KR20020043578A - 자연상태의 골 조직을 처리하여 골 보철 소재를 제조하는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자연상태의 골 조직, 특히 I형 교원질을 보존하면서 골 이식조직을 제조하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 자연상태의 골 소재, 특히 적절하게 절단된 사람의 대퇴골두(femoral head)의 탈지와 정제처리로 구성되고, 상기 처리는 적어도 1번의 아세톤을 이용한 추출단계를 포함하는데, 상기 추출단계에 앞서 가압수에 의한 감도증가 단계 및 상기 추출단계이후 요소를 이용한 추출단계를 시행하여 오염원, 특히 사람 조직에서 전염가능한 형태로 존재할 가능성이 높은 바이러스, 예를 들면 간염, 소아마비, 에이즈(HIV) 바이러스와 같은 바이러스 및 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeld Jacob Disease) 또는 관련된 해면상 뇌병증(spongiform encephalopathy)의 프리온(prions)을 제거하는 것이 바람직하다.

Description

자연상태의 골 조직을 처리하여 골 보철 소재를 제조하는 방법{METHOD FOR MAKING A MATERIAL FOR BONE PROSTHESIS BY TREATING A NATURAL BONE TISSUE}

본 발명에 따라 제조되는 소재는 골 보철 소재로서 사용된다. 특히, 이 소재는 고체 형태로서 피하 이식용 조직편이나 골 이식조직의 구성에 사용되거나, 또는 유동 형태, 특히 분말 형태로 구강 의학에서 치아를 복구하는데 사용될 수 있다.

본 소재의 특성은 다음과 같다:

- 이식된 소재에서 골 조직의 성장을 통해 상실, 결손 또는 손상된 신체 골 조직을 재구성한다. 즉, 골절된 뼈의 접합을 촉진시킨다.

- 이식조직에 의한 수혜자의 감염 위험이 없다. 치료가 어려운 질병의 감염이나 이식조직에 대한 거부 반응은 이식시 고려해야 할 중요한 문제이다.

자가이식의 경우 환자에게 부가적인 수술을 하는 것이 용이하지 않고, 동종 이식의 경우 기증자가 부족한 실정이며, 감염의 위험이 이식조직 소재를 인간으로부터 채취하는 것만큼이나 중요함에도 불구하고 신속하고 지속적인 뼈 접합에 대한 연구는 주로 인간의 뼈를 이용한 이식조직 제조에 중점적으로 이루어지고 있다.

현재 시장에서는 충분한 살균 처리를 거친 사람의 사체나 동물에서 채취한 자연상태의 골 조직으로부터 제조된 골 이식소재가 시판되고 있다. 이런 소재를 사용할 경우에는 환자에게 외상을 입히는 자가이식이나 병균 감염이나 거부 반응의 위험이 있는 동종 이식을 시행할 필요가 없다. 이들 중에서 가장 흥미로운 것은 냉동된 상태(저온 보존)나 저온에서 건조하여 보관해야 하는 다른 소재들과 달리 건조 상태로 상온에서 보존가능한 소재들이다. 그러나 불행하게도 이런 소재는 공격적인 처리 과정을 거쳐 제조되기 때문에 사용하기에 어렵고 부서지기 쉽다. 게다가 병균제거에 사용되는 통상적인 제품은 골 조직을 파괴하기 때문에 골전도와 골유도에 의한 신생골 형성을 방해하는 불편함이 있다.

한편 기술적 발전을 통해 본 발명의 출원인은 채취한 자연상태의 골 조직을 요소(urea)가 주성분인 물질로 선별적 추출 처리하는 특수한 방법으로, 상기의 기존 제품과 같은 종류의 골 이식 소재를 성공적으로 제조 및 판매하고 있다. 이 방법은 프랑스 특허 89 15 363과 유럽 특허 EP 0 502 055에 자세히 개시되어 있다. 요소 이용으로부터 얻을 수 있는 이점은 제조된 소재가 I형 교원질로 구성되는 골 조직의 자연상태 구조를 유지한다는 점이다.

실제로 오늘날 판매되는 소재들은 일반적으로 도축된 동물, 특히 소에서 채취한 골 조직으로 제조되고 있다. 이런 방법은 도살장에서 제공되는 대량의 뼈를 사용하기 때문에 산업적인 측면에서 특히 유리하다.

현재 외과, 치과에서는 이식조직과 동일한 성질 및 단순히 세척, 냉동 보존되어 판매되는 재료와 마찬가지의 특성(저렴한 비용과 편리한 공급, 특히 편리한 보관)을 가지면서도, 동물이 아닌 사람의 뼈로 제조된, 그리고 무엇보다도 감염의 우려가 적은 골 이식조직 소재를 필요로 하고 있다.

본 발명은 자연상태의 골 조직을 처리하여 생체 적합성 소재를 제조하는 방법에 관한다. 좀더 구체적으로, 본 발명의 목적은 이러한 소재의 제조 방법에 관하고, 더 나아가 제조된 소재 및 이를 의료 시술에 적용하는 것에 관한다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간의 뼈를 동물의 뼈만큼 충분히 공급할 수 없는 상황에서 기술적, 질적 측면에서뿐만 아니라 경제적인 측면에서 인간의 뼈를 골 이식조직 소재로서 유리하게 사용할 수 있는 방법을 제안하는 것이다. 또한, 본 발명은 날이 갈수록 중요해지는 위생의 필요성을 절감하고 있는 수많은 생산자 및 사용자들의 다양한 요구를 만족시키는 것을 목적으로 한다. 종래 기술에 비해 본 발명은 다양한 감염의 위험을 줄이는데, 본 발명에서 주로 제거되는 감염원은 크로이츠펠트-야콥병과 유사한 해면상 퇴행을 유발하는 프리온 질환과 같이 가축에서 발병하는 전염병 및 인간에게 주로 발병하는 에이즈(인간의 면역 결핍 바이러스, 영어식 명칭으로는 "Human Immuno-Deficiency Virus")이다.

이런 목적을 실현하기 위해, 본 발명은 자연상태의 뼈를 사용하여 골 이식조직을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 40℃ 미만의 아세톤으로 병원균을 선별적으로 추출하고 지질을 제거하는 단계를 적어도 한 번 포함한다.

좀더 구체적으로 설명하면, 본 발명의 부차적인 특징에서 상기 추출 단계는 I형 교원질로 구성되는 자연상태 골질 구조가 변형되지 않도록 상온에서 이루어진다. 이때, 상온이란 평균적으로 18-25℃의 온도를 의미한다.

아세톤을 이용한 상기 추출 단계에서는 화학적 방식에 따른 선택적인 탈지(delipidation)가 이루어지는데, 여기서 병원균을 옮기는 지질 및 비교원질 구조의 단백질이 제거된다.

이때 아세톤은 경우에 따라 하급, 즉 분자에 함유된 탄소의 원자수가 여섯 개를 넘지 않는 다른 케톤으로 대체 가능하다.

선호되는 조건에서, 상기 다른 케톤 분자는 이의 기능을 교란하는 요소를 갖지 않는다.

이런 2가지 조건에 따라, 분자구조 내에 각각 4, 5개의 탄소원자를 가지고 알킬이외의 다른 작용기를 갖지 않는 메틸에틸케톤 또는 아세토부틸론으로 아세톤을 대체할 수 있다.

그러나, 본 발명의 범주에서, 아세톤은 동족체보다 더 용이하게 재료내의 수분(이전 처리단계에서 생긴)과 혼합된다.

한편, 본 발명에서 아세톤을 이용한 추출단계에 앞서 통상적인 탈지, 즉 가압수(pressurized water) 세척에 의한 감도증가를 실행하면 유리하다. 통상적인 탈지란 유리 지방산 및 골 조직과 결합된 지단백의 추출을 주 기능으로 하는 기계적 방식의 기름 제거 작용을 의미한다.

아세톤에 의한 추출단계이후에는 전술한 종래 기술(특히 유럽특허 0 502 055)에 제시된 바와 같이, 요소에 의한 추출을 실행하면 유리하다.

기억해 둘 점은 아세톤으로 인해, 제조된 소재가 저렴한 가격에 판매될 수 있다는 것이다. 아세톤은 간단한 기름기 제거에 자주 사용된다.

그러나, 이런 경우에 아세톤은 일반적으로 비등점 정도의 높은 온도에서 1-10% 농도의 매우 희석된 수용액 상태로 사용된다.

본 발명의 결과에 따르면, 아세톤은 요소와 유사하게 자연상태 골질 조직의 교원질 구조는 그대로 보존하고 비교원질 단백질은 선택적으로 추출함으로써 바람직하지 못한 성분들을 제거하는 기능을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 이런 관점에서, (거의)순수한, 즉 희석되지 않은 상태인 80-98%의 케톤을 사용하면 유리하다.

추출단계 초기에 뼈를 담그는 시점에서 아세톤은 대략 98%의 농도로 순수하지만, 추출단계에 앞서 시행되는 감도증가 단계를 마친 이후 아세톤 추출단계에 들어가기 전에 뼈를 건조하지 않기 때문에, 처리된 뼈에 흡수된 수분이 아세톤을 희석시켜 농도를 떨어뜨릴 수 있다는 점에 주목해야 한다. 그러나 아세톤의 농도는 항상 80% 이상을 유지하며, 적어도 본 발명에서 선호되는 조건에서는 대부분의 경우 90%를 넘는다.

필요에 따라서, 최적의 조건에서 아세톤이 충분히 뼈에 스며들 수 있도록 중간 세척을 통해 추출 잔여물질을 씻어낸 후, 아세톤에 의한 추출을 한번 더 시행할 수 있다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 아세톤에 의한 추출을 한번 더 시행할 경우에는 두 번째 추출을 첫 번째보다 오랜 시간 동안 상온에서 시행한다.

한편, 아세톤은 인간의 뼈로 이루어진 재료의 처리를 위한 추출 용매로서의 효과가 요소보다 더 우수한 것으로 밝혀졌다. 그 이유는 아세톤이 처리되는 재료내부에 더 효과적으로 침투하기 때문인 것으로 보이는데, 이런 침투 효과는 추출단계에 앞서 뼈를 가압수에 세척하는 감도증가 단계를 실행할 경우 더욱 개선된다. 따라서, 비교적 부피가 큰 뼈도 절단할 필요 없이 처리할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 특히 뼈 두께가 0.5-5cm, 바람직하게는 10-20mm 또는 10-30 mm의 뼈 블럭을 사용하는 것이 유리한데, 이를 수득하는 가장 통상적인 방법은 인간의 대퇴골두를 2 또는 3조각으로 절단하는 것이다. 이렇게 함으로써, 뼈를 처리하기 전에 분쇄함으로써 야기되는 불가피한 손실을 피할 수 있으며 제조된 이식조직을 소요의 크기로 다시 재구성할 필요가 없다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 본 발명의 결과에 따르면 아세톤과 요소에 의한 처리는 시너지 효과를 일으키는 것으로 보인다. 아세톤은 특히 외피를 가진 바이러스의 추출에 효과적이고, 반면 요소는 외피가 없는 바이러스의 제거에 효과적인 것으로 보인다. 어쨌든 본 발명에 따른 방법의 여러 단계에서 시행된 다양한 분석에 따르면, 경우에 따라 이 두 추출용매의 추출과정은 1번 이상 반복하고 이에 더하여 세척, 헹굼의 과정을 함께 사용하면 골 조직으로부터 감염원이 매우 효과적으로 제거되는 것으로 밝혀졌다. 여기서, 바이러스, 특히 사람의 조직에서 전염가능한 형태로 발생할 위험이 있는 간염이나 소아마비, 에이즈 및 크로이츠펠트-야콥병 또는 해면상 뇌병증의 프리온이 효과적으로 제거된다.

본 발명의 부차적인 특징에 따라, 요소에 의한 추출이전에 아세톤에 의한 추출을 실시하는 것이 유리한데, 이것은 아세톤이 골 조직 중간 섬유주 공간에 침투하는 능력이 요소보다 우수하다는 것과 관련이 있다. 또한, 아세톤은 특히 사람의뼈를 처리하는 경우에 감도가 높은데, 그 이유는 사람의 중간 섬유주 간격이 소의 간격보다 넓기 때문에 비교적 부피가 큰 뼈의 경우도 절단하지 않고 효과적으로 추출 처리할 수 있기 때문이다. 하지만, 본 발명이 산업적 용도에만 한정되는 것은 아니며, 모든 경우에 있어서 아세톤에 의한 추출은 이후의 추출단계에서 추출용액이 골 조직 내부로 용이하게 침투하도록 보완한다.

동일한 이유로, 아세톤에 의한 추출과 요소에 의한 추출 사이에, 아세톤 처리 단계에 앞서 권장되는 세척 단계 및 유사한 감도증가 단계를 실시하는 것이 바람직한 것으로 보인다. 따라서, 골 조직에 가압수를 투사하는데, 이런 물리적 제거 작용을 통해 여전히 남아 있는 무른 조직이 제거된다. 게다가 세척 성분을 함유한 멸균된 물을 사용함으로써, 뼈 표본을 추출 용액에 담그기 전에 예비적인 화학적 처리를 수행할 수 있다. 특히, 인산염이나 알칼리성의 무기인산염(polyphosphate)(경우에 따라 염소를 함유)을 주성분으로 하는 거품이 없는 세척 성분이 효과적인 것으로 밝혀졌다. 매우 희석된 아세톤 역시 세척제로서 높은 효과를 기대할 수 있다. 본 발명에서 인산염이나 무기인산염을 주성분으로 하는 세척제의 선호되는 농도는 1-10%, 바람직하게는 2-5%이다.

본 발명은 또한 부차적으로 산업 시설의 사용 조건과 관련된 특징을 가지고 있다. 특히, 사람의 뼈 표본을 수집하여 냉동상태로 보관하는 뼈 은행은 채집 장소 부근에 세우는 것이 유리한데, 이것은 뼈 기증을 보다 용이하게 하고, 한번에 제한된 양의 대퇴골두만 처리할 수 있어(특히 1-5개 정도가 가능하지만 1-4개 정도가 선호된다) 각 처리 단계가 연속적으로 이루어져야 하는 자동화 설비를 보다 용이하게 갖출 수 있도록 한다.

통상적인 단계를 포함하고 있지만 종래 기술에 비해 신규한 단계로 이루어진 본 발명에 명시된 조건을 준수하면서 사람의 뼈를 재료로 하여 본 발명에 따른 방법을 좀더 주의깊게 실시하고자 하는 경우에는, 건강하다고 판정되었지만 서로 다른 기증자들로부터 채취된 표본들간의 교차 감염의 위험을 줄이기 위하여, 적어도 뼈의 절단 또는 분쇄 전후에 가압수에 의한 세척을 실시해야 한다. 상기 세척을 약 30℃의 미지근한 온도에서 시행할 경우, 골 조직의 주요 구성 성분인 지질 함유량이 약 2%까지 감소된다.

그리고, 정확히 말해서 멸균 단계(보통 특별히 바이러스의 활동을 저해시킨다고 부르는 경향이 있음)는 매우 중요하다. 멸균 단계는 아세톤을 이용한 추출, 가압 세척 수용액에 의한 중간 공격, 요소에 의한 추출 및 최종적인 소독 단계전의 열처리(특히 에이즈 바이러스 제거를 위한 조건에서 이루어진다)를 순차적으로 포함한다.

실제로, 요소를 이용한 추출은 종종 요소를 함유한 수용액에 골편을 연속적으로 2번 담궈 수행하기도 한다.

본 발명의 부차적인 특성에 따르면, 요소를 함유한 상기 수용액의 농도는 2-10 M이 적당하며, 바람직하게는 대략 5-8 M이다.

요소에 의한 추출은 30-35℃의 미지근한 온도에서 이루어짐에도 불구하고 상온에서 이루어지는 아세톤에 의한 추출보다 오래 걸리는데, 이것은 일반적으로 요소와 뼈가 접촉하는 시간이 아세톤이 뼈와 접촉하는 시간보다 길 때 바람직하다는것과 관련이 있다.

하기 실시예를 통하여 본 발명의 특성과 이점, 결과를 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 하기의 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1

특히 박테리아, 균류(fungus), 바이러스 등의 잠재적 감염원을 제거하여 외과적 이식수술에 사용되는 골 이식조직을 제조하기 위하여 사람의 대퇴골두를 처리하였다.

본 발명에 따른 처리는 두 단계로 구성되는데, 이것은 중간 섬유주 공간에 남아 있을 수도 있는 지질 및 그 밖의 잔여물질(특히 혈액)을 추출함으로써 경우에 따라 미확인된 바이러스를 제거한다. 첫 번째 단계에서는 아세톤을, 두 번째 단계에서는 요소를 시약으로 사용한다.

우선, 각 대퇴골두에서 피질부분을 제거한 뒤 둥근 회전톱으로 대퇴골두를 세로로 2 또는 3조각으로 절단한다. 이렇게 하는 것은 최대 16 mm를 초과하지 않는(1 mm 차이로) 절반-부분에 일치하는 표본을 얻기 위한 것인데, 경우에 따라서는 8 mm 두께의 조각을 얻을 수도 있다.

이후, 각 대퇴골두는 매우 선명한 분홍빛의 흰색이 나타날 때까지 가압수(100bar 이하)로 세척한다.

상기 세척이 끝난 후, 아세톤을 이용한 첫 번째 추출단계를 시행한다. 이 때, 선택적 탈지 및 병원균의 제거가 이루어진다. 우선, 골편은 15분동안 초음파통에서 18℃의 최소 80%(본 실시예에서는 98%) 아세톤에 담근다. 이후, 상기 처리된 골편은 자기-교반기에 담긴 약 18℃의 새 아세톤에 3시간 동안 다시 담근다.

100 g의 뼈(처리 시작시의 무게)를 처리하는 데에 필요한 아세톤의 양은 400 ml으로 예상된다.

상기의 선별적인 화학적 탈지 및 병원균 제거 단계에서, 최대한의 지질, 잠재적인 바이러스 매개물질, 이들 이외의 전염원 및 비교원질 단백질이 제거된다. 처리 전에는 전체 중량의 30-40%을 차지하던 지질이 2% 미만까지 제거되었다.

이후, 상기 골편은 초음파로 살균한 물로 30분동안 간단히 헹군 뒤, 초음파 통에서 항-박테리아 비이온 세척제(4%)로 두 번째 탈지 처리를 통상적인 방법으로 실행한다. 이때, 인산염과 무기인산염이 주성분인 세척제를 사용한다.

상기의 두 번째 통상적인 탈지 처리에서, 골수 파편 및 지질이 완전히 제거되고, 바이러스나 박테리아가 한번 더 제거된다. 세척 잔여물질은 초음파로 살균한 물로 제거한다.

처리 효과를 평가하기 위해 상기 처리된 대퇴골두를 분석하였다. 분석에는 조직 형태계량학적 연구 및 지질량과 색깔 검사가 활용되었는데, 이의 결과에서 다음의 사실을 확인할 수 있었다:

- 뼈의 I형 교원질 구조가 매우 잘 유지된다.

- 소의 뼈가 아닌 인간의 뼈를 사용하였으며, 작지 않은 크기(8-16 mm의 두께)의 뼈 블럭을 처리하였음에도 불구하고 아세톤이 항상 뼈 내부 깊숙이 침투한다.

- 살균 효과가 매우 우수하다. 특히 하기의 외피를 가진 바이러스의 경우에 그러하다:

- 헤프레스-바이러스과에 속하는 오제스키 전염병(유사 공수 병, PRV)의 외피를 가진 ADN 바이러스

- 토가바이러스과에 속하는 소 바이러스성 설사병의 외피를 가진 ARN 바이러스(BVDV)

- 에이즈의 원인인 I형 HIV 바이러스, 외피를 가진 ARN 바이러스, 사람면역결핍의 레트로바이러스(retrovirus)

최종적으로 이식조직의 세균 또는 병균으로부터의 안전을 기하기 위해, 상기 골편은 살균된 물로 헹군 뒤 초음파 아래에서 6 M의 요소에 연속적으로 두 번 담근다. 각 요소처리이후에 요소에 남은 잔여 물질은 초음파로 살균한 물로 헹군다.

상기 처리는 I형 교원질 단백질을 파괴하지 않으면서, 이전에 실행된 처리 단계의 프로테오글리칸, 당단백질 추출 효과 및 항 바이러스 작용 효과를 보충한다.

요소는 상기의 외피를 가진 바이러스를 완전히 제거함으로써 아세톤의 항 바이러스 효과를 보완한다. 한편, 요소 처리는 특히 하기의 외피가 없는 바이러스 제거에 효과적인 것으로 밝혀졌다:

- 특히, 통상적인 물리-화학적 요소에 대한 저항력이 큰 것으로 알려진, MVM(Minute Virus of Mice)라 불리는 생쥐의 외피가 없는 ADN 파르보바이러스

- 역시 강한 저항력을 갖고 있는 것으로 알려졌으며 소아마비를 유발하는외피가 없는 ARN 소아마비 바이러스

피질이 제거되었지만 교원질 단백질을 여전히 유지하는 상기 골편은 살균된 물에 넣어 초음파하에서 56-60℃까지 가열한다. 이런 열처리는 박테리아와 HIV 바이러스를 제거하기 위한 것이다.

상기 처리된 골편은 에탄올에 헹구고 알코올을 증발시켜 최종적으로 건조시킨다.

제조된 소재는 사용 전까지 일반적인 상온인 25℃에서 보관한다.

실시예 2

실시예 1의 분석 테스트에 대한 보충으로서 최종적으로 제조된 이식조직은 통상적인 바이러스로부터 안전하고, 본 발명에 따르는 처리는 잠재적으로 프리온, 특히 크로이츠펠트-야콥병의 프리온 제거에 효과적이라는 사실이 밝혀졌다.

이때, 요소에 의한 추출이 매우 중요한 역할을 하는데, 이런 사실은 상기 인용된 출원인의 유럽 특허에 개시된 기술에 따라 소의 뼈를 산업적으로 처리한 경우에서 이미 입증되었다.

그러나, 이런 효과는 요소에 의한 추출을 시행하기에 앞서 아세톤에 의한 추출을 시행할 경우 더욱 향상될 수 있다. 그리고, 가압수 및/또는 세척 수용액에 의한 감도증가 처리를 시행할 경우 보다 높은 효과를 거둘 수 있다.

실시예 3

본 발명에 따른 방법은 사람의 뼈에 자동화 형태로 적용하였다. 각 처리 단계는 작업실에서 이루어졌는데, 뼈 표본을 하나의 처리 통에서 다른 처리 통으로옮기는 작업은 자동화로 이루어졌다. 수 작업을 요하는 처리는 장갑을 끼고 상자 안에서 시행하였는데, 가압수의 투사에 의한 감도증가 처리가 그러하였다.

본 발명의 실시예에서, 고관절증으로 사망하거나 수술을 받은 환자로부터 채취한 대퇴골두 부위가 사용되었다. 각각의 말단은 세척, 절단, 감도증가, 아세톤에 의한 추출단계를 개별적으로 거쳤기 때문에, 다른 표본으로부터의 교차 감염의 위험도가 감소되었다. 또한, 자동화된 공정하에서 한번에 적은 분량(한번에 처리하는 대퇴골두의 개수가 4개를 초과하지 않았다)의 표본을 처리한 것도 감염의 위험을 낮추는 데에 도움이 되었다.

골편은 절단된 모양 그대로 사용자들에게 판매된다. 골편은 최대 16 mm를 초과하지 않는 2개의 절반-부분(측면 부분과 반구형의 대퇴골두)으로 이루어지며, 경우에 따라 최대 8mm를 넘지 않는 중간 부분을 갖기도 한다.

처리에 들어가기에 앞서, 기증자가 병균으로부터 안전한 지를 확인하는 절차를 거쳤다(의학적 설문과 혈청 분석을 통해). 또한, 채취되어 냉동보관된 뼈 중에서 치료목적에 충분한 수준의 안전성을 보이는 표본만 본 발명에 따른 처리 방법에 사용하였다.

이때, 실시된 혈청 검사는 특히 안티-HIV 항체(1형), HBs 간염 항원, 안티-HBc 항체, 안티-HCV 항체 (C형 간염 바이러스) 테스트에 대한 반응을 보이지 않는다는 것을 확인하게 위해 실시한다. 선정되어 처리 대기중인 뼈는 무균 상자 처리를 거쳐 -35℃의 냉동고에 보관한다.

표본의 처리는 박피 단계에서 시작된다. 박피를 하는 이유는 시약이 이식조직 깊숙이 스며들 수 있도록 해면골을 노출시키기 위해서이다. 먼저, 상자에서 수작업 처리를 거친 대퇴골두는 장갑을 끼고 다른 곳에서 따로 마련된 작업실로 옮긴다. 이후, 움직이지 않도록 대퇴골두를 바이스에 고정한 뒤, 공기 프레이즈반으로 피질을 긁어낸다.

상기 처리된 표본의 말단에서 전염원을 제거하기 위해, 비-이온 세척제의 유기 성분이 첨가된 가압수(박테리아를 걸러낸 물은 압력에 의해 침투시켰다)를 투사하여 세척했으며, 수 작업에 의한 세척 과정의 결과는 시각적 검사로 점검한다. 이렇게 함으로써 골질 조직으로부터 특히 지질과 혈액, 골수등의 대부분의 면역 유전자 요소가 제거된다.

이후, 아세톤에 의한 병원균의 제거 및 선별적 탈지 단계에 들어간다. 이번에도 서로 다른 기증자로부터 채취된 표본들간의 교차 감염을 방지하기 위해, 각각의 대퇴골두를 개별적으로 처리하였다.

이 단계를 시행하는 목적은 골질 조직에 남아있는 지질과 잠재적인 바이러스 매개물 및 이들 이외의 감염원을 제거하기 위함이다. 처리 후에는 세포 잔해의 대부분이 제거되며, 지질은 전체 지질 무게의 2% 미만으로 감소한다. 세척된 뼈를 담은 바구니는 순수한 아세톤(98% 이상)에 담근 후, 15분 동안 초음파 통에 넣어 둔다. 이후, 상기 처리된 뼈는 자기-교반기에서 최소 3시간 동안 다시 아세톤에 담근다.

상기의 처리과정은 완전한 자동화 조작으로 수행한다. 한번에 최대 4개의 대퇴골두밖에 처리할 수 없는 상황에서, 가능한 많은 양을 처리하기 위해 각 단계는 연속적으로 이루어진다. 이식조직은 바구니에 담겨 컨베이어에 의해 한 용액에서 다른 용액으로 옮겨진다.

우선, 세척제가 첨가된 가압수에 의한 통상적인 탈지처리는 골 섬유주로부터 피질 잔여물질 및 병원균 제거이후에도 남아있을 지 모르는 혈액 잔해를 제거하고, 또한 적절한 항-바이러스 및 항-박테리아 작용을 시행하기 위해 실시한다.

이 단계는 완전 자동화로 이루어지는데, 적어도 1시간 20분 동안 초음파 아래에서 수행한다. 이 단계가 끝나면 이식조직은 탈지되지만, 무기 골질과 교원질 단백질은 보존된다.

상기 처리 후에는 처리 후의 세척 잔여물을 제거하기 위해 뼈를 헹구는데, 이는 박테리아가 걸러진 삼투압 물로 시행한다.

이후, 항-바이러스 작용 및 특히 통상적이지 않은 전염원의 제거를 위해 요소 처리를 시행한다.

이 단계는 초음파 통에서 실행한다. 뼈는 35℃의 용액에 한 번에 두 시간씩 연속적으로 두 번 담근다. 이렇게 함으로써, 요소에 의한 추출은 아세톤에 의한 추출에서보다 뼈와 용액의 접촉 시간이 2배가된다. 그리고, 요소에 의한 추출을 두 번 시행하는 것은 새로운 용액의 침투를 통하여 효과를 더욱 증진시킨다.

요소 잔여물을 제거하기 위해 다시 뼈를 세척한 뒤 열처리를 실시하는데, 이것은 두 가지 목적이 있다. 하나는 항-박테리아 및 항-바이러스 작용(HIV 바이러스의 완전한 제거)이며, 다른 하나는 모든 처리 잔여물의 제거이다. 열처리는 초음파 보온통에 담긴 살균수에서 시행한다.

이후, 에탄올에 의한 마지막 세척을 실행하는데, 이것은 최종 건조를 용이하게 하기 위한 것이다.

교원질 조직을 손상하지 않을 정도로 충분히 낮은 온도의 열로 건조한 이후, 건조된 제품은 실온에서 저장한다.

시각적 검사를 마친 후 살균 처리에 앞서 각각의 이식조직을 저장용 상자에 담아 저장한다.

살균 처리는 이온화(전리) 장치에 의한 가속화된 전자단의 방사(열, 빛)에 의해 이루어지며, 이렇게 함으로써 여전히 남아 있을 수도 있는 미생물을 파괴하고 외과적 살균처리 제품을 담보한다.

실시예 4

상기 실시예 1과 유사한 조건에서, 한편으로는 사람의 뼈를, 다른 한편으로는 소의 뼈를 본 발명에 따른 방법으로 처리한다. 2가지 뼈 모두 세립 측정 분류법에 따라 센티미터 단위까지 분쇄하였다.

처리 과정을 거친 이식조직들의 조직형태계측 결과는 다음과 같다:

뼈의 평균치 인간 소

골 조직 부피 (%) 27 34

섬유주 평균 두께 (㎛) 178 165

섬유주 평균 개수 (/mm) 1.4 2.0

섬유주 사이의 평균 간격 (㎛) 555 343

이식조직의 화학적 구성성분 분석 결과는 다음의 평균치를 보였다:

중량 퍼센트 인간 소

수분 6.7% 7.4%

칼슘(Ca++) 23.7% 22.2%

인 10.7% 11.9%

지질 0.1% 0.1%

단백질 29.9% 29.6%

교원질 26.9% 26.4%

모든 경우에 있어서 교원질은 전체 중량의 20-40%(보다 정확히 전체 무게의 25-35%), 칼슘은 전체 중량의 15-25%를 차지하는데, 이는 처리 후에도 교원질과 인회석으로 이루어진 골 조직의 기본 구조가 유지된다는 것을 입증한다. 또한, 지질의 비율은 모든 경우에 있어서 2% 미만으로 거의 존재하지 않았다.

실시예 5

실시예 1의 처리를 거쳐 생산된 소재의 조직이 뼈 보철로서의 기능을 유지할 수 있는지, 그리고 처리 과정을 거치는 동안 독성을 띄지 않는지를 알아보기 위해 생체 적합성 검사를 실시한다.

하기의 표준 검사들로부터 모두 유리한 결과를 얻을 수 있었다:

- 모르모트에 실시한 감도증가 평가(ISO/EN 30993-10에 따라)

- 세포독성검사(ISO/EN 30993-5에 따라)

- 전신독성검사(ISO/EN 30993-11에 따라)

- 다음의 검사를 포함하는 유전독성검사(ISO/EN 30993-3에 따라)

- 정신검사(OCDE 471에 따라)

- 인간 임파구 염색체 변성 검사(OCDE 473에 따라)

이상의 검사 결과로부터, 본 발명에 따라 제조된 이식조직은 탁월한 생체 적합성을 갖고 있다는 결론을 얻을 수 있었다.

사람의 뼈를 처리하여 제조된 이식조직을 섬유주에 이식한 뒤 장기간에 걸쳐 관찰한 결과 역시 성공적이었다.

이러한 상기 관찰 결과중 양에게 시행한 이식(EN 30993-6에 따라)의 관찰 결과를 예로 들면, 3개월 후 이식조직이 주변 조직과 훌륭하게 결합하고 있는 것을 발견할 수 있었다.

실시예 6

실시예 1의 조건에 따라 사람의 뼈와 소의 뼈를 처리하였다. 그리고 추가적으로 경우에 따라 요소와 아세톤 처리에 앞서 뼈를 약 1-3cm로 절단하거나 세립 측정 분류법에 따라 0.5 cm 미만으로 분쇄하였다.

뼈 분쇄의 이점은 인간의 뼈에서만 발견할 수 있었다, 좀더 구체적으로 설명하면 뼈가 대퇴골두이거나 또는 분말 형태로 제조된 소재가 요구되는 경우에 효과적이었다.

실시예 7

아세톤과 요소의 멸균 효과를 입증하기 위한 검사를 실시하였다.

상기 실시예 1에서 언급된 바이러스에 대한 결과는 다음과 같다. 검사 결과는 로그에 의한 감소계수와 평균값으로 표시한다.

추출용매 감소계수:

바이러스 아세톤 요소 1 요소 2

HIV-1 > 4.32 > 4.19 > 4.19

PRV > 4.59 > 4.61 > 4.61

BVDV > 4.95 > 4.08 > 4.08

폴리오(Polio) > 4.68 > 5.19 > 5.19

MVM > 1.22 > 3.55 > 3.55

중복 감소계수는 다음과 같다.

HIV-1 12.70

PRV 13.81

BVDV 13.11

폴리오 15.06

MVM 8.32

아세톤에 의한 멸균 작용은 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 아세톤에 의한 멸균 작용은 뼈 깊숙한 곳에 있는 병원균을 제거하는 과정으로 이루어지는데(잔여 지질은 전체 무게의 0.2% 미만으로 감소된다), 이것은 뼈가 이후에 실시되는 요소의 멸균 작용에 보다 민감하게 반응하도록 한다.

상기 결과는 특히 전술한 실시예들과 함께, 본 발명이 당업자가 용이하게 예측할 수 없는 방법으로 고안되었고, 소요의 목적을 달성하고 있음을 보여준다. 특히, 본 발명은 우수한 뼈 접합 능력을 가지면서 감염 위험없이 인간에 대한 외과적 시술에서 사용 가능한 이식조직의 생산을 실현한다.

비록 동물의 뼈를 사용할 수도 있지만(가장 일반적인 것은 도축된 소에서 채취한 뼈이다), 사체(피질이나 해면, 또는 탈회된 뼈의 형태로 얻어질 수 있다) 또는 살아있는 기증자(이런 경우 일반적으로 피질이나 해면질의 뼈는 적은 양 밖에 얻을 수 없다)에서 채취한 사람의 뼈를 이용하는 것이 더 선호된다. 본 발명에 따른 기술은 적절하게 절단된 대퇴골두 처리에 적용될 때 특히 적합하다.

아세톤에 의한 추출은 가압수에 의한 감도증가와 결합할 경우 바람직한데, 이후 적어도 한 번의 요소에 의한 추출(두 번이 선호된다)을 실시함으로써 높은 탈지 및 살균 효과를 거둘 수 있다. 권장 조건에서 실시될 경우, 상기 아세톤에 의한 추출은 특히 외피를 가진 바이러스의 제거에 효과가 있고, 반면 상기 요소에 의한 추출은 특히 외피가 없는 바이러스의 제거에 효과가 있다.

그러나, 본 발명에 따른 방법에서는 I형 교원질을 주성분으로 하는 골 조직의 기본 구조가 유지되는데, I형 교원질은 본 발명에 따른 소재로 구성되는 이식된 골 조직이 주변 조직과 잘 결합하는 데에 필수적이다.

만일 이런 사실을 이끌어내기에 지금까지의 설명이 충분하지 않다면 다음을 강조할 수 있다:

- 비록 본 발명에 따른 방법은 채취이후 저온 보관된 뼈 표본의 처리에 용이하게 적용할 수 있을 뿐만 아니라 채취된 표본에 곧바로 적용할 수도 있는데, 이것은 비용을 절감하고 수요와 공급의 연결을 용이하게 한다.

- 마찬가지로, 최종적으로 제조된 제품은 냉동 보관할 필요가 없다. 즉 제조된 소재는 미리 건조시키거나 마른 상태로 18-25℃의 상온에서 보관 가능하다.

- 실행된 검사 결과를 통해 요소의 프리온 추출처리 효과가 입증되었는데, 본 발명에 따른 방법으로 시행할 경우 그 효과는 더욱 개선된다.

- 본 발명에 따른 방법은 뼈에 공격적이지 않은 용매에만 기초하고 있으면서도, 전염성이 있는 박테리아와 저항력이 크지 않은 균(fungus)은 물론, 지질 및 이들 이외에 잠재적으로 바이러스를 옮길 위험이 있는 혈액 구성성분을 완전히 제거하며, 심지어 그리 흔치 않은 프리온 질환까지 제거한다.

- 사람의 대퇴골두의 절반 부분을 처리할 수 있다는 점은 본 발명에 따른 방법의 실행에서 중요한 성공 조건이다. 왜냐하면 분말 상태로 분쇄된 소재의 처리와 같이 상대적으로 부피가 큰 골편에 대해 잠재적으로 유해할 수도 있는 뼈 구성성분의 활성을 차단하는 물리적 작용 및 이런 구성성분을 용해시키는 화학적 작용을 교대로 실시할 수 있기 때문이다.

-본 발명에 따른 방법에 사용되는 용매는 적어도 본 발명에서 선호되는 권장 조건에서 휘발성 알코올의 폭발 등을 야기할 위험이 없으며, 이로 인해 산업 시설의 측면에서 부가 비용이 절약된다.

결론적으로, 본 발명에 따라 제조된 이식조직은 통상적인 방법으로 저온 보존된 뼈와 동일한 용도에 적용할 수 있다. 이것은 본 발명에 따라 제조된 이식조직이 특히 허리나 무릎 인공뼈 제조, 척추의 관절고정, 종기 적출수술등의 외과적 시술, 외상치료나 인공 보정기, 치과 시술등에서 결손된 골조직의 수복, 재생에 사용된다는 사실에서 알 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 이식조직이 저온 보존된 이식조직과 다른 점은 본 발명에 따른 처리 방법이 표본에 함유된 전염성 세균을 직접 파괴하면서도 이식조직과 주변 조직의 결합 능력이 우수하고, 수산화-인회석과 I형 교원질의 기본 구조를 변형시키지 않는다는 점이다.

Claims (12)

1. 자연상태의 골 조직을 처리하여 골 보철 소재를 제조하는 방법에 있어서,

   자연상태의 골 조직을 이용하여 지질 및 이들 이외에 병원성 구성 성분을 추출하는 연속적인 처리를 거치고, I형 교원질로 이루어진 골 조직의 기본 구조가 변형되지 않도록 40℃미만의 온도에서 아세톤과 같은 케톤으로 이루어진 용매에 의한 추출단계를 적어도 한 번 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 아세톤에 의한 추출단계 후에 40℃를 초과하지 않는 온도에서 요소에 의한 추출단계를 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 아세톤에 의한 추출 처리는 특히 외피를 가진 바이러스를 제거하기 위해 실시하는 한편, 상기 요소에 의한 추출 처리는 특히 외피가 없는 바이러스를 제거하기 위해 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2항 또는 3항에 있어서, 상기 아세톤에 의한 추출단계는 상온에서, 그리고 요소에 의한 추출단계는 특히 약 30-35℃의 약간 미지근한 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 3항 또는 4항에 있어서, 특히 5-8 M이 선호되는 2-10 M 농도의 요소를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 2항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 요소에 의한 추출단계를 실시하기 전에 가압수에 의한 감도증가 단계를 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 상기 아세톤에 의한 추출단계를 실시하기 전에 추출 용매가 골 조직 안으로 용이하게 침투할 수 있도록 가압수에 의한 감도증가 단계를 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 6항 또는 7항에 있어서, 상기 감도증가 단계는 특히 인산염과 polyphosphate alcalins을 주성분으로 하며 항 박테리아 비이온 세척제가 첨가된 가압수로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항 내지 4항중 어느 한 항에 있어서, 거의 희석되지 않은, 처음의 농도가 80% 이상인 순수한 상태의 아세톤을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 2항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 경우에 따라 제 6항 내지 9 항의 특징 중 한 하나에 의해 보충될 수 있는, 아세톤에 의한 추출단계에 비해 또는 경우에 따라 제 7 항에 따른 각각의 감도증가 단계에 비해 거의 두 배의 뼈와 용매의 접촉 시간을 확보하기 위해 요소에 의한 추출단계를 적어도 한 번 이상 반복하는것을 특징으로 하는 방법.
11. 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 상기 아세톤에 의한 추출단계를 다시 한 번 반복하며, 두 번째 추출은 첫 번째 추출보다 오랫동안 실시하는 것이 선호되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 본 발명의 방법은 얇은 조각 또는 0.5-3 cm의 두께로 절단된 인간의 뼈에 적용된다는 것과, 상기 방법은 적은 양을 연속적으로 처리하는 자동화 조작으로 수행하는 것이 선호된다는 것, 그리고 미리 개별적으로 수작업에 의한 세척을 거친 사람의 대퇴골두를 한번에 처리하는 개수는 4개를 넘지 않는다는 것을 특징으로 하는 방법.