ℓ)로 나타났다(도 4). 스퍼민은 농도가 높아질수록 생장이 감소하였으나, %함량에서는 0.10±0.029~0.49±0.387%로 증가하였고, 생산성에서도 최대 62 ㎎/ℓ(스퍼민 5 ㎎/ℓ)로 유의적으로 증가하였으며, 스퍼민의 농도가 증가할수록 생산성이 감소하는 경향을 나타내었다(도 5). 스퍼미딘은 10 ㎎/ℓ의 농도에서 생산성 증가(44.07± 2.5 ㎎/ℓ)를 보였으나 10 ㎎/ℓ 이상의 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다(도 6).The results are shown in FIGS. 2 to 6. GA 3 was treated from 0.01 mg / l to 2 mg / l, resulting in GA 3 Growth tended to decrease (0.34 ± 0.01 ~ 0.39 ± 0.01 g, dry wt) compared to untreated (0.4 ± 0.03 g, dry wt), and 0.04 ± 0.013% compared to 0.19 ± 0.139% of control (GA 3 2). Mg / l) to 0.18 ± 0.039% (GA 3 Reduced to 0.01 mg / l), up to 21 mg / l in productivity (GA 3 0.01 mg / l) Treatment)) (FIG. 2). TDZ increased from 0.32 ± 0.251% (TDZ 0.001 mg / ℓ) to 0.38 ± 0.266% (TDZ 0.05 mg / l) compared to the control (0.19 ± 0.139%) at 0.001-0.05 mg / l concentration. There was no significant change in (0.01 mg / l 0.32 ± 0.07 ~ 0.05 mg / l 0.39 ± 0.01 g). On the other hand, the maximum productivity of 49 mg / L (TDZ 0.05 mg / L) was about 2 times compared to the control group (Fig. 3). Zeatin also did not increase growth, but% content increased from 0.10 ± 0.023% (zeatine 0.1 mg / l) to 0.46 ± 0.250% (
실시예 3: 매크로원소의 최적농도 탐색Example 3 Search for Optimal Concentration of Macro Elements
홍경천 세포배양에서 살리드로사이드 생산을 위한 매크로원소의 최적농도를 조사하기 위하여, 1 ㎎/ℓ NAA와 5 ㎎/ℓ BA가 첨가된 2B5 액체배지에서 배양된 홍경천 캘러스를 매크로원소인 KNO3(17 mM~148 mM), (NH4)2SO4(0.7 mM~6 mM), NaH2PO4·2H2O(0.7 mM~7 mM), CaCl2·2H2O(0.7 mM~6 mM), MgSO4·7H2O(0.7 mM~6 mM)를 농도별로 30 ㎖ 액체배지/100 ㎖ 엘렌마이어 플라스크의 기본조건으로 3% 슈크로스, pH 5.7로 조정한 2B5 기본배지에서 3 주간 배양하였다. 모든 처리는 5회 반복하여 최대치와 최소치를 제거한 3처리구의 수치만으로 평균과 오차를 계산하였다.To honggyeongcheon cells to investigate the optimum concentration of macro elements for the draw side production raised in the culture, 1 ㎎ / ℓ NAA and 5 ㎎ / ℓ BA a 2B of the honggyeongcheon callus macro elements cultured in 5 broth KNO 3 was added ( 17 mM to 148 mM), (NH 4 ) 2 SO 4 (0.7 mM to 6 mM), NaH 2 PO 4 2H 2 O (0.7 mM to 7 mM), CaCl 2 · 2H 2 O (0.7 mM to 6 mM) , MgSO 4 · 7H 2 O (0.7 mM to 6 mM) by concentration in a 30 ml liquid medium / 100 ml Elenmeyer flask for 3 weeks in 2B 5 base medium adjusted to 3% sucrose, pH 5.7 It was. All treatments were repeated five times to calculate the mean and error using only the values of the three treatments with the maximum and minimum values removed.
그 결과를 도 7 내지 11에 나타내었다. 98.92 mM의 KNO3 농도에서 홍경천 캘러스 생장이 0.35±0.015 g, 건조 wt로 가장 좋았으며, 생산성도 98.92 mM 농도에서 64.53±11.242 ㎎/ℓ로 가장 좋았다(도 7). 또한, 0.68 mM의 (NH4)2SO4 농도에서 생장이 0.37±0.012 g으로 가장 좋았으며, 생산성은 1.01 mM에서 29.48±2.284 ㎎/ℓ로 가장 좋았다(도 8). 또한, 3.27 mM의 NaH2PO4·2H2O 농도에서 0.31±0.006 g으로 가장 높은 생장을 보였고, 생산성은 2.18 mM에서 25.07±3.37 ㎎/ℓ 로 높게 나타났다(도 9). 또한, 3.06 mM의 CaCl2·2H2O 농도에서 생장은 0.35±0.008 g으로 높았고, 생산성은 2.04 mM에서 25.07±3.37 ㎎/ℓ로 높았다(도 10). 또한, 3.03 mM의 MgSO4·7H2O 농도에서 생장은 0.33±0.004 g으로 높았고, 생산성은 1.01 mM에서 42.46±4.526 ㎎/ℓ에서 가장 높게 나타났다(도 11).The results are shown in FIGS. 7 to 11. At the 98.92 mM KNO 3 concentration, Rhodiola sachaline callus growth was the best at 0.35 ± 0.015 g and dry wt, and the productivity was the best at 64.53 ± 11.242 mg / L at 98.92 mM concentration (FIG. 7). In addition, the growth was the best (0.37 ± 0.012 g) at (NH 4 ) 2 SO 4 concentration of 0.68 mM, the productivity was the best (29.48 ± 2.284 mg / l at 1.01 mM) (Fig. 8). In addition, the highest growth was observed at 0.31 ± 0.006 g at NaH 2 PO 4 .2H 2 O concentration of 3.27 mM, and the productivity was high at 25.07 ± 3.37 mg / L at 2.18 mM (FIG. 9). In addition, growth was high at 0.35 ± 0.008 g at a CaCl 2 · 2H 2 O concentration of 3.06 mM, and productivity was high at 25.07 ± 3.37 mg / L at 2.04 mM (FIG. 10). In addition, the growth was 0.33 ± 0.004 g at a concentration of 3.0 g mM MgSO 4 · 7H 2 O, the productivity was the highest at 42.46 ± 4.526 mg / L at 1.01 mM (Fig. 11).
실시예 4: 최적 배양조건 탐색Example 4 Search for Optimal Culture Conditions
1 ㎎/ℓ NAA와 5 ㎎/ℓ BA가 첨가된 2B5 액체배지에서 홍경천을 3 주간 세포 현탁배양하여 살리드로사이드 생산에 대한 통기속도의 영향을 조사하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 0.4 ℓ/분의 통기속도로 홍경천 캘러스를 배양하는 경우 가장 높은 살리드로사이드 생산성을 나타내었다.The effect of aeration rate on salidroside production was investigated by suspending cultured Rhodiola saline for 2 weeks in 2B 5 liquid medium supplemented with 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 12, the highest salidroside productivity was obtained when culturing honggyeongcheon callus at an aeration rate of 0.4 L / min.
또한, 1 ㎎/ℓ NAA 및 5 ㎎/ℓ BA를 함유하는 2B5 액체배지에서 0.4 ℓ/분의 통기속도로 홍경천을 7 주간 세포 현탁배양하면서 살리드로사이드 생산양상을 살펴보았다. 그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 홍경천 캘러스를 5 주간 현탁배양함으로써, 높은 살리드로사이드 생산성을 얻을 수 있었다.In addition, the salidose side production conditions were examined while cell suspension cultured for 7 weeks in a honggyeongcheon in a 2B 5 liquid medium containing 1 mg / l NAA and 5 mg / l BA at aeration rate of 0.4 l / min. The results are shown in FIG. As shown in Fig. 13, high salicide side productivity was obtained by suspending cultured Rhodiola salicateus for 5 weeks.
실시예 5: 홍경천의 면역활성화 효과 측정Example 5 Measurement of Immunoactivation Effect of Rhodiola sachalinensis
1) 항체생성능 측정 1) Measurement of antibody production performance
홍경천의 현탁배양 세포는 김 등(2004)의 방법으로 식물체로부터 세포를 클 론하여 사용하였고 0.5 ㎎/ℓ NAA와 1 ㎎/ℓ BA가 첨가된 2B5 액체배지와 25 ℃를 유지한 암실에서 100 rpm의 회전식 진탕배양조건에 있는 세포주를 사용하였다. 그 후 새로운 배지에 생중량 0.5 g을 이식하여 4 주간 전배양하여 홍경천 캘러스만을 20 ㎛ 공극 크기의 체에 수확하고 무균 증류수에 3회 세척한 후 충분히 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 홍경천 캘러스를 수확하여 여과지(왓트만 No. 2)로 충분하게 습기를 제거한 후 액체질소로 급속 동결하여 48 시간 동결건조하여 사용하였다.Suspension cultured cells of Hong Kyung-cheon were used as clones of cells from plants by Kim et al. (2004), and 100% in a 2B 5 liquid medium containing 0.5 mg / l NAA and 1 mg / l BA and 25 ℃ The cell line in rotational shaking culture conditions of rpm was used. Thereafter, 0.5 g of fresh weight was transplanted into fresh medium and pre-cultured for 4 weeks, and only ryecheon-cal callus was harvested in a sieve having a pore size of 20 µm, washed three times in sterile distilled water, and then sufficiently dehydrated. The water-removed Honggyeongcheon callus was harvested and sufficiently moisturized with a filter paper (Whatman No. 2), and then rapidly frozen with liquid nitrogen and used for freeze-drying for 48 hours.
마우스 실험동물용 사료 500 g에 홍경천을 동결건조한 시료를 1.5 g(0.3%) 섞어 물을 넣고 반죽하여 경단을 만들고, 자연 순환식 건조기(JSON-150, JS 리서치 INC.)에서 70 ℃로 6 시간마다 뒤집어 주면서 20 시간 건조한 후 사료로 사용하였다. 또한, 생체 외 실험을 위하여 동결건조시킨 시료 10 g을 실온에서 메탄올 10 ㎖씩으로 3회 반복추출한 후 여과지를 이용하여 여액을 합하고 회전증발기로 농축시켰다. 농축된 시료를 메탄올 10 ㎖에 재용해시켜 밀리포어 필터(0.2 ㎛ FG)를 사용하여 여과한 후 회전증발기로 농축시킨 농축액을 사용하였다.Mix 500 g of mouse experimental animal feed with 1.5 g (0.3%) of lyophilized sample, add water and knead to make dumplings, and use the natural circulation dryer (JSON-150, JS Research INC.) At 70 ° C. for 6 hours. It was used for feeding after drying for 20 hours while turning upside down. In addition, 10 g of the lyophilized sample was repeatedly extracted three times with 10 ml of methanol at room temperature for in vitro experiments, and the filtrates were combined using filter paper and concentrated by rotary evaporator. The concentrated sample was redissolved in 10 ml of methanol, filtered using a Millipore filter (0.2 μm FG), and then concentrated using a rotary evaporator.
홍경천 첨가 1 주일 후에 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 타입 A(PmA)를 0.2% 포르말린으로 불활성화시킨 후 애쥬번트(완전)와 혼합하여 복강에 1㎖으로 1회 접종하고, 애쥬번트(불완전)로 2회 접종하였다. 6 주령의 Balb/c 마우스에 홍경천이 0.3중량% 첨가된 사료를 투여한 실험군과 일반사료를 먹인 대조군으로 나누어 사육하였다. 홍경천이 첨가된 사료를 매일 급여하면서 1 주일 후에 모 든 실험을 실사하였다.One week after the addition of Rhodiola sap, Pasteurella multocida Type A (PmA) was inactivated with 0.2% formalin, mixed with adjuvant (complete), inoculated once in the abdominal cavity with 1 ml, and adjuvant ( Inoculated twice). Six-week-old Balb / c mice were bred into two groups: the experimental group fed with 0.3% by weight of honggyeongcheon and the control group fed with normal feed. One week later, all experiments were conducted with daily feed supplemented with Hong Kyung-cheon.
PmA에 대한 마우스 혈중 IgG 항체가를 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 시험법으로 측정하였다. 일단 PmA를 카보네이트 완충액(pH9.6)에 20 ㎍/㎖로 용해시킨 후 96-웰 플레이트의 각 웰당 100 ㎕씩 분주한 후 4 ℃에서 O/N하여 플레이트에 PmA를 부착하였다. 0.05% 트윈 20-PBS(PBS/트윈) 완충액으로 각 웰을 3회 세척한 후 5% NFDM(Non Fat Dry Milk)을 200 ㎕씩 분주하고 37 ℃에서 2 시간 동안 방치시켰다. 다시 PBS/트윈으로 세척하고 마우스에서 얻어진 혈청을 비동화하여 PBS/트윈에 1:159로 희석하여 100 ㎕씩 분주하고 37 ℃에서 1 시간 암실 방치하였다. 그 후 PBS/트윈으로 세척하고 퍼옥시다제가 결합된 α-마우스 IgG를 PBS/트윈에 5000배 희석하여 웰에 100 ㎕씩 분주하였다. 37 ℃에서 1 시간 후에 PBS/트윈으로 세척하고 기질(시트레이트 완충액:ABTS:H2O2=200:5:1)로 100 ㎕ 분주하여 암실에서 10 분간 반응시키고 5% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시켰다. 각 웰에서의 발색정도를 405 ㎚의 파장에서 ELISA 리더(써모 랩시스템즈(Thermo Labsystems), 멀티스캔(Multiskan) EX)로 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 실험군에서 대조군보다 항체가가 높게 나왔으며, 실험군 최대 항체가와 대조군 최저 항체가는 무려 2배가 넘는 결과를 보였다.Mouse blood IgG antibody titers against PmA were determined by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) assay. Once PmA was dissolved in carbonate buffer (pH9.6) at 20 μg / ml, 100 μl of each well of the 96-well plate was dispensed, followed by O / N at 4 ° C. to attach PmA to the plate. After washing each well three times with 0.05% Tween 20-PBS (PBS / Twin) buffer, 200 μl of 5% NFDM (Non Fat Dry Milk) was dispensed and left at 37 ° C. for 2 hours. Again washed with PBS / twin, the serum obtained from the mouse was not agitated, diluted 1: 159 in PBS / twin, 100 μl was dispensed and left 1 hour dark at 37 ℃. Thereafter, the cells were washed with PBS / Twin and peroxidase-bound α-mouse IgG was diluted 5000-fold in PBS / Twin and dispensed into the
2) 대식세포 활성화 시험 2) Macrophage Activation Test
실험군과 대조군에 오브알부민 1 ㎖을 복강에 접종하고 3 일 후에 헤파린(10 U/㎖)을 넣은 PBS(Phosphate-buffered saline, pH 7.3) 10 ㎖을 복강에 주입하였다. 주입액을 8~10 ㎖ 정도 천천히 채취하여 4 ℃에서 250×g로 10 분간 원심분리하였다. 상층액을 이용하여 적혈구(RBC) 용혈시킨 후 대식세포를 추출하였다. 세포를 1×108 세포/㎖로 96-웰 플레이트에 2 웰당 100 ㎕씩 분주하고 CO2 배양기에 1 시간 동안 배양하였다. 각 웰에 PBS에 10배 희석한 루시게닌(Lucigenin) 50 ㎕와 500 ㎕ DMEM 배지로 희석한 100 nM 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)를 10 ㎕를 넣어 대식세포 활성화를 루미노미터로 측정하였다.The experimental group and the control group were inoculated with 1 ml of ovalbumin intraperitoneally, and after 3 days, 10 ml of PBS (Phosphate-buffered saline, pH 7.3) containing heparin (10 U / ml) was intraperitoneally injected. The injection solution was slowly collected about 8-10 mL and centrifuged at 250 x g for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was used to erythrocyte (RBC) hemolysis and macrophages were extracted. Cells were aliquoted at 1 × 10 8 cells / ml in 96-well plates at 100 μl per 2 wells and incubated for 1 hour in a CO 2 incubator. In each well, 10 μl of 100 nM Phobol-12-myristate-13-acetate (PMA) diluted with 10-fold diluted Lucigenin in PBS and 500 μl DMEM medium was used to stimulate macrophage activation. Measured by meter.
그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 실험군은 측정 8~10 분에 최대의 활성화를 보였으며, 대조군은 그보다 늦은 32분에 최대 활성화를 보였다.The results are shown in FIG. As shown in FIG. 15, the experimental group showed the maximum activation at 8 to 10 minutes, and the control group showed the maximum activation at 32 minutes later.
3) 비장세포 비율 측정 3) Spleen Cell Ratio Measurement
사이클로포스파미드(CY; cyclophosphamide)는 동물실험과 임상적인 사용에서 항원주사로 사용되고, 투여용량과의 관계 등 투여시기의 조건에 따라서 면역기능을 억제하므로, 이를 이용하여 비장세포 비율을 측정하고자 하였다. 1그룹, 2그룹의 실험군과 3그룹, 4그룹의 대조군으로 나누어 2그룹, 3그룹에 CY(500 ㎎/㎏)를 투여하고 3 일 후에 무균적으로 비장세포를 적출하여 RBC 용혈시킨 세포를 이용하였다.Cyclophosphamide (CY; cyclophosphamide) is used as an antigen injection in animal experiments and clinical use, and suppresses immune function according to the conditions of administration, such as the relationship with the dose, to measure the ratio of splenocytes using this . CY (500 mg / kg) was administered to
CD3(PE 항-마우스, BD 파밍겐(Pharmingen)™), CD19(FITC 항-마우스, BD 파밍겐™)을 PBS에 300배 희석하여 5×106 세포/㎖의 비장세포에 혼합한 후 암실에서 30 분간 반응시켰다. 염색된 세포를 세척 완충액으로 2회 원심분리(1500 rpm, 5 분)하고 세척한 후 PBS 200 ㎕를 분주하여 유세포분석기(Flow Cytometry; FACSCalibur™)로 측정하였다.CD3 (PE anti-mouse, BD Pharmingen ™) and CD19 (FITC anti-mouse, BD Pharmingen ™) were diluted 300-fold in PBS and mixed in 5 × 10 6 cells / ml splenocytes, followed by dark The reaction was carried out for 30 minutes at. Stained cells were centrifuged twice with wash buffer (1500 rpm, 5 min), washed, and then aliquoted with 200 μl of PBS and measured by Flow Cytometry (FACSCalibur ™).
그 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에 나타낸 바와 같이, CY 처리한 실험군 비장세포는 CY 처리하지 않은 대조군 비장세포보다 비장이 위축되어 크기가 작았으며 B-세포와 T-세포 비율을 조사해본 결과 B-세포와 T-세포 모두 대조군 보다 세포가 많은 것을 알 수 있었다. T-세포의 백분율에서 보면 면역억제된 실험군이 대조군보다 높고, B-세포의 집단을 보면 면역억제된 실험군이 면역억제된 대조군보다 높음을 알 수 있었다.The results are shown in FIG. As shown in FIG. 16, CY-treated experimental splenocytes were smaller in size due to atrophy of the spleen than untreated CY-treated splenocytes. As a result of examining the ratio of B-cells and T-cells, both B-cells and T-cells were examined. It was found that more cells than the control. In the percentage of T-cells, the immunosuppressed experimental group was higher than the control group, and the B-cell population showed that the immunosuppressed experimental group was higher than the immunosuppressed control group.
4) 마우스 비장세포의 사이토카인 유전자 발현 측정 4) Measurement of cytokine gene expression in mouse splenocytes
동결건조시킨 시료 10 g을 실온에서 메탄올 10 ㎖씩으로 3회 반복 추출한 후 여과지(왓트만 No. 2)를 이용하여 여액을 합하고 회전증발기로 농축시켰다. 농축된 시료를 다시 메탄올 10 ㎖에 재용해시켜 밀리포어 필터(0.2 ㎛ FG)를 사용하여 여과한 후, 회전증발기로 농축시킨 농축액을 DMEM 배지 100 ㎖에 넣어 희석하였다. 이를 ICR 마우스(6 주)의 비장세포를 적출하여 배지로 이용하여 실험하였다.10 g of the lyophilized sample was extracted three times with 10 ml of methanol at room temperature, and the filtrates were combined using a filter paper (Whatman No. 2) and concentrated using a rotary evaporator. The concentrated sample was redissolved again in 10 ml of methanol, filtered using a Millipore filter (0.2 μm FG), and then concentrated by rotary evaporator to dilute 100 ml of DMEM medium. The splenocytes of ICR mice (6 weeks) were extracted and used as a medium.
6-웰 플레이트에 각 웰당 DMEM 2 ㎖에 3×107 세포를 넣고 홍경천 추출액을 배양액의 10배, 100배, 1000배 희석하여 자극을 실시하고, PHA(Phytohemagglutinin) 10 ㎕ 자극, 자극하지 않은 CON으로 나누어 CO2 배양기에 4 시간 동안 배양하였다. 그 후 RNA를 추출하여 나노드롭(Nanodrop)(U.S. ND-1000)으로 총 RNA 농도를 모두 동일하게 200 ng/㎖로 맞추고, 사이토카인 IL-1β, IL-4, IFN-γ, TNF-α에 대한 RT-PCR을 실시하였다. RT-PCR용 슈퍼스크립트(Superscript)™ 제1쇄 합성 시스템을 이용하여 얻은 cDNA를 프라이머 셋트의 주형으로 이용하여 PCR을 수행하였다. IL-1β, IFN-γ의 PCR 조건으로는, 95 ℃에서 2 분간 예비-변성화한 후 94 ℃에서 50 초, 60 ℃에서 50 초, 72 ℃에서 1 분을 1 사이클로 하여 30회 반응시켜 각 사이토카인을 증폭시키고, 72 ℃에서 4 분간 DNA 합성을 연장시켰다. IL-4는 95 ℃에서 5 분간 반응시키고, 변성화(94 ℃ 30초), 어닐링(58 ℃ 30초), 신장(72 ℃ 30초)의 PCR 사이클을 30회 반복한 후 72 ℃에서 7 분간 유지하였다. TNF-α는 IL-4 조건에서 어닐링(63 ℃ 30초)만 바꾸어 PCR하였다. 이를 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하여 UV 조명기 하에서 밴드를 확인하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.In a 6-well plate, put 3 × 10 7 cells in 2 ml of DMEM per well and dilute the Rhodiola sac extract 10-fold, 100-fold, and 1000-fold of the culture solution, and stimulate 10 μl of PHA (Phytohemagglutinin), without stimulating CON. The mixture was incubated for 4 hours in a CO 2 incubator. The RNA was then extracted and adjusted to 200 ng / ml for total RNA concentrations equally by nanodrop (US ND-1000), followed by cytokine IL-1β, IL-4, IFN-γ and TNF-α. RT-PCR was performed. PCR was performed using cDNA obtained using the Superscript ™ first chain synthesis system for RT-PCR as a template for primer sets. As PCR conditions for IL-1β and IFN-γ, after pre-denaturation at 95 ° C for 2 minutes, the reaction was performed 30 times with 50 cycles at 94 ° C, 50 seconds at 60 ° C, and 1 minute at 72 ° C for 30 minutes. Cytokines were amplified and extended DNA synthesis for 4 min at 72 ° C. IL-4 was reacted at 95 ° C for 5 minutes, repeated 30 cycles of denaturation (94 °
본 발명에 따르면, 자연산 홍경천에 비해 유효성분인 살리드로사이드의 함량이 3~4배 증가되어 뛰어난 면역활성화 효과를 나타내는 홍경천 세포를 대량으로 얻을 수 있는 바, 본 발명에 따라 얻어진 홍경천 세포는 사료첨가제 및 사료로 효율적으로 활용될 수 있다.According to the present invention, the content of salidroside, an active ingredient, is increased 3 to 4 times as compared to natural red ginseng, and thus a large amount of red glenocytes showing excellent immunoactivation effect can be obtained. And it can be efficiently used as a feed.
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| 김수정의 전남 대학교 석사학위논문 "홍경천 배양세포로부터 Salidroside의 생산"(2004. 2.)* |
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